CN107486270B - 基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法 - Google Patents

基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法 Download PDF

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Abstract

在本发明提供的一种基于球‑刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，基于球‑刷双层纳米结构基底的微阵列芯片的制备方法具有通用性，方法简便，设备需求少，适宜进行大批量生产；且本发明提供的基于球‑刷双层纳米结构基底的微阵列芯片可以实现对核苷酸与核苷酸、糖与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用的分析检测，具有简便、样品消耗少、灵敏度高等优点。实验结果表明：利用本方法制备的糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素‑120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测限为1ng/mL，DNA微阵列芯片对靶标DNA的检测限为0.1nmol/L，糖蛋白微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素‑120的检测限为0.3ng/mL，抗体微阵列芯片对CY5修饰兔抗人抗体的检测限为10pg/mL。

Description

基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法
技术领域
本发明设计生物医疗领域，尤其涉及一种基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法。
背景技术
微阵列芯片是目前基因组学、蛋白质组学和糖组学研究的重要工具，主要通过机械手臂点样技术或微电子光刻技术在平方厘米量级的固相载体表面构建成千上万个不同探针分子点阵，以实现对核酸、蛋白、糖类以及其他生物组分准确、快速和大信息量的检测，具有高通量、自动化、样品消耗量小等优点(Nucleic Acids Res.,2014,43,D82–D86；Nat.Struct.Mol.Biol.,2015,22(8),603–610；Nat.Protoc.,2015,10(5),756–767)。
目前，生物芯片主要以氨基、醛基、环氧基或聚赖氨酸修饰的平板玻片为载体，但二维(2D)平板基底限制了探针的固定量，在分析检测应用中具有较差的检测灵敏度。与二维基底相比，三维基底能够有效地提高探针的固定量和固定分子的空间分布，有效增强表面固定分子与特异性识别分子的键合力(Lab on a Chip,2014,14(14),2505–2514；Biotechnol.Bioeng.,2004,87(1),99–103.)。
硅球是一类尺寸可控、单分散性好、表面形貌相似、易合成易修饰的材料，通过简单的自组装方法能够提供均匀、表面积大的球状纳米结构表面(Anal.Chem.2011,83,6800–6809；Acs Nano 2013,7(11),9997–10010)。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷是一类灵活的柔性材料，并带有大量的环氧基团，在温和的实验条件下能够与氨基基团发生自发反应，实现各类生物分子的直接固定(ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,9552–9556；ACSAppl.Mater.Interfaces 2017,9,8985-8995)。然而，目前对于在硅球表面修饰聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，通过表面引发原子转移自由基聚合法在硅球表面生长浓密的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷，能够提供一种具有三维结构的球-刷双层纳米结构基底，有效提高探针分子的固定量和识别靶标分子的易接近性，从而有效增强特异性识别分子在基底表面的反应能力。鉴于这种基底的优良性质，球-刷双层纳米结构基底能够为基于分子相互作用的高通量分析方法提供一个高效的检测平台。
为实现上述目的，本发明提出了一种基于上述球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采用硅球自组装方法制备硅球基底；
步骤2：对步骤1中获得的硅球基底依次进行氨基化修饰和引发剂修饰；
步骤3：利用表面引发原子转移自由基聚合法，在经氨基化修饰和引发剂修饰的硅球基底表面修饰聚合物刷；
步骤4：在聚合物刷修饰的硅球基底上固定生物大分子捕获探针，形成微阵列芯片。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，硅球基底的制备包括以下步骤：
步骤a：将2～2.5ml氨水和20～30ml乙醇在室温下搅拌8～16min，加入0.55～0.85ml原硅酸四乙酯在室温下反应2.5～4.5h后，在转速为8500～9500rpm/min的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液，所述硅球的直径为150～170nm；
