CN108085236A - 一种可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱的制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱及其制备和应用，属于功能生物色谱材料，及其制备与应用领域。所述的毛细管柱的制备方法包括：(1)毛细管内表面预处理；(2)毛细管内表面硅烷化；(3)毛细管内表面聚合物修饰；(4)特异性结合肿瘤细胞的核酸适配体在毛细管内表面的修饰。本发明所提供的用于特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱，结合了毛细管柱的高通量性和核酸适配体的特异性识别性能，所得到固定相稳定性和重现性好，可以在简单和复杂环境中实现对肿瘤细胞的识别和捕获。

Description

一种可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱的制备与应用
技术领域
本发明属于功能性生物材料，及其制备技术及其在细胞识别、捕获和释放中的应用，具体的说是一种新型的可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱，及其制备和应用。
背景技术
实现血液中肿瘤细胞的早期检测是发现肿瘤早期转移的新方法，具有无创且比传统方法如临床表现、影像学表现及血清标志物更可靠等优点。但是，在肿瘤发生早期，肿瘤患者血液中肿瘤细胞数量很少，而且由于其来源不同和上皮间质转化等作用，导致肿瘤细胞表面的生物标志物多种多样，所以实现对CTCs细胞的直接检测十分困难(CatherineAlix-Panabières et al,Nature Review Cancer,2014,14,623-631)。因此，实现肿瘤细胞的的早期检测的前提是从血液中识别和捕获到目标肿瘤细胞。
目前捕获肿瘤细胞的技术主要分为两大类。一类是基于免疫原理的技术。这类技术或者利用针对肿瘤细胞的抗体实现对血液中相应的肿瘤细胞的捕获，或者利用针对白细胞的抗体将白细胞去除实现间接捕获肿瘤细胞的目的。但是，由于肿瘤细胞表面的标志物表达的不确定性，导致抗体的筛选十分困难，特异性较差，而且该方法通量比较低，耗时。被捕获细胞的活性也会受到影响，无法与后续细胞检测和分析兼容(Pantel,Klaus et al,Cancer research 2013,73,6384-6388)。另一类是基于物理性质的技术。这类技术利用肿瘤细胞和血细胞在密度、大小和带电性等方面的差异，通过过滤、离心和电泳等方法实现肿瘤细胞的捕获。但是，由于肿瘤细胞具有可变形性和大小不均一性等特点，所以采用该方法特异性较差，得到的肿瘤细胞的纯度和灵敏度不高(Sollier Elodie et al,Lab on aChip 2014,14,63-77.)。因此，开发一种既能够高通量的特异性的捕获肿瘤细胞、又能够与后续肿瘤细胞检测和分析兼容的技术就显得十分重要。
核酸适配体是指以肿瘤细胞为目标，通过指数富集配基的系统进化技术筛选得到的能够特异性结合肿瘤细胞的单链寡聚核苷酸，具有特异性强、稳定性高和毒性小等优点，有望成为抗体的理想替代品(Ellington A D et al,Nature,1990,346,818-822.)。而毛细管柱在实现对目标物分离和富集方面具有速度快、通量高、与色谱技术和质谱技术兼容性好等优点，可以实现对肿瘤细胞的高通量捕获和肿瘤细胞的在线检测和分析等目的。因此，将核酸适配体技术与毛细管柱联用在建立一种快速、简便和精确的肿瘤细胞捕获、释放和检测与分析一体化平台方面具有巨大潜力。
针对目前复杂环境中肿瘤细胞捕获与检测方面的问题，以及核酸适配体技术和毛细管柱在解决上述问题方面的优势，通过将毛细管柱进行预处理、硅烷化修饰、聚合物层修饰和核酸适配体修饰，制备了一种可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱，并将其应用到了血液中肿瘤细胞的识别与捕获过程中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱的制备及其应用。本发明提供的可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱结合了毛细管柱的高通量性和核酸适配体的特异性识别性能，所得到固定相稳定性和重现性好，可以在简单和复杂环境中实现对肿瘤细胞的识别和捕获。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种可特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱的制备方法包括如下步骤：
