CN101967517B - 一种无需借助pcr的基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子诊断领域，公开了一种无需借助PCR的基因检测方法。该方法包含如下步骤：利用修饰有识别分子和编码分子的纳米探针及修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，通过洗涤用磁力架分离出该夹心式复合物，去杂交释放出纳米探针，通过基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱直接检测纳米探针表面的编码分子的加钠分子离子峰，其中：纳米探针中编码分子与识别分子的比例为300～2000∶1。本方法最大的优势在于高灵敏度、高选择性，可用于生物样品中目标基因的直接检测。此外，本发明还具有操作简便、速度快、自动化程度高等优点，为疾病早期诊断或其他基因检测提供了新的有力手段。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种无需借助PCR的基因检测方法。
背景技术
公共健康问题一直都是在世界范围内备受关注的。例如，乙肝病毒和丙肝病毒是慢性肝炎发病的主要原因，并直接导致肝癌。人类免疫缺陷病毒造成艾滋病感染，梅毒螺旋体引起性传播疾病——梅毒，现代科技对于这些疾病还不能很好控制与治疗。事实上，不管是癌症还是传染性疾病都是人类健康的主要威胁之一，这主要是由于缺乏有效的早期诊断方法，相应的预防疫苗和对治疗切实有效的药物。与后两者相比，疾病的早期诊断在控制疾病发展和传播上不失为一个最重要的手段。从预防的角度来讲，实验室诊断包括传统的抗原-抗体反应以及复杂的分子生物学诊断方法，这些都是诊断疾病有效的重要的方法。与抗原-抗体检测相比，以生物大分子为基础的分子生物学诊断主要是在疾病早期检测致病病原微生物的遗传物质——核苷酸，这可以把疾病的窗口期由几个月缩短到几天。窗口期缩短对控制疾病的传播非常重要。当前检测传染性疾病生物样品中生物标志物(包括核酸和蛋白质)的主要手段有酶联免疫吸附试验(ELISA)，聚合酶链式反应(PCR)产物与探针杂交并凝胶显影等，其中像酶联免疫吸附试验(ELISA)这类属于以抗原-抗体反应为原理的检测手段，机体感染病原微生物后产生抗体需要数月甚至更长的时间，这个时间几乎相当于疾病窗口期的时间。另外就是以PCR技术为基础衍生出来的各种检测方法，这些方法检测生物样本中的目标基因虽然也具有很多优点，而且是目前临床抗原-抗体检测方法的主要辅助或者再确认“金标准”手段，但这些方法存在着PCR技术本身带来的“假阳性”，易被污染，技术要求高，繁琐费时等缺点。虽然这些方法可以在分子水平进行检测，但是传染病的快速传播使建立费用低廉、结果可靠、灵敏度高、特异性高、操作简便、可同时进行多种疾病诊断的高通量DNA检测技术成为越来越需要迫切解决的问题。
纳米粒子(nano-particle)也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1～100nm间的粒子，是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，它是一种优良的生物分子标记物，使用纳米材料制成的纳米探针用于基因检验的方法逐渐引起了分子诊断学等各个领域的广泛关注，越来越显示出光明的发展前景。
近年来，质谱(MS)技术得到迅速发展，已被广泛应用于化工、石油、医药、生物等领域，成为科研和生产中十分重要的工具。特别是20世纪80年代中期出现的基质辅助激光解析离子化(MALDI-TOF-MS，TOF MS)和电喷雾电离(ESI)两种软电离方式的出现，因其具有检测范围广、灵敏度高、操作简便、自动化程度高、快速等特点，已广泛用于生物学、临床医学、环境学等领域的研究。目前，德国Qiagen公司开发的一套有机分子编码核酸的技术，建立了64个编码核酸的标记库，利用质谱技术可同时检测22种病原体(Tgomas Briese，et al.Diagnostic system for rapid and sensitive differential detectionof pathogens.Emerging inferctious diseases，2005，11(2)，310-313.Kokoris，Mark，et al.High-throμghput SNP genotyping with the Masscode system.MolecμLar Diagnosis，2000，5(4)，329-340.)。该方法通过可控的光切技术把小分子标记物连接到核酸上，经过PCR扩增，再进行生物识别，最后通过光照把标记物释放出来，采用质谱检测做出判断。该方法设计十分巧妙，但是该方法需要把标记物通过化学方法连接到生物分子上，而检测时需要把标记物通过化学反应再释放出来，这个过程不仅技术要求高、操作繁琐而且费时、费力。
专利CN101281164A中公开了一种组装质量编码纳米探针的方法，但靶目标的检测必须经PCR将信号放大后，才能达到所述的检测灵敏度，而且也没有涉及到关于实际应用方面的内容，即在实际生物样品中该方法的耐用性考察。其具体过程是将编码分子和相应的识别分子修饰到金纳米粒子表面，制成胶体金纳米探针。通过杂交，与靶基因结合，再利用处理后的硅片对纳米探针-靶目标复合物进行分离，最后采用质谱检测胶体金纳米探针表面的编码分子，从而实现对靶DNA的检测。其中编码分子为可与金纳米粒子结合的有机小分子，可被质谱检测；而识别分子为一段可与靶DNA发生特异性识别的DNA序列。处理过的硅片具有捕获金纳米探针-靶DNA复合物的作用，这是因为硅片表面连接有另外一段可与靶DNA发生特异性结合但不同于识别分子的DNA序列，这种修饰的硅片只有分离和纯化作用，不具有浓缩靶目标的作用。该方法通过纳米探针实现信号的编码和放大，且无需把编码分子从纳米探针上释放出来，即可直接对其进行检测。质谱检测编码分子，自动化程度高、灵敏度最高可达10-14M。但是该专利最大的缺陷是尚需通过PCR扩增靶DNA，靶基因的浓度提高后才能对其进行检测，整个操作过程繁琐，费时，灵敏度也达不到临床检测需要的水平。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，为满足生物样本检测尤其是疾病早期诊断的临床现实需求，提供一种不再需要PCR技术对靶目标进行信号扩大的生物磁性纳米探针结合质谱技术进行基因检测的方法。