步骤b：将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面自发形成自组装单层，当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，然后在450～550℃煅烧0.5～2h，获得稳定的硅球基底。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，步骤2中，所述氨基化修饰采用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，对所述硅球基底的氨基化修饰为将硅球基底浸泡在含有体积分数为0.5～7.5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中常温下反应0.5～2h。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，步骤2中，引发剂采用α-溴异丁酰溴；对所述硅球基底的引发剂修饰方式为将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为0.5～7.5％α-溴异丁酰溴，0.5～7.5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中，先在-5～5℃下反应20～50min，然后在25℃下反应1～3h。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，在步骤3中，所述聚合物刷为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷；在硅球基底表面修饰聚合物刷的方式为：将引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为0.5～1.5％甲基丙烯酸缩水甘油酯，1～10mg/mL溴化亚铜和8～15mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中，在25～35℃反应7～12h。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，在步骤4中，在聚合物刷修饰的硅球基底上固定的生物大分子捕获探针为寡核苷酸，且寡核苷酸为3’-NH2修饰的DNA，形成DNA微阵列芯片；DNA微阵列芯片制备包括以下步骤：
步骤a：配置点样液
点样液组成为含有10μmol/L寡核苷酸、质量分数为0.005％十二烷基硫酸钠、1.5mol/L甜菜碱和0.45mol/L氯化钠且pH＝7的45mmol/L二水柠檬酸钠缓冲溶液；
步骤b：点样
用步骤a中的点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h；
步骤c：封闭未反应的环氧基团
点样反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到DNA微阵列芯片。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，步骤4中，在聚合物刷修饰的硅球基底上固定的生物大分子捕获探针为单糖，且该单糖为4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖或4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖，形成糖微阵列芯片；糖微阵列芯片制备包括以下步骤：
步骤a：配置点样液
点样液组成为：含有10mmol/L单糖、0.05mol/L甜菜碱和0.15mol/L氯化钠的pH＝8.5且浓度为0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液；
步骤b：点样
用步骤a中的点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h；
步骤c：封闭未反应的环氧基团
点样反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到糖微阵列芯片。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，在步骤4中，在聚合物刷修饰的硅球基底上固定的生物大分子捕获探针为糖蛋白，且该糖蛋白为去唾液酸糖蛋白，形成糖蛋白微阵列芯片；糖蛋白微阵列芯片制备包括以下步骤：
步骤a：配置点样液
点样液组成为：含有500μg/mL去唾液酸糖蛋白、体积分数为30％甘油、200μg/mL牛血清白蛋白、体积分数为0.003％聚乙二醇辛基苯基醚和0.15mol/L氯化钠的浓度为0.05mol/L且pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液；
步骤b：点样
用步骤a中的点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h；
步骤c：封闭未反应的环氧基团
点样反应后，选用含有0.1mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到糖蛋白微阵列芯片。
进一步的，在所述基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法中，在步骤4中，在聚合物刷修饰的硅球基底上固定的生物大分子捕获探针为人抗体，形成抗体微阵列芯片；抗体微阵列芯片制备包括以下步骤：
步骤a：配置点样液
点样液组成为：含有1mg/mL人抗体，体积分数为2.5％甘油，0.15mol/L氯化钠的浓度为0.05mol/L且pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液；
步骤b：点样
用步骤a中的点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h；
步骤c：封闭未反应的环氧基团