(总体而言：1.此部分为权利要求的正序即可，但可以扩充一些技术细节，但是不能超过权利要求的范围。2.权利要求改了之后，对此此处的修改。)
(1)毛细管的预处理：通过手动注射泵、自动注射泵、真空负压或气体正压方式将无机碱或无机酸中的一种或二种以上灌入毛细管中对毛细管内表面进行活化处理，使其表面带有羟基活性基团，易于后续硅烷化修饰。无机碱或无机酸的摩尔浓度范围为0.1M-10M，活化时间为0.5h-12h。
(2)毛细管的硅烷化修饰：通过手动注射泵、自动注射泵、真空负压或气体正压方式将硅烷化偶联剂灌入预处理过的毛细管中，利用硅烷化偶联剂与毛细管内表面的醇羟基反应，将带有氨基、氯基、溴基、烯基或环氧基中的一种或二种以上基团的硅烷化偶联剂修饰于毛细管内表面。其中硅烷化偶联剂包括硅烷化修饰是指在已经过预处理的毛细管内表面通过硅烷化反应修饰上γ-氨丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三异丙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-巯丙基三甲氧基硅烷、3-(三甲氧基硅烷)丙基-2-溴-2-甲基丙烯酸酯、3-氯-2-羟丙基甲基丙烯酸酯中的一种或二种以上。硅氧烷的体积浓度范围为20％-100％，硅烷化时间为0.5h-72h，硅烷化温度为15℃-200℃。分散硅氧烷的溶剂为甲醇、乙醇、水或甲苯中一种或二种以上。
(3)毛细管的聚合物层修饰：通过手动注射泵、自动注射泵、真空负压或气体正压方式将甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯经过光聚合、热聚合、自由基聚合或缩合反应中的一种或二种以上形成的高分子层。其中，可聚合的单体包括丙烯酸类、丙烯酰胺类、苯硼酸类、巯基类、醛基类、环氧类。可聚合单体的质量浓度为1％-40％，聚合物修饰温度为15℃-80℃，聚合物修饰时间为0.5h-72h。分散可聚合单体的溶剂为甲醇、乙醇、环己醇、水、甲苯、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或二种以上。
(4)毛细管的核酸适配体修饰：通过手动注射泵、自动注射泵、真空负压或气体正压方式将3’端或5’端中的一种或二种以上被巯基、丙烯酰基、氨基、羧基、醛基或环氧基中的一种或二种以上修饰的能够特异性识别肿瘤细胞的核酸适配体经光聚合、热聚合、自由基聚合或缩合中的一种或二种以上修饰在毛细管内表面。
(5)将该毛细管柱用于生物相关领域内细胞的选择性识别、捕获或释放。
本发明是一种基于核酸适配体特异性识别肿瘤细胞的能力和毛细管柱高通量性能以及易于实现在线检测分析的性能的核酸适配体功能化的毛细管柱。该毛细管柱能对目标细胞进行特异性识别、捕获、释放和富集。当核酸适配体修饰在毛细管内表面后，目标肿瘤细胞通过毛细管时，由于核酸适配体与细胞二者之间存在生物亲和力，目标肿瘤细胞被捕获到毛细管内表面，非目标细胞由于与核酸适配体之间不存在亲和力而不被捕获，最终实现特异性捕获肿瘤细胞的目的。
本发明具有如下优点：
(1)本发明利用核酸适配体技术和毛细管修饰技术制备得到了能用于特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱。利用核酸适配体的高特异性识别能力和毛细管的高通量分析能力，提高了细胞识别和捕获的纯度、灵敏度和效率，降低了捕获细胞时非目标细胞的干扰作用。
(2)本发明中所用的核酸适配体以及所制备的固定相具有良好的稳定性和生物兼容性，有利于保证在复杂环境中对肿瘤细胞的捕获效果，有利于保证被捕获细胞的活性，进而有利于对肿瘤细胞的后续检测与分析。
(3)本发明中所制备的毛细管柱及其固定相具有速度快、通量高、与色谱技术和质谱技术兼容性好等优点，可以实现对肿瘤细胞的高通量捕获和肿瘤细胞的在线检测和分析等目的。
(4)本发明中的核酸适配体功能化的毛细管柱的制备流程简单，易于操作。相较于其他细胞识别与捕获方法，采用该毛细管柱能简化识别过程，提高识别效率，易于建立一种快速、简便和精确的肿瘤细胞捕获、释放和检测与分析一体化平台。
附图说明：
图1：毛细管内表面聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层的扫描电镜图
图2：柠檬酸还原法制备金纳米粒子透射电镜图
图3：金纳米粒子修饰前后毛细管柱的照片图
图4：从核酸适配体功能化毛细管柱中释放的SMMC-7721细胞的SDS-PAGE图
具体实施方式
实施例1
一种特异性捕获SMMC-7721细胞的毛细管柱(AC1)的制备
