CN117761322A - 用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents
用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用。该试剂盒包括SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂。SERS检测芯片为表面修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片，第一试剂为Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt‑P，第二试剂为发夹型DNA单链H2，第三试剂为SERS探针，通过SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂的相互配合，检测SERS检测芯片上SERS探针的拉曼信号，可以实现对于急性心肌梗死蛋白标志物的快速、高灵敏检测，克服了现有的基于抗体识别的免疫检测技术在检测灵敏度、时效性、便携操作性等方面的不足。
Description
技术领域
本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
急性心肌梗死目前主要通过检测心肌生物标志物(心肌肌钙蛋白(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌红蛋白(Myo)等)来进行诊断。相较于其他心肌生物标志物，cTnI更具特异性。因此，定量分析cTnI有望实现早期急性心肌梗死(AMI)的有效诊断。然而，由于其在血液中的表达水平的增加具有一定的延迟，因此检测cTnI时存在灵敏度和准确性方面的限制，迫切需要开发高灵敏度和高选择性的cTnI检测方法。目前已有许多研究采用如ELISA、化学发光、荧光和电化学等技术进行cTnI检测，但这些方法存在灵敏度低，检测时间长等不足。相比之下，表面增强拉曼散射(SERS)技术因其高灵敏度和快速检测的优势，在痕量分子的定性和定量分析方面已被广泛应用。因此，开发基于SERS技术的高灵敏度、高选择性的cTnI检测试剂盒对于实现早期AMI的有效诊断具有独特的技术优势。
近年来，许多基于抗体识别cTnI的SERS免疫检测策略已被报道。然而，抗体的蛋白质性质导致其具有生产成本高、稳定性差、生产步骤漫长、孵育时间长等限制。相比之下，适配体作为单链DNA，表现出更好的稳定性、更强的物种识别、更容易储存和更方便合成的优点。因此，使用适配体技术来识别cTnI蛋白，可以为AMI的诊断提供高效、快速和可靠的工具。催化发夹组装(CHA)作为一种核酸介导的信号放大技术，具有无酶、等温反应和信号放大效率高等特点，在靶标触发下，两个发夹DNA相互杂交组装形成双链结构，从而导致靶标的循环和百倍催化放大，为构建高灵敏的心肌肌钙蛋白(cTnI)表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒提供了信号放大策略。
针对基于抗体识别cTnI的免疫检测技术的不足，需要开发一种用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒，制备及应用简单，检测快速、灵敏度高、特异性好。
发明内容
发明目的：针对当前早期急性心肌梗死(AMI)有效诊断的重大需求，以及基于抗体识别的免疫检测技术在检测灵敏度、时效性、便携操作性等方面的不足，本发明公开了一种用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用。
该表面增强拉曼散射检测试剂盒，包括：SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂。其中SERS检测芯片通过在银纳米棒阵列基片表面修饰发夹型DNA单链H1制备得到，第一试剂为Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt-P，第二试剂为发夹型DNA单链H2，第三试剂为SERS探针即修饰有Probe单链和拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的金纳米颗粒。
本发明公开的用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测(SERS)试剂盒制备简单、检测快速(60分钟)、灵敏度高(检测限低至10pg/mL)、特异性好(能识别不同蛋白标志物)，可通过修改核酸探针的碱基序列，检测包括急性心肌梗死在内的各种疾病类型的生物标志物，为疾病相关标志物检测提供了一种普适技术。相比现有的免疫检测技术具有显著优势，在急性心肌梗死早期诊断等领域具有突出的应用优势。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒，包括：SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂。
其中SERS检测芯片通过在银纳米棒阵列基片表面修饰发夹型DNA单链H1制备得到；
第一试剂为Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt-P；
第二试剂为发夹型DNA单链H2；
第三试剂为SERS探针，即表面修饰Probe单链和拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的金纳米颗粒。
所述银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，并在其表面用聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜制备3×10阵列型小孔，每个小孔的孔径为3～5mm，深度为0.8～1.2mm。作为优选地，所述小孔的孔径为4mm，深度为1mm。
