JP2007536528A - アプタマー・ナノ粒子コンジュゲートおよび標的分析物の検出のための同使用方法 - Google Patents
アプタマー・ナノ粒子コンジュゲートおよび標的分析物の検出のための同使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007536528A JP2007536528A JP2007511707A JP2007511707A JP2007536528A JP 2007536528 A JP2007536528 A JP 2007536528A JP 2007511707 A JP2007511707 A JP 2007511707A JP 2007511707 A JP2007511707 A JP 2007511707A JP 2007536528 A JP2007536528 A JP 2007536528A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aptamer
- probe
- target analyte
- binding
- nanoparticles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y10/00—Nanotechnology for information processing, storage or transmission, e.g. quantum computing or single electron logic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies
Abstract
Description
本発明は、アプタマープローブ、ナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ、アプタマー・アレイ、標的分析物のアプタマープローブとの結合を検出することからなる試料中の標的分析物の検出方法、検出方法、およびキットに関する。
本願は2004年11月22日出願の米国特許出願第10/995051号の一部継続出願であり、2004年5月3日出願の米国仮特許出願第60/567874号の利益を主張する。米国特許出願第10/995051号および米国仮特許出願第60/567874号の全体を本明細書に援用する。
抗体マイクロアレイによるタンパク質分析物の検出は、プロテオミクスならびに診断の強力なツールとして登場した(非特許文献1〜3)。抗体アレイを標識するための多種多様な検出法が開発されており、限定するものではないが、蛍光(非特許文献1、非特許文献4)、化学発光(非特許文献2)、共鳴光散乱(非特許文献3)、およびSERS(非特許文献5)が挙げられる。また、ローリングサークル型増幅(RCA)法などのシグナル増幅戦略を使用して、蛍光を用いる方法の検出感度が増大されてきた(非特許文献6および7)。これらの方法はタンパク質分析物の高感度検出(<10pg/mL)を提供してきたが、そのような標識方法の使用は、交差反応を生じ易い抗体の性能による制限を受けてきた(非特許文献3)。また、高度に精製された抗体試薬を再現性よく調製するのは困難であると同時に時間を要する(非特許文献8)。したがって当該分野では、対象のタンパク質分析物に対する高い感度および特異性を提供するだけでなく製造および使用の際の再現性も提供するプローブ・システムが必要とされている。
本発明は、非核酸分子および核酸分子などの分析物を検出する方法を提供する。1実施形態では、該方法は、アプタマーが結合しているナノ粒子(ナノ粒子・アプタマーコンジュゲート)に分析物を接触させる工程を含み、該アプタマーは特異的標的分析物に結合することのできる構造を有する。この接触工程は、ナノ粒子上のアプタマーと分析物との結合を可能にするのに有効な条件下で行われる。ナノ粒子上のアプタマーを分析物に結合させると、検出可能な変化が生じる。
別の実施形態では、2種類以上のナノ粒子プローブが提供され、各種類のナノ粒子プローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両者に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
ーが結合している少なくとも2種類のナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と;(c)ナノ粒子に結合しているアプタマーが標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
磁性ビーズまたは表面が平坦な基材などの任意の基材を用いてよい。基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックなどの任意の適切な材料から作製されてよい。本実施形態の1態様では、基材は位置指定可能であり、各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブがアレイ状のスポットとして基材に結合される。本実施形態の別の態様では、捕捉プローブの各スポットが2つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、工程(d)が導電率の変化を検出する工程を含んでもよい。電極およびナノ粒子は金などの任意の導電性材料から構成されてよい。必要に応じて、基材を銀染色剤と接触させて導電率の変化を発生させてもよい。
手段を提供するオリゴヌクレオチドである。該DNAバーコードは任意選択で検出標識、例えば、フルオロフォアで標識されてもよい。該検出標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする。
別の態様では、該コンジュゲートプローブには、アプタマーに加えてさらに希釈オリゴヌクレオチドが結合している。該希釈オリゴヌクレオチドには、ポリA10[配列番号6]またはポリA20[配列番号7]などの任意の適切な長さのポリアデノシンオリゴヌクレオチドがある。
別の実施形態では、基材に結合したアプタマーが2つの電極の間に配置され、該ナノ粒子が導電体である材料から作製され、本発明の方法の工程(d)が導電率の変化を検出する工程を含んでもよい。さらに別の実施形態では、各々異なる標的分析物を認識し得る複数のアプタマーがアレイ状のスポットとして基材に結合され、アプタマーのスポットの各々が2つの電極の間に配置され、ナノ粒子が導電体である材料から作製され、本発明の方法の工程(d)は導電率の変化を検出する工程を含む。該電極は、例えば金から作製することができ、ナノ粒子は金から作製される。あるいは、基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させることもできる。
を提供する工程と;(b)標的分析物の第2の結合部位に結合することのできる少なくとも1種類の検出アプタマープローブを提供する工程と;(c)該捕捉プローブが該標的分析物の第1の結合部位に結合し、かつ該アプタマープローブが該標的分析物の第2の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を基材およびプローブに接触させる工程と;(d)検出可能な変化を観察する工程とを含む。捕捉された標的とアプタマープローブとの複合体は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出される。
別の態様では、2種類以上のアプタマープローブが提供され、各種類のプローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
任意の適切な基材を用いてよく、そのような基材は位置指定可能であってもよい。代表的な基材を上に記載した。各々異なる標的分析物を認識し得る複数の捕捉プローブをアレイ状のスポットとして基材に結合させることができる。必要に応じて、捕捉プローブの各スポットが2つの電極の間に配置され、アプタマープローブ上の任意選択の標識が導電体である材料から作製されたナノ粒子であり、導電率の変化が検出されてもよい。電極は金から作製することができ、該ナノ粒子は金から作製することができる。
分析物を検出する方法が提供され、該方法は、(a)請求項33に記載の少なくとも2種類のアプタマープローブであって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするアプタマープローブを提供する工程と;(b)該試料と、該少なくとも2種類のアプタマープローブとを、該標的分析物と該ナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と;(c)該アプタマーが該標的分析物に結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
文脈上必要な場合以外は、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語はその単数形を含むものとする。
本明細書で用いられる場合「核酸配列」、「核酸分子」または「核酸」は、本明細書に定める1つまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
チオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合などを含む。例えば、ラプランシェら(LaPlanche et al.)、1986年、Nucl.Acids Res.、第14巻、p.9081;ステックら(Stec
et al.)、1984年、J.Am.Chem.Soc.、第106巻、p.6077;スタインら(Stein et al.)、1988年、Nucl.Acids Res.、第16巻、p.3209;ゾンら(Zon et al.)、1991年、Anti−Cancer Drug Design、第6巻、p.539;ゾンら(Zon
et al.)、1991年、「OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH」、pp.87〜108、(エフ.エクスタイン(F.Eckstein)編、英国オックスフォードのオックスフォード大学出版(Oxford University Press);ステックら(Stec et al.)、米国特許第5151510号明細書;ウフルマンとペイマン(Uhlmann and Peyman)、1990年、Chemical Reviews、第90巻、p.543を参照されたい。これらの文献の開示を目的に応じて本明細書に援用する。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にするための検出可能な標識を含み得る。
cations」、p.51〜63(マルセル・デッカー(Marcel Dekker)、1987年))がある。
Szostak)、1990年、Nature、第346巻、p.818)。アプタマーは典型的には10〜300ヌクレオチド長である。RNAおよびDNAアプタマーは、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment;試験管内人工進化法)などのin vitro選択実験から得ることができる。アプタマーの使用および技術の例は、PhotoSELEX(商標)およびRiboreporters(商標)である。アプタマー、その使用および製造法については、例えば、米国特許第5840867号明細書、米国
特許第6001648号明細書、米国特許第6225058号明細書、米国特許第6207388号明細書および米国特許出願公開第20020001810号に記載されており、本明細書にそれらの開示全体を援用する。
Bind Specific ligands」、Nature、第346巻、p.818〜822に記載されている。例えば、DNAオリゴマーのヘテロ集団を合成して、アプタマーのin vitro選択のための候補となるオリゴマーを提供することができる。この最初のDNAオリゴマー集団は、15〜100ヌクレオチド長の無作為配列に10〜50ヌクレオチド長の一定の5’および3’配列が隣接しているもののセットである。この一定領域は、PCRプライマーがハイブリダイゼーションする部位を提供し、また1実施例では、RNAポリメラーゼによる転写を開始してRNAオリゴマーの集団を生成するための部位を提供する。この一定領域は、選択されたアプタマーをクローニングするための制限酵素認識部位も含む。一定領域の多数の実例をアプタマーの進化において用いることができる。例えば、コンラッドら(Conrad et al.)、「In Vitro Selection of Nucleic Acid Aptamers That Bind Proteins」、Methods in Enzymology、第267巻、p.336〜383(1996年);シエシオルカら(Ciesiolka
et al.)、「Affinity Selection−Amplification from Randomized Ribooligonucleotide Pools」、Methods in Enzymology、第267巻、p.315〜335(1996);およびフィッツウォーターら(Fitzwater et al.)、「A SELEX Primer」、Methods in Enzymology、第267巻、p.275〜301(1996年)を参照されたい。
Oligonucleotides Functions」、Annual Revi
ew of Biochemistry、第64巻、p.763〜797(1995年)を参照されたい)、相応の抗原に対する抗体の親和性と同程度に強力な、標的に対するnMの結合親和性を有する場合が最も多い。グリフィンら(Griffin et al.)、EMBO J.、第13巻、p.3245〜3260(1994年)を参照されたい。
ゴヌクレオチドとを含む。該オリゴヌクレオチド・テールは、有利なことに、多重化、例えば、蛍光体、デンドリマー、放射性標識、酵素等の様々な検出部分で標識した様々なオリゴヌクレオチド・プローブを結合させることを可能にする。オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマープローブは、直接的または間接的サンドイッチ・アッセイなどの、標的分析物を検出する種々のアッセイにおいて広く有用である。図16は代表的なサンドイッチ・アッセイを示しており、同アッセイは、捕捉用基材、例えば、捕捉抗体プローブを有する磁性ビーズ(MB)と、検出部分で標識されたリンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド・テールを備えた検出アプタマーを有する検出プローブと、捕捉プローブと検出アプタマーとの間に挟まれた標的分析物を要している。図16(b)は図16(a)と同じであるが、リンカーオリゴヌクレオチドを単一のDNAバイオバーコードとして使用したものを示している。該DNAバイオバーコードは、任意選択で増幅(例えば、PCR増幅)して、サンドイッチ・アッセイなどの任意の適切な手段によって検出することができる。好ましくは、該DNAバイオバーコードは、アレイ化された基材および銀増幅を用いて高感度のナノ粒子系検出システムを利用して検出される(図17)。米国特許第6750016号明細書および2004年6月25日出願の米国特許出願第10/877750号明細書を参照されたい。これらの特許文献の全体を本明細書に援用する。別例として、該DNAバイオバーコードを蛍光体などの任意の適切な検出標識で標識することができる。標識されたDNAバイオバーコードは溶液系の蛍光定量法などの任意の適切な手段によって検出することができる。
第126巻、p.5932〜5933)である。このバイオバーコード増幅法は、これまで研究されてきたこの系のためのイムノPCR法よりも感度が高く、酵素増幅に頼らず、あまり複雑ではないという利点を有する。バイオバーコード・アッセイの説明については、本明細書にその全体を援用する2004年6月25日出願の米国特許出願第10/877750号を参照されたい。該バイオバーコード増幅アッセイでは一般に2種類の粒子、すなわち、対象の標的に対して親和性を有する基で官能化された磁性マイクロ粒子(MMP)と、その同じ標的に対して親和性を有する第2の基とともに該対象の標的に関するレポーター基として働き得るオリゴヌクレオチド(バーコードDNA)で官能化されたナノ粒子とを要する。標的がタンパク質である場合、該磁性粒子上の認識物質は典型的にはモノクローナル抗体であるが、アプタマーであってもよく、金ナノ粒子上の認識物質はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、磁性粒子上の抗体のとは異なる抗原決定基を認識するアプタマーであることが好ましい。バイオバーコード・アッセイでは、MMPプローブが対象のタンパク質標的の入った溶液に添加される。MMPプローブに標的と反応する機会を与えた後、バーコードDNAを有するナノ粒子プローブを加えて、捕捉された標的を有するMMPプローブとともにサンドイッチ構造を形成する。適切な分離方法、例えば、磁界を用いてそのようなサンドイッチ複合体を試験溶液から分離することが可能であり、その上清は廃棄する。バーコードDNAを脱ハイブリダイズしてから金ナノ粒子プローブを用いてマイクロアレイ検出すると、そのバーコード配列を同定し、試験溶液中のタンパク質標的の量を定量することが可能となる。別例として、ナノ粒子に結合しているDNAバーコードを任意の適切な標識(蛍光体など)でさらに修飾し、蛍光検出法などの別の適切な手段によって検出することもできる。図18は、DNAバーコードを有するナノ粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートで標識したアプタマープローブを用いた、アプタマーを介在させたバイオバーコード・アッセイを示している。分離されたDNAバイオコードは、一部には該バイオコードが標識されているか否かに応じて、任意の適切な手段によって検出することができる。
好適には約10〜約30nmである。ナノ粒子はロッドであってもよい。本発明に有用な他の粒子にはシリカおよびポリマー(例えば、ラテックス)のナノ粒子がある。
et al.)、J.Phys.Chem.、第95巻、p.5382(1992年)を参照されたい。
所望のレベルの結合相互作用を示すように調整する手段が提供される。この希釈オリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、コンジュゲートを調製するためにナノ粒子と接触させる溶液中における比とほぼ同じ比でナノ粒子に結合することがわかっている。したがって、コンジュゲートが所望の数の結合事象に関与するように、ナノ粒子に結合する希釈オリゴヌクレオチドとアプタマーとの比を制御することができる。希釈オリゴヌクレオチドは、アプタマーがナノ粒子に結合される能力または標的分析物と結合する能力に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、希釈オリゴヌクレオチドは、アプタマーまたは核酸標的分析物の配列に相補的な配列を有するべきではない。希釈オリゴヌクレオチドはまた、アプタマーが個々の標的と結合する能力に干渉することなく、アプタマーがその標的に結合しうるように、アプタマーの長さよりも短いことが好ましい。
