JP4326334B2 - プローブ溶液組成物と、これを用いた反応性チップおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
この出願の発明は、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上に高密度で整列固定した反応性チップを製造する際に用いるプローブ溶液組成物と、この組成物を用いて製造した反応性チップ、並びにこの反応性チップの製造方法に関するものである。
背景技術
遺伝子の構造や遺伝子発現様式の大量かつ迅速な解析を目的として、様々な反応性チップが用いられている。この反応性チップは、スライドガラス等の基板上に数千から数万種以上の異なるプローブがスポットとして整列固定されており、蛍光等によって標識した標的物質のプローブへの結合の有無を指標として、標的物質の特定やサンプル中における標的物質の量を定量することができるようになっている。チップ上に固定されるプローブは、解析する標的物質の種類によって異なる。例えばＤＮＡやＲＮＡが標的物質となる場合は、それらと相補性結合（ハイブリダイゼーション）が可能な２本鎖および１本鎖ＤＮＡ断片やポリヌクレオチド鎖、オリゴヌクレオチド鎖等がプローブとして採用され、これらはＤＮＡチップ（またはＤＮＡアレイ）と呼ばれている。また、プローブのスポットは、例えばＤＮＡ断片等をプローブとする場合、ＤＮＡ断片それ自体を基板上に固定化する方法か、あるいは基板上で所定塩基配列のＤＮＡ断片を合成する方法によって形成される。いずれの方法の場合も、それらのプローブ材料を所定位置に一定量、正確にスポッティングする必要がある。
基板上にプローブ材料をスポッティングする方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、スプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのプローブ溶液の供給（打ち込み）を行う方法が知られている。
これに対して、この出願の出願人は、ジェットノズルを使用することによって、極微量のプローブ溶液を迅速かつ正確に基板所定位置にスポッティングする方法を発明し、特許出願している（特開２００１−１１６７５０号公報）。また、この出願人は、ＤＮＡプローブ溶液を複数回スポッティングすること（重ね打ちスポッティング）によって、プローブ溶液の使用効率の向上と、スポット径の均一化を可能とするＤＮＡチップの製造法を特許出願している（特開２００１−１８６８８０号公報）。
一方、プローブ溶液には、プローブスポットを基板上に安定的に固定するためにカルボキシルメチルセルロース等を含有されているが、さらなる検出感度の向上やスポットの高密度化を目的としたプローブ溶液組成の改良も行われている。例えば、特開２０００−２９５９９０号公報には、親水性ポリマーを含有するプローブ溶液（ＤＮＡ溶液）が開示されている。また、特開２００１−６６３０５号公報には、インクジェット法のプローブ溶液として、プローブ、尿素、グリセリン、チオジグリコールおよびアセチレンアルコールからなる液体組成物が開示されている。
ポストゲノム時代を迎え、膨大な数の未知遺伝子の特定やその機能解析が急務となっている現状において、ＤＮＡチップをはじめとする各種の反応性チップへの期待はますます高まっている。このような要請に対して、高精度に標的物質の特定や定量を可能とする反応性チップを効率よく大量製造し、安価に提供するためには、さらに解決すべき課題が存在する。１つには、極微量の標的物質をも測定可能なように検出感度をさらに向上させることであり、そのためにはスポット形状をさらに安定化させることが必要である。また、スポッティング形状をさらに安定化させることは、プローブスポットの高密度化を可能とするとともに、異なる種類の生体分子プローブを画一条件でスポッティングすることをも可能とする。しかしながら、従来のプローブ溶液組成物では、良好なスポット形状を安定的に得るには限界があった。
また従来のプローブ溶液組成物では、プローブ溶液の粘度を上げるため、ＳＳＣ バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー等の塩含有バッファーが通常用いられている。また、エポキシ被覆基板とプローブ側修飾アミノ基との共有結合によってプローブを固定する場合にも、共有結合の効率を向上させるなどの目的で、塩含有バッファー（特にＳＳＣ バッファー等）が好ましく使用されている。しかしながら、この塩含有バッファーを使用した場合には、塩の析出によってスポット形状が不良化するという問題が存在した。
さらに、通常の反応性チップの製造工程は、スポッティングの後に、スポットの乾燥を防ぐための水分付加工程、ベーキング工程、固定化処理工程等を必要とするが、これらの工程の省略化もまた、反応性チップの低コストによる大量製造のためには解決すべき課題である。特に、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されている重ね打ちスポッティングにおいては、工程の省略化は製造の効率化と低コスト化に対してより大きな効果をもたらすものと期待させる。しかしながら、従来の反応性チップの製造方法や、あるいはプローブ試料溶液の組成改良は、これらの課題を全て解決するものではなかった。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、検出感度の向上、スポット形状の安定化、および製造工程の省略化を全て可能とする新しいプローブ溶液組成物を提供することを課題としている。
また、この出願の発明は、前記の組成物を用いて製造された反応性チップと、この反応性チップの製造方法を提供することを課題としてもいる。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、プローブと保湿性物質とを含有することを特徴とするプローブ溶液組成物を提供する。
この溶液組成物においては、保湿性物質が、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩からなる群より選択される１種または２種以上であること、保湿性物質の含有量が１〜１５重量％であること、並びにプローブが、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ペプチド、またはそれらの任意の複合物であることを好ましい態様としている。さらにこのプローブ溶液は、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌの塩を含有することを別の好ましい態様としている。
この出願の発明はまた、前記のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップを提供する。
さらにこの出願の発明は、前記のプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポットを基板上で固定化することを特徴とする反応性チップの製造方法を提供する。
この製造方法においては、インクジェット方式でスポッティングを行うこと、プローブ溶液組成物スポットを、水分付加を行わずに固定化すること、並びにスポッティングを２回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化することを好ましい態様としている。