所述金纳米颗粒(AuNP)粒径为15～100nm。作为优选地，所述金纳米颗粒粒径为15nm。
所述发夹型DNA单链H1碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述形成双链Apt-P的Aptamer碱基序列如SEQ ID NO：2所示，Primer碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述Probe单链的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。
发夹型DNA单链H1(SEQ ID NO：1)：
5’-AAT GCG CAA CCC TTT CTC CGC ATT CCA ATA GAG AAA GGG TTG TTT TTTTT-(CH2)6-SH-3’
Aptamer单链(SEQ ID NO：2)：
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Primer单链(SEQ ID NO：3)：
5’-GAGAAA GGG TTG CGCATT-3’
发夹型DNA单链H2(SEQ ID NO：4)：
5’-TTT CTC TAT TGG AAT GCG GAG AAA GGG TGT CGC ATT CCA ATA ATG CCTCTAACC-3’
Probe单链(SEQ ID NO：5)：
5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTG GTTAGAGGCAT-3’。
所述形成第一试剂的Aptamer和Primer的摩尔浓度比为1：0.8～2，作为优选地，Aptamer和Primer的摩尔浓度比为1：1；
所述第一试剂的工作浓度为5～20μM，作为优选地，第一试剂浓度为10μM；
所述第二试剂的工作浓度为5～20μM，作为优选地，第二试剂浓度为10μM；
所述第三试剂浓度为1～10nM，作为优选地，所述第三试剂浓度为2.3nM。具体地，在制备第三试剂的过程中，金纳米颗粒(AuNP)的用量为500μL 2.3nM，Probe单链为10μL 50μM，拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)为10μL 100μM，经离心提纯后定容到50μL，即得。
上述用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)SERS检测芯片制备：
(1)制备银纳米棒阵列基片并用超纯水多次冲洗；
(2)将发夹型DNA单链H1退火处理，所述的退火处理是加热95℃放置5～10min后于冰水浴中降温至25～37℃；
(3)将浓度为10～20μL 500～2000nM序列如SEQ ID NO：1所示的发夹型DNA单链H1与银纳米棒阵列基片共培养，培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置3～5小时；
(4)使用反应缓冲液清洗基片后，将10～20μL 0.1～1mM 6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面置于25～37℃恒温混匀仪中反应10min；
(5)依次用反应缓冲液和超纯水多次清洗基片，得到SERS检测芯片；
2)第一试剂制备：将序列如SEQ ID NO：2所示的Aptamer单链和序列如SEQ ID NO：3所示的Primer单链，按照浓度比为1：0.8～2的比例混合并于90～95℃退火5～10min，即得；
3)第二试剂制备：根据发夹型DNA单链H1设计并合成具有如SEQ ID NO.4所示序列的发夹型DNA单链H2；
4)第三试剂制备：
(1)将1～10μL 10～100μM Probe单链与100～500μL 1～10nM AuNP溶液混合于0.5×TBE溶液中，并于25～37℃温度下200～400rpm培养过夜；
(2)每隔30分钟分4次缓慢加入5、10、15和20μL的1～3M NaCl溶液形成混合物，NaCl的最终浓度为100～300mM，在25～37℃温度下200～400rpm培养过夜；
(3)加入10～100μL 10～100μM的拉曼分子DTNB反应2～4小时；
(4)最后通过离心去除上清液，用0.5×TBE溶液分散离心沉积物并定容至10～100μL，即得。
其中，所述步骤1)-3)中的第一试剂的工作浓度为5～20μM，第二试剂的工作浓度为5～20μM，第三试剂的工作浓度为1～10nM。
上述用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的应用如下(以用于非疾病诊断目的的检测急性心肌梗死蛋白标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)为例)：
1)将第一试剂、第二试剂和第三试剂与含有不同浓度目标心肌肌钙蛋白(cTnI)的样品溶液混合，滴加至SERS检测芯片表面共培养；心肌肌钙蛋白(cTnI)的浓度范围为10pg/mL～500ng/mL；
2)用超纯水清洗SERS检测芯片多次后进行SERS测试，得到不同浓度目标cTnI对应的SERS光谱及其特征信号强度值，以目标cTnI浓度的对数为横坐标，以SERS特征峰强度值为纵坐标，得到表面增强拉曼散射检测试剂盒的工作曲线，根据工作曲线计算表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的检测限；
3)将待检测样品与第一试剂、第二试剂和第三试剂混合后滴加至SERS检测芯片表面共培养，用超纯水清洗芯片多次后进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值，根据工作曲线计算得到待检测样品中目标cTnI的浓度。