子を用いてよい。
ナノ粒子に接触させる。このような時間は実験的に決定することができる。例えば、約12〜24時間で良好な結果が得られることがわかっている。アプタマーおよびオリゴヌクレオチドを結合するための他の適切な条件も実験的に決定することができる。例えば、約10〜20nMのナノ粒子濃度で室温にてインキュベートすれば良好な結果が得られる。
「エイジング」工程の使用によって生産されたアプタマー・ナノ粒子コンジュゲートは、「エイジング」工程を用いずに生産したものよりも大幅に安定性が高いことがわかった。上記のように、この安定性の増大は、「エイジング」工程により達成されるナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増大による。「エイジング」工程によって達成される表面密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにアプタマー/オリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存する。ナノ粒子を安定するために適した表面密度、およびナノ粒子とアプタマー/オリゴヌクレオチドの所望の組み合わせについて該表面密度を得るのに必要な条件は、実験的に決定することが可能である。
る複数のオリゴヌクレオチドで官能化されているので、十分な標的が存在する場合、標的と結合させると標的/金ナノ粒子プローブ凝集体が形成されることになる。このDNA標的の認識の結果、粒子の粒子間距離が減少することによって色が変化する。この色の変化を、UV/vis分光光度計を用いて光学的に測定してもよいし、肉眼で視覚的に観察してもよい。さらに、該溶液を膜上で濃縮すると、この色が増強される。したがって、単純な色の変化により特異的DNA配列の有無が証明される。このアッセイを用いて、モデルDNA標的およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅された核酸配列についてフェムトモル量およびnMの濃度が検出されている。
色から陰性結果を表す色を差し引くことによってアッセイの感度を増大させうることがわかっている。
を援用する同時係属の2004年11月22日出願の米国特許出願第10/995051号も参照されたい。ナノ粒子プローブ複合体は特異的標的分析物に結合した2以上のプローブを含む。
別の態様では、2種類以上のナノ粒子プローブが提供され、各種類のプローブには、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基に、または異なる標的分析物に、あるいはその両者に結合することのできる検出アプタマーが結合している。
任意の適切な基材を用いてよく、そのような基材は位置指定可能であり得る。代表的な
基材は上記に記載した。各々異なる標的分析物を認識し得る複数の捕捉プローブを、アレイ状のスポットとして基材に結合させることができる。必要に応じて、捕捉プローブの各スポットを2つの電極の間に配置し、アプタマープローブ上の任意選択の標識を導電体の材料から作製されたナノ粒子とし、かつ導電率の変化を検出することもできる。該電極は金から作製され、該ナノ粒子は金から作製される。
本発明のさらに別の実施形態では、試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法が提供され、該方法は、(a)標的分析物の2つ以上の結合部位に結合することのできる、請求項33に記載のある種類の検出アプタマープローブを提供する工程と;(b)該試料と、アプタマーが結合しているアプタマープローブとを、該標的分析物と該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と;(c)該標的分析物がアプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程とを含む。
以下の例示的実施例によって、本発明をさらに実証する。該実施例は例証として示すものであり、本発明をどのようにも限定することを意図したものではない。これらの実施例では、すべての割合(%)は固体の場合には重量%、液体の場合には容量%であり、特に記載のない限り、温度はすべて摂氏で記載されている。
巻、p.1849〜1862;ニーマイヤー,シー.エム.(Niemeyer,C.M.)、Angew.Chem.Int.Ed.(2001年)、第40巻、p.4128〜4158;リウ,ジェイ(Liu,J.);ルー,ワイ.(Lu,Y.)、J.Am.Chem.Soc.(2003年)、第125巻、p.6642〜6643を参照されたい)、該形式は例えば、銀増幅と併用して高い検出感度が達成されるDNAマイクロアレイ(タトン,ティー.エイ.(Taton,T.A.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、Science(2000年)、第289巻、p.1757〜1760;ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);マルラ,エス.エム.(Marla,S.M.);バオ,ピー.(Bao,P.);ハゲノー,エス.(Hagenow,S.);メータ,エイチ.(Mehta,H.);ルーカス,エイ.(Lucas,A.);ガリメラ,ブイ.(Garimella,V.);パント,ティー.(Patno,T.);バッキンガム,ダブリュ.(Buckingham,W.);コーク,ダブリュ.(Cork,W.);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Biosens.Bioelectron.(2004年)、第19巻、p.875〜883)が含まれる。本技術のさらなる重要な特徴には、温度上昇および塩濃度上昇のいずれにも耐えるDNA修飾金ナノ粒子の著しい安定性および堅牢性(マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.);ムシック,アール.シー.(Mucic,R.C);ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.)、Nature(1996年)、第382巻、p.607〜609;ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);エルガニアン.アール.(Elghanian,R.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、Langmuir(2002年)、第18巻、p.6666〜6670)、ならびにDNA配列を認識する著しい特異性(ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);エルガニアン.アール.(Elghanian,R.);ムシック,アール.シー(Mucic,R.C);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、J.Am.Chem.Soc.(1998年)、第120巻、p.1959〜1964;タトン,ティー.エイ.(Taton,T.A.);ムシック,アール.シー.(Mucic,R.C.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、J.Am.Chem.Soc.(2000年)、第122巻、p.6305〜6306)がある。これまでの研究から、抗体またはハプテンをDNA依存性の固定化または受動的吸着により金ナノ粒子に結合させて、タンパク質検出に使用することが可能であることがわかっているが(ニールセン,ユー.ビー.(Nielsen,U.B.);ガイエルスタンガー,ビー.エイチ.(Geierstanger,B.H.)、Journal Immunol.Meth.(2004年)、第290巻、p.107〜120;ニーマイヤー,シー.エム.(Niemeyer,C.M.);セイヤン,ビー.(Ceyhan,B.)、Angew.Chem.Int.Ed.(2001年)、第40巻、p.3585〜3688;ナム,ジェイ.エム.(Nam,J.M.);パーク,エス.ジェイ.(Park,S.J.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);J.Am.Chem.Soc.(2002年)、第124巻、p.3820〜3821)、これらの戦略は依然として上記制限を受け易い。DNA修飾金粒子をタンパク質分析物の検出に直接使用することは大きな進歩となろう。本実施例もまた、診断および治療の両方の用途のための種々のタンパク質分析物に対して開発された核酸系アプタマー(ジャヤセーナ,エス.ディー.(Jayasena,S.D.)、Clin.Chem.(1999年)、第45巻、p.1628〜1650;ブロディー,イー.(Brody,E.);ゴールド,エル(Gold,L.)、Rev.Mol.Biotech.(2000年)、第74巻、p.5〜13;ポティーライロ,アール.エイ.(Potyrailo,R.A.);コンラッド,アール.シー.(Conrad,
R.C.);エリントン,エイ.ディー.(Ellington,A.D.);ヒフティア,ジー.エム.(Hiftjea.G.M.)、Anal.Chem.、(1998年)、第70巻、p.3419〜3425)を、金ナノ粒子にコンジュゲートすることが可能であることを実証する。また、本実施例は、得られたアプタマー被覆金プローブ(AGP)が、抗体で標識された金プローブよりも高い特異性および感度で抗体標識を検出し得ることを実証する。
この実施例では、代表的な金ナノ粒子・アプタマーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの検出プローブを、IgEタンパク質の検出に使用するために調製した。タセットら(Tasset and coworkers)は、高い親和性と高い特異性を持ってヒトIgEに結合するアプタマーオリゴヌクレオチド配列を最初に報告した。(ウィーガンドら(Wiegand et al.)、1996年、The Journal of Immunology、第157巻、p.221〜230)。続いて、IgE結合親和性を増大させるために、伸びたステムループ構造を有するアプタマー配列が設計された(リスら(Liss et al.)、2002年、Anal.Chem.、第74巻、p。4488〜4495頁)。このアプタマー配列および報告された研究から推定される二次構造を図1にまとめた。本明細書にその全体を援用した、1997年7月21日出願の国際特許出願第PCT/US97/12783号;2000年6月26日出願のPCT/US00/17507号;2001年1月12日出願のPCT/US01/01190号に記載された手順を用いて、図1に示したアプタマー配列を検出プローブとして用いるために金ナノ粒子にコンジュゲートした。
フレンス(Frens)、1973年、Nature Phys.Sci.、第241巻、p.20〜22およびグラバー(Grabar)、1995年、Anal.Chem.、第67巻、p.735に記載されているように、HAuCl4をクエン酸で還元することによって金コロイド(直径約15nm)を調製した。簡単に述べると、すべてのガラス器具を王水(HClを3部とHNO3を1部)で洗浄し、Nanopure(登録商標)水で濯ぎ、使用前にオーブン乾燥した。.HAuCl4およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)から購入した。HAuCl4水溶液(1mM、500mL)を攪拌しながら還流した。次いで、38.8mMのクエン酸ナトリウム(50mL)を迅速に添加した。溶液の色が淡黄色から赤紫色に変化し、還流を15分間継続した。室温まで冷却後、この赤色の溶液をマイクロン・セパレーション・インコーポレイテッド(Micron Separations Inc.)の0.2μmの酢酸セルロースフィルタで濾過した。ヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)の8452A型ダイオード・アレイ分光光度計を用いたUV−vis分光法および日立(Hitachi)8100透過型電子顕微鏡を用いた透過電子顕微鏡法(TEM)によって、金コロイドの特徴を解析した。
アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)のExpedite8909型DNA合成装置を利用して、ホスホロアミダイト法を用いたシングルカラムモードで、IgE、APC遺伝子DNA配列、またはMecA遺伝子DNA配列に特異的なアプタマー配列、あるいはA10に相当するオリゴヌクレオチドを1マイクロモルスケールで合成した。エックスタイン,エフ.(Eckstein,F.)編、「Oligonucleotides and Analogues:A Practical
Approach」、(アイアールエルプレス(IRL Press)、オックスフォ
ード、1991年)。合成試薬はすべてグレン・リサーチ(Glen Research)またはアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)から購入した。平均カップリング効率は98〜99.8%で変化し、ステロイドジスルフィド・ホスホロアミダイトがカップリングされるように、最後のジメトキシトリチル(DMT)保護基をオリゴヌクレオチドから除去した。
するまで蒸発させ、250mMリン酸緩衝液(pH7)中で再構成した。オリゴヌクレオチドの量を260nmの吸光度で決定し、最終純度をイオン交換クロマトグラフィで評価した。
クエン酸還元法を用いて約13.75nMの金ナノ粒子(直径約15nm)の溶液を調製した。この金ナノ粒子プローブは、これまでに開発された手法の変法を用いて直径約15nmの金粒子(約13.75nM)にステロイドジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドを装荷することによって調製した。例えば、本明細書にその全体を援用した米国特許第6767702号明細書を参照されたい。このアプタマーオリゴヌクレオチドコンジュゲートについては、3nmolのアプタマーオリゴヌクレオチドおよび1nmolのA10を13.7nMの金ナノ粒子1mL当たりに加え、室温で15時間インキュベートした。この溶液を、1MのNaCl、100mMリン酸(pH7)、1%アジドを用いて0.1MのNaCl、10mMリン酸(pH7)、0.01%アジドまで上げ、12時間インキュベートした。次いでこの溶液を、5MのNaCl緩衝液を用いて0.3MのNaClまで上げ、さらに12時間インキュベートした。次いでこの溶液を、同じ緩衝液を用いて0.8MのNaClまで上げさらに24時間インキュベートした。ベックマン・コールター(Beckman Coulter)のMicrofuge(登録商標)18を用いて13000rpmで20分間遠心分離して、該アプタマー・金ナノ粒子コンジュゲートを単離した。遠心分離後、上清を除去し、エッペンドルフチューブの底に残った暗赤色のゼラチン状の残渣を水中に再分散させた。この工程を2回繰り返して結合していないオリゴヌクレオチドをすべて確実に除去するようにした。推定される吸光係数ε520=2.4×108M−1cm−1を用いて、520nmにおけるUV‐可視吸光度に基づいて最終的なナノ粒子濃度を10nMに調整した。
IgEプローブ:金−S’−5’[gcgcggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgccccgcgc−3’]n(配列番号1)
をこの方法で調製した。
MECA 2Q:金−S’−5’−[a15−peg−atggcatgagtaacgaata]n(配列番号2)
CRC 4D:金−S’−5’−[a20−gcagaataaaag]n(配列番号3)
S’はエピアンドロステロンジスルフィド基を介して作製された連結ユニットを示し、nはいくつかのオリゴヌクレオチドが各々の金ナノ粒子に結合していることを示す。
アフィニティー精製された抗IgEポリクローナル抗体はケミコン・インターナショナル(Chemicon International)から購入した。該抗体を、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル(British BioCell International;BBI)によって以前報告された手順を用いて、径15nmの金ナノ粒子にコンジュゲートさせた。簡単に述べると、炭酸ナトリウム緩衝液を用いて直径15nmの金粒子をpH9〜10に調整した。5μg/mLの抗体をこの金ナノ粒子に加え、室温で1.0時間インキュベートした。次いで、BSAを該溶液に添加し粒子を安定させた。この抗体・金ナノ粒子コンジュゲートを、ベックマン・コールターのMicrofuge18を用いて13000rpmで20分間遠心分離することによって単離した。遠心分離後、上清を除去し、エッペンドルフチューブの底に残った暗赤色のゼラチン状の
残渣を緩衝液(0.2Mトリス緩衝液(pH8.5)、0.1%BSAおよび0.01%アジド)中に再分散させた。この工程を繰り返して、結合していない抗体をすべて確実に除去するようにした。推定される吸光係数ε520=2.4×108M−1cm−1を用いて、520nmにおけるUV‐可視吸光度に基づいて最終的なナノ粒子濃度を10nMに調整した。
精製ヒトIgEはケミコン・インターナショナルから購入し、ウシ血清アルブミン(BSA)およびIgGはシグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)から購入した。これらのタンパク質を、GMS417型アレイヤー(アフィメトリクス(Affymetrix)社)を用いてCodelink(登録商標)スライド(アマシャム・インコーポレイテッド(Amersham,Inc.))上にアレイ化した。前記ヒトIgE、IgG、およびBSAのアレイ化は、150mMリン酸緩衝液(pH8.5)中の2mg/mLの濃度として実施した。該スライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、次に0.05%Tweenを含んだTBS−T緩衝液(150mM NaCl/10mMトリスベース緩衝液(pH8)で洗浄した。タンパク質はすべて3連としてアレイ化した。アレイ化スポットの位置は、各スライド上で複数のハイブリダイゼーション試験を行えるように設計し、シリコンガスケット(グレース・バイオラブス(Grace Biolabs))を用いてスライドを別個の試験ウェルに間仕切りすることによって達成した。
実験:
IgE特異的なアプタマーオリゴヌクレオチド・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブ(配列番号1)または陰性対照として用いた他のオリゴヌクレオチド・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブ(配列番号2および3)の結合について、IgEが固定化され、かつIgGおよびBSAの陰性対照スポットを備えたマイクロアレイ化ガラススライドを用いて試験した(図2)。各50μLの結合反応物には、1×リン酸緩衝生理食塩水(pH7)、1.0mMのMgCl2から成る結合緩衝液中に約2nMの検出プローブを含めた。アプタマーで被覆された金プローブ溶液をエッペンドルフチューブ内で95℃に3分間加熱し、室温まで5分間冷却し、氷上に2分間置き、次いでタンパク質アレイ上にピペットで移し、室温(約24℃)で1時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、最初は1×リン酸緩衝食塩水(pH7)、1.0mMのMgCl2、0.001%Tween20にガラススライドを1分間浸漬し、次いでスライドを水中に(約2秒間)入れて、ガラススライドの表面から過剰な塩類を除いた。これまでに報告されている銀増幅法(タトンら(Taton et al.)、2000年、Science、第289巻、p.1757〜1760)を用いてスライドを銀増強溶液で染色し、回転式乾燥器で乾燥させ、ArrayWorx(登録商標)バイオチップリーダー(モデル番号AWE、米国ワシントン州イサクア所在のアプライド・プレシジョン・インコーポレイテッド(Applied Precision Inc.))で画像化した(図3および4)。ArrayWorxソフトウェアを用いてアレイ上の各スポットからの散乱シグナルを定量した。陽性対照の結合反応として、抗IgE抗体・金ナノ粒子コンジュゲートの検出プローブを試験した。結合反応に用いたプロトコルおよび緩衝液は、アプタマーで被覆された金プローブについて上述したものと同じであるが、最初の加熱工程は省いている。
ガラス表面に固定化したIgEとの結合反応において、IgE特異的アプタマーで被覆した金プローブ(AGP)の結合を、抗IgE抗体で被覆した金プローブ(Ab−GP)と比較した(「実験」参照)。ガラススライドを銀増幅後に画像化し、正味のシグナルをアレイ上で定量した(図3)。AGP(配列番号1)は、ガラススライド上に固定化した陽性(IgE)スポットおよび陰性対照(IgG、BSA)スポットからの正味のシグナ
ル強度に基づくと、アレイ上のIgEに対して特異的結合を示した。同様のプローブ濃度でAb−GPを用いて実施された陽性対照反応においても、IgEへの特異的結合が観察された。このIgE特異的なAGPを、銀増幅アッセイを用いて他のDNA修飾金ナノ粒子(配列番号2および3)とも比較した(図4)。DNA修飾金ナノ粒子はIgEまたは陰性対照に結合しなかったが、AGPはIgEに特異的に結合した。これらの実験は、アプタマーが金ナノ粒子表面上で、タンパク質の特異的検出を可能にする機能を有していることを明らかに示している。この系は、銀増幅のほかにタンパク質標的を2種類のアプタマー被覆金プローブによって「サンドイッチ」することによる比色法を用いたサンドイッチ形式のアッセイにおけるタンパク質の検出に拡張することが可能である。
試作研究のさらなる証明として、この実施例は、ヒトIgEに対して高い結合親和性を有する良く研究されたDNAアプタマー配列(ヴィーガンド,ティー.ダブリュ.(Wiegand,T.W.);ウィリアムズ,ピー.ビー.(Williams,P.B.);ドレスキン,エス.シー.(Dreskin,S.C.);ジョウビン,エム.エイチ.(Jouvin,M.H.);キネット,ジェイ.ピー.(Kinet,J.P.);タセット,ディー.(Tasset,D.)、J.Immunol.(1996年)、第157巻、p.221〜230;リス,エム.(Liss,M.);ピーターソン,ビー.(Petersen,B.);ウォルフ,エイチ.(Wolf,H.);プロハスカ,イー.(Prohaska,E.)、Anal.Chem.、(2002年)、第74巻、p.4488〜4495):
(5’cgcggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgccccgcgc3’)[配列番号4]
について評価する。
対照1:5’aaaaaaaaaaaaaaaatggcatgagtaacgaata3’[配列番号5]。
nM、50μL)を、IgEで被覆したガラススライド上で、1×PBS緩衝液(pH7.2)、1mMのMgCl2中で約24℃にて1時間インキュベートした。0.001%Tween20を含んだ同様の緩衝液でガラススライドを洗浄後、該ガラススライドを銀増強液で5分間染色した(タトン,ティー.エイ.(Taton,T.A.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、Science(2000年)、第289巻、p.1757〜1760;ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);マルラ,エス.エム.(Marla,S.M.);バオ,ピー.(Bao,P.);ハゲノー,エス.(Hagenow,S.);メータ,エイチ.(Mehta,H.);ルーカス,エイ.(Lucas,A.);ガリメラ,ブイ.(Garimella,V.);パント,ティー.(Patno,T.);バッキンガム,ダブリュ.(Buckingham,W.);コーク,ダブリュ.(Cork,W.);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Biosens.Bioelectron.(2004年)、第19巻、p.875〜883)。この手順を、陰性対照のDNAで修飾された金粒子を用いて別個のアレイ上で繰り返した。ガラススライド上に捕捉された金粒子の銀増幅によって散乱された光を、白色光でガラススライドを照射してCCDカメラで画像を記録する市販のスキャナを用いて、分析した(ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);マルラ,エス.エム.(Marla,S.M.);バオ,ピー.(Bao,P.);ハゲノー,エス.(Hagenow,S.);メータ,エイチ.(Mehta,H.);ルーカス,エイ.(Lucas,A.);ガリメラ,ブイ.(Garimella,V.);パント,ティー.(Patno,T.);バッキンガム,ダブリュ.(Buckingham,W.);コーク,ダブリュ.(Cork,W.);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Biosens.Bioelectron.(2004年)、第19巻、p.875〜883)。この画像およびそれに対応するデータ分析から、抗IgE AGPはアレイ上に固定化されたIgE抗体に特異的に結合するが、陰性対照のDNA修飾金プローブはIgE抗体の試験部位においてシグナルをほとんど示さない/まったく示さないことを実証している(図5B)。これらのデータは、抗IgEアプタマー配列が金粒子表面に結合した後も機能を有し、該アプタマーは固定化されたIgE標的に特異的に結合することを実証している。また、これらのデータは、DNA修飾金粒子はスライド上に固定化された抗体に対する非特異的結合が低いという予備的証拠を提供している。このことはDNAマイクロアレイに関するこれまでの試験(タトン,ティー.エイ.(Taton,T.A.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);レットシンガー,アール.エル.(Letsinger,R.L.)、Science(2000年)、第289巻、p.1757〜1760)と一致する。
フレンス(Frens)、1973年、Nature Phys.Sci.、第241巻、p.20〜22およびグラバー(Grabar)、1995年、Anal.Chem.、第67巻、p.735に記載されているように、HAuCl4をクエン酸で還元する
ことによって金コロイド(直径約15nm)を調製した。簡単に述べると、すべてのガラス器具を王水(HClを3部とHNO3を1部)で洗浄し、Nanopure(登録商標)水で濯ぎ、使用前にオーブン乾燥した。HAuCl4およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)から購入した。HAuCl4水溶液(1mM、500mL)を攪拌しながら還流し、次いで、38.8mMクエン酸ナトリウム(50mL)を迅速に添加した。溶液の色が淡黄色から赤紫色に変化し、還流を15分間継続した。室温まで冷却後、この赤色の溶液をマイクロン・セパレーション・インコーポレイテッド(Micron Separations Inc.)の0.2μmの酢酸セルロースフィルタで濾過した。ヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)の8452A型ダイオード・アレイ分光光度計を用いたUV−vis分光法によって、金コロイドの特徴を解析した。
調製されたままの状態のナノ粒子を、これまでに記載されている塩エイジング法(ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);マルラ,エス.エム.(Marla,S.M.);バオ,ピー.(Bao,P.);ハゲノー,エス.(Hagenow,S.);メータ,エイチ.(Mehta,H.);ルーカス,エイ.(Lucas,A.);ガリメラ,ブイ.(Garimella,V.);パント,ティー.(Patno,T.);バッキンガム,ダブリュ.(Buckingham,W.);コーク,ダブリュ.(Cork,W.);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Biosens.Bioelectron.(2004年)、第19巻、p.875〜883、およびこの文献中に記載の参照文献)を用いて、チオール官能化オリゴヌクレオチドで誘導体化した。簡単に述べると、IgEアプタマー(最終濃度3μM)およびA20希釈配列(最終濃度1μM)を、調製されたままの状態の金ナノ粒子とともに最初に16時間超インキュベートし、次いでリン酸緩衝生理食塩水を、最終濃度が0.8MのNaCl、10mMリン酸(pH7)になるまで連続して添加した。10時間より長く放置した後、プローブを遠心分離によって単離し、等量の水で洗浄し、0.1MのPBS、0.01%アジドに再分散させて粒子濃度10nMとした。プローブはすべて4℃で保管した。
金コロイドの購入に伴って添付されたブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル(BBI)による既述の手順を用いて、直径60nmの金ナノ粒子にポリクローナル抗体をコンジュゲートさせた。簡単に述べると、炭酸ナトリウムを用いて直径60nmの金ナノ粒子をpH9〜10に調整した(0.1Mの炭酸ナトリウム約25μLを入手した状態のままのコロイド1mLに添加)。金ナノ粒子1mL当たり3μgの抗体を加え、室温で1.0時間インキュベートした。次いで、BSAを最終濃度1%になるまで添加して粒子を安定させた。この抗体・金ナノ粒子コンジュゲートを、ベックマン・コールター(Beckman Coulter)のMicrofuge(登録商標)18を用いて210
0rcfで25分間の遠心分離により単離した。遠心分離後、この上清を取り除き、エッペンドルフチューブの底に残る暗赤色のゼラチン状の残渣を緩衝液(20mMトリス緩衝液(pH8.5)、0.5%BSAおよび0.01%アジド)に再分散させた。吸光係数ε520=2.8×1010M−1cm−1を用いて、520nmのUV‐可視吸光度に基づき最終的なナノ粒子濃度を算出した。
直径500μmのピンを装備したアフィメトリクス(Affymetrix)GMS417型ピンアンドリング方式マイクロアレイヤーを用いて、ヒトIgE抗体、抗IgE抗体およびIgG抗体をCodelink(登録商標)スライド(アマシャム・インコーポレイテッド)上にアレイ化した。典型的には、1×PBS(pH7.2)、60mMトレハロース中で抗体を最終濃度500μg/mLとして緩衝化した。プリントした後、スライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、続いてTBS−T緩衝液(0.05%Tween20を含んだ150mM NaCl/10mM トリスベース緩衝液(pH8))で洗浄した。抗体は3連としてアレイ化し、アレイ化スポットの複製10個を各スライド上に作製した。該アレイを、シリコンガスケット(グレース・バイオラブス)を用いて別個の試験ウェルに間仕切りした。
シリコンガスケットを用いて、容量40〜50μLでアッセイを行った。アッセイ終了後、ガスケットを取り外し、スライドを遠心分離にかけて過剰な液体を除去する。銀で現像するために、銀増強溶液AおよびBを1:1で混合し、各スライド上に置き、5分間インキュベートした。続いて、スライドを水で洗浄し、金属ハロゲン化物アーク灯を用いた白色光でスライドを照射して照射されたスライドからの散乱光を顕微鏡対物レンズ経由で冷却されたCCDカメラ上に集める市販の画像分析システムを用いて画像化した(ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);マルラ,エス.エム.(Marla,S.M.);バオ,ピー.(Bao,P);ハゲノー,エス.(Hagenow,S.);メータ,エイチ.(Mehta,H.);ルーカス,エイ.(Lucas,A.);ガリメラ,ブイ.(Garimella,V.);パント,ティー.(Patno,T.);バッキンガム,ダブリュ.(Buckingham,W.);コーク,ダブリュ.(Cork,W.);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Biosens.Bioelectron.(2004年)、第19巻、p.875〜883、およびこの文献中の参照文献)。
この実施例では、サンドイッチ・アッセイ形式においてIgE標的に結合する検出標識として、抗IgE AGPと比較するために、抗IgE抗体金ナノ粒子コンジュゲートを調製した(図5)。これらの試験のために、ヒトIgEに対して作製されたヤギ・ポリクローナル抗体を、十分に確立された手法を用いて直径60nmの金粒子に受動吸着させ、抗IgEアプタマーを直径60nmの金粒子にコンジュゲートさせた(上記実施例2を参照)。種々の大きさのAGPを作成し、検出標識として使用可能であることを実証するために、直径60nmの金粒子を選択した。直径>40nmの金属粒子は表面プラスモン共鳴周波数で特定の色の光を散乱し(イグエラビデ,ジェイ.(Yguerabide,J.);イグエラビデ,イー.イー.(Yguerabide,E.E.)、Anal.Biochem.、(1998年)、第262巻、157〜176)、また、粒子の大きさ、形状および化学組成を制御することによってアレイ上で多色標識に用いることが可能であるほか(タトン,ティー.エイ.(Taton,T.A.);ルー,ジー.(Lu,G.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.)J.Am.Chem.Soc.(2001年)、第123巻、p.5164〜5165;ジン,アール.シー.(Ji
n,R.C.);カオ,ワイ.ダブリュ.(Cao,Y.W.);マーキン,シー.エイ.(Mirkin,C.A.);ケリー,ケイ.エル.(Kelly,K.L.);シャッツ,ジー.シー.(Schatz,G.C.);ツウェン,ジェイ.ジー.(Zheng,J.G.)、Science(2001年)、第294巻、p.1901〜1903)、均質な検出アッセイにも使用することができる(ストルホフ,ジェイ.ジェイ.(Storhoff,J.J.);ルーカス,エイ.ディー.(Lucas,A.D.);ビスワナダム,ジー.(Viswanadham,G.);バオ,ピー.(Bao,P);ミューラー,ユー.(Muller,U.)、Nat.Biotechnol.(2004年)、第22巻、p.883〜887)。抗IgEポリクローナル抗体およびヒトIgG抗体(標的には特異的でない)を先に記載したようなガラススライド上に固定化することによって、試験アレイを作製した。
(Jayasena,S.D.)、Clin.Chem.(1999年)、第45巻、p.1628〜1650)に応用することができる
この実施例では、種々の表面密度のアプタマーで標識されたナノ粒子を調製し、評価した。これらの標識ナノ粒子は実施例1に記載の手順に従って調製した。希釈用A20の比を変えてIgEアプタマーで被覆した直径60nmの金粒子上で利用可能なアプタマー(A10アプタマー1またはT10アプタマー1のプローブ配列)の数を、これまでに報告されている蛍光ベースのアッセイ(デマースら(Demers et al,)、Anal.Chem.、2000年)を用いて測定した(図8)。第1の実験で試験した金粒子に、IgEアプタマー:希釈用A20の比を100:0、2:1、1:2、1:8、または0:100(A20(対照))を、あるいはT10アプタマーを装荷した。上記プローブ配列を以下の表1に示す。
抗体をプリントした。抗IgE抗体および対照のIgG抗体の連続希釈液(1000、500および250μg/mL)を官能化したガラススライド上に3連でアレイ化した。次いで、IgE標的(1μg/mL)を個々の試験アレイ上で30分間インキュベートした。このIgE標的をアレイから取り出し、アプタマー被覆金プローブ(図2を参照)を最適な結合緩衝液中で個々のアレイ上で15分間インキュベートした。該試験スライド上に配置された抗IgEスポットおよびIgGスポット各々からの散乱強度の合計を測定し、特異的に結合したAGPの量を決定した(図9)。比較のために、陰性対照としてA20で被覆した金プローブと共に抗IgEポリクローナル抗体プローブも別個の反応において試験した。アプタマー被覆金プローブならびに抗IgE抗体被覆金プローブはそれぞれ、抗IgEスポットおよび対照IgGスポットからの散乱強度の合計についての比較に基づくと、IgE標的に特異的に結合する。IgE標的を含まない対照の反応は最小の散乱を示し、AGPの結合がIgE特異的であることを表している。定量的には、該予備データから、アプタマーで被覆された金プローブは、これらの結合条件下では、利用可能なアプタマーの数に関係無く抗IgE抗体プローブよりもIgE標的への結合性が高いことが示唆される。
この実施例では、アプタマーで被覆した金プローブのアレイの調製について説明する。アプタマーで被覆した金プローブを、導波路基材の表面に共有結合しているアミン修飾T20オリゴヌクレオチド(配列番号10)にハイブリダイゼーションすることにより、導波路基材に固定化した(図11)。典型的には、アミン修飾T20オリゴヌクレオチドを1×PBS(pH7.2)中に最終濃度500μMに再懸濁させ、直径500μmのピンを装備したアフィメトリクスのGMS417型ピンアンドリング方式マイクロアレイヤーを用いてCodelinkスライド(アマシャム・インコーポレイテッド)またはSuperaldehyde(登録商標)スライド(テレケム・インターナショナル(Telechem International))上にアレイ化した。このスライドを湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、次に1×PBS(pH7.2)、0.01%Tween20緩衝液で洗浄した。典型的には、オリゴヌクレオチドを3連として2列にアレイ化し、アレイ化したスポットの10個の複製を各スライド上に作製した。シリコンガスケット(グレース・バイオラブス)を用いてこのアレイを別個の試験ウェルに間仕切りした。次いで、アプタマー修飾金プローブ(配列A10アプタマーと希釈用T20、配列番号10
