CN109870429B - 一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。该芯片包括支撑层、点击化修饰层、多层石墨烯和固定修饰层；所述点击化修饰层共价锚定于支撑层上；所述石墨烯通过点击化学共价结合于点击修饰层上；所述多层石墨烯通过点击化学共价相结合；所述固定修饰层通过共价结合于石墨烯上。本发明提供的多层石墨烯传感生物芯片具有结构稳定及灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片制备领域，特别是一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。
背景技术
石墨烯是一种单原子厚度的二维碳材料，由于其出色的电子、机械及热特性，石墨烯被研究机构及工业界广泛关注。石墨烯有大的表面面积（约为2600m2/g）、平整的表面及丰富的π共轭结构，使其成为优异的生物分子支撑物。
最近，石墨烯被用于生物传感领域，特别是基于无标记的表面等离子体（SPR）的生物传感芯片的制备方向。目前，基于石墨烯的SPR传感芯片基本都是通过静电作用吸附于金膜。Kim课题组通过静电相互作用在金膜表层组装了多重石墨烯结构，即首先把金膜表层进行正电荷的修饰，然后再对氧化石墨烯进行带正电及负电的化学修饰，并通过静电作用进行层层组装，最终形成石墨烯的生物芯片（ACSAppl.Mater.Interfaces2015,7,144−151）。由于石墨烯能与金膜的表面等离子体激元相耦合，并增强传感芯片的灵敏度，Kim等设计的这一结构能有效地增强SPR的传感信号，为生物分子的检测及相互作用的分析提供了更灵敏的传感芯片模型。
但是，由于多层石墨烯是通过静电作用来进行构建的，使得石墨烯-金膜层及石墨烯层与层之间的固定相对松散；这一静电吸附作用构建方式不但在芯片使用及保存时会出现不稳定的现象，还会在芯片后期的化学修饰中破坏芯片的结构。因此，多层石墨烯之间及石墨烯与金膜之间的固定模式是多层石墨烯生物传感芯片开发的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。本发明提供的多层石墨烯传感生物芯片具有结构稳定及灵敏度高的优点。
本发明的技术方案：一种多层石墨烯传感生物芯片，该芯片包括支撑层、点击化修饰层、多层石墨烯和固定修饰层；所述点击化修饰层共价锚定于支撑层上；所述石墨烯通过点击化学共价结合于点击修饰层上；所述多层石墨烯通过点击化学共价相结合；所述固定修饰层通过共价结合于石墨烯上。
一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）清洁表面镀金或镀银的玻璃基片，把清洁的基片浸泡于1～10mM的巯基乙胺乙醇溶液中，在自组装驱动下，在基片的金属膜表面形成一单分子层，再将基片浸泡于6～12mM的溴丙炔二甲基亚砜溶液中，于常温下反应1～5小时，清洗芯片，得到点击化修饰的基片；
（2）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（1）中的点击化修饰基片，加入20-50%叠氮修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到单层石墨烯通过共价固定于点击修饰层上的基片，即单层石墨烯修饰的基片；
（3）在芯片反应器中加入炔基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（2）中的单层石墨烯修饰的基片，加入20-50%炔基修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到双层石墨烯修饰的基片；
（4）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水,分散，放入步骤（3）中的双层石墨烯修饰的基片，加入20-50%叠氮修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到三层石墨烯修饰的基片；
（5）重复步骤（3）和步骤（4），得到多层石墨烯修饰的基片；
（6）在一芯片反应器中放入步骤（5）中的多层石墨烯修饰的基片，加入固定修饰剂、催化剂及溶剂，反应得到多层石墨烯传感生物芯片。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（2）中，所述叠氮基修饰的石墨烯的制备方法包括如下步骤：
（2-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至60～80℃，加入水合肼，继续保温反应18～24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，然后在60～70℃下干燥，得到石墨烯；
（2-2）在反应器中加入步骤（2-1）中得到的石墨烯及乙醇-水混合溶剂，分散，随后加入（3-溴丙基）三乙氧基硅烷、（3-氯丙基）三乙氧基硅烷和（3-溴丙基）三甲氧基硅烷或（3-氯丙基）三甲氧基硅烷，加入后的浓度为1-15mmol/L，于30～60℃下反应3～6小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到卤素修饰的石墨烯；