本发明原理如下：本发明采用的生物磁性纳米探针由胶体金纳米探针和捕获探针组成。纳米探针为在金纳米颗粒表面通过自组装，连接包括用来识别靶目标的识别分子和作为信号阅读和信号放大的编码分子。捕获探针是在磁性粒子表面连接有可识别靶目标的另一个生物大分子，捕捉探针在靶目标存在的环境中起到分离、纯化和浓缩的作用。当生物磁性纳米探针与靶目标相遇，可形成由纳米探针、靶目标、捕获探针3部分组成的夹心式复合物。利用捕捉探针分离纯化该夹心结构，洗涤除去其他干扰物质，去杂交释放出纳米探针，通过质谱测定纳米探针表面的编码分子，从而判断被测样品中靶目标的存在与否情况。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种基因检测方法，包含如下步骤：利用修饰有识别分子和编码分子的纳米粒子为纳米探针及修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，分离出该夹心式复合物，释放出纳米探针，通过质谱直接检测纳米探针表面编码分子的分子离子峰，其中：纳米探针中编码分子与识别分子的比例为300～2000∶1，优选1300～2000∶1。
所述的形成夹心式复合物的杂交反应体系的盐浓度为0.2～1.0M，优选0.5～0.7M。所述的盐一般为氯化钠。实验结果显示DNA分子之间的杂交效率随着体系中盐浓度的提高而提高，体系的稳定性也提高，但是太高的盐浓度(浓度超过1M)却抑制杂交，并产生非特异性杂交。研究发现盐浓度在0.2～1.0M，特别是在0.5～0.7M不仅可以确保较高的杂交效率，而又不出现非特异性杂交的问题。
所述的质谱为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱或电喷雾质谱，优选基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱。所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱所用的基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸，3，5-二乙氧基-4-羟基肉桂酸，芥子酸，2，5-二羟基苯甲酸或DNA自主装的金纳米颗粒中的任一种，优选DNA自主装的金纳米颗粒，特别优选以10～20个胸腺嘧啶或者腺嘌呤组成的DNA自组装的胶体金纳米颗粒。
所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用AnchorChipR400/384点样靶，利用337nm波长的氮激光光源进行被测物的解析和离子化。
所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用正离子反射模式，在10％～70％的激光强度下进行检测，激光强度优选20％～50％，进一步优选20％～35％。
所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用的加速电压为20～35KV，优选25KV。
所述的纳米探针中的纳米材料为金纳米粒子，其粒径为10～100nm。
所述的编码分子是分子中含有巯基或者二硫键的有机化合物，优选硫醇、硫醚或二硫化物。
所述的磁性微球可以是无机微球、生物高分子微球或聚合物高分子微球，优选聚苯乙烯磁性微球。
所述的磁性微球表面修饰有氨基或链霉亲和素。
所述的夹心式复合物可通过磁力架分离。
本发明的有益效果：
本发明是一种不需经过PCR扩增的基因检测方法，主要是通过提高胶体金纳米探针表面编码分子和识别分子的比例，进行靶目标信号扩大，结合修饰过的磁性微球的浓缩作用，以及与高灵敏度的现代化分析仪器相结合，从而实现不再需要PCR扩增靶目标的高特异性、高灵敏度的基因检测。
专利申请CN101281164A提出了利用双分子修饰的纳米探针与磁性捕获探针检测基因或生物大分子的一个大方向，并未对其中影响灵敏度的具体条件进行研究，因此灵敏度并不是很高，在用于基因检测时必须先借助PCR对靶基因进行扩增。发明人在前者的基础上通过大量实验对影响灵敏度的因素进行了研究，确定了其具体条件，使检测灵敏度有了显著的提高，即由原来的10-14M提高到10-17M。本发明不需要PCR扩增即可直接检测生物大分子，从而避免PCR技术本身固有的可能出现“假阳性”，易于污染，技术操作要求高，繁琐费时以及PCR过程需用酶具有的昂贵、易失活、不易保存等缺陷。本发明探针组装过程简单、技术要求不高、可大批量制备、探针稳定性好易于保存；且杂交过程简单快速，易于操作，质谱仪器分析自动化程度高等，这些优点有利于该方法的临床化，为临床疾病早期诊断提供了一个新思路。
理论上，利用有机分子作为质量条码的基因分析可以进行非常复杂的多重检测，但目前的技术只能做到一重或两重靶目标的检测。多重检测对于许多分析方法都是一个十分具有挑战性的问题，这是因为可能存在探针与非靶目标之间的非特异性结合、探针设计需要兼顾多方面考虑因素、测定时需要把待测物从探针-靶目标复合物中分离出来等许多十分棘手且不可规避的问题。这些都要求分析方法不但要有高灵敏度，同时还要有高特异性。然而一般情况下，分析测定方法的灵敏度与特异性是一对矛盾，往往需要根据方法的实际需要，或者牺牲特异性而追求高灵敏度，或者牺牲灵敏度而追求高特异性。发明人经过大量试验，在金纳米探针自组装过程中极大地提高了编码分子和识别分子的比例，使本发明的检测灵敏度显著提高；在此基础上，在杂交时使用相对较高的盐离子浓度的反应体系，既提高了杂交效率又不发生非特异性杂交，并且质谱测定过程中以DNA(10～20个胸腺嘧啶或者腺嘌呤)自组装的胶体金粒子作为基质，几乎不存在其他方法存在的“本底”，使质谱图更“干净”，确保该基因检测方法具备高灵敏度的同时，还兼具了很高的特异性，为实现生物样品的多重检测提供了有力的手段。
本方法对靶目标的检测是通过质谱检测胶体金纳米探针上组装的编码分子的分子离子峰实现的。理论上编码分子与识别分子的比例越大，靶目标的信号放大效果越好，灵敏度越高。但由于编码分子是脂溶性物质，其溶解介质为乙醇，组装过程中太多的乙醇会破坏胶体金的稳定状态，使其聚集沉淀。专利申请CN101281164A仅是参考文献随机选择了一个比例，未研究编码分子与识别分子的比例与检测灵敏度及探针稳定性的关系。本发明在专利申请CN101281164A的基础上通过大量平行实验优化了金纳米粒子表面的编码分子和识别分子的比例，在该比例范围内既提高了灵敏度，又保证了纳米探针的稳定性。在此比例范围以外，要么灵敏度过低，要么探针组装失败。
本发明使用磁性微球(magnetic microparticle，MMP)作为固相支持物，同时起到分离纯化与富集浓缩的作用，也是本方法灵敏度大大提高的主要贡献者之一。磁珠的种类很多，根据磁珠制备的材料不同，可分为无机微球、生物高分子微球、聚合物高分子微球等。磁珠表面可以连接有多种活性基团。本发明中使用的磁性粒子是表面具有氨基或者链霉亲和素的微球。
综上所述，本方法具有高灵敏度、高特异性，操作简单快速等优点，可用于生物样品中靶目标的直接检测以及多重靶目标的测定，也可进行基因中寡核苷酸多态性(SNP)的不同分型及其他方面的基因检测。另外，借助双标记的胶体金纳米探针，针对质谱无法区分的相同质量数而不同碱基排列顺序的核苷酸检测尤为有效。
附图说明
图1.单个靶DNA检测的灵敏度实验结果
a.为靶DNA浓度分别为0，10-17，10-15，10-13，10-11M的样品的TOF MS检测结果质谱图，m/z 869；
