DE69735445T2 - Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung - Google Patents

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der chemischen Analyse. Insbesondere betrifft sie eine neue Klasse von nicht flüchtigen, freisetzbaren Markierungsreagenzien für eine Verwendung beim Nachweis und der Analyse von Zielmolekülen, z.B. massenspektrometrisch.
  • 2. Beschreibung des betreffenden Fachgebiets
  • Chemische Markierungen, auch als Tags oder Signalgruppen bekannt, werden in der chemischen Analyse weithin verwendet. Unter den Arten der verwendeten Moleküle sind radioaktive Atome, fluoreszierende Reagenzien, lumineszierende Reagenzien, metallhaltige Verbindungen, Elektronen-absorbierende Substanzen und Licht-absorbierende Verbindungen. Chemische Signalgruppen können mit reaktionsfähigen Gruppen kombiniert werden, sodass sie kovalent mit dem Ziel, der nachzuweisenden Substanz, verbunden werden können. In vielen Fällen können jedoch chemische Anteile, welche auf dem Ziel vorliegen, den Nachweis der Signalgruppe stören oder eine Messung der Signalgruppe in einer optimalen Nachweisumgebung unmöglich machen.
  • Ein indirekter Nachweis des Ziels ist deshalb oftmals bevorzugt. Beispielsweise kann die Signalgruppe das Abbauprodukt des Ziels oder ein Derivat des Ziels sein (Bueht et al., 1974; Senft, 1985; U.S.-Patent 4,50,750; U.S.-Patent 4,709,0146; U.S.-Patent 4,629,689). Es sind flüchtige, freisetzbare Makierungsverbindungen beschrieben worden, welche unter Verwendung von verschiedenen Formen einer Elektronenanlagerungsmassenspektroskopie analysiert werden können, oft mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) (Wang et al., 1996; U.S.-Patent 5,360,819; U.S.-Patent 5,516,931). Trotz der beschriebenen breiten Auswahl von flüchtigen Massemarkierungen ist für eine Analyse, welche signifikante synthetische und Größenparameter auf der Markierung einordnet, ein Übergang von der flüssigen in die Gasphase erforderlich. Es sind auch Isotopen- Massemarkierungen beschrieben worden, wie etwa die Verwendung von Zinn- oder Schwefelisotopen, mit verschiedenen Ansätzen der Massenspektroskopie-Untersuchung (Arlinghaus et al., 1997; U.S.-Patent 5,174,962). Jacobson et al. (Gen. Analy. Techniques Appl. 8(8): 223–229 (1996) offenbaren die Verwendung von Isotopenmarkierungen (Schwefel, Zinn und Eisen) für einen direkten Nachweis von Oligonukleotiden durch Massenspektrometrie. Sloop et al. (Bioconjugate Chem. 4: 406–509 (1993)) offenbaren die Synthese von 3-(Triethylstannyl)propansäure (TESPA) und von dem N-Succinimidylester von TESPA zur Verwendung als eine Massemarkierung für Oligonukleotide. Die Isotopenmarkierung beschränkt oft das Ausmaß des Multiplexverfahrens und sorgt für kompliziertere Analysebedingungen.
  • Das U.S.-Patent Nr. 4,775,619 (Urdea et al.) offenbart Verbindungen, welche den indirekten Nachweis von Probenukleinsäuren ermöglichen, durch eine gegenseitige Beeinflussung von Probenukleinsäuren und einem Polynukleotidreagenz, welches eine spaltbare Markierung enthält, Spaltung der Markierung und Nachweis der Probenukleinsäure durch einen Nachweis der Markierung. WO 94/21822 (Köster) offenbar Verbindungen, welche in den Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure verwendet werden, durch Spaltung von Nukleinsäuren mit Exonukleasen zur sequenziellen Freisetzung einzelner Nukleotide und Identifizierung jedes Nukleotids durch Massenspektrometrie. Hayes F. J. (Dissertation Abstracts Internat. 53(9B): 4624 (1992)) offenbart Verfahren für einen indirekten Nachweis von Wechselwirkungen von Protein:Antikörper durch die Freisetzung eines Metallions gefolgt von einem Nachweis des Metallions durch Plasma-Massenspektrometrie. WO 96/29431 (Köster) offenbart Massenspektrometrieverfahren zum Nachweis von Zielnukleinsäuresequenzen durch Massenspektrometrie.
  • Die Massenspektralanalyse von Signalgruppen bringt keine der Bedenken mit sich, welche mit radioaktiven Signalgruppen verbunden sind, wie etwa deren kurze Halbwertszeiten und deren Sicherheits- und Entsorgungsprobleme. Ein anderer Hauptvorteil vom Nachweis von Signalgruppen über Massenspektrometrie ist der, dass eine größere Fähigkeit für Multiplexverfahren ermöglicht wird, um mehr als eine Signalgruppe in einem komplexen Gemisch nachzuweisen, und deshalb jeweils mehr als ein Ziel. Brummel et al. (1994; 1996) haben die Verwen dung von Massenspektrometrie bei der direkten Analyse von kombinatorischen Bibliotheken von kleinen Peptiden demonstriert. Die Verwendung dieser Technologie ist jedoch beschränkt auf die Analyse der gesamten reagierenden Verbindung durch Massenspektrometrie.
  • Der Nachweis von mehrfachen Floureszenzmarkierungen ist verwendet worden, um Nukleinsäuresequenzen zu analysieren. Nukleinsäurehybridisierungssonden werden so modifiziert, dass sie fluoreszierende Chromophore enthalten, welche bei Anregung durch Licht eine einzigartige Farbspektrumsignatur emittieren. Bei Sequenziersystemen, welche auf Fluoreszenz basieren, kann ein Multiplexverfahren mit vier unterschiedlichen Chromophoren innerhalb einer Probe durchgeführt werden und mithilfe einer Software-Dekonvolution einzeln nachgewiesen werden. Die praktische obere Grenze für Fluoreszenz-Multiplexverfahren liegt wahrscheinlich bei etwa 10 unterschiedlichen Markierungen, aufgrund des breiten überlappenden Spektrums, welches durch vorhandene fluoreszierende Chromophore erzeugt wird. Die Entwicklung von nicht flüchtigen freisetzbaren Massemarkierungen, welche über einen brauchbaren Bereich eines Massenspektrometers nachweisbar sind, würde klar einen wesentlichen Vorteil darstellen, dadurch dass ein Multiplexverfahren mit mehreren Zehn, Hunderten und vielleicht sogar Tausenden von unterschiedlichen Massemarkierungen ermöglicht wird, welche verwendet werden können, um jedes gewünschte Ziel eindeutig zu identifizieren.
  • Obwohl gegenwärtig Werkzeuge verfügbar sind, durch welche Zielmoleküle nachgewiesen werden können, bleibt ein Bedarf an einer weiteren Entwicklung dieser Systeme, um eine große Zahl von Zielen gleichzeitig zu analysieren. Dies ermöglicht die systematische Analyse von Zielmolekülen mit vorher bestimmten Eigenschaften und Funktionen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren bereitzustellen, welche die Verwendung von Release-Tag-Verbindungen zum Nachweis und für eine Analyse von Zielmolekülen betreffen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer nicht flüchtigen freisetzbaren Tag-Verbindung, welche freisetzbare Massemarkierungen enthält, bei der chemischen Analyse und die Verwendung dieser Reagenzien in Verbindung mit Sonden, welche mit einem Molekül reagieren oder nicht kovalent an ein Molekül binden, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll. Die freisetzbaren Tag-Reagenzien können folglich Zielmoleküle indirekt nachweisen, einschließlich biomolekularer Ziele. Die Massemarkierung kann nach einer Reaktion mit oder einer Bindung der Sonde an das Ziel von der Sonde freigesetzt werden und durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Der Massewert der Markierung identifiziert und charakterisiert die Sonde und folglich das Zielmolekül. In dem Fall, dass eine massemarkierte Oligonukleotidsonde verwendet wird, um ein Polynukleotid anzusteuern, bedeutet eher der Nachweis der Massemarkierung als der Nukleinsäuresonden oder der Nukleinsäureziele selbst, dass biochemische Analyseverfahren in außerordentlich vereinfacht werden können. Der Bedarf an langsamen, mühsamen, kostenintensiven und/oder komplizierten Festphasen- und/oder Lösungsphasenverfahren zur Reinigung und Entsalzung können minimiert oder sogar eliminiert werden.
  • Erfindungsgemäß wird deshalb eine Release-Tag-Verbindung bereitgestellt, umfassend Rx, Re und M, worin Rx eine reaktionsfähige Gruppe ist, Re eine Release-Gruppe ist und M eine Massemarkierung ist, welche durch Massenspektrometrie nachweisbar ist. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "ein" bzw. „eine" Ausführungsformen, worin auf ein einzelnes Element Bezug genommen wird, ebenso wie Ausführungsformen, welche ein oder mehrere solcher Elemente enthalten. Beispielsweise kann sich der Ausdruck "eine reaktionsfähige Gruppe" auf eine einzelne reaktionsfähige Gruppe beziehen, kann aber auch Ausführungsformen umfassen, welche mehr als eine reaktionsfähige Gruppe enthalten.
  • Die Massemarkierung ist normalerweise ein synthetisches Polymer oder ein Biopolymer oder irgendeine Kombination davon. In bestimmten Ausführungsformen kann die Massemarkierung ein Biopolymer sein, welches Monomereinheiten umfasst, wobei jede Monomereinheit jeweils gesondert und unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend im Wesentlichen aus einer Aminosäure, einer Nukleinsäure und einem Saccharid, wobei Aminosäuren und Nukleinsäuren bevorzugte Monomereinheiten darstellen. Weil jede Monomereinheit gesondert und unabhängig ausgewählt sein kann, können Biopolymer- Massemarkierungen Polynukleinsäuren, Peptide, Peptidnukleinsäuren, Oligonukleotide usw. sein.
  • Wie hierin definiert, beziehen sich "Nukleinsäuren" auf Standardnukleinsäuren oder natürlich vorkommende Nukleinsäuren, ebenso wie auf modifizierte/nicht natürliche Nukleinsäuren, welche oft als Nukleinsäurenachahmungen („nucleic acid mimics") bekannt sind. Folglich bezieht sich der Begriff "Nukleotide" sowohl auf natürlich vorkommende als auch modifizierte/nicht natürlich vorkommende Nukleotide, einschließlich Nukleosidtri-, -di- und -monophosphate ebenso wie Monophosphatmonomere, welche innerhalb einer Polynukleinsäure oder eines Oligonukleotids vorhanden sind. Ein Nukleotid kann auch ein Ribo-, 2'-Desoxy-, 2',3'-Desoxynukleotid sein, ebenso wie eine riesige Reihe von anderen Nukleotidnachahmungen, welche im Fachgebiet gut bekannt sind. Nachahmungen umfassen Ketten-beendigende Nukleotide, wie etwa 3'-O-Methyl, eine halogenierte Base oder Zuckersubstitutionen, alternative Zuckerstrukturen einschließlich Nicht-Zucker, Alkylringstrukturen, alternative Basen einschließlich Inosin, Deaza-modifizierte, Chi und Psi, Linker-modifizierte, Massemarkierung-modifzierte, Phosphodiestermodifikationen oder -austausche einschließlich Phosphorthioat, Methylphosphonat, Boranphosphat, Amid, Ester, Ether und ein basischer Austausch oder vollständige Internukleoidaustausche einschließlich Spaltungsverbindungen, wie etwa photospaltbare Nitrophenylanteile. Diese Modifikationen sind Fachleuten gut bekannt und basieren auf den von Saenger (1983) beschriebenen elementaren Grundsätzen.
  • Auf ähnliche Weise bezieht sich der Begriff "Aminosäure" auf natürlich vorkommende Aminosäuren ebenso wie auf eine beliebige modifizierte Aminosäure, welche durch Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert oder erhalten werden kann.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Massemarkierung ein synthetisches Polymer sein, wie etwa Polyethylenglykol, Polyvinylphenol, Polypropylenglykol, Polymethylmethacrylat und Derivate davon. Synthetische Polymere können normalerweise Monomereinheiten enthalten, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend im Wesentlichen aus Ethylenglykol, Vinylphenol, Propylenglykol, Methylmethacrylat und Derivaten davon. Insbesondere kann die Massemarkierung ein Polymer sein, welches Polyethylenglykoleinheiten enthält.
  • Die Massemarkierung ist normalerweise durch ein Massenspektrometrieverfahren nachweisbar. Obwohl vorgesehen ist, dass ein beliebiges bekanntes Massenspektrometrieverfahren zum Nachweis der Massemarkierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind Verfahren, wie etwa Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation-Massenspektrometrie, direkte Laserdesoprtion-Ionisation-Massenspektrometrie (ohne Matrix), Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie, Sekundär-Neutralteilchen-Massenspektrometrie und Sekundärionen-Massenspektrometrie bevorzugt.
  • In bestimmten Ausführungsformen besitzt die Massemarkierung ein Molekulargewicht von mehr als etwa 50 Daltons und ist eine nicht flüchtige (einschließlich einer „involatilen") Massemarkierung.
  • Wie hierin definiert, bezieht sich der Begriff "reaktionsfähige Gruppe" auf eine Gruppe, welche mit dem nachzuweisenden Molekül reagieren kann. Beispielsweise kann die reaktionsfähige Gruppe ein Biomolekül sein, welches zu einer spezifischen Molekülerkennung befähigt ist. Biomoleküle, welche zu einer spezifischen Molekülerkennung befähigt sind, können normalerweise beliebige Moleküle sein, welche zu speziellen Bindungswechselwirkungen mit bestimmten Molekülen oder Klassen von Molekülen, wie etwa Peptiden oder Proteinen befähigt sind.
  • Folglich umfassen die hierin für die Verwendung mit den offenbarten Verfahren offenbarten reaktionsfähigen Gruppen Polypeptide. Wie hierin verwendet, beziehen sich Polypeptide auf Moleküle mit mehr als einer Aminosäure (wobei native und nicht native Aminosäuremonomere umfasst sind). Folglich umfassen Polypeptide Peptide, welche 2 oder mehrere Aminosäuren umfassen, native Proteine, Enzyme, Genprodukte, Antikörper, Proteinkonjugate, mutierte oder polymorphe Polypeptide, posttranslational modifizierte Proteine, genetische veränderte Genprodukte einschließlich Produkte einer chemischen Synthese, einer in vitro-Translation, von auf Zellen basierenden Expressionssystemen einschließlich „fast evolution systems", welche Vektor-Shuffling, zufällige oder gerichtete Mutagenese und Peptidsequenzrandomisierung betreffen. In bevorzugten Ausführungsformen können Polypeptide Oligopeptide, Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, regulatorische Proteine, Nukleinsäure-bindende Proteine, Hormone oder ein Proteinprodukt eines Displayverfahrens sein, wie etwa einem Phagen-Displayverfahren oder einem Bakterien-Displayverfahren. Die am meisten bevorzugten reaktionsfähigen Polypeptidgruppen sind Antikörper und Enzyme. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Produkt eines Displayverfahrens" auf ein beliebiges Polypeptid, welches sich aus der Durchführung eines Displayverfahrens, welches im Fachgebiet gut bekannt ist, ergibt. Es ist vorgesehen, das jedes im Stand der Technik bekannte Displayverfahren verwendet werden kann, um die Polypeptide für eine Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
  • In anderen Ausführungsformen kann die reaktionsfähige Gruppe einen Anteil zur Nukleaseblockierung enthalten. Diese Anteile dienen dazu, den Verdau des Oligonukleotids durch die Nuklease, wie etwa eine Exonuklease, zu blockieren. Typische Anteile zur Nukleaseblockierung umfassen folglich Phosphorathioat, Alkylsilyldiester, Boranphosphat, Methylphosphonat und eine Peptidnukleinsäure.
  • Die Massemarkierung ist an die reaktionsfähige Gruppe gebunden oder mit der reaktionsfähigen Gruppe durch eine freisetzbare Verbindung verbunden. Normalerweise wird somit die Massemarkierung von der gesamten oder einem Teil der reaktionsfähigen Gruppe vor der Massenspektralanalyse freigesetzt, wie es bei den verschiedenen hierin beschriebenen Verfahren vorgesehen ist. Diese freisetzbare Verbindung tritt normalerweise durch die Verwendung einer Release-Gruppe auf, welche die Bindung zwischen der Massemarkierung und der reaktionsfähigen Gruppe sein kann, oder welche einen Teil der reaktionsfähigen Gruppe oder die gesamte reaktionsfähige Gruppe umfassen kann, oder welche innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe enthalten sein kann.
  • Die Release-Gruppe kann eine beliebige labile Gruppe sein, welche solch eine freisetzbare Verbindung bereitstellt. Die Release-Gruppe kann folglich eine chemisch spaltbare Bindung oder eine labile chemische Bindung sein. Solche Bindungen können normalerweise durch Verfahren gespalten werden, welche Fachleuten gut bekannt sind, wie etwa durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Wärme, Licht, oder durch Metallionen katalysiert, durch Verdrängung oder durch Eliminierungschemie. In einer bestimmten Ausführungsform umfasst die chemisch spaltbare Bindung eine modifizierte Base, einen modifizierten Zucker, eine Disulfidbindung, eine in das Phosphatgerüst eingefügte chemisch spaltbare Gruppe oder einen chemisch spaltbaren Linker. Einige Beispiele dieser Bindungen sind in PCT WO 96/37630 beschrieben. Wie hierin verwendet, sind "chemisch spaltbare Linker" Anteile, welche beispielsweise durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Wärme, Licht, Metallionen-katalysiert, Verdrängung oder Eliminierungschemie spaltbar sind.
  • Chemisch spaltbare Gruppen, welche in das Phosphatgerüst eingefügt werden können, sind Fachleuten gut bekannt und können Dialkoxysilan, 3'-(S)-Phosphorthioat, 5'-(S)-Phosphorthioat, 3'-(N)-Phosphoramidat oder 5'-(N)-Phosphoramidat umfassen. In weiteren Ausführungsformen kann die chemisch spaltbare Bindung ein modifizierter Zucker sein, wie etwa Ribose. Alternativ kann die Bindung eine Disulfidbindung sein.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist Re in Rx enthalten. In diesem Fall kann die Freisetzung von Re durch ein selektives Ereignis aktiviert werden. In bestimmten Ausführungsformen wird die selektive Freisetzung durch ein Enzym vermittelt, wie etwa durch eine Exonuklease, welche für doppelsträngige oder einzelsträngige DNA spezifisch ist. Wenn gesagt wird, dass Re in Rx enthalten ist, ist es im Allgemeinen selbstverständlich, dass die reaktionsfähige Gruppe innerhalb ihrer Struktur die bestimmte Release-Gruppe enthält, welche bewirkt, dass in dieser bestimmten Ausführungsform die Massemarkierung von der Tag-Verbindung getrennt wird.
  • Release-Gruppen, welche von der Erfindung umfasst werden, enthalten folglich auch Gruppen oder eine Bindung, welche durch ein Enzym spaltbar ist. Enzymatisch spaltbare Release-Gruppen umfassen Phosphodiester- oder Amidbindungen, ebenso wie Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen umfassen Release-Gruppen, welche durch Nukleasen spaltbar sind. Diese Nukleasen können normalerweise eine Exonukleoase oder eine Restriktionsendonuklease sein. Typische Exonukleasen umfassen Exonukleasen, welche sowohl für doppelsträngige als auch einzelsträngige Polynukleinsäuren spezifisch sind. Außerdem umfassen Restriktionsendonukleasen, welche von bestimmten Ausführungsformen umfasst werden, Restriktionsendonukleasen des Typs IIS und des Typs II.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Release-Gruppe durch eine Protease spaltbar sein. Typische Proteasen umfassen Endoproteinasen.
  • In noch weiteren Ausführungsformen werden massemarkierte Sonden bereitgestellt, worin mindestens ein Bestandteil ein Nukleosidtriphosphat ist. Es ist weiter vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen markierten Sonden mindestens zwei eingefügte unikale Massemarkierungen umfassen.
  • Normalerweise kann die Massemarkierung von mindestens einem Mitglied der Gruppe eine spezifische Sequenz innerhalb der variablen Region identifizieren. In einigen Ausführungsformen kann die Massemarkierung von jedem Mitglied der Gruppe auf einzigartige Weise jede unterschiedliche Sequenz innerhalb der variablen Region identifizieren. In anderen Ausführungsformen kann eine Kombination der Massemarkierungen von zwei oder mehreren Release-Tag-Verbindungen jede unterschiedliche Sequenz innerhalb der variablen Region identifizieren.
  • Verfahren zur Herstellung einer massemarkierten Sonde werden bereitgestellt, umfassend eine Kombination von Nukleosid- oder Aminosäuremonomeren mit mindestens einem massemarkierten Monomer unter Bedingungen, welche eine Polymerisation ermöglichen.
  • Es werden weitere Ausführungsformen bereitgestellt, worin die Polymerisation durch ein Enzym vermittelt wird. Es werden noch weitere Ausführungsformen bereitgestellt, worin die Polymerisation durch eine chemische Synthese vermittelt wird. Die bevorzugten synthetischen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung sind im Wesentlichen diejenigen für eine Standardpeptid- und DNA-Synthese.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen ist eine Synthese in der Festphase bevorzugt, um die Produktion einer breiten Vielfalt von Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren zu ermöglichen.
  • Es werden zusätzliche Ausführungsformen bereitgestellt für ein Verfahren zur Herstellung einer massemarkierten Sonde, umfassend die Schritte (a) Kombinieren von Nukleosidmonomeren mit mindestens einem aktivierten Nukleosidmonomer unter Bedingungen, welche eine Polymerisation ermöglichen, und (b) Hinzufügen einer freisetzbaren, nicht flüchtigen Masseeinheit zu dem aktivierten Nukleosidmonomer.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Ausführungsformen bereit, welche ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls bereitstellen. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren Erhalten von mehreren Sonden, wobei jede Sonde, wie beschrieben, eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine Massemarkierung enthält. Es ist bevorzugt, dass jede Sonde innerhalb der mehreren Sonden eine unikale Massemarkierung enthält. Mit "unikaler Massemarkierung" ist gemeint, dass jede Sonde innerhalb der mehreren Sonden eine Massemarkierung aufweist, welche sich von allen anderen der mehreren Sonden unterscheidet. „Mehrere" wird im Allgemeinen so verstanden, dass zwei oder mehr Sonden enthalten sind. Als Nächstes wird das Zielmolekül mit den mehreren Sonden in Kontakt gebracht, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um die Bildung von Komplexen Sonde:Zielmolekül zu ermöglichen. Die Massemarkierung wird von der Sonde freigesetzt und die Masse der Massemarkierung wird bestimmt. Normalerweise weist die Masse auf ein spezifisches Zielmolekül hin. Auf diese Art kann das Zielmolekül entsprechend der unikalen Kombination von Massemarkierungen identifiziert werden.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls bereit, worin das Zielmolekül amplifiziert wird, um ein amplifiziertes Zielmolekül zu erzeugen. Das amplifizierte Zielmolekül wird dann mit einer Sonde hybridisiert, wie die hierin oben beschriebenen Sonden, um Komplexe aus Sonde:amplifiziertem Zielmolekül zu erzeugen. Die Massemarkierung an den Komplexen Sonde:amplifiziertes Zielmolekül werden dann freigesetzt und die Masse der Massemarkierung durch Massenspektrometrie bestimmt.
  • Die Zielnukleinsäure kann durch ein beliebiges Verfahren, welches einem Fachmann bekannt ist, amplifiziert werden, beispielsweise durch eine Polymerasekettenreaktion ("PCR"), wobei die PCR ein bevorzugtes Amplifikationsverfahren ist. Die Amplifikation kann eine funktionelle Gruppe enthalten, welche auf einem festen Träger immobilisiert werden kann, wie etwa Biotin oder Digoxigenin. Diese funktionelle Gruppe kann mit einem Oligonukleotidprimer verbunden werden, welcher während des Amplifikationsschritts in das amplifizierte Molekül eingefügt wird, oder sie kann mit einem Nukleotid verbunden werden, welches während des Amplifikationsschritts in das amplifizierte Zielmolekül eingefügt wird.
  • Es werden auch Verfahren bereitgestellt, worin das amplifizierte Zielmolekül auf einem festen Träger immobilisiert wird und jede Sonde, welche nicht Teil eines Komplexes aus Sonde:amplifiziertem Zielmolekül ist, durch Waschen entfernt wird. Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, dass die Art der Erkennung des Zielmoleküls durch die reaktionsfähige Gruppe von der Identität des Zielmoleküls und der reaktionsfähigen Gruppe abhängt. Zum Zweck der Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung kann diese Erkennung die Bildung eines doppelsträngigen Duplexmoleküls durch Hybridisierung umfassen, wobei die reaktionsfähige Gruppe und das Zielmolekül Oligonukleotide sind. Die Massemarkierung kann enzymatisch oder chemisch freigesetzt werden.
  • Es ist vorgesehen, dass für diese Ausführungsform verwendbare Enzyme Nukleasen, wie etwa Restriktionsendonuklease Typ II und IIS und Exonukleasen, umfassen. Die vorgesehenen Exonukleasen können spezifisch sein für doppelsträngige DNA, wie etwa Exonuklease III, T4-Endonuklease VII, Lambda-Exonuklease und DNA-Polymerase. Für diese Ausführungsformen kann die Freisetzung der Massemarkierung durch die Hybridisierung der Sonde mit dem Amplifikationsprodukt ausgelöst werden. In dieser Ausführungsform ist die Sonde einzelsträngig und kann mit dem Ziel hybridisieren, dessen Vorhandensein nachgewiesen werden soll. Die Exonuklease kann auch für einzelsträngige DNA spezifisch sein.
  • Chemisch spaltbare Bindungen können eine modifizierte Base, einen modifizierten Zucker, eine Disulfidbindung, eine in das Phosphatgerüst eingefügte chemisch spaltbare Gruppe oder einen chemisch spaltbaren Linker umfassen und werden normalerweise durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion, Wärme, Licht oder Metallionen-katalysiert, durch Verdrängung oder Eliminierungschemie gespalten.
  • Hierin werden Ausführungsformen bereitgestellt, worin die reaktionsfähige Gruppe weiterhin ein Nukleotid oder Oligonukleotid umfasst, welches nach der Hybridisierung mit dem Amplifikationsprodukt, dem amplifizierten Zielmolekül oder dem amplifizierten Nukleinsäuremolekül hinzugefügt werden. Diese hinzugefügten Nukleotide oder Oligonukleotide können optional eine funktionelle Gruppe enthalten, welche auf einem festen Träger immobilisiert werden kann.
  • Bei Ausführungsformen, bei welchen eine Immobilisierung auf einem festen Träger verwendet wird, wird man normalerweise die reaktionsfähige Gruppe auf den festen Träger nach der Zugabe des Nukleotids oder Oligonukleotids immobilisieren, dann werden alle Sonden mit nicht gebundenen reaktionsfähigen Gruppen entfernt vor der Freisetzung der Massemarkierung von jeder Sonde, welche zu einem Komplex Sonde:amplifiziertes Zielmolekül oder einem Komplex Sonde:Zielmolekül gehört.
  • Bei diesen Ausführungsformen können die reaktionsfähigen Gruppen und die Release-Gruppen die gleichen sein, oder die Release-Gruppe kann in der reaktionsfähigen Gruppe enthalten sein. Die Sonde kann auch mindestens zwei unikale Massemarkierungen umfassen.
  • Es werden auch Multiplexverfahren bereitgestellt, worin das Zielmolekül mit mehreren Sonden in Kontakt gebracht wird. In diesen Fällen kann jede reaktionsfähige Gruppe der Sonde mit einer unikalen Massemarkierung verbunden sein, oder sie kann mit einer unikalen Gruppe von Massemarkierungen verbunden sein. Folglich kann ein Zielmolekül nachgewiesen werden durch den Massenspektralnachweis einer bestimmten Massemarkierung oder einer bestimmten Gruppe von Massemarkierungen. Wenn eine Gruppe von Massemarkierungen verwendet wird, kann die Gruppe von Massemarkierungen mit der gleichen Sonde verbunden sein. Alternativ kann jedes Mitglied der Gruppe mit einer unterschiedlichen Sonde verbunden sein.
  • Es werden auch Verfahren bereitgestellt zum Nachweis von Fehlpaarungen, worin das amplifizierte Nukleinsäureprodukt ein doppelsträngiges Molekül umfasst, welches eine Fehlpaarung und eine Funktionalität zur Exonukleaseblockierung an den 3'-Enden der Stränge enthält. Normalerweise kann dieses Verfahren weiterhin die Spaltung von mindestens einem Strang des doppelsträngigen Moleküls an der Stelle der Fehlpaarung umfassen, und eine selektive Freisetzung der Massemarkierung. Eine selektive Freisetzung der Massemarkierung kann normalerweise ausgeführt werden durch Verdau des gespaltenen Strangs durch eine 3'-5'-Exonuklease, wie etwa die Exonuklease III.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "selektives Freisetzen" die Freisetzung einer Massemarkierung von einer Sonde, welche zu einem Komplex aus Sonde:Zielmolekül gehört, ohne eine Massemarkierung von einer Sonde freizu setzen, welche nicht zu solch einem Komplex gehört, ohne dass die zwei Arten von Sonden stofflich getrennt werden müssen. Einige Ausführungsformen können jedoch sowohl eine selektive Freisetzung als auch eine stoffliche Trennung enthalten. Die beschriebene Immobilisierungs und Waschverfahren veranschaulichen ein Verfahren der stofflichen Trennung.
  • Die Fehlpaarung kann durch ein Enzym, wie etwa mutHLS, T4-Endonuklease VII, mutY-DNA-Glykosylase, Thymin-Mismatch-DNA-Glykosylase oder Endonuklease V gespalten werden. Die Fehlpaarung kann auch durch eine Chemikalie gespalten werden, wie etwa durch OsO4, HONH2 oder KmnO4.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls bereit, welches die Schritte umfasst: (a) Erhalten einer Sonde, enthaltend eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine nicht flüchtige Massemarkierung, (b) Inkontaktbringen des Zielmoleküls mit der Sonde, um Komplexe aus Sonde:Zielmolekül zu erzeugen, (c) selektives Freisetzen der Massemarkierung aus den Komplexen aus Sonde:Zielmolekül, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen und (d) Bestimmen der Masse der freigesetzten Massemarkierungen durch Massenspektrometrie.
  • Auf ähnliche Weise können normalerweise chemische und enzymatische Freisetzungsverfahren in diesen Ausführungsformen verwendet werden. Eine selektive Freisetzung der Massemarkierung kann auch erreicht werden durch Verwendung von Mitteln zur Spaltung, welche durch die Gegenwart eines doppelsträngigen Oligonukleotids an der Release-Gruppe inhibiert werden. Wie in diesem Kontext verwendet, bedeutet "an der Release-Gruppe", dass die Basenpaarung an beiden Seiten der Release-Gruppe durch mindestens ein Nukleotid beibehalten wird.
  • Bei dieser Ausführungsform bewirkt das Inkontaktbringen der Sonde mit dem Zielmolekül normalerweise, dass die Release-Gruppe in einer einzelsträngigen Region vorliegt, da ein Strang der Sonde mit dem Zielmolekül wechselwirkt, beispielsweise mit ihm hybridisiert.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung umfasst ein Multiplexverfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls, umfassend: (a) Erhalten von mehreren Sonden, wobei jede Sonde eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine Massemarkierung enthält, (b) Inkontaktbringen des Zielmoleküls mit den mehreren Sonden, um Komplexe aus Sonde:Zielmolekül zu erzeugen, (c) Freisetzen der Massemarkierung von jeder Sonde, welche zu den Komplexen aus Sonde:Zielmolekül gehört, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen, und (d) Bestimmen der Masse von jeder freigesetzten Massemarkierung durch Massenspektrometrie. In diesem Aspekt ist jede reaktionsfähige Gruppe, welche ein spezifisches Zielmolekül erkennt, mit einer unikalen Gruppe von Massemarkierungen verbunden. Oft können mehrere Zielmoleküle mit den mehreren Sonden bevorzugt sein.
  • Die Mitglieder der Gruppe von Massemarkierungen können mit derselben Sonde oder mit unterschiedlichen Sonden verbunden sein. Außerdem kann die gleiche Massemarkierung ein Mitglied von Gruppen sein, welche mehr als eine reaktionsfähige Gruppe identifizieren. Folglich ist in dieser Ausführungsform die Gruppe von Massemarkierungen und nicht die einzelne Massemarkierung für eine bestimmte reaktionsfähige Gruppe unikal. In dieser Ausführungsform können Sonden mit einer reaktionsfähigen Gruppe, welche ein bestimmtes Ziel identifiziert, in der Release-Gruppe und der Massemarkierung ebenso wie in anderer Hinsicht variieren.
  • Immobilisierungs- und Waschverfahren können in dieser Ausführungsform verwendet werden, und es kann in einigen Ausführungsformen bevorzugt sein, mehrere Zielmoleküle auf dem festen Träger an räumlich getrennten Stellen zu immobilisieren, und diese dann mit den massemarkierten Sonden in Kontakt zu bringen. Typische Zielmoleküle umfassen ein Polynukleotid, ein Antigen, einen Liganden, ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat und ein Lipid.
  • In weiteren Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, Gruppen von Massemarkierungen zu verwenden, worin ein Mitglied der Massemarkierung der Gruppe einen bestimmten Anteil oder eine Funktionalität oder eine Untergruppe des Zielmoleküls repräsentiert. Beispielsweise kann eine Massemarkierung A einer reaktionsfähigen Gruppe entsprechen, welche aus den Funktionalitäten A'X2 ... XN zusammengesetzt ist, wobei A überall in der reaktionsfähigen Gruppe vorliegen kann und nur A' repräsentiert, oder es kann auf beliebige Art mit A' strukturelle verwandt sein oder nicht. Folglich ergibt der Nachweis der Massemarkierung den Nachweis eines Zielmoleküls, welches A' erkennt, aber nicht notwendigerweise etwas anderes über die Struktur oder Zusammensetzung des Zielmoleküls aufzeigt.
