CN108585543A - 一种生物传感三维芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物分析领域，具体是一种生物传感三维芯片及其制备方法。本发明的生物传感三维芯片具有支撑层、锚定层、点击修饰层及高分子刷层，且其中锚定层通过Au‑S键或Ag‑S键锚定结合于支撑层上，点击修饰层通过共价键结合于锚定层上，高分子刷层通过点击反应共价结合于点击修饰层上。在制备的过程中，本发明使用“接枝到(graft to)”的方法来构建高分子刷层，较好的控制高分子刷的分子量、提升芯片制备工艺过程的可重复性及芯片质量的稳定性；本发明通过点击化学来实现“接枝到(graft to)”的方法，以制备高接枝密度的高分子刷层的生物传感三维芯片。本发明最终得到的生物传感三维芯片具有载样量高、特异性强的特点。

Description

一种生物传感三维芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物分析领域，具体是一种生物传感三维芯片及其制备方法。
背景技术
生物芯片是基因组计划的产物，它主要通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对待分析样品的检测，但因其存在敏感性不高、特异性不够强等缺点，在一定程度限制了其应用。生物传感器是现代科技的前沿技术之一，已成为现代生物技术的重要领域之一；而生物传感芯片则组合了生物芯片和生物传感器两种技术的优点，其不但提高了检测效率，还提升了检测的灵敏度及增强了对分析样品的特异性识别。
目前，大多生物传感芯片是二维的生物传感芯片，即在传感芯片表面结合一单分子自组装层，就能实现生物传感芯片的基本功能，但其存在载样量较低、特异性较弱的缺点。
为了克服这些问题，三维传感芯片的开发与应用已成为趋势，但是目前三维生物传感芯片的制备方法都是基于“接枝于(graft from)”的技术，制备方法的相对单一在一定程度上限制了三维生物传感芯片的多样性及应用。
因此，寻找一种新的生物传感三维芯片的制备方法是当务之急。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种生物传感三维芯片及其制备方法。
一种生物传感三维芯片，包括支撑层、锚定层、点击修饰层及高分子刷层，其中锚定层通过Au-S键或Ag-S键锚定结合于支撑层上，点击修饰层通过共价键结合于锚定层上，高分子刷层通过点击反应共价结合于点击修饰层上。
所述的生物传感三维芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)以表面镀有金膜或银膜的基片为支撑层，清洁其表面，把清洁的基片浸泡于1-10mM的锚定剂的乙醇溶液中，在自组装的驱动下，使锚定剂在基片表面形成自组装单分子锚定层；
(2)把步骤(1)中得到的含自组装单分子锚定层的基片浸泡于含点击修饰剂的溶液中，于常温下反应6-24h，清洗芯片，得到表面进行点击化修饰后的基片；
(3)将2-溴异丁酸乙酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、催化剂、甲醇-水混合溶液进行混合，在氮气或氩气的保护下，于30-50℃下，反应8-16h，得到共聚物；
(4)步骤(3)得到的共聚物溶解于溶剂中，加入叠氮化钠，于25-55℃下，反应10-24h，得到叠氮基团修饰的共聚物；
(5)将步骤(4)中叠氮基团修饰的共聚物加入溶剂中，搅拌使其溶解，在氮气或氩气的保护下，加入催化剂，放入步骤(2)中得到的表面进行点击化修饰后的基片，于20-50℃下，反应0.5-2h，通过点击反应以“接枝到(graft to)”的方法使高分子刷层接枝到基片表面，得到表面接枝高分子刷的芯片。
所述步骤(1)中，锚定剂的结构式为：
其中n为6-110的正整数。
该锚定剂能通过-SH与金或银表面形成共价键，进而通过分子自组装形成单分子自组装层，为基片的进一步修饰提供官能基团。所述步骤(2)中，点击修饰剂为：
其中n为1-4的正整数，X为Cl或Br。
该点击修饰剂能在基片表面引入点击官能团，为三维芯片的修饰提供活性连接点。
所述步骤(3)，聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、催化剂、甲醇-水混合溶液的混合摩尔比为：(0.005-0.02)(0.5-1.5)：(1-3)：(0.02-0.2)：(200-400)，优选的混合摩尔比为：0.01:1:1:0.02:200。
所述步骤(3)中，聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体的结构式为：