（2-3）取步骤（2-2）中得到的卤素修饰的石墨烯分散于去离子水中，加入叠氮化钠，加入后的浓度为1-10mmol/L，在80～90℃下反应10～14小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到叠氮基修饰的石墨烯。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（3）中，所述炔基修饰的石墨烯的制备方法包括如下步骤：
（3-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至60～80℃，加入水合肼，继续保温反应18～24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，在60～70℃下干燥，得到石墨烯；
（3-2）在反应器中加入步骤（3-1）得到的石墨烯及去离子水，分散，随后加入摩尔比为（5-10）：1：（10-30）的对氨基苯甲酸、亚硝酸钠及硝酸，在50～70℃下反应2～5小时，离心并用去离子水清洗，得到羧基修饰的石墨烯；
（3-3）将步骤（3-2）得到的羧基修饰的石墨烯分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺于常温反应30～60分钟，二环己基碳二亚胺在加入后浓度为1-5mmol/L，然后加入丙炔胺，继续反应2～5小时，得到炔基修饰的石墨烯。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（6）中，所述固定修饰剂的制备方法包括如下步骤：在反应器中加入摩尔比为1：1：2:200的丙炔溴、对氨基苯甲酸、碳酸钾及N,N-二甲基甲酰胺，于5～10℃下反应2～5小时，移除溶剂，得到固定修饰剂。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（1）中，所述表面镀金或镀银的玻璃基片为支撑层。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（2）、（3）和（4）中，所述的催化剂均为摩尔比为1:1的卤化铜及抗坏血酸钠。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（2）、（3）、（4）和（6）中，所述反应的温度范围均为20～50℃；所述反应的时间范围均为0.5～2小时。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法中，在步骤（6）中，所述的催化剂为卤化亚铜及2,2’-联吡啶；溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
前述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，在步骤（6）中，所述催化剂与固定修饰剂的摩尔比为（0.01-0.5）：1；所述固定修饰剂加入后的浓度为1-10mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明所制备的多层石墨烯传感生物芯片的整个表面包括支撑层、点击化修饰层、多层石墨烯、固定修饰层，由于芯片的整个界面传感层都是通过共价键相连接，使得多层石墨烯芯片的结构非常稳定，这一特性不但便于芯片在不同环境条件下的使用，而且便于芯片的保存及后期的化学修饰；
（2）本发明所制备的多层石墨烯传感生物芯片是通过点击反应来构建其整个界面传感层，由于点击化学的反应条件温和、且反应具有高效及正交性，可以方便快速且高效地组装多层石墨烯结构，为多层石墨烯传感生物芯片的工业化生产提供了条件；
（3）本发明所制备的传感生物芯片具有多层石墨烯的结构，由于石墨烯能与金膜表面等离子体激元相耦合，多层石墨烯结构的芯片具有高灵敏度的特点。
为证明本发明的效果，发明人做了如下实验：
对比例。把镀有金膜的玻璃基片放入等离子体清洗机中清洗10分钟，除去金膜表面的污染物，将洁净后的镀金玻璃基片浸泡于1mM的11-巯基-1-十一烷酸的乙醇溶液中，经由自组装而制得表面羧基化的芯片。
所用去离子水与丙三醇配置折射率（RI）分别为1.3334,1.3385,1.34482,1.35743,1.36406,1.3708的溶液。
实验1：
将实施例2的多层石墨烯传感生物芯片及对比例的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，每次通入上述溶液中某一折射率的溶液至基线稳定，随后进行SPR角度扫描。扫描结果：多层石墨烯传感生物芯片的灵敏度为160.03deg/RIU,而对比例的灵敏度为144.01deg/RIU。因此，相对于对比例没有石墨烯层的芯片，实施例2多层石墨烯传感生物芯片的灵敏度有了显著的提高。
实验2：
将实施例3还原石墨烯辅助的生物芯片与对比例芯片浸泡在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）按摩尔份1：2配成的水溶液中，在常温下反应60分钟，用磷酸缓冲液冲洗芯片，得到表面活化的芯片。把人lgG通过点样机点于活化的芯片表面，室温反应2小时，清洗芯片得到固定人lgG的芯片。