発明を実施するための最良の形態
この発明のプローブ溶液組成物は、標的物質に特異的に結合するプローブと保湿性物質とを含有することを特徴としている。
保湿性物質は、例えば、それを含有する水溶液を濾紙に１ｍｌ滴下して２５℃、相対湿度４０％雰囲気下で１０分間放置した場合の水分残存量が、滴下時水分量と比較して９０％以上となるような物質である。このような保湿性物質としては、分子量が３００〜２０００、粘度が１〜２０ｃｐ程度のものであり、例えば化粧品等に使用されているグリセリン、ホエイ、ヤシ脂肪酸、スクロース、ソルビトール等を使用することができるが、この発明のプローブ溶液組成物においては、特に、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩（以下、これらを「シアル酸類」と記載することがある）の１種または２種以上を使用することが好ましい。なお、シアル酸（塩）のオリゴマーは、シアル酸（塩）の２〜６量体を、コロミン酸（塩）はシアル酸（塩）の７量体以上のものである。これらのシアル酸類は市販の乾燥品等を適宜に使用することができる。
この発明の溶液組成物に使用するプローブは、標的物質と特異的に結合する生体分子である。例えば、標的物質がゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片（例えばｃＤＮＡ等）の場合には、プローブは、相補性に基づいてこれらＤＮＡ断片とハイブリダイズする１本鎖のＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖（１００塩基以上のポリヌクレオチドまたは１００塩基未満のオリゴヌクレオチド）等である。また、標的物質がタンパク質の場合は、そのアミノ酸配列の一部に特異的に結合するタンパク質やペプチド等である。また、タンパク質のエピトープに結合することができる抗体またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等をプローブとすることもできる。
このプローブ溶液組成物におけるプローブの濃度は、プローブの種類や分子量等に応じて適宜とすることができるが、例えばＤＮＡ断片やヌクレオチド鎖の場合には０．１〜５μｇ程度とすることができる。また、保湿性物質の濃度は、その保湿性能や粘度等に応じて適宜とすることができるが、シアル酸類の場合には、１〜１５重量％の範囲とすることが好ましい。
この発明の溶液組成物におけるプローブおよび保湿性物質以外の成分は、通常の反応性チップ製造に用いられるプローブ溶液のそれと同一とすることができる。例えば、プローブおよび保湿性物質をｐＨ７〜８程度のバッファーに混合してプローブ溶液組成物を調製することができる。バッファーは、塩非含有バッファーであってもよいが、ＳＳＣ バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー等の塩含有バッファーが好ましい。また、塩非含有バッファーに、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息硝酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トレエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を使用することができる。なお、塩の濃度は、後記の試験例にて確信したように、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０−２〜１ｍｏｌ／ｌ程度とすることができる。
この発明のプローブ溶液組成物の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡ断片を用いた場合の溶液組成物の組成例は、最終濃度が、シアル酸ナトリウム類水溶液１０％（ｗ／ｖ）、ＤＮＡ断片０．０１％（ｗ／ｖ）になるように、ＴＥ バッファー（ｐＨ８、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）に溶解したものである。
また、実施例に示したように、シアル酸類を含む溶液とプローブを含む溶液とを別途に調製し、それらを混合してプローブ溶液組成物を作成するようにしてもよい。この場合、シアル酸類の溶液を大量に準備し、複数種のプローブ溶液と個々に混合することによって、反応性チップにスポッティングする全種類のプローブ溶液組成物を効率よく作成することができる。
次に、この発明の反応性チップとその製造方法について説明する。この発明の反応性チップは、前記のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする。基板は、通常の反応性チップに用いられるスライドグラス等であり、特に、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているポリＬ−リジンを被覆した基板が好ましい。この基板では、ＤＮＡ自体のマイナスチャージとアミノ基のプラスチャージの静電結合によりプローブが基板に固定する。また、エポキシ被覆基板を用いる場合には、塩を含有させたプローブ溶液組成物の使用が好ましい。
スポッティングされるプローブ溶液組成物は、例えば１００〜２０，０００種の異なったプローブを含む溶液組成物であり、スポッティングされたこれらの組成物が１００〜１０００μｍ程度の距離をもって、それぞれ直径５０〜５００μｍの大きさのスポットを形成する。
このような反応性チップを製造する場合のスポッティング方法は、従来のピン方式によって行うこともできるが、好ましくは、特開２００１−１１６７５０号公報や特開２００１−１８６８８１号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが好ましい。これらの方法でスポッティングされたプローブは、保湿性物質の効果によって良好な形状で基板に固定される。また塩含有バッファーを使用した場合も、塩析出が抑えられ良好なスポット形状が得られる。そして、このような良好なスポット形状により、検出感度の向上と、スポットの高密度化が達成される。
スポッティングの後は、通常の反応性チップ製造と同様にして、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜８０％程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを基板上に固定する。ただし、この発明の製造方法では、スポッティングされたプローブ溶液組成物が保湿性を有しているために、前記の水分付加工程を省略しても、スポット形状が不良化すること（例えばドーナツ状スポットの形成）はない。
さらに、この発明の製造方法では、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うことを好ましい態様としている。この場合も、個々のスポッティングにおいてスポット形状が良好に保たれるため、より一層の重ね打ち効果が得られる。また、重ね打ちにおける水分付加も必要としないため、より少ない工程で反応性チップを製造することもできる。