其中n为6-12的正整数。
所述步骤(3)中，催化剂为卤化铜与抗坏血酸钠的混合物，优选的卤化铜与抗坏血酸钠的摩尔比为1:(1-2)。在此催化剂的作用下，进行原子转移自由基聚合(Atom TransferRadical Polymerization，ATRP)，使得聚合物的分子量可控。
所述步骤(3)中，甲醇-水混合溶液中甲醇-水的摩尔份比例为(1-3)：1。在此混合溶剂的环境下，反应得到聚合物分子量的均一性更好。
所述步骤(2)、(4)、(5)中，溶剂均为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)中的一种。
所述步骤(5)中，催化剂为卤化亚铜与五甲基二乙烯三胺(PMDETA)的混合物，优选的卤化亚铜与五甲基二乙烯三胺(PMDETA)的摩尔比为1:(1-2)。此催化反应为典型的点击反应，在室温下就能快速的进行，同时转化率也非常。
优选的，还包括步骤(6)，将步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片浸泡于含有丁二酸酐或者戊二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在40℃下反应9小时，清洗芯片，得到表面羧基化的生物传感三维芯片。步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片的表面是含羟基的表面，较难链接生物大分子，经过步骤(6)的处理后，使其表面羧基化，能更好的连接生物大分子。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明所制备生物传感三维芯片的整个传感界面包括支撑层、锚定层、点击修饰层及高分子刷层。其中高分子刷层是通过“接枝到(graft to)”的方法来构建。相对于“接枝于(graft from)”的方法，“接枝到(graftto)”更容易控制高分子刷的分子量、芯片制备工艺过程的可重复性及芯片质量的稳定性。
(2)本发明所用到“接枝到(graft to)”的方法是通过点击化学来实现的，点击化学具有条件温和、反应高效及正交的优点，因此能够制备高接枝密度的高分子刷层的生物传感三维芯片。
(3)本发明所制备的生物传感芯片具有三维的特性，一般二维生物传感芯片是只有一层单分子自组装层，而三维生物传感芯片是由高分子刷层来构建的，其具有载样量高、特异性强的特点。
附图说明
图1为该生物传感三维芯片的结构示意图。
图2为对比实验1中实施例1表面羧基化的生物传感三维芯片与对比例1表面羧基化的二维芯片的固载量及SPR信号。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
(1)把镀有金膜的玻璃基片放于等离子体清洗机中清洗10分钟，将清洗后的镀金玻璃基片浸泡于总浓度为1mM的锚定剂(分子量约为400)乙醇溶液中，在自组装的驱动下，在基片表面形成自组装单分子锚定层；
(2)把步骤(1)中得到的含自组装单分子锚定层的基片浸泡于3-溴丙炔的乙酸乙酯溶液中，于常温反应6小时，清洗芯片，得到表面炔基官能团修饰的基片；
(3)在一反应瓶中加入0.01摩尔份的2-溴异丁酸乙酯、1摩尔份的聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体及1摩尔份的甲基丙烯酸羟乙酯单体、0.01摩尔份的氯化铜、0.01摩尔份的抗坏血酸钠、100摩尔份的甲醇及100摩尔份的去离子水。在氮气的保护下，于30℃下反应16小时，得到共聚物；
(4)步骤(3)得到的共聚物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入叠氮化钠，于25℃下反应24小时，得到叠氮基团修饰的共聚物；
(5)在一芯片反应器中加入叠氮基团修饰的共聚物及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5分钟溶解，在氮气的保护下，加入氯化亚铜及五甲基二乙烯三胺(PMDETA)，放入炔基官能团修饰的基片，于20℃下反应2小时，通过点击反应以“接枝到(graft to)”的方法制备得到表面接枝高分子刷的芯片；
(6)将步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片浸泡于含有丁二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在40℃下反应9小时，清洗芯片，得到表面羧基化的生物传感三维芯片。
实施例2