其中，所述步骤1)和3)中共培养条件为在25～37℃，200～400rpm的恒温混匀仪中培养60～80min。
本发明的检测原理(以非疾病诊断目的的检测急性心肌梗死蛋白标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)为例)：
发夹型DNA单链H1通过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列基片表面，然后将6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面进行封闭，减少基片非特异性吸附，即可得到SERS检测芯片。
当目标cTnI存在时，由于Aptamer和cTnI蛋白的特异性结合，识别双链Apt-P的Primer从Apt-P释放，触发发夹型DNA单链H1和H2之间发生催化发夹组装(CHA)反应。在SERS检测芯片表面形成若干H1-H2双链，同时伴随Primer释放，供循环使用。
在SERS检测芯片上同时加入第一试剂、第二试剂和第三试剂后，第三试剂上的Probe单链与H1-H2双链的粘性末端杂交，将SERS探针捕获至SERS检测芯片上。
最后，通过测试SERS检测芯片上SERS探针的拉曼信号，实现对于急性心肌梗死蛋白标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)的快速、高灵敏及特异性检测。
有益效果：本发明与现有基于抗体识别的免疫检测技术相比，具有以下优点：
本发明公开了一种用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用。该表面增强拉曼散射检测试剂盒包含SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂。其中SERS检测芯片通过在银纳米棒阵列基片表面修饰发夹型DNA单链H1制备得到，第一试剂为Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt-P，第二试剂为发夹型DNA单链H2，第三试剂为SERS探针即表面修饰有Probe单链和拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的金纳米颗粒。
本发明公开的用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒制备简单、检测快速(60分钟)、灵敏度高(检测限低至10pg/mL)、特异性好(能识别不同蛋白标志物)，可通过修改核酸探针的碱基序列，检测包括急性心肌梗死在内的各种疾病类型的生物标志物，为疾病相关标志物检测提供了一种普适技术。相比现有的免疫检测技术具有显著优势，在急性心肌梗死早期诊断等领域具有突出的应用优势。
附图说明
图1是用于急性心肌梗死蛋白标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒制备示意图；
图2是实施例1表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的最优培养(检测)时间优化实验；
图3是实施例2表面增强拉曼散射检测试剂盒检测不同浓度cTnI的工作曲线；
图4是实施例3表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的特异性表征；
图5是实施例4表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的均一性表征。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。
本发明提供了一种用于检测急性心肌梗死蛋白标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒，其包括：
1、SERS检测芯片
所述SERS检测芯片是以银纳米棒阵列作为基片，在基片的表面修饰有发夹型DNA单链H1，所述发夹型DNA单链H1通过巯基与银形成共价键而固定在基片表面，然后在基片表面滴加6-巯基己醇(MCH)进行封闭，减少基片非特异性的吸附，从而得到SERS检测芯片。在本发明中，银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备(基于文献C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modified silver nanorodarrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal of MaterialsChemistry,2012,22(3):1150-1159.制备)，并用聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜封装其表面，PDMS模包括3×10阵列型小孔，每个小孔的孔径为3～5mm，每个小孔的深度为0.8～1.2mm。
2、第一试剂(即Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt-P)，其由摩尔浓度比为1：0.8～2的Aptamer单链和Primer单链混合并于90～95℃退火而得。作为优选，Aptamer和Primer的摩尔浓度比为1：1。所述第一试剂的工作浓度为5～20μM，作为优选，第一试剂浓度为10μM。
3、第二试剂(即发夹型DNA单链H2)，所述第二试剂的工作浓度为5～20μM，作为优选，第二试剂浓度为10μM。
4、第三试剂(即SERS探针)