)を種々の濃度で加えて室温で15分間の第2工程とし(1×PBS、1mMのMgCl2、0.01%Tween20)、「アプタマーで被覆した金プローブのアレイ」を形成した。各プローブアレイを白色光で照射し、カラーCCDカメラを用いて画像化して散乱色を記録した。図12に示すように、AGPはアルデヒド基材上の相補的なT20スポットに固定化され、該プローブはプローブ濃度に応じて主に緑〜緑黄色の光を散乱する。このことは、表面に結合したAGPの密度を、付加する金プローブの量によって制御することができることを示している。
この実施例では、実施例5で調製した抗IgEアプタマーで被覆した金プローブのアレイ上で、ヒトIgE標的の検出を試験した。図13を参照されたい。これらの試験のために、抗IgEアプタマーで被覆した金プローブ(75pM)を上記のようなT20アレイ上に固定化した。アッセイ工程はすべて40μLの反応容量中で、室温で行った。第1の工程では、様々な濃度のヒトIgE(2μg/mL−1ng/mL)または陰性対照としてヒトIgG(2μg/mL)を、1mMのMgCl2、1×PBS、0.01%Tween20に含めて、別個の試験アレイ上で30分間インキュベートした。第2の工程では、抗IgE抗体で被覆した金プローブ(上記のように調製)を、1mMのMgCl2、1×PBS、0.01%Tween20、2%硫酸デキストランを含んだ緩衝液中でプローブ濃度450pMとしてアレイ上で10分間インキュベートした。白色光で照射後、カラーCCDカメラを用いて各プローブアレイからの散乱色を記録した(図14)。緑色からオレンジ色までの散乱色の変化が、>50ng/mLのIgE標的(2.5ngの総IgE)を含む試料について観察された。<10ng/mLのIgE標的または2μg/mLのIgG標的を含む試料は散乱色が緑のままであった。この散乱色は肉眼で視覚的に検出することも可能であることに留意されたい。
標準的なホスホロアミダイト法によって、A20テールを備えた抗IgEアプタマー[配列番号10]を合成した。アミンで修飾されたT20およびA20オリゴヌクレオチドをホスホロアミダイト法によって合成し、最終濃度約0.1〜1mMで10mMのリン酸
(pH8)に再分散させた。直径500μmのピンを装備したピンアンドリング方式のマイクロアレイヤーを用いて、オリゴヌクレオチドの結合についての製造業者の推奨事項に従ってアミン修飾オリゴヌクレオチドをCodelink(登録商標)基材に結合させた。
5’aaa aaa aaa a aaa aaa aaa agcg cgg ggc
acg ttt atc cgt ccc tcc tag tgg cgt gcc
ccg cgc 3’[配列番号10]
このA20テールを備えた抗IgEアプタマー(配列番号10)を、基材に結合しているT20オリゴヌクレオチドに、1×PBS、1mMのMgCl2、0.01%Tween20緩衝液(インキュベーション緩衝液と呼ぶ)中で、10nMの濃度で室温にて15分間ハイブリダイズさせた。このスライドを約100mLのインキュベーション緩衝液で洗浄した。次いで、インキュベーション緩衝液中のヒトIgE標的または陰性対照のヒトIgG(50pg/mL−500ng/mL)を基材に7分間添加した。続いて、この標的溶液をスライドから除去し、2%硫酸デキストランの入ったインキュベーション緩衝液中の400pMのヤギx−IgEポリクローナル抗体で被覆した直径60nmの金プローブを各アレイに加え、3分間インキュベートした。このスライドを約100mLのインキュベーション緩衝液で洗浄し、ArrayWorx画像分析装置で画像化した。図19を参照すると、アレイ上のT20にハイブリダイズしたA20テールを備えたxIgEアプタマーを用いた、IgEの検出が示されている。
Claims (80)
- 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する少なくとも1つの標的分析物を検出する方法であって、
a)特異的標的分析物の第1の結合部位に結合することのできる少なくとも1種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と、
b)該標的分析物の第2の結合部位に結合することのできる検出アプタマーを含んでなる少なくとも1種類のナノ粒子プローブを提供する工程と、
c)該捕捉プローブが該標的分析物の第1の結合部位に結合し、かつ該ナノ粒子プローブが該標的分析物の第2の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、該基材と該ナノ粒子プローブとに該試料を接触させる工程と、
d)該試料中の特異的標的分析物の存在の有無を示す、該複合体の存在の有無を検出する工程と
から成る方法。 - 前記捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる請求項1に記載の方法。
- 前記結合部位は特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である請求項1に記載の方法。
- 2種類以上のナノ粒子プローブであって、各ナノ粒子プローブに、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基、または異なる標的分析物、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合していることを特徴とするナノ粒子プローブが提供される、請求項1に記載の方法。
- 試料中に存在する標的分析物がナノ粒子プローブ上の検出アプタマーに結合するように、試料を最初にナノ粒子プローブに接触させ、次いで、該標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、前記ナノ粒子プローブに結合した標的分析物を基材に接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように、試料を最初に基材に接触させ、次いで、該標的分析物がナノ粒子プローブ上の検出アプタマーに結合するように、前記捕捉アプタマーに結合した標的分析物をナノ粒子プローブに接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料、ナノ粒子プローブ、および基材上の捕捉プローブを同時に接触させる、請求項1に記載の方法。
- 捕捉された標的とナノ粒子プローブとの複合体を、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は金または銀から作製される請求項9に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は金から作製される請求項10に記載の方法。
- 前記基材は磁性ビーズである請求項1に記載の方法。
- 前記基材は平坦な表面を有する請求項1に記載の方法。
- 前記基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックから作製される請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程は前記基材を銀染色剤に接触させる工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程は前記ナノ粒子によって散乱された光を検出する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程は光学スキャナを用いて観察する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 前記スキャナはグレイスケール測定値を算出することのできるソフトウェアを装備したコンピュータに連結され、検出された分析物の量を定量するためにグレイスケール測定値が算出される、請求項17に記載の方法。
- 前記基材は位置指定可能である請求項1に記載の方法。
- 各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブが、アレイ状のスポットとして基材に結合される、請求項19に記載の方法。
- 捕捉プローブの各スポットが2つの電極の間に配置され、前記ナノ粒子が導電体である材料から作製され、工程(d)が導電率の変化を検出する工程を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記電極は金から作製され、前記ナノ粒子は金から作製される請求項21に記載の方法。
- 前記基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させる請求項21に記載の方法。
- 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する少なくとも1種類の標的分析物を検出する方法であって、
a)検出アプタマーを含んでなる少なくとも1種類のナノ粒子プローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが、特定の種類の標的分析物の第1の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とするナノ粒子プローブを提供する工程と、
c)検出アプタマーが標的分析物に結合するのに有効な条件下で、試料をナノ粒子プローブに接触させる工程と、
d)該検出アプタマーが該標的分析物に結合するかどうかを検出する工程と
から成る方法。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
a)標的分析物の2つ以上の結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している、ある種類のナノ粒子を提供する工程と、
b)標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料と、アプタマーが結合しているナノ粒子とを接触させる工程と、
c)標的分析物がナノ粒子に結合しているアプタマーと結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
a)アプタマーが結合している少なくとも2種類のナノ粒子であって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするナノ粒子を提供する工程と、
b)標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で、試料と、アプタマーが結合している少なくとも2種類のナノ粒子とを接触させる工程と、
c)ナノ粒子に結合しているアプタマーが標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
a)標的分析物のある結合部位に結合することのできるアプタマーが結合している少なくとも1種類のナノ粒子と、標的分析物の異なる結合部位に結合することのできる抗体が結合している少なくとも1種類のナノ粒子とを提供する工程と、
b)試料と、アプタマーが結合している少なくとも1種類のナノ粒子と、抗体が結合している少なくとも1種類のナノ粒子とを、標的分析物とナノ粒子に結合しているアプタマーおよび抗体との間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
c)ナノ粒子に結合しているアプタマーおよびナノ粒子に結合している抗体が標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
からなる方法。 - 検出工程は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によってなされる、請求項24、25、26、または27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項28に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は金または銀から作製される請求項29に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は金から作製される請求項29に記載の方法。
- 検出工程は、前記ナノ粒子によって散乱された光を検出する工程を含む、請求項24、25、26、または27のいずれか1項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド・テールを有するアプタマーと、
該オリゴヌクレオチド・テールの配列の少なくとも一部分と相補的な配列を有し、任意選択の標識を有する第2のオリゴヌクレオチドと
から成るアプタマープローブ。 - 前記任意選択の標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする検出標識である、請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記任意選択の標識は、蛍光性、発光性、リン光性、または放射性の検出標識である、請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記任意選択の標識は、量子ドット、ナノ粒子、デンドリマー、分子集合体またはビーズである、請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記任意選択の標識は既知配列を有する第3のオリゴヌクレオチドである、請求項33
に記載のアプタマープローブ。 - 前記第3のオリゴヌクレオチドは、物理的、化学的または生化学的な手段により増幅されるように設計されている、請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記第3のオリゴヌクレオチドの増幅はハイブリダイゼーション・カスケードまたは酵素的手段によって行われる、請求項38に記載のアプタマープローブ。
- 前記任意選択の標識はナノ粒子である請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記任意選択の標識はナノ粒子・オリゴヌクレオチドコンジュゲートである請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記コンジュゲートは1種類以上のDNAバーコードが結合しているナノ粒子を含む請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド・テールに結合している第1の部分およびナノ粒子コンジュゲートに結合しているオリゴヌクレオチドに結合している第2の部分の、少なくとも2つの部分の配列を有する、請求項42に記載のアプタマープローブ。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドは、複数のDNAバーコードがさらに結合しているナノ粒子で標識されている、請求項33に記載のアプタマープローブ。
- 前記DNAバーコードは前記ナノ粒子に直接的または間接的に結合している請求項44に記載のアプタマープローブ。
- 前記DNAバーコードが検出標識をさらに含む請求項44に記載のアプタマープローブ。
- 前記検出標識は、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段による検出を可能にする請求項44に記載のアプタマープローブ。
- a)ナノ粒子と、
b)該ナノ粒子上に約1.0×1010〜約5.0×1012個/cm2の表面密度で存在する少なくとも1種類のアプタマーと
を含んでなるナノ粒子・アプタマーコンジュゲートプローブ。 - 少なくとも2種類のアプタマーを含む請求項48に記載のプローブ。
- 前記アプタマーが約8.0×1011〜6.4×1012の範囲の表面密度でナノ粒子上に存在する請求項48に記載のプローブ。
- 前記ナノ粒子は前記アプタマーに加えてさらにオリゴヌクレオチドが結合している、請求項33または44に記載のプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドはポリアデノシンオリゴヌクレオチドである請求項51に記載のプローブ。
- 前記ポリアデノシンオリゴヌクレオチドはA10またはA20である請求項52に記載のプローブ。
- 前記アプタマーはホスホロチオエート部分またはホスホロジチオエート部分を含む請求項33または44に記載のプローブ。
- 前記ナノ粒子は金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子である請求項51に記載のプローブ。
- 前記ナノ粒子は貴金属から作製される請求項55に記載のプローブ。
- 前記ナノ粒子は金から作製される請求項56に記載のプローブ。
- 1つ以上の標的分析物を検出するための基材であって、
a)基材と、
b)該基材に結合している少なくとも1種類の捕捉アプタマーであって、各種類の捕捉アプタマーが特異的標的分析物に結合し、アレイ状の別個のスポットとして配置されることを特徴とする捕捉アプタマーと、
c)該別個のスポットの間に配置された電極と
から成る基材。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する少なくとも1つの標的分析物を検出する方法であって、
a)特異的標的分析物の第1の結合部位に結合することのできる少なくとも1種類の捕捉プローブが結合している基材を提供する工程と、
b)請求項33に記載の少なくとも1種類の検出アプタマープローブであって、該検出アプタマーが前記標的分析物の第2の結合部位に結合することができることを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
c)該捕捉プローブが該標的分析物の第1の結合部位に結合し、かつ該アプタマープローブが該標的分析物の第2の結合部位に結合して複合体を形成するのに有効な条件下で、試料を該基材および該プローブに接触させる工程と、
d)検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。 - 前記捕捉プローブは抗体または捕捉アプタマーを含んでなる請求項59に記載の方法。
- 前記結合部位は特異的捕捉プローブが結合する抗原決定基である請求項59に記載の方法。
- 2種類以上のアプタマープローブであって、各種類のプローブに、同じ標的分析物上の異なる抗原決定基、または異なる標的分析物、あるいはその両方に結合することのできる検出アプタマーが結合していることを特徴とするアプタマープローブが提供される、請求項59に記載の方法。
- 試料中に存在する標的分析物がプローブ上の検出アプタマーに結合するように、試料を最初にアプタマープローブに接触させ、次いで、標的分析物が基材上の捕捉プローブに結合するように、前記アプタマープローブに結合している標的分析物を基材に接触させる、請求項59に記載の方法。
- 試料中に存在する標的分析物が捕捉プローブに結合するように、試料を最初に基材に接
触させ、次いで、標的分析物がアプタマープローブ上の検出アプタマーに結合するように、前記捕捉アプタマーに結合している標的分析物をアプタマープローブに接触させる、請求項59に記載の方法。 - 前記試料、前記アプタマープローブ、および前記基材上の前記捕捉プローブを同時に接触させる、請求項59に記載の方法。
- 捕捉された標的とアプタマープローブとの複合体を、光学的、電気的、音響学的、光音響学的、重力学的、電気化学的、電気光学的、質量分光学的、酵素的、化学的、生化学的または物理的な手段によって検出する請求項59に記載の方法。
- 前記基材は磁性ビーズである請求項59に記載の方法。
- 前記基材は平坦な表面を有する請求項59に記載の方法。
- 前記基材はガラス、石英、セラミックまたはプラスチックから作製される請求項59に記載の方法。
- 前記検出工程は前記基材を銀染色剤に接触させる工程を含む請求項59に記載の方法。
- 前記基材は位置指定可能である請求項59に記載の方法。
- 各々異なる標的分析物を認識することのできる複数の捕捉プローブが、アレイ状のスポットとして基材に結合されている、請求項59に記載の方法。
- 捕捉プローブの各スポットが2つの電極の間に配置され、前記アプタマープローブ上の任意選択の標識は導電体である材料から作製されたナノ粒子であり、かつ工程(d)は導電率の変化を検出する工程を含む請求項72に記載の方法。
- 前記電極は金から作製され、前記ナノ粒子は金から作製される請求項73に記載の方法。
- 前記基材を銀染色剤に接触させて導電率の変化を発生させる請求項73に記載の方法。
- 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する少なくとも1種類の標的分析物を検出する方法であって、
a)請求項33に記載の少なくとも1種類の検出アプタマープローブであって、各種類のプローブ上の検出アプタマーが特定の種類の標的分析物の第1の結合部位に結合することのできる構造を有することを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
c)該検出アプタマーが該標的分析物に結合するのに有効な条件下で、試料をアプタマープローブに接触させる工程と、
d)検出アプタマーが標的分析物に結合するかどうかを検出する工程と
から成る方法。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
a)請求項33に記載のある種類の検出アプタマープローブであって、アプタマーが標的分析物の2つ以上の結合部位に結合することができることを特徴とする検出アプタマープローブを提供する工程と、
b)試料と、アプタマーが結合している該アプタマープローブとを、該標的分析物と該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
c)該標的分析物が該アプタマーに結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。 - 試料中の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物を検出する方法であって、
a)請求項33に記載の少なくとも2種類のアプタマープローブであって、各種類のアプタマーが標的分析物の異なる結合部位に結合することができることを特徴とするアプタマープローブを提供する工程と、
b)試料と、少なくとも2種類のアプタマープローブとを、該標的分析物と該ナノ粒子に結合している該アプタマーとの間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程と、
c)該アプタマーが該標的分析物と結合することによってもたらされる検出可能な変化を観察する工程と
から成る方法。 - 請求項33または48に記載のアプタマー検出プローブと任意選択の基材とを含む、試料中の1つ以上の分析物を検出するためのキット。
- 前記基材は特異的標的分析物用の少なくとも1つの捕捉プローブでアレイ化されている、請求項79に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56787404P | 2004-05-03 | 2004-05-03 | |
US10/995,051 US20050250094A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-11-22 | Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes |
PCT/US2005/016201 WO2005113817A2 (en) | 2004-05-03 | 2005-05-03 | Aptamer-nanoparticle conjugates and method of use for target analyte detection |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007536528A true JP2007536528A (ja) | 2007-12-13 |
Family
ID=35428943
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007511707A Ceased JP2007536528A (ja) | 2004-05-03 | 2005-05-03 | アプタマー・ナノ粒子コンジュゲートおよび標的分析物の検出のための同使用方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20050250094A1 (ja) |
EP (1) | EP1766085B1 (ja) |
JP (1) | JP2007536528A (ja) |
AT (1) | ATE425266T1 (ja) |
AU (2) | AU2005245824A1 (ja) |
CA (1) | CA2564217A1 (ja) |
DE (1) | DE602005013225D1 (ja) |
WO (1) | WO2005113817A2 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011527745A (ja) * | 2008-02-21 | 2011-11-04 | オーティーシー バイオテクノロジーズ、エルエルシー | 均質なプラスチック付着性アプタマー磁性蛍光ビーズ(Plastic−adherentaptamer−magneticbead−fluorophore)の製造方法及びその他のサンドイッチアッセイ |
KR101090982B1 (ko) | 2009-03-16 | 2011-12-08 | 경희대학교 산학협력단 | 양자점-앱타머 접합체를 이용한 생분석 방법 |
JP2016507063A (ja) * | 2013-02-05 | 2016-03-07 | ヴィクトリア リンク リミテッド | 小分子を検出するための新規バイオセンサー |
JP2016533747A (ja) * | 2013-08-22 | 2016-11-04 | アプトン バイオシステムズ インコーポレイテッド | 電気的方法を用いた分子分析物のデジタル分析の方法 |
US10829816B2 (en) | 2012-11-19 | 2020-11-10 | Apton Biosystems, Inc. | Methods of analyte detection |
US11047005B2 (en) | 2017-03-17 | 2021-06-29 | Apton Biosystems, Inc. | Sequencing and high resolution imaging |
US11650202B2 (en) | 2012-11-19 | 2023-05-16 | Apton Biosystems, Inc. | Methods for single molecule analyte detection |
Families Citing this family (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070166741A1 (en) * | 1998-12-14 | 2007-07-19 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
US8152991B2 (en) | 2005-10-27 | 2012-04-10 | Nanomix, Inc. | Ammonia nanosensors, and environmental control system |
US8154093B2 (en) | 2002-01-16 | 2012-04-10 | Nanomix, Inc. | Nano-electronic sensors for chemical and biological analytes, including capacitance and bio-membrane devices |
US7714398B2 (en) * | 2002-09-05 | 2010-05-11 | Nanomix, Inc. | Nanoelectronic measurement system for physiologic gases and improved nanosensor for carbon dioxide |
US7948041B2 (en) | 2005-05-19 | 2011-05-24 | Nanomix, Inc. | Sensor having a thin-film inhibition layer |
JP2007505323A (ja) * | 2003-09-12 | 2007-03-08 | ナノミックス・インコーポレーテッド | 二酸化炭素用ナノ電子センサー |
CA2564609C (en) * | 2003-12-31 | 2014-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Assay device and method |
JP2008507296A (ja) * | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | 混合培養物中でメチシリン耐性黄色ブドウ球菌とメチシリン感受性黄色ブドウ球菌とを区別する方法 |
WO2007044025A2 (en) * | 2004-11-22 | 2007-04-19 | Nanosphere, Inc. | Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nonoparticle probe complexes |
US20070026391A1 (en) * | 2005-04-11 | 2007-02-01 | Ghc Technologies, Inc. | Methods and compositions for identifying chemical or biological agents using multiplexed labeling and colocalization detection |
WO2006125050A2 (en) * | 2005-05-17 | 2006-11-23 | Nanosphere, Inc. | Biobarcode assays for ultra high sensitive detection |
DE602006018477D1 (de) * | 2005-08-19 | 2011-01-05 | Nanosphere Inc | Dna und antikörpern sowie verwendungen davon |
US7466896B2 (en) | 2005-10-26 | 2008-12-16 | The Hong Kong Polytechnic University | Photonic fabric display with controlled pattern, color, luminescence intensity, scattering intensity and light self-amplification |
US20080019659A1 (en) * | 2005-10-26 | 2008-01-24 | Xiaoming Tao | Photonic fabric display with controlled graphic pattern, color, luminescence intensity, and light self-amplification |
EP1981994B1 (en) * | 2006-02-08 | 2014-06-04 | Becton, Dickinson and Company | Sers nanotag assays |
JP2009532064A (ja) * | 2006-04-04 | 2009-09-10 | ナノミックス・インコーポレーテッド | 被検体増幅とレポーターを用いる生体分子のナノ電子的検出 |
US20080085508A1 (en) * | 2006-05-11 | 2008-04-10 | Nanosphere, Inc. | Non-nucleic acid based biobarcode assay for detection of biological materials |
US7763097B2 (en) | 2006-06-08 | 2010-07-27 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Devices, systems and methods for reducing the concentration of a chemical entity in fluids |
JP4878223B2 (ja) | 2006-06-16 | 2012-02-15 | 国立大学法人東京農工大学 | 核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置 |
KR100828936B1 (ko) | 2006-08-01 | 2008-05-20 | 김성천 | 단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자분석방법 |
EP3159417B1 (en) * | 2006-08-01 | 2021-10-06 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nonspecific target capture of nucleic acids |
US20100099858A1 (en) * | 2006-09-28 | 2010-04-22 | Mirkin Chad A | Maximizing Oligonucleotide Loading on Gold Nanoparticle |
US8362618B2 (en) * | 2006-11-08 | 2013-01-29 | Northeastern University | Three dimensional nanoscale circuit interconnect and method of assembly by dielectrophoresis |
US9589686B2 (en) | 2006-11-16 | 2017-03-07 | General Electric Company | Apparatus for detecting contaminants in a liquid and a system for use thereof |
US9536122B2 (en) | 2014-11-04 | 2017-01-03 | General Electric Company | Disposable multivariable sensing devices having radio frequency based sensors |
US10914698B2 (en) | 2006-11-16 | 2021-02-09 | General Electric Company | Sensing method and system |
US9658178B2 (en) | 2012-09-28 | 2017-05-23 | General Electric Company | Sensor systems for measuring an interface level in a multi-phase fluid composition |
US20100134286A1 (en) * | 2008-12-01 | 2010-06-03 | General Electric Company | Radio frequency based sensors employing analyte recognition element |
US9538657B2 (en) | 2012-06-29 | 2017-01-03 | General Electric Company | Resonant sensor and an associated sensing method |
US7947447B2 (en) | 2007-01-16 | 2011-05-24 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
WO2008098248A2 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Northwestern University | Particles for detecting intracellular targets |
JP5238171B2 (ja) * | 2007-03-14 | 2013-07-17 | 株式会社東芝 | 光導波路型抗体チップ |
WO2008150873A1 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Purdue Research Foundation | Ultrasensitive detection of biomolecules using immunoseparation and diffractometry |
US20100105079A1 (en) * | 2007-06-01 | 2010-04-29 | Atonomics A/S | Bio surface acoustic wave (saw) resonator amplification with nanoparticles for detection of a target analyte |
WO2008157649A1 (en) * | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Northwestern University | Non-enzymatic detection of bacterial genomic dna |
JP4947520B2 (ja) * | 2007-07-04 | 2012-06-06 | 国立大学法人東京農工大学 | 生体小分子の検出方法及び装置 |
US7973019B1 (en) | 2007-10-03 | 2011-07-05 | Alcon Research, Ltd. | Transferrin/transferrin receptor-mediated siRNA delivery |