以下、実施例および試験例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品を、表１に示した組成で溶解し、ｐＨ調製し、最終濃度が９〜４８％のシアル酸Ｎａ溶液を調製した。
また、酵母（サッカロマイセスセルビジェ）由来のＤＮＡ（Ｙ１−１０ＢおよびＹ５３−１Ａ）を精製し、それぞれＴＥバッファー２００μｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液のＤＮＡ濃度は３μｇ／ｍｌであった。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各濃度のシアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、表２に示した液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した各々の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理を行って、ＤＮＡプローブを固定した１６種類のＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ ８．７５μｌ、１０％ ＳＤＳ １．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３−３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで測定した。
（３−４）結果
結果は図１に示したとおりである。この図１に示したように、シアル酸ナトリウムを含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、特に３〜１４％濃度において高いシグナル強度が得られることが確認された。
実施例２
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品と、そのオリゴマー乾燥品（ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー）を、実施例１と同様に溶解し、ｐＨ調製し、最終濃度が３０％のシアル酸Ｎａ溶液を調製した。
また、酵母（サッカロマイセスセルビジェ）由来のＤＮＡ（Ｙ１−１０ＢおよびＹ５３−１Ａ）を精製し、それぞれＴＥバッファー１００μｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液のＤＮＡ濃度は３．０３μｇ／ｍｌであった。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各シアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、表３に示した液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した各々の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理することによって、ＤＮＡプローブを固定化した７種類のＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ８．７５μｌ、１０％ＳＤＳ１．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３．３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで測定した。
（３−４）形状判定
ガラス上に固定されたＤＮＡプローブを含むスポットの形状を、実体顕微鏡を用いた目視により判定し、サテライト出現率を計上した。また、ハイブリダイゼーション処理後の蛍光画像から、目視で確認できなかったサテライトを判定し、出現率を計上した。
（３−５）結果
結果は表４に示したとおりである。この表４に示したように、シアル酸類水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、純水を含むプローブ溶液組成物を使用したＤＮＡチップに比較して、サテライト形状不良の出現率が明らかに低く、良好なスポット形状が形成されることが確認された。
実施例３
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品、およびカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）を、表５に示した組成で溶解し、ｐＨ調製し、シアル酸Ｎａの最終濃度が６〜４２％のシアル酸Ｎａ溶液と、２％ＣＭＣ溶液を調製した。
また、酵母（サッカロマイセスセルビジェ）由来のＤＮＡ（Ｙ１−１０ＢおよびＹ５３−１Ａ）を精製し、それぞれＴＥバッファー１２０μｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液のＤＮＡ濃度は３．２μｇ／ｍｌであった。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各濃度のシアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、シアル酸Ｎａ濃度が２、７、１０および１４の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。また、０．５％ＣＭＣ濃度の液体組成物（ＤＮＡ／ＣＭＣ溶液）を作成した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した各々の液体組成物をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各液体組成物をスポットしたガラスの半数（３枚）には、スポット部分に水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理することによって、ＤＮＡプローブを固定化したＤＮＡチップを作成した。また、残りの半数（３枚）は、水分付加を行わずにベーキングし、固定化処理してＤＮＡチップを作成した（表６、７）。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水 １μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ８．７５μｌ、１０％ ＳＤＳ１．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３−３）蛍光測定による形状判定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで、固定スポットの形状を判定した。すなわち、スポット内で明るさが均一でなく、蛍光強度が一定でない形状スポット数をカウントした。
（３−４）結果
結果は表８に示したとおりである。従来のＣＭＣを使用して水分付加を行わない場合には、１００％の割合で不良スポットが出現するのに対し、シアル酸ナトリウム水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、特に２〜１４％濃度において、水分付加を行わない場合であっても不良スポットの出現をほぼ完全に防止することが可能であることが確認された。