(1)把镀有银膜的玻璃基片放于等离子体清洗机中清洗10分钟，将清洗后的镀金玻璃基片浸泡于总浓度为10mM的锚定剂(分子量约为1000)乙醇溶液中，在自组装的驱动下，在基片表面形成自组装单分子锚定层；
(2)把步骤(1)中得到的含自组装单分子锚定层的基片浸泡于6-溴正己炔的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，于常温反应24小时，清洗芯片，得到表面炔基官能团修饰的基片；
(3)在一反应瓶中加入0.02摩尔份的2-溴异丁酸乙酯、1摩尔份的聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体及2摩尔份的甲基丙烯酸羟乙酯单体、0.03摩尔份的氯化铜、0.03摩尔份的抗坏血酸钠、300摩尔份的甲醇及100摩尔份的去离子水。在氮气的保护下，于50℃下反应8小时，得到共聚物；
(4)步骤(3)得到的共聚物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，加入叠氮化钠，于55℃下反应10小时，得到叠氮基团修饰的共聚物；
(5)在一芯片反应器中加入叠氮基团修饰的共聚物及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5分钟溶解，在氮气的保护下，加入溴化亚铜及五甲基二乙烯三胺(PMDETA)，放入炔基官能团修饰的基片，于50℃下反应0.5小时，通过点击反应以“接枝到(graft to)”的方法制备得到表面接枝高分子刷的芯片；
(6)将步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片浸泡于含有戊二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在40℃下反应9小时，清洗芯片，得到表面羧基化的生物传感三维芯片。
实施例3
(1)把镀有金膜的玻璃基片放于等离子体清洗机中清洗10分钟，将清洗后的镀金玻璃基片浸泡于总浓度为5mM的锚定剂(分子量约为10000)乙醇溶液中，在自组装的驱动下，在基片表面形成自组装单分子锚定层；
(2)把步骤(1)中得到的含自组装单分子锚定层的基片浸泡于4-氯正丁炔的四氢呋喃(THF)溶液中，于常温反应16小时，清洗芯片，得到表面炔基官能团修饰的基片；
(3)在一反应瓶中加入0.005摩尔份的2-溴异丁酸乙酯、1摩尔份的聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体及3摩尔份的甲基丙烯酸羟乙酯单体、0.1摩尔份的氯化铜、0.1摩尔份的抗坏血酸钠、200摩尔份的甲醇及100摩尔份的去离子水。在氮气的保护下，于40℃下反应12小时，得到共聚物；
(4)步骤(3)得到的共聚物溶解于四氢呋喃(THF)中，加入叠氮化钠，于45℃下反应15小时，得到叠氮基团修饰的共聚物；
(5)在一芯片反应器中加入叠氮基团修饰的共聚物及四氢呋喃(THF)，搅拌5分钟溶解，在氮气的保护下，加入溴化亚铜及五甲基二乙烯三胺(PMDETA)，放入炔基官能团修饰的基片，于40℃下反应1小时，通过点击反应以“接枝到(graft to)”的方法制备得到表面接枝高分子刷的芯片；
(6)将步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片浸泡于含有戊二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在40℃下反应9小时，清洗芯片，得到表面羧基化的生物传感三维芯片。
对比例1
把镀有金膜的玻璃基片放于等离子体清洗机中清洗10分钟，将清洗后的镀金玻璃基片浸泡于总浓度为1mM的11-巯基-1-十一烷酸的乙醇溶液中，在自组装的驱动下，在基片表面形成自组装单分子层，清洗芯片，得到表面羧基化的二维芯片。
对比例2
把镀有银膜的玻璃基片放于等离子体清洗机中清洗10分钟，将清洗后的镀金玻璃基片浸泡于总浓度为1mM的11-巯基-1-十一烷酸的乙醇溶液中，在自组装的驱动下，在基片表面形成自组装单分子层，清洗芯片，得到表面羧基化的二维芯片。
对比实验1
将实施例1表面羧基化的生物传感三维芯片及对比例1表面羧基化的二维芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为3μL/s，基线稳定后，依次通入EDC/NHS的水溶液、PBS、人lgG，随后依次通入PBS、羊抗人lgG(anti-lgG)、PBS。如图2，相对于对比例1，实施例1表面羧基化的生物传感三维芯片有更高的固载量及更大的信号反馈。