TW200930405A (en) * | 2007-11-15 | 2009-07-16 | Alcon Res Ltd | Low density lipoprotein receptor-mediated siRNA delivery |
WO2009076323A2 (en) | 2007-12-06 | 2009-06-18 | Genalyte Inc. | Monitoring enzymatic process |
CA2724638C (en) | 2008-05-27 | 2020-02-18 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods comprising a polar aprotic solvent |
EP2347247B1 (en) | 2008-10-27 | 2019-06-26 | Genalyte, Inc. | Biosensors based on optical probing and sensing |
US20110235037A1 (en) * | 2008-12-02 | 2011-09-29 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Sensor device for detecting target particles by frustrated total internal reflection |
US7879625B1 (en) | 2008-12-03 | 2011-02-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Preparation of SERS substrates on silica-coated magnetic microspheres |
JP5260339B2 (ja) * | 2009-01-30 | 2013-08-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 |
EP2401395A1 (en) | 2009-02-26 | 2012-01-04 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for rna hybridization applications |
GB0904934D0 (en) | 2009-03-23 | 2009-05-06 | Geneseqe As | Method and apparatus for detecting molecules |
EP2462051A4 (en) | 2009-08-07 | 2013-06-26 | Nanomix Inc | MAGNETIC CARBON NANOTUBES BASED BIO RECOGNITION |
WO2011061351A1 (en) | 2009-11-23 | 2011-05-26 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Aptamers directed against the matrix protein-1 of type a influenza viruses and uses thereof |
US20110158901A1 (en) * | 2009-12-29 | 2011-06-30 | Swadeshmukul Santra | Chitosan-based nanoparticles and methods for making and using the same |
CA2787201A1 (en) | 2010-01-14 | 2011-07-21 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Methods for biomolecule and biomolecule complex (bmc) detection and analysis and the use of such for research and medical diagnosis |
KR101198476B1 (ko) * | 2010-08-31 | 2012-11-06 | 연세대학교 산학협력단 | 나노 구조 기반의 초고해상도 영상 방법 및 장치 |
CN101967517B (zh) * | 2010-03-19 | 2012-11-07 | 黄乐群 | 一种无需借助pcr的基因检测方法 |
CN102269758B (zh) * | 2010-06-04 | 2013-11-20 | 国家纳米科学中心 | 可视化检测抗原抗体反应的方法、试剂盒及其应用 |
EP2591107A2 (en) | 2010-07-06 | 2013-05-15 | Aptateck Bio Ltd. | Nucleic acid aptamer-based diagnostic methods with novel techniques for signal enhancement |
GB201016484D0 (en) | 2010-09-30 | 2010-11-17 | Geneseque As | Method |
EP3266881B1 (en) | 2010-11-05 | 2019-12-25 | Genalyte, Inc. | Optical analyte detection systems and methods of use |
US8542023B2 (en) | 2010-11-09 | 2013-09-24 | General Electric Company | Highly selective chemical and biological sensors |
US9353421B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-05-31 | Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH-UFZ | Aptamers that are specific for immunoglobulin-binding cell wall proteins |
DE102011006610B3 (de) | 2011-03-31 | 2012-06-21 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Aptamere, die spezifisch sind für Immunoglobulin bindende Zellwandproteine |
DE102011006612B3 (de) | 2011-03-31 | 2012-04-12 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Aminoglykosid-spezifische Aptamere |
US8946389B2 (en) | 2011-04-25 | 2015-02-03 | University Of Washington | Compositions and methods for multiplex biomarker profiling |
WO2012161677A1 (en) | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Alcon Research, Ltd. | TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED siRNA DELIVERY |
CA2839705A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Nanostring Technologies, Inc. | Multivariate diagnostic assays and methods for using same |
CN102253194B (zh) * | 2011-06-25 | 2013-08-28 | 南方医科大学 | 一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针 |
US8691500B2 (en) | 2011-07-29 | 2014-04-08 | Korea Institute Of Science And Technology | Device and method for detecting biomolecule |
KR101292636B1 (ko) * | 2011-08-04 | 2013-08-02 | 한국식품연구원 | 식중독균 검출 센서용 슬라이드 칩 및 그 제조방법 |
US10662465B2 (en) * | 2011-09-30 | 2020-05-26 | Agilent Technologies, Inc. | Hybridization compositions and methods using formamide |
US11118226B2 (en) | 2011-10-21 | 2021-09-14 | Agilent Technologies, Inc. | Hybridization compositions and methods |
AU2013220156B2 (en) | 2012-02-15 | 2018-08-09 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Aptamer method |
WO2014031749A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | General Electric Company | Wireless system and method for measuring an operative condition of a machine |
US10598650B2 (en) | 2012-08-22 | 2020-03-24 | General Electric Company | System and method for measuring an operative condition of a machine |
US10684268B2 (en) | 2012-09-28 | 2020-06-16 | Bl Technologies, Inc. | Sensor systems for measuring an interface level in a multi-phase fluid composition |
US9982292B2 (en) * | 2012-09-28 | 2018-05-29 | Src, Inc. | Detecting chemical and biological agents using textile-based sensors |
US10322221B2 (en) | 2013-01-18 | 2019-06-18 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Removal of carbon dioxide via dialysis |
GB201318465D0 (en) | 2013-10-18 | 2013-12-04 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
DE102013204057A1 (de) | 2013-03-08 | 2014-09-11 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Fluorchinolon-spezifische Aptamere |
US20160166186A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-06-16 | The Regents Of The University Of California | In-vivo monitoring of molecular targets |
US9983206B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for enhancing immunoassays |
US9874554B1 (en) * | 2014-07-16 | 2018-01-23 | Verily Life Sciences Llc | Aptamer-based in vivo diagnostic system |
GB201413929D0 (en) | 2014-08-06 | 2014-09-17 | Geneseque As | Method |
CN104569420B (zh) * | 2014-10-09 | 2016-08-17 | 南京大学 | 适配体修饰的纳米银探针及其应用 |
KR102457147B1 (ko) | 2014-10-17 | 2022-10-19 | 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 피엘씨 | 나노 세공 rna 특징 규명을 위한 방법 |
CN104297309B (zh) * | 2014-10-29 | 2016-08-17 | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用 |
JP2018508518A (ja) | 2015-03-04 | 2018-03-29 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | Hiv感染の処置のための方法及び医薬組成物 |
WO2016196691A2 (en) | 2015-06-01 | 2016-12-08 | California Institute Of Technology | Compositions and methods for screening t cells with antigens for specific populations |
WO2017089570A1 (en) | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Molecular robot |
US20180355426A1 (en) | 2015-11-27 | 2018-12-13 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Autonomous sensing molecules (asm) |
KR101928620B1 (ko) * | 2016-07-01 | 2018-12-12 | 중앙대학교 산학협력단 | 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 |
WO2018081193A1 (en) * | 2016-10-25 | 2018-05-03 | Purdue Research Foundation | Conjugates for sensing |
WO2018089391A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Dots Technology Corp. | Allergen detection agents and assays |
CN107058501A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-08-18 | 济南大学 | 一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法 |
CN109001165B (zh) * | 2017-06-07 | 2020-11-20 | 天津师范大学 | 一种免标记磷光探针定量检测三磷酸腺苷的方法 |
US11331019B2 (en) | 2017-08-07 | 2022-05-17 | The Research Foundation For The State University Of New York | Nanoparticle sensor having a nanofibrous membrane scaffold |
GB201720162D0 (en) * | 2017-12-04 | 2018-01-17 | Univ Oxford Innovation Ltd | Method |
US10871485B2 (en) | 2018-04-13 | 2020-12-22 | Rarecyte, Inc. | Kits for labeling of biomarkers and methods of using the same |
AT521238B1 (de) | 2018-05-09 | 2020-02-15 | Lifetaq Analytics Gmbh | In-situ zellanalyse im zellkultursystem |
AU2020213460B2 (en) * | 2019-01-30 | 2024-02-29 | Suzhou Astrabio Technology Co., Ltd. | Single molecule quantitative detection method and detection system |
CN110082524B (zh) * | 2019-04-29 | 2022-06-14 | 上海大学 | 检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用 |
GB201907007D0 (en) * | 2019-05-17 | 2019-07-03 | Nano Biosols Ltd | A simple method and kit for quantifying gold nanoparticles in a liquid sample |
WO2021034995A1 (en) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | Dots Technology Corp. | Optimized nucleic acid probes for analyte detection |
US11624606B2 (en) * | 2020-02-20 | 2023-04-11 | Cognex Corporation | Methods and apparatus for using range data to predict object features |
CN112326602B (zh) * | 2020-10-15 | 2023-07-21 | 哈尔滨工业大学 | 一种可实现肿瘤光学诊断与光热治疗双重功能的纳米复合物的筛选方法及其应用 |
WO2023004248A1 (en) * | 2021-07-23 | 2023-01-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Deprotection-counting probes for detecting and quantifying single molecular analytes |
US11530406B1 (en) | 2021-08-30 | 2022-12-20 | Sachi Bioworks Inc. | System and method for producing a therapeutic oligomer |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020037506A1 (en) * | 2000-04-18 | 2002-03-28 | Yun Lin | Aptamer based two-site binding assay |
JP2003503699A (ja) * | 1999-06-25 | 2003-01-28 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子およびその利用法 |
JP2004132954A (ja) * | 2002-06-25 | 2004-04-30 | Bayer Ag | 一個または複数個の分析物を検出するための方法および装置、ならびに装置の使用 |
Family Cites Families (94)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
US4318707A (en) * | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
US4256834A (en) * | 1979-04-09 | 1981-03-17 | Syva Company | Fluorescent scavenger particle immunoassay |
US4261968A (en) * | 1979-05-10 | 1981-04-14 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4650770A (en) * | 1981-04-27 | 1987-03-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Energy absorbing particle quenching in light emitting competitive protein binding assays |
US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
US4713348A (en) * | 1983-04-05 | 1987-12-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Fluorescent multiparameter particle analysis |
US5288609A (en) * | 1984-04-27 | 1994-02-22 | Enzo Diagnostics, Inc. | Capture sandwich hybridization method and composition |
US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
US4868104A (en) * | 1985-09-06 | 1989-09-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous assay for specific polynucleotides |
US4851337A (en) * | 1986-01-08 | 1989-07-25 | Hygeia Sciences, Inc. | Extraction of test substances |
US5137827A (en) * | 1986-03-25 | 1992-08-11 | Midwest Research Technologies, Inc. | Diagnostic element for electrical detection of a binding reaction |
US5514602A (en) * | 1986-06-09 | 1996-05-07 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles |
US5360895A (en) * | 1987-04-22 | 1994-11-01 | Associated Universities, Inc. | Derivatized gold clusters and antibody-gold cluster conjugates |
US4853335A (en) * | 1987-09-28 | 1989-08-01 | Olsen Duane A | Colloidal gold particle concentration immunoassay |
US4886741A (en) * | 1987-12-09 | 1989-12-12 | Microprobe Corporation | Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization |
US5252459A (en) * | 1988-09-23 | 1993-10-12 | Abbott Laboratories | Indicator reagents, diagnostic assays and test kits employing organic polymer latex particles |
US4966143A (en) * | 1988-12-06 | 1990-10-30 | Meinershagen Charles I | Surgical wire guide |
US5151510A (en) * | 1990-04-20 | 1992-09-29 | Applied Biosystems, Inc. | Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs |
ES2259800T3 (es) * | 1990-06-11 | 2006-10-16 | Gilead Sciences, Inc. | Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico. |
US5789163A (en) * | 1990-06-11 | 1998-08-04 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Enzyme linked oligonucleotide assays (ELONAS) |
US5567588A (en) * | 1990-06-11 | 1996-10-22 | University Research Corporation | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX |
US5460831A (en) * | 1990-06-22 | 1995-10-24 | The Regents Of The University Of California | Targeted transfection nanoparticles |
AU8951191A (en) * | 1990-10-29 | 1992-05-26 | Dekalb Plant Genetics | Isolation of biological materials using magnetic particles |
US5665582A (en) * | 1990-10-29 | 1997-09-09 | Dekalb Genetics Corp. | Isolation of biological materials |
US5294369A (en) * | 1990-12-05 | 1994-03-15 | Akzo N.V. | Ligand gold bonding |
US5840867A (en) * | 1991-02-21 | 1998-11-24 | Gilead Sciences, Inc. | Aptamer analogs specific for biomolecules |
WO1993010564A1 (en) * | 1991-11-22 | 1993-05-27 | The Regents Of The University Of California | Semiconductor nanocrystals covalently bound to solid inorganic surfaces using self-assembled monolayers |
US5225064A (en) * | 1992-01-15 | 1993-07-06 | Enzyme Technology Research Group, Inc. | Peroxidase colloidal gold oxidase biosensors for mediatorless glucose determination |
US5472881A (en) * | 1992-11-12 | 1995-12-05 | University Of Utah Research Foundation | Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces |
JPH08507203A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-08-06 | イノーバー ラボラトリーズ,インコーポレイテッド | 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法 |
US5637508A (en) * | 1993-03-26 | 1997-06-10 | Geo-Centers, Inc. | Biomolecules bound to polymer or copolymer coated catalytic inorganic particles, immunoassays using the same and kits containing the same |
US5384265A (en) * | 1993-03-26 | 1995-01-24 | Geo-Centers, Inc. | Biomolecules bound to catalytic inorganic particles, immunoassays using the same |
US5681943A (en) * | 1993-04-12 | 1997-10-28 | Northwestern University | Method for covalently linking adjacent oligonucleotides |
US5543158A (en) * | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US5466580A (en) * | 1993-09-22 | 1995-11-14 | Xoma Corporation | Method for quantifying BPI in body fluids |
US5521289A (en) * | 1994-07-29 | 1996-05-28 | Nanoprobes, Inc. | Small organometallic probes |
US5599668A (en) * | 1994-09-22 | 1997-02-04 | Abbott Laboratories | Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events |
US6025202A (en) * | 1995-02-09 | 2000-02-15 | The Penn State Research Foundation | Self-assembled metal colloid monolayers and detection methods therewith |
US5609907A (en) * | 1995-02-09 | 1997-03-11 | The Penn State Research Foundation | Self-assembled metal colloid monolayers |
IL126544A (en) * | 1996-04-25 | 2004-08-31 | Genicon Sciences Inc | Test for component detection using detectable particles in diffused light |
US7169556B2 (en) * | 1996-07-29 | 2007-01-30 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6361944B1 (en) * | 1996-07-29 | 2002-03-26 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6506564B1 (en) * | 1996-07-29 | 2003-01-14 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
EP1818417B1 (en) * | 1996-07-29 | 2014-02-12 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6582921B2 (en) * | 1996-07-29 | 2003-06-24 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof |
US6750016B2 (en) * | 1996-07-29 | 2004-06-15 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6984491B2 (en) * | 1996-07-29 | 2006-01-10 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US5830986A (en) * | 1996-10-28 | 1998-11-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for the synthesis of functionalizable poly(ethylene oxide) star macromolecules |
US5900481A (en) * | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
US5922537A (en) * | 1996-11-08 | 1999-07-13 | N.o slashed.AB Immunoassay, Inc. | Nanoparticles biosensor |
US5939021A (en) * | 1997-01-23 | 1999-08-17 | Hansen; W. Peter | Homogeneous binding assay |
US6001570A (en) * | 1997-02-18 | 1999-12-14 | Invitro Diagnostics, Inc. | Compositions, methods, kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules |
US6974669B2 (en) * | 2000-03-28 | 2005-12-13 | Nanosphere, Inc. | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles |
US6149868A (en) * | 1997-10-28 | 2000-11-21 | The Penn State Research Foundation | Surface enhanced raman scattering from metal nanoparticle-analyte-noble metal substrate sandwiches |
US5990479A (en) * | 1997-11-25 | 1999-11-23 | Regents Of The University Of California | Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes |
US6242246B1 (en) * | 1997-12-15 | 2001-06-05 | Somalogic, Inc. | Nucleic acid ligand diagnostic Biochip |
US6225058B1 (en) * | 1998-01-13 | 2001-05-01 | Invitro Diagnostics, Inc. | Compositions, methods, kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules |
US5972615A (en) * | 1998-01-21 | 1999-10-26 | Urocor, Inc. | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate disease |
US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
US6399302B1 (en) * | 1998-08-21 | 2002-06-04 | University Of Virginia Patent Foundation | Signal generating oligonucleotide-based biosensor |
US6251303B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-06-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble fluorescent nanocrystals |
US6306610B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of quantum dots |
US6203989B1 (en) * | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
US6261779B1 (en) * | 1998-11-10 | 2001-07-17 | Bio-Pixels Ltd. | Nanocrystals having polynucleotide strands and their use to form dendrimers in a signal amplification system |
FI982489A (fi) * | 1998-11-17 | 2000-05-18 | Arto Remes | Menetelmä lihasten harjoittamiseksi |
US6277489B1 (en) * | 1998-12-04 | 2001-08-21 | The Regents Of The University Of California | Support for high performance affinity chromatography and other uses |
EP1183521B1 (en) * | 1999-05-14 | 2014-03-19 | Brandeis University | Aptamer-based detection |
US6680377B1 (en) * | 1999-05-14 | 2004-01-20 | Brandeis University | Nucleic acid-based detection |
AU1429401A (en) * | 1999-07-02 | 2001-02-05 | Conceptual Mindworks, Inc. | Organic semiconductor recognition complex and system |
WO2001051665A2 (en) * | 2000-01-13 | 2001-07-19 | Nanosphere Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US20020001810A1 (en) * | 2000-06-05 | 2002-01-03 | Farrell Michael Patrick | Q-beta replicase based assays; the use of chimeric DNA-RNA molecules as probes from which efficient Q-beta replicase templates can be generated in a reverse transcriptase dependent manner |
AU2001276870B2 (en) * | 2000-07-11 | 2006-07-20 | Northwestern University | Method of detection by enhancement of silver staining |
US6649138B2 (en) * | 2000-10-13 | 2003-11-18 | Quantum Dot Corporation | Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media |
WO2002046483A2 (en) * | 2000-12-06 | 2002-06-13 | Northwestern University | Silver stain removal from dna detection chips by cyanide etching or sonication |
US20020127563A1 (en) * | 2001-01-08 | 2002-09-12 | Salafsky Joshua S. | Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interactions without labels |
US20030113740A1 (en) * | 2001-04-26 | 2003-06-19 | Mirkin Chad A. | Oligonucleotide-modified ROMP polymers and co-polymers |
AU2002239726A1 (en) * | 2001-05-25 | 2002-12-09 | Northwestern University | Non-alloying core shell nanoparticles |
ES2474192T3 (es) * | 2001-05-25 | 2014-07-08 | Duke University | Moduladores de agentes farmacol�gicos |
US7147687B2 (en) * | 2001-05-25 | 2006-12-12 | Nanosphere, Inc. | Non-alloying core shell nanoparticles |
JP4347053B2 (ja) * | 2001-08-03 | 2009-10-21 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | ナノ粒子撮像システムおよび方法 |
DK1432786T3 (da) * | 2001-09-06 | 2009-10-26 | Rapid Micro Biosystems Inc | Hurtig detektion af replikerede celler |
AU2002367817B2 (en) * | 2001-11-09 | 2008-05-29 | Nanosphere, Inc. | Bioconjugate-nanoparticle probes |
US20030162190A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-08-28 | Gorenstein David G. | Phosphoromonothioate and phosphorodithioate oligonucleotide aptamer chip for functional proteomics |
CA2473683A1 (en) * | 2002-01-22 | 2003-07-31 | Mcmaster University | Signalling aptamer complexes |
US20040023415A1 (en) * | 2002-03-05 | 2004-02-05 | Konstantin Sokolov | Biospecific contrast agents |
US20030211488A1 (en) * | 2002-05-07 | 2003-11-13 | Northwestern University | Nanoparticle probs with Raman spectrocopic fingerprints for analyte detection |
ATE420357T1 (de) * | 2002-07-02 | 2009-01-15 | Nanosphere Inc | Nanopartikel-polyanion-konjugate sowie verfahren zur verwendung davon beim nachweis von analyten |
CN1672050A (zh) * | 2002-08-02 | 2005-09-21 | 美国艾培拉公司 | 荧光偏振检测 |
ATE520027T1 (de) * | 2002-09-03 | 2011-08-15 | Bayer Technology Services Gmbh | Analytische plattform und nachweisverfahren mit gegebenenfalls nach fraktionierung in einer probe nachzuweisenden analyten als immobilisierten spezifischen bindungspartnern |
DE602004022943D1 (de) * | 2003-05-30 | 2009-10-15 | Nanosphere Inc | Verfahren zum nachweis von analyten auf grundlage von evaneszenzbelichtung und auf streuung beruhender nachweis von nanopartikelsondenkomplexen |
-
2004
- 2004-11-22 US US10/995,051 patent/US20050250094A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-05-03 AT AT05779974T patent/ATE425266T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-05-03 AU AU2005245824A patent/AU2005245824A1/en not_active Abandoned
- 2005-05-03 US US11/121,165 patent/US20060014172A1/en not_active Abandoned
- 2005-05-03 CA CA002564217A patent/CA2564217A1/en not_active Abandoned
- 2005-05-03 JP JP2007511707A patent/JP2007536528A/ja not_active Ceased
- 2005-05-03 EP EP05779974A patent/EP1766085B1/en not_active Not-in-force
- 2005-05-03 DE DE602005013225T patent/DE602005013225D1/de active Active
- 2005-05-03 WO PCT/US2005/016201 patent/WO2005113817A2/en active Application Filing
-
2009
- 2009-02-27 AU AU2009200803A patent/AU2009200803A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003503699A (ja) * | 1999-06-25 | 2003-01-28 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子およびその利用法 |
US20020037506A1 (en) * | 2000-04-18 | 2002-03-28 | Yun Lin | Aptamer based two-site binding assay |
JP2004132954A (ja) * | 2002-06-25 | 2004-04-30 | Bayer Ag | 一個または複数個の分析物を検出するための方法および装置、ならびに装置の使用 |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011527745A (ja) * | 2008-02-21 | 2011-11-04 | オーティーシー バイオテクノロジーズ、エルエルシー | 均質なプラスチック付着性アプタマー磁性蛍光ビーズ(Plastic−adherentaptamer−magneticbead−fluorophore)の製造方法及びその他のサンドイッチアッセイ |
KR101090982B1 (ko) | 2009-03-16 | 2011-12-08 | 경희대학교 산학협력단 | 양자점-앱타머 접합체를 이용한 생분석 방법 |
US10829816B2 (en) | 2012-11-19 | 2020-11-10 | Apton Biosystems, Inc. | Methods of analyte detection |
US11650202B2 (en) | 2012-11-19 | 2023-05-16 | Apton Biosystems, Inc. | Methods for single molecule analyte detection |
US11248266B2 (en) | 2012-11-19 | 2022-02-15 | Apton Biosystems, Inc. | Methods of analyte detection |
JP2016507063A (ja) * | 2013-02-05 | 2016-03-07 | ヴィクトリア リンク リミテッド | 小分子を検出するための新規バイオセンサー |
US11435356B2 (en) | 2013-08-22 | 2022-09-06 | Apton Biosystems, Inc. | Digital analysis of molecular analytes using electrical methods |
JP2016533747A (ja) * | 2013-08-22 | 2016-11-04 | アプトン バイオシステムズ インコーポレイテッド | 電気的方法を用いた分子分析物のデジタル分析の方法 |
JP2020072651A (ja) * | 2013-08-22 | 2020-05-14 | アプトン バイオシステムズ インコーポレイテッド | 電気的方法を用いた分子分析物のデジタル分析の方法 |
US11474107B2 (en) | 2013-08-22 | 2022-10-18 | Apton Biosystems, Inc. | Digital analysis of molecular analytes using electrical methods |
US11047005B2 (en) | 2017-03-17 | 2021-06-29 | Apton Biosystems, Inc. | Sequencing and high resolution imaging |
US11434532B2 (en) | 2017-03-17 | 2022-09-06 | Apton Biosystems, Inc. | Processing high density analyte arrays |
US11060140B2 (en) | 2017-03-17 | 2021-07-13 | Apton Biosystems, Inc. | Sequencing and high resolution imaging |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005113817A9 (en) | 2006-08-17 |
AU2009200803A1 (en) | 2009-03-19 |
US20050250094A1 (en) | 2005-11-10 |
EP1766085A2 (en) | 2007-03-28 |
DE602005013225D1 (de) | 2009-04-23 |
CA2564217A1 (en) | 2005-12-01 |
ATE425266T1 (de) | 2009-03-15 |
WO2005113817A2 (en) | 2005-12-01 |
EP1766085B1 (en) | 2009-03-11 |
US20060014172A1 (en) | 2006-01-19 |
WO2005113817A3 (en) | 2006-05-26 |
AU2005245824A1 (en) | 2005-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1766085B1 (en) | Aptamer-nanoparticle conjugates and method of use for target analyte detection | |
EP1915466B1 (en) | Methods for preparing hybrid substrates comprising dna and antibodies and uses thereof | |
JP4146239B2 (ja) | オリゴヌクレオチド修飾粒子をベースとするバイオバーコード | |
US7323309B2 (en) | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles | |
Lin et al. | Electrochemical detection of nucleic acids, proteins, small molecules and cells using a DNA-nanostructure-based universal biosensing platform | |
EP1747295B1 (en) | Bio-barcode based detection of target analytes | |
US7253277B2 (en) | Nanoparticle polyanion conjugates and methods of use thereof in detecting analytes | |
US20060040286A1 (en) | Bio-barcode based detection of target analytes | |
Baptista et al. | Nanoparticles in molecular diagnostics | |
US20040086897A1 (en) | Nanoparticle probes with Raman Spectroscopic fingerprints for analyte detection | |
AU2004254367B2 (en) | Bio-barcode based detection of target analytes | |
JP2007525651A (ja) | ナノ粒子プローブ複合体のエバネセント照明および散乱を基礎とする検出に基づいて分析物を検出する方法 | |
WO2006125050A2 (en) | Biobarcode assays for ultra high sensitive detection | |
AU2002256145B2 (en) | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles | |
Baptista et al. | C0055 Nanoparticles in Molecular Diagnostics | |
AU2007203391A1 (en) | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090924 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091001 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091023 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091030 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091224 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100622 |
|
A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20101026 |