将上述固人lgG的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液（PBSbuffer,10mM,pH=7.4）作为流动相，流速设为1.5μL/s，基线稳定后，依次通入羊抗人lgG（anti-lgG）、PBS。如图2，由于实施例3多层石墨烯传感芯片有高的灵敏度，其对anti-lgG的特异性识别信号明显强于对比例的生物芯片。
实验3：
将实施例4的多层石墨烯传感生物芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，依次循环通入PBS及重生液，经过12个循环后，该芯片的基线依然稳定（见图3），由此可见，该芯片具有很好的使用稳定性。
附图说明
图1为多层石墨烯传感生物芯片的结构示意图；
图2为实施例3的多层石墨烯传感生物芯片与对比例生物芯片固定人lgG后，对羊抗人lgG（anti-lgG）的特异性识别结果示意图；
图3为实施例4的多层石墨烯传感生物芯片稳定性的测试结果示意图。
附图标记：1-支撑层，2-点击化修饰层，3-多层石墨烯，4-固定生物分子，5-固定修饰层，A-实施例3的多层石墨烯传感生物芯片,B-对比例的生物芯片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1。一种多层石墨烯传感生物芯片。
该芯片包括支撑层、点击化修饰层、多层石墨烯和固定修饰层；所述点击化修饰层共价锚定于支撑层上；所述石墨烯通过点击化学共价结合于点击修饰层上；所述多层石墨烯通过点击化学共价相结合；所述固定修饰层通过共价结合于石墨烯上。
实施例2。一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。
（1）清洁表面镀金或镀银的玻璃基片，把清洁的基片浸泡于1mM的巯基乙胺乙醇溶液中,这里的mM是指mmol/L，在自组装驱动下，在基片的金属膜表面形成一单分子层，再将基片浸泡于6mM的溴丙炔二甲基亚砜（DMSO）溶液中，于常温下反应5小时，清洗芯片，得到点击化修饰的基片；
（2-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至80℃，加入水合肼，继续保温反应24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，然后在65℃下干燥，得到石墨烯；
（2-2）在反应器中加入步骤（2-1）中得到的石墨烯及乙醇-水混合溶剂（其体积比为95:5），分散，随后加入（3-溴丙基）三乙氧基硅烷，于60℃下反应3小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到卤素修饰的石墨烯；
（2-3）取步骤（2-2）中得到的卤素修饰的石墨烯分散于去离子水中，加入叠氮化钠，在85℃下反应12小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到叠氮基修饰的石墨烯。
（2）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及离子水，分散，放入步骤（1）中的点击化修饰基片，加入摩尔比为1:1的氯化铜及抗坏血酸钠，于20℃下反应2小时，得到单层石墨烯通过共价固定于点击修饰层上的基片，即单层石墨烯修饰的基片；
（3-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至60℃，加入水合肼，继续保温反应24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，在65℃下干燥，得到石墨烯；
（3-2）在反应器中加入步骤（3-1）得到的石墨烯及去离子水，分散，随后加入摩尔比为7.5：1：20的对氨基苯甲酸、亚硝酸钠及硝酸，在50℃下反应5小时，离心并用去离子水清洗，得到羧基修饰的石墨烯；
（3-3）将步骤（3-2）得到的羧基修饰的石墨烯分散于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）于常温反应30分钟，然后加入丙炔胺，继续反应2小时，得到炔基修饰的石墨烯。
（3）在芯片反应器中加入炔基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（2）中的单层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1氯化铜及抗坏血酸钠，于20℃下反应2小时，得到双层石墨烯修饰的基片；
（4）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水,分散，放入步骤（3）中的双层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1氯化铜及抗坏血酸钠，于20℃下反应2小时，得到三层石墨烯修饰的传感生物芯片。
（5）先在反应器中各自加入1摩尔份的丙炔溴、1摩尔份的对氨基苯甲酸、2摩尔份的碳酸钾及200摩尔份的N,N-二甲基甲酰胺（DMF），于10℃下反应5小时，移除溶剂，得到固定修饰剂；在一芯片反应器中放入步骤（4）中的三层石墨烯修饰的基片，加入固定修饰剂、氯化亚铜、2,2’-联吡啶及N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入的氯化亚铜加上2,2’-联吡啶的摩尔总量与固定修饰剂的摩尔比为0.01：1，且固定修饰剂加入后的浓度控制为1mmol/L，于20℃下反应2小时，得到三层石墨烯传感生物芯片。