对比实验2
将实施例2表面羧基化的生物传感三维芯片及对比例2表面羧基化的二维芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为3μL/s，基线稳定后，依次通入EDC/NHS的水溶液、PBS、人lgG，随后依次通入PBS、羊抗人lgG(anti-lgG)、PBS。
对比实验3
将实施例1表面羧基化的生物传感三维芯片及对比例1表面羧基化的二维芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为2μL/s，基线稳定后，通入2mg/mL的人lgG，随后通入PBS。实施例1表面羧基化的生物传感三维芯片对人lgG有很好的抗非特异性吸附作用，对比例1表面羧基化的二维芯片对人lgG有一定的非特异性吸附吸附。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物传感三维芯片，其特征在于，包括支撑层、锚定层、点击修饰层及高分子刷层，其中锚定层通过Au-S键或Ag-S键锚定结合于支撑层上，点击修饰层通过共价键结合于锚定层上，高分子刷层通过点击反应共价结合于点击修饰层上。
2.根据权利要求1所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以表面镀有金膜或银膜的基片为支撑层，清洁其表面，把清洁的基片浸泡于1-10mM的锚定剂的乙醇溶液中，在自组装的驱动下，使锚定剂在基片表面形成自组装单分子锚定层；
(2)把步骤(1)中得到的含自组装单分子锚定层的基片浸泡于含点击修饰剂的溶液中，于常温下反应6-24h，清洗芯片，得到表面进行点击化修饰后的基片；
(3)将2-溴异丁酸乙酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、催化剂、甲醇-水混合溶液进行混合，在氮气或氩气的保护下，于30-50℃下，反应8-16h，得到共聚物；
(4)步骤(3)得到的共聚物溶解于溶剂中，加入叠氮化钠，于25-55℃下，反应10-24h，得到叠氮基团修饰的共聚物；
(5)将步骤(4)中叠氮基团修饰的共聚物加入溶剂中，搅拌使其溶解，在氮气或氩气的保护下，加入催化剂，放入步骤(2)中得到的表面进行点击化修饰后的基片，于20-50℃下，反应0.5-2h，通过点击反应以“接枝到(graft to)”的方法使高分子刷层接枝到基片表面，得到表面接枝高分子刷的芯片。
3.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，锚定剂的结构式为：
其中n为6-110的正整数。
4.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，点击修饰剂为：
其中n为1-4的正整数，X为Cl或Br。
5.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)，2-溴异丁酸乙酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、催化剂、甲醇-水混合溶液的混合摩尔比为：(0.005-0.02)：(0.5-1.5)：(1-3)：(0.02-0.2)：(200-400)。
6.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体的结构式为：
其中n为6-12的正整数。
7.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，催化剂为卤化铜与抗坏血酸钠的混合物。
8.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)、(4)、(5)中，溶剂均为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)中的一种。
9.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，催化剂为卤化亚铜与五甲基二乙烯三胺(PMDETA)的混合物。
10.根据权利要求2所述的生物传感三维芯片的制备方法，其特征在于，还包括步骤(6)，将步骤(5)得到的表面接枝高分子刷的芯片浸泡于含有丁二酸酐或者戊二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在40℃下反应9小时，清洗芯片，得到表面羧基化的生物传感三维芯片。
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