点样反应后，选用含有0.1mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到抗体微阵列芯片。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法具有通用性，方法简便，设备需求少，适宜进行大批量生产。本发明提供的基于球-刷双层纳米结构基底的微阵列芯片可以实现对核苷酸与核苷酸、糖与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用的分析检测，具有简便、样品消耗少、灵敏度高等优点。实验结果表明：利用本方法制备的糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测限为1ng/mL，DNA微阵列芯片对靶标DNA的检测限为0.1nmol/L，糖蛋白微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测限为0.3ng/mL，抗体微阵列芯片对CY5修饰兔抗人抗体的检测限为10pg/mL。
附图说明
图1为本发明提出的基于球-刷双层纳米结构基底的制备示意图；
图2为本发明实施例1中DNA微阵列芯片对靶标DNA的检测分析结果图；
图3(a)为本发明实施例2中糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测分析结果；
图3(b)为本发明实施例2中糖微阵列芯片对生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测分析结果图；
图4为本发明实施例3中糖蛋白微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测分析结果图；
图5为本发明实施例4中抗体微阵列芯片对CY5修饰兔抗人抗体的检测分析结果图。
具体实施方式
下面将结合示意图对本发明的一种基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
为了克服背景技术现有技术中微阵列芯片的缺点，本发明采用硅球自组装方法在玻片表面构建球状纳米结构；利用表面引发原子转移自由基聚合法在硅球表面修饰密集的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷，得到含有大量环氧基的三维聚合物刷层；利用此方法构建的基底为载体制备微阵列芯片，用于分析检测多种分子相互作用。
本发明提出的基于球-刷双层纳米结构基底的微阵列芯片，包括硅球自组装形成的具有三维球状纳米结构的硅球基底，所述硅球基底上修饰有聚合物刷；在所述聚合物刷上固定有寡核苷酸、单糖、糖蛋白或抗体分别形成对应的DNA微阵列芯片、糖微阵列芯片、糖蛋白微阵列芯片和抗体微阵列芯片。球-刷双层纳米结构基底的制备过程如图1所示。
实例1——DNA微阵列芯片
步骤1：硅球自组装方法制备硅球基底
1)将2.2mL氨水和26.5mL乙醇在室温下搅拌10min，加入0.75mL原硅酸四乙酯在室温下反应3h后，在转速为9000rpm/min的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液。
2)将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面会自发形成自组装单层。当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，在500℃煅烧1h后，获得稳定的硅球基底。该硅球基底具有三维球状纳米结构。
步骤2：在获得硅球基底上依次进行氨基化修饰和引发剂修饰
1)氨基化修饰：将步骤1制备的硅球基底浸泡在含有体积分数为5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中反应1h得到氨基修饰的硅球基底；
2)引发剂修饰：将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为5％α-溴异丁酰溴，5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中在0℃反应30min，然后在25℃下反应2h得到引发剂固定的硅球基底。
步骤3：在硅球基底表面修饰聚合物刷(表面引发原子转移自由基聚合法)
将步骤2制备的引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为1％甲基丙烯酸缩水甘油酯，5mg/mL溴化亚铜和10.4mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇(体积分数为50％)溶液中，在30℃反应9h，依次用甲醇和水清洗后放入4℃冰箱保存。获得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底。
步骤4：制作DNA微阵列芯片
选用步骤3制备的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底和SmartArrayer 136生物芯片点样系统制作DNA微阵列芯片：
1)点样：点样量为1nL/点；为了获得良好均匀的阵列点及保持生物分子的活性，选用的点样液组成为：含有10μmol/L寡核苷酸、质量分数为0.005％十二烷基硫酸钠、1.5mol/L甜菜碱和0.45mol/L氯化钠且pH＝7的45mmol/L二水柠檬酸钠缓冲溶液；用该点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h，完成寡核苷酸在硅球基底上的固定。其中，寡核苷酸为3’-NH2修饰的DNA。
2)封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)对未反应的环氧基团进行封闭后得到DNA微阵列芯片。