第三试剂是配合SERS检测芯片而使用的SERS探针。其中，金纳米颗粒在一定尺寸和密度范围内，可达到SERS增强效果的最大值，其粒径为15～100nm，优选为15nm。所述第三试剂浓度为1～10nM，作为优选地，所述第三试剂浓度为2.3nM。具体地，在制备第三试剂的过程中，金纳米颗粒(AuNP)的量为500μL 2.3nM，Probe单链为10μL50μM，拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)为10μL 100μM，经离心提纯后定容到50μL即得。
以上所使用的DNA碱基序列片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。发夹型DNA单链H1、Aptamer单链和Primer单链、发夹型DNA单链H2和Probe单链碱基序列分别为：
发夹型DNA单链H1(SEQ ID NO：1)：
5’-AAT GCG CAA CCC TTT CTC CGC ATT CCA ATA GAG AAA GGG TTG TTT TTTTT-(CH2)6-SH-3’
所述发夹型DNA单链H1的3’端连接有-(CH2)6-SH基团；
Aptamer单链(SEQ ID NO：2)：
5’-CGT GCAGTACGC CAACCT TTC TCATGC GCT GCC CCT CTTA-3’
Primer单链(SEQ ID NO：3)：
5’-GAGAAA GGG TTG CGCATT-3’
发夹型DNA单链H2(SEQ ID NO：4)：
5’-TTT CTC TAT TGG AAT GCG GAG AAA GGG TGT CGC ATT CCA ATA ATG CCTCTAACC-3’
Probe单链(SEQ ID NO：5)：
5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTG GTTAGAGGCAT-3’
所述Probe单链的5’端连接有-(CH2)6-SH基团。
请参阅图1，为本发明的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的工作原理图。将第一试剂、第二试剂、第三试剂和待检测样本混合，然后滴加至SERS检测芯片表面。若待检测样本中含有心肌肌钙蛋白(cTnI)，第一试剂的Aptamer和cTnI特异性结合，第一试剂的Primer从中释放，Primer与H1杂交；第二试剂可与已杂交在H1上的Primer竞争杂交，释放出Primer和H1-H2双链，释放的Primer可供循环使用。第三试剂上的Probe单链与H1-H2双链的粘性末端杂交，将SERS探针捕获至SERS检测芯片上。因此，通过检测SERS检测芯片上SERS探针的拉曼信号，实现对于心肌肌钙蛋白(cTnI)的快速、高灵敏及特异性检测。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的制备
表面增强拉曼散射检测试剂盒包含：SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂。
1、SERS检测芯片
即以银纳米棒阵列作为基片，在基片表面修饰有浓度为500nM的发夹型DNA单链H1，所述银纳米棒阵列基片包括3×10阵列型小孔，每个小孔的孔径为4mm，每个小孔的深度为1mm。
2、第一试剂(即Aptamer和Primer杂交形成的识别双链Apt-P)
其由浓度比为1：1的Aptamer单链和Primer单链混合并于95℃退火即得，所述第一试剂的工作浓度为10μM。
3、第二试剂(即发夹型DNA单链H2)
发夹型DNA单链H1设计并合成的发夹型DNA单链H2，所述第二试剂的工作浓度为10μM。
4、第三试剂(即SERS探针)
即使用10μL 50μM Probe单链和10μL 100μM拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)修饰的500μL 2.3nM金纳米颗粒，所述金纳米颗粒的粒径为15nm。
本实施例的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的的制备方法，包括以下步骤：
1、制备SERS检测芯片
(1)制备银纳米棒阵列并用超纯水多次冲洗；
(2)将发夹型DNA单链H1退火处理，所述的退火处理是加热95℃放置5min后于冰水浴中降温至25℃；
(3)将浓度为20μL 500nM的发夹型DNA单链H1与银纳米棒阵列基片共培养，培养条件：37℃，80％湿度环境中静置3小时；
(4)使用反应缓冲液清洗基片后，将20μL 1mM 6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面置于25℃恒温混匀仪中反应10min；
(5)依次用反应缓冲液和超纯水多次清洗基片，得到SERS检测芯片；
2、制备第一试剂
将Aptamer单链和Primer单链，按照浓度比为1：1的比例混合并于95℃退火5min，即得，第一试剂的工作浓度为10μM；
2、制备第二试剂
根据发夹型DNA单链H1设计并合成的发夹型DNA单链H2，即为第二试剂，第二试剂的工作浓度为10μM；
3、制备第三试剂
(1)将10μL 50μM Probe单链与500μL 2.3nMAuNP溶液混合于0.5×TBE溶液中，并于37℃温度下300rpm培养过夜；
(2)每隔30分钟分4次缓慢加入5、10、15和20μL的2M NaCl溶液形成混合物，NaCl的最终浓度为200mM，在37℃温度下300rpm培养过夜；
(3)加入10μL 100μM的拉曼分子DTNB反应3小时；
(4)最后通过离心去除上清液，用0.5×TBE溶液分散离心沉积物并定容至50μL，即得。
实施例1表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的最优培养(检测)时间优化实验