  • Es werden somit Verfahren bereitgestellt, worin die unikalen Gruppen von Massemarkierungen eine Massemarkierung umfassen, welche die Gegenwart eines speziellen Bestandteils innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe anzeigt. Weitere Ausführungsformen enthalten auch Verfahren, worin die Massemarkierung die Gegenwart des speziellen Bestandteils an einem speziellen Ort innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe anzeigt. Eine reaktionsfähige Gruppe, welche n spezielle Bestandteile umfasst, kann mit einem unikalen Satz von Massemarkierungen mit n Mitgliedern verbunden werden, wobei n normalerweise 1 bis 100 o beträgt. Im Allgemeinen sind Massemarkierungen einzeln mit der reaktionsfähigen Gruppe verbunden und werden intakt identifiziert.
  • Eine reaktionsfähige Gruppe, welche n spezielle Bestandteile umfasst, kann auch mit einer unikalen Gruppe von Massemarkierungen mit y Mitgliedern verbunden sein, worin n kleiner ist als y!/[x!(y – x)!], und worin x die Anzahl der Massemarkierungen pro reaktionsfähiger Gruppe umfasst.
  • In einigen Ausführungsformen können mehrere Sonden jeweils eine bekannte reaktionsfähige Gruppe umfassen mit einer bekannten Gruppe von Massemarkierungen, und die mehreren Sonden können durch kombinatorische Synthese hergestellt werden. Die mehreren Zielmoleküle können auch eine bekannte chemische Struktur umfassen.
  • Es wird auch ein Verfahren zum Monitoring der Genexpression bereitgestellt, umfassend (a) Erhalten von mehreren Sonden, wovon jede eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine Massemarkierung enthält, (b) Inkontaktbringen von mehreren Zielnukleinsäuren mit den mehreren Sonden, um Komplexe aus Sonde:Zielnukleinsäure zu erzeugen, (c) selektives Freisetzen der Massemarkierung von jeder Sonde, welche zu einem Komplex aus Sonde:Zielnukleinsäure gehört, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen und (d) Bestimmen der Masse von jeder freigesetzten Massemarkierung durch Massenspektrometrie.
  • Normalerweise können die Zielnukleinsäuren Sequenzen besitzen, welche repräsentativ sind für die Gene, welche in einer bestimmten Zellkultur exprimiert werden und welche in Konzentrationen vorliegen, die mit der Menge ihrer mRNA- Siegel in Beziehung stehen. Die Zielnukleinsäuren können normalerweise mRNA oder Erststrang-cDNA umfassen, ebenso wie amplifizierte Nukleinsäureprodukte.
  • Solche amplifizierten Nukleinsäureprodukte können erzeugt werden unter Verwendung von PCR, rtPCR, LCR, Qbeta-Replikase, SDA, CPR, TAS, NASBA oder mehreren Runden einer RNA-Transkription oder einer beliebigen Kombination davon. Die Amplifikation kann verwendet werden, um selektiv eine Untergruppe des mRNA-Pools zu amplifizieren, wobei das Nachweissignal für diese Genprodukte erhöht und der Hintergrund von Genprodukten außerhalb der amplifizierten Untergruppe verringert wird.
  • Eine andere Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Monitoring der Genexpression, umfassend Amplifizieren einer Untergruppe eines mRNA-Pools, um mehrere amplifizierte Nukleinsäureprodukte zu erzeugen, Inkontaktbringen von mehreren ampflifizierten Nukleinsäureprodukten mit mehreren Sonden, wobei jede Sonde eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine Massemarkierung enthält, um Komplexe Sonde:amplifizierte Nukleinsäure zu erzeugen, selektives Freisetzen der Massemarkierung von jeder Sonde, welche zu den Komplexen Sonde:amplifizierte Nukleinsäure gehört, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen, Bestimmen der Masse von jeder freigesetzten Massemarkierung durch Massenspektrometrie.
  • Bei dieser Ausführungsform können eine oder mehrere Sonden oder amplifizierte Nukleinsäureprodukte auf einem festen Träger immobilisiert werden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls, umfassend Inkontaktbringen eines Zielmoleküls mit einer Sonde, welche eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine nicht flüchtige Massemarkierung enthält, um Komplexe Sonde:Zielmolekül zu erzeugen, Freisetzung der Massemarkierung von jeder Sonde, welche zu einem Komplex gehört, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen, selektives Desorbieren der freigesetzten Massemarkierung von der Massenspektralmatrix, sodass die Sonden, welche nicht zu Komplexen Sonde:Zielmolekül gehören, nicht desorbieren, und Bestimmen der Masse der freigesetzten Massemarkierung durch Massenspektrometrie.
  • Bei diesen Ausführungsformen sollte die Massemarkierung effizienter von der Massenspektralmatrix desorbieren als die Sonde oder die massemarkierte Sonde. Bevorzugte Massenspektralmatrizen umfassen 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Siapinsäure oder alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure.
  • Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst Amplifizieren von einer oder mehreren Zielnukleinsäuren, um amplifizierte Nukleinsäureprodukte zu erzeugen, Einfügen von einem oder mehreren Molekülen, welche eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine nicht flüchtige Massemarkierung enthalten, in das amplifizierte Nukleinsäureprodukt während des Amplifikationsverfahrens, selektives Freisetzen der in die amplifizierten Nukleinsäureprodukte eingefügten Massemarkierungen, um freigesetzte Massemarkierungen zu erzeugen, und Bestimmen der Masse der freigesetzten Massemarkierungen durch Massenspektrometrie.
  • Eingefügte Moleküle können Oligonukleotidprimer und Nukleosidtriphosphate sein, und die amplifizierten Nukleinsäureprodukte werden unter Verwendung von PCR, rtPCR, LCR, Qbeta-Replikase, SDA, CPR, TAS, NASBA oder mehreren Runden einer RNA-Transkription oder einer beliebigen Kombination daraus erzeugt. Es können auch ein oder mehrere zweite Moleküle in die amplifizierten Nukleinsäureprodukte eingefügt werden, wobei jedes eine funktionelle Gruppe enthält, welche an einem festen Träger immobilisiert werden kann. Die funktionelle Gruppe kann auch verwendet werden, um die amplifizierten Nukleinsäureprodukte mit einem festen Träger zu verbinden, und eingefügte massemarkierte Moleküle von nicht eingefügten massemarkierten Molekülen zu trennen. Es kann auch bevorzugt sein, die amplifizierten Nukleinsäureprodukte von den nicht eingefügten massemarkierten Molekülen zu trennen, beispielsweise durch Binden der amplifizierten Nukleinsäureprodukte an einen festen Träger oder durch Hybridisieren der amplifizierten Nukleinsäureprodukte mit einem an einen festen Träger gebundenen Polynukleotid. Im letzteren Fall kann das gebundene Polynukleotid ein Oligonukleotid, ein Polyribonukleotid, ein Plasmid, ein M13, ein Cosmid, ein P1-Klon, ein BAC oder ein YAC sein. Es können auch mehrere dieser Polynukleotide auf dem festen Träger an räumlich getrennten Stellen immobilisiert sein.
  • Es wird auch ein Verfahren bereitgestellt zum Nachweis des Vorliegens eines Zielnukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren umfasst: Erhalten einer Sonde, welche eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine Masse markierung umfasst, Inkontaktbringen der Sonde mit einem Zielnukleinsäuremolekül, um Komplexe aus Sonde:Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, Modifizieren der Masse der Komplexe aus Sonde:Nukleinsäuremolekül durch Verbinden eines Nukleotids oder Oligonukleotids mit der Sonde, um massemodifizierte Massemarkierungen zu erzeugen, Freisetzen der massemodifizierten Massemarkierungen und Bestimmen der Masse der massemodifizierten Massemarkierungen durch Massenspektrometrie.
  • Eine andere Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Biomolekülen in einem Enzym-gebundenen Affinitätsassay, umfassend: Erhalten eines Substrates, Inkontaktbringen eines Zielmoleküls mit einem Affinitätsligand-Enzym-Konjugat, um einen Komplex aus Affinitätsligand-Enzym-Konjugat:Zielmolekül zu erzeugen, Inkontaktbringen des Komplexes aus Affinitätsligand-Enzym-Konjugat:Zielmolekül mit dem Substrat, um ein massemodifiziertes Produkt zu erzeugen, und Bestimmen der Masse des massemodifizierten Produkts durch Massenspektrometrie.
  • Wie hierin verwendet, sind "Affinitätsliganden" Gruppen, Moleküle oder Anteile, welche eine Affinität zu einem bestimmten Zielmolekül besitzen oder mit einem bestimmten Zielmolekül reagieren, ähnlich wie die reaktionsfähigen Gruppen, welche bei den oben offenbarten Massemarkierungssonden verwenden werden. Der Affinitätsligand kann ein Biomolekül sein, welches ein spezifisches Molekül erkennen kann, wie etwa ein Polypeptid oder eine Polynukleinsäure. Bevorzugte Polypeptide umfassen Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, regulatorische Proteine, Nukleinsäure-bindende Moleküle, Hormone und Proteinprodukte eines Displayverfahrens, wie etwa Produkte eines Phagen-Displayverfahrens oder eines Bakterien-Displayverfahrens.
  • Die mit diesen Affinitätsliganden konjugierten Enzyme können ein beliebiges Enzym sein, welches die Umwandlung des Substrats in ein Produkt mit einer unterschiedlichen Masse katalysieren, wie etwa Restriktionsendonukleasen und Proteasen. Somit ist die Masse des Substrats bei der Herstellung des Produkts durch das Enzym modifiziert worden. Affinitätsligand-Enzym-Konjugate sind Moleküle, wobei der Affinitätsligand und das Enzym durch die Bildung von kovalenten oder nicht kovalenten Wechselwirkungen, einschließlich Wasserstoffbindungen, verbunden worden sind.
  • In einigen Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, mehrere Restriktionsendonukleasen zu verwenden. In diesen Fällen können die verschiedenen Endonukleasen mit dem Affinitätsligand konjugiert sein, um mehrere Affinitätsligand-Enzym-Konjugate zu bilden, welche dann mit dem Zielmolekül in Kontakt gebracht werden. Ebenso kann es bevorzugt sein, mehrere Affinitätsligand-Enzym-Konjugate zu verwenden, welche unterschiedliche Affinitätsliganden, Enzyme oder beides aufweisen.
  • Das Substrat kann ein beliebiges Molekül sein, dessen Umwandlung in ein massemodifiziertes Produkt durch das verwendete Enzym erreicht wird, wie etwa ein Polypeptid. Für Ausführungsformen, bei welchen Restriktionsendonukleasen verwendet werden, kann es folglich eine Restriktionsstelle umfassen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um weiterhin bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung von speziellen Ausführungsformen, welche hierin präsentiert wird, besser verstanden werden.
  • 1A und 1B zeigen verallgemeinerte Beispiele von zwei massemarkierten Bausteinen für die Herstellung von massemarkierten Polynukleotiden, ein massemarkiertes Nukleosidtriphosphat (1A) und ein massemarkiertes Nukleosidphosphoramidit (1B). In diesen Figuren bezieht sich B auf eine Base, R auf eine optionale freisetzende Bindung und M auf eine Massemarkierung. Massemarkierungen können auch nach der Polynukleotidsynthese über Linkerreagenzien hinzugefügt werden.
  • 2A und 2B zeigen Beispiele einer massemarkierten Sonde, wobei die freisetzbare Gruppe in der reaktionsfähigen Gruppe enthalten ist, und die freigesetzte Massemarkierung ein oder mehrere Monomere der reaktionsfähigen Gruppe enthält.
  • In 2A ist die Verwendung der Sonde als ein Oligonukleotidprimer gezeigt, welcher durch Polymerase verlängert werden kann (Schritt A), unter Verwendung von Nukleosidtriphosphaten einschließlich Desoxy- und Didesoxyribonukleotid oder Kombinationen davon, oder durch Ligase unter Verwendung von Oligonukleotiden. Ligase kann verwendet werden, um Oligonukleotide mit dem 5'- ebenso wie mit dem 3'-Ende zu verbinden. Hinzugefügte Nukleotide und Oligonukleotide ebenso wie Nukleotidmonomere innerhalb der Sonde können optional aus modifizierten Nukleotiden oder nicht natürlichen Nukleotidnachahmungen bestehen. Es ist auch die optionale Verwendung einer Festphasenbindungsgruppe, wie etwa Biotin (mit B bezeichnet) gezeigt, welche verwendet werden kann, um den verlängerten massemarkierten Primer vor der Freisetzung des massemarkierten Produkts einzufangen (Schritt B). Nach der Freisetzung wird das massemarkierte Produkt durch Massenspektrometrie analysiert (Schritt C). Der Bestandteil der nicht reaktionsfähigen Gruppe der Massemarkierung wird durch Mx bezeichnet, wobei das x bedeutet, dass dieser Bestandteil eine einzelne Molekularmasse aufweisen kann, oder dass er eine Kombination von zwei oder mehreren Molekülen mit definierter Masse darstellen kann. Der Mx-Bestandteil kann optional vollständig in der reaktionsfähigen Gruppe enthalten sein und kann Nukleotide oder nicht natürliche Nukleotidnachahmungen umfassen. Die Bestimmung der Masse des massemarkierten Produkts stellt ein Mittel bereit zur Identifizierung der Nukleotidzusammensetzung und der Sequenz der Basen, welche zu der Sonde unmittelbar benachbart sind.
  • 2B veranschaulicht den speziellen Fall, bei welchem die massemarkierte Sonde als ein Primer fungiert, um einen einzelnen Nukleotidpolymorphismus nachzuweisen. In Schritt A wird nach der Hybridisierung mit einer Templatnukleinsäure eine Polymerase verwendet, um einen einzelnen Nukleotidkettenterminator oder eine massemodifizierte Version davon hinzuzufügen, ausgewählt aus den vier möglichen Basen. Nach der Verlängerung der Sonde wird das massemarkierte Produkt freigesetzt (Schritt B) und durch Massenspektrometrie analysiert (Schritt C). Wie in 2A umfasst die Sonde optional eine Festphasenbindungsgruppe, welche verwendet werden kann, um die Sonde vor dem Schritt der Freisetzung zu binden und zu waschen. In diesem Beispiel wird ein T-Kettenterminator hinzugefügt, welcher die Masse des Massemarkierungsprodukts auf 298 Da erhöht, was das Vorliegen eines A in dem Templat an der Zielposition anzeigt.
  • 2C veranschaulicht eine andere Ausführungsform für die Verwendung einer massemarkierten Sonde bei der Bestimmung eines Einzelnukleotidpolymorphismus. Eine massemarkierte Sonde wird mit einem Templat hybridisiert und durch eine Polymerase verlängert, welche ein Einzelketten-Terminationsnukleotid einfügt (Schritt A). Das Kettenterminationsnukleotid wird modifiziert, um eine Festphasenbindungsgruppe wie etwa Biotin (mit B bezeichnet) zu enthalten, welche verwendet wird, um den verlängerten massemarkierten Primer vor der Freisetzung des massemarkierten Produkts einzufangen (Schritt D). In dieser speziellen Darstellung wird die Sonde verwendet, um zu identifizieren, ob ein A-Nukleotid in der Position, welche dort benachbart ist, wo die Sonde hybridisiert, vorliegt oder nicht vorliegt. Obwohl die Reaktion alle vier Kettenterminationsnukleotide enthalten kann, wird nur der T-Kettenterminator modifiziert und trägt die Festphasenbindungsgruppe. Deswegen wird die massemarkierte Sonde nur, wenn T eingefügt wird und A in dem Templat vorliegt, modifiziert und von der Festphase eingefangen (Schritt B). Die Anwendung eines Waschschritts (Schritt C) vor der Freisetzung (Schritt D) entfernt alle Sonden, welche T nicht eingefügt haben, wobei deren Massemarkierungen aus dem System entfernt werden. Nur Sonden, welche an die Festphase gebunden sind (Schritt B), werden im Massenspektrometer nachgewiesen (Schritt E). Die Massemarkierung wird mit Mx bezeichnet, wobei das x bedeutet, dass dieser Bestandteil eine Einzelmolekularmasse besitzt oder dass er eine Kombination von zwei oder mehreren Molekülen mit definierter Masse darstellt. Es ist ein Multiplexverfahren mit vielen unterschiedlichen Sonden möglich. Die Release-Gruppe Re kann in dem Linker platziert werden, welcher die Massemarkierung mit der Sonde verbindet, oder an einer beliebigen Position in dem Gerüst der Sonde. Diese Methodik kann auf Fälle ausgeweitet werden, bei welchen eine Kombination von Nukleotiden und Kettenterminationsnukleotiden verwendet wird, ebenso wie Oligonukleotide, wobei bestimmte Bestandteile so ausgewählt werden, dass sie eine Festphasenbindungsgruppe enthalten.
  • 3A und 3B veranschaulichen ein verallgemeinertes Schema zur Erzeugung eines Gemisches von Nukleinsäuresonden, jede mit einer unikalen einzelnen Massemarkierung oder einer Kombination von Massemarkierungen (3A), und insbesondere ein verallgemeinertes Schema zum Einfügen von massemarkierten Nukleotiden oder Oligonukleotiden in eine Polynukleotid sequenz unter Verwendung von DNA-Polymerase (Schritt A) oder Ligase (Schritt B) (3B).
  • 3A veranschaulicht eine Nukleinsäuresonde, welche eine invariante Region und eine variable Region enthält. Die invariante Region, welche optional ist, trägt die gleiche oder nahezu die gleiche Sequenz wie alle Sonden innerhalb einer Familie. Die variable Region enthält alle möglichen Sequenzen oder einige Untergruppen davon. Wenn die variable Region beispielsweise 4 Nukleotide lang ist, können 256 unterschiedliche Sonden hergestellt werden, wenn die variable Region 6 Nukleotide lang ist, können 4096 unterschiedliche Sonden hergestellt werden. Verbunden mit jeder Sondensequenz ist eine einzelne oder eine Kombination von Massemarkierungen. In jedem Fall sind die gewählten Massemarkierungen für jede Sequenz unikal. In Fällen, bei welchen Kombinationen verwendet werden, können die Massemarkierungen (als M bezeichnet) einzelne Markierungen sein, welche mit unterschiedlichen Sonden verbunden sind, welche die gleiche Sequenz tragen oder mehrere Markierungen, welche mit einer einzelnen Sonde verbunden sind, oder eine beliebige Kombination davon.
  • 3B veranschaulicht zwei Ausführungsformen, wobei die massemarkierte Familie von Sonden verwendet werden kann, um ein Nukleinsäuretemplat zu screenen. Neben einer einfachen Hybridisierung der Sonde mit dem Templat können die Sonden entweder unter Verwendung von Polymerase (Schritt A) oder Ligase (Schritt B) verlängert werden. In jedem Fall können Nukleotide oder Oligonukleotide verwendet werden, welche weitere Massemarkierungen enthalten (als M* bezeichnet), welche die Sequenz des hinzugefügten Nukleinsäureprodukts identifizieren, wobei die gesamte Templatsequenz, welche pro Sondenhybridisierungsereignis bestimmt wird, vergrößert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Templat an eine Festphase gebunden. Alternativ können die zu der Sonde hinzugefügten Nukleotide oder Oligonukleotide eine Festphasenbindegruppe enthalten, was die Isolierung der Sonde und die Verbindung über einen Festphaseneinfangprozess ermöglicht. Wie veranschaulicht, stellt X-Y eine Watson-Crick-Basenpaarung in der variablen Region der Sonde dar, und N-M stellt eine Watson-Crick-Basenpaarung in der hinzugefügten Nukleotid- oder der Oligonukleotidsequenz dar.
  • 4A, 4B und 4C veranschaulichen unterschiedliche kombinatorische Ansätze zur Herstellung von massemarkierten Sonden (4A) unter Verwendung von massemarkierten Sonden, um ein Vektorinsert zu screenen (4B), und enzymatischen Verfahren einschließlich Transkription und PCR für die Herstellung von großen massemarkierten Polynukleotidsonden (4C).
  • 4A beschreibt ein Beispiel dafür, wie kombinatorische Markierungen verwendet werden können, um eine komplexe Gruppe von Oligonukleotiden zu markieren. Das Beispiel beschreibt eine Gruppe von Sonden, welche eine 4 Nukleotide lange variable Region besitzen, wobei 256 mögliche Sequenzkombinationen umfasst sind. Es sind auch kürzere oder längere variable Regionen möglich. In der Tabelle und Beispielliste (C) ist gezeigt, wie eine Gruppe von 16 unterschiedlichen Massemarkierungen verwendet werden kann, um eine Massemarkierungssignatur zu erzeugen, welche für alle 256 Kombinationen unikal ist. Es können zwei unterschiedlichen Ansätze verwendet werden, um die markierten Sonden zu erzeugen, wobei der erste (A) die Verwendung von 16 unterschiedlichen Phosphoramiditen mit jeweils einer unterschiedlichen Massemarkierung ist, welche gemäß der Base und der Position der Synthese verwendet werden. Dieser Ansatz führt zu einer Gruppe von Molekülen mit jeweils 4 auf dem Molekül und wird als eine einzelne Reaktion durchgeführt. Varianten sind möglich, wobei die Synthese in mehreren Gefäßen aufgespalten ist und Standardphosphoramidit in einigen Positionen verwendet wird, um die Anzahl der Markierungen pro Molekül zu verringern. Der zweite kombinatorische Ansatz (B) ist die vorherige Synthese der 256 Kombinationen in 16 unterschiedlichen Reaktionen vor dem Hinzufügen der Massemarkierungen, wobei jede davon verwendet wird, um eine der 4 Basen in einer der 4 Positionen zu definieren. Nach der Oligonukleotidsynthese wird jede der 16 unterschiedlichen Reaktionen mit einer der 16 unterschiedlichen Massemarkierungen gekoppelt. Das Endprodukt ist, dass jede Probe in dem Pool nur eine spezifische Massemarkierung enthält. Der zweite Ansatz ermöglicht eine größere Flexibilität für die Positionierung und die Art der Massemarkierung, da sie nicht direkt mit der Oligonukleotidsynthese gekoppelt ist. Andere Markierungsschemata können vorgesehen sein, wenn das Post-Oligonukleotidsyntheseverfahren verwendet wird, insbesondere wenn die Oligonukleotidgruppe in einer größeren Zahl von Reaktionen synthetisiert wird, mit einer optimalen Flexibilität, wenn die 256 Kombinationen alle einzeln synthetisiert werden. Mit beiden Ansätzen kann die Synthese optional eine invariante Syntheseregion enthalten, wie in 4A gezeigt. Die variable Region kann auch ein oder mehrere diskontinuierliche Basen innerhalb der invarianten Region enthalten. Diese Sonden können angewendet werden zum Screening von Polymorphismen in diagnostischen und genomischen Anwendungen, einschließlich eines Einzelnukleotidpolymorphismus, wobei die variable Region nur ein Nukleotid lang ist.
  • 4B beschreibt, wie die kombinatorisch markierten Sonden verwendet werden können, um polymorphe Sequenzen zu screenen, welche benachbart sind zu den Insertsequenzen innerhalb von Klonierungsvektoren (A), einschließlich cDNA und genomischen Klonen. Die Verwendung einer invarianten Sequenz innerhalb der Sonde ermöglicht, dass die Sonden an der Verbindung zwischen der bekannten Vektorsequenz und der unbekannten Insertsequenz verankert werden, wobei die invariante Region der Sonde mit der bekannten Sequenz hybridisiert und die variable Region ihre Ergänzung in der unbekannten Region auswählt (B). Verfahren zur Verwendung dieser Sonden umfassen eine einfache Hybridisierung mit einem oder beiden der Insertenden, Nukleotid- oder Oligonukleotidverlängerungen des Klons, wie in 3B beschrieben, und die Verwendung von Sonden für eine Primerverlängerung, um eine einzelne Kopie des Inserts herzustellen oder für Zwecke der Amplifikation. Für eine bestimmte Insersequenz ergibt die Verwendung von „forward" und „reverse" Sonden in einer PCR-Amplifikation die Selektion von nur einer „forward" und einer „reverse" Sonde aus der Gruppe unter Erzeugung des Amplifikationsprodukts. Dieses Verfahren kann kombiniert werden mit einer Anzahl von unterschiedlichen selektiven Methodiken der Freisetzung einer Massemarkierung, um Sequenzen zu identifizieren.
  • 4C veranschaulicht zwei unterschiedliche Verfahren zur Erzeugung von massemarkierten Polynukleotidsonden entweder durch Transkription (A) oder PCR-Amplifikation (B). Die Verwendung einer RNA-Transkription zur Synthese von Massensonden ist beschränkt auf die Sequenzregionen, welche stromabwärts einer Promotorsequenz liegen (mit P markiert). Bei typischen Syntheseverfahren werden RNA-Polymerase und Ribonukleosidtriphosphate verwendet, einschließlich massemarkierter Versionen, welche eine oder mehrere Massemarkierungen tragen können. In (A) ist ein Transkriptionsvektor gezeigt, welcher einen Transkriptionspromotor und eine Kloninsertsequenz enthält, welche stromabwärts transkribiert werden soll. Der Vektor trägt auch eine oder mehrere Restriktionsstellen (mit R markiert), welche optional geschnitten werden können, um die Länge der Transkripte zu steuern bzw. regulieren. Es kann praktische jede Amplifikationstechnik verwendet werden, um massemarkierte Sonden zu erzeugen, einschließlich PCR, wie in (B) gezeigt ist. Die PCR-Amplifikation erfordert die Verwendung von zwei entgegengesetzten Primern, um eine exponentielle Amplifikation der Sequenz zu ermöglichen, welche zwischen diesen lokalisiert ist. Es können ein oder mehrere Massemarkierungen an einem Primer oder beiden Primern angebracht sein, oder optional durch die Verwendung von massemarkierten Nukleosidtriphosphaten eingefügt werden.
  • 5A und 5B veranschaulichen Schemata zum Nachweis von Mutationen unter Verwendung von Techniken mit enzymatisch synthetisierten massemarkierten Sonden, welche für Fehlpaarungen spezifisch sind. Im Allgemeinen erfordert die Methodik die Kreuzhybridisierung einer normalen und einer mutierten oder polymorphen Nukleinsäure unter Bildung eines doppelsträngigen Produkts, welches eine Fehlpaarung enthält, die enzymatische oder chemische Spaltung an der Stelle einer Fehlpaarung, und den durch die Spaltung induzierten Verdau der Sonde unter Freisetzung von einer oder mehreren Massemarkierungen. In dem in 5A gezeigten und in 5B fortgesetzten Beispiel wird eine doppelsträngige massemarkierte Nukleinsäuresonde unter Verwendung von PCR synthetisiert (A), die 3'-Enden des Produkts werden für einen Exonukleaseverdau blockiert (B) und die PCR-Sonde wird hybridisiert mit einer DNA, welche eine Mutation trägt (C), was zur Bildung einer Basenpaar-Fehlpaarung führt, die Fehlpaarungen werden gespalten (D), die gespaltenen Produkte werden mit einer 3'-5'-Exonuklease verdaut (E), die Massemarkierungen werden freigesetzt (F) und durch Massenspektrometrie analysiert (G). Beispiele für Gruppen, welche eine 3'-Exonuklease blockieren, umfassen Nukleotidnachahmungen, welche nahe dem 3'-Ende eingefügt sind, wie etwa Nukleotide, welche Boranphosphate oder Phosphorthioate enthalten, oder die Verwendung von 3'-Überhängen, erzeugt während einer „Nested-Set-PCR" oder durch Templat-unabhängige Verlängerung durch eine Terminaltransferase in Kombination mit einer doppelstrangspezifischen 3'-5'-Exonuklease, wie etwa Exonuklease III, welche 3'-Überhänge nicht erkennt oder verdaut. Beispiele für Fehlpaarungs-spezifische Spaltungsmittel zur Verwendung in (D) umfassen die Chemikalien OsO4, KMnO4 und HONH2 und Enzyme, wie etwa mutHLS, T4-Endonuklease VII, mutY-DNA-Glykosylase, Thymidin-Mismatch-DNA-Glykosylase oder Endonuklease V. Es sind auch Verfahren unter Verwendung von RNA oder RNA/DNA-Hybriden möglich.
  • 6A, 6B und 6C veranschaulicht Schemata für die Synthese von Peptid-gebundenen Nukleosidtriphosphaten (6A), ein Oligonukleotid mit einem Linkermolekül, welches eine Release-Gruppe, ein Disulfid und eine terminale Aminomodifikation enthält, für eine Kopplung eines Peptids eines anderen Massemarkierungsbestandteils mit dem Ende (6B) und ein Schema für die Synthese eines Peptid-gebundenen Nukleosidphosphoramidits (6C).
  • 7A und 7B zeigt die Massenspektren des nicht konjugierten Oligonukleotids (6A) und des Oligonukleotid-Peptid-Konjugats (7B) von Beispiel 1 D. Das Spektrum von 7A enthält neben dem Signal für das gewünschte Oligonukleotid bei m/z 7052 Signale, welche die Anwesenheit von zwei signifikanten Synthesefehlern zeigen, welche einer Base und drei Basen weniger entsprechen, und auch Signale von doppelt geladenen Ionen für jeden von diesen. Das Spektrum von 7B zeigt, dass das gereinigte Konjugat eine ähnliche Reinheit aufweist wie das Ausgangsoligonukleotid.
  • 8A, 8B, 8C und 8C zeigen die Massenspektren einer hybridisierten, massemarkierten Sonde und eines Ziels in einem Puffer nach einem Verdau mit Exonuklease III (8A), einer hybridisierten, massemarkierten Sonde und eines Ziels, welche ohne Exonuklease III inkubiert wurden (8B), einer massemarkierten Sonde in Puffer, welche mit Exonuklease III inkubiert wurde (8C), einer massemarkierten Sonde, welche mit Exonuklease III-Puffer in Gegenwart eines nicht komplementären 36-mer Ziels inkubiert wurde (8D). Wie in diesen Figuren gezeigt ist, wird die Massemarkierung nur in Gegenwart der Exonuklease und eines komplementären Zielstrangs freigesetzt.
  • 9A, 9B und 9C vergleichen Festphasengitterassays unter Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde (9A), von Fluoreszenzmarkierten Sonden (9B) und massemarkierten Sonden (9C).
  • 9A beschreibt einen klassischen Ansatz zum Sondieren von Nukleinsäureproben, welche auf einem Gitter mit Zwischenräumen angeordnet sind. Übliche Nukleinsäureproben, welche mRNA-Isolate, cDNA-Klone, genomische Klone darstellen, werden auf einer Nylonmembran oder einem Filtergitter (A) angeordnet. Nach einem Photovernetzungsverfahren zur kovalenten Verbindung der Proben mit der Membran wird eine radioaktive Sonde (B) (mit A markiert) in Lösung zugegeben und mit dem Gitter (C) inkubiert. Die Sonde hybridisiert mit Positionen in dem Gitter, wobei die Nukleinsäuresonden eine Sequenzlänge enthalten, welche komplementär zu der Sonde ist. Nach einem Waschschritt wird das Gitter einem Röntgenfilm ausgesetzt und die Hybridisierungspositionen werden identifiziert (gezeigt durch die A-Positionen in dem Gitter) (D).
  • 9B veranschaulicht die Erweiterung des Verfahrens von 9A auf die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Sonden (B). aufgrund der unterschiedlichen Emissionsspektren von unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen ist es möglich, eine kleine Anzahl, beispielsweise 4 (mit A, B, C, D markiert) unterschiedlich markierte fluoreszierende Proben einem Multiplexverfahren zu unterziehen und sie auf dem Gitter zu kreuzhybridisieren (C). In dem Fall, in welchem Fluoreszenz verwendet wird, kann das Gitter eher auf einer Glasplatte als auf einem Filter oder einer Membran aufgesetzt sein, um Fluoreszenzscanningverfahren zu ermöglichen.
  • 9C veranschaulicht die Verwendung von massemarkierten Sonden (B) (mit A-S markiert) für eine Hybridisierung gegenüber einer gitterförmigen Anordnung von Nukleinsäureproben. Es können entweder einzelne oder kombinatorische Markierungsverfahren verwendet werden, um einige wenige bis Millionen von unterschiedlichen Sonden zu erzeugen, welche alle gleichzeitig gegenüber der Anordnung hybridisiert werden. Das Gitter (D), welches eine Nylonmembran oder ein anderes leitfähiges Material sein kann, kann nach den Schritten Hybridisieren, Waschen, Freisetzen der Massemarkierung und Matrixzugabe direkt in dem Massenspektrometer gescannt werden (C). Das Scannen in jeder Position des Gitters in dem Massenspektrometer ergibt eine der vielen möglichen Masse markierungssignaturen, welche mit jeder unikalen Sonde verbunden sind. Typische Beispiele von Assays, bei welchen diese Technologie verwendet wird, umfassen die Verwendung von bekannten genspezifischen Sonden gegenüber gitterförmigen cDNA-Klonen, mRNA, cDNA oder amplifizierten cDNA-Pools; genomische Sonden, sowohl bekannt als auch unbekannt, gegenüber gitterförmigen genomischen Klonen; mRNA, cDNA, amplifizierte cDNA gegenüber bekannten gitterförmigen Genen.
  • 10A und 10B vergleichen eine Expressionsanalyse einer Bibliothek unter Verwendung eines auf Fluoreszenz basierenden Systems (10A) und eines massemarkierten Systems (10B). Die Fluoreszenzmarkierung von Paaren von cDNA-Pools, welche von mRNA stammen, wird verwendet, um die Genexpressionsmuster zwischen zwei unterschiedlichen biologischen Proben gegenseitig zu vergleichen.
  • In 10A wird ein cDNA-Pool mit einem fluoreszierenden Tag A markiert, während der andere Pool mit einem fluoreszierenden Tag B markiert wird (A). Die Konzentrationen dieser Pools wurden normiert und gemischt (B). Das Gemisch dieser Pools wird dann hybridisiert gegenüber einer gitterförmigen Referenzanordnung von bekannten Genen, welche normalerweise als cDNA-Klone angeordnet werden. Nach der Hybridisierung wird der Array fluorimetrisch gescannt und das Verhältnis der zwei Tags wird für jeden Ort gemessen. Wenn der Tag A die zweifache Intensität des Tag B aufweist, wird für einen bestimmten Ort ermittelt, dass das Gen, welches an diesem Ort gerastert ist, in der Probe A als mRNA mit der zweifachen Konzentration der Probe B exprimiert wird.
  • 10B weitet das Konzept der kompetitiv hybridisierenden cDNA-Pools über das Ausmaß von 2 Pools aus. Die Verwendung von freisetzbaren Massemarkierungen stellt Mittel bereit für die Herstellung von viel mehr Pools (A) (mit A-H markiert), einer kreuzkompetitiven Hybridisierung (B) und dem Nachweis (C) von viel mehr Pools von exprimierter mRNA („message") gleichzeitig.
  • 11 veranschaulicht das Grundprinzip der Freisetzung einer Massemarkierung von einer Nukleinsäuresonde zur Analyse durch Massenspektrometrie. Die Massemarkierung M1 wird entweder chemisch oder enzymatisch freigesetzt (A) und durch Massenspektrometrie nachgewiesen (B).
  • 12 veranschaulicht die selektive Freisetzung von Massemarkierungen nach Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde mit einer Ziel-DNA-Sequenz. Massemarkierte Nukleinsäuresonden (A), welche mehr als eine Markierung enthalten können (wie gezeigt) und welche unterschiedliche Massen der Massemarkierung aufweisen (nicht gezeigt), werden mit einem komplementären Nukleinsäureziel hybridisiert (B) unter Bildung eines doppelsträngigen Komplexes (C). Dieser Komplex wird von einer doppelstrangspezifischen Exonuklease erkannt und die Sonde wird verdaut (D), wobei Massemarkierungen von der Sonde freigesetzt werden (E). Bei prozessiven Exonukleasen geht der Prozess weiter (F), bis die gesamte Probe verdaut ist (G). Der Verdau wird dann durch Massenspektrometrie analysiert und die freigesetzten Massemarkierungen werden nachgewiesen (H). Massemarkierungen umfassen mindestens ein Nukleotid, wenn sie durch eine Exonuklease verdaut werden.
  • 13 veranschaulicht die Trennung der Peptide A-G durch MALDI-Massenspektrometrie, wobei A Angiotensin I ist, B die Substanz P ist, C CGYGPKKKRKVGG (SEQ ID NO: 2) ist, D TCVEWLRRYLKN (SEQ ID NO: 7) ist, E CSRARKQAASIKVSADR (SEQ ID NO: 8) ist, F eine oxidierte A-Kette von Insulin ist und G Melittin ist.
  • 14 veranschaulicht eine schematische Darstellung eines Verfahrens, bei welchem eine Reihe von genspezifischen massemarkierten Nukleinsäuresonden verwendet werden, um unterschiedliche Ziel-mRNAs innerhalb einer bestimmten Probe nachzuweisen und deren Menge zu quantifizieren. Ein Ausgangspool von Nukleinsäure (A), welche die mRNA, eine cDNA-Kopie der mRNA oder ein anderes amplifiziertes Multiplex der von der mRNA stammenden Nukleinsäure ist, wird mit einer Gruppe von mRNA(„message")-spezifischen massemarkierten Nukleinsäuresonden gemischt (B) (Sonden mit unterschiedlichen Massemarkierungen, welche mit A-S bezeichnet sind). Das Gemisch kann hybridisieren (C), wobei die Sonden, welche in dem Pool komplementäre mRNAs(„messages")finden, doppelsträngige Komplexe bilden, worin die Konzentrationen der genspezifischen doppelsträngigen Komplexe proportional sind zu den Spiegeln der mRNA, welche in dem Ausgangsmaterial vorliegt. Nach der Bildung der doppelsträngigen Komplexe wird das Gemisch mit einer doppelstrangspezifischen Nuklease behandelt, beispielsweise eine Exonuklease III-Behandlung, welche selektiv Massemarkierungen von Sonden freisetzt, welche hybridisiert haben (D). Die freigesetzten Massemarkierungen (mit A-S bezeichnet) werden dann durch Massenspektrometrie analysiert (E), worin die Quantität jeder Massemarkierung proportional zu den Spiegeln der mRNA ist, welche in dem Ausgangsmaterial vorliegt. Der Schritt der selektiven Freisetzung kann zur Unterscheidung von doppelsträngigen Sonden von nicht hybridisierten einzelsträngigen Sonden optional doppelsträngige, Chemikalien-freigesetzte Sonden ebenso wie Festphaseneinfangverfahren verwenden.
  • 15A und 15B zeigt zwei Massenspektren. Bei 15A wurde eine rtPCRTM-Reaktion unter Verwendung eines massemarkierten Primerpaars durchgeführt, welche gegen die mRNA für das riposomale Protein L7 gerichtet waren. Nach der PCRTM wurde das Reaktionsgemisch mit der doppelstrangspezifischen Endonuklease T7-Gen-6-Exonuklease behandelt. Nur wenn ein doppelsträngiges PCRTM-Produkt gebildet wird, verdaut die Exonuklease das Produkt und setzt die zwei Massemarkierungen frei, wie durch die Peaks in dem Spektrum gezeigt wird. In 15B wurde eine Kontrolle durchgeführt, wobei ein einzelsträngiger massemarkierter Primer mit T7-Gen-6-Exonuklease inkubiert wurde. Es trat kein Verdau auf.
  • 16 veranschaulicht die Freisetzung einer Reihe von sieben unterschiedlichen massemarkierten Sonden, welche mit sieben unterschiedlichen cDNA-Plasmiden hybridisiert und dann mit Exonuklease III behandelt wurden. Ein Aliquot des doppelstrangspezifischen Verdaus wurde entnommen und durch Massenspektrometrie analysiert. Es wird das Massenspektrum gezeigt, wobei die Peaks jedem Massemarkierungssignal entsprechen, mit A-G markiert.
  • 17A und 17B zeigen zwei Massenspektren einer SNP-Analyse unter Verwendung eines massemarkierten Primers und eines biotinylierten Didesoxynukleotidtriphosphats. In 17A wird eine komplementäre Paarung durchgeführt zwischen der polymorphen Base an dem Templat und dem biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphat. Der massemarkierte Primer wurde erweitert und dadurch biotinyliert, wodurch ermöglicht wird, dass er von einer mit Streptavidin beschichteten Fläche eingefangen, gewaschen und anschließend von der Fläche abgespalten werden kann. 17B zeigt ein Massenspektrum von einer Reaktion, bei welcher die Base an der polymorphen Stelle keine komplementäre Paarung mit dem biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphat aufweist, welches in der Reaktion vorliegt. Es trat keine Verlängerung des Primers auf, wie durch die Abwesenheit eines Massenspektrometriesignals für die Primermassemarkierung gezeigt wird. Der nicht verlängerte Primer wird nicht auf der mit Streptavidin beschichteten Oberfläche eingefangen und wird in den nachfolgenden Waschungen entfernt.
  • 18 zeigt ein Massenspektrum von einer Multiplex-SNP-Analyse, worin drei unterschiedlich markierte Primer für drei unterschiedliche polymorphe Stellen alle gleichzeitig mit einem biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphat verlängert wurden. Die drei verlängerten Primer können alle auf einer mit Streptavidin beschichteten Fläche eingefangen werden, zur Entfernung der nicht verlängerten Primer gewaschen und dann von der Oberfläche abgespalten werden.
  • 19A und 19B zeigt zwei Massenspektren von einer SNP-Analyse, in welcher die Verlängerung wenige Basen nach der polymorphen Stelle durchgeführt wird, und bei welcher Biotin durch ein biotinyliertes Desoxynukleosidtriphosphat eingefügt wird. Das Gemisch von Triphosphaten in den Reaktionen besteht aus Desoxy-ATP, biotinyliertem Desoxy-CTP und Didesoxy-TTP.
  • Das Spektrum in 19A ist von einer Reaktion, in welcher die polymorphe Stelle auf dem Templat ein T ist, lokalisiert eine Base nach dem 3'-Ende des Primers. Da die polymorphe Stelle eine komplementäre Paarung mit einem der Desoxynukleosidtriphosphate in der Reaktion ist, wird der Primer über die polymorphe Stelle verlängert und danach wird ein biotinyliertes dCTP eingefügt vor Termination der Kettenverlängerung mit dem Didesoxynukleosidtriphosphat.
  • Die Reaktion, deren Spektrum in 19B gezeigt ist, ist eine Reaktion, bei welcher die polymorphe Stelle auf dem Templat ein A ist. Deshalb wird ein Didesoxy-TTP an der ersten Base nach dem Primer eingefügt, und die Kettenverlängerung wird vor dem Einfügen des biotinylierten dCPTs terminiert, wodurch in dem Massenspektrum kein Signal erscheint.
  • 20A und 20B zeigen zwei Massenspektren von Primerverlängerungsanalysen, bei welchen ein Gemisch aus drei Primern, welche sich nur in deren Basen am 3'-Ende unterscheiden und welche jeweils unikale Massemarkierungen enthalten, mit einem biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphat verlängert werden. In 20A zeigt das Massenspektrum in erster Linie ein Signal für den Primer, dessen Base am 3'-End (Primer A) eine perfekte Paarung des in der Reaktion verwendeten Templats ist. Das Spektrum in 20B ist von einer Reaktion, bei welcher das Templat ein anderes ist als in der Reaktion in 20A, sodass die Base am 3'-Ende mit einem anderen Primer paart und in erster Linie ein Signal durch die Verlängerung des Primers E ergibt.
  • 21A und 21B zeigen zwei Massenspektren, worin die chemischen Spaltungsraten von doppelsträngiger gegenüber einzelsträngiger DNA verglichen werden. Ein spaltbares Oligonukleotid mit einer 5'-S-P-Bindung ist durch AgNO3 spaltbar. Es werden zwei Spaltungsreaktionen durchgeführt. In der ersten Reaktion wird das spaltbare Oligonukleotid mit einem komplementären Oligonukleotid hybridisiert, um es vor der Zugabe des Spaltungsreagenz doppelsträngig zu machen. Die zweite Reaktion wird mit einem einzelsträngigen Oligonukleotid durchgeführt. Das Massenspektrum in 21A zeigt die Produkte aus der Spaltung von doppelsträngiger DNA. Die Spaltungsprodukte werden bei Massen von 6560 Da und 1470 Da erwartet, während das ungespaltene Oligonukleotid bei 8012 Da zu sehen ist. Das Spektrum von 21A zeigt, dass nur etwa 5% Spaltung aufgetreten ist. Das Spektrum von 21B, welches von der Spaltung des einzelsträngigen Oligonukleotids stammt, zeigt, dass unter den gleichen Bedingungen die Spaltung zu etwa 90% vollständig ist.
  • 22A und 22B zeigen zwei Massenspektren von einem Sondenassay eines genspezifischen RNA-Transkripts. Es werden zwei Exonuklease III-Verdaureaktionen durchgeführt. In beiden Reaktionen liegt ein Gemisch von zwei Sonden vor und das Templat besteht entweder aus einem RNA-Transkript oder aus dem DNA-PCR-Produkttemplat, von welchem die RNA transkribiert wird. Nur eine der Sonden ist komplementär zu dem RNA-Transkript, die andere Sonde ist komplementär zu dem gegenüberliegenden Strang. Wenn von dem DNA-PCR-Produkt ein Massemarkierungssignal erhalten wird, sind deshalb Signale für beide Sonden zu sehen, während nur ein Signal zu sehen ist, wenn das Signal von dem RNA-Transkript erhalten wird.
  • In 22A zeigt das Massenspektrum die resultierende freigesetzte Massemarkierung für die Reaktion, in welcher das RNA-Transkript vorliegt. Da nur ein Signal zu sehen ist, muss das Signal vom Verdau der Sonde kommen, welche mit dem RNA-Transkript hybridisiert. Die zweite Reaktion enthält eine 100-fach größere Menge des DNA-PCR-Produkts, als in der ersten Reaktion vorliegt, und kein RNA-Transkript.
  • 22B zeigt das Massenspektrum, welches von der zweiten Reaktion resultiert. Das Vorliegen von Signalen von beiden Sonden bestätigt die Tatsache, dass das Signal in 22A von der hybridisierten RNA-Sonde kommt.
  • 23A, 23B, 23C und 23D zeigen eine Gruppe von vier Massenspektren, welche die Analytselektivität von zwei unterschiedlichen Matrizen für MALDI vergleichen. Die für den Vergleich verwendeten Proben sind äquimolare Gemische eines nukleotidylierten Peptids und eines Oligonukleotids, erhalten durch eine selektive chemische Spaltung eines Oligonukleotid-Peptid-Konjugats. Die 23A und 23B vergleichen Spektren der gleichen Probe, welche mit einer 2,5-Dihydroxybenzoesäurematrix (23A) und mit einer 3-HPA-Matrix (23B) erhalten werden. In 23A überwiegt das Peptidsignal, während im Spektrum der 23B des Oligonukleotid überwiegt, aufgrund der unterschiedlichen Desorptionsselektivitäten oder Effizienzen der Matrizes für das Peptid und das Oligopeptid. Die Spektren in 23C und 23D führen den gleichen Vergleich mit einer unterschiedlichen Probe durch, wobei gezeigt wird, dass die Ionisierungsselektivität allgemein ist.
  • 24 veranschaulicht die Verwendung einer doppelsträngigen, massemarkierten Nukleinsäuresonde zum Nachweisen und Quantifizieren der Anwesenheit einer Nukleinsäurezielsequenz. In der doppelsträngigen Sonde ist eine chemische Spaltungsgruppe enthalten, welche unter geeigneten Bedingungen nur dann gespaltet wird, wenn die Nukleinsäuresonde einzelsträngig ist. Beispiele für chemische Spaltungsgruppen, welche bei Einzelsträngen erhöhte Spaltungsraten zeigen, umfassen chemisch labile Nukleinsäuregerüstmodifikationen, wie etwa 5'-(S)-Phosphorthioat, 3'-(S)-Phosphorthioat, 5'-(N)-Phosphoramidat, 3'-(N)-Phosphoramidat und Ribose. Sondieren einer Nukleinsäurezielsequenz betrifft eine Kombination der doppelsträngigen Sonde (A) mit dem einzelsträngigen Ziel (B) und ermöglicht, dass diese unter Gleichgewichtsbedingungen (C) denaturieren und annealen. Der Sondenstrang mit der Massemarkierung und der einzelstrangspezifischen Release-Gruppe (mit Re bezeichnet) ist homolog zu der Zielnukleinsäure, der Komplementärstrang ist auch zu dem Ziel komplementär. Die anderen Produkte dieses Gleichgewichtsereignisses sind der massemarkierte, spaltbare Strang in einzelsträngiger Form (D) und der komplementäre Strang, welcher mit dem Ziel (E) annealed ist. Die Menge des komplementären Strangs, welcher von dem massemarkierten Strang freigesetzt und mit dem Ziel annealed ist, ist proportional zu der Konzentration der Zielnukleinsäure. Nach dem Annealingverfahren werden die Sonden mit einem einzelstrangspezifischen chemischen Spaltungsmittel (F) behandelt, was eine gespaltene einzelsträngige Sonde (G) ergibt, und durch Massenspektrometrie nachgewiesen und quantifiziert (H). Wie bei anderen, hier beschriebenen massemarkierten Sonden kann die Massemarkierung vollständig oder nur teilweise in der Nukleinsäuresonde oder der reaktionsfähigen Gruppe enthalten sein, oder kann die Verwendung von Nukleinsäurenachahmungen umfassen.
  • 25 veranschaulicht die Verwendung von massemarkierten Substraten bei Enzym-gebundenen Affinitätsassays. Speziell veranschaulicht sind die Fälle, bei welchen das Zielmolekül (mit T bezeichnet) ein Protein (A) und eine Nukleinsäure (B) ist. In der Abbildung (A) wird ein Antikörper (mit Ab bezeichnet) verwendet, um das Festphasen-gebundene Ziel zu erkennen. Der Antikörper ist konjugiert mit dem Enzym (mit E bezeichnet), welches zur Signalerzeugung verwendet wird. In diesem bestimmten Affinitätsassay erkennt das Enzym ein Massemarkierungssubstrat (mit Mx bezeichnet) und wandelt es zu einem Produkt um, was in diesem Beispiel ein Spaltungsereignis unter Bildung von zwei Produkten ist (mit M und X bezeichnet), welche dann durch Massenspektrometrie analysiert werden. Im Hinblick auf die Massemarkierungssubstrate ist die Hauptanforderung die, dass das Enzym die Masse des Substrats modifiziert, wenn es zum Produkt umgewandelt wird, entweder durch Hinzufügen oder Entfernen von chemischen Anteilen von dem Substrat. In Abbildung (B) ist der Antikörper durch eine Nukleinsäuresonde ersetzt worden, welche dann mit dem signalerzeugenden Enzym konjugiert wird. Der Assay kann in großem Maße verallgemeinert werden und ein Fachmann ist in der Lage, eine Vielzahl von Kombinationen von Sonde und Ziel, ebenso wie Enzyme und massemarkierte Substrate zu bestimmen, welche verwendet werden können.
  • 26 veranschaulicht zwei Beispiele für Massemarkierungssubstrate zur Verwendung in Enzym-gebundenen Affinitätsassays. Insbesondere werden zwei Beispiele veranschaulicht, (A) ein doppelsträngiges Oligonukleotid, welches eine Restriktionsendonukleasestelle (mit R bezeichnet) enthält, und (B) ein Polypeptid, welches eine spezifische proteolytische Bindung enthält. In beiden Beispielen ist es möglich, ein Repertoire von Enzymen und Massemarkierungssubstraten zu entwickeln, da eine Vielzahl von Restriktionsendonukleasen und Proteasen existiert, welche entweder eine sequenzspezifische oder monomerspezifische Spaltungsaktivität aufweisen. Die Verwendung dieser Enzymklassen macht es möglich, dass eine Vielzahl von Affinitätsassays gleichzeitig innerhalb des gleichen Reaktionsgefäßes stattfinden. Alle erzeugen massendifferenzierbare Massemarkierungsprodukte. Wie bei anderen hierin beschriebenen massemarkierten Sonden kann die Massemarkierung vollständig oder nur teilweise in der Nukleinsäure oder dem Polypeptidsubstrat enthalten sein und kann die Verwendung von Nukleinsäurenachahmungen oder nicht natürlichen Aminosäuren umfassen.
  • Beschreibung von veranschaulichenden Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Zusammensetzung und Verwendung von freisetzbaren, nicht flüchtigen Massemarkierungen für eine chemische Analyse gerichtet. Die Massemarkierungen sind durch Massenspektrometrie nachweisbar. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch neue Verfahren, bei welchen Massemarkierungen in beliebiger Form verwendet werden. Der hierin verwendete Begriff nicht flüchtig bezieht sich auf ein Molekül, welches beim Vorliegen in reiner, sauberer Form und Erwärmen nicht in einem signifikanten Ausmaß intakt sublimiert. In der Definition von nicht flüchtigen Verbindungen sind auch Verbindungen enthalten, welche beim Vorliegen in deren reiner sauberer Form durch Massenspektrometrie nicht praktisch analysiert werden, wenn bei dem Probenverfahren eine konventionelle Gaschromatographie verwendet wird. Ein Vorteil bei der Verwendung von nicht flüchtigen Massemarkierungen gegenüber flüchtigen Massemarkierungen ist der, dass die Probengemische dabei nach der Freisetzung leicht physikalisch stabil sind. Die beschriebenen Massemarkierungen können mit einem Sondenmolekül verbunden sein, welches mit dem vorgesehenen Ziel spezifisch wechselwirken kann. In einigen Fällen kann eine spezielle Release-Gruppe enthalten sein, um die Massemarkierung mit der Sonde chemisch zu verbinden.
  • Es ist auch möglich, Massemarkierungen zu verwenden, welche bei Raumtemperatur einen vernachlässigbaren Dampfdruck aufweisen, welche aber durch die obige Definition als flüchtig betrachtet werden kann. In der vorliegenden Arbeit verdampfen die neue Massemarkierungen, welche von dem Sondenmolekül freigesetzt werden, bei Raumtemperatur in unbedeutendem Ausmaß, wenn überhaupt, und sie sind keine effizienten Elektrophore. Moleküle, welche in diese Kategorie fallen, werden "involatile" Massemarkierungen genannt.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind verwendbar zum Nachweis einer breiten Vielfalt von biomolekularen Wechselwirkungen. Repräsentative Beispiele umfassen die Identifizierung von Gensequenzen, die Identifizierung von nicht codierenden Nukleotidsequenzen, die Identifizierung von Mutationen innerhalb eines Gens oder einer Proteinsequenz, den Nachweis von Metallen, den Nachweis von Toxinen, den Nachweis von Rezeptoren bei einem Organismus oder einer Zelle, die Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen und die Charakterisierung von Liganden-Wechselwirkungen.
  • A. Massemarkierungen
  • Massemarkierung ist ein Begriff, welcher synonym mit Tag oder Signal verwendet werden kann. Beispiele für die Arten von Massemarkierungen für die vorliegende Erfindung umfassen ein Repertoire von Verbindungen, bevorzugt Verbindungen, welche ähnliche massenspektrometrische Desorptionseigenschaften teilen und ähnliche oder identische Kopplungschemien aufweisen, um die Synthese von mehreren Massemarkierungsvarianten zu vereinfachen. Eine erfindungsgemäße Massemarkierung ist durch Massenspektrometrie nachweisbar. Repräsentative Arten von Massenspektrometrietechniken umfassen Matrix-unterstütze Laserdesoprtion-Ionisierung, direkte Laserdesorption, Elektrospray-Ionisierung, Sekundär-Neutralteilchen-Massenspektrometrie und Sekundärionen-Massenspektrometrie, wobei die Laserdesorption-Ionisierung bevorzugt ist. Der dynamische Bereich von Massenspektrummessungen kann im Allgemeinen ausgedehnt werden durch die Verwendung eines logarithmischen Verstärkers und/oder einer variablen Dämpfung bei der Bearbeitung und Analyse des Signals. Ein Beispiel für ein Peptidgemisch, welches durch Massenspektrometrie getrennt wird, ist in 13 gezeigt.
  • Massemarkierungen können eine riesige Anzahl von unterschiedlichen Arten von Verbindungen umfassen, einschließlich Biopolymere und synthetische Polymere. Repräsentative biologische Monomereinheiten, welche als Massemarkierungen verwendet werden können, entweder einzeln oder in polymerer Form, umfassen Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren, Nukleinsäuren, Saccharide, Kohlenhydrate, Peptidnachahmungen und Nukleinsäurenachahmungen. Bevorzugte Aminosäuren umfassen diejenigen mit einfachen aliphatischen Seitenketten (z.B. Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin), Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten (z.B. Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin und Histidin), Aminosäuren mit Sauerstoff- und Schwefel-haltigen Seitenketten (z.B. Serin, Threonin, Methionin und Cystein), Aminosäuren mit Seitengruppen, welche Carboxyl- oder Amidgruppen enthalten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin und Glutamin) und Aminosäuren mit Seitenketten, welche starke basische Gruppen enthalten (z.B. Lysin und Arginin) und Prolin. Derivate der oben beschriebenen Aminosäuren sind auch als Monomereinheiten vorgesehen. Ein Aminosäurederivat, wie hierin verwendet, ist eine beliebige Verbindung, welche in ihrer Struktur den Grundaminosäurekern einer α-Amino-substituierten Carbonsäure enthält, wobei repräsentative Beispiele Azaserin, Fluoralanin, GABA, Ornithin, Norleucin und Cycloserin umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Peptide, welche von den oben beschriebenen Aminosäuren abgeleitet sind, können auch als Monomereinheiten verwendet werden. Repräsentative Beispiele umfassen sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Peptide mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 500 Dalton, wobei Peptide mit etwa 500 bis 5000 Dalton bevorzugt sind. Repräsentative Beispiele von Sacchariden umfassen Ribose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose und andere Zuckerderivate, welche aus Ketten von 2–7 Kohlenstoffen zusammengesetzt sind. Repräsentative Polysaccharide umfassen Kombinationen der oben beschriebenen Saccharideinheiten, verbunden über eine Glykosidbindung. Die Sequenz der Polymereinheiten innerhalb einer beliebigen Massemarkierung ist nicht entscheidend, die Gesamtmasse ist das Hauptmerkmal der Markierung.
  • Die erfindungsgemäßen Monomereinheiten können auch aus Nukleobasenverbindungen zusammengesetzt sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff Nukleobase auf einen beliebigen Anteil, welcher in seiner Struktur ein Purin, ein Pyrimidin, eine Nukleinsäure, ein Nukleosid, ein Nukleotid oder Derivat von einem von diesen umfasst, wie etwa eine geschützte Nukleobase, ein Purinanalogon, ein Pyrimidinanalogon, ein Folinsäureanalogon, Methylphosphonatderivate, Phosphotriesterderivate, Boranphosphatderivate bzw. Boranphosphatderivate oder Phosphorthioatderivate.
  • Erfindungsgemäße Massemarkierungen können auch ein beliebiges organisches oder anorganisches Polymer enthalten, welches einen definierten Massewert aufweist, während Bioassays wasserlöslich bleibt und durch Massenspektrometrie nachweisbar ist. Repräsentative synthetische Monomereinheiten, welche als Masseeinheiten in polymerer Form verwendet werden können, umfassen Polyethylenglykole, Polyvinylphenole, Polymethylmethacrylate, Polypropylenglykol, Polypyrole und Derivate davon. Eine breite Vielfalt von Polymeren ist für einen Fachmann leicht erhältlich auf Grundlage von Referenzen, wie etwa Allcock et al. (1981), welcher die Eigenschaften von vielen weiteren Polymeren beschreibt, welche für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind. Die Polymere können aus einer einzigen Art einer Monomereinheit oder Kombinationen von Monomereinheiten zusammengesetzt sein, wobei ein gemischtes Polymer erzeugt wird. Die Sequenz der polymeren Einheiten innerhalb jeder Massemarkierung ist nicht entscheidend, das Hauptmerkmal der Markierung ist die Gesamtmasse.
  • Für nicht flüchtige Massemarkierungen mit einer Masse von weniger als etwa 500 Dalton ist normalerweise ein signifikanter ionischer Charakter erforderlich, repräsentative Beispiele umfassen Polyethylenglykololigomere von quaternären Ammoniumsalzen (z.B. R-(O-CH2-CH2)n-N(CH3)3 +·Cl–) und Polyethylenglykololigomere von Carbonsäuren und Salzen (z.B. R-(O-CH2-CH2)n-CO2 –·Na+).
  • Beispiele für involatile Massemarkierungen umfassen normalerweise kleine Oligomere von Polyethylenglykol und kleine Peptide (natürlich oder modifizeirt) mit weniger als etwa 500 Dalton Molekulargewicht. In diesen Fällen erfolgt, wie für alle die hierin beschriebenen Fälle, eine Massenanalyse nicht durch Elektronenanlagerung.
  • Massemarkierungen der vorliegenden Erfindung können auch eine Vielzahl von nicht flüchtigen organischen und involatilen Verbindungen umfassen, welche nicht polymer sind. Repräsentative Beispiele für nicht flüchtige organische Verbin dungen umfassen Hämgruppen, Farbstoffe, Organometallverbindungen, Steroide, Fullerene, Retinoide, Carotinoide und polyaromatische Kohlenwasserstoffe.
  • Neben den beschriebenen Polymermassemarkierungen und gemischten Polymermassemarkierungen umfassen die Massemarkierungen der vorliegenden Erfindung auch gemischte Massemarkierungen, welche einen polymeren Bestandteil mit variabler Masse und einen nicht polymeren Bestandteil mit feststehender Masse enthalten. Ein repräsentatives Beispiel umfasst eine Reihe von Massemarkierungen mit einem polymeren Bestandteil, wobei die Anzahl der Wiederholungseinheiten innerhalb der Gruppe im Bereich von etwa 10 bis 100 liegt und wobei an jedem Polymer eine Verbindung mit einer festen großen Masse ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Massemarkierungen innerhalb einer Gruppe den gleichen Bestandteil mit feststehender Masse. In dieser bevorzugten Gruppe von Verbindungen wird nur die Länge des Polymers verändert, um eine Gruppe von Massemarkierungen bereitzustellen mit einem schrittweisen Anstieg der Masse und einem relativ einheitlichen Signal zwischen den Massemarkierungen. Diese Verbindungen stellen ein Mittel bereit zur Verwendung von Massemarkierungen mit gewünschten Spektraleigenschaften, sind jedoch nicht in einem großen Repertoire von unterschiedlichen Massen verfügbar.
  • Bei der Verwendung von mehreren Massemarkierungen an einer Sonde ist es bevorzugt, eine Überlappung des Signals zu vermeiden. Neben der Präsentation eines großen Primärsignals für eine Massemarkierung mit einer Einzelladung besteht auch das Potenzial für mehrfach geladene Versionen einer Massemarkierung, ein Signal ebenso wie dimerisierte Versionen der Massemarkierung zu präsentieren. Das Vorliegenden von mehreren Signalen für eine einzige Massemarkierung kann potenziell mit dem Signal für den Primärpeak einer zweiten Massemarkierung überlappen und dieses Signal verdecken. Normalerweise kann folglich der Bereich der verwendeten Massemarkierungen, welche für eine bestimmte Analyse verwendet werden, einen Massebereich aufweisen, wobei keine mehrfach geladenen oder Dimer-Spezies den Nachweis aller Massemarkierungen stören kann, beispielsweise können die Massemarkierungen einen Massebereich aufweisen, worin die kleinste Massemarkierung mehr als die Hälfte der Masse der größten Massemarkierung beträgt.
  • B. Reaktionsfähige Gruppen
  • Die Massemarkierung ist normalerweise mit einer reaktionsfähigen Gruppe verbunden. Die reaktionsfähigen Gruppen der vorliegenden Erfindung können ein beliebiges Biomolekül sein, welches zu einer speziellen molekularen Erkennung fähig ist. Insbesondere kann die reaktionsfähige Gruppe eine spezielle Wechselwirkung mit dem Zielmolekül ausbilden. Die Wechselwirkung kann nicht kovalent oder kovalent sein, wie etwa eine Vernetzung. Repräsentative reaktionsfähige Gruppen der vorliegenden Erfindung umfassen Polypeptide, Antikörper, Enzyme, Lipide, Steroide, Antibiotika und Verbindungen, wie etwa Neocarzinostatin, welche eine Präferenz für bestimmte DNA-Sequenzen aufweisen. Repräsentative Steroidhormone umfassen Östrogene, Progestine und Androgene.
  • Repräsentative Wechselwirkungen zwischen reaktionsfähiger Gruppe und Zielmolekül umfassen Wechselwirkungen von Enzym-Substrat oder Substratanalogon/Zwischenprodukt, Wechselwirkungen von Polypeptid-Nukleinsäure, Wechselwirkungen von Protein-Ligand, Wechselwirkungen von Rezeptor-Ligand, Wechselwirkungen von Lipid-Lipid, Wechselwirkungen von Polypeptid-Metall oder Wechselwirkungen von Antigen-Antikörper.
  • Repräsentative Beispiele einer kovalenten Wechselwirkung zwischen einer reaktionsfähigen Gruppe und einem Ziel umfassen Proteine als reaktionsfähige Gruppen, aktiviert mit Vernetzungsmitteln, um Konjugate mit dem Zielmolekül zu bilden, wie etwa Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, Rezeptor-Membran-Wechselwirkungen oder eine Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung. Repräsentative Vernetzungsmittel umfassen chemisch aktivierte Vernetzungsmittel, wie etwa EDC oder MBS und photoreaktionsfähige Vernetzungsmittel wie etwa SADP oder PNP-DTP.
  • C. Verfahren zur Freisetzung der Massemarkierung
  • Bei einigen Ausführungsformen kann es wichtig sein, die Massemarkierung von allen oder den meisten der reaktionsfähigen Gruppen vor einer spektrometrischen Analyse freizusetzen, wie in 11 für eine massemarkierte Nukleinsäureprobe dargestellt wird. Aus diesem Grund ist eine Release-Gruppe erwünscht. Eine Vielzahl von Mitteln kann die Freisetzung bewirken, einschließlich einer labilen chemischen Bindung zwischen der Massemarkierung und der reaktionsfähigen Gruppe. Wie hierin verwendet, ist eine labile chemische Verbindung ein beliebiger Anteil, welcher bei Behandlung mit einem zweiten chemischen Mittel, Licht, einem Enzym oder Wärme den Anteil spaltet und die Massemarkierung freisetzt. Diese Bindungen können eine Bindung durch chemisch spaltbare Gruppen umfassen, welche in das Phosphatgerüst eingefügt sind (z.B. Ersatz von Phosphat durch ein Phosphoramidat) oder als ein Substituent an einer der Basen oder Zucker des Oligonukleotidprimers eingefügt sind oder eine der Basen oder einen der Zucker des Oligonukleotidprimers ersetzen (z.B. eine modifizierte Base oder ein Zucker, wie etwa eine labilere Glykosidbindung). Solche chemisch spaltbaren Gruppen sind für einen Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung offensichtlich und umfassen beispielsweise Dialkoxysilan, 3'-(S)-Phosphorthioat, 5'-(S)-Phosphorthioat, 3'-(N)-Phosphoramidat, 5'-(N)-Phosphoramidat und Ribose. Experimentell ist auch gefunden worden, dass solche Gruppen viel schneller gespalten werden, wenn die Sonde in einzelsträngiger Form vorliegt, als wenn sie mit einem komplementären Strang hybridisiert ist. Ein Beispiel für diese kinetische Selektivität wird im Beispiel 9 gezeigt. Die chemisch spaltbare Stelle sollte im Allgemeinen unter den zu verwendenden Bedingungen von Amplifikation, Hybridisierung und Waschen stabil sein. Andere Beispiele für labile chemische Linker bestehen aus Gruppen, welche durch Oxidation spaltbar sind, wie etwa Dialkyltartrat, durch Basen spaltbare Gruppen, wie etwa Bis[2-(alkoxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Silylether und Ketale, welche bei Behandlung mit einem Fluoridion oder einer Säure gespalten werden, Orthonitrobenzylether, welche bei Bestrahlung mit Licht gespalten werden und Gruppen, welche durch Reduktion spaltbar sind, wie etwa Dialkydisulfide.
  • Eine bevorzugte labile chemische Bindung umfasst eine Disulfidbindung, welche bei Behandlung mit einem Sulfhydrylreagenz, wie etwa 2-Mercaptoethanol, die Disulfidbindung in zwei -SH-Gruppen reduziert. Bei Massemarkierungen, welche chemisch von Sonden gespalten werden, kann es bevorzugt sein, alle Monomere der nicht eingefügten reaktionsfähigen Gruppe wegzuwaschen, sodass sie im Massenspektrometer nicht sichtbar gemacht werden.
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden jedoch keine weiteren Bindungsgruppe benötigt, da die Release-Gruppe in der reaktionsfähigen Gruppe enthalten sein kann. Deshalb kann die freigesetzte Massemarkierung keine, einen Teil oder das Gesamte der reaktionsfähigen Gruppe enthalten, noch immer angeheftet an die spezifische Massemarkierung. Repräsentative Beispiele für Release-Gruppen, welche innerhalb einer reaktionsfähigen Gruppe enthalten sind, umfassen die endogenen Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in einem Polypeptid und die endogenen Verbindungen der Phosphodiesterbindung zwischen Basen in einem Polynukleotid. Diese endogenen Bindungen können auch modifiziert werden, um eine spezifische Sequenz innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe anzusteuern. Beispiele umfassen modifizierte Phosphodiesterbindungen, wie etwa Phosphorthioate, Phosphoramidate und Dialkylsilylketale. Nukleotidsequenzen können auch zur Erkennung durch eine Endonuklease (Restriktionsenzym) eingebracht werden, wie etwa durch Restriktionsendonukleasen des Typs II oder des Typs IIS. In bestimmten Ausführungsformen ist eine Phosphodiesterbindung die Release-Gruppe, erkannt durch ein Exonukleaseenzym. Eine temperaturlabile Freisetzung ist auch vorgesehen. Repräsentative Beispiele umfassen thermisches Schmelzen eines hybridisierten Oligonukleotids von einem DNA-Ziel oder eine temperaturabhängige Denaturierung eines Proteins, um ein gebundenes Molekül freizusetzen.
  • Es können auch spezifische Peptidbindungen in eine reaktionsfähige Polypeptidgruppe eingebracht werden. Beispiele umfassen Peptidbindungen, welche spezifisch durch Chemikalien gespalten werden, wie etwa ein Methionin, welches durch CNBr erkannt wird, oder Tryptophan, welches entweder durch Iodosobenzoesäure oder BNPS-Skatol gespalten werden kann. Peptidbindungen können auch zur Erkennung durch ein Enzym, wie etwa Trypsin, eingebracht werden.
  • Ein weiteres Beispiel für endogene Bindungen als Freisetzungsgruppen umfasst eine chemische oder enzymatische Spaltung an einer Glykosidbindung. Ein Fachmann erkennt, dass innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eine breite Vielfalt von Ansätzen für eine Freisetzung vorliegt.
  • D. Selektive Freisetzung von Massemarkierungen
  • In einigen der hierin beschriebenen Ausführungsformen, bei welchen die Verwendung von einer oder mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuresonden einbezogen wird, kann die Verwendung von massemarkierten Nukleinsäuresonden von der selektiven Freisetzung bestimmter Massemarkierungen in Abhängigkeit vom Auftreten eines bestimmten Ereignisses abhängen. Beispielsweise kann die Freisetzung einer Massemarkierung anzeigen, dass ein Hybridisierungsereignis zwischen einer bestimmten massemarkierten Nukleinsäuresonde und einer Nukleinsäurezielsequenz aufgetreten ist. Ein Ansatz zur selektiven Freisetzung kann einen gerichteten Nukleaseverdau nur von hybridisierten Sonden betreffen, welche in einer doppelsträngigen Form vorliegen, wie in 12 gezeigt ist. Eine Anzahl von Nukleasen, beispielsweise Restriktionsendonukleasen und DNase I verdauen nur doppelsträngige Nukleinsäuren. Folglich setzt die Behandlung mit solchen Enzymen nur Massemarkierungen aus Nukleinsäuresonden frei, welche erfolgreich mit einer Zielsequenz hybridisiert haben. Als eine Alternative kann eine Nuklease verwendet werden, welche nur eine in einzelsträngiger Form vorliegende Nukleinsäuresequenz erkennt, einschließlich S1-Nuklease, um Signal- und Identitätsdaten für Sonden zu erhalten, welche keine Hybridisierung durchlaufen.
  • Die Verwendung einer Hybridisierungssonde von mindestens etwa 10–14 Nukleotiden Länge ermöglicht die Bildung eines Duplexmoleküls, welches sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, welche benachbarte komplementäre Sequenzen über Strecken von mehr als 10 Basen Länge aufweisen, können verwendet werden, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen. Man wird es im Allgemeinen vorziehen, Nukleinsäuremoleküle mit komplementären Strecken von etwa 15 bis etwa 20 benachbarten Nukleotiden zu gestalten, oder sogar länger, falls gewünscht. Beispielsweise kann es bevorzugt sein, Nukleinsäuremoleküle mit etwa 25, etwa 30, etwa 35, etwa 40, etwa 45 oder etwa 50 benachbarten Nukleotiden usw. zu gestalten. In diesem Zusammenhang besagt der Begriff "etwa", dass das Nukleinsäuremolekül von der angegebenen Länge um 1 bis 4 Nukleotide variieren kann. Beispielsweise ist "ungefähr 25" so zu verstehen, dass 21, 22, 23 und 24 umfasst sind, "etwa 30" ist so zu verstehen, dass 26, 27, 28 und 29 umfasst sind, "etwa 35" ist so zu verstehen, dass 31, 32, 33 und 34 umfasst sind und so weiter.
  • Hybridisierungssonden können aus einem beliebigen Teil einer Zielsequenz ausgewählt werden. Die Wahl von Sonde und Primersequenzen kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, beispielsweise kann man, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Primer von Regionen nahe den Termini der Gesamtsequenz verwenden, oder von den Enden der für die funktionelle Domäne codierenden Sequenzen oder man kann Sonden verwenden, welche der gesamten DNA entsprechen. Es können Sonden entworfen werden, um homologe Gene zwischen Spezies einschließlich dem Menschen zu identifizieren, oder man kann Wildtyp- und Mutantensonden oder Primer mit Sequenzen verwenden, welche so gestaltet sind, dass humane oder nicht humane Patienten identifiziert werden, welche eine bestimmte Mutation tragen und somit für eine Erkrankung oder ein pharmazeutisches Mittel empfänglich sind.
  • Variable Parameter bei der Hybridisierung umfassen Temperatur, Zeit, Salzkonzentration und Formamidkonzentration. Hybridisierung bedeutet die Bildung von stabilen, antiparallelen Duplexmolekülen, basierend auf der spezifischen Wasserstoffbindung von komplementären Nukleotidbasen der Nukleinsäuremoleküle.
  • Die Tendenz zweier komplementärer Nukleinsäurestränge in Lösung, durch Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen deren komplementären Basen, sich anzulagern oder zu hybridisieren, ist in entscheidender Weise abhängig von der Konzentration der monovalenten oder bivalenten Kationen in der Lösung. Natrium (Na+) war das Kation der Wahl zur Bestimmung der Wirkungen der Salzkonzentration auf die Stabilität von Duplexnukleinsäuren. Oberhalb von einer Na+-Schwellenkonzentration bilden zwei komplementäre Einzelstränge (entweder DNA oder RNA) eine Wasserstoffbindung durch die Wechselwirkung der Basen in jedem Strang, unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls von DNA, RNA oder sogar eines DNA-RNA-Heteroduplex. Komplementäre Basen sind Adenosin (A) und Thymidin (T) (bei DNA) oder Adenosin und Uridin (U) (bei RNA) und Cytosin (C) und Guanin (G) sowohl in DNA als auch in RNA. Zwischen gepaarten A- und T- oder A- und U-Resten werden zwei Wasserstoffbindungen gebildet, während eine C-G-Basenpaarung die Bildung von drei Wasserstoffbindungen ergibt. Deshalb ist die G-C-Basenpaarung eine stärkere Wechselwirkung als die A-U- oder A-T-Basenpaarung. Im Allgemeinen kommt zwischen nicht komplementären Basen keine Wasserstoffbindung vor (welche zur Duplexbildung führt). Die Fähigkeit von zwei Einzelsträngen, ein stabiles doppelsträngiges Duplex zu bilden, hängt von der Sequenz der Basen in jedem Strang ab, welche zueinander komplementär sind, sodass bei einer Orientierung der Stränge in einer antiparallelen Richtung aufeinanderfolgende angrenzende Basen Wasserstoff-bindungen bilden können. Obwohl die Wasserstoffbindung zwischen zwei beliebigen komplementären Basen nur eine schwache Bindungsenergie bereitstellt, stellt die kumulative Bindungsenergie zwischen vielen aufeinanderfolgenden gepaarten Basen ausreichende Anziehungskräfte bereit, um die Stränge zusammen in einem stabilen Duplex zu halten. Durch Maskierung der negativen Ladungen der Phosphatgruppen in den Phosphodiesterbindungen, welche das "Gerüst" eines Nukleinsäurestrangs bilden, verstärken Kationen die Tendenz bei komplementären Strängen, Wasserstoffbrücken zu bilden. Bei geringen Konzentrationen von positiv geladenen Ionen begünstigen abstoßende Kräfte zwischen negativ geladenen Strängen deren einzelsträngige oder denaturierte Konformation, wenn die Kationenkonzentration angehoben wird, werden die negativen Ladungen maskiert, komplementäre Basen paaren durch Wasserstoffbindungen und es wird ein Duplexnukleinsäuremolekül gebildet. In einem Duplex mit einem fehlgepaarten (nicht komplementären) Basenpaar stellt die einzelne nicht gepaarte Position in den beiden im Übrigen komplementären Strängen das Ziel für die einzelstrang-spezfische RNase in dem RNase-Protection-Assay bereit.
  • Neben der Kationenkonzentration beeinflussen andere Parameter die Tendenz der komplementären Stränge, in den alternativen doppelsträngigen oder einzelsträngigen Konformationen vorzuliegen. Die Temperatur ist eine kritische Variable, wenn die Temperatur einer Lösung von Duplexnukleinsäuremolekülen erhöht wird, werden Wasserstoffbindungen zuerst in A-U-reichen Regionen und schließlich in G-C-reichen Regionen aufgebrochen, bis oberhalb einer kritischen Temperatur die komplementären Stränge auseinander fallen. Die Zusammensetzung der zwei Stränge, d.h. deren prozentualer G-C-Gehalt, bestimmt die kritische Temperatur für die Duplexdenaturierung bei einer bestimmten Ionenstärke. Als Folge davon bestimmen die GC-Prozente auch die Schwellenkonzentration an Na+, welches zur Aufrechterhaltung der Duplexstabilität bei einer bestimmten Temperatur benötigt wird. Die Stabilität von Duplexnukleinsäuremolekülen in Lösung wird auch durch die Natur des Lösungsmittels beeinflusst. Beispielsweise sind Duplexe in Formamid (welches Wasserstoffbrücken destabilisiert) weniger stabil als in einer wässrigen Lösung, eine Tatsache, welche von Molekularbiologen ausgenutzt wird, um eine Nukleinsäurehybridisierung bei geringeren Temperaturen zu erreichen als die Temperaturen, welche anderenfalls erforderlich wären.
  • Es sind Gleichungen abgeleitet worden, um die Duplexbildung auf die Hauptvariablen Temperatur, Salzkonzentration, Nukleinsäurestranglänge und -zusammensetzung und Formamidkonzentration zu beziehen.
  • Gleichung:
    • Tm = 81,5 – 16,6(log[Na+]) + 0,41(%GC) – 600/N 1.(Tm = Temperatur, bei welcher der Duplex zur Hälfte denaturiert; N = Kettenlänge) Tm = 81,5 – 16,6(log[Na+] + 0,41(%CG) – 0,63 (%Formamid) – 600/N 1.
  • Man kann folglich vorhersagen, ob komplementäre Stränge unter bestimmten Bedingungen in doppelsträngiger oder in einzelsträngiger Form vorliegen. Wenn die Bedingungen so gewählt werden, dass komplementäre Stränge einen stabilen Duplex bilden, ist der Duplex theoretisch resistent gegenüber der nukleolytischen Wirkung von Enzymen (DNasen und RNasen), welche für die Spaltung von Phosphodiesterbindungen in einzelsträngigen Molekülen spezifisch sind. Es existieren unterschiedliche Arten von Nukleasen, welche hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten in großem Maß variieren. Die in Rnase-Protection-Assays normalerweise verwendeten RNasen sind spezifisch für die Spaltung nach bestimmten Basen in einzelsträngigen RNA-Molekülen. Unterhalb der Na+-Schwellenkonzentration, welche zum Aufrechterhalten der Duplexstabilität benötigt wird, denaturieren komplementäre RNA-Stränge in Einzelstränge, welche dann Substrate für den Abbau durch die RNasen darstellen. Die Empfänglichkeit gegenüber einem Verdau durch RNase A ist deshalb ein funktioneller Assay dafür, ob komplementäre Stränge als einzelsträngige oder doppelsträngige Moleküle vorliegen.
  • Hybridisierung
  • Standardverfahren zum Annealing oder zur Hybridisierung werden von Sambrook et al. (1989) beschrieben. Im Allgemeinen ist es erforderlich, dass zwei oder mehr Nukleinsäuren, beispielsweise Sonden- und Testprobenukleinsäure zusammengemischt, denaturiert werden und dann Bedingungen unterworfen werden, bei welchen komplementäre Stränge annealen oder Basen durch Wasserstoffbrücken unter Bildung von Doppelsträngen paaren. Die angelagerten bzw. annealten Stränge werden als hybridisiert bezeichnet. Beispielsweise kann das Gemisch für etwa 3 Minuten auf etwa 90°C bis etwa 95°C erwärmt werden und dann schrittweise auf eine geringere Temperatur, beispielsweise 42°C, für einen Zeitraum abgekühlt werden, welcher ausreicht, damit eine Wasserstoffbindung der komplementären Stränge auftritt. Die für das Annealing von komplementären Strängen erforderliche Zeit hängt von der Konzentration jedes Strangs ab und variiert von wenigen Minuten (bei Reaktionen, bei welchen sowohl Sonden- als auch Testnukleinsäure in hohen Konzentrationen vorliegen) bis zu mehreren Stunden oder über Nacht bei Reaktionen, bei welchen mindestens eine Spezies mit geringer Konzentration vorliegt. Deshalb ist es vorteilhaft, von Sonden- und Testprobenukleinsäure hohe Konzentrationen zu verwenden, wie sie etwa durch eine PCR-Amplifikation und/oder Transkription von durch PCR amplifizierten Sequenzen erzeugt werden können.
  • In Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung kann man unterschiedliche Bedingungen der Hybridisierung anwenden, um unterschiedliche Grade der Selektivität der Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erreichen. Bei Anwendungen, welche eine hohe Selektivität erfordern, kann man normalerweise relativ stringente Bedingungen zur Hybridbildung verwenden, z.B. Bedingungen mit wenig Salz und/oder einer hohen Temperatur, beispielsweise bereitgestellt durch 0,02 M–0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C. Solche selektive Bedingungen tolerieren wenig Fehlpaarungen, falls überhaupt, zwischen der Sonde und dem Templat oder Zielstrang.
  • Natürlich können bei einigen Anwendungen normalerweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, um den Heteroduplex zu bilden, beispielsweise wenn man Mutanten identifizieren möchte, unter Verwendung eines Mutantenprimerstrangs, hybridisiert mit einem zugrundeligenden Templat, oder wenn man für ein Protein codierende Sequenzen von verwandten Spezies, funktionelle Äquivalente oder dergleichen isolieren möchte. Unter diesen Umständen kann man mildere Hybridisierungsbedingungen verwenden, wie etwa 0,15 M–0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von 20°C bis 55°C. Dabei können kreuzhybridisierende Spezies leicht als positive Hybridisierungssignale bezogen auf auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. Außerdem können die Bedingungen stringenter gemacht werden durch Zugabe von steigenden Mengen von Formamid, welches dazu dient, den Hybridduplex auf die gleiche Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erreichen.
  • Verfahren zur Freisetzung
  • Die Verwendung von Nukleasen, welche massemarkierte Nukleinsäuresonden, welche mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert sind, selektiv verdauen, ermöglicht eine lineare Amplifikation eines Signals. Beispielsweise kann man eine Nuklease verwenden, welche in der Lage ist, nur die Nukleinsäuresonde und nicht das Ziel zu verdauen, z.B. eine doppelstrangspezifische Exonuklease, zum Verdau einer kurzen linearen Sonde in Gegenwart eines zirkulären Ziels ohne Ende verwenden, um den Start eines Exonukleaseverdaus zu ermöglichen. Lange lineare Ziele können auch verwendet werden in Fällen, bei welchen die Exonuklease ein zurückgesetztes oder klebriges doppelsträngiges Ende benötigt. Wenn eine Sonde mit dem Ziel hybridisiert, wird sie verdaut und die verdauten Fragmente spalten sich von dem Ziel ab und machen Platz für eine zweite Kopie der zu hybridisierenden Sonde. Die zweite Sonde wird dann verdaut und erneut ist das Ziel frei für die nächste Hybridisierung. Die wiederholten Zyklen von Hybridisierung und Verdau führen zu einer linearen Amplifikation der Menge der freigesetzten Massemarkierung in Lösung, wodurch folglich das massenspektrometrische Signal verstärkt wird. Es ist möglich, unter Verwendung solch eines Systems die Amplifikation eines Signals um das Vielhunderfache zu verstärken. Siehe Okano und Kambara, 1995 (Exonuklease III), Copley und Boot, 1992 (Lambda-Exonuklease).
  • Nicht selektive Freisetzungsereignisse können auch verwendet werden bei den hierin offenbarten Verfahren. Beispielsweise kann eine nicht selektive Spaltung einer Disulfid-Freisetzungsgruppe unter Verwendung eines chemischen Mittels, wie etwa eines Phosphins oder eines Mercaptans, verwendet werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann der Nachweis der gewünschten Markierung von einer spezifischen Unterteilung der Population von reaktionsfähigen Gruppen oder Zielen abhängen. Reaktionsfähige Gruppen, welche ein bestimmtes Ziel erkennen und daran binden, können beispielsweise an einem spezifischen Ort immobilisiert werden. Beispielsweise kann eine Zielsequenz oder Sequenzen von Nukleinsäuren mit gitterförmigen Positionen an einem festen Träger verbunden werden, wie etwa einem Filter, Glas, Gold, oder an einem Bead oder einer Gruppe von Beads. Massemarkierte Oligonukleotide (Sonden), welche nicht mit der Zielsequenz hybridisieren, können dann durch einfaches Waschen des Filters oder der Beads von den Sonden abgetrennt werden, welche mit den immobilisierten Zielen hybridisieren. Solche Ansätze können besonders bevorzugt sein bei der Entfernung von nicht hybridisierten Sonden, wobei ein nachfolgender nicht spezifischer Freisetzungsmechanismus verwendet werden soll. Es kann auch der umgekehrte Fall angewendet werden, bei welchem die markierten Sonden immobilisiert werden und die Ziele mit diesen hybridisiert werden.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren können die Verwendung eines Nukleinsäureamplifikationsereignisses einschließen, wie etwa eine Polymerasekettenreaktion (als PCRTM bezeichnet), um eine massemarkierte Nukleinsäuresonde, welche insbesondere als Primer verwendet wird, mit einem zweiten Primer zu verbinden, welcher an einen festen Träger gebunden werden kann oder zu diesem Zeitpunkt an einen festen Träger gebunden ist. Ein Beispiel für einen zweiten Primer ist ein Primer, welcher einen Biotinanteil enthält. Ähnlich wie bei der oben beschriebenen Ausführungsform bietet die Bindung des Amplifikationsprodukts an die feste Phase einen Mechanismus, um nicht verwendete Primer abzuwaschen und dann die restlichen Massemarkierungen nicht selektiv freizusetzen.
  • Es kann auch ein Nukleinsäureamplifikationsereignis verwendet werden, welches die Verwendung von einer oder mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuresonden umfasst, um massemarkierte Nukleinsäuresonden, welche spezifisch als ein Primer verwendet werden, aus der einzelsträngigen Form in die doppelsträngige Form umzuwandeln. Diese Umwandlung ermöglicht die Verwendung einer doppelstrangspezifischen Nuklease, um nur diejenigen Massemarkierungen selektiv freizusetzen, welche mit Primern verbunden sind, welche in die Amplifikationsereignisse involviert sind. Nicht verwendete Primer bleiben einzelsträngig und setzen deren gebundene Massemarkierungen nicht frei.
  • Andere hierin als ein Teil der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren, welche die Verwendung von einer oder mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuresonden umfassen, können die Modifikation einer ausgewählten Population von Sonden nach deren Hybridisierung mit einem Ziel betreffen, was die Aufteilung der Sondenpopulation ermöglicht. Solche Verfahren umfassen eine Doppelstrang-abhängige Addition von biotinylierten Nukleotiden oder Oligonukleotiden an das Ende von massemarkierten Sonden unter Verwendung von Polymerase oder Ligase, gefolgt von einem direkten Einfangen der biotinylierten Sonden von einer mit Streptavidin modifizierten Fläche.
  • Als eine andere Option kann die Analyse von massemarkierten Nukleinsäuresonden durch MALDI-Massenspektrometrie unter Verwendung einer Matrix durchgeführt werden, welche intakt freigesetzte Massemarkierungen, selektiv desorbiert und effektiv ionisiert, nicht jedoch Massemarkierungen, welche noch immer an deren entsprechende Nukleinsäuresonden gekoppelt sind. Nukleinsäuremoleküle desorbieren bei vielen Matrizes, welche für die Desorption von freigesetzten Massemarkierungen bisher effektiv sind, oft nicht gut, und dieser Unterschied kann hervorgehoben werden durch die Gegenwart von Verunreinigungen, wie etwa Salzen. Massemarkierte Nukleinsäuresonden können normalerweise ohne eine weitere Reinigung durch direkte Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert werden, wenn beispielsweise die freigesetzte(n) Massemarkierung(en) viel effizienter nachgewiesen werden als nicht freigesetzte Markierungen. Das gleiche bewahrheitet sich für andere Formen der Massenspektrometrie. In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von Laserdesorptions-Massenspektrometrie muss folglich eine physische Aufteilung der freigesetzten und nicht freigesetzten Massemarkierungen nicht erforderlich sein. Ein Fachmann kann sich angesichts der vorliegenden Offenbarung die Verwendung einer Vielzahl von anderen Verfahren vorstellen, um Proben selektiv aufzuteilen, welche die Synthese der Probenmarkierung, die Freisetzung der Markierung und den Massenspektralnachweis der Markierung betreffen, in unterschiedlichen Kombinationen.
  • E. Syntheseverfahren
  • Massemarkierungen können zu der reaktionsfähigen Gruppe während der Synthese hinzugefügt werden, oder die reaktionsfähige Gruppe kann nach der Synthese modifiziert werden. Beispielsweise stellt die Modifikation von Nukleinsäure- oder Aminosäurebausteinen einen bequemen Weg bereit zur Entwicklung von allgemeinen Verfahren für die Massemarkierung reaktionsfähiger Gruppen während der Synthese. Wenn das Polypeptid oder die Polynukleinsäure synthetisiert wird, können beispielsweise unterschiedliche massemarkierte Nukleotide oder Aminosäuren zu dem Gemisch hinzugefügt werden und in das wachsende Polymer eingefügt werden. Ein verallgemeinertes Beispiel eines massemarkierten Nukleosidtriphosphats wird in 1A abgebildet. Ein Fachmann stellt sich im Licht der vorliegenden Offenbarung eine Vielzahl von Bindungsschemata und Stellen der Bindung vor. Im Allgemeinen sollte die Bindung einer Massemarkierung die Wechselwirkung zwischen der reaktionsfähigen Gruppe und einem Zielmolekül nicht wesentlich inhibieren, wie etwa die Wasserstoffbindung der massemarkierten Base und der komplementären Zielbase, oder die korrekte Faltung eines Polypeptids zur Bildung eines aktiven Proteins nicht stören. Weiterhin sollte die Markierung in dem Fall eines massemarkierten Nukleosidtriphosphats normalerweise nicht die Polymerisation durch ein Polymeraseenzym inhibieren.
  • Ein Syntheseansatz der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von massemarkierten modifizierten Nukleosidtriphosphaten, welche durch eine Polymerase eingefügt werden, um ein massemarkiertes Polynukleotid zu erzeugen. Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es einfach, eine Nukleinsäuresonde mit vielen Kopien einer Massemarkierung zu beladen. Auf Polymerase basierende Verfahren ermöglichen die kostengünstige Synthese von sehr langen Sonden mit hunderten oder zehntausenden Basen Länge durch Einfügen in ein RNA-Transkript oder ein PCRTM-Amplikon.
  • Wenn die reaktionsfähige Gruppe ein Protein ist, kann die Massemarkierung eine Länge von Aminosäuren aufweisen, welche ein Peptid bilden, verbunden entweder mit dem Carboxyl- oder Aminoende des Proteins. Die Zusammensetzung der Massemarkierung kann direkt in die DNA-Sequenz codiert werden, welche unmittelbar benachbart ist zur codierenden Region des Proteins, welches die reaktionsfähige Gruppe darstellt. Eine nachfolgende Transkription und Translation dieser DNA-Sequenz ergibt ein Produkt, wobei die Peptidmassemarkierung mit dem Protein fusioniert ist.
  • F. Enzymatische Amplifikationsverfahren
  • Es können Verfahren der Nukleinsäureamplifikation verwendet werden, um massemarkierte Sonden herzustellen oder die Gegenwart einer Zielsequenz nachzuweisen. Eines der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die PCRTM, welche ausführlich im U.S.-Patent 4,683,195, im U.S.-Patent 4,683,202, im U.S.-Patent 4,800,159 und von Innus et al. (1990) beschrieben wird.
  • Bei der PCRTM werden normalerweise zwei Primersequenzen hergestellt, welche mit Regionen auf gegenüberliegenden komplementären Strängen der Zielsequenz komplementär sind. Die Primer können unter Bildung eines Komplexes aus Nukleinsäure:Primer hybridisieren, wenn die Zielsequenz in einer Probe vorliegt. Ein Überschuss von Desoxynukleotidtriphosphaten wird auch zu einem Reaktionsgemisch zusammen mit einer DNA-Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, zugegeben, welche die Templat-abhängige Nukleinsäuresynthese erleichtert.
  • Wenn sich der Komplex aus Markersequenz:Primer gebildet hat, bewirkt die Polymerase, dass die Primer entlang der Markersequenz durch Hinzufügen von Nukleotiden verlängert wird. Durch Anheben und Senken der Temperatur des Reaktionsgemisches dissoziieren die verlängerten Primer von dem Marker unter Bildung von Reaktionsprodukten, überschüssige Primer binden an den Marker und an die Reaktionsprodukte und das Verfahren wird wiederholt. Diese mehreren Runden der Amplifikation, welche als "Zyklen" bezeichnet werden, werden durchgeführt, bis eine ausreichende Menge eines Amplifikationsprodukts erzeugt ist.
  • Es kann ein Amplifikationsverfahren mit reverser Transkriptase PCRTM ("rtPCRTM") durchgeführt werden, um die Menge von amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Verfahren zur reversen Transkription von RNA in cDNA sind gut bekannt und in Sambrook et al., 1989 beschrieben.
  • Ein anderes Verfahren für die Amplifikation ist die Ligasekettenreaktion ("LCR"), welche in der europäischen Patentanmeldung Nr. 320,308 offenbart wird. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt und in Gegenwart der Zielsequenz bindet jedes Paar an gegenüberliegende komplementäre Stränge des Ziels, sodass diese aneinander grenzen. In Gegenwart einer Ligase verbinden sich die zwei Sondenpaare unter Bildung einer einzelnen Einheit. Durch einen Temperaturzyklus wie bei der PCRTM dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von Ziel und dienen dann als "Zielsequenzen" für eine Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. Das U.S.-Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren, welches ähnlich ist wie die LCR, zur Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
  • Auch Qbeta-Replikase, beschrieben in der PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/US87/00880, kann in der vorliegenden Erfindung als ein weiteres Amplifikationsverfahren verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz von RNA, welche eine Region besitzt, welche komplementär ist zu der eines Ziels, zu einer Probe in Gegenwart einer RNA-Polymerase hinzugefügt. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz.
  • Ein isothermisches Amplifikationsverfahren, bei welchem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, welche Nukleotid 5'-[alpha-thio]-triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten, kann für die Amplifikation von Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Solch ein Amplifikationsverfahren wird von Walker et al. (1992) beschrieben.
  • Die "Strand-Displacement-Amplification" (SDA) ist ein anderes Verfahren zur Durchführung einer isothermischen Amplifikation von Nukleinsäuren, welches mehrere Runden von Strangverdrängung und Synthese umfasst. Ein ähnliches Verfahren, „Repair-Chain-Reaction" (RCR) genannt, betrifft das Annealing von mehreren Sonden über eine Region, welche für eine Amplifikation vorgesehen ist, gefolgt einer Reparaturreaktion, bei welcher nur zwei der vier Basen vorliegen. Die andere zwei Basen können für einen leichten Nachweis als biotinylierte Derivate hinzugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei der SDA verwendet.
  • Spezifische Zielsequenzen können auch erzeugt werden unter Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion ("CPR", "Cyclic Probe Reaction"). Bei der CPR wird eine Sonde mit 3'- und 5'-Sequenzen einer nicht spezifischen DNA und einer mittleren Sequenz einer spezifischen RNA mit DNA hybridisiert, welche in einer Probe vorliegt. Bei der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde als charakteristische Produkte identifiziert, welche nach einem Verdau freigesetzt werden. Das originale Templat lagert sich an eine andere Zyklussonde an und die Reaktion wird wiederholt.
  • Andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren betreffen auf einer Transkription basierende Amplifikationssysteme ("TAS", Transkription-Based Amplification Systems"), einschließlich einer auf einer Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikation ("NASBA", "Nucleic Acid Sequence Based Amplification") und 3SR (Kwoh et al., 1989; PCT-Patentanmeldung WO 88/10315).
  • Bei der NASBA können die Nukleinsäuren für die Amplifikation durch eine Standardphenol/Chloroformextraktion, einer Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, behandelt mit Lysepuffer und Minispin-Säulen für die Isolierung von DNA und RNA oder Guanidiniumchlorid-zielspezifische Sequenzen hergestellt werden. Nach der Polymerisation werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA vollständig doppelsträngig gemacht durch Hinzufügen eines zweiten zielspezifischen Primers, gefolgt von einer Polymerisation. Die doppelstärngigen DNA-Moleküle werden dann mehrfach durch eine Polymerase, wie etwa T7 oder SP6, transkribiert. Bei einer isothermischen zyklischen Reaktion werden die RNA-Moleküle revers transkribiert zu doppelsträngiger DNA und erneut mit einer Polymerase, wie etwa T7 oder SP6, transkribiert. Die resultierenden Produkte, entweder trunkiert oder vollständig, zeigen zielspezifische Sequenzen an.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 329,822 offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren, welches eine zyklische Snthese einzelsträngiger RNA ("ssRNA"), einzelsträngiger DNA ("ssDNA") und doppelsträngiger DNA ("dsDNA") betrifft, welches erfindungsgemäß verwendet werden kann.
  • Nach der Amplifikation kann es erwünscht sein, das Amplifikationsprodukt von dem Templat und dem überschüssigen Primer zu trennen für den Zweck der Bestimmung, ob eine spezifische Amplifikation aufgetreten ist. In einer Ausführungsform werden die Amplifikationprodukte durch Agarose, Agarose-Acrylamid oder Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren getrennt (Sambrook et al., 1989).
  • Alternativ können zum Ausführen der Trennung chromatographische Verfahren verwendet werden. Es gibt verschiedene Arten der Chromatographie, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie und viele spezialisierte Verfahren zu deren Verwendung, einschließlich Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982).
  • Die Trennung kann auch erreicht werden unter Verwendung von biologischen Wechselwirkungen, wie etwa Biotin-Streptavidin- oder Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.
  • Bei Ausführungsformen, bei welchen die Massemarkierungen in das Produkt eingefügt wurden, kann der Nachweis der Massemarkierungen verwendet werden, um die Amplifikation zu bestätigen. Wenn die Massemarkierung später hinzugefügt werden soll, sollten die Amplifikationsprodukte normalerweise sichtbar gemacht werden, um die Amplifikation der Sequenz zu bestätigen. Ein typisches Verfahren der Sichtbarmachung betrifft die Färbung eines Gels mit Ethidiumbromid oder die Sichtbarmachung unter UV-Licht. Wenn die Amplifikationsprodukte integral mit radiomarkierten oder fluorometrisch markierten Nukleotiden markiert sind, können die Amplifikationsprodukte normalerweise gegenüber einem Röntgenfilm exponiert werden oder unter den geeigneten stimulierenden Spektren nach der Trennung sichtbar gemacht werden.
  • G. Chemische Syntheseverfahren
  • Wenn die Sonde chemisch synthetisiert wird, kann die Massemarkierung an einer oder mehreren Stellen innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe platziert werden. beispielsweise können Polypeptidverbindungen der vorliegenden Verbindung synthetisiert werden unter Verwendung von bekannten Verfahren für die Peptidsynthese (Atherton & Shepard, 1989). Das bevorzugte Verfahren für die Synthese ist eine Festphasen-Standardmethodik, wie etwa diejenige, welche auf der Schutzgruppe 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl ("FMOC") basiert (Barlos et al., 1989), mit einem mit Glycin-funktionalisierten O-Chlortritylpolystyrolharz. Die Festphasenpeptidsynthese ermöglicht eine strategische Platzierung einer Massemarkierung innerhalb der Verbindung. Auf ähnliche Weise kann eine Oligonukleotidsonde beispielsweise spezifisch markiert werden durch Einbringen eines modifizierten massemarkierten Phosphoramidits an einer bestimmten Stelle innerhalb der Sequenz. Chemische Syntheseverfahren ermöglichen auch die Platzierung von Massemarkierungen an den Enden der Sonde oder in einem inneren Linker, worin die Massemarkierung nicht direkt mit der Base eines Nukleotids verbunden ist. Ein allgemeines Beispiel eines massemarkierten Phosphoramidits ist in 1B gezeigt. Chemische Syntheseverfahren für DNA sind im Fachgebiet gut bekannt (Agrawal, 1993).
  • Die Verwendung von Kombinationen von unterschiedlichen Massemarkierungen kann die Anzahl der unikalen Massesignaturen beträchtlich erweitern, welche verfügbar sind, wenn eine Bibliothek von Nukleinsäuresonden hergestellt wird, während nur eine bescheidene Reihe von unterschiedlichen Massemarkierungsbestandteilen benötigt wird. Als ein Beispiel kann man unter Verwendung von auf Polymerase basierenden Verfahren und einem Repertoire von 40 unterschiedlichen massemarkierten Thymidintriphosphatnukleotiden, jeweils mit einer unikalen Massemarkierung, eine gewaltige Reihe von unterschiedlich markierten Sonden synthetisieren. Wenn für jede Sonde Kombinationen von zwei unterschiedlichen Massemarkierungen von den 40 Massemarkierungen verwendet werden, dann können insgesamt 780 Proben hergestellt werden, jeweils mit einer unikalen Signatur mit zwei Massen [= 40!/(2!·38!) = 780]. Wenn pro Sonde drei unterschiedliche Markierungen verwendet werden, dann sind 9.880 unterschiedliche Kombinationen möglich [= 40!/(3!·37!) = 9.880]. Der Trend setzt sich wie folgt fort unter Verwendung des Beispiels einer Kombination von Reihen von Massemarkierungen aus einem Pool von 40 Markierungsmolekülen: Eine Reihe von vier Markierungen ergibt 91.390 mögliche Kombinationen, fünf Markierungen ergeben 658.008 mögliche Kombinationen, sechs Markierungen ergeben 3.838.380 mögliche Kombinationen usw. Es ist denkbar, dass für jedes Gen eines Menschen und eines beliebigen anderen Organismus für diesen Zweck Sonden mit einer unikalen Massemarkierung hergestellt werden können. Beispiele für eine enzymatische Sondensynthese sind in 4C und 4D gezeigt.
  • Eine Alternative zu der Verwendung von Gemischen von massemarkierten Nukleotiden ist die Verwendung von Gemischen von massemarkierten Primern. Bei Nukleinsäuresonden, hergestellt durch ein Amplifikationsverfahren wie etwa PCRTMm, können Gemische von Primern verwendet werden, wobei jeder Primer eine unterschiedliche Massemarkierung und die gleiche DNA-Sequenz enthält. Wie bei den massemarkierten Nukleosidtriphosphaten kann ein Repertoire von massemarkierten Primern verwendet werden, um viele unterschiedliche Massesignaturen herzustellen. Neben der Verwendung von Primergemischen mit einer einzelnen Art einer Massemarkierung können Primer hergestellt werden, welche mehrere unterschiedliche Massemarkierungen innerhalb eines einzelnen Moleküls enthalten.
  • Ein besonderer Vorteil des Festphasensyntheseverfahrens ist die Modifikation dieser Verbindungen unter Verwendung von kombinatorischen Syntheseverfahren. Kombinatorische Syntheseverfahren werden definiert als diejenigen Verfahren, welche durch aufeinanderfolgende Bindung unterschiedlicher Bausteine große Sammlungen oder Bibliotheken von Verbindungen gleichzeitig erzeugen. Bibliotheken können konstruiert werden unter Verwendung von frei in Lösung vorliegenden Verbindungen, aber bevorzugt ist die Verbindung mit einem festen Träger, wie etwa einem Bead, einem festen Partikel verbunden oder wird sogar auf der Oberfläche von Mikroorganismen präsentiert. Es existieren mehrere Verfahren für die kombinatorische Synthese (Holmes et al., 1995; Burbaum et al., 1995; Martin et al., 1995; Freier et al., 1995; Pei et al., 1991; Bruce et al, 1995; Ohlmeyer et al., 1993), einschließlich einer geteilten Synthese oder einer parallelen Synthese. Eine geteilte Synthese kann verwendet werden, um kleine Mengen einer relativ großen Anzahl von Verbindungen zu erzeugen, während eine parallele Synthese größere Mengen einer relativ kleinen Anzahl von Verbindungen erzeugen kann. Im Allgemeinen werden Verbindungen unter Verwendung einer geteilten Synthese an der Oberfläche eines Mikropartikels synthetisiert. Bei jedem Schritt werden die Partikel in mehrere Gruppen für das Hinzufügen des nächsten Bestandteils aufgeteilt. Die unterschiedlichen Gruppen werden dann wieder kombiniert und zur Bildung neuer Gruppen aufgeteilt. Das Verfahren wird wiederholt, bis die Verbindung vollständig vorliegt. Jeder Partikel trägt mehrere Kopien der gleichen Verbindung, was eine leichte Trennung und Reinigung ermöglicht. Eine geteilte Synthese kann nur unter Verwendung eines festen Trägers durchgeführt werden.
  • Ein alternatives Verfahren, welches als parallele Synthese bekannt ist, kann entweder in Festphase oder Lösung durchgeführt werden. Unter Verwendung einer parallelen Synthese werden unterschiedliche Verbindungen in getrennten Gefäßen synthetisiert, oft unter Verwendung einer Automatisierung. Eine parallele Synthese kann in Mikrotiterplatten durchgeführt werden, wobei unterschiedliche Reagenzien in einer vorbestimmten Art und Weise zu jedem Well hinzugefügt werden können unter Erzeugung einer kombinatorischen Bibliothek. Die parallele Synthese ist der bevorzugte Ansatz für eine Verwendung mit enzymatischen Verfahren. Es versteht sich, dass viele Modifikationen dieses Verfahrens existieren und für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung angepasst werden können. Unter Verwendung von kombinatorischen Verfahren kann eine große Zahl von unikalen massemarkierten Sonden synthetisiert werden.
  • Eine Ausführungsform ist ein Ansatz zur Synthese aller möglichen Kombinationen einer Sequenz gleichzeitig auf eine solche Art und Weise, dass jede unikale Sequenz innerhalb des Pools eine unikale Massesignatur besitzt. Der synthetische Ansatz betrifft die Verwendung einer unikalen Reihe von vier massemarkierten Nukleotiden für jede Position innerhalb einer Oligonukleotidsonde, d.h. eine Gruppe von vier Massemarkierungen wird ausschließlich an Position 1 verwendet, während eine unterschiedliche Reihe von vier ausschließlich an Position 2 verwendet wird usw. Das primäre Verfahren für Synthese dieser Sonden ist chemisch unter Verwendung einer Phosphoramiditchemie, obwohl andere chemische und enzymatische Verfahren einschließlich einer Einzelbasenaddition durch eine Polymerase auch verwendet werden können. Als ein Beispiel erfordert eine Synthese der kombinatorischen Reihe von allen Oligonukleotiden mit 10 Basen Länge 40 unterschiedliche Phosphoramidite, 10 unterschiedliche A mit unikalen Massemarkierungen, 10 unterschiedliche C mit unikalen Massemarkierungen, 10 unterschiedliche G mit unikalen Massemarkierungen und 10 unterschiedlichen T mit unikalen Massemarkierungen. Dieses Schema wird in 4A veranschaulicht.
  • Der Nutzen für die komplette Gruppe von Sonde ist mannigfaltig. Anwendungen umfassen Hybridisierungsassays zur Identifizierung von cDNAs von anderen Sequenzen, welche in einer Festphasen-gebundenen Anordnung oder einem anderen Format vorliegen, Mapping-Anwendungen und andere diagnostische Anwendungen. Es ist auch möglich, die Gruppe für statistische PCRTM-Amplifikationsassays zu verwenden, wo die Produkte durch Elektrophorese getrennt werden und die Primer, welche unter Bildung der unterschiedlichen PCRTM-Produkte gepaart haben, identifiziert werden. Diese Anwendungen betreffen auch die Verfahren, welche zur Identifizierung von kurzen Sequenzstücken („sequence reads") verwendet werden.
  • Die kombinatorische Synthese von Sonden kann als eine Einzelreaktion in einem einzelnen Gefäß durchgeführt werden, oder sie kann unter Verwendung des zuvor beschriebenen geteilten Syntheseverfahrens durchgeführt werden. Wenn bei der kombinatorischen Synthese keine getrennten Syntheseverfahren verwendet werden, können bei der Identifizierung einer Sequenz Schwierigkeiten auftreten in Fällen, bei welchen mehrere Proben hybridisieren. In Fällen, bei welchen die ganze Reihe der Sonden verwendet wird, kann es schwierig sein, die einzelnen Sequenzen der Sonden zu identifizieren, wenn mehr als eine Sonde bei einem signifikanten Ausmaß vorliegt. Ein möglicher Ansatz zur Beschränkung der Anzahl der Sonden, welche mit einem bestimmten Ziel hybridisieren, ist die Verbindung mit einer unikalen Ankersequenz mit der Gruppe der Sonden, welche die Orte beschränkt, an welche die Sonde hybridisieren kann. Dieser Anker ist ähnlich wie die Verfahren, welche zur Identifizierung von kurzen Sequenzstücken verwendet werden. Wie zuvor beschrieben ist, kann es auch möglich sein, zusätzliche Basen an das Ende der Sonde hinzuzufügen, um die Sequenzbestimmung zu verlängern und die Unterscheidung zu verbessern, falls nötig.
  • Ein spezielles Beispiel der Verwendung der verankerten kombinatorisch synthetisierten Sonden ist in 4B gezeigt. Beim Screenen von genomischen oder cDNA-Klon-Inserts kann die verankerte, invariante Sequenz verwendet werden, um mit der bekannten Vektorsequenz unmittelbar benachbart zu dem Insert zu hybridisieren, oder im speziellen Fall eines cDNA-Inserts mit der Poly A/T-Region des Inserts.
  • Für das Hinzufügen von Markierungen an eine bereits synthetisierte Sonde, hierin als Post-Modifikation beschrieben, können verschiedene chemisch aktive Stelle der Sonde verwendet werden. Beispielsweise kann eine passende Funktionalität einer Markierung mit einem primären Amin an 5-Propargylaminodesoxyuridin, einem terminalen Amino- oder Carboxyllinker oder einem endogenen Anteil umgesetzt werden, wie etwa mit dem exozyklischen Amin in Cytosin, Guanin oder Adenin. Potenzielle Linkergruppen umfassen die heterobifunktionellen Ver netzungsmittel mal-sac-HNSA (Bachem Inc., Torrence, CA) oder ein beliebiges aus einer Vielzahl von Vernetzungsmitteln, welche von der Firma Pierce Chemical Company (Rockford, IL) erhältlich sind. Ein Fachmann kann angesichts der vorliegenden Offenbarung andere Beispiele ergänzen. Die Post-Modifikation ermöglicht auch das Hinzufügen von mehreren Massemarkierungen.
  • I. Assays mit nicht flüchtigen, freisetzbaren massemarkierten Sonden
  • Die beschriebenen massemarkierten Nukleinsäuresonden besitzen eine Vielzahl von Verwendungen. Markierte Polypeptide können verwendet werden, um die Wechselwirkung einer reaktionsfähigen Gruppe mit einem speziellen Ziel nachzuweisen. Repräsentative Beispiele umfassen einen massemarkierten Antikörper zum Nachweis eines Antigens entweder in Lösung oder an einem festen Träger oder ein massemarkiertes Enzym zum Nachweis eines Substrats. Ein Fachmann erkennt, dass es viele solcher Wechselwirkungen gibt, welche unter Verwendung von markierten Polypeptiden nachweisbar sind, um Wechselwirkungen mit einem Zielmolekül nachzuweisen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft den einfachen Nachweis einer spezifischen Zielnukleinsäure.
  • Es gibt eine Reihe von Gründen für den Nachweis einer bestimmten Nukleinsäuresequenz. Diese Gründe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den Nachweis von infektiösen Agenzien in einer klinischen Probe, den Nachweis eines Amplifikationsprodukts, welches von genomischer DNA oder RNA oder mRNA („message") stammt, oder den Nachweis eines Geninserts (cDNA) in einem Klon. Ein einfacher Nachweis kann eine beliebige Kombination der hierin beschriebenen Verfahren für die Herstellung der Nukleinsäuresonde und der Freisetzung und den Nachweis der Massemarkierung betreffen. Man kann auch die nachgewiesene Menge quantifizieren. Die meisten dieser Verfahren betreffen die Verwendung eines hybridisierungsspezifischen Ereignisses, um die Freisetzung einer Massemarkierung einzuleiten, und in Fällen, bei welchen nur kleine Mengen eines Zielmaterials vorliegen, die Verwendung eines beliebigen Amplifikationsverfahrens.
  • Ein Vorteil der Verwendung von massemarkierten Verbindungen, welche durch Massenspektrometrieverfahren nachweisbar sind, ist die Möglichkeit des gleich zeitigen Nachweises von vielen Zielverbindungen zur gleichen Zeit. Aufgrund von breiten überlappenden Spektren, welche durch existierende Fluoreszenzchromophore erzeugt werden, ist eine Obergrenze für ein Fluoreszenz-Multiplexverfahren wahrscheinlich etwa 10 unterschiedliche Markierungen. Mit einem Matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit("MALDI-TOF")-Massenspektrometer oder einem direkten Laserdesorption-Massenspektrometer oder einem Elektrospray-Massenspektrometer ist ein Multiplexverfahren mit mehreren Zehn oder Hunderten oder möglicherweise sogar Tausenden von unterschiedlichen Massemarkierungen möglich. Ein nicht flüchtiger Pool von Markierungen kann einen breiteren Bereich von Massen und Strukturen bereitstellen. Aufgrund dieser Möglichkeit von Multiplexverfahren können nicht nur viele markierte Sonden zur gleichen Zeit verwendet werden, jede einzelne Probe kann mit vielen unterschiedlichen Markierungen markiert werden.
  • J. Nachweis eines Einzelnukleotidpolymorphismus
  • Weitere Ausführungsformen betreffen den Nachweis von einzelnen Basenvariationen. Diese Anwendungen erfordern im Allgemeinen ziemlich viel Sensitivität. Diese Anwendungen umfassen den Nachweis von "hot spot"-Punktmutationen und die Identifizierung der Base an einer Stelle eines Einzelnukleotidpolymorphismus ("SNP", "Single Nucleotide Polymorphism"). Es können massemarkierte Sonden hergestellt werden, welche unmittelbar benachbart an eine polymorphe Stelle hybridisieren, und dann kann eine Polymerase verwendet werden, um eine Base an der Polymorphismusstelle hinzuzufügen. Die bestimmte Base kann durch viele Arten zu der Sonde hinzugefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, bei welcher eine einzelne Sonde verwendet wird, kann beispielsweise ein Gemisch der vier Ketten-beendigenden Triphosphate zugegeben werden, wobei jedes mit einer unikalen Massemarkierung verbunden ist. Im Fall eines homozygoten SNP kann nur eins der vier Ketten-beendigenden Nukleotide an das Ende der Sonde hinzugefügt werden, wobei die gebundene Massemarkierung mit der Sonde verbunden wird. Mehrere Ansätze können durchgeführt werden beim Freisetzen der Massemarkierung von der Sonde. Diese Ansätze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Verwendung von chemisch labilen funktionellen Gruppen, welche die Massemarkierung mit dem Endnukleotid verbinden, chemisch labile funktionale Gruppen in dem Gerüst des verlängerten Primers oder des Ketten-beendigenden Nukleotids oder die Verwendung eines Enzyms, um eine oder mehrere der Phosphodiester- oder Glykosidbindungen in dem verlängerten Primerprodukt zu spalten. In Fällen, bei welchen der Punkt der Freisetzung der Massemarkierung in dem Gerüst des Verlängerungsprodukts liegt, kann die freigesetzte Massemarkierung das terminale Nukleotid oder eine gewisse massemodifizierte Version davon enthalten. In einer anderen Version, bei welcher der Punkt der Freisetzung im Innern des Primerverlängerungsprodukts liegt, können die nativen Kettenbeendigungsnukleotide selbst als gesamte oder ein Teil der Massemarkierungen dienen, da jede Base eine unikale Masse besitzt. In Fällen, bei welchen die Massemarkierung chemisch von der Sonde gespalten wird, können zuerst alle nicht eingefügten Nukleotide entfernt werden oder abgewaschen werden, sodass sie durch das Massenspektrometer nicht sichtbar gemacht werden.
  • Eine Aufteilung der hybridisierten massemarkierten Ketten-beendigenden Triphosphate kann auf Basis der Massenunterschiede durchgeführt werden, da markierte Triphosphate, welche mit einer mit dem Ziel hybridisierten Sonde hybridisiert sind, ein höheres Molekulargewicht besitzen als ein markiertes Triphosphat, welches nicht hybridisiert ist. Die Sonde oder das Ziel können auch mit einer Festphase verbunden werden durch eine Anzahl von Mitteln einschließlich Biotin/Streptavidin oder eine chemische Kopplung oder eine UV-Vernetzung. Eine Alternative ist die Verwendung einer Nuklease, um die massemarkierte Sonde zu verdauen. Unter Verwendung einer Nuklease wird das massemarkierte Ketten-beendigende Nukleotid als ein Monophosphat freigesetzt. Die nicht eingefügten massemarkierten Ketten-beendigenden Nukleotide verbleiben als Triphosphate und die resultierende Masseverschiebung zum Monophosphat zeigt, welches Nukleotid eingefügt war. Dieses Nukleaseverfahren befreit von der Notwendigkeit, nicht eingefügte Nukleotide von der Analyse zu entfernen.
  • Eine andere Ausführungsform umfasst Multiplexverfahren mit einer großen Anzahl von Sonden, um so viele SNPs gleichzeitig nachzuweisen. Bevorzugt können Massemarkierungen vorliegen, um jede der Sonden, welche im Pool enthalten sind, unikal zu markieren. Das Hinzufügen eines biotinylierten Ketten-beendigenden Nukleotids an der Stelle des Punktpolymorphismus kann auch verwendet werden, um die Probenpopulation zu trennen in Abhängigkeit davon, welche Sonden ein spezifisches biotinyliertes Ketten-beendigendes Nukleotid enthalten und welche nicht. Als ein Beispiel kann der Pool aus massemarkierten Sonden und dem Ziel in vier Reaktionen unterteilt werden. Die erste Reaktion enthält nur biotinyliertes Didesoxyadenosintriphosphat, die zweite enthält nur biotinyliertes Didesoxycytidintriphosphat, die dritte nur biotinyliertes Didesoxyguanidintriphosphat und die vierte nur biotinyliertes Didesoxythymidintriphosphat. Nach einer Polymerase-abhängigen Einzelbasenverlängerungsreaktion in Gegenwart des passenden Nukleotids werden die verlängerten Produkte eingefangen, gewaschen und die Massemarkierungen werden für eine massenspektrometrische Analyse freigesetzt. Bei der ersten Reaktion werden nur diejenigen massemarkierten Sonden sichtbar gemacht, in welche ein A eingefügt ist. In der zweiten Reaktion werden nur diejenigen massemarkierten Sonden sichtbar gemacht, in welche ein C eingefügt ist. Bei der dritten bzw. vierten Reaktion werden Sonden sichtbar, in welche ein G bzw. ein T eingefügt ist. Es wird erwartet, dass auf diese Art Hunderte von Sonden im Multiplexverfahren bearbeitet werden können.
  • Ein Fachmann kann eine Vielzahl von Variationen des Einzelsondenansatzes oder Multiplexsondenansatzes zum Lesen der SNP erkennen, basierend entweder auf der Abwesenheit oder der Anwesenheit der Massemarkierung oder der in der Massemarkierung auftretenden Masseveränderung. Ein anderes Beispiel einer Masseveränderung innerhalb einer Massemarkierung ist der Fall, bei welchem die Massemarkierung am 3'-Ende der Sonde vorliegt. Nach einer Polymerase-abhängigen Basenverlängerung kann die Massemarkierung freigesetzt werden, was die Kettenterminationsbasenaddition ebenso wie die vorletzte Base umfasst. Eine mögliche Struktur für diese Art der Sonde ist in 2 gezeigt. Die Platzierung der Massemarkierung und der Release-Stelle können an anderen Basen durchgeführt werden, wobei eine Platzierung nahe dem 3'-Ende bevorzugt ist. In allen Fällen sollte die Massemarkierung bevorzugt zwischen der Release-Gruppe und dem 3'-Ende platziert sein. In anderen Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, das durchzuführen, was effektiv eine kurze kettenterminierte Sequenzierungsreaktion darstellt, wobei neben den Didesoxynukleotiden eine bestimmte Menge von normalen Desoxynukleotiden vorliegt. Die Verlängerung des Primers ergibt eine verschachtelte Reihe von Produkten, wobei jedes durch ein Didesoxynukleotid kettenterminiert ist, welches der komplementären Base an dem Templatstrang entspricht. In der bevorzugten Form kann die Massemarkierung innerhalb des Primers nahe dem 3'-Ende lokalisiert sein, welches eine chemische Release-Gruppe enthält. Solch ein Verfahren bietet eine gesonderte Ausführungsform für kurze Sequenzstücke ebenso wie für den Nachweis von einem oder mehreren SNPs. Alle die oben beschriebenen SNP-Nachweisverfahren können die Verwendung von massemodifizierten Formen der unterschiedlichen Nukleotide umfassen, um den Massenunterschied zwischen den unterschiedlichen möglichen Produkten zu vergrößern.
  • Eine alternative bevorzugte Ausführungsform zur Einzelbasenaddition für den Nachweis eines SNP ist die Durchführung eines unterscheidenden Exonukleaseereignisses in Gegenwart von passenden und nicht passenden Oligonukleotidsonden. Ein Beispiel dieses Ansatzes ist die Kombination der Verwendung von freisetzbaren Massemarkierungen mit Nick-Translations-PCRTM. Neben der Polymeraseaktivität besitzt die Taq-DNA-Polymerase sowohl eine 5'-3'-Exonuklease- als auch eine Endonukleaseaktivität. Wenn eine vollständig komplementäre Oligonukleotidsonde in den Weg der Polymerisation platziert wird, beispielsweise während einer PCRTM-Amplifikation, greift die Polymerase das 5'-Ende der Sonde mit ihrer Exonukleaseaktivität an, wobei das Molekül verdaut wird, bis es zu klein ist, um hybridisiert zu bleiben. Aber wenn das Oligonukleotid nahe dem 5'-Ende nicht perfekt komplementär ist, beispielsweise in der Nähe eine Fehlpaarung vorliegt, ist das Ende der Sonde ausgefranst und wird eher von der endonukleolytischen Aktivität der Polymerase als von der Exonukleaseaktivität angegriffen. Das nukleolytisch gespaltene Produkt, welches bevorzugt die Massemarkierung enthält, besitzt eine unterschiedliche Endmasse in Abhängigkeit davon, ob eine Fehlpaarung vorlag oder nicht und wie die Nuklease als Reaktion auf diese Fehlpaarung schneidet. Es ist gezeigt worden, dass die Einleitung der endonukleolytischen Aktivität beeinflusst werden kann durch die Gegenwart und Platzierung einer Fehlpaarung innerhalb der Hybridisierungssonde (Holland et al., 1991; Lee et al., 1993). Eine selektive Platzierung einer Massemarkierung in der Oligonukleotidsonde relativ zur erwarteten Fehlpaarungsstelle kann verwendet werden, um ein unterschiedliches Signal zu ergeben in Abhängigkeit davon, ob tatsächliche eine Fehlpaarung vorliegt oder nicht.
  • Unter Ausnutzung des Vorteils der hohen Multiplexfähigkeit der massemarkierten Sonden kann man diesen Assay auf den simultanen Nachweis von mehreren SNPs ausweiten. Jede der Sonden, welche einen bestimmten SNP ansteuern, enthält eine der vier möglichen Basen zur Komplementierung der Polymorphismusstelle. Die Platzierung der Massemarkierung ist so, dass die Massemarkierung, wenn die Sonde eine perfekte Paarung mit dem Templat enthält, durch die Exonukleaseaktivität der Taktpolymerase freigesetzt wird, primär in einer Form, welche ein einzelnes Nukleotid enthält. Die anderen Sonden erzeugen eine Fehlpaarung und die Endonukleaseaktivität der Polymerase leitet ein Zerschneiden der Sonde auf eine solche Art und Weise ein, dass die Massemarkierung mit einem größeren Segment der Sonde verbunden bleibt, welches mehr als ein Nukleotid enthält. Die Verschiebung der Masse des massemarkierten Spaltprodukts ist diagnostisch dafür, ob eine Fehlpaarung aufgetreten ist oder nicht.
  • Wenn der Nachweis mittels Massenspektrometrie unter Verwendung von MALDI durchgeführt wird, kann es möglich sein, eine Matrix auszuwählen, welche sichtbar unterscheiden kann zwischen den kleineren Produkten, welche sich durch die passende Sonde ergeben, und den größeren Produkten, welche sich durch die nicht passenden Sonden ergeben, so dass das kleinere Produkt effizienter oder selektiver desorbiert wird. Unter Verwendung einer Matrix, wie etwa 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Sinapinsäure oder α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, nimmt die Signalstärke ab, je mehr Nukleotide mit der Sonde verbunden sind (Jensen et al., 1996).
  • Durch Verwendung einer Reihe von 50 massemarkierten Sonden kann eine Menge von 25 biallelen SNPs in einem einzelnen Gefäß nachgewiesen werden. Wie dies bei einem beliebigen auf PCRTM basierenden Nachweisschema der Fall ist, ist die Grenze der nachzuweisenden SNPs wahrscheinlich das Ergebnis der Grenzen der Multiplex-PCRTM. Bei Kopplung mit einer Massenspektrometrieanalyse mit einem hohen Durchsatz kann das Verfahren insbesondere kostengünstig sein bei der Analyse einer kleinen Gruppe von Polymorphismusstellen, z.B. in einem Cluster von Exons, als Teil einer Populationsstudie, bei welcher Tausende bis Zehntausende Proben analysiert werden müssen.
  • Als ein allgemeines Verfahren für den Nachweis und das Monitoring einer PCRTM-Amplifikationsreaktion kann auch eine Nick-Translation-PCRTM in Kombination mit massemarkierten Sonden verwendet werden. In diesem Fall liegen nur passende Sonden vor und die Massemarkierung wird nur freigesetzt, wenn bei einer PCRTM die durch eine bestimmte Sonde angesteuerte bestimmte Region amplifiziert wird.
  • Obwohl die bevorzugte Ausführungsform für diese Assays die Verwendung nicht flüchtiger freisetzbarer Massemarkierungen oder involatiler freisetzbarer Massemarkierungen ist, können andere Arten der Markierung ebenso verwendet werden, wie beispielsweise Isotopenmassemarkierungen, flüchtige Massemarkierungen (einschließlich Elektrophore), Fluoreszenzmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen.
  • K. Kurze Sequenzstücke („sequence reads")
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die massemarkierten Sonden verwendet werden, um kurze Sequenzen zu identifizieren. Insbesondere können Kombinationen von Hybridisierung und enzymatischer Verlängerung (Polymerase oder Ligase) mit den markierten Sonden verwendet werden, um kurze Sequenzläufe zu identifizieren, welche einer "Priming"- oder Ankerregion benachbart sind. Es gibt drei optimale Verfahren für die Durchführung. Das erste Verfahren wird in 3A veranschaulicht. Es wird ein Gemisch von Sonden synthetisiert, welche zwei Domänen enthalten, eine Erkennungsdomäne mit fester Sequenz, welche normalerweise nur eine oder wenige Sequenzen umfasst, und eine randomisierte Domäne, welche die gesamte Gruppe (oder einige Untergruppen) aller möglichen Sequenzen umfasst. Die feste Sequenz der Sonde wird verwendet, um die Hybridisierung der Sonde auf eine Einzelstelle innerhalb einer bestimmten Zielnukleinsäure zu richten. Diese Zielstelle ist normalerweise invariant. Die Sequenz benachbart zur invarianten Sequenz ist variabel und in Abhängigkeit vom bestimmten Ziel kann sie eine beliebige der Gesamtkombinationen der Sequenz aufweisen. Um alle Möglichkeiten zu sondieren, ist es notwendig, Sonden zu synthetisieren, welche alle der möglichen sekundären Domainsequenzkombinationen enthalten. Wenn die zweite Sondenregion vier Basenpaare lang ist, müssen 256 unterschiedliche Sonden synthetisiert werden. Wenn die zweite Probenregion 5 Basenpaare lang ist, dann müssen 1024 unterschiedliche Sonden synthetisiert werden. Sechs Basen erfordern 4096 usw. Die Sonden können einzeln synthetisiert werden, wobei jede eine unikale Kombination von Massemarkierungen als freisetzbare Massesignatur besitzt. Alternativ können die Sonden mit unikalen Massesignaturen synthetisiert werden unter Verwendung eines kombinatorischen Syntheseverfahrens der oben beschriebenen Art. Bei besonderen Ausführungsformen, welche diagnostische Sonden betreffen, kann es erwünscht sein, nur eine kleine Zahl von Sonden, beispielsweise weniger als 20, zu erzeugen.
  • Die zwei Domainsonden sind verwendbar zur Identifizierung der Endsequenz innerhalb der Kloninserts. Als ein Beispiel hybridisiert die feste Sequenzdomäne mit der Sequenz des Klonierungsvektors, welche zu der Insertsequenz unmittelbar benachbart ist. Die variable Sequenz ist dann verfügbar, um mit dem klonierten Insert zu hybridisieren. Nur die Sonde, welche komplementär ist zu der klonierten Insertsequenz, welche benachbart ist zu der Sequenz des Klonierungsvektors, wird ein perfektes Hybrid bilden. Die restlichen zwei Domainsonden nicht. Der Nachweis der Massemarkierungssignatur der Sonde, welche hybridisiert hat, unter Verwendung der beschriebenen Verfahren, identifiziert die Sondensequenz und die Sequenz des Kloninserts. Andere Anwendungen umfassen das Ansteuern von hypervariablen Sequenzregionen oder eine Analyse von Mutation/Polymorphismus an gezielten Stellen. In allen Fällen richtet die feste Sequenz die Sonde auf eine unikale Region innerhalb des Ziels, welche im Wesentlichen dort verankert wird, wo die variable Region sondiert.
  • Um das Ausmaß der Unterscheidung zu erhöhen und die Leselänge für das kurze Sequenzstück zu verlängern, ist es möglich, ein Enzym, wie etwa Polymerase oder Ligase, zu verwenden, um ein einzelnes Nukleotid oder Oligonukletoid an das Ende der variablen Region der verankerten Sonde hinzuzufügen, optional mit Massemarkierungen an dem hinzugefügten Nukleotid oder Oligonukleotid, welche die Sequenz im Hinblick auf diese Additionen identifizieren können. Die Addition von Basen durch beide Enzyme ergibt strengere Anforderungen der variablen Region im Hinblick darauf, dass sie ein perfektes Hybrid ist, um eine enzymatische Aktivität zu ermöglichen. Beispiele dafür, wie diese Sondenadditionen arbeiten, sind in 3B gezeigt. Es wird angemerkt, dass für die Polymerase das Hinzufügen am 3'-Ende der Probe stattfinden muss, während eine Ligation entweder am 3'-Ende oder am 5'-Ende auftreten kann. Wie bei der variablen Region in der Sonde erfordert eine Erhöhung der Größe der Addition einen immer größeren Pool, um alle möglichen Sequenzen darzustellen. Oligonukleotidadditionen müssen nicht notwendigerweise völlig variabel sein. Es kann Fälle geben, bei welchen die variable Region eine invariante Region enthält. Solche Verlängerungen steigern die thermodynamische Stabilität der Oligonukleotidaddition und ermöglichen, dass die Ligation bei höheren Temperaturen stattfindet. Es ist auch möglich, Fälle vorzusehen, bei welchen eine invariante Nukleotidsequenz mit den beschriebenen variablen Sequenzen vermischt ist.
  • Es können auch kombinatorische Bibliotheken verwendet werden, um kurze Sequenzen nachzuweisen. Obwohl es in Fällen, bei welchen die vollständige Gruppe der Sonden verwendet wird, sein kann, dass es nicht möglich ist, die Sequenzen der Sonden im Einzelnen zu identifizieren, wenn mehr als eine Sonde nach der Hybridisierung in einem bestimmten Ausmaß vorliegt. Ein möglicher Ansatz zur Beschränkung der Anzahl der Sonden, welche mit einem bestimmten Ziel hybridisieren, ist die Verbindung einer unikalen Ankersequenz mit der Sondengruppe, welche die Orte beschränkt, an welchen die Probe hybridisieren kann. Dieses Verankern ist ähnlich wie das zuvor für die Analyse von kurzen Sequenzstücken beschriebene Verankern. Wie zuvor beschrieben, ist es auch möglich, dass zusätzliche Basen an das Ende der Sonde hinzugefügt werden können, um die Sequenzbestimmung zu verlängern und die Unterscheidung zu verbessern, falls nötig.
  • Ein spezielles Beispiel der Verwendung der verankerten, kombinatorisch synthetisierten Sonden wird in 4B gezeigt. Im Fall eines Screening von genomischen oder cDNA-Klon-Inserts wird die verankerte invariante Sequenz verwendet, um mit der bekannten Vektorsequenz zu hybridisieren, welche zu dem Insert oder im speziellen Fall eines cDNA-Inserts zu der Poly A/T-Region des Inserts unmittelbar benachbart ist.
  • Obwohl die bevorzugte Ausführungsform dieser Assays die Verwendung von nicht flüchtigen freisetzbaren Massemarkierungen oder involatilen freisetzbaren Massemarkierungen ist, können andere Arten von Markierungen ebenso verwendet werden, wie etwa Isotopenmassemarkierungen, flüchtige Massemarkierungen (einschließlich Elektrophore), Fluoreszenzmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen.
  • L. Fehlpaarungs-Nachweis durch gezielte Spaltung
  • Der Nachweis des Vorliegens einer Mutation innerhalb einer bestimmten Sequenz ist in Fällen von Interesse, bei welchen keine Vorkenntnis vorhanden ist, wo genau die bestimmte Mutation auftreten könnte. Es können Oligonukleotidsonden verwendet werden für die Hybridisierung mit einer Ziel-DNA, welche eine einzelne Mutation innerhalb einer interessierenden Region enthält, welche zur Bildung einer Fehlpaarung führt. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden enzymatisch synthetisierte massemarkierte Sonden verwendet, welche vor einem doppelstrangspezifischen, enzymatischen Verdau am 3'-Ende blockiert sind. Die 3'-Enden der Sonden können blockiert sein durch chemische Modifikation oder können enzymatisch blockiert sein. Beispielsweise kann eine Blockierung erreicht werden durch Unzugänglichmachen des 3'-Terminus für einen enzymatischen Verdau. Nach der Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz spaltet eine Behandlung mit einem für eine Fehlpaarung spezifischen chemischen oder enzymatischen Spaltungsreagenz das hybridisierte Paar an der Fehlpaarungsstelle. Repräsentative Spaltungsreagenzien umfassen KmnO4 und T4-Endonuklease VII. Eine nachfolgende Behandlung des gespaltenen Paars mit einer doppelstrangspezifischen 3'-5'-Exonuklease, wie etwa Exonuklease III, führt zum Verdau der Sonde von der Spaltungssteile zum 5'-markierten Ende, wobei die Massemarkierung freigesetzt wird. Dieses Verfahren wird in 5A und 5B veranschaulicht. Als eine Alternative kann die Polarität des Systems umgekehrt werden durch Platzierung der Massemarkierung an dem 3'-Ende der Sonde und durch Verwendung einer Doppelstrang-spezifischen 5'-3'-Exonuklease, wie etwa die T7-Gen-6-Exonuklease.
  • Ein anderes Beispiel eines Fehlpaarungsnachweises bezieht die Amplifikation einer heterozygoten Ziel-DNA unter Verwendung von zwei unterschiedlichen massemarkierten Sonden ein. Der Unterschied kann eine Einzelbasenmutation sein, beispielsweise A:T zu G:C. Durch die PCRTM-Reaktion werden vier Produkte erzeugt, zwei vollständig homogene Produkte, welche die Originalsequenzen darstellen, während die anderen zwei Produkte eine Fehlpaarung an der Mutationsstelle enthalten. Eine Behandlung mit einer terminalen Transferase fügt lange 3'-Überhänge an alle Produkte hinzu. Es wird eine chemische oder enzymatische Fehlpaarungs-spezifische Spaltung verwendet, welche nur die zwei heterogenen Paare beeinflusst. Ein Verdau mit Exonuklease III betrifft auch nur die gespaltenen heterogenen Paare, wobei die Massemarkierungen ohne Verdau der Sequenzen freigesetzt werden, welche durch die 3'-Überhänge blockiert sind. Dieses Verfahren ist in 5C und 5D gezeigt. Diese Fehlpaarungsverfahren können auch mit anderen Markierungsverfahren kombiniert werden, wie etwa Fluoreszenzmarkierungen oder Radiomarkierungen.
  • Obwohl die bevorzugte Ausführungsform für diese Assays die Verwendung von nicht flüchtigen freisetzbaren Massemarkierungen oder involatilen freisetzbaren Massemarkierungen ist, können auch andere Arten von Markierungen verwendet werden, wie etwa Isotopenmassemarkierungen, flüchtige Massemarkierungen (einschließlich Elektrophore), Fluoreszenzmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen.
  • M. Hoch-Multiplexverfahren für Sonden-Screeningassays
  • Mit in Multiplexverfahren massemarkierten Sonden wird eine Reihe von neuen Anwendungen möglich, wobei durch das bevorzugte Verfahren eine große Anzahl von Zielen gleichzeitig gescreent werden kann. Multiplexanwendungen umfassen Mehrfach-Pathogendiagnostik, genetisches Multigenpolymorphismusscreening, SNP-Genotypisierung, Klon- und Gen-Mapping und Genexpressionsanalyse.
  • Die Hoch-Multiplexanalyse durch Hybridisierung kann in einen von drei Ansätzen unterteilt werden: (A) Hybridisierung einer Bibliothek von Sonden mit bekannter Sequenz gegen eine Bibliothek von Zielen mit unbekannter Sequenz, (B) Hybridisierung einer Sondenbibliothek mit unbekannter Sequenz gegen eine Zielbibliothek mit bekannter Sequenz und (C) Hybridisierung einer Sondenbibliothek mit unbekannter Sequenz gegen eine Zielbibliothek mit unbekannter Sequenz.
  • Der Ansatz (A) ist nützlich für Anwendungen, wie etwa Diagnostik, Genotypisierung, Expressionsanalyse und Sonden-Mapping, wobei vorher festgelegt wurde, welche Sequenzen gescreent werden sollen. Viele der oben beschriebenen Verfahren können in diesem Ansatz (A) verwendet werden. Mit dem Ansatz (A) können kombinatorisch synthetisierte Sonden verwendet werden, wobei die Sequenzen der Sonden (und des Ziels, mit welchem die Sonde hybridisiert wird) nachher bestimmt werden, d.h. Sondieren und dann Bestimmen der Sequenz, mit welcher die Sonde hybridisiert hat. Es treffen die Beschränkungen zu, welche zuvor für kombinatorische Sonden beschrieben wurden. Die Verwendung eines Repertoire von Gruppen von massemarkierten Sonden, im Gegensatz zu kombinatorischen Sonden, können in Multiplexgemischen verwendet werden, um das Vorliegen von kurzen Sequenzen nachzuweisen, für Zwecke der Sequenzierung durch Hybridisierung oder Produktion einer Sondensignatur für eine bestimmte Zielsequenz.
  • Der Ansatz (B) stellt einen Weg bereit für eine Anzahl von Anwendungen, bei welchen eine Bibliothek von unterschiedlichen bekannten DNA-Sequenzen, wie etwa Oligonukleotiden, PCRTM-Produkten, RNA-Transkripten oder DNA-Klonen, angeordnet wurden und verfügbar sind zum Aufteilen der unbekannten Sondengruppe. Diese Verfahren umfassen oft, aber nicht immer die Verwendung von Festphasenanordnungen zur physischen Aufteilung der bekannten Sequenzen vor dem Sondieren. Die Anwendungen umfassen eine kompetitive Hybridisierung für eine differenzielle Expressionsanalyse und ein schnelles Mapping von Genen, Subklonen oder kurzen Sequenztags (SST) gegenüber einer Masterbibliothek von genomischen Klonen, einen Multiplexnachweis eines infektiösen Mittels oder einer beliebigen anderen Gruppe von Proben, welche im Multiplexverfahren sondiert werden sollen.
  • Der Ansatz (C) ist verwendbar in Fällen, bei welchen es nicht notwendig ist, die Sequenz zu kennen, sondern nur Tendenzen bestimmt werden sollen. Als ein Beispiel kann die Bestimmung des Grads der Homologie oder Komplementarität zwischen zwei oder mehr Spezies oder zwei oder mehr Gruppen von exprimierten Genen erwünscht sein. Statistische oder halbstatistische Sonden gegenüber einem statistischen oder halbstatistischen Ziel können prozentuale Homologiewerte bereitstellen. In diesen Fällen können Sonden oder Ziele, welche unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, z.B. in die Kategorie nicht homolog fallen, für eine weitere Analyse verwendet werden, um deren Sequenzen zu bestimmen. Solch ein Verfahren kann für das Auffinden von Genen verwendet werden.
  • Ein praktisches Beispiel zur Verwendung dieser drei Ansätze ist die Messung von Genexpressionsprofilen. Der grundlegendste Weg zur Messung eines Gen expressionsprofils ist statistisch, wobei die Zahl der mRNAs („message") gezählt wird, welches für jedes einzelne Gen innerhalb einer bestimmten Zellprobe erzeugt wird. Je mehr mRNA-Kopien eines bestimmten Gens vorliegen, umso höher ist das Expressionsniveau. Der normalerweise herangezogene Ansatz ist die Trennung einer repräsentativen Anzahl von mRNAs durch ein Verfahren zum Kopieren der mRNA in komplementäre DNA (cDNA) und dann Aufziehen der einzelnen Klonkolonien jeder cDNA auf Kulturplatten. Normalerweise werden cDNAs entweder durch Insertion in ein Plasmid oder einen Phagemidklonierungsvektor kloniert, und dann in Bakterien transformiert bzw. in einen Phagen eingekapselt. Jeder Klon stellt eine einzelne mRNA dar, welche von der Gesamtpopulation stammt. Die Gruppe von Klonen umfasst eine Genexpresssionsbibliothek.
  • Gegenwärtig ist der allgemeine Ansatz, welcher bei der Genomforschung zum Screening der Klone und zur Identifizierung, welche mRNA/Gen welchem Klon entspricht, die Sequenzierung der DNA. Ein Teil jeder cDNA-Klonsequenz wird gelesen unter Erzeugung eines exprimierten Sequenztags (EST, „expressed sequence tag"), welcher die mRNA/Gensequenz unikal identifiziert. Die Identität wird hergestellt durch Vergleich des EST mit den genomischen Datenbasen, welche zuvor identifizierte Gensequenzen enthalten. In einigen Jahren werden alle humanen EST-Sequenzen in bestehende öffentliche und private Datenbanken gestellt worden sein.
  • Wenn eine bestimmte Klonbibliothek gescreent wird, möglicherweise eine Bibliothek, welche 10.000 Klone enthält, erscheint jedes bestimmte EST mehrere Male. Je häufiger ein bestimmtes EST auftaucht, umso höher ist das Expressionsniveau des Gens, welches dem EST entspricht. Je mehr Klone gelesen werden können, umso mehr werden die EST-Daten in Bezug auf die tatsächliche Expression statistisch repräsentativ sein. Das Screening größerer Zahlen von Klonen macht es auch wahrscheinlicher, dass Gene, welche mit niedrigem Niveau exprimiert werden, identifiziert werden.
  • Angesichts dieser Tatsache wäre es ideal, 100.000 oder mehr Klone pro Bibliothek screenen zu können. Diese Menge ist jedoch unter Verwendung der existierenden Sequenztechologie teuer und unmöglich. Typische Sequenz screens analysieren 500, 10.000 Proben bei Kosten von $ 5.000 bis $ 100.000. Neue DNA-Sequenzierungstechnologien können diese Kosten etwas verringern.
  • Die massemarkierten Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung können die Genexpressionsanalyse vereinfachen und deren Kosten verringern. Der Sondenansatz verwendet primär das Wissen der zu analysierenden Gene. Da die überwältigende Mehrheit der Gensequenzen innerhalb weniger Jahre bekannt sein wird, ist es nicht notwendig, eine Technik von neuem zu verwenden. Es ist auch möglich, zuvor unbekannte Gene mit diesen Hybridisierungsverfahren nachzuweisen. Die komplette Identifizierung von neuen Genen kann nach einem Hybridisierungsassay eine getrennte DNA-Sequenzanalyse erfordern, um die Sequenz von beliebigen dieser neu gefundenen Gene zu bestimmen.
  • Ebenso wie im Fall des auf Sequenzierung basierenden Ansatzes der Genexpressionsanalyse betreffen die Hybridisierungsansätze der vorliegenden Erfindung normalerweise eine Umwandlung der mRNA-Population in cDNA, eine Transformation der cDNA in Bakterien und Wachsen der Bakterienkolonien auf Kulturplatten und Screening von bakteriell erhaltenen Plasmiden. Nach dem Verfahren gemäß Ansatz (A), der Hybridisierung einer Bibliothek von bekannten Sonden gegen eine Bibliothek von unbekannten Zielen (die cDNA-Klone), können die zu untersuchenden Klone in einem regelmäßig angeordneten Array oder Gitter auf einer Oberfläche, wie etwa einem Nylonfilter, Glas, Silikon oder Gold, aufgetupft werden. Das typische Verfahren, welches Bakterienkolonien einbezieht, umfasst die Lyse der Bakterienzellen auf dem Gitter und Fixieren der DNA auf der Oberfläche. Das cDNA-Gitter stellt die Bibliothek von mehreren Zehn bis Hundert bis Tausend von zu sondierenden exprimierten mRNAs dar.
  • Bei konventionellen Verfahren kann ein Gitter mit nur einer einzelnen Sondensequenz zu einem Zeitpunkt sondiert werden, welche normalerweise radioaktiv markiert ist, wie in 9A gezeigt. Nach dem gitterförmigen Anordnen der unbekannten cDNA wird die cDNA-Bibliothekanordnung mit einer Lösung benetzt, welche die markierte Nukleinsäuresonde enthält. Die Gitter-Sonden-Lösung wird inkubiert, damit die Sonde mit dem komplementären Molekül an einer oder mehreren Positionen innerhalb des Gitters hybridisieren kann. Nach der Hybridisierung wird das Gitter abgebildet, um die Positionen der Sondenhybridisierung zu lokalisieren. Um mehrere Sonden zu verwenden, welche mehrere Gene darstellen, muss das Gitter repliziert werden, und für jede Sonde wird ein unterschiedliches Gitter verwendet. Unter Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen können vier unterschiedliche Chromophore innerhalb einer Probe im Multiplexverfahren verwendet werden und einzeln nachgewiesen werden mit der Hilfe einer Auflösungs-Software für das Fluoreszenzemissionsspektrum, wie in 9B gezeigt wird. Die praktische obere Grenze für ein Fluoreszenzmultiplexverfahren liegt jedoch wahrscheinlich bei etwa 10 unterschiedlichen Markierungen, aufgrund des breiten überlappenden Spektrums, welches durch existierende Fluoreszenzchromophore erzeugt wird.
  • Die Verwendung von freisetzbaren nicht flüchtigen Massemarkierungen zur unikalen Markierung von einzelnen Sonden stellt ein Mittel bereit zur Verwendung Gruppe von Sonden im Hoch-Multiplexverfahrent, um gleichzeitig ein einzelnes Gitter von Unbekannten zu screenen. Die Nukleinsäuresonden können synthetisiert werden unter Verwendung von einzelnen cDNAs mit bekannter Sequenz als Template. In allen Fällen können bei den Sonden Kombinationen von Massemarkierungen oder einzelne Massemarkierungen verwendet werden. Nach der Synthese und Massemarkierung können die unterschiedlichen Sonden kombiniert und verwendet werden, um ein einzelnes Gitter in einem Multiplexverfahren zu sondieren. Das Sondierungsverfahren ist identisch mit dem Verfahren, welches bei einer einzelnen radioaktiv markierten Sonde verwendet wird, bis der Abbildungsschritt erreicht wird. Anstelle der Verwendung eines Phosphorimagers oder Röntgenfilms wird das Gitter innerhalb des Massenspektrometers nach der Freisetzung der Markierungen gescannt, wobei an jeder Position kurz angehalten wird, um das Massemarkierungssignal nachzuweisen, welches gegebenenfalls vorliegt.
  • Die Zahl der verwendeten Sonden ist nur beschränkt durch die Anzahl der Sonden, welche man durchführen will, und durch die Anzahl, an welcher man interessiert ist. Als ein Beispiel kann man an einer Gruppe von 1000 Genen interessiert sein, welche eine wichtige Rolle bei einer bestimmten Erkrankung spielen oder man kann wünschen, 50.000 unterschiedliche Gene anzuschauen. In jedem Fall können die Proben einzeln synthetisiert oder in Kombinationen in Mikrotiterplatten erzeugt werden unter Verwendung von Robotern zur Handhabung von Flüssigkeiten („Liquid Handling Robots"). Ähnliche Ansätze umfassen die Durchführung von T7-RNA-Polymerase-Transkriptionen von Plasmiden, welche bekannte cDNA-Inserts enthalten, unter Verwendung von massemarkierten Nukleosidtriphosphaten, um massemarkierte RNA-Sonden zu erzeugen, PCRTM-Reaktionen zur Amplifikation bekannter cDNA-Inserts entweder unter Verwendung von massemarkierten Nukleosidtriphosphaten oder von massemarkierten DNA-Primern, um massemarkierte DNA-Sonden zu erzeugen, oder chemisch synthetisierte massemarkierte Oligonukleotidsonden. Beispiele für eine enyzmatische Sondensynthese werden in 4C und 4D bereitgestellt. Innerhalb jeder Synthesereaktion wird ein unterschiedliches einzelnes oder eine unikale Kombination von massemarkierten Nukleosidtriphosphaten zugegeben, welche dabei eine unikale Massesignatur innerhalb jeder neu synthetisierten Sonde einfügen. In den Fällen von massemarkierten Oligonukleotidsonden ist es auch möglich, chemisch synthetisierte kombinatorische Sonden zu verwenden. Nach der Synthese wird die Sondengruppe zusammengemischt, um eine Mastersondenmischung zu erzeugen. Falls erwünscht, können viele Mastersondengemische hergestellt werden, um ein Multiplexverfahren durchzuführen, wobei jede cDNA jeder Mastersondenmischung eine unikale Massemarkierungssignaturkombination aufweist. Die Sondengruppe oder -gruppen können dann verwendet werden, um eine große Anzahl unbekannter komplementärer DNA zu sondieren, welche in Bibliotheken gitterförmig angeordnet ist, wie in 9C gezeigt wird. Unterschiedliche Bibliotheken können aus einer Vielzahl von Proben hergestellt werden, welche beispielsweise unterschiedlichen Stressorbedingungen und/oder unterschiedlichen Testpharmazeutika ausgesetzt werden, wobei die Zeit möglicherweise als weitere Variable dienen kann.
  • Ein alternatives Verfahren für die Genexpressionsanalyse folgt dem Verfahren von Ansatz (B), der Hybridisierung einer Bibliothek von unbekannten Sonden gegen eine Bibliothek von bekannten Zielsequenzen. Man kann eher Bibliotheken von unbekannten cDNAs markieren und gegen nicht markierte Gensonden hybridisieren, welche auf einem Gitter angeordnet sind, als bekannte Gensonden unikal zu markieren, um sie gegen unbekannte cDNAs zu hybridisieren. Dieses Verfahren ist für zwei Bibliotheken unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten unbekannten cDNA-Gemischen beschrieben worden (Schena et al., 1995), wie in 10A gezeigt. In dem Fall von Fluoreszenz wird eine Erststrang-cDNA aus zwei getrennten Zellproben hergestellt. Die Synthese des ersten Gemisches aus cDNAs wird in Gegenwart eines bestimmten Fluoreszenznukleotids durchgeführt, und die Synthese des zweiten Gemisches in Gegenwart eines anderen Fluoreszenznukleotids. Das Gemisch der cDNAs, welches die relative Häufigkeit von unterschiedlichen mRNAs aus jeder Probe widerspiegelt, wird dann gemischt und kompetitiv mit einer gitterförmigen Anordnung von bekannten Genen hybridisiert, welche auf einer Festphasenfläche vorliegen. Nachdem die cDNAs mit dem Gitter hybridisiert wurden und nicht gebundene markierte cDNAs abgewaschen wurden, wird die relative Fluoreszenzintensität der zwei Farbstoffe an jeder Position in der gitterförmigen Anordnung gemessen. Wenn die Fluoreszenzintensität jedes Farbstoffs äquivalent ist, dann wurden die entsprechenden mRNAs aus jeder Probe mit einem ähnlichen Niveau exprimiert. Wenn die Fluoreszenzintensität für einen Farbstoff an einer bestimmten Position/Gen in der gitterförmigen Anordnung stärker ist als für den anderen, dann wurde das Gen in der Probe, deren Fluoreszenz stärker war, mit einem höheren Niveau exprimiert.
  • Es ist eher durch Verwendung der Massemarkierungsverfahren zur Herstellung der cDNAs als durch Fluoreszenz möglich, cDNAs aus vielen unterschiedlichen zellulären Quellen herzustellen und mit der gitterförmigen Anordnung von bekannten Genen gleichzeitig zu hybridisieren. Anstelle von nur zwei oder drei cDNA-Pools, welche gleichzeitig verglichen werden, macht es die Verwendung von Massemarkierungen möglich, mehrere Zehn, wenn nicht Hunderte von cDNA-Pools gleichzeitig zu vergleichen, wie in 10B gezeigt. Die Massemarkierungen können durch einen beliebigen der beschriebenen geeigneten Freisetzungsmechanismen freigesetzt werden und das Gitter kann im Hinblick auf das Massemarkierungssignal gescannt werden. Die Intensität der Massesignale an einer bestimmten Gitterposition ist proportional zu der Menge der mRNA in der originalen Probe, welche der nachgewiesenen cDNA auf dem Gitter entspricht. Die relativen Verhältnisse der konkurrierenden Massemarkierungen werden bestimmt und stellen Information über die Unterschiede in der Genexpression zwischen allen unterschiedlichen Proben für alle vorhandenen Gene auf der gitterförmigen Anordnung bereit.
  • Die gleiche Multiplexmethodik massemarkierter Sonden kann verwendet werden, um Gene schnell in großen genomischen Bibliotheken zu kartieren. Gitterförmige Bibliotheken von P1-, PAC/BAC- und YAC-Klonen können auf die gleiche Art und Weise wie cDNA-Filter hergestellt werden. Untersuchungen mit mehreren Markierungen stellen ein Mittel bereit zum schnellen Mapping bzw. zur Kartierung von Genen und Identifizierung von Genclustern. Es werden Sonden verwendet, welche aus besonderen Kloninserts oder Gensequenzen erzeugt wurden, um genomische Bibliotheken oder Bibliotheken von cDNA-Klonen zu screenen. Hybridisierungsereignisse zeigen eine Überlappung der Insertsequenz im Fall genomischer DNA und das Vorliegen eines Gens im Fall von cDNA an. Diese Bibliotheken können auch verwendet werden für eine Sondierung zwischen Genomen, z.B. für eine Sondierung einer Bibliothek von C. elegans mit humanen Gensonden und umgekehrt.
  • Die Technologie zum Sondieren mit Massemarkierungen und zum Nachweis von Massemarkierungen innerhalb gitterförmiger Anordnungen kann auch bei anderen Festphasensystemen angewendet werden, bei welchen DNA-Proben verwendet werden, insbesondere Northern und Southern Assays. Bei diesen zwei Verfahren ist die Anfangsphase der Lauf eines Polyacrylamidgels und dann der Transfer der DNA auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Blottingverfahrens (Sambrook et al., 1989). Wie bei anderen oben beschriebenen Verfahren können massemarkierte Nukleinsäuresonden hergestellt werden, um mit diesen Filtern zu hybridisieren. In einer anderen Ausführungsform können Gemische von einzelnen oder Kombinationen von Massemarkierungen verwendet werden in einem Versuch eines Multiplexnachweis. Scanning des Filters nach der Hybridisierung und Waschen innerhalb des Massenspektrometers stellt ein Mittel bereit zum Nachweis und falls notwendig zur Quantifizierung der Menge der vorliegenden Massemarkierung an einem bestimmten Ort.
  • Eine weitere Ausführungform der Technologie ist die Verwendung von massemarkierten Proteinsonden in der Form von Antikörpern für eine Hybridisierung gegen ein- und zweidimensionale Proteingele. Ein Fachmann kann sich auch andere Kombinationen von massemarkierten Sondenmolekülen vorstellen, welche gegen Ziele hybridisiert werden, welche an eine Festphasenmatrix gebunden sind. In allen Fällen wird die Massemarkierung freigesetzt und entweder wird die Festphasenoberfläche unter Verwendung eines Scanning-Massenspektrometers analysiert oder es findet vor der Massenanalyse ein Transfer auf eine andere Fläche statt.
  • Die Verbindung des genetischen Ziels oder eines anderen Ziels mit einem Filter oder einer andere Art eines Gitters ist als Teil der breitesten Ausführungsformen der Erfindung nicht notwendig. Beispielsweise kann eine Gruppe massemarkierter Sonden direkt mit DNA- oder RNA-Zielen in Lösung hybridisiert werden. Um zwischen den hybridisierten und den nicht hybridisierten Sonden zu unterscheiden, muss eines von zwei möglichen Ereignissen auftreten. Entweder müssen die Massemarkierungen an hybridisierten Sonden enzymatisch freigesetzt werden unter Verwendung einer doppelstrangspezifischen Nuklease, wie etwa Exonuklease III, Lambda-Exonuklease, T7-Gen-6-Exonuklease oder einer Restriktionsendonuklease, oder es muss ein Teilungsereignis auftreten, worin nicht hybridisierte Sonden von hybridisierten Sonden getrennt werden. Ein Fachmann kann sich mehrere andere Mittel zum Aufteilen vorstellen als das vorherige Binden des Ziels an eine Festphasenanordnung, wie in den Verfahren oben beschrieben, wie etwa eine Verlängerung der hybridisierten Sonde durch eine Polymerase unter Verwendung von biotinylierten Nukleotiden, oder einer Kopplung der massemarkierten Sonde mit einer biotinylierten Sonde als Teil eines Amplifikationsereignisses, wie etwa PCRTM oder LCR.
  • Sowohl im Fall der Nuklease als auch im Fall einer Aufteilung kann ein Amplifikationsereignis verwendet werden, um eine signifikante Menge der Massemarkierung zu erzeugen. Massemarkierungen, welche an eine Sonde angeheftet werden, welche stromabwärts von einem der PCRTM-Primier hybridisiert, können während der PCRTM-Amplifikation freigesetzt werden unter Verwendung der Nick-Translations-5'-3'-Exonuklease-Aktivität der thermostabilen Polymerase. Massemarkierungen innerhalb von Primern können unter Verwendung einer 5'-3'-Exonuklease, wie etwa der T7-Gen-6-Exonuklease nach der Amplifikation freigesetzt werden. In Ausführungsformen, bei welchen ein massemarkierter Primer mit einem biotinylierten Primer während der Amplifikation gekoppelt wird, oder bei welchem Biotin durch die Verwendung von biotinylierten Nukleotiden eingefügt wird, und das Produkt von den nicht eingefügten Primern abgeteilt wird, ist es möglich, für die Freisetzung der Massemarkierung eine unspezifische Spaltung zu verwenden, wie etwa chemische Spaltungsverfahren.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein Hybridisierungs-spezifischer Nukleaseverdau auch verwendet werden, um eine Probe zu spalten, welche sowohl Biotin als auch eine Massemarkierung enthält, in einem Assay, in welchem festphasengebundenes Streptavidin verwendet wird, um nicht gespaltene Massemarkierungen zu entfernen. Beispiele für solch eine Spaltung betreffen die Verwendung einer doppelstrangspezifischen Nuklease, wie die oben beschriebene. Es können Restriktionsendonukleasen verwendet werden, um eine Sonde zu spalten, welche eine Restriktionsstelle im Zentrum und eine Massemarkierung und Biotin an gegenüberliegenden Enden der Sonde enthält. Ein anderes Beispiel, bei welchem RNA als eine Sonde verwendet wird, betrifft die doppelstrangspezifische Spaltung unter Verwendung von RNase H.
  • In einem anderen exemplarischen Verfahren für den Nachweis eines amplifizierten einzelsträngigen Ziels, wie etwa das durch eine T7-RNA-Polymerase-Transkription erzeugte Ziel, wird eine doppelsträngige Sonde hergestellt, wobei die Massemarkierung mit dem Strang verbunden ist, welcher hinsichtlich der Sequenz homolog zum Zielstrang ist. Der massemarkierte Strang wird dann durch eine kompetitive Hybridisierung mit dem Ziel verdrängt und die Massemarkierung wird durch eine einzelstrangspezifische Exonuklease, wie etwa Exonuklease VII, Mungobohnen-Nuklease oder Nuklease S1, freigesetzt. Bei einem alternativen Verfahren wird die Verwendung eines einzelstrangspezifischen chemischen Spaltungsreagenz zur Freisetzung der Massemarkierung aus einer chemisch modifizierten Sonde angewandt. Beispiele für chemische Modifikationen, welche eine einzelstrangpezifische Freisetzung einer Massemarkierung ermöglichen, umfassen die Spaltung einer Ribonukleotidbase durch Umesterung, eine Phosphoramidatspaltung durch Säure und ein 5'-P-S-Phosphorthioat, welches durch Silbernitrat spaltbar ist, wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • Es kann auch eine PCRTM mit der Verwendung eines massemarkierten Primers und eines Restriktionsenzyms kombiniert werden, um die Freisetzung einer Massemarkierung nur dann zu ermöglichen, wenn eine Amplifikation auftritt. In dieser Ausführungsform enthält der massemarkierte PCRTM-Primer die Sequenz einer Restriktionsstelle, welche nur als Teil des Amplifikationsverfahrens doppelsträngig wird. Wenn die Stelle einmal doppelsträngig ist, wird sie durch das Restriktionsenzym erkannt und gespalten. Dieses Spaltungsereignis setzt die Massemarkierung aus der Masse der Primer frei und das PCRTM-Produkt kann unikal nachgewiesen werden.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung, bei welcher massemarkierte Sonden verwendet werden können zur Messung von mRNA-Spiegeln in Lösung, ist schematisch in 14 gezeigt. Eine Reihe von genspezifischen, massemarkierten Sonden (1–100 pro Untersuchung) werden zu dem mRNA-Pool (oder eher zu den Erst-Strang-cDNAs, welche von dem mRNA-Pool stammen) zugegeben und hybridisiert. Jede genspezifische Sonde trägt eine unikale Massemarkierung und eventuell mehrere Kopien dieser Markierung, um die Sensitivität zu steigern. Das hybridisierte Gemisch wird mit einer Doppelstrang-spezifischen Exonuklease behandelt, welche die Massemarkierungen für den Teil der Probenpopulation freisetzt, welche mit Zielgenen hybridisierte. Nur wenn die mRNA eines interessierenden Gens vorliegt, wird die entsprechende Massemarkierung freigesetzt und nachgewiesen. Außerdem ist die Signalintensität für die bestimmte Massemarkierung proportional zur relativen Häufigkeit der bestimmten mRNA innerhalb des Pools. Vergleiche der relativen Intensitäten der unterschiedlichen Massemarkierungen spiegeln die relativen mRNA-Expressionsniveaus wider. Das relative Genexpressionsmuster für immerhin 38.400 Gene konnte in einer einzelnen 384 Mikrotiterplatte sondiert werden, wenn 100 unterschiedliche Sonden pro Well verwendet wurden. Umgekehrt konnte eine Gruppe von 100 Genen untersucht werden bei 384 unterschiedlichen Proben in einem einzigen Mikrotiterplattenexperiment.
  • Es gibt Beispiele, bei welchen gefunden werden kann, dass die Sensitivitätsniveaus der Massenspektrometrie nicht ausreichend sind, um die mRNA-Niveaus direkt zu beobachten, z.B. aufgrund von kleinen Mengen von Zellen als Ergebnis eines schlechten Zellwachstums, oder bei Tiermodellproben, welche von sehr kleinen Gewebebiopsien stammen. Bei solchen Proben kann es notwendig sein, mRNA-Amplifikationsschemata in die Methodik einzufügen.
  • Wie zuvor beschrieben, ermöglicht die Verwendung von Nukleasen, welche massemarkierte Nukleinsäuresonden verdauen, wenn diese mit einer Zielnukleinsäure hybridisieren, die Möglichkeit für eine lineare Amplifikation des Signals. In Fällen, in welchen die Ziel-DNA einzelsträngig ist und signifikant länger als die verwendete Sonde, ist es möglich, selektiv nur die Sonde zu verdauen. Der Verdau der Oligonukleotidsonde bewirkt, dass der Zielstrang wiederholt verfügbar wird für mehrere Runden der Hybridisierung und des Verdaus. Diese Art von Amplifikation kann leicht zwei bis drei Größenordnungen der Amplifikation erreichen.
  • Da irgendeine bestimmte Untersuchung nur eine relativ kleine Anzahl von Genen beobachten kann, z.B. 20 bis 100, kann es möglich sein, eine oder wenige Multiplex-PCRTM-Reaktionen zu verwenden, um nur die Ziele zu amplifizieren, welche mit der Gruppe von Sonden verbunden sind. Die Verwendung von PCRTM oder anderen Amplifikationsverfahren kann die Entwicklung von zusätzlichen Kontrollen erfordern, um den Einfluss der Amplifikationsartefakte zu verringern. Die Mulitplexfähigkeit von massemarkierten Sonden erleichtert es, eine oder mehrere Kontrollen einzufügen. Die Verwendung von redundanten oder halbredundanten Primern, wie etwa diejenigen, welche in Differential-Display-Verfahren verwendet werden, können auch einen effektiven Amplifikationsweg bereitstellen. In allen Fällen, bei welchen für die Amplifikation eine Polymerase, wie etwa die Taq-DNA-Polymerase, verwendet wird, kann die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität verwendet werden, die Sonde zu verdauen, während die Amplifikation weitergeht (Holland et al., 1991).
  • Alle die Lösungsphasenverfahren, einschließlich der Verfahren, bei welchen eine Aufteilung angewandt wird, welche oben beschrieben sind, können als ein Mittel verwendet werden zur Kopplung der Freisetzung einer Massemarkierung an das Vorliegen einer bestimmten mRNA-Sequenz. Andere Verfahren, welche bei der Amplifikation der mRNA-Population verwendet werden können, umfassen die Ligasekettenreaktion, die in vitro-Transkription der cDNA-Population und Varianten von Verfahren zur Herstellung von cDNA-Bibliotheken, wie etwa das Plasmidwachstum von polyklonaler cDNA in einzelnen Wells.
  • Da der vollständige Satz von Genen eines Organismus verfügbar wird, ist es vorstellbar, im Voraus die komplette Gruppe von massemarkierten Sonden für eine Genexpressionsanalyse herzustellen. Da die Sonden enzymatisch synthetisiert werden, kann ein großer Stamm dieser Sonden relativ kostengünstig in weniger als einer Woche Aufwand hergestellt werden. Es ist auch möglich, schnell ein Repertoire von massemarkierten Sonden durch chemische Mittel herzustellen.
  • Obwohl die bevorzugte Ausführungsform für die hierin beschriebenen Assays die Verwendung nicht flüchtiger freisetzbarer Massemarkierungen oder involatiler freisetzbarer Massemarkierungen ist, können andere Arten von Markierungen auch verwendet werden, wie etwa Isotopenmassemarkierungen, flüchtige Massemarkierungen (einschließlich Elektrophore), Fluoreszenzmarkierungen und Chemilumineszenzmarkierungen.
  • N. Multiplexverfahren bei Massemarkierungssubstraten in Affinitätsassays
  • Die hierin offenbarten Verfahren können auch angewendet werden in indirekten Schemata zur Identifizierung des Vorliegens von einem oder mehreren Zielbiomolekülen. Indirekte Schemata, wie etwa Enzym-gebundene Immunosorbent-Assays (ELISAs) stellen ein Verfahren bereit zur Anwendung der Umwandlung eines Substrats in ein Produktmolekül über einen enzymatischen Umsatz des Substrats. Die enzymatische Katalyse eines Substrats führt zu einer linearen Amplifikation des Signals des Produkts.
  • In einem ELISA werden die Zielmoleküle, welche im Allgemeinen an die Festphase gebunden sind, durch einen Antikörper erkannt, welcher nicht kovalent an das Ziel bindet. Der Erkennungsantikörper ist mit einem Enzym verbunden, welches zur Katalyse der Substratumwandlung in das Produkt verwendet wird. Traditionelle ELISA-Verfahren setzen kleinmolekulare organische Substrate ein, welche bei Umwandlung in ein Produkt durch ein Enzym, wie etwa alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder Urease, ein Molekül mit veränderten optischen Qualitäten ergeben, z.B. wird die Lösung farbig oder das Produkt besitzt eine starke Fluoreszenz. Außerdem erzeugt die Umwandlung des Substrats oft eine Masseveränderung, folglich kann das Produkt als eine Massemarkierung agieren, welche durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann. Die Menge des Produkts kann entweder absolut oder relativ zu dem verwendeten Substrat quantifiziert werden, unter Kenntnis der Enzymumwandlungsraten und Reaktionsbedingungen, und zur Berechnung der Menge des in dem Assay vorliegenden Zielmoleküls verwendet werden.
  • Verfahren für traditionelle ELISA-Assays sind gut etabliert (siehe "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 2, Kapitel 11, hierin als eine Referenz enthalten). Es existieren mehrere Protokolle, welche indirekte, direkte kompetitive, Antikörper-Sandwich-, Zweifach-Antikörper-Sandwich-, direkte zelluläre und indirekte zelluläre Assays umfassen. Die in dieser Anmeldung vorgesehene Modifikation der Massemarkierung wird so gestaltet sein, dass unbekannte Mengen von Zielbiomolekülen durch Anpassung der traditionellen ELISA-Verfahren gemessen werden. In dieser Modifikation werden Zielbiomoleküle kovalent oder nicht kovalent mit einer Fläche verbunden, wie etwa einem Bead oder einer Plastikschale, entweder direkt oder durch ein kleines "Einfang"-Molekül (Ligand) oder ein Protein (wie etwa einen Antikörper). Das Zielbiomolekül kann auch ein Bestandteil einer Zelle sein, welche an die Fläche des Gefäßes gebunden sein kann. Die Festphasen-Zielbiomoleküle werden mit einem Zielerkennungsmolekül (Antikörper, Ligand, Oligonukleotid usw.) inkubiert, welches eine spezifische Affinität für das Zielbiomolekül aufweist. Dieses Zielerkennungsmolekül ist mit einem Enzym verbunden. Für Multiplexassays muss jedes Zielerkennungsmolekül kovalent mit einem Enzym verbunden sein mit einer unikalen katalytischen Aktivität für die Unterscheidung der unterschiedlichen Ziele (typisch für die Protokolle des "direkten" Assays). Diese konjugierten Zielerkennungsmoleküle können an das Substrat binden, ungebundene Moleküle werden durch Waschen entfernt, dann werden die Enzymsubstrate unter Bedingungen hinzugefügt, bei welchen gebundenes Enzym mit seinem Substrat reagiert unter Freisetzung eines Produkts mit einer unikalen Masse, welches unter Verwendung von Massenspektrometrie nachweisbar ist.
  • "Einfang-Antikörper" mit einer hochspezifischen Bindungsaffinität für die Antigene können für lösliche Antigene erforderlich sein. Verfahren zur Herstellung von spezifischen Antikörpern entweder zum Einfangen oder zur Quantifizierung von Antigenen sind in der Literatur gut etabliert. Verfahren für Konjugation von Enzymen und Antikörpern sind ebenso gut etabliert und können Vernetzungsmittel, wie etwa Glutaraldehyd oder eine Konjugation durch Peroxidoxidation umfassen. Gereinigte DNA-Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich. Es können auch neue Enzyme mit einer unikalen katalytischen Aktivität unter Verwendung von etablierten molekularen Verfahren entwickelt werden.
  • Die Leichtigkeit des Nachweises von Multiplex-Massemarkierungen ermöglicht die Gelegenheit für die Durchführung von mehrfachen Immunoassays gleichzeitig in einer einzigen Lösung. Es können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, konjugiert mit Antikörpern oder anderen Zielerkennungsmolekülen, verwendet in Kombination mit einer Reihe von enzymspezifischen Substraten, um enzyma tische Produkte zu erhalten, welche im Hinblick auf die Masse unikal sind und deshalb durch Massenspektrometrie unikal nachweisbar und quantifizierbar sind.
  • Neben einem Multiplexverfahren mit einer Gruppe von Enzymen und Substraten, welche nicht miteinander zusammenhängen, können auch Klassen von Enzymen einem Multiplexverfahren unterzogen werden, welche eine Klasse von Substraten modifizieren. Beispielsweise können Enzymklassen, welche alle das gleiche Substrat erkennen, es aber auf unterschiedliche Arten modifizieren, verwendet werden, ebenso wie viele Enzyme, welche bestimmte chemisch zusammenhängende Substrate erkennen und modifizieren, wobei die Variationen in der Struktur die Spezifität von bestimmten Enzymen für das bestimmte Substrat verändern.
  • Eine Klasse von Enzymen, welche alle die gleichen oder wenige Substrate erkennen, sind Proteasen. Proteasen erkennen unterschiedliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzmotive und spalten die Amidbindung, wobei zwei oder mehr Fragmente erhalten werden. Beispiele für Proteasen und deren Spezifitäten umfassen: Trypsin, welches an der C-terminalen Seite sowohl von Arginin- als auch Lysinresten spaltet, Thrombin, welches bei Arginin spaltet, Glu-C, welches an der C-terminalen Seite von Glutaminsäureresten spaltet, Lys-C, welches an der C-terminalen Seite von Lysinen spaltet und Asp-N, welches an der N-terminalen Seite von Asparaginsäureresten spaltet. Kleine Polypeptide, welche spezifische Aminosäuren und/oder Aminosäuresequenzmotive enthalten, können als Substrate für einen proteolytischen Verdau verwendet werden. Die Verwendung von einem oder wenigern Polypeptiden, welche von unterschiedlichen Proteasen unterschiedlich erkannt und gespalten werden, etabliert eine Situation, bei welcher ein Wettbewerb um das Substrat vorliegt. Die Verwendung von kompetitiven Substraten und Messungen der relativen Verhältnisse von unterschiedlichen Produkten, welche vom gleichen Substrat stammen, können eine genauere Messung der relativen Quantitäten von unterschiedlichen Zielbiomolekülen ermöglichen.
  • Ein potenzielles Problem der Verwendung von Proteasen ist deren möglicher Verdau von Antikörpern und anderen Proteinen, welche für den Bioassay erforderlich sind. Dieses Problem kann überwunden werden durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich der sorgfältigen Auswahl der Proteasen, einer selektiven chemischen Modifikation zur Blockierung der Proteolyse unter Verwendung von Proteinaseinhibitoren, einschließlich der Proteaseinhibitoren, welche kompetitiv durch die Reaktionssubstrate verdrängt werden. Alternativ können Proteasen bei anderen nicht auf Proteinen basierenden Assays verwendet werden, wie etwa der Sondierung von Nukleinsäure unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, welche mit den Proteasen konjugiert sind. Andere Enzymklassen, welche anstelle von Proteasen verwendet werden können, umfassen Kinasen, welche ihre Substrate phosphorylieren, und Nukleasen.
  • Ribonukleasen und Desoxyribonukleasen besitzen eine abweichende Spezifität. Endonukleasen, wie etwa RNase T1, Rnase U2 und Rnase CL3, zielen auf die Nukleotide G, A bzw. C. Auf ähnliche Art und Weise wie die Verwendung von kleinen Polypeptiden als Substrat für Proteasen können kleine Oligonukleotide mit Nukleasen verwendet werden. Nuklease-resistente Nukleotide, wie etwa Phosphorthioate, Methylphosphonate, Boranphosphate und Peptidnukleinsäuren, können in die Substrate eingefügt werden, um die Spezifität der unterschiedlichen Nukleasen auf den Erhalt unikaler Produkte zu richten. Im Gegensatz zu Peptiden, welche einfach und leicht durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden können, kann es bevorzugt sein, die Oligonukleotide durch das Hinzufügen von Polypeptiden oder anderen Molekülen zu modifizieren, um die Analyse in dem Massenspektrometer zu verbessern und zu erleichtern.
  • Eine andere Enzymklasse sind Restriktionsendonukleasen. Die Verwendung von Restriktionsenzymen fällt unter den oben beschriebenen zweiten Fall, bei welchem Substrate chemisch verwandt sein können, aber Variationen in der Struktur deren Spezifität verändern, dahingehend, welches Enzym der Klasse das Substrat erkennt und es modifiziert. In diesem Fall sind die Strukturveränderungen Veränderungen in der Sequenz der Substrate. Die Substrate selbst sind kleine doppelsträngige Oligonukleotide, welche eine oder mehrere Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen und Spaltungsstellen enthalten. Ähnlich wie die oben beschriebene Verwendung von Nukleasen und wie in den anderen Abschnitten dieser Erfindung beschrieben wird, ist es bevorzugt, die Oligonukleotide durch die Addition von Polypeptiden oder anderen Molekülen zu modifizieren, um die Analyse und Selektivität in dem Massenspektrometer zu verbessern und zu erleichtern. Da viele Restriktionsendonukleasen palindrome Sequenzen erkennen, ist es auch möglich, die Signalstärke durch die Verwendung von palindromen Oligonukleotidsubstraten, welche Dimere bilden, zweifach zu erhöhen. Jedes Spaltungsereignis bildet zwei identische Produkte. Es können auch längere Konkatamere hergestellt werden, wobei längere, mehrfach massemarkierte Substrate erzeugt werden.
  • Antikörper sind nicht die einzig möglichen Zielerkennungsmoleküle, welche in diesen Assays verwendet werden können. Polypeptide, welche von Verfahren wie etwa einem Phagendisplay mit Zielbindungseigenschaften stammen, ebenso wie eine Vielzahl von nativen Proteinen, welche eine gewisse interessante Bindungsaktivität zeigen, können anstelle dessen verwendet werden. Die Ziele können auch etwas anderes als Proteine sein und können eine Vielzahl von biologisch relevanten kleinen Molekülen enthalten, einschließlich Enzymcofaktoren, Hormone, Neurotransmitter und andere Biopolymere, einschließlich Polysaccharide und am wichtigsten Nukleinsäuren. Nukleinsäurehybridisierungswechselwirkungen können verwendet werden, wenn sowohl das Ziel als auch das Erkennungsmolekül aus Nukleinsäuren bestehen. Nukleinsäuren und andere Nicht-Peptid-Erkennungsmoleküle können mit dem Enzym verbunden werden, welches in die Substratumwandlung involviert ist, kovalent über eine Vielzahl von Bindungschemien, wovon einige hier in Abschnitt XXX beschrieben wurden, oder nicht kovalent durch eine Biotin/Avidin-Bindung, wobei das Avidin mit dem das Substrat umwandelnde Enzym verbunden ist. Ein Fachmann kann andere Bindungsverfahren identifizieren.
  • Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen und die Beispiele sind dienlich für das Verständnis der Erfindung. Fachleute sollten erkennen, dass die in den Beispielen offenbarten Verfahren repräsentativen Techniken folgen, wobei die Erfinder gefunden haben, dass diese in der Praxis der Erfindung gut funktionieren und folglich bevorzugte Verfahren der Praxis darstellen. Im Licht der vorliegenden Offenbarung sollten Fachleute jedoch erkennen, dass viele Veränderungen in den spezifischen Ausführungsformen, welche offenbart sind, vorgenommen werden können und noch immer ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Beispiel 1
  • Synthese von Peptid-markierten Oligonukleotiden
  • A. Herstellung von Peptid-gebundenen Nukleosid-5'-triphosphaten
  • Die Herstellung von Peptid-gebundenen Nukleosid-5'-triphosphaten umfasst die Synthese und die Kopplung von Allylamino-substituierten dNTPs. Ein Beispiel wird in 6A gezeigt. 5-(3-Aminoallyl)-2-desoxyuridin-5'-triphosphat (c) wurde hergestellt nach dem Verfahren von Langer et al. (1991). Die Behandlung von dUTP (a) mit Quecksilberacetat bei pH 5–7 ergibt das 5-Quecksilberderivat (b). Die Allylierung in Gegenwart eines Palladiumkatalysators ergab dann c, welches mit dem NHS-Ester (d) eines in geeigneter Art geschützten Peptids (Lysin- und N-terminale Amine mit FMOC-Gruppen blockiert) gekoppelt wurde. Die Entschützung der Base des Peptids ergab die Bildung des gewünschten Produkts (e). Alternativ wurde das Allyloamin-Nukleotid (c) nacheinander mit dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel mal-sac-HNSA (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, PA) und einem N-terminalen Cysteinpeptid behandelt, um das Konjugat (f) zu erhalten.
  • B. Herstellung von Peptid-markierten Phosphoramiditen
  • Peptidnukleosid-Phosphoramidit-Konjugate wurden aus 5'-geschützten Allylaminonukleosiden hergestellt, wie in 6B gezeigt. Eine selektive Dimethoxytritylierung von Uridin (h) ergab den 5'-DMT-Ether (i), welcher über das Quecksilbernukleosid mit einem Palladiumkatalysator allyliert wurde (Dale et al., 1973; Langer et al., 1981). Die Behandlung des NHS-Esters eines in geeigneter Weise geschützten Peptids und Umwandlung des Konjugats in das Phosphoramidit (Sproat et al., 1987) ergab die gewünschte Verbindung (k).
  • C. Synthese eines 5'-markierten Oligonukleotid-Peptid-Konjugats
  • Das Oligonukleotid g (6C) (SEQ ID NO: 10) wurde hergestellt unter Verwendung einer Festphasenphosphoramidit-Standardchemie. Die 5'-Aminomodifikation durch eine Disulfidbindung wurde erreicht durch sequenzielle Addition eines Thiomodifikationsmittels C6 S-S und eines Aminomodifikationsmittels C6 dT (Glen Research Inc., Sterling, VA) an das 5'-Ende. Das Oligonukleotid wurde mit dem heterobifunktionellen Reagenz mal-sac-HNSA (Bachem California Inc., Torrance, CA) durch die terminale primäre Aminogruppe ge koppelt, durch Auschlusschromatographie gereinigt und kovalent mit einem Peptid mit der Sequenz CGF GSG K durch das N-terminale Cysteinthiol gekoppelt. Das Konjugat wurde durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (7X). Der Peak bei m/z 8401 in 7X entspricht dem gewünschten Konjugat.
  • D. Synthese eines 3'-markierten Oligonukleotids
  • Ein 3'-phosphoryliertes Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-TGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTp-3' (SEQ ID NO: 1) wurde durch Phosphoramidit-Standardchemie synthetisiert. In 7A ist ein MALDI-Spektrum des nicht konjugierten Oligonukleotids gezeigt. Der 3'-terminale T-Rest des Oligonukleotids wurde mit einer primären Aminogruppe modifiziert, welche während der Synthese als das modifizierte Phosphoramidit (C6-Aminomodifikationsmittel, Glen Research Inc., Sterling, VA) eingefügt wurde. Das Oligonukleotid wurde durch die aktive Aminogruppe mit einem Peptid gekoppelt unter Verwendung des heterobifunktionellen Kopplungsreagenz mal-sac-HSNA (Bachem Inc., Torrance, CA). Die Sequenz des für die Kopplung an das Oligonukleotid verwendeten Peptids war CGYGPKKKRKVGG (SEQ ID NO: 2) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Reaktion zur Kopplung des Peptids mit dem Oligonukleotid tritt an der reaktionsfähigen Thiolgruppe an dem N-terminalen Cysteinrest auf. Nach der Kopplungsreaktion, welche nach einem Standardverfahren durchgeführt wird, wird das rohe gekoppelte Produkt durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Fraktionen, welche das gewünschte gekoppelte Produkt enthalten, wurden durch MALDI-MS identifiziert und wurden kombiniert und zur Trockene verdampft. Das getrocknete Material wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und die Konzentration durch UV-Extinktion bei 260 nm bestimmt. Ein MALDI-Massenspektrum des Oligonukleotid-Peptid-Konjugats wird in 7B gezeigt. Der Hauptpeak bei m/z 8622.8 stimmt gut mit dem gewünschten Produkt überein, während der Peak bei 7051.7 durch eine Restmenge von nicht umgesetztem Oligonukleotid (ca. 20%) hervorgerufen wird.
  • E. Synthese eines innen markierten Oligonukleotid-Peptid-Konjugats
  • Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-GGTTTACATGTTCCAA(AminoT)ATGAT-3' (SEQ ID NO: 11) wurde hergestellt durch Phosphoramidit-Standardchemie unter Verwendung des Aminomodifikationsmittels C6 dT (Glen Research Inc., Sterling, VA), um die innere Aminomodifikation einzufügen. Das Oligonukleotid wurde durch die innere primäre Aminogruppe mit dem heterobifunktionellen Reagenz mal-sac-HNSA gekoppelt (Bachem California Inc., Torrance, CA), durch Ausschlusschromatographie gereinigt und durch das N-terminale Cysteinthiol kovalent mit einem Peptid mit der Sequenz CGT RGS GKG TG gekoppelt. Das Konjugat wurde durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (7X). Der Peak bei m/z 8075 in 7X entspricht dem gewünschten Konjugat.
  • Beispiel 2
  • Nachweis einer spezifischen Zielsequenz
  • Als ein Beispiel für die Verwendbarkeit des Oligunukleotid-Peptid-Konjugats als eine Sonde in einer Hybridisierungsuntersuchung wurde ein Modellsystem entworfen unter Verwendung eines synthetischen komplementären Strangs als Ziel-DNA. Ein 42-mer wurde als ein Modellziel synthetisiert, welches die Sequenz 5'-CTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGT-3' (SEQ ID NO: 3) aufwies. Der Nachweis des Ziels beruhte auf der Freisetzung der Peptidmassemarkierung (SEQ ID NO: 2) von der Sonde durch einen Verdau mit der 3'-5'-Doppelstrang-spezifischen Exonuklease III mit einer Analyse durch MALDI-MS.
  • Ein Gemisch von 1 pmol Sonde und pmol Ziel in einem Volumen von 9 μl 1 × Exonuklease III-Puffer (66 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5, mM DTT; 6,6 mM MgCl2; 50 μg/ml BSA) konnte sich durch Erwärmen der Lösung für 2 Minuten in einem kochenden Wasserbad und dann langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur über den Verlauf von etwa 20 Minuten anlagern. Die Exonuklease III (USB, Cleveland, OH) wurde aus ihrer Stammkonzentration von 17,5 U/μl auf 0,35 U/μl in 1 × Puffer verdünnt, und ein 1 μl Aliquot wurde zu der Lösung mit aneinandergelagertem Ziel – Sonde zugegeben. Es waren vier Kontrollen enthalten und liefen gleichzeitig mit der Testlösung. Die Kontrollprobe A enthielt sowohl Ziel als auch Probe, aber keine Exonuklease III, die Kontrollprobe B enthielt Sonde und Exonuklease III, aber kein Ziel, die Kontrollprobe C enthielt Sonde und Exonuklease III zusammen mit einem statistischen, nicht komplementären 36-mer und die Kontrollprobe D enthielt nur Exonuklease III. Die Gemische wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein 1 μl Aliquot der Lösung wurde entnommen und oben auf einen polykristallinen Spot von 2,5-Dihydroxybenzoesäure auf einer MALDI-MS-Probenplatte hinzugefügt. Das resultierende Positvionen-Massenspektrum des Tests und der Kontrollproben A, B und C sind in 8A, 8B, 8C und 8D gezeigt. Nur die Testprobe in 8A zeigte einen Peak bei 2045.3, der Masse, welche für das freigesetzte Peptid-Nukleotid-Konjugat erwartet wurde, was zeigt, dass die Erfinder in diesem Modellsystem das Vorhandensein der Zielsequenz spezifisch nachweisen konnten durch ein empfindliches und schnelles Verfahren.
  • Selektive enzymatische Spaltung eines Peptids.
  • Die oxidierte Rinderinsulinkette B (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in Tris·HCl (pH = 7,8) wurde mit Endoproteinase Glu-C (w/w Verhältnis 20:1, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) für zwei Stunden bei 37°C behandelt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie untersucht. Die Analyse (XX) zeigte, dass das Insulin (SEQ ID NO: 12) effizient an der Carboxylseite der Glutamylreste in drei Fragmente gespalten wurde (m/z 1533 (FVNQHLC[SO3H]GSHLVE) (SEQ ID NO: 13), m/z 1098 (RGFFYTPKA) (SEQ ID NO: 14) und m/z 919 (ALYLVC[SO3H]GE) (SEQ ID NO: 15). Die relativen Intensitäten der drei Peaks in dem Massenspektrum spiegeln die Zahl der basischen (ionisierbaren) Funktionalitäten in drei Fragmenten wider. Das Fragment mit dem größten Molekulargewicht enthält zwei mäßig basische Hystidinreste und ist deshalb in dem Spektrum nur mäßig sichtbar. Das mittlere Fragment enthält stark basische Lysin- und Argininreste und stellt deshalb einen intensiven Peak dar. Im kleinsten Fragmen ist nur die terminate Aminogruppe für eine Protonierung verfügbar, und es ist deshalb in dem Spektrum kaum sichtbar.
  • Beispiel 3
  • Nachweis von mRNA unter Verwendung von massemarkierten Primern und rtPCRTM
  • Ein Paar von PCRTM-Primern für das Gen des ribosomalen Proteins L7 wurde durch Phosphoramidit-Standardchemie synthetisiert, wobei ein modifiziertes Aminothymidin (Glen Research, Sterling, VA) jeweils nahe dem 3'-Ende eingefügt wurde. Die Sequenz des forward-Primers war 5'-ATCTGAAGTCAGTAAAT*GAAC-3' (SEQ ID NO: 4) und die Sequenz des reverse-Primers war 5'-ATTTACCAGAGAT*CGAG-3' (SEQ ID NO: 5), wobei T* das aminomodifizierte Thymidin darstellt. Jeder Primer war massemarkiert mit einem unikalen Peptid durch eine Standardkopplungsreaktion zwischen der Aminogruppe des aminomodifizierten Thymidins und einer Sulfhydrylgruppe an dem Peptid durch den heterobifunktionellen Linker mal-sac-HNSA (Bachem Corp., Torrance, CA) und durch Ionenaustausch-HPLC gereinigt. Die für den forward-Primer verwendete Peptidmassemarkierung besaß die Sequenz CGYGPKKKRKVGG (SEQ ID NO: 2) und das Peptid für den reverse-Primer war CKNLNKDKQVYRATHR (SEQ ID NO: 6).
  • Mit 10 μg Gesamt-RNA, welche aus einer stabilen Tumorzelllinie isoliert wurde, wurde eine reverse Transkription zur Erzeugung von Erststrang-cDNA durchgeführt. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt und enthielt 0,5 mg Oligo dT15-Primer (SEQ ID NO: 9) und 25 Unit AMV reverse Transkriptase. Eine PCRTM-Reaktion wurde mit 1 μl der Erststrang-cDNA durchgeführt unter Verwendung von jeweils 10 pmol des massemarkierten forward-Primers und reverse-Primers und 0,25 Unit Taq-DNA-Polymerase in einer Reaktion mit 10 μl. Das rtPCRTM-Produkt wurde durch eine Mikrocon-30-Ultrafiltrationseinheit (Amicon, Inc., Beverly, MA) gereinigt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach Sammeln der DNA von der Filtereinheit wurde sie in einer Vakuumzentrifuge zur Trockene verdampft und in 3,5 μl H2O resuspendiert.
  • Dann wurde eine Verdauungsreaktion unter Verwendung der doppelstrangspezifischen 5'-3'-Exonuklease des T7-Gens-6 durchgeführt. Zu den 3,5 μl des gereinigten PCRTM-Produkts wurden 0,5 μl 10 × Puffer (660 mM Tris, pH 8, 6,6 mM MgCl2) zugegeben, gefolgt von 1 μl (5 Unit) T7-Gen-6-Exonuklease (Amersham Inc.). Gleichzeitig wurde ein Kontrollverdau durchgeführt und enthielt 5 Unit Enzym, 5 pmol des freien forward-Primers in einem identischen Puffer. Die Verdauungsreaktionen wurden bei 37°C für 60 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung des Enzyms (85°C für 15 Minuten). Zu jedem Verdau wurde ein kleiner Anteil Anionenaustauschharz (DEAE Sephadex A-25, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) zugegeben und eine Menge von 1 μl des Überstands wurde entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 25-Dihydroxybenzoesäurematrix). Das resutlierende Massenspektrum des verdauten PCRTM-Produkts und der Kontrolle sind in 15A bzw. 15B gezeigt.
  • Beispiel 4
  • Nachweis eines Gemisches von cDNA-Plasmiden
  • Ein Gemisch von jeweils 100 ng von sechs und 50 ng von sieben einzelsträngigen M13-Plasmidklonen, welche jeweils unikale Inserte enthielten, wurde entsalzt und in einer Mikrocon-30-Ultrafiltrationseinheit gemäß den Anweisungen des Herstellers aufkonzentriert. Die DNA wurde nach dem Sammeln zur Trockene verdampft und in 1 μl H2O resuspendiert. Ein Gemisch von sieben massemarkierten Sonden, jeweils mit 2,5 pmol enthalten, wurde zugegeben. Jede Sonde war komplementär zu einem Teil des Inserts für jeden Klon in dem Gemisch und wurde mit einer unikalen Massemarkierung gekoppelt. Die Sonden wurden durch Erhitzen des Gemisches auf 95°C für 30 Sekunden, gefolgt von einer einminütigen Inkubation bei 45°C hybridisiert. Nach dem Kühlen des Gemisches auf 37°C wurden 0,35 Unit Exonuklease III zugegeben und der Verdau wurde für 60 Minuten fortgeführt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann wurde eine kleine Portion DEAE Sephadex A25 Anionenaustauschharz (Aldrich Chemical Col, Milwaukee, WI) zugegeben. Eine Menge von 1 μl des Überstands wurde dann entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Dihydroxybenzoesäurematrix). Das resultierende Massenspektrum des Gemisches von freigesetzten Massemarkierungen wird in 16 gezeigt.
  • Beispiel 5
  • SNP-Analyse mit massemarkierten Primern und biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphaten
  • Ein Primer ("Primer A"), welcher eine chemisch freisetzbare Massemarkierung enthält, wird gemäß dem in Beispiel 1 C beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt. Zwei synthetische Templatstränge werden ebenso durch Standardverfahren der Festphasensynthese synthetisiert. Die Sequenz von Primer A ist 5'-LTSS-GTGCTCAAGAACTACATGG-3' (SEQ ID NO: 16) und die Sequenzen der Templatstränge sind 5'-TACTCCAGTTCCATGTAGTTCTTGAGCAC-3' (Templat 1T) (SEQ ID NO: 17) und 5'-TACTCCAGTACCATGTAGTTCTTGAGCAC-3' (Templat 1A) (SEQ ID NO: 18), wobei LT die Massemarkierung bedeutet, welche mit einem aminomodifizierten Thymidin verbunden ist, SS die chemisch spaltbare Disulfid-haltige Gruppe darstellt und die fettgedruckten Basenbezeichnungen in den Templatsträngen die polymorphen Stellen anzeigen, welche dem 3'-Ende des Primers benachbart sind. Der Primer ist massemarkiert mit einem synthetischen Peptid, welches die Sequenz CGRGSGK (SEQ ID NO: 19) besitzt. Es werden zwei Zyklussequenzreaktionen durchgeführt. Jede Reaktion enthält 2 pmol des massemarkierten Primers A, 100 fmol entweder von Templat 1T oder Templat 1A, 200 pmol Biotin-ddUTP (Boehringer-Mannheim, Inc.) und 2,4 Unit der thermostabilen DNA-Polymerase AmpliTaq-FS (Perkin-Elmer Inc.) in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Beide Reaktionen wurden unter Verwendung von typischen Hot-Start-Bedingungen gestartet. Die Reaktionen werden durchgeführt nach dem folgenden Thermozyklusprogramm: Denaturierung bei 90°C für 30 s, Annealing bei 50°C für 10 s, Verlängerung bei 65°C für 10 s, mit insgesamt 35 Zyklen. Nach Beendigung werden die Sequenzierungsreaktionen gereinigt durch Einfangen der verlängerten biotinylierten Produkte auf mit Streptavidin beschichteten Magnetbeads. Die Beads wurden gewaschen, um nicht verlängerten Primer zu entfernen und dann wurden die Massemarkierungen freigesetzt durch Behandlung des mit dem Bead verbundenen Produkts mit einem milden reduzierenden Mittel zur Spaltung der Disulfidbindung und Freisetzung der Massemarkierung in die Lösung. Eine Portion von 1 μl des Überstands wird entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Diyhdroxybenzoesäurematrix). Die resultierenden Massenspektren der Reaktion, welche das korrekte Templat zur Verlängerung mit Biotin-ddUTP enthält, und der Reaktion, welche das nicht korrekte Templat enthält, sind in 17A bzw. 17B gezeigt. Da das Signal nur im Spektrum in 17A zu sehen ist, wie es für den richtigen Einbau des Nukleotids erwartet wird, zeigen diese Ergebnisse die Möglichkeit der Durchführung einer SNP-Analyse unter Verwendung eines massemarkierten Primers zusammen mit biotinylierten Didesoxynukleotidtriphosphaten.
  • Beispiel 6
  • SNP-Multiplexanalyse mit massemarkierten Primern und biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphaten
  • Zwei Primer ("Primer B" und "Primer C"), welche jeweils eine unikale, chemisch freisetzbare Massemarkierung enthalten, werden gemäß dem in Beispiel 1C beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt. Es wird auch für jeden ein synthetischer Templatstrang synthetisiert durch Standardverfahren der Festphasensynthese. Die Sequenz des Primers B ist 5'-LTSS-TCGGAGTCAACGGATTTG-3' (SEQ ID NO: 20) und die Sequenz für den entsprechenden Templatstrang ist 5'-TCCAGTTCTCAAATCCGTTGACTCCGA-3' ("Templat 2T") (SEQ ID NO: 21). Primer C und dessen Templatstrang ("Templat 3T") besitzen die Sequenzen 5'-LTSS-GATGTCTGTATATGTTGCACTG-3' (SEQ ID NO: 22) bzw. 5'-AAGTTGACTCTCAGTGCAACATATACAGACATC-3' (SEQ ID NO: 23), wobei LT, SS und das Fettgedruckte die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie in Beispiel 5 beschrieben ist. Der Primer B ist mit dem synthetischen Peptid CAGGRGGGKGGA (SEQ ID NO: 24) massemarkiert und der Primer C ist mit dem synthetischen Peptid CASGRGSGKGSA (SEQ ID NO: 25) massemarkiert.
  • Mit Primer A, Primer B, Primer C und jedem der entsprechenden Template wird ein Multiplexverfahren einer Zyklussequenzierreaktion durchgeführt. Die Reaktion enthält 2 pmol jedes massemarkierten Primers, 10 fmol jeweils von Templat 1T, Templat 2T und Templat 3T, 200 pmol Biotin-ddATP (Clonetech, Inc.) und 2,4 Unit der thermostabilen DNA-Polymerase AmpliTaq-FS (Perkin-Elmer Inc.) in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die Reaktion wird unter Verwendung von typischen Hot-Start-Bedingungen gestartet und wird durchgeführt gemäß dem folgenden Thermozyklusprogramm: Denaturierung bei 90°C für 30 s, Annealing bei 50°C für 10 s, Verlängerung bei 65°C für 10 s mit insgesamt 35 Zyklen. Nach Beendigung wird die Sequenzierreaktion gereinigt durch Einfangen der verlängerten biotinylierten Produkte auf mit Streptavidin beschichteten Magnetbeads. Die Beads werden gewaschen, um nicht verlängerten Primer zu entfernen und dann werden die Massemarkierungen freigesetzt durch Behandlung der an die Beads gebundenen Produkte mit einem milden Reduktionsmittel zur Spaltung der Disulfidbrücken und Freisetzung der Massemarkierungen in die Lösung. Eine Menge von 1 μl des Überstands wird entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Dihydroxybenzoesäurematrix). Das resultierende Massenspektrum, welches Signale jeweils für die erwarteten Massemarkierungen zeigt, wobei die mit A, B und C bezeichneten Peaks den Primern A, B und C entsprechen, ist in 18 gezeigt. Dies veranschaulicht das Potenzial für die Durchführung von SNP-Multiplexanalysen unter Verwendung von massemarkierten Primern.
  • Beispiel 7
  • SNP-Analyse mit massemarkierten Primern und biotinylierten Nukleosidtriphosphaten und normalen Didesoxynukleotisidtriphosphaten
  • Zwei Zyklussequenzierreaktionen wurden mit Primer A und entweder Templat 1T (SEQ ID NO: 17) oder Templat 1A (SEQ ID NO: 18) durchgeführt. Jede Reaktion anthält 2 pmol massemarkierten Primer und 100 fmol Templat. Die Triphosphate in jeder Reaktion bestehen aus jeweils 200 pmol Biotin-dCTP (Clonetech, Inc.), dATP und ddTTP. Die Reaktionen werden mit 2,4 Unit der thermostabilen DNA-Polymerase AmpliTaq-FS (Perkin-Elmer Inc.) in einem Gesamtvolumen von 20 ml durchgeführt. Die Reaktionen werden unter Verwendung von typischen Hot-Start-Bedingungen gestartet und werden dann durchgeführt gemäß dem folgenden Thermozyklusprogramm: Denaturierung bei 90°C für 30 s, Annealing bei 50°C für 10 s, Verlängerung bei 65°C für 10 s, mit insgesamt 35 Zyklen. Nach Beendigung werden die Sequenzierreaktionen gereinigt durch Einfangen der verlängerten biotinylierten Produkte auf mit Streptavidin beschichteten Magnetbeads. Die Beads werden gewaschen, um nicht verlängerten Primer zu entfernen und dann werden die Massemarkierungen freigesetzt durch eine Behandlung des an die Beads gebundenen Produkts mit einem milden Reduktionsmittel, um die Disulfidbindungen zu spalten und die Massemarkierungen in die Lösung freizusetzen. Eine Menge von 1 ml jedes Überstands wird entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Dihydroxybenzoesäurematrix). Die resultierenden Massenspektren für die Reaktion, welche Templat 1T enthält, und die Reaktion, welche Templat 1A enthält, sind in 19A [XX3a] bzw. 19B [XX3b] gezeigt.
  • Beispiel 8
  • Tagging bzw. Markieren von degenerierten Basenprimern mit einer Massemarkierung und die Identifizierung von Sequenzvarianten durch Verlängerung mit biotinylierten Didesoxynukleosidtriphosphaten
  • Zwei mit Primer A verwandte Primern, welche sich nur in der Identität der 3'-terminalen Base unterscheiden, werden gemäß dem in Beispiel 1C beschriebenen Verfahren synthetisiert und massemarkiert. Die Sequenz von Primer D ist 5'-LTSS-GTGCTCAAGAACTACATGA-3' (SEQ ID NO: 26) und die Sequenz von Primer E ist 5'-LTSS-GTGCTCAAGAACTACATGT-3' (SEQ ID NO: 27), wobei LT und SS die in Beispiel 5 beschriebenen Bedeutungen aufweisen. Ein synthetischer Templatstrang ("Templat 4A") wird ebenso unter Verwendung eines Standardverfahrens der Festphasensynthese synthetisiert. Die Sequenz des Templatstrangs ist 5'-TACTCCAGTTACATGTAGTTCTTGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 28), worin der Fettdruck die Base anzeigt, welche im Hinblick auf das Templat 1T variiert. Die Primer D und E werden mit zwei unikalen synthetischen Peptiden massemarkiert, welche sich von dem Peptid unterscheiden, welches mit Primer A verbunden ist. Das mit Primer D verbundene Peptid ist CAGGRGGGKGGA (SEQ ID NO: 29), während das mit Primer E verbundene Peptid CASGRGSGKGSA (SEQ ID NO: 30) ist.
  • Es werden zwei Zyklussequenzierreaktionen durchgeführt. Jede Reaktion enthält 2 pmol jeweils vom massemarkierten Primer A, Primer D und Primer E, 100 fmol entweder von Templat 1T oder Templat 4A, 200 pmol Biotin-ddATP (Clonetech, Inc.) und 2,4 Unit der thermostabilen DNA-Polymerase AmpliTaq-FS (Perkin-Elmer Inc.) in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Beide Reaktionen werden unter Verwendung der typischen Hot-Start-Bedingungen gestartet. Die Reaktionen werden durchgeführt gemäß dem folgenden Thermozyklusprogramm: Denaturierung bei 90°C für 30 s, Annealing bei 60°C für 10 s, Verlängerung bei 65°C für 10 s, für insgesamt 35 Zyklen. Nach Beendigung werden die Sequenzierreaktionen gereinigt durch Einfangen der verlängerten biotinylierten Produkte auf mit Streptavidin beschichteten Magnetbeads. Die Beads werden gewaschen, um nicht verlängerten Primer zu entfernen und dann wird die Massemarkierung freigesetzt durch Behandlung des an die Beads gebundenen Produkts mit einem milden Reduktionsmittel zur Spaltung der Disulfidbrücke und Freisetzung der Massemarkierung in die Lösung. Eine Menge von 1 μl des Überstands wird entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Dihydroxybenzoematrix). Die resultierenden Massenspektren für das zum Primer E passende Templat und zum Primer A passende Templat sind in 20A bzw. 20B gezeigt. Wenn der Primer E perfekt zu dem Templat passt, ist das vorherrschende Massemarkierungssignal, welches in dem Massenspektrum zu sehen ist, das von Primer E. Ebenso ist das vorherrschende Massemarkierungssignal, welches in dem Massenspektrum sichtbar ist, das von Primer A, wenn Primer A perfekt zu dem Templat in der Reaktion passt. Dieses Beispiel zeigt den möglichen Nutzen der Verwendung eines Gemisches aus degenerierten unikal massemarkierten Primern zur Bestimmung einer variablen Sequenz, welche zu einer festgelegten Sequenz benachbart ist.
  • Beispiel 9
  • Einzelstrang-selektive chemische Freisetzung einer Massemarkierung
  • Eine chemisch spaltbare Oligonukleotidsonde (SEQ ID NO: 31), welche eine 5'-S-P-Phosphodiester-Brückenbindung in dem Gerüst enthält, wird durch Standardverfahren der Festphasesynthese synthetisiert, wobei ein modifiziertes Phosphoramiditreagenz an der Stelle der Spaltung eingefügt wird, wie in der PCT-Patentanmeldung WO 96/37630 beschrieben wird. Die Sequenz der 25-mer Sonde ist 5'-CCTGGCAAACTCAACTAGGC(sT)GTCC-3' (SEQ ID NO: 31), wobei sT die Spaltungsstelle anzeigt. Ein komplementäres 35-mer Oligonukleotid mit der Sequenz (5'-GATCCGGACAGCCTAGTTGAGTTTGC-CAGGTAAGA-3' (SEQ ID NO: 32) wird ebenso synthetisiert.
  • Die Sonde und das Komplement werden zusammen hybridisiert unter Bildung einer Duplex-DNA in 1 M Triethylammoniumacetatpuffer durch Erwärmen eines Gemisches von jeweils 10 pmol bei 95°C für 3 min, befolgt von einer 10 minütigen Inkubation bei 70°C und einer anschließenden Inkubation bei 50°C für 10 min. Das Gemisch erreicht Raumtemperatur und AgNO3 wird zu einer Endkonzentration von 0,14 mM zugegeben. Die durch Silber geförderte Spaltungsreaktion verläuft für 60 min bei Raumtemperatur (20°C), wonach die Reaktion durch die Zugabe von überschüssigem Dithiothreitol gequenched wird. Nach der Verdampfung der Probe wird eine 3-HPA MALDI-Matrixlösung zugegeben, um die DNA wieder zu lösen. Die Lösung wird auf die Massenspektrometerprobenplatte aufgetupft und analysiert. Das resultierende Massenspektrum und ein Massenspektrum einer nicht komplementären Kontrollspaltung sind in 21A bzw. 21B gezeigt. Das Spektrum der Kontrollreaktion zeigt, dass unter den verwendeten Bedingungen das einzelsträngige Oligonukleotid einer etwa zu 90°C kompletten Spaltung unterzogen wird, während das Spektrum der doppelsträngigen Form zeigt, dass unter identischen Bedingungen nicht mehr als etwa 5% Spaltung auftritt. Dies zeigt die potenzielle Verwendung eines chemischen Spaltungsreagenzes zur Unterscheidung zwischen hybridisierten und nicht hybridisierten Sonden zur Freisetzung einer Massemarkierung.
  • Beispiel 10
  • Freisetzung einer Massemarkierung durch einen Exonuklease III-Verdau einer DNA-Sonde, hybridisiert mit einem RNA-Transkript
  • Ein Paar von PCR-Primern für das Gen des ribosomalen Proteins L7 wird durch Phosphoramidit-Standardchemie synthetisiert. Der forward-Primer enthielt am 5'-Ende eine Verlängerung, welche die Promotorregion der T7-RNA-Polymerase darstellt. Die Sequenz des forward-Primers ist 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCTGAGGATTGTA-GAGC-3' (SEQ ID NO: 33) und die Sequenz des reverse-Primers ist 5'-TCCAACAGTATAGATCTCATG-3' (SEQ ID NO: 34). Es wird auch ein Paar Sonden synthetisiert, wobei jede unikale Massemarkierungen enthält. Die Sonden werden so gestaltet, dass jede mit einem unterschiedlichen Strang des PCR-Produkts hybridisiert, während nur eine von ihnen mit einem Strang der transkribierten RNA hybridisiert. Die Peptidmassemarkierung, welche für die Sonde des oberen Strangs verwendet wurde, besaß die Sequenz CGYGPKKKRKVGG (SEQ ID NO: 35) und die Peptidmassemarkierung, welche für die (RNA-spezifische) Sonde des unteren Strangs verwendet wurde, war CKNLNKDKQVYRATHRB (SEQ ID NO: 36). Die Synthese der massemarkierten Sonden wird in Beispiel 1E beschrieben.
  • Es wurde eine reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt mit 10 μg Gesamt-RNA, welche aus einer stabilen Tumorzelllinie isoliert wurde, zur Erzeugung einer Erststrang-cDNA. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt und enthielt 0,5 μg Oligo-dTO-Primer und 25 Unit AMV reverse Transkriptase. Mit 1 μl der Erststrang-cDNA wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt unter Verwendung von jeweils 10 pmol des T7-forward- und reverse-Primers und 1 Unit Taq-DNA-Polymerase in einer Reaktion von 20 μl.
  • Ein Aliquot von 2 μl des RT-PCR-Produkts wird dann verwendet für eine 20 μl Transkriptionsreaktion, welche 100 Unit T7-RNA-Polymerase, 20 Unit RNAsin-Inhibitor und 1 mM Konzentration jedes rNTPs enthält. Die Transkriptionsreaktion verläuft bei 37°C für 2 Stunden. Ein Mikroliter des Transkriptionsreaktionsprodukts wird dann unter Verwendung von 5 pmol von jedem der zwei oben genannten strangspezifischen Sonden sondiert. Als eine Kontrolle wird 1 μl des RT-PCR-Produkts anstelle des Transkriptionsreaktionsprodukts verwendet. Die Sonden und Ziele werden in 1 × Exonuklease III-Puffer hybridisiert durch Erwärmen des Gemisches für 3 min auf 95°C, dann Inkubieren bei 65°C für 1 min, dann Kühlen auf 37°C. Dann wird zu dem Gemisch Exonuklease III zugegeben und der Verdau verläuft bei 37°C für 1 Stunde. Eine Menge von 1 μl des Überstands wurde entnommen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (positive Ionen, 2,5-Dihydroxybenzoesäurematrix). Die resultierenden Massenspektren des verdauten RNA-Transkriptionsprodukts und der Kontrolle sind in 22A bzw. 22B gezeigt. In der Probe der Transkriptionsreaktion ist nur das Massemarkierungssignal der RNA-Strang-spezifischen Sonde zu sehen, während beide Massemarkierungssignale der Sonde zu sehen sind, wenn das RT-PCR-Produkt untersucht wird. Die Tatsache, dass nur die RNA-Strang-spezifische Sonde ein Signal in dem Massenspektrum erzeugt, wenn das RNA-Transkript vorliegt, zusammen mit der Tatsache, dass die Signale von beiden Sonden zu sehen sein sollten, wenn das Signal nur vom restlichen RT-PCR-Produkt stammt, zeigt, dass das Enzym Exonuklease III verwendet werden kann, um spezifisch eine Sonde zu verdauen, welche mit einem RNA-Transkript hybridisiert ist, zur Freisetzung einer Massemarkierung.
  • Beispiel 11
  • Matrixselektivität für eine Peptidmassemarkierung oder DNA
  • Eine Menge von 2 pmol von jedem der massemarkierten Primer A und Primer C wird mit einem milden Reduktionsmittel behandelt, um das Molekül an der Disulfidbindung zu spalten, um ein separates Peptid und DNA-Fragmente zu erhalten. Für jeden Primer wird eine Menge von 1 μl auf die Massenspektrometerprobenplatte mit der Matrix 2,5-Dihydroxybenzoesäure aufgetupft, und eine zweite Menge von 1 μl wird bei der Matrix 3-HPA aufgetupft. Das Massenspektrum für Primer C, erhalten mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure, wird in 23A gezeigt und zeigt ein starkes Peptidsignal mit einem nur sehr schwachen, schlecht aufgelösten Signal bei der erwarteten Masse des DNA-Fragments. Im Gegensatz dazu zeigt das mit 3-HPA erhaltene Spektrum (23B) ein starkes, scharfes Signal für das DNA-Fragment und ein schwächeres Signal für das Peptidfragment. Die entsprechenden Spektren, welche für Primer A erhalten werden, sind in 23C (2,5-DHB) und 23D (3-HPA) gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, selektiv einen freigesetzten massemarkierten Abschnitt einer Sonde nachzuweisen in Gegenwart des viel größeren Teils der Sonde, welche keine Massemarkierung trägt.
  • Beispiel 12
  • Nachweis eines spezifischen Biomoleküls (T) in einem Restriktionsenzym-gebundenen Immunosorbent-Assay
  • Als ein Beispiel für den Nachweis eines Zielmoleküls über die Freisetzung von Massemarkierungen wurde ein Modellsystem entworfen, welches auf ELISA-Technologie basiert. Dieser Assay bezieht ein DNA-Restriktionsenzym für den Verdau eines massemarkierten Substrats ein, welches schließlich durch Massenspektrometrie nachgewiesen wird. Dieses Beispiel beschreibt einen Antikörper-Sandwich-ELISA zum Nachweis von löslichen Antigenen. ELISA werden von Ausubel et al. (1997) beschrieben. Die Synthese der Sonde (Massemarkierung ist an ein doppelsträngiges Oligonukleotid mit einer EcoRI-Restriktionsstelle gebunden) wird in Beispiel 1 beschrieben. Die doppelsträngige Sonde wird hergestellt durch Hybridisierung von komplementären Oligonukleotiden. Standardlösungen von Antigen T werden zur Kalibrierung des Assays hergestellt (1–1000 ng/ml, in Abhängigkeit vom linearen Bereich des Assays). Es werden auch spezielle Einfangantikörper (Anti-T) und Zielerkennungsmoleküle, welche mit dem Restriktionsenzym EcoRI vernetzt sind (Anti-T-EcoRI) hergestellt (0,1 Unit EcoRI pro ng spezifischem Antikörper, 10 Unit pro ml).
  • Verfahren
    • 1. Mikrowell-Platten (Immulon oder Äquivalent) werden mit einem Einfangantikörper (10 μg/ml) beschichtet, welcher dann über Nacht gemäß den Anleitungen des Hersteller gebunden wird. Die restliche Bindekapazität der Platte wird mit Blockierungspuffer (eine gepufferte Lösung von 0,05% Tween 20 und 0,25% Rinderserumalbumin) durch Auffüllen der Wells mit der Lösung und Inkubieren für 30 min bei Raum temperatur blockiert. Die Platten werden dreimal mit Wasser gespült und das restliche Wasser wird entfernt.
    • 2. Lösungen von bekannten und unbekannten Mengen von Antigen T (in Blockierungspuffer) werden an die Wells gebunden, 50 μl/Well, und für mindestens 2 Stunden inkubiert. Die Platten werden dreimal mit Wasser gewaschen, dann für 10 min mit Blockierungspuffer behandelt. Es wird erneut dreimal mit Wasser gespült.
    • 3. 50 μl Anti-T-EcoRI (mit 0,5 Unit EcoRi-Aktivität) werden zu jedem Well zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden dreimal unter Verwendung von 1 × EcoRI-Puffer mit 0,25% BSA gewaschen.
    • 4. Für jede 96 Well-Platte werden 140 μl doppelsträngige Sonde (10 pmol massemarkiertes Oligonukleotid, 7 μM Stammlösung), 100 μl EcoRI-Puffer (10×) 760 μl H2O gemischt.
    • 5. 10 μl des obigen Gemisches werden zu jedem Well zugegeben, bei 37°C für eine angemessene Zeit inkubiert, um eine lineare Reaktion mit der Konzentration von T zu erhalten (bis zu 1 Stunde). Das Enzym wird bei 65°C für 20 min hitzeinaktiviert, dann auf 4°C abgekühlt. 1 μl des Gemisches wird bei DHB aufgetupft, die Spots zweimal mit 2 μl H2O gewaschen und getrocknet und im Hinblick auf die freigesetzte Massemarkierung analysiert.
  • Alle die hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können ohne unangemessene Experimentation angesichts der vorliegenden Offenbarung durchgeführt und ausgeführt werden. Insbesondere ist offensichtlich, dass bestimmte Mittel, sowohl chemische als auch physiologische Mittel, die hier beschriebenen Mittel ersetzen können, wobei gleiche oder ähnliche Ergebnisse erhalten werden.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (110)

  1. Verbindung zum Nachweisen eines Zielmoleküls, worin die Verbindung ein Release-Tag umfasst, welches Rx, M und Re umfasst, worin: Rx eine reaktionsfähige Gruppe ist, welche mit dem Zielmolekül wechselwirkt und welche ausgewählt ist aus einem Protein, Peptid, Polypeptid, Lipid, Steroid, Antibiotikum und Neocarzinostatin; M eine nicht flüchtige Massemarkierung ist, worin eine nicht flüchtige Massemarkierung eine Verbindung ist, welche ein Biopolymer umfasst, welches eine oder mehrere Monomereinheiten umfasst, wobei mindestens eine Einheit davon ein Nukleosid umfasst, welches beim Vorliegen in reiner, sauberer Form und Erwärmen nicht in einem signifikanten Ausmaß intakt sublimiert und welches durch Massenspektrometrie nachweisbar ist; und Re eine Release-Gruppe ist, welche die Massemarkierung von dem Release-Tag freisetzt.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin das Biopolymer mehrere Monomereinheiten umfasst, welche jeweils ein Nukleosid umfassen.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, worin das Biopolymer weiter eine oder mehrere Monomereinheiten umfasst, welche jeweils gesondert und unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure und einem Saccharid.
  4. Verbindung nach Anspruch 2, worin das Biopolymer weiterhin mehrere Monomereinheiten umfasst, welche jeweils eine Aminosäure umfassen.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, worin das Biopolymer mehrere Monomereinheiten umfasst, welche jeweils ein Nukleosid umfassen.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Massemarkierung ein synthetisches Polymer umfasst.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, worin das synthetische Polymer Polyethylenglykol, Polyvinylphenol, Polypropylenglykol, Polymethylmethacrylat und Derivate davon umfasst.
  8. Verbindung nach Anspruch 7, worin das synthetische Polymer Polyethylenglykol umfasst.
  9. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Release-Gruppe eine chemisch spaltbare Bindung umfasst.
  10. Verbindung nach Anspruch 9, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfidbindung, eine in ein Phosphatgerüst eingefügte chemisch spaltbare Gruppe oder einen chemisch spaltbaren Linker umfasst.
  11. Verbindung nach Anspruch 10, worin die chemisch spaltbare Bindung weiter einen Anteil umfasst, welcher durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion oder Wärme spaltbar ist.
  12. Verbindung nach Anspruch 10, worin die chemisch spaltbare Gruppe in ein Phosphatgerüst eingefügt ist.
  13. Verbindung nach Anspruch 12, worin die chemisch spaltbare Gruppe Phosphorthioat oder Phosphoramidat umfasst.
  14. Verbindung nach Anspruch 10, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Glykosidbindung umfasst.
  15. Verbindung nach Anspruch 10, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfibindung umfasst.
  16. Verbindung nach Anspruch 1, worin das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, einem Rezeptor und einem Hormon.
  17. Verbindung nach Anspruch 16, worin das Polypeptid ein Enzym umfasst.
  18. Verbindung nach Anspruch 1, worin Rx und Re gleich sind.
  19. Verbindung nach Anspruch 1, worin Re in Rx enthalten ist.
  20. Verbindung nach Anspruch 1, worin Re durch ein Enzym spaltbar ist.
  21. Verbindung nach Anspruch 20, worin Re eine Phosphodiester- oder eine Peptidbindung ist.
  22. Verbindung nach Anspruch 1, worin mehr als eine Massemarkierung eingefügt ist.
  23. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Massemarkierung ein Molekulargewicht von mehr als etwa 500 Dalton aufweist.
  24. Verfahren zum Nachweisen eines Zielmoleküls, worin das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Sonde, welche eine reaktionsfähige Gruppe, eine Release-Gruppe und eine nicht flüchtige Massemarkierung umfasst, worin eine nicht flüchtige Massemarkierung ein Molekül ist, welches beim Vorliegen in seiner reinen, sauberen Form und Erwärmen nicht in einem signifikanten Ausmaß intakt sublimiert, (b) Amplifizieren eines Zielnukleinsäuremoleküls, (c) Inkontaktbringen des amplifizierten Zielnukleinsäuremoleküls mit der Sonde, um einen Komplex Sonde:amplifiziertes Zielnukleinsäuremolekül zu erzeugen, (d) selektives Freisetzen der Massemarkierung von dem Komplex Sonde:amplifiziertes Zielnukleinsäuremolekül und (e) Bestimmen der Masse der Massemarkierung durch MALDI-Massenspektrometrie.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die reaktionsfähige Gruppe und die Release-Gruppe gleich sind.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Release-Gruppe in der reaktionsfähigen Gruppe enthalten ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Sonde mindestens zwei Massemarkierungen mit unterschiedlichen Massen umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 24, worin das amplifizierte Zielnukleinsäuremolekül ein doppelsträngiges Molekül umfasst, wobei jeder Strang ein 3'-Ende und ein 5'-Ende aufweist, wobei das doppelsträngige Molekül ein Fehlpaarung enthält und die 3'-Enden nicht durch eine Exonuklease verdaut werden können.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, weiter umfassend: Spalten von mindestens einem Strang des doppelsträngigen Moleküls an der Fehlpaarung und selektives Freisetzen der Massemarkierung durch Verdauen des gespaltenen Strangs mit einer 3'-5'-Exonuklease.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, worin die Fehlpaarung durch ein Enzym gespalten wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, worin das Enzym T4-Endonuklease VII umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 29, worin die Fehlpaarung durch eine Chemikalie gespalten wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, worin die Chemikalie KMnO4 umfasst.
  34. Verfahren nach Anspruch 29, worin die 3'-5'-Exonuklease Exonuklease III umfasst.
  35. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Massemarkierung selektiv durch ein Enzym freigesetzt wird.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, worin das Enzym eine Nuklease umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Nuklease eine Restriktionsendonuklease umfasst.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Nuklease eine Exonuklease umfasst.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, worin die Exonuklease ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Exonuklease III und T4-Endonuklease VII.
  40. Verfahren nach Anspruch 38, worin die Exonuklease spezifisch ist für doppelsträngige DNA.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, worin die selektive Freisetzung der Massemarkierung bei der Hybridisierung der Sonde mit dem amplifizierten Zielmolekül und dem Nukleaseverdau des Komplexes Sonde:amplifiziertes Zielnukleinsäuremolekül erfolgt.
  42. Verfahren nach Anspruch 38, worin die Exonuklease spezifisch ist für einzelsträngige DNA.
  43. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Release-Gruppe eine chemisch spaltbare Bindung umfasst.
  44. Verfahren nach Anspruch 43, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfidbindung, eine in ein Phosphatgerüst eingefügte chemisch spaltbare Gruppe oder einen chemisch spaltbaren Linker umfasst.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, worin die chemisch spaltbare Bindung weiter einen Anteil umfasst, welcher durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion oder Wärme spaltbar ist.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfidbindung umfasst.
  47. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Release-Gruppe innerhalb der reaktionsfähigen Gruppe lokalisiert ist und die reaktionsfähige Gruppe ein Oligonukleotid ist.
  48. Verfahren nach Anspruch 47, worin die selektive Freisetzung der Massemarkierung durch die Anwesenheit eines doppelsträngigen Oligonukleotids an der Release-Gruppe inhibiert wird.
  49. Verfahren nach Anspruch 48, worin das Inkontaktbringen der Sonde mit dem amplifizierten Zielnukleinsäuremolekül ergibt, dass die Release-Gruppe in einer einzelsträngigen Region vorliegt.
  50. Verfahren nach Anspruch 49, worin die Release-Gruppe eine chemisch spaltbare Release-Gruppe umfasst.
  51. Verfahren nach Anspruch 50, worin die chemisch spaltbare Gruppe Phosphorthioat oder Phosphoramidat umfasst.
  52. Verbindung nach Anspruch 49, worin die Release-Gruppe durch eine einzelstrangspezifische Nuklease spaltbar ist.
  53. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Zielnukleinsäuremolekül eine funktionelle Gruppe umfasst, welche an einen festen Träger immobilisiert werden kann.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, worin die funktionelle Gruppe Biotin umfasst.
  55. Verfahren nach Anspruch 53, worin das amplifizierte Zielnukleinsäuremolekül auf dem festen Träger immobilisiert wird und jede Sonde, welche nicht Teil eines Komplexes Sonde:amplifiziertes Zielnukleinsäuremolekül ist, durch Waschen entfernt wird.
  56. Verfahren nach Anspruch 24, worin die reaktionsfähige Gruppe ein Polynukleotid oder ein Oligonukleotid umfasst.
  57. Verfahren nach Anspruch 56, worin die reaktionsfähige Gruppe weiterhin ein Nukleotid oder ein Oligonukleotid umfasst, welches nach der Hybridisierung mit dem amplifizierten Zielnukleinsäuremolekül hinzugefügt wird.
  58. Verfahren nach Anspruch 57, worin das Nukleotid durch eine Polymerase hinzugefügt wird.
  59. Verfahren nach Anspruch 57, worin das Oligonukleotid durch eine Ligase hinzugefügt wird.
  60. Verfahren nach Anspruch 57, worin das Nukleotid oder Oligonukleotid weiter eine funktionelle Gruppe umfasst, welche an einem festen Träger immobilisiert werden kann.
  61. Verfahren nach Anspruch 60, worin die funktionelle Gruppe Biotin umfasst.
  62. Verfahren nach Anspruch 60, weiter umfassend: (a) Immobilisieren der reaktionsfähigen Gruppe auf dem festen Träger nach dem Hinzufügen des Nukleotids oder Oligonukleotids und (b) Entfernen aller Sonden mit nicht gebundenen reaktionsfähigen Gruppen vor dem Freisetzen ihrer Massemarkierungen.
  63. Verfahren nach Anspruch 24, worin das amplifizierte Zielnukleinsäuremolekül mit mehreren Sonden in Kontakt gebracht wird.
  64. Verfahren nach Anspruch 63, worin jede reaktionsfähige Gruppe mit einer unikalen Massemarkierung verbunden ist.
  65. Verfahren nach Anspruch 63, worin jede reaktionsfähige Gruppe mit einer unikalen Gruppe von Massemarkierungen verbunden ist.
  66. Verfahren nach Anspruch 64, worin die Release-Massemarkierung eine unikale Gruppe von Massemarkierungen umfasst.
  67. Verfahren nach Anspruch 65, worin jede Massemarkierung in der Gruppe von Massemarkierungen mit der gleiche Sonde verbunden ist.
  68. Verfahren nach Anspruch 65, worin jede Massemarkierung in der Gruppe von Massemarkierungen mit unterschiedlichen Sonden verbunden ist.
  69. Verfahren nach Anspruch 65, worin das amplifizierte Zielnukleinsäuremolekül auf einem festen Träger immobilisiert wird.
  70. Verfahren nach Anspruch 68, worin mehrere amplifizierte Zielnukleinsäuremoleküle an räumlich getrennten Stellen auf dem festen Träger immobilisiert werden.
  71. Verfahren nach Anspruch 70, worin die reaktionsfähige Gruppe ein Polynukleotid oder ein Oligonukleotid umfasst.
  72. Verfahren nach Anspruch 66, worin die Zielnukleinsäuren mRNA oder Erst-Strang-cDNA umfassen.
  73. Verfahren nach Anspruch 66, worin die Zielnukleinsäuren amplifizierte Nukleinsäureprodukte umfassen.
  74. Verfahren nach Anspruch 73, worin die amplifizierten Nukleinsäureprodukte unter Verwendung von PCR, rtPCR, LCR, Qbeta Replicase, SDA, CPR, TAS, NASBA oder mehreren Runden einer RNA-Transkription oder irgendeiner Kombination davon erzeugt werden.
  75. Verfahren nach Anspruch 66, worin die mehreren Zielnukleinsäuren durch Amplifizieren eines Teils eines mRNA-Pools erhalten werden.
  76. Verfahren nach Anspruch 75, worin mindestens eine Sonde auf einem festen Träger immobilisiert werden kann.
  77. Verfahren nach Anspruch 75, worin mindestens ein amplifiziertes Nukleinsäureprodukt auf einem festen Träger immobilisiert werden kann.
  78. Verfahren nach Anspruch 24, worin die freigesetzte Massemarkierung selektiv von einer organischen Matrix desorbiert wird unter Erzeugung von desorbierten Massemarkierungen.
  79. Verfahren nach Anspruch 78, worin die organische Matrix 2,5-Dihydroxybenzoesäure umfasst.
  80. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Sonde während des Amplifikationsverfahrens in das amplifizierte Nukleinsäureprodukt eingefügt wird, um eingefügte massemarkierte Moleküle und nicht eingefügte massemarkierte Moleküle zu erzeugen.
  81. Verfahren nach Anspruch 80, worin die Moleküle Oligonukleotidprimer sind.
  82. Verfahren nach Anspruch 80, worin die Moleküle Nukleosidtriphosphate sind.
  83. Verfahren nach Anspruch 80, worin die amplifizierten Nukleinsäureprodukte unter Verwendung von PCR, rtPCR, LCR, Qbeta Replicase, SDA, CPR, TAS, NASBA oder mehreren Runden einer RNA-Transkription oder irgendeiner Kombination davon erzeugt werden.
  84. Verfahren nach Anspruch 83, worin die amplifizierten Nukleinsäureprodukte unter Verwendung von PCR oder rtPCR erzeugt werden.
  85. Verfahren nach Anspruch 80, worin die Massemarkierung durch ein Enzym freigesetzt wird.
  86. Verfahren nach Anspruch 85, worin das Enzym eine Nuklease umfasst.
  87. Verfahren nach Anspruch 86, worin die Nuklease eine Restriktionsendonuklease umfasst.
  88. Verfahren nach Anspruch 86, worin die Nuklease eine Exonuklease umfasst.
  89. Verfahren nach Anspruch 88, worin die Exonuklease spezifisch ist für doppel-strängige DNA.
  90. Verfahren nach Anspruch 89, worin die Exonuklease ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Exonuklease III und T4-Endonuklease VII.
  91. Verfahren nach Anspruch 80, worin die Release-Gruppe eine chemisch spaltbare Bindung umfasst.
  92. Verfahren nach Anspruch 91, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfidbindung, eine in ein Phosphatgerüst eingefügte chemisch spaltbare Gruppe oder einen chemisch spaltbaren Linker umfasst.
  93. Verfahren nach Anspruch 92, worin die chemisch spaltbare Bindung weiter einen Anteil umfasst, welcher durch Säure, Base, Oxidation, Reduktion oder Wärme spaltbar ist.
  94. Verfahren nach Anspruch 93, worin der chemisch spaltbare Anteil in ein Phosphatgerüst eingefügt ist.
  95. Verfahren nach Anspruch 94, worin der chemisch spaltbare Anteil Phosphorthioat oder Phosphoramidat umfasst.
  96. Verfahren nach Anspruch 93, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Glykosidbindung umfasst.
  97. Verfahren nach Anspruch 93, worin die chemisch spaltbare Bindung eine Disulfidbindung umfasst.
  98. Verfahren nach Anspruch 24, worin der Komplex Sonde:amplifiziertes Zielnukleinsäuremolekül massemodifiziert wird durch Anfügen eines Nukleotids oder Oligonukleotids an die Sonde, unter Erzeugung einer massemodifizierten Massemarkierung.
  99. Verfahren nach Anspruch 24, worin die reaktionsfähige Gruppe mit einer Zielnukleinsäure hybridisieren kann, welche eine einzelne Nukleotidpolymophismusstelle enthält, und worin die Identität des Nukleotids an der einzelnen Nukleotidpolymophismusstelle der Masse der freigesetzten Massemarkierung entspricht.
  100. Verfahren nach Anspruch 99, worin die Sonde durch Hybridisierung der reaktionsfähigen Gruppe mit der Zielnukleinsäure erhalten wird unter Erzeugung eines Komplexes reaktionsfähige Gruppe: Zielnukleinsäure, und Erweitern der reaktionsfähigen Gruppe durch Hinzufügen von einem oder mehreren hinzugefügten Nukleotiden.
  101. Verfahren nach Anspruch 100, worin mindestens ein hinzugefügtes Nukleotid massemarkiert ist.
  102. Verfahren nach Anspruch 99, weiter umfassend eine Gruppe von Sonden mit einer invarianten Region und einer variablen Region, wobei die invariante Region mit einer Region hybridisieren kann, welche unmittelbar benachbart ist zu einer einzelnen Nukleotidpolymorphismusstelle, und worin mindestens ein Mitglied der Gruppe von Sonden eine variable Region enthält, welche zu dem Nukleotid an der einzelnen Nukleotidpolymorphismusstelle komplementär ist.
  103. Verfahren nach Anspruch 99, worin mehrere Sonden erhalten werden, worin jede eine reaktionsfähige Gruppe umfasst, welche mit einer Zielnukleinsäure hybridisieren kann, welche eine einzelne Nukleotidpolymorphismusstelle enthält.
  104. Verfahren nach Anspruch 103, worin die mehreren Sonden mit mehreren Zielnukleinsäuren hybridisiert werden.
  105. Verfahren nach Anspruch 103, worin eine oder mehrere Sonden erhalten werden durch Hybridisieren einer reaktionsfähigen Gruppe mit einer Zielnukleinsäure, um einen Komplex reaktionsfähige Gruppe:Zielnukleinsäure zu erzeugen, und Erweitern der reaktionsfähigen Gruppe durch Hinzufügen von einem oder mehreren hinzugefügten Nukleotiden.
  106. Verfahren nach Anspruch 105, worin mindestens ein hinzugefügtes Nukleotid massemarkiert ist.
  107. Verfahren nach Anspruch 103, weiter umfassend eine Gruppe von Sonden mit einer invarianten Region und einer variablen Region, worin die invariante Region mit einer Region hybridisieren kann, welche unmittelbar benachbart ist zu einer einzelnen Nukleotidpolymorphismusstelle, und worin mindestens ein Mitglied der Gruppe von Sonden eine variable Region enthält, welche zu dem Nukleotid an der einzelnen Nukleotidpolymorphismusstelle komplementär ist.
  108. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Sonde eine doppelsträngige Nukleinsäure umfasst mit einem komplementären Strang und einem massemarkierten Strang, und worin der massemarkierte Strang weiter die Massemarkierung und die Release-Gruppe umfasst, das amplifizierte Zielnukleinsäuremolekül ein einzelsträngiges Ziel ist, welches bei Kontakt mit der doppelsträngigen Sonde einen Komplex komplementärer Strang:Zielnukleinsäuremolekül und einen einzelsträngigen massemarkierten Strang erzeugt und die einzelsträngige Zielnukleinsäure der Masse der freigesetzten Massemarkierung entspricht.
  109. Verfahren nach Anspruch 108, worin das einzelsträngige Zielnukleinsäuremolekül mit mehreren doppelsträngigen Sonden in Kontakt gebracht wird und worin jede reaktionsfähige Gruppe der doppelsträngigen Sonde mit einer unikalen Gruppe von Massemarkierungen verbunden ist.
  110. Verbindung nach Anspruch 16, worin das Hormon Östrogen, Progestin oder Androgen umfasst.
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