b.为靶DNA浓度分别为0，10-17，10-15，10-13，10-11M的样品的TOF MS检测灵敏度的柱状图，图中信号强度为考虑了测定过程中稀释或者浓缩倍数以及点样量的结果。
图2.多重靶基因检测选择性实验结果图(一)
a.空白实验，即加入30μL超纯水；
b.体系中加入含HIV-1，HCV，HBV和TP四种靶DNA的样品液，其总浓度为10-10M，在m/z 693，781，869和957显示4个峰；
c.体系中加入只含HGV(完全不匹配DNA)的样品液30μL，质谱测定无峰，表示无杂交产物生成。
图3.多重靶基因检测选择性实验结果图(二)
a至d依次为加入30μL分别含HIV-1，HBV，HCV和TP四种靶DNA的样品液的质谱图，分别在m/z 693，781，869和957各显示相应的峰；e为加入含HIV-1和TP两种靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 693和957显示相应的峰；f为加入含HCV和HBV的两种靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 781和869显示相应的峰；g为加入含HIV-1，HBV和TP的3种靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 693，781和957显示相应的峰；h为加入含HIV-1，HCV和TP的3种靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 693，869，和957显示相应的峰。
图4.多重靶基因检测灵敏度实验结果图
a中从左至右依次为5种样品液(其中靶DNA总浓度分别为0，10-17，10-15，10-13，10-11M)的质谱图；
b各样品液(其中靶DNA总浓度分别为0，10-17，10-15，10-13，10-11M)的MALDI TOFMS检测灵敏度柱状图，每个浓度水平柱状图从左至右依次对应HIV、HBV、HCV、TP基因。每个浓度水平分别平行实验3次。图中信号强度为考虑了测定过程中稀释或者浓缩倍数以及点样量的结果。
图5.实际生物样品的测定过程示意图。
图6.实际生物样品靶目标检测灵敏度实验
a生物样品中靶DNA浓度从左至右依次为0，4.2fM，42fM，420fM和4.2pM的测定质谱图；b为对应的灵敏度实验的柱状图。
图7.寡核苷酸多态性(SNP)分析
a.加入靶目标DNA1的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNA1与捕获探针及纳米探针完全匹配，经过杂交-去杂交过程后，反应体系呈红色，MS测定存在m/z 869([M+Na]+)和837([M+Na-S]+)。
b.加入DNA2的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNA2存在SNP，与捕获探针及纳米探针不匹配，反应体系呈无色，MS测定无峰。
c.加入DNA3的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNA3存在SNP，与捕获探针及纳米探针不匹配，反应体系呈无色，MS测定无峰。
图8.对质量数相同但碱基排列顺序不同核苷酸的区分
a含有DNA1和DNA4两个靶基因的样品的颜色反应及质谱检测结果图；
b不含任何靶基因的样品的颜色反应及质谱检测结果图；
c只含有DNA1的样品的颜色反应及质谱检测结果图；
d只含有DNA4的样品的颜色反应及质谱检测结果图。
具体实施方式
本发明所有DNA其合成和纯化由上海英潍捷基公司完成，氯金酸(99.9％)购自上海久岳化学有限公司，SMPB购自美国Pierce生物技术有限公司，氨基化磁性微球购自上海英潍捷基公司，超纯水(18.2MΩ·cm)经过SartoriusArium 611体系纯化，整个实验均采用布鲁克公司的质谱(Bruker MLtraflex III TOF/TOF Mass Spectrometer)进行测定。
实施例1生物磁性纳米探针应用于HCV-DNA的MS测定
(1)HCV胶体金纳米探针(HCV-AuNPs)的制备：
①1OD HCV-DNA识别分子(5’GCA GTA CCA CAA GGC AAA AAA AAA A SH 3’，SEQID NO.1)大约35μg，离心5min(5000rpm)，加超纯水200μL溶解，涡旋30s，混匀；
②加入2mL胶体金(自己合成，13nm，透射电子显微镜镜测定)，轻轻振摇24h(20rpm)，室温(25℃)；
③加入0.3M NaCl，10mM磷酸缓冲液(PB)，pH＝7.0(磷酸缓冲液1)，使体系中NaCl浓度到0.1M，轻轻振摇老化36h；
④加入五甘醇二硫分子，48μL(100mM乙醇溶液为溶剂)，继续轻轻振摇12h，即得编码分子与识别分子的比例约为1600∶1的胶体金纳米探针。4℃保存。
⑤临用前，离心(12,000g)25min，除去上清液，以0.1M NaCl，10mM PB，pH7.0(磷酸缓冲液2)分散，如此离心并洗涤3次，最终分散于磷酸缓冲液1中，浓度大约5nM。
(2)HCV捕捉探针(HCV-MMPs)的制备：
磁性微球(上海英潍捷基公司，300μL，30mg/mL)用300μL二甲亚砜(DMSO)洗涤3次，然后分散于SMPB(4-[p-maleimidophenyl]butyrate，4-[p-苯基马来酰亚胺]-丁酸，琥珀酰亚胺)的DMSO溶液(1mg/100μL)，涡旋30min，室温振摇12h，磁力架分离，再用300μL DMSO洗涤3次，用300μL 0.15M NaCl，0.1M PB，pH7.0(磷酸缓冲液3)洗涤2次。
1OD的HCV-DNA捕获分子(5’SHA AAA AAA AAA GCA CCC TAT CAG 3’，SEQ IDNO.2)，大约33μg，溶于100μL超纯水，加入到上述DMSO洗涤好并且已经氨基活化的磁珠中，室温振摇10h，用300μL磷酸缓冲液3洗涤3次；然后分散在磷酸缓冲液3中，加入72μM(1OD)，100μL的A13钝化DNA(5’SHA AAA AAA AAA 3’，SEQ ID NO.3)，振摇10h，用300μL 0.2M NaCl，10mM PB，pH7.2(磷酸缓冲液4)洗涤2次，最终分散于2mL 0.3M NaCl，10mM PB，pH7.2(磷酸缓冲液5)中。
(3)夹心结构形成：
30μL靶HCV-DNA(5’-GCC TTG TGG TAC TGC CTG ATA GGG TGC 3’，SEQ ID NO.4)加入到50μL HCV-MMPs中，再加入饱和氯化钠磷酸溶液(用磷酸缓冲液1配制，浓度大约为6M，25℃)，使体系氯化钠浓度为0.6M，水浴45℃温孵30min，10min振摇1次，室温静置3h，用0.65M NaCl，10mM PB，pH7.0(磷酸缓冲液6)洗涤3次，100μL/次，最终用50μL磷酸缓冲液6分散。加入50μL HCV-AuNPs，再加入饱和氯化钠磷酸溶液，使体系氯化钠浓度为0.62M，室温静置3h，30min振摇1次，用磷酸缓冲液6洗涤7次，200μL/次，最终用10μL超纯水分散。75℃水浴温孵5min，去杂交，磁力架分离，质谱测定。
(4)质谱测定：
以15个单位的腺嘌呤(A15)自组装的胶体金颗粒作为基质，易于测定，质谱更“干净”。离子源1和离子源2的加速电压分别为25kV和21.55kV，线性正离子扫描模式，棱镜的加速电压为9.5kV，反射元件1和反射元件2的加速电压分别为26.3kV和13.85kV，一般情况下使用30％的最适激光强度测定。把2μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的专用靶(Anchor-Chips，400/385)上。主要检测编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。质谱检测HCV-DNA靶DNA时，检测限可达到10aM(10-17M)水平，见图1。
实施例2基于生物磁性纳米探针对靶DNA(HIV-1，HBV，HCV和TP)混合液的多重测定本实施例中所涉及的DNA链序列见表1：
表1
| 序列名 | 名称 | 序列 |
| SEQ ID NO.5 | HIV-AuNP | 5’-GCT GTC CCT GTA ATA AAC CCG AAA ATTTTT TTT TT-(CH2)3-SH-3’ |
| SEQ ID NO.6 | HBV-AuNP | 5’-CTC TGT GGT ATT GTG AGG ATT CTT GTCATT TTT TTT TT-(CH2)3-SH-3’ |
| SEQ ID NO.7 | HCV-AuNP | 5’-CGC TTT CTG CGT GAA GAC AGT AGT TTTTTT TTT TT-(CH2)3-SH-3’ |
| SEQ ID NO.8 | TP-AuNP | 5’-GTG TAC TAG CCC TCC CTT CTA CCT GATTTT TTT TTT-(CH2)3-SH-3’ |
| SEQ ID NO.9 | HIV-MMP | 5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT TTT GTA TGT CTGTTG CTA TTA TGT CTA TTA TTC TTT CCC CTG C-3’ |
| SEQ ID NO.10 | HBV-MMP | 5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT TCA AAC GGG CAACAT ACC TTG GTA GTC CAG AA-3’ |
| SEQ ID NO.11 | HCV-MMP | 5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT TCG CAA GCA CCCTAT CAG GCA GTA CCA CAA-3’ |
| SEQ ID NO.12 | TP-MMP | 5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT TTT TGT AAT GTATCG TTT GTT GCT TCT GTA TCT ATT TCT TGC-3’ |
| SEQ ID NO.13 | 钝化DNA | 5’-SH-(CH2)6-TTT TTT TTT T-3’ |
| SEQ ID NO.14 | HIV-target | 5’-TTT TCG GGT TTA TTA CAG GGA CAG C-GCAGGG GAA AGA ATA ATA GAC ATA ATA GCA ACAGAC ATA CAA-3’ |
| SEQ ID NO.15 | HBV-target | 5’-TGA CAA GAA TCC TCA CAA TAC CAC AGA G-TTC TGG ACT ACC AAG GTA TGT TGC CCG TTTG-3’ |
| SEQ ID NO.16 | HCV-target | 5’-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC G-TTGTGG TAC TGC CTG ATA GGG TGC TTG CG-3’ |
| SEQ ID NO.17 | TP-target | 5’-TCA GGT AGA AGG GAG GGC TAG TAC AC-GCA AGA AAT AGA TAC AGA AGC AAC AAA CGATAC ATT ACA AA-3’ |
| SEQ ID NO.18 | HGV-DNA | 5’-CAG GGT TGG TAG GTC GTA AAT CC-CCT ATTGGT CAA GAG AGA CAT-3’ |
有机小分子的分子式如下：
MI：([S(CH2)11(OCH2CH2)3OH]2，[MI+Na]+m/z 693
MII：([S(CH2)11(OCH2CH2)4OH]2，[MII+Na]+m/z 781
MIII：([S(CH2)11(OCH2CH2)5OH]2，[MIII+Na]+m/z 869
MIV：([S(CH2)11(OCH2CH2)6OH]2，[MIV+Na]+m/z 957
本实施例中，使用的磁性微球是其表面修饰有氨基的聚苯乙烯磁性微球，捕获探针(探针上连接的寡核苷酸链序列见表1，具体分别为SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)的制备方法和胶体金纳米探针(胶体金纳米探针上连接的寡核苷酸链序列见表1，具体分别为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)的制备方法同实施例1。
分别用磷酸缓冲液1混合两种探针，使捕获探针总浓度为16.0mg/mL(含HIV-MMP，HBV-MMP，HCV-MMP和TP-MMP四种捕获探针，每种探针的浓度均为4.0mg/mL)，使金纳米探针总浓度为500pM(含HIV-AuNP、HBV-AuNP、HCV-AuNP、TP-AuNP四种金纳米探针，每种探针浓度均为125pM)，金纳米探针表面编码分子与识别分子的比例均约为1950∶1)。
取50μL捕捉探针混合液，先加入10μL饱和氯化钠(6M)磷酸溶液(10mM PB，pH7.0)，加入30μL待测样品(四种靶DNA序列见表1，具体分别为SEQ ID NO.14，SEQID NO.15，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)，45℃温孵30分钟，25℃混合3小时，形成的捕捉探针-靶DNA复合物利用磁力架分离，200μL磷酸缓冲液6洗涤3次，再分散到50μL磷酸缓冲液6中。同时加入胶体金纳米探针混合液50μL，25℃杂交过夜，形成夹心式复合物，用磷酸缓冲液6洗涤7次，除去未结合的纳米探针。然后把洗涤后的夹心式复合物再分散于10μL超纯水中。70℃加热去杂交，磁力架分离，去杂交产物TOF MS测定。
TOF MS检测条件为：
离子源1和离子源2的加速电压分别为25kV和21.55kV，棱镜的加速电压为9.5kV，反射元件1和反射元件2的加速电压分别为26.3kV和13.85kV，使用线性正离子扫描模式，激光强度为30％。把0.1μL～10μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的靶(Anchor-Chips，400/385)上。以20个单位的胸腺嘧啶(T20)自组装的胶体金作为基质，质谱测定编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。
2.1选择性实验
待测样品分别为靶DNA浓度为0，10-10M(含有HIV-1，HCV，HBV和TP四种靶DNA混合液的总浓度)的DNA混合液及HGV-DNA(完全不匹配DNA，SEQ ID NO.18)浓度为10-10M的HGV-DNA溶液。其他过程同前叙述，结果见图2。
其他过程同上，待测样品分别为含1种，2种和3种靶DNA组成的混合液，总浓度均为10-10M。结果见图3。
2.2灵敏度测定
其他过程同上，五种样品中靶DNA总浓度分别为0，10-17，10-15，10-13，10-11M，结果见图4。
实施例3生物样品检测
HBV基因组DNA是双链共价闭合环状DNA，曾有报道显示对于实际生物样品的检测其关键步骤是在双链DNA加热变性过程中使用阻抑寡核苷酸链(blocker)，以提高其中一条单链与探针的杂交效率，因为这些阻抑寡核苷酸可以有效防止两条单链DNA在降温时再复性，或者防止单链DNA形成超螺旋结构，这样才能有效提高探针的杂交效率。本实施例借用这种方法(见图5)提高杂交效率，采用实施例2的多重检测方法，测定实际生物样品的检测限可以到达10-15M。
3.1乙肝患者生物标本测定
本实验中可以有效阻止双链HBV DNA变性-复性过程中再复性和超螺旋结构形成，提高杂交效率的阻抑寡核苷酸链的序列分别为：Center blocker：SEQ ID NO.19，5’-blocker：SEQ ID NO.20，3’-blocker：SEQ ID NO.21。
本部分实验中使用的4对探针与实施例2中的多重检测实验中使用的4对生物磁性纳米探针的序列与制备方法完全相同。
实验过程：
①HBV-DNA基因组提取：
DNA提取试剂盒(上海科华生物工程有限公司)，煮沸法。
②HBV-DNA消化，获得小片段，进行后续实验：
选择限制性内切酶EcoN I(New England Biolabs)，37℃温孵过夜。获得879bp HBVDNA片段。
酶切反应20μL体系：5μL HBV-DNA，2μL 10×反应缓冲液，内切酶(EcoN I)1μL(15,000U/mL)，加入超纯水12μL。
③加入阻滞DNA，然后杂交：
相当于10μL HBV-DNA的酶切片段(相当于4.2fM，通过实时荧光PCR结果计算获得)，加入3种阻抑DNA，每种1μL，浓度200μM，再加入27μL缓冲液7(0.15M NaCl，10mM PB，pH7.4)。95℃变性15min，72℃复性过夜。然后迅速加入10μL捕捉探针混合液(20mg/mL)和4.5μL饱和氯化钠(6M)磷酸溶液(10mM，pH7.0)，温度降到25℃混合4h，期间不断轻轻混合，形成的捕捉探针-靶DNA复合物用磁力架分离，200μL磷酸缓冲液6洗涤3次，再分散到50μL磷酸缓冲液6中，同时加入50μL金纳米探针混合液(500pM)，25℃杂交过夜，形成夹心式复合物，用磷酸缓冲液6洗涤7次，除去未结合的金纳米探针。然后把洗涤后的夹心式复合物再分散于10μL超纯水中。70℃加热去杂交，磁力架分离，去杂交产物MALDI TOF MS检测，检测条件同实施例2，把0.1μL～5μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的靶(Anchor-Chips，400/385)上。以20个单位的胸腺嘧啶(T20)自组装的胶体金作为基质，质谱测定编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。
3.2生物样品测定的灵敏度实验
取相当于浓度分别为0，4.2，42，420fM和4.2pM的酶切产物按3.1步骤操作，测定其检测限，结果见图6。
实施例4单碱基突变DNA分析(SNP检测)
本实施例中所涉及的DNA链序列如表2：
表2
| 序列名 | 名称 | 序列 |
| SEQ ID NO.22 | DNAII-MMP | 5’-TAA CAA TAA CCA AAA AAA AAA A-(CH2)3SH-3’ |
| SEQ ID NO.23 | DNA 1-target | 5’GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 3’ |
| SEQ ID NO.24 | DNA2-target | 5’GGA TAA TTG TTAAAT ATT GAT AAG GAT 3’ |
| SEQ ID NO.25 | DNA3-target | 5’GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AGG GAT 3’ |
| SEQ ID NO.26 | DNAI-AuNP | 5’-HS(CH2)6-A AAA AAA AAA ATC CTT ATC AATATT-3’ |
使用DNAII(5’-TAA CAA TAA CCA AAA AAA AAA A-(CH2)3SH-3’，SEQ ID NO.22)修饰表面带有氨基的聚苯乙烯磁性微球，制成捕捉探针。在磷酸缓冲液1中分别加入捕获探针(其浓度为4.5mg/mL)以及能与捕获探针完全匹配的靶DNA1(SEQ ID NO.23)、存在单碱基突变的靶DNA2(SEQ ID NO.24，在其5’端第五个碱基的位置有一个从T到G的单碱基突变，其他位置的碱基序列同DNA1)和靶DNA3(SEQ ID NO.25，在其3’端第五个碱基的位置有一个从A到G的突变，其他位置的碱基序列同DNA1)，各靶DNA浓度均为为10nM，45℃温孵30min，25℃混合2h。形成的捕捉探针-靶DNA复合物或捕获探针用磁力架分离，200μL磷酸缓冲液1洗涤3次，再分散到50μL磷酸缓冲液1中。加入DNAI(5’-HS(CH2)6-AAAAAAAAAA ATC CTT ATC AAT ATT-3’，SEQ ID NO.26)和编码分子MIII([S(CH2)11(OCH2CH2)5OH]2，[MI+Na]+m/z 869，且编码分子与识别分子的摩尔比为350：1)双修饰的胶体金纳米探针溶液50μL，杂交2h后，形成的夹心式复合物或捕获探针用磷酸缓冲液1洗涤7次，除去未结合的胶体金纳米探针。然后把洗涤后的夹心式复合物或捕获探针再分散于10μL磷酸缓冲液1中。75℃温孵5分钟，磁力架分离，点板，MS检测，检测条件同实施例2，最适激光强度为10％。把2μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的靶(Anchor-Chips，400/385)上。以10个单位的胸腺嘧啶(A10)自组装的胶体金作为基质，质谱测定编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。
结果显示加入DNA1的反应体系，DNA1与捕获探针完全匹配，能够形成夹心式复合物，去杂交后，体系呈红色；采用MALDI TOF MS进行测定，编码分子m/z 869([M+Na]+)和837([M+Na-S]+)显示完全匹配的DNA1的存在。见图7a。而加入DNA2和DNA3的体系，由于存在着有1个SNP，与捕获探针不匹配，不能够形成夹心式复合物，体系成则呈无色；采用MALDI TOF MS进行测定，没有质谱信号峰，见图7b和7c。
实施例5质量数相同但碱基排列顺序不同的DNA片段的区分
本实施例中所涉及的DNA链序列如表3：
表3
| 序列名 | 名称 | 序列 |
| SEQ ID NO.22 | DNAII-MMP | 5’-TAA CAA TAA CCA AAA AAA AAA A-(CH2)3SH-3’ |
| SEQ ID NO.23 | DNA1-target | 5’GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 3’ |
| SEQ ID NO.26 | DNAI-AuNP | 5’-HS(CH2)6-A AAA AAA AAA ATC CTT ATC AATATT-3’ |
| SEQ ID NO.27 | DNAII’-MMP | 5’-CAT ACT AAC ATA AAA AAA AAA A-(CH2)3SH-3’ |
| SEQ ID NO.28 | DNA4-target | 5’TAT GTT AGT ATG ATA TAG GAA TAG TTA 3’ |
| SEQ ID NO.29 | DNAI’-AuNP | 5’-HS(CH2)6-A AAA AAA AAA TAA CTA TTC CTATAT-3’ |
本实施例中所涉及的编码小分子如下：
MIII：([S(CH2)11(OCH2CH2)5OH]2，[MI+Na]+m/z 869
MIV：([S(CH2)11(OCH2CH2)6OH]2，[MII+Na]+m/z 957
MS测定是不能区分质量数相同但碱基排列顺序不同的DNA片段的，但本发明所述方法可以解决这个问题，我们选择2条靶DNA链——DNA1和DNA4(序列见表3，序列名为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.28).它们具有相同的质量数，但碱基排列顺序不同。2对生物磁性纳米探针，编码分子对应的加钠分子离子峰分别为m/z 837及869和m/z925及957，具体过程如下：
使用DNAII和DNAII’分别修饰两种捕捉探针，在磷酸缓冲液1中分别与同时含有DNA1和DNA4的靶DNA混合液，没有靶DNA存在的溶液(水，作为空白对照实验)，仅DNA1存在的靶DNA溶液和仅DNA4存在的靶DNA溶液杂交，45℃温孵30min，25℃混合3h。形成的捕捉探针-靶DNA复合物或捕获探针用磁力架分离，200μL磷酸缓冲液1洗涤3次，再分散到50μL磷酸缓冲液1中。加入双标记有编码分子MIII和识别分子DNAI(SEQ ID NO.26)及双标记有MIV和识别分子DNAI’的金纳米探针的混合液50μL(其中编码分子与DNA链的摩尔量之比分别为1000∶1)，杂交2h后，形成的夹心式复合物用磷酸缓冲液1在38℃洗涤7次，除去未结合的胶体金纳米探针，然后把洗涤完的复合物再分散于10μL磷酸缓冲液1中。75℃温孵5min，磁力架分离，点板，MS检测。检测条件同实施例2，激光强度为20％。把2μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的靶(Anchor-Chips，400/385)上。以20个单位的胸腺嘧啶(A20)自组装的胶体金作为基质，质谱测定编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。实验结果见图8。
为保证实验准确无误进行，我们选择10nM水平的高靶DNA浓度，可以通过颜色变化对实验结果做初步判断，再进行有关靶DNA1和DNA4的MS测定。结果显示当2个质量数相同但碱基排列顺序不同的靶DNA同时存在时，反应体系呈红色，MS测定时有2种编码分子同时被检测到，见图8a。这个结果显示靶DNA1和DNA4同时存在于被测溶液中，说明质量数相同但碱基排列顺序不同的DNA是可以应用本方法进行区分的。当这2个靶DNA同时不存在，即加入超纯水作为空白对照时，体系溶液呈无色，MS也检测不到任一个编码分子，见图8b。当加入的靶DNA溶液中仅有DNA1或者DNA4时，，体系都呈红色，MS测定仅能检测到相对应的编码分子见图8c和图8d。实验结果同时也表明，即使在10nM这个比检测限高很多的浓度下进行此生物磁性纳米探针的杂交实验也未见非特异性杂交方面的干扰。
实施例613-nm胶体金纳米探针表面识别分子和编码分子比例优化实验
(1)纳米探针(AuNPs)制备：
①1OD HCV-DNA识别分子(5’-GCA GTA CCA CAA GGC AAA AAA AAAA-(CH2)3-SH-3’，SEQ ID NO.1)，33μg，离心5min(5000rpm)，分别加超纯水200μL溶解，涡旋30s，混匀；
②加入2mL胶体金(自己合成，13nm，电镜测定)，轻轻振摇24h(20r/min)，室温(25℃)；
③再加入0.3M NaCl，10mM PBS，pH＝7.0(磷酸缓冲液1)，至体系中NaCl浓度到0.1M，轻轻振摇老化36h；
④按照表4中所示该比例的用量加入五甘醇二硫分子，继续轻轻振摇12h，即得该比例组成的组装有编码分子与识别分子的纳米探针，4℃保存。
⑤临用前，离心25min，除去上清液，以0.1M NaCl，10mM PBS，pH7.0(磷酸缓冲液1)分散，离心并洗涤3次，最终分散于磷酸缓冲液1中，浓度大约5nM。
(2)捕捉探针(MMPs)制备：
取氨基-磁性微球(上海英潍捷基公司，300μL，30mg/mL)，用300μL二甲亚砜(DMSO)洗涤3次，然后分散于SMPB(4-[p-maleimidophenyl]butyrate，4-[p-苯基马来酰亚胺]-丁酸，琥珀酰亚胺)的DMSO溶液(1mg/100μL)，涡旋30min，室温振摇12h，磁力架分离，用300μL DMSO洗涤3次，用300μL 0.15M NaCl，0.1MPBS，pH7.0(磷酸缓冲液3)洗涤2次。
1OD的HCV-DNA捕获分子(5’-(CH2)6-SHA AAA AAA AAA GCA CCC TAT CAG 3’，SEQ ID NO.2)，约33μg，溶于100μL超纯水，加入到上述DMSO洗涤好并且已经氨基活化的磁珠中，室温振摇10h，用300μL磷酸缓冲液3洗涤3次；然后分散在磷酸缓冲液3中，加入72μM，100μL的钝化DNA(5’-(CH2)6-SHA AAA AAA AAA-3’，SEQ IDNO.3)，振摇10h，再用300μL 0.2M NaCl，10mM PBS，pH7.2(磷酸缓冲液4)洗涤2次，最终分别分散于2mL0.3M NaCl，10mM PBS，pH7.2(磷酸缓冲液5)中。
(3)夹心结构形成：
30μL靶HCV-DNA(5’-GCC TTG TGG TAC TGC CTG ATA GGG TGC-3’，SEQ IDNO.4)分别加入到50μL HCV-MMPs中，再加入饱和氯化钠磷酸溶液(用磷酸缓冲液1配制，浓度大约为6M，25℃)使体系氯化钠浓度为0.6M，水浴45℃温孵30min，10min振摇1次，室温静置3h，用磷酸缓冲液1洗涤3次，100μL/次，最终用50μL磷酸缓冲液1分散。再加入50μL纳米探针表面两物质组装比例不同的HCV-AuNPs，加入饱和氯化钠磷酸溶液，使体系氯化钠浓度为0.62M，室温静置3h，30min振摇1次，分别用0.65MNaCl，10mMPB，pH7.0(磷酸缓冲液6)洗涤7次，200μL/次，最终用10μL超纯水分散。75℃水浴5min，解螺旋，磁力架分离，质谱测定。
(4)质谱测定：
以20个单位的腺嘌呤(A20)自组装的胶体金作为基质，易于测定，质谱更“干净”。离子源1和离子源2的加速电压分别为25kV和21.55kV，线性正离子扫描模式，棱镜的加速电压为9.5kV，反射元件1和反射元件2的加速电压分别为26.3kV和13.85kV，一般情况下使用30％的最适激光强度。把2μL的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的靶(Anchor-Chips，400/385)上。主要检测分子离子峰[M+Na]+。
在相同测定条件下测定方法的检测灵敏度与编码分子与识别分子的比例关系表现为：当编码分子与识别分子比例为1300～2000∶1时，检测限达到10aM(10-17M)水平。在该范围以外，当两者比例减小时，灵敏度下降；当两者比例增大时，灵敏度也下降，直至加入的编码分子的量导致纳米探针组装失败。也就是说，在质量条码分子与DNA分子两者比例逐渐变大的过程中，组装的纳米探针用于该方法的灵敏度检查，整个趋势近似于“钟罩”型，结果见表5。
表4
| 编号 | 编码分子与识别分子的浓度比例 | 编码分子用量(μl) | 识别分子用量 |
| 1a | 150∶1 | 45 | 3.0nmol |
| 2a | 200∶1 | 60 | 3.0nmol |
| 3a | 250∶1 | 75 | 3.0nmol |
| 4a | 350∶1 | 105 | 3.0nmol |
| 5b | 500∶1 | 30 | 3.0nmol |
| 6b | 800∶1 | 50 | 3.0nmol |
| 7b | 1000∶1 | 60 | 3.0nmol |
| 8b | 1300∶1 | 80 | 3.0nmol |
| 9b | 1700∶1 | 100 | 3.0nmol |
| 10c | 2000∶1 | 60 | 3.0nmol |
| 11c | 2300∶1 | 70 | 3.0nmol |
| 12c | 2700∶1 | 80 | 3.0nmol |
| 13c | 3000∶1 | 90 | 3.0nmol |
| 14c | 3300∶1 | 100 | 3.0nmol |
| 15c | 3700∶1 | 110 | 3.0nmol |
表1中，a：表示加入五甘醇二硫分子的浓度为10mM；b：表示加入五甘醇二硫分子的浓度为50mM；c：表示加入五甘醇二硫分子的浓度为100mM
表5
+：MALDI TOF MS可以检测到编码小分子，质谱图中出现m/z 869峰。
-：质谱图中无峰。
序列表
<110>黄乐群
<120>一种无需借助PCR的基因检测方法
<160>29
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcagtaccac aaggcaaaaa aaaaa 25
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
aaaaaaaaaa gcaccctatc ag 22
<210>3
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
aaaaaaaaaa aaa 13
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
gccttgtggt actgcctgat agggtgc 27
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gctgtccctg taataaaccc gaaaattttt ttttt 35
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ctctgtggta ttgtgaggat tcttgtcatt tttttttt 38
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
cgctttctgc gtgaagacag tagttttttt ttttt 35
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
gtgtactagc cctcccttct acctgatttt tttttt 36
<210>9
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
tttttttttt ttgtatgtct gttgctatta tgtctattat tctttcccc tgc 53
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
tttttttttt caaacgggca acataccttg gtagtccaga a 41
<210>11
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
tttttttttt cgcaagcacc ctatcaggca gtaccacaa 39
<210>12
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
tttttttttt tttgtaatgt atcgtttgtt gcttctgtat ctatttcttg c 51
<210>13
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
tttttttttt 10
<210>14
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
ttttcgggtt tattacaggg acagcgcagg ggaaagaata atagacataa tagcaacaga 60
catacaa 67
<210>15
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
tgacaagaat cctcacaata ccacagagtt ctggactacc aaggtatgtt gcccgtttg 59
<210>16
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
aactactgtc ttcacgcaga aagcgttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcg 54
<210>17
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
tcaggtagaa gggagggcta gtacacgcaa gaaatagata cagaagcaac aaacgataca 60
ttacaaa 67
<210>18
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
cagggttggt aggtcgtaaa tcccctattg gtcaagagag acat 44
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
gacaagaggt tggtgagtga ttggaggttg gggac 35
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
gaagattgac gatatgggtg aggcagtagt cggaaca 37
<210>21
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
cctggaagta gaggacaaac gggcaacata cc 32
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
taacaataac caaaaaaaaa aa 22
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
ggattattgt taaatattga taaggat 27
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
ggataattgt taaatattga taaggat 27
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
ggattattgt taaatattga tagggat 27
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
aaaaaaaaaa atccttatca atatt 25
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
catactaaca taaaaaaaaa aa 22
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
tatgttagta tgatatagga atagtta 27
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
aaaaaaaaaa taactattcc tatat 25
Claims (13)
1.一种基因检测方法，包含如下步骤：修饰有识别分子和编码分子的纳米粒子为纳米探针，修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针，利用所述纳米探针和所述捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，分离出该夹心式复合物，释放出纳米探针，通过质谱直接检测纳米探针表面编码分子的分子离子峰，其特征在于：纳米探针中编码分子与识别分子的分子数之比为1300~2000：1，形成夹心式复合物的杂交反应体系的盐离子浓度为0.2~1.0 M。
2.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的形成夹心式复合物的杂交反应体系的盐离子浓度为0.5~0.7 M。
3.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的质谱为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱或电喷雾质谱。
4.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的质谱为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱。
5.根据权利要求4所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱所用的基质为α-氰基- 4 -羟基肉桂酸，3,5 - 二乙氧基- 4 -羟基肉桂酸，芥子酸，2，5-二羟基苯甲酸或DNA自主装的金纳米颗粒中的任一种。
6.根据权利要求4所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱所用的基质为以10~20个胸腺嘧啶或者腺嘌呤组成的DNA自组装的胶体金纳米颗粒。
7.根据权利要求4所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用正离子反射模式，在10%~70%的激光强度下进行检测。
8.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的纳米粒子为胶体金纳米粒子，其粒径为1~100 nm。
9.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的编码分子是分子中含有巯基或者二硫键的有机化合物。
10.根据权利要求9所述的基因检测方法，其特征在于所述的编码分子是硫醇、硫醚或二硫化物。
11.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的磁性微球是无机微球、生物高分子微球或聚合物高分子微球。
12.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的磁性微球为聚苯乙烯磁性微球。
13.根据权利要求1或11所述的基因检测方法，其特征在于所述的磁性微球表面修饰有氨基或链霉亲和素。
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