将长度为5m，内径为100μm的毛细管柱用1M的氢氧化钠溶液活化1小时后，用去离子水冲洗至中性。然后用1M的盐酸溶液继续活化毛细管，1小时后用去离子水冲洗至中性。接着用甲醇置换去离子水后，将毛细管用氮气吹干。将原子转移自由基聚合反应的链式引发剂3-(三甲氧基硅烷)丙基-2-溴-2-甲基丙烯酸酯与甲醇等体积混合后灌入活化后的毛细管柱中，将毛细管密封后置于50℃真空干燥箱中反应12小时。接着用甲醇冲洗修饰有引发剂的毛细管柱，氮气吹干备用。
分别称取0.0007g氯化铜和0.0050g氯化亚铜于10ml的离心管中，超声2s后，加入15.66μl的五甲基二乙烯三胺，超声2s后，加入0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯，超声混匀5分钟后，加入3.8607g环己醇。将上述溶液混匀后，迅速采用氮气灌柱的方法将溶液灌入修饰有引发剂的毛细管柱，然后置于30℃水浴中，反应1h，然后用甲醇冲洗后利用扫描电镜观察(图1)。
将质量比为1％的氯金酸溶于2ml水中后加至50ml水中煮沸，然后加入5ml的含38.8mmol的柠檬酸钠的水溶液，磁力搅拌(700rpm)，110℃回流30min后，冷却至室温，4℃保存备用(图2)。
将0.2252g胱胺二盐酸盐溶于1ml的1M的氢氧化钠溶液后通入毛细管中，50℃反应6小时。用去离子水冲洗至中性后，用1ml的1M的Tris-HCl封尾2小时。用去离子水冲洗至中性。接着将0.071g三羧甲基磷酸溶于1ml去离子水中，加入100μl浓度为28％的氨水溶液混匀后灌入毛细管中室温反应2小时。用去离子水冲洗至中性后，将金纳米粒子溶液恒流通入毛细管柱直至达到吸附饱和为止。然后用去离子水将毛细管中过量的金纳米粒子去除后备用(图3)。
将50μl浓度为1mg/ml的链霉亲和素水溶液加至450μlPBS溶液中混匀后，在4℃时，恒流通入毛细管中，流速为9μl/h。接着用200μl去除未吸附的链霉亲和素，流速为100μl/h。
在4℃时，将500μl浓度为1μM对SMMC-7721细胞具有特异性识别能力的生物素修饰的核酸适配体(ZY sls)通入毛细管中，流速为20μl/h。接着用200μl水去除未吸附的核酸适配体，流速为100μl/h，得到核酸适配体功能化毛细管柱。
实施例2
生物素修饰的适配体功能化毛细管柱(AC1)用于识别与捕获SMMC-7721细胞
准备五份各1米长的AC1，然后分别向AC1中灌入含牛血清蛋白(BSA)的缓冲液中封闭非特异性吸附。30分钟后，将五份1毫升分别含1×105,1×104,1×103和1×102个SMMC-7721细胞的细胞悬液以每小时1毫升的速度通入AC1中。1小时后，用缓冲液洗去非特异性吸附的细胞。接着采用生物素竞争法释放被AC1捕获的SMMC-7721细胞。将释放的细胞冻干后进行SDS-PAGE分析(图4)。结果表明，在不同细胞浓度下，AC1均能快速、高校和高灵敏的识别与捕获SMMC-7721细胞的捕获。进一步将SMMC-7721细胞加入到人体血液样本中，按照上述方法，AC1也实现了从血液中特异性的识别和捕获SMMC-7721细胞。
实施例3
巯基修饰的核酸适配体功能化聚合物修饰的毛细管柱(AC2)的制备
同实施例1，首先制备金纳米粒子修饰的毛细管柱，然后在4℃时，将500μl浓度为1μM对SMMC-7721细胞具有特异性识别能力的巯基修饰的核酸适配体(ZY sls)通入毛细管中，流速为20μl/h。接着用200μl水去除未吸附的核酸适配体，流速为100μl/h，得到巯基修饰的核酸适配体功能化的毛细管柱(AC2)。
实施例4
羧基修饰的核酸适配体功能化硅氨烷修饰的毛细管柱(AC3)的制备
同实施例1，首先将毛细管柱预处理，然后将γ-氨丙基三乙氧基硅烷与甲醇等体积混合后灌入活化后的毛细管柱中，将毛细管密封后置于50℃真空干燥箱中反应12小时。接着用甲醇冲洗修饰有引发剂的毛细管柱，氮气吹干得到硅氨烷修饰的毛细管柱。然后通过酰胺反应将对CCRF-CEM细胞具有特异性识别能力的羧基修饰的核酸适配体(Sgc8)修饰于毛细管柱中得到羧基修饰的核酸适配体功能化硅氨烷修饰的毛细管柱(AC3)。
实施例5
丙烯酰基修饰的核酸适配体功能化乙烯基硅氧烷修饰的毛细管柱(AC4)的制备
同实施例4，将γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰在毛细管内。然后通过自由基反应将对Ramos细胞具有特异性识别能力的丙烯酰基修饰的核酸适配体(TD05)修饰于毛细管柱中得到丙烯酰基修饰的核酸适配体功能化乙烯基硅氧烷烷修饰的毛细管柱(AC4)。
实施例6
巯基修饰的核酸适配体功能化支化聚乙烯亚胺修饰的毛细管柱(AC5)的制备
同实施例1，将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰在毛细管内制备成聚合物层修饰的毛细管柱。然后将浓度为20％的支化聚乙烯亚胺溶液通入毛细管柱中，在80℃反应16小时。用甲醇和去离子水先后洗涤去除未反应的支化聚乙烯亚胺。将浓度10mg/ml的碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯通入毛细管内与聚乙烯亚胺反应6h。然后用甲醇和去离子水先后洗涤。最后将500μl浓度为1μM对SMMC-7721细胞具有特异性识别能力的巯基修饰的核酸适配体(ZYsls)通入毛细管中，流速为20μl/h。接着用200μl去除未吸附的核酸适配体，流速为100μl/h，得到巯基修饰的核酸适配体功能化的毛细管柱(AC5)。
实施例7
巯基修饰的核酸适配体功能化丙烯酰氧基修饰的毛细管柱(AC6)的制备
同实施例4，将甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰在毛细管内。然后通过点击化学反应，在常温三乙胺的催化作用下，将巯基修饰的对HL60细胞具有特异性识别能力的核酸适配体(KH1C12)修饰于毛细管柱中得到巯基修饰的核酸适配体功能化丙烯酰氧基修饰的毛细管柱(AC6)。
实施例8
丙烯酰基修饰的核酸适配体功能化巯基修饰的毛细管柱(AC7)的制备
同实施例1，制备含有巯基的毛细管柱。然后通过点击化学反应，在常温三乙胺的催化作用下，将丙烯酰基修饰的对HL60细胞具有特异性识别能力的核酸适配体(KH1C12)修饰于毛细管柱中得丙烯酰基修饰的核酸适配体功能化巯基修饰的毛细管柱(AC7)。

Claims (9)

1.一种用于特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱，其特征在于：
将毛细管内表面进行预处理后，对其内表面进行硅烷化修饰，接着在毛细管内表面修饰聚合物层，然后在聚合物层上修饰对肿瘤细胞具有特异性识别能力的核酸适配体，得到可用于肿瘤细胞特异性捕获的毛细管柱。
2.如权利要求1所述的毛细管柱，其特征在于：
毛细管包括玻璃或金属毛细管。
3.如权利要求1所述的毛细管柱，其特征在于：
预处理是指采用无机碱或无机酸中的一种或二种以上对毛细管内表面进行活化处理；无机碱或无机酸的摩尔浓度范围为0.1M-10M，活化时间为0.5h-12h。
4.如权利要求1所述的毛细管柱，其特征在于：
硅烷化修饰是指在已经过预处理的毛细管内表面通过硅烷化反应修饰上γ-氨丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三异丙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-巯丙基三甲氧基硅烷、3-(三甲氧基硅烷)丙基-2-溴-2-甲基丙烯酸酯、3-氯-2-羟丙基甲基丙烯酸酯中的一种或二种以上；硅烷化修饰液中硅氧烷的体积浓度范围为20％-100％，硅烷化时间为0.5h-72h，硅烷化温度为15℃-200℃。
5.如权利要求1所述毛细管柱，其特征在于：
聚合物层修饰是指在硅烷化修饰的毛细管内表面通过光聚合、热聚合、自由基聚合或缩合方式中的一种或二种以上修饰含有羧基、氨基、环氧基或醛基中的一种或二种以上基团的聚合物层；聚合物层修饰液中可聚合单体的质量浓度为1％-40％，聚合物修饰温度为15℃-80℃，聚合物修饰时间为0.5h-72h。
6.如权利要求1所述的毛细管柱，其特征在于：
核酸适配体的修饰是指在硅烷化修饰的毛细管或聚合物层修饰的毛细管内表面通过自由基聚合或缩合反应中的一种或二种以上修饰能够特异性识别肿瘤细胞的核酸适配体；所述的用于修饰在毛细管内壁的核酸适配体的核苷酸序列的3’端或5’端中的一种或二种以上被巯基、丙烯酰基、氨基、羧基、醛基或环氧基中的一种或二种以上修饰。
7.如权利要求1或5所述的毛细管柱，其特征在于：
聚合物是由甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯中的一种或二种以上聚合形成。
8.如权利要求1或6所述的毛细管柱，其特征在于：
核酸适配体是指以肿瘤细胞为目标，通过指数富集配基的系统进化技术筛选得到的能够特异性结合肿瘤细胞的单链寡聚核苷酸；具体为ZY sls、Anti-EGFR、SYL3C、S6、A9、A10、YJ-1、APTmuc、TD05、TE02、Sgc8、Sgd5、KDED2a-3、KCHA10、KH1C12中的一种或二种以上。
9.一种权利要求1-8任一所述特异性捕获肿瘤细胞的毛细管柱用于肿瘤细胞的选择性识别、捕获或释放。
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