実施例４
（１）液体組成物の作成
塩化ナトリウム３Ｍとクエン酸ナトリウム０．３Ｍを混合し、ｐＨ７．０に調整することにより２０×ＳＳＣ液を調製した。次いで、シアル酸を水で溶解し、１０％のシアル酸溶液を調製した。またオリゴＤＮＡ（５０塩基長）凍結乾燥品を１００ｐｍｏｌ／μｌ（１．６５μｇ／μｌ）となるように純水に溶解した。以上の溶液を、ＤＮＡ溶液：５０ｐｍｏｌ／μｌ、１×ＳＳＣ（塩化ナトリウム０．３Ｍ＋クエン酸ナトリウム０．０３Ｍ）、シアル酸溶液：１％の割合で混合し、液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を調製した。対照として、シアル酸を含まない液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ）も調製した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）をインクジェットのマイクロピペットに充填し、エポキシランを被覆したスライドガラスに２００ｐｌずつスポッティングした。次いで、湿度５０％下で、４２℃インキュベータ内で８時間反応させることにより共有結合反応を進行させ、固定化処理を行って、オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを固定したＤＮＡチップを作成した。また、対照液体組成物を用いて同様にＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ラットｍＲＮＡ（クロンテック社製、５μｇ／μｌ）５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）Ｐｒｉｍｅｒ１μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１Ｍｍ Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｏｔ ２．５μｌを混合した。これに、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）１μｌを添加し、４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し、４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）５μｌ、１Ｎトリス塩酸（ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、ＱＩＡＧＥＮＴＭカラムを用いて精製し、純水により標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ １１．２５μｌ、２０×ＳＳＣ ８μｌ、１０％ ＳＤＳ ０．７μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚に１５μｌスポットし、カバーガラス（２４×３２ｍｍサイズ）をかぶせ、６５℃の温度環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ液中にＤＮＡチップを浸して静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ液中で５分間放置、１×ＳＳＣ液中で洗浄、０．５×ＳＳＣ液中で洗浄後、９００ｒｐｍ、２分間遠心、乾燥した。
（３−３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙにセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ７０％、ＰＭＴ ６０％、解像度５μｍで測定した。
（３−４）結果
結果は表９に示したとおりである。従来のプローブ溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ）を用いて作成したＤＮＡチップに比べ、この発明のプローブ溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を用いて作成したＤＮＡチップでは、測定した全ての遺伝子ｃＤＮＡについて高いシグナル強度が得られた。
試験例
プローブ溶液組成物に塩を含有させる場合の好ましい塩濃度範囲を探索した。
（１）方法
ＳＳＣ バッファーの塩濃度を変更した以外は、実施例４と同様に溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を調製し、ＤＮＡチップを作成した。また、実施例４と同様に標識ｃＤＮＡを調製し、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光測定を行った。
（２）結果
心筋アクチンｃＤＮＡの検出結果を表１０に示す。この結果から明らかなように、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０−２〜１ｍｏｌ／ｌ程度の塩を含有させることによって、高いシグナル強度を得ることが可能となる。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための新しいプローブ溶液組成物が提供される。これによって、反応性チップにおける検出感度の向上、高密度化、製造工程の省略化が実現され、高精度の反応性チップを低価格で大量に提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、様々な濃度のシアル酸ナトリウム水溶液を含むプローブ溶液組成物を用いて作成したＤＮＡチップにおけるシグナル強度の測定結果を示す。
この出願の発明は、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上に高密度で整列固定した反応性チップを製造する際に用いるプローブ溶液組成物と、この組成物を用いて製造した反応性チップ、並びにこの反応性チップの製造方法に関するものである。
背景技術
遺伝子の構造や遺伝子発現様式の大量かつ迅速な解析を目的として、様々な反応性チップが用いられている。この反応性チップは、スライドガラス等の基板上に数千から数万種以上の異なるプローブがスポットとして整列固定されており、蛍光等によって標識した標的物質のプローブへの結合の有無を指標として、標的物質の特定やサンプル中における標的物質の量を定量することができるようになっている。チップ上に固定されるプローブは、解析する標的物質の種類によって異なる。例えばＤＮＡやＲＮＡが標的物質となる場合は、それらと相補性結合（ハイブリダイゼーション）が可能な２本鎖および１本鎖ＤＮＡ断片やポリヌクレオチド鎖、オリゴヌクレオチド鎖等がプローブとして採用され、これらはＤＮＡチップ（またはＤＮＡアレイ）と呼ばれている。また、プローブのスポットは、例えばＤＮＡ断片等をプローブとする場合、ＤＮＡ断片それ自体を基板上に固定化する方法か、あるいは基板上で所定塩基配列のＤＮＡ断片を合成する方法によって形成される。いずれの方法の場合も、それらのプローブ材料を所定位置に一定量、正確にスポッティングする必要がある。
基板上にプローブ材料をスポッティングする方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、スプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのプローブ溶液の供給（打ち込み）を行う方法が知られている。
これに対して、この出願の出願人は、ジェットノズルを使用することによって、極微量のプローブ溶液を迅速かつ正確に基板所定位置にスポッティングする方法を発明し、特許出願している（特開２００１−１１６７５０号公報）。また、この出願人は、ＤＮＡプローブ溶液を複数回スポッティングすること（重ね打ちスポッティング）によって、プローブ溶液の使用効率の向上と、スポット径の均一化を可能とするＤＮＡチップの製造法を特許出願している（特開２００１−１８６８８０号公報）。
一方、プローブ溶液には、プローブスポットを基板上に安定的に固定するためにカルボキシルメチルセルロース等を含有されているが、さらなる検出感度の向上やスポットの高密度化を目的としたプローブ溶液組成の改良も行われている。例えば、特開２０００−２９５９９０号公報には、親水性ポリマーを含有するプローブ溶液（ＤＮＡ溶液）が開示されている。また、特開２００１−６６３０５号公報には、インクジェット法のプローブ溶液として、プローブ、尿素、グリセリン、チオジグリコールおよびアセチレンアルコールからなる液体組成物が開示されている。
ポストゲノム時代を迎え、膨大な数の未知遺伝子の特定やその機能解析が急務となっている現状において、ＤＮＡチップをはじめとする各種の反応性チップへの期待はますます高まっている。このような要請に対して、高精度に標的物質の特定や定量を可能とする反応性チップを効率よく大量製造し、安価に提供するためには、さらに解決すべき課題が存在する。１つには、極微量の標的物質をも測定可能なように検出感度をさらに向上させることであり、そのためにはスポット形状をさらに安定化させることが必要である。また、スポッティング形状をさらに安定化させることは、プローブスポットの高密度化を可能とするとともに、異なる種類の生体分子プローブを画一条件でスポッティングすることをも可能とする。しかしながら、従来のプローブ溶液組成物では、良好なスポット形状を安定的に得るには限界があった。
また従来のプローブ溶液組成物では、プローブ溶液の粘度を上げるため、ＳＳＣ バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー等の塩含有バッファーが通常用いられている。また、エポキシ被覆基板とプローブ側修飾アミノ基との共有結合によってプローブを固定する場合にも、共有結合の効率を向上させるなどの目的で、塩含有バッファー（特にＳＳＣ バッファー等）が好ましく使用されている。しかしながら、この塩含有バッファーを使用した場合には、塩の析出によってスポット形状が不良化するという問題が存在した。
さらに、通常の反応性チップの製造工程は、スポッティングの後に、スポットの乾燥を防ぐための水分付加工程、ベーキング工程、固定化処理工程等を必要とするが、これらの工程の省略化もまた、反応性チップの低コストによる大量製造のためには解決すべき課題である。特に、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されている重ね打ちスポッティングにおいては、工程の省略化は製造の効率化と低コスト化に対してより大きな効果をもたらすものと期待させる。しかしながら、従来の反応性チップの製造方法や、あるいはプローブ試料溶液の組成改良は、これらの課題を全て解決するものではなかった。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、検出感度の向上、スポット形状の安定化、および製造工程の省略化を全て可能とする新しいプローブ溶液組成物を提供することを課題としている。
また、この出願の発明は、前記の組成物を用いて製造された反応性チップと、この反応性チップの製造方法を提供することを課題としてもいる。
発明の開示
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、プローブと保湿性物質とを含有することを特徴とするプローブ溶液組成物を提供する。
この溶液組成物においては、保湿性物質が、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩からなる群より選択される１種または２種以上であること、保湿性物質の含有量が１〜１５重量％であること、並びにプローブが、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ペプチド、またはそれらの任意の複合物であることを好ましい態様としている。さらにこのプローブ溶液は、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌの塩を含有することを別の好ましい態様としている。
この出願の発明はまた、前記のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップを提供する。
さらにこの出願の発明は、前記のプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポットを基板上で固定化することを特徴とする反応性チップの製造方法を提供する。
この製造方法においては、インクジェット方式でスポッティングを行うこと、プローブ溶液組成物スポットを、水分付加を行わずに固定化すること、並びにスポッティングを２回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化することを好ましい態様としている。
発明を実施するための最良の形態
この発明のプローブ溶液組成物は、標的物質に特異的に結合するプローブと保湿性物質とを含有することを特徴としている。
保湿性物質は、例えば、それを含有する水溶液を濾紙に１ｍｌ滴下して２５℃、相対湿度４０％雰囲気下で１０分間放置した場合の水分残存量が、滴下時水分量と比較して９０％以上となるような物質である。このような保湿性物質としては、分子量が３００〜２０００、粘度が１〜２０ｃｐ程度のものであり、例えば化粧品等に使用されているグリセリン、ホエイ、ヤシ脂肪酸、スクロース、ソルビトール等を使用することができるが、この発明のプローブ溶液組成物においては、特に、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩（以下、これらを「シアル酸類」と記載することがある）の１種または２種以上を使用することが好ましい。なお、シアル酸（塩）のオリゴマーは、シアル酸（塩）の２〜６量体を、コロミン酸（塩）はシアル酸（塩）の７量体以上のものである。これらのシアル酸類は市販の乾燥品等を適宜に使用することができる。
この発明の溶液組成物に使用するプローブは、標的物質と特異的に結合する生体分子である。例えば、標的物質がゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片（例えばｃＤＮＡ等）の場合には、プローブは、相補性に基づいてこれらＤＮＡ断片とハイブリダイズする１本鎖のＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド鎖（１００塩基以上のポリヌクレオチドまたは１００塩基未満のオリゴヌクレオチド）等である。また、標的物質がタンパク質の場合は、そのアミノ酸配列の一部に特異的に結合するタンパク質やペプチド等である。また、タンパク質のエピトープに結合することができる抗体またはそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等をプローブとすることもできる。
このプローブ溶液組成物におけるプローブの濃度は、プローブの種類や分子量等に応じて適宜とすることができるが、例えばＤＮＡ断片やヌクレオチド鎖の場合には０．１〜５μｇ程度とすることができる。また、保湿性物質の濃度は、その保湿性能や粘度等に応じて適宜とすることができるが、シアル酸類の場合には、１〜１５重量％の範囲とすることが好ましい。
この発明の溶液組成物におけるプローブおよび保湿性物質以外の成分は、通常の反応性チップ製造に用いられるプローブ溶液のそれと同一とすることができる。例えば、プローブおよび保湿性物質をｐＨ７〜８程度のバッファーに混合してプローブ溶液組成物を調製することができる。バッファーは、塩非含有バッファーであってもよいが、ＳＳＣ バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー等の塩含有バッファーが好ましい。また、塩非含有バッファーに、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息硝酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トレエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を使用することができる。なお、塩の濃度は、後記の試験例にて確信したように、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０−２〜１ｍｏｌ／ｌ程度とすることができる。
この発明のプローブ溶液組成物の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡ断片を用いた場合の溶液組成物の組成例は、最終濃度が、シアル酸ナトリウム類水溶液１０％（ｗ／ｖ）、ＤＮＡ断片０．０１％（ｗ／ｖ）になるように、ＴＥ バッファー（ｐＨ８、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）に溶解したものである。
また、実施例に示したように、シアル酸類を含む溶液とプローブを含む溶液とを別途に調製し、それらを混合してプローブ溶液組成物を作成するようにしてもよい。この場合、シアル酸類の溶液を大量に準備し、複数種のプローブ溶液と個々に混合することによって、反応性チップにスポッティングする全種類のプローブ溶液組成物を効率よく作成することができる。
次に、この発明の反応性チップとその製造方法について説明する。この発明の反応性チップは、前記のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする。基板は、通常の反応性チップに用いられるスライドグラス等であり、特に、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているポリＬ−リジンを被覆した基板が好ましい。この基板では、ＤＮＡ自体のマイナスチャージとアミノ基のプラスチャージの静電結合によりプローブが基板に固定する。また、エポキシ被覆基板を用いる場合には、塩を含有させたプローブ溶液組成物の使用が好ましい。
スポッティングされるプローブ溶液組成物は、例えば１００〜２０，０００種の異なったプローブを含む溶液組成物であり、スポッティングされたこれらの組成物が１００〜１０００μｍ程度の距離をもって、それぞれ直径５０〜５００μｍの大きさのスポットを形成する。
このような反応性チップを製造する場合のスポッティング方法は、従来のピン方式によって行うこともできるが、好ましくは、特開２００１−１１６７５０号公報や特開２００１−１８６８８１号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが好ましい。これらの方法でスポッティングされたプローブは、保湿性物質の効果によって良好な形状で基板に固定される。また塩含有バッファーを使用した場合も、塩析出が抑えられ良好なスポット形状が得られる。そして、このような良好なスポット形状により、検出感度の向上と、スポットの高密度化が達成される。
スポッティングの後は、通常の反応性チップ製造と同様にして、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜８０％程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを基板上に固定する。ただし、この発明の製造方法では、スポッティングされたプローブ溶液組成物が保湿性を有しているために、前記の水分付加工程を省略しても、スポット形状が不良化すること（例えばドーナツ状スポットの形成）はない。
さらに、この発明の製造方法では、特開２００１−１８６８８０号公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うことを好ましい態様としている。この場合も、個々のスポッティングにおいてスポット形状が良好に保たれるため、より一層の重ね打ち効果が得られる。また、重ね打ちにおける水分付加も必要としないため、より少ない工程で反応性チップを製造することもできる。
以下、実施例および試験例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品を、表１に示した組成で溶解し、ｐＨ調製し、最終濃度が９〜４８％のシアル酸Ｎａ溶液を調製した。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各濃度のシアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、表２に示した液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。
前記（１）で作成した各々の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理を行って、ＤＮＡプローブを固定した１６種類のＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ ８．７５μｌ、１０％ ＳＤＳ １．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３−３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで測定した。
（３−４）結果
結果は図１に示したとおりである。この図１に示したように、シアル酸ナトリウムを含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、特に３〜１４％濃度において高いシグナル強度が得られることが確認された。
実施例２
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品と、そのオリゴマー乾燥品（ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー）を、実施例１と同様に溶解し、ｐＨ調製し、最終濃度が３０％のシアル酸Ｎａ溶液を調製した。
また、酵母（サッカロマイセスセルビジェ）由来のＤＮＡ（Ｙ１−１０ＢおよびＹ５３−１Ａ）を精製し、それぞれＴＥバッファー１００μｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液のＤＮＡ濃度は３．０３μｇ／ｍｌであった。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各シアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、表３に示した液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。
前記（１）で作成した各々の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理することによって、ＤＮＡプローブを固定化した７種類のＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ８．７５μｌ、１０％ＳＤＳ１．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３．３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで測定した。
（３−４）形状判定
ガラス上に固定されたＤＮＡプローブを含むスポットの形状を、実体顕微鏡を用いた目視により判定し、サテライト出現率を計上した。また、ハイブリダイゼーション処理後の蛍光画像から、目視で確認できなかったサテライトを判定し、出現率を計上した。
（３−５）結果
結果は表４に示したとおりである。この表４に示したように、シアル酸類水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、純水を含むプローブ溶液組成物を使用したＤＮＡチップに比較して、サテライト形状不良の出現率が明らかに低く、良好なスポット形状が形成されることが確認された。
（１）液体組成物の作成
シアル酸ナトリウム（Ｎａ）凍結乾燥品、およびカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）を、表５に示した組成で溶解し、ｐＨ調製し、シアル酸Ｎａの最終濃度が６〜４２％のシアル酸Ｎａ溶液と、２％ＣＭＣ溶液を調製した。
ＤＮＡ溶液（２０μｌ）、各濃度のシアル酸Ｎａ溶液（２０μｌ）および純水（２０μｌ）を混合し、シアル酸Ｎａ濃度が２、７、１０および１４の液体組成物（ＤＮＡ／シアル酸Ｎａ溶液）を作成した。また、０．５％ＣＭＣ濃度の液体組成物（ＤＮＡ／ＣＭＣ溶液）を作成した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した各々の液体組成物をインクジェットノズルのマイクロピペット（例えば、特開２００１−１８６８８１号公報記載の装置）に充填し、ポリＬリジンでコーティングしたスライドガラスに２００ｐｌづつスポッティングした。次いで、各液体組成物をスポットしたガラスの半数（３枚）には、スポット部分に水分付加を行い、約８０℃で１時間焼成し、固定化処理することによって、ＤＮＡプローブを固定化したＤＮＡチップを作成した。また、残りの半数（３枚）は、水分付加を行わずにベーキングし、固定化処理してＤＮＡチップを作成した（表６、７）。
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ＤＮＡチップ５枚当たりの試料として、酵母ｍＲＮＡ５μｌ、ＤＥＰＣ処理水 １μｌ、ｏｌｉｇｏ ｐｒｉｍｅｒ １μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１ｍＭ ｆｒｕｏｒｉＬｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．５μｌを混合した。これに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ０．５μｌを添加して４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５μｌ、１Ｎ ＮａＯＨ １０μｌを添加して６５℃で６０分間加熱した。トリス（１Ｍ，ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０を用いて８０００ｒｐｍで５分間遠心濾過し、滅菌水２５０μｌを添加し８０００ｒｐｍで１０分間の遠心濾過を２回実施した後、３０００ｒｐｍ、４５秒間の遠心分離によって標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ２４．５μｌ、２０×ＳＳＣ８．７５μｌ、１０％ ＳＤＳ１．７５μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に１５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚につき１７．５μｌづつ２回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、６５℃の湿潤環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５５℃に加熱した２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．０５×ＳＳＣでリンスし、遠心・乾燥した。
（３−３）蛍光測定による形状判定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙ（ＢＭ機器スキャナー）にセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ８０％、ＰＭＴ８０％、解像度１０μｍで、固定スポットの形状を判定した。すなわち、スポット内で明るさが均一でなく、蛍光強度が一定でない形状スポット数をカウントした。
（３−４）結果
結果は表８に示したとおりである。従来のＣＭＣを使用して水分付加を行わない場合には、１００％の割合で不良スポットが出現するのに対し、シアル酸ナトリウム水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成したＤＮＡチップは、特に２〜１４％濃度において、水分付加を行わない場合であっても不良スポットの出現をほぼ完全に防止することが可能であることが確認された。
（１）液体組成物の作成
塩化ナトリウム３Ｍとクエン酸ナトリウム０．３Ｍを混合し、ｐＨ７．０に調整することにより２０×ＳＳＣ液を調製した。次いで、シアル酸を水で溶解し、１０％のシアル酸溶液を調製した。またオリゴＤＮＡ（５０塩基長）凍結乾燥品を１００ｐｍｏｌ／μｌ（１．６５μｇ／μｌ）となるように純水に溶解した。以上の溶液を、ＤＮＡ溶液：５０ｐｍｏｌ／μｌ、１×ＳＳＣ（塩化ナトリウム０．３Ｍ＋クエン酸ナトリウム０．０３Ｍ）、シアル酸溶液：１％の割合で混合し、液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を調製した。対照として、シアル酸を含まない液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ）も調製した。
（２）ＤＮＡチップの作成
前記（１）で作成した液体組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）をインクジェットのマイクロピペットに充填し、エポキシランを被覆したスライドガラスに２００ｐｌずつスポッティングした。次いで、湿度５０％下で、４２℃インキュベータ内で８時間反応させることにより共有結合反応を進行させ、固定化処理を行って、オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを固定したＤＮＡチップを作成した。また、対照液体組成物を用いて同様にＤＮＡチップを作成した。
（３）測定
（３−１）標識ｃＤＮＡの調製
ラットｍＲＮＡ（クロンテック社製、５μｇ／μｌ）５μｌ、ＤＥＰＣ処理水１μｌ、ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）Ｐｒｉｍｅｒ１μｌを混合し、７０℃で５分間、４２℃で３分間加熱した。これに、５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ２μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ ２μｌ、１Ｍｍ Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ ｄＵＴＰ ２μｌ、４０ ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｏｔ ２．５μｌを混合した。これに、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）１μｌを添加し、４２℃で４０分間加熱、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ １μｌを添加し、４２℃で４０分間加熱した後、滅菌水２０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）５μｌ、１Ｎトリス塩酸（ｐＨ７．５）を２５μｌ添加して中和した後、ＱＩＡＧＥＮＴＭカラムを用いて精製し、純水により標識ｃＤＮＡを回収した。
（３−２）ハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡ １１．２５μｌ、２０×ＳＳＣ ８μｌ、１０％ ＳＤＳ ０．７μｌを混合し、９５℃で３分間加熱、室温に５分間放置した後、ＤＮＡチップ１枚に１５μｌスポットし、カバーガラス（２４×３２ｍｍサイズ）をかぶせ、６５℃の温度環境下で１６時間放置した。
次いで、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ液中にＤＮＡチップを浸して静かにカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ液中で５分間放置、１×ＳＳＣ液中で洗浄、０．５×ＳＳＣ液中で洗浄後、９００ｒｐｍ、２分間遠心、乾燥した。
（３−３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション処理後のＤＮＡチップをＳｃａｎ Ａｒｒａｙにセットし、Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ７０％、ＰＭＴ ６０％、解像度５μｍで測定した。
（３−４）結果
結果は表９に示したとおりである。従来のプローブ溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ）を用いて作成したＤＮＡチップに比べ、この発明のプローブ溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を用いて作成したＤＮＡチップでは、測定した全ての遺伝子ｃＤＮＡについて高いシグナル強度が得られた。
プローブ溶液組成物に塩を含有させる場合の好ましい塩濃度範囲を探索した。
（１）方法
ＳＳＣ バッファーの塩濃度を変更した以外は、実施例４と同様に溶液組成物（ＤＮＡ／ＳＳＣ／シアル酸溶液）を調製し、ＤＮＡチップを作成した。また、実施例４と同様に標識ｃＤＮＡを調製し、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光測定を行った。
（２）結果
心筋アクチンｃＤＮＡの検出結果を表１０に示す。この結果から明らかなように、少なくとも１０−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０−２〜１ｍｏｌ／ｌ程度の塩を含有させることによって、高いシグナル強度を得ることが可能となる。
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための新しいプローブ溶液組成物が提供される。これによって、反応性チップにおける検出感度の向上、高密度化、製造工程の省略化が実現され、高精度の反応性チップを低価格で大量に提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、様々な濃度のシアル酸ナトリウム水溶液を含むプローブ溶液組成物を用いて作成したＤＮＡチップにおけるシグナル強度の測定結果を示す。
Claims (7)
- 標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、DNA断片、RNA断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ペプチド、またはそれらの任意の複合物であるプローブと、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩からなる群より選択される１種または２種以上の保湿性物質とを含有し、かつ保湿性物質の含有量が１〜15重量％であることを特徴とするプローブ溶液組成物。
- さらに、少なくとも10-3mol/lの塩を含有する請求項１のプローブ溶液。
- 請求項１または２のプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップ。
- 請求項１または２のプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポットを基板上で固定化することを特徴とする反応性チップの製造方法。
- インクジェット方式でスポッティングを行う請求項４の製造法。
- プローブ溶液組成物スポットを、水分付加を行わずに固定化する請求項４または５の製造方法。
- スポッティングを２回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化する請求項４、５または６の製造方法。
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