步骤5：DNA微阵列芯片效果检测
1)靶标DNA的制备
采用CY5(荧光染料)对待检测DNA进行荧光标记，获得靶标DNA。其中，CY5浓度为0.1mol/L。
2)DNA微阵列芯片与靶标DNA杂交
将制作好的DNA微阵列芯片分别与0.05nmol/L-1000nmol/L的靶标DNA杂交，选用的反应温度为55℃，时间为1h；反应后依次用含有0.1％十二烷基硫酸钠，0.6mol/L氯化钠的60mmol/L柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(pH＝7.0)；含有0.01％十二烷基硫酸钠，0.15mol/L氯化钠的15mmol/L二水柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝7.0)，去离子水清洗干净并离心甩干，得到靶标DNA杂交修饰的DNA微阵列芯片。
3)DNA微阵列芯片的灵敏性检测
将靶标DNA杂交修饰的DNA微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到DNA微阵列芯片的荧光检测信号。注：靶标DNA已由CY5(荧光染料)标记。
4)DNA微阵列芯片对靶标DNA检测效果
按照以上实验步骤，本发明得到的结果如图2所示。图2是本发明获得的荧光信号随靶标DNA浓度的变化而变化的点阵光学图片和靶标DNA的检测曲线图，它们分别表示在DNA微阵列芯片上，荧光信号随靶标DNA浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中图中横坐标为靶标DNA的浓度，纵坐标为荧光信号强度，其中，实验中用到的捕获探针即寡核苷酸(3’-NH2修饰的DNA)的浓度为10μmol/L，标记探针用的CY5浓度为0.1μmol/L，靶标DNA的浓度为0.05nmol/L，0.1nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，500nmol/L，1000nmol/L。由图2可知，利用这一方法所获得的DNA微阵列芯片对靶标DNA的检测限为：0.1nmol/L，其中，荧光信号随着靶标DNA浓度的增加而增加。
实例2——糖微阵列芯片
步骤1：硅球自组装方法制备硅球基底
1)将2.2mL氨水和26.5mL乙醇在室温下搅拌10min，加入0.75mL原硅酸四乙酯在室温下反应3h后，在转速为9000rpm/min的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液。
2)将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面会自发形成自组装单层。当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，在500℃煅烧1h后，获得稳定的硅球基底。该硅球基底具有三维球状纳米结构。
步骤2：在获得硅球基底上依次进行氨基化修饰和引发剂修饰
1)氨基化修饰：将步骤1制备的硅球基底浸泡在含有体积分数为5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中反应1h得到氨基修饰的硅球基底；
2)引发剂修饰：将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为5％α-溴异丁酰溴，5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中在0℃反应30min，然后在25℃下反应2h得到引发剂固定的硅球基底。
步骤3：在硅球基底表面修饰聚合物刷(表面引发原子转移自由基聚合法)
将步骤2制备的引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为1％甲基丙烯酸缩水甘油酯，5mg/mL溴化亚铜和10.4mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇(体积分数为50％)溶液中，在30℃反应9h，依次用甲醇和水清洗后放入4℃冰箱保存。获得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底。
步骤4：糖微阵列芯片制作
选用步骤3制备的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底和SmartArrayer 136生物芯片点样系统制作糖微阵列芯片：
1)点样：点样量为1nL/点；为了获得良好均匀的阵列点及保持生物分子的活性，选用的点样液组成为：含有10mmol/L单糖，0.05mol/L甜菜碱，0.15mol/L氯化钠的0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.5)；用该点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中反应12h，完成单糖在硅球基底上的固定。其中，单糖为4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖或4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖。
2)封闭未反应的环氧基团：反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)对未反应的环氧基团进行封闭后得到糖微阵列芯片。
步骤5：糖微阵列芯片效果检测
1)制备生物素标记的糖微阵列芯片
将制作好的糖微阵列芯片分别与1ng/mL-0.8μg/mL的生物素修饰蓖麻凝集素-120和1ng/mL-4μg/mL的生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素反应，选用的反应温度为30℃，时间为2h；反应后依次用含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到生物素标记的糖微阵列芯片。
2)制备荧光标记的糖微阵列芯片
经过10μg/mL CY5修饰的链霉亲和素对生物素标记的糖微阵列芯片进行标记后,依次使用磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到荧光标记的糖微阵列芯片。
3)糖微阵列芯片灵敏性检测
将荧光标记的糖微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到糖微阵列芯片的荧光检测信号。
4)糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素检测效果
按照以上实验步骤，本发明得到的结果如图3所示。图3a和图3b分别是本发明获得的荧光信号随生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素浓度的变化而变化的点阵光学图片和生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测曲线图，其中单糖的浓度为10mmol/L，CY5修饰的链霉亲和素的浓度为10μg/mL。它们分别表示在糖微阵列芯片上，荧光信号随着生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中图中横坐标分别为生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的浓度，纵坐标为荧光信号强度，实验中用到的CY5修饰的链霉亲和素的浓度为10μg/mL，生物素修饰蓖麻凝集素-120的浓度为0.25ng/mL，1ng/mL，6ng/mL，32ng/mL，160ng/mL，800ng/mL，生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的浓度为0.25ng/mL，1ng/mL，6ng/mL，32ng/mL，160ng/mL，800ng/mL，4μg/mL，利用这一方法所获得的糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测限均为：1ng/mL，其中，荧光信号随着生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素浓度的增加而增加。
实例3——糖蛋白微阵列芯片
步骤1：硅球自组装方法制备硅球基底
1)将2.2mL氨水和26.5mL乙醇在室温下搅拌10min，加入0.75mL原硅酸四乙酯在室温下反应3h后，在转速为9000rpm/min的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液。
2)将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面会自发形成自组装单层。当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，在500℃煅烧1h后，获得稳定的硅球基底。该硅球基底具有三维球状纳米结构。
步骤2：在获得硅球基底上依次进行氨基化修饰和引发剂修饰
1)氨基化修饰：将步骤1制备的硅球基底浸泡在含有体积分数为5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中反应1h得到氨基修饰的硅球基底；
2)引发剂修饰：将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为5％α-溴异丁酰溴，5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中在0℃反应30min，然后在25℃下反应2h得到引发剂固定的硅球基底。
步骤3：在硅球基底表面修饰聚合物刷(表面引发原子转移自由基聚合法)
将步骤2制备的引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为1％甲基丙烯酸缩水甘油酯，5mg/mL溴化亚铜和10.4mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇(体积分数为50％)溶液中，在30℃反应9h，依次用甲醇和水清洗后放入4℃冰箱保存。获得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底。
步骤4：糖蛋白微阵列芯片制备
选用步骤3制备的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底和SmartArrayer 136生物芯片点样系统制作糖蛋白微阵列芯片：
1)点样：点样量为1nL/点；为了获得良好均匀的阵列点及保持生物分子的活性，选用的点样液组成为：含有500μg/mL去唾液酸糖蛋白，体积分数为30％甘油，200μg/mL牛血清白蛋白，体积分数为0.003％聚乙二醇辛基苯基醚，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)；用该点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在25℃，真空反应12h；完成去唾液酸糖蛋白在硅球基底上的固定。
2)封闭未反应的环氧基团：反应后，选用含有0.1mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)对未反应的环氧基团进行封闭后得到糖蛋白微阵列芯片。