将8μL 10μM第一试剂、2μL 10μM第二试剂、5μL第三试剂和4μL 10ng/mL cTnI混合于20μL反应缓冲液中，滴加至SERS检测芯片表面，置于37℃300rpm恒温混匀仪中分别反应10、20、30、40、50、60、70、80、90和100min后，使用反应缓冲液和超纯水清洗小孔并进行SERS检测，测试得到SERS光谱图，参见图2，可见，通过检测培养了10～100min不同时段后检测芯片的SERS信号，观察到在10～60min内，SERS强度逐渐增强，并在共培养60min时SERS信号达到最大饱和值，表明60min是最佳cTnI检测时间。
实施例2表面增强拉曼散射检测试剂盒检测不同浓度cTnI的工作曲线
将8μL 10μM第一试剂、2μL 10μM第二试剂、5μL第三试剂和4μL不同浓度的cTnI(10pg/mL～500ng/mL)混合于20μL反应缓冲液中，滴加至SERS检测芯片表面，在37℃300rpm恒温混匀仪中培养60min后，依次使用反应缓冲液和超纯水多次清洗小孔。自然风干后在SERS检测芯片上进行SERS测试(拉曼测试条件：扫描时间1s，激光功率1％，物镜放大倍率20×，累计次数1次，激发光波长785nm)，得到SERS光谱及其特征信号强度值，以目标cTnI浓度的对数为横坐标，以SERS探针的特征峰强度值为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的检测限。参照图3所示，其中(a)是检测含有不同浓度cTnI所得的SERS光谱，(b)是其各谱线在1331cm-1处所对应的SERS峰强度。对于检测cTnI，得到工作曲线为I1331＝1689×lg CT+6664(R2＝0.998)，通过计算检测限为3.5pg/mL。
实施例3表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的特异性表征
将目标cTnI稀释至2.5ng/mL，将牛血清白蛋白(BSA)、脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白C(cTnC)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)样品稀释至20ng/mL，并将没有添加任何额外生物分子的反应缓冲液用作空白对照。取8μL 10μM第一试剂、2μL 10μM第二试剂、5μL第三试剂分别和4μL 2.5ng/mL cTnI、4μL 20ng/mL BSA、BNP、cTnC和cTnT蛋白样品以及空白样品(反应缓冲液)混合。将上述混合溶液滴加至SERS检测芯片表面，在37℃300rpm恒温混匀仪中培养60min后，依次使用反应缓冲液和超纯水清洗小孔。自然风干后在SERS检测芯片上进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征峰强度值。参照图4所示，其中(a)是检测不同蛋白样品的SERS光谱，(b)是其谱线在1331cm-1处所对应的SERS峰强度。所制备的表面增强拉曼散射检测试剂盒可以较好的区分目标cTnI与其他蛋白样品，这表明表面增强拉曼散射检测试剂盒具有良好的特异性。
实施例4表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI的均一性表征
将8μL 10μM第一试剂、2μL 10μM第二试剂、5μL第三试剂和4μL 10ng/mL cTnI混合于20μL反应缓冲液中，滴加至SERS检测芯片表面，置于37℃300rpm恒温混匀仪中反应60min后使用反应缓冲液和超纯水冲洗干净，记录SERS检测芯片上15个随机点的SERS信号来研究表面修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片的均一性。参照图5所示，其中，(a)是检测10ng/mL cTnI的15个随机点的SERS光谱，(b)是其谱线在1331cm-1处所对应的SERS峰强度。对应于cTnI检测的15个随机点的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)很小(RSD＝6.14％)，这表明所提出的表面增强拉曼散射检测试剂盒检测cTnI具有良好的均一性。
Claims (9)
1.用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒，其特征在于，所述表面增强拉曼散射检测试剂盒包含SERS检测芯片、第一试剂、第二试剂和第三试剂；
所述SERS检测芯片为表面修饰有发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片；
所述第一试剂为Aptamer单链和Primer单链杂交形成的识别双链Apt-P；
所述第二试剂为发夹型DNA单链H2；
所述第三试剂为配合银纳米棒阵列基片使用的SERS探针；所述SERS探针为表面修饰Probe单链和拉曼分子5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒，其特征在于：
以检测急性心肌梗死蛋白标志物心肌肌钙蛋白cTn为例，
所述SERS检测芯片为表面修饰有序列如SEQ ID NO：1所示的发夹型DNA单链H1的银纳米棒阵列基片；
所述第一试剂是由序列如SEQ ID NO：2所示的Aptamer单链和序列如SEQ ID NO：3所示的Primer单链混合并于90～95℃退火而得；所述Aptamer和Primer的浓度比为1：0.8～2；
所述第二试剂为序列如SEQ ID NO：4所示的发夹型DNA单链H2；
所述第三试剂为表面修饰有序列如SEQ ID NO：5所示的Probe单链和5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的金纳米颗粒，所述Probe单链和DTNB的浓度比为1：1～3。