实施例3。一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。
（1）清洁表面镀金或镀银的玻璃基片，把清洁的基片浸泡于10mM的巯基乙胺乙醇溶液中，在自组装驱动下，在基片的金属膜表面形成一单分子层，再将基片浸泡于12mM的溴丙炔二甲基亚砜（DMSO）溶液中，于常温下反应1小时，清洗芯片，得到点击化修饰的基片；
（2）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及离子水，分散，放入步骤（1）中的点击化修饰基片，加入摩尔比为1:1的溴化铜及抗坏血酸钠，于50℃下反应0.5小时，得到单层石墨烯通过共价固定于点击修饰层上的基片，即单层石墨烯修饰的基片；叠氮基修饰的石墨烯的制备同实施例2中（2-1）、（2-2）和（2-3）的步骤；
（3）在芯片反应器中加入炔基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（2）中的单层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1溴化铜及抗坏血酸钠，于50℃下反应0.5小时，得到双层石墨烯修饰的基片；炔基修饰的石墨烯的制备同实施例2中（3-1）、（3-2）和（3-3）的步骤；
（4）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水,分散，放入步骤（3）中的双层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1溴化铜及抗坏血酸钠，于50℃下反应0.5小时，得到三层石墨烯修饰的基片；
（5）重复步骤（3）和步骤（4），得到叠氮基修饰的石墨烯为最上层的五层石墨烯修饰的基片；
（6）先在反应器中各自加入1摩尔份的丙炔溴、1摩尔份的对氨基苯甲酸、2摩尔份的碳酸钾及200摩尔份的N,N-二甲基甲酰胺，于10℃下反应5小时，移除溶剂，得到固定修饰剂；在一芯片反应器中放入步骤（5）中的五层石墨烯修饰的基片，加入固定修饰剂、溴化亚铜、2,2’-联吡啶及二甲基亚砜（DMSO），加入的溴化亚铜加上2,2’-联吡啶的摩尔总量与固定修饰剂的摩尔比为0.5：1，且固定修饰剂加入后的浓度控制为10mmol/L，于50℃下反应0.5小时，得到五层石墨烯传感生物芯片。
实施例4。一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法。
（1）清洁表面镀金或镀银的玻璃基片，把清洁的基片浸泡于5mM的巯基乙胺乙醇溶液中，在自组装驱动下，在基片的金属膜表面形成一单分子层，再将基片浸泡于8mM的溴丙炔二甲基亚砜（DMSO）溶液中，于常温下反应3小时，清洗芯片，得到点击化修饰的基片；
（2）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及离子水，分散，放入步骤（1）中的点击化修饰基片，加入摩尔比为1:1的碘化铜及抗坏血酸钠，于30℃下反应1小时，得到单层石墨烯通过共价固定于点击修饰层上的基片，即单层石墨烯修饰的基片；叠氮基修饰的石墨烯的制备同实施例2中（2-1）、（2-2）和（2-3）的步骤；
（3）在芯片反应器中加入炔基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（2）中的单层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1的碘化铜及抗坏血酸钠，于30℃下反应1小时，得到双层石墨烯修饰的基片；炔基修饰的石墨烯的制备同实施例2中（3-1）、（3-2）和（3-3）的步骤；
（4）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水,分散，放入步骤（3）中的双层石墨烯修饰的基片，加入摩尔比为1:1的碘化铜及抗坏血酸钠，于30℃下反应1小时，得到三层石墨烯修饰的基片；
（5）重复步骤（3）和步骤（4），得到七层石墨烯修饰的基片；
（6）先在反应器中各自加入1摩尔份的丙炔溴、1摩尔份的对氨基苯甲酸、2摩尔份的碳酸钾及200摩尔份的N,N-二甲基甲酰胺，于10℃下反应5小时，移除溶剂，得到固定修饰剂；在一芯片反应器中放入步骤（5）中的七层石墨烯修饰的基片，加入固定修饰剂、碘化亚铜、2,2’-联吡啶及二甲基亚砜（DMSO），，加入的碘化亚铜加上2,2’-联吡啶的摩尔总量与固定修饰剂的摩尔比为0.25：1，且固定修饰剂加入后的浓度控制为5mmol/L，于30℃下反应1小时，得到七层石墨烯传感生物芯片。
Claims (9)
1.一种多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：该芯片包括支撑层、点击化修饰层、多层石墨烯和固定修饰层；所述点击化修饰层共价锚定于支撑层上；所述石墨烯通过点击化学共价结合于点击修饰层上；所述多层石墨烯通过点击化学共价相结合；所述固定修饰层通过共价结合于石墨烯上；所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）清洁表面镀金或镀银的玻璃基片，把清洁的基片浸泡于1～10mM的巯基乙胺乙醇溶液中，在自组装驱动下，在基片的金属膜表面形成一单分子层，再将基片浸泡于6～12mM的溴丙炔二甲基亚砜溶液中，于常温下反应1～5小时，清洗芯片，得到点击化修饰的基片；
（2）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（1）中的点击化修饰基片，加入20-50%叠氮修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到单层石墨烯通过共价固定于点击修饰层上的基片，即单层石墨烯修饰的基片；
（3）在芯片反应器中加入炔基修饰的石墨烯及去离子水，分散，放入步骤（2）中的单层石墨烯修饰的基片，加入20-50%炔基修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到双层石墨烯修饰的基片；
（4）在芯片反应器中加入叠氮基修饰的石墨烯及去离子水,分散，放入步骤（3）中的双层石墨烯修饰的基片，加入20-50%叠氮修饰石墨烯质量的催化剂反应，得到三层石墨烯修饰的基片；
（5）重复步骤（3）和步骤（4），得到多层石墨烯修饰的基片；
（6）在一芯片反应器中放入步骤（5）中的多层石墨烯修饰的基片，加入固定修饰剂、催化剂及溶剂，反应得到多层石墨烯传感生物芯片。
2.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述叠氮基修饰的石墨烯的制备方法包括如下步骤：
（2-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至60～80℃，加入水合肼，继续保温反应18～24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，然后在60～70℃下干燥，得到石墨烯；
（2-2）在反应器中加入步骤（2-1）中得到的石墨烯及乙醇-水混合溶剂，分散，随后加入（3-溴丙基）三乙氧基硅烷、（3-氯丙基）三乙氧基硅烷、（3-溴丙基）三甲氧基硅烷或（3-氯丙基）三甲氧基硅烷，加入后的浓度为1-15mmol/L，于30～60℃下反应3～6小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到卤素修饰的石墨烯；
（2-3）取步骤（2-2）中得到的卤素修饰的石墨烯分散于去离子水中，加入叠氮化钠，加入后的浓度为1-10mmol/L，在80～90℃下反应10～14小时，离心并用去离子水清洗，干燥，得到叠氮基修饰的石墨烯。
3.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述炔基修饰的石墨烯的制备方法包括如下步骤：
（3-1）把氧化石墨烯分散于去离子水中，升温至60～80℃，加入水合肼，继续保温反应18～24小时，过滤，用甲醇及去离子水反复冲洗，在60～70℃下干燥，得到石墨烯；
（3-2）在反应器中加入步骤（3-1）得到的石墨烯及去离子水，分散，随后加入摩尔比为（5-10）：1：（10-30）的对氨基苯甲酸、亚硝酸钠及硝酸，在50～70℃下反应2～5小时，离心并用去离子水清洗，得到羧基修饰的石墨烯；
（3-3）将步骤（3-2）得到的羧基修饰的石墨烯分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺于常温反应30～60分钟，二环己基碳二亚胺在加入后浓度为1-5mmol/L，然后加入丙炔胺，继续反应2～5小时，得到炔基修饰的石墨烯。
4.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（6）中，所述固定修饰剂的制备方法包括如下步骤：在反应器中加入摩尔比为1：1：2:200的丙炔溴、对氨基苯甲酸、碳酸钾及N,N-二甲基甲酰胺，于5～10℃下反应2～5小时，移除溶剂，得到固定修饰剂。
5.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述表面镀金或镀银的玻璃基片为支撑层。
6.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（2）、（3）和（4）中，所述的催化剂均为摩尔比为1:1的卤化铜及抗坏血酸钠。
7.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（2）、（3）、（4）和（6）中，所述反应的温度范围均为20～50℃；所述反应的时间范围均为0.5～2小时。
8.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（6）中，所述的催化剂为卤化亚铜及2,2’-联吡啶；溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
9.根据权利要求1所述的多层石墨烯传感生物芯片的制备方法，其特征在于：在步骤（6）中，所述催化剂与固定修饰剂的摩尔比为（0.01-0.5）：1；所述固定修饰剂加入后的浓度为1-10mmol/L。
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