步骤5：糖蛋白微阵列芯片效果检测
1)制备生物素标记的糖蛋白微阵列芯片
将制作好的糖蛋白微阵列芯片分别与0.05ng/mL-4μg/mL生物素标记的蓖麻凝集素-120反应，选用的反应温度为25℃，时间为3h；反应后依次用含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，获得生物素标记的糖蛋白微阵列芯片。
2)制备荧光标记的糖蛋白微阵列芯片
经过10μg/mL CY5修饰的链霉亲和素对生物素标记的糖蛋白微阵列芯片进行标记后，依次使用磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到荧光标记的糖蛋白微阵列芯片。
3)糖蛋白微阵列芯片灵敏度检测
将荧光标记的糖蛋白微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到糖蛋白微阵列芯片的荧光检测信号。
4)糖蛋白微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120检测效果
按照以上实验步骤，本发明得到的结果如图4所示。图4是本发明获得的荧光信号随生物素修饰蓖麻凝集素-120浓度的变化而变化的点阵光学图片和生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测曲线图，它们分别表示在糖蛋白微阵列芯片上，荧光信号随着生物素修饰蓖麻凝集素-120浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中图中横坐标为生物素修饰蓖麻凝集素-120的浓度，纵坐标为荧光信号强度，实验中用到的CY5修饰的链霉亲和素的浓度为10μg/mL，去唾液酸糖蛋白的浓度为500μg/mL，生物素修饰蓖麻凝集素-120的浓度为0.05ng/mL,0.3ng/mL，1ng/mL，6ng/mL，32ng/mL，160ng/mL，800ng/mL，4μg/mL，利用这一方法所获得的生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测限为：0.3ng/mL，其中，荧光信号随着生物素修饰蓖麻凝集素-120的增加而增加。
实例4——抗体微阵列芯片
步骤1：硅球自组装方法制备硅球基底
1)将2.2mL氨水和26.5mL乙醇在室温下搅拌10min，加入0.75mL原硅酸四乙酯在室温下反应3h后，在转速为9000rpm/min的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液。
2)将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面会自发形成自组装单层。当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，在500℃煅烧1h后，获得稳定的硅球基底。该硅球基底具有三维球状纳米结构。
步骤2：在获得硅球基底上依次进行氨基化修饰和引发剂修饰
1)氨基化修饰：将步骤1制备的硅球基底浸泡在含有体积分数为5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中反应1h得到氨基修饰的硅球基底；
2)引发剂修饰：将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为5％α-溴异丁酰溴，5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中在0℃反应30min，然后在25℃下反应2h得到引发剂固定的硅球基底。
步骤3：在硅球基底表面修饰聚合物刷(表面引发原子转移自由基聚合法)
将步骤2制备的引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为1％甲基丙烯酸缩水甘油酯，5mg/mL溴化亚铜和10.4mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇(体积分数为50％)溶液中，在30℃反应9h，依次用甲醇和水清洗后放入4℃冰箱保存。获得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底。
步骤4：抗体微阵列芯片的制备
选用步骤3制备的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷修饰的硅球基底和SmartArrayer 136生物芯片点样系统制作抗体微阵列芯片：
1)点样：点样量为1nL/点；为了获得良好均匀的阵列点及保持生物分子的活性，选用的点样液组成为：含有1mg/mL人抗体，体积分数为2.5％甘油，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)；用该点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在30℃，真空反应12小时，完成人抗体在硅球基底上的固定。
2)封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)对未反应的环氧基团进行封闭后得到抗体微阵列芯片。
步骤5：抗体微阵列芯片效果检测
1)抗体微阵列芯片荧光标记
将制作好的抗体微阵列芯片分别与1pg/mL-10ng/mL的CY5修饰兔抗人抗体反应，选用的反应温度为37℃，时间为2小时；反应后依次用含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干，得到荧光标记的抗体微阵列芯片。
2)抗体微阵列芯片灵敏度检测
将荧光标记的抗体微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到抗体微阵列芯片的荧光检测信号。
3)抗体微阵列芯片灵敏度检测结果
按照以上实验步骤，我们得到的结果如图5所示。图5是本发明获得的荧光信号随CY5修饰兔抗人抗体浓度的变化而变化的点阵光学图片和的CY5修饰兔抗人抗体的检测曲线图，其中捕获抗体的浓度为1mg/mL。它们分别表示在抗体微阵列芯片上，荧光信号随着CY5修饰兔抗人抗体浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中图中横坐标为CY5修饰兔抗人抗体的浓度，纵坐标为荧光信号强度，实验中用到的CY5修饰兔抗人抗体的浓度为1pg/mL,10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL，10ng/mL，利用这一方法所获得的CY5修饰兔抗人抗体的检测限为：10pg/mL，其中，荧光信号随着CY5修饰兔抗人抗体浓度的增加而增加。
综上，在本发明实施例提供的一种基于球-刷双层纳米结构基底的微阵列芯片及其制备方法中，基于球-刷双层纳米结构基底的微阵列芯片的制备方法具有通用性，方法简便，设备需求少，适宜进行大批量生产；且本发明提供的基于球-刷双层纳米结构基底的微阵列芯片可以实现对核苷酸与核苷酸、糖与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用的分析检测，具有简便、样品消耗少、灵敏度高等优点。实验结果表明：利用本方法制备的糖微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120和生物素修饰伴刀豆球蛋白凝集素的检测限为1ng/mL，DNA微阵列芯片对靶标DNA的检测限为0.1nmol/L，糖蛋白微阵列芯片对生物素修饰蓖麻凝集素-120的检测限为0.3ng/mL，抗体微阵列芯片对CY5修饰兔抗人抗体的检测限为10pg/mL。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用硅球自组装方法制备硅球基底；
步骤2：对步骤1中获得的硅球基底依次进行氨基化修饰和引发剂修饰；
步骤3：利用表面引发原子转移自由基聚合法，在经氨基化修饰和引发剂修饰的硅球基底表面修饰聚合物刷；
步骤4：在聚合物刷修饰的硅球基底上固定生物大分子捕获探针，形成微阵列芯片；
在步骤3中，所述聚合物刷为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物刷；在硅球基底表面修饰聚合物刷的方式为：将引发剂修饰的硅球基底放入含有体积分数为0.5～1.5％甲基丙烯酸缩水甘油酯，1～10mg/mL溴化亚铜和8～15mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中，在25～35℃反应7～12h；
在步骤4中，在聚合物刷修饰的硅球基底上固定的生物大分子捕获探针为寡核苷酸，且寡核苷酸为3’-NH2修饰的DNA，形成DNA微阵列芯片；DNA微阵列芯片制备包括以下步骤：
步骤a：配置点样液
点样液组成为含有10μmol/L寡核苷酸、质量分数为0.005％十二烷基硫酸钠、1.5mol/L甜菜碱和0.45mol/L氯化钠且pH＝7的45mmol/L二水柠檬酸钠缓冲溶液；
步骤b：点样
用步骤a中的点样液对由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的硅球基底进行点样，点样后在37℃，60％湿度恒温恒湿箱中，反应12h；
步骤c：封闭未反应的环氧基团
点样反应后，选用含有5mg/mL甲氧基聚乙二醇胺，0.15mol/L氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到DNA微阵列芯片。
2.根据权利要求1所述的基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，硅球基底的制备包括以下步骤：
步骤a：将2～2.5ml氨水和20～30ml乙醇在室温下搅拌8～16min，加入0.55～0.85ml原硅酸四乙酯在室温下反应2.5～4.5h后，在转速为8500～9500rpm的条件下离心提纯反应产物并分散到正丁醇溶液中，即得到硅球溶液，所述硅球的直径为150～170nm；
步骤b：将得到的硅球溶液逐滴加入水中，硅球在水表面自发形成自组装单层，当干净的玻片放到水表面后，形成的硅球单层自发地转移到玻片表面，然后在450～550℃煅烧0.5～2h，获得稳定的硅球基底。
3.根据权利要求1所述的基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述氨基化修饰采用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，对所述硅球基底的氨基化修饰为将硅球基底浸泡在含有体积分数为0.5～7.5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中常温下反应0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的基于球-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，步骤2中，引发剂采用α-溴异丁酰溴；对所述硅球基底的引发剂修饰方式为将氨基修饰的硅球基底放入含有体积分数为0.5～7.5％α-溴异丁酰溴，0.5～7.5％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中，先在-5～5℃下反应20～50min，然后在25℃下反应1～3h。
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