3.根据权利要求3所述的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒，其特征在于：
发夹型DNA单链H1(SEQ ID NO：1)：
5’-AAT GCG CAA CCC TTT CTC CGC ATT CCA ATA GAG AAA GGG TTG TTT TTT TT-(CH2)6-SH-3’
Aptamer单链(SEQ ID NO：2)：
5’-CGT GCA GTA CGC CAACCT TTC TCATGC GCT GCC CCT CTT A-3’
Primer单链(SEQ ID NO：3)：
5’-GAG AAAGGG TTG CGC ATT-3’
发夹型DNA单链H2(SEQ ID NO：4)：
5’-TTT CTC TAT TGG AAT GCG GAG AAAGGG TGT CGC ATT CCAATAATG CCT CTA ACC-3’
Probe单链(SEQ ID NO：5)：
5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTG GTT AGA GGC AT-3’。
4.根据权利要求1所述的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒，其特征在于，所述银纳米棒阵列基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，其包括3×10阵列型小孔，每个所述小孔的孔径为3～5mm，深度为0.8～1.2mm；
所述金纳米颗粒的粒径为15～100nm；
所述第一试剂的工作浓度为5～20μM，所述第二试剂的工作浓度为5～20μM，所述第三试剂的工作浓度为1～10nM。
5.根据权利要求1或者2所述的一种用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)SERS检测芯片制备：
(1)制备银纳米棒阵列基片并用超纯水多次冲洗；
(2)将发夹型DNA单链H1退火处理，所述的退火处理是加热90～95℃放置5～10min后于冰水浴中降温至25～37℃；
(3)将浓度为10～20μL 500～2000nM序列如SEQ ID NO：1所示的发夹型DNA单链H1与银纳米棒阵列基片共培养，培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置3～5小时；
(4)使用反应缓冲液清洗基片后，将10～20μL0.1～1mM 6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面置于25～37℃恒温混匀仪中反应；
(5)依次用反应缓冲液和超纯水多次清洗基片，得到SERS检测芯片；
(二)第一试剂制备：
将序列如SEQ ID NO：2所示的Aptamer单链和序列如SEQ ID NO：3所示的Primer单链，按照浓度比为1：0.8～2的比例混合并于90～95℃退火5～10min，即得；
(三)第二试剂制备：
根据发夹型DNA单链H1设计并合成具有如SEQ ID NO.4所示序列的发夹型DNA单链H2；
(四)第三试剂制备：
(1)将1～10μL 10～100μM Probe单链与100～500μL 1～10nM AuNP溶液混合于0.5×TBE溶液中，并于25～37℃温度下200～400rpm培养过夜；
(2)每隔30分钟分4次缓慢加入5、10、15和20μL的1～3M NaCl溶液形成混合物，NaCl的最终浓度为100～300mM，在25～37℃温度下200～400rpm培养过夜；
(3)加入10～100μL10～100μM的拉曼分子DTNB反应2～4小时；
(4)最后通过离心去除上清液，用0.5×TBE溶液分散离心沉积物并定容至10～100μL，即得。
6.根据权利要求5所述的用于急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的制备方法，其特征在于：反应缓冲液是10mM tris-HCl和1mM MgCl2，pH 8.0。
7.一种用于非疾病诊断目的的急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的应用。
8.根据权利要求7所述的用于非疾病诊断目的急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的应用，其特征在于，步骤如下：
1)将第一试剂、第二试剂和第三试剂与含有不同浓度目标急性心肌梗死蛋白标志物的样品溶液混合，滴加至SERS检测芯片表面共培养；
2)用超纯水清洗SERS检测芯片多次后进行SERS测试，得到不同浓度目标急性心肌梗死蛋白标志物对应的SERS光谱及其特征信号强度值，以目标急性心肌梗死蛋白标志物浓度的对数为横坐标，以SERS特征峰强度值为纵坐标，得到表面增强拉曼散射检测试剂盒的工作曲线，根据工作曲线计算表面增强拉曼散射检测试剂盒检测急性心肌梗死蛋白标志物的检测限；
3)将待检测样品与第一试剂、第二试剂和第三试剂混合后滴加至SERS检测芯片表面共培养，用超纯水清洗芯片多次后进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值，根据工作曲线计算得到待检测样品中目标急性心肌梗死蛋白标志物的浓度。
9.根据权利要求8所述的用于非疾病诊断目的急性心肌梗死蛋白标志物检测的表面增强拉曼散射检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤1)和3)中共培养条件为在25～37℃，200～400rpm的恒温混匀仪中培养60～80min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |