ES2296996T3 - Marcaje de moleculas. - Google Patents

Abstract

Un conjunto de dos o más marcadores de masa, comprendiendo cada marcador del conjunto un radical señalizador de masas anclado por medio de un enlazador escindible que tiene al menos un enlace amida a un radical de normalización de masas, donde cada radical de normalización de masas asegura que un marcador de masa tiene una masa agregada deseada, y donde el conjunto comprende un grupo de marcadores que tienen un radical señalizador de masas con una masa común, y cada marcador tiene una masa agregada diferente de todos los demás marcadores de ese grupo; o un grupo de marcadores que tienen un radical señalizador de masas, teniendo cada radical señalizador de masas una masa diferente de la de todos los demás radicales marcadores de masa de ese grupo, y cada marcador del grupo tiene una masa agregada común; y donde todos los demás marcadores de masa del conjunto son distinguibles entre sí por espectrometría de masas, y donde el radical señalizador de masas comprende un aminoácido y el radical denormalización de masas comprende un aminoácido.

Description

Marcaje de moléculas.

Esta invención se refiere a compuestos útiles para el marcaje de moléculas de interés, concretamente biomoléculas tales como péptidos y proteínas. Específicamente esta invención se refiere al marcaje de analitos para la detección mediante espectrometría de masas y métodos asociados de análisis de analitos sometidos a marcaje de masas mediante espectrometría de masas.

Los diversos métodos de marcaje de moléculas de interés son conocidos en la técnica, incluyendo átomos radiactivos, colorantes fluorescentes, reactivos luminiscentes, reactivos para la captura de electrones y colorantes absorbentes de luz. Cada uno de estos sistemas de marcaje tiene características que lo hacen adecuado para ciertas aplicaciones y no otras. Por razones de seguridad, el interés en los sistemas de marcaje no radiactivos conduce al desarrollo comercial muy difundido de esquemas de marcaje fluorescente concretamente para análisis genético. Los esquemas de marcaje fluorescente permiten el marcaje de un número relativamente pequeño de moléculas simultáneamente, típicamente se pueden utilizar 4 marcas simultáneamente y posiblemente hasta ocho. Sin embargo los costes del aparato de detección y las dificultades de análisis de las señales resultantes limitan el número de marcas que se pueden utilizar simultáneamente en un esquema de detección de fluorescencia.

Más recientemente ha habido un desarrollo en el área de la espectrometría de masas como método de detección de marcadores que están anclados de forma escindible a su molécula de interés asociada. En muchas aplicaciones de la biología molecular se necesita poder realizar separaciones de las moléculas de interés antes del análisis. Estas son generalmente separaciones en fase líquida. En los últimos años la espectrometría de masas ha desarrollado numerosas interfases para la separación en fase líquida que hacen la espectrometría de masas particularmente eficaz como sistema de detección para estas clases de aplicaciones. Hasta hace poco se utilizaba la Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas para detectar iones de analitos o sus iones fragmento directamente, no obstante para muchas aplicaciones tales como el análisis de ácido nucleico, la estructura del analito se puede determinar a partir del marcaje indirecto. Esto es particularmente ventajoso con respecto al uso de la espectrometría de masas debido a que las biomoléculas complejas tales como el ADN tienen espectros de masas complejos y se detectan con una sensibilidad relativamente escasa. La detección indirecta significa que se puede utilizar una molécula marcadora asociada para identificar el analito original, donde el marcador se diseña para la detección sensible y un espectro de masas simple. El espectro de masas simple significa que se pueden utilizar múltiples marcadores para analizar múltiples analitos simultáneamente.

En la publicación PCT/GB98/00127 se describen matrices de sondas de ácido nucleico ancladas covalentemente a marcadores escindibles que son detectables mediante espectrometría de masas que identifican la secuencia de la sonda de ácido nucleico unida covalentemente. Las sondas marcadas de esta solicitud tienen la estructura Nu-L-M donde Nu es un ácido nucleico unido covalentemente a L, un enlazador escindible, unido covalentemente a M, un marcador de masa. Los enlazadores escindibles preferidos en esta solicitud escinden en la fuente de iones del espectrómetro de masas. Los marcadores de masa preferidos son los poliariléteres sustituidos. Esta solicitud describe una variedad de métodos de ionización y análisis mediante analizadores de masa cuadrupolares, analizadores TOF e instrumentos de sector magnético como métodos específicos para analizar marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

En la publicación PCT/GB94/01675 se describen ligandos, y específicamente ácidos nucleicos, unidos escindiblemente a moléculas para etiquetas de masa. Los enlazadores escindibles preferidos son foto-escindibles. Esta solicitud describe la espectrometría de masas de Ionización/Desorción mediante Láser Asistida por Matriz (MALDI)-Tiempo de Vuelo (TOF) como un método específico de análisis de marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

En la publicación PCT/US97/22639 se describen moléculas marcadoras de masa no volátiles liberables. En las realizaciones preferidas estos marcadores comprenden polímeros, típicamente biopolímeros que son anclados escindiblemente a un grupo reactivo o ligando, esto es, una sonda. Los enlazadores escindibles preferidos parecen ser químicamente o enzimáticamente escindibles. Esta solicitud describe la espectrometría de masas MALDI TOF como un método específico de análisis de los marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

En las publicaciones PCT/US97/01070, PCT/US97/01046, y PCT/US97/01304 se describen ligandos, y específicamente ácidos nucleicos, unidos escindiblemente a moléculas etiquetas de masa. Los enlazadores escindibles preferidos parecen ser escindibles químicamente o foto-escindibles. Estas solicitudes describen una variedad de métodos de ionización y análisis mediante analizadores de masas cuadrupolares, analizadores TOF y aparatos de sector magnético como métodos específicos de analizar marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

Ninguna de estas aplicaciones de la técnica anterior mencionan el uso de análisis de masas en tándem o seriados para su uso en el análisis con marcadores de masa.

Gygi et al. (Nature Biotechnology 17: 994-999, "Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags" 1999) describen el uso de "etiquetas de afinidad codificadas por isótopos" para la captura de péptidos a partir de proteínas, para permitir el análisis de la expresión de las proteínas. En este artículo, los autores describen el uso de un enlazador de biotina, que es reactivo con los tioles, para la captura de péptidos con cisteína. Una muestra de proteína de una fuente se hace reaccionar con el enlazador de biotina y se escinde con una endopeptidasa. Los péptidos que contienen cisteína biotinilada se pueden asilar después sobre cuentas de avidina para su posterior análisis mediante espectrometría de masas. Se pueden comparar dos muestras cuantitativamente marcando una muestra con el enlazador de biotina y marcando la segunda muestra con una forma deuterada del enlazador de biotina. Cada péptido de las muestras es representado después como un par de picos en el espectro de masas. La integración de los picos del espectro de masas correspondientes a cada etiqueta indica los niveles de expresión relativos del péptido unido a las etiquetas.

Este método de "codificación con isótopos" tiene numerosas limitaciones. La primera es la dependencia de la presencia de tioles en una proteína - muchas proteínas no tienen tioles mientras otras tienen varios. En una variación de este método, se pueden diseñar enlazadores para que reaccionen con otras cadenas secundarias, tales como aminas. No obstante, puesto que muchas proteínas contienen más de un resto lisina, generalmente se podrían aislar múltiples péptidos por proteína en este enfoque. Es probable que esto no reduzca la complejidad de la muestra suficientemente para el análisis mediante espectrometría de masas. Es probable que una muestra que contiene demasiadas especies padezca "supresión de iones", en la cual ciertas especies se ionizan con preferencia sobre otras especies que aparecerían normalmente en el espectro de masas en una muestra menos compleja. En general, es probable la captura de proteínas por sus cadenas laterales que proporcione demasiados péptidos por proteína o ciertas proteínas se pierdan del todo.

La segunda limitación de este enfoque es el método utilizado para comparar los niveles de expresión de las proteínas de diferentes muestras. El marcaje de cada muestra con una variante de isótopo diferente de la etiqueta de afinidad da como resultado un pico adicional en el espectro de masas para cada péptido de cada muestra. Esto significa que si se analizan dos muestras juntas habrá el doble de picos en el espectro. De un modo similar, si se analizan tres muestras juntas, el espectro será tres veces más complejo que para una muestra sola. Está claro que este enfoque estará limitado, puesto que los números siempre crecientes de picos aumentarán la probabilidad de que dos péptidos diferentes tengan picos solapantes en el espectro de masas.

Una limitación adicional, que es referida por los autores de la publicación anterior, es el cambio de movilidad causado por las etiquetas. Los autores informan de que los péptidos marcados con la etiqueta de biotina deuterada eluyen ligeramente después que el mismo péptido marcado con la etiqueta no deuterada.

Los espectros de masas generados para el material analito son muy sensibles a los contaminantes. Esencialmente, cualquier material introducido en el espectrómetro de masas que se pueda ionizar aparecerá en el espectro de masas. Esto significa que para muchos análisis es necesario purificar cuidadosamente el analito antes de introducirlo en el espectrómetro de masas. Para los sistemas de alto rendimiento para el análisis indirecto de los analitos por medio de marcadores de masa sería deseable evitar cualquiera de las etapas innecesarias de la preparación de las muestras. Es decir sería deseable poder detectar los marcadores en un fondo de material contaminante y estar seguro de que el pico que se detecta corresponde de hecho a un marcador. La técnica anterior no describe métodos o composiciones que puedan mejorar la razón señal a ruido obtenible en los sistemas de detección basados en la espectrometría de masas o que puedan proporcionar la confirmación de que un pico de masa en un espectro estaba causado por la presencia de un marcador de masa.

Para detectar analitos después de separaciones mediante cromatografía líquida o electroforéticas es deseable que los marcadores utilizados, interfieran mínimamente en el proceso de separación. Si se utiliza una matriz de semejantes marcadores, es deseable que el efecto de cada miembro de la matriz sobre su analito asociado sea el mismo que cualquier otro marcador. Esto está reñido hasta cierto punto con la intención del marcaje de masas que es para generar matrices que son resolvibles en el espectrómetro de masas basándose en su masa. En la técnica anterior se describe que los marcadores de masa se resolverán preferiblemente por 4 Dalton para evitar la interferencia de los picos de los isótopos de un marcador con los de otro marcador. Esto significa que para generar 250 marcadores de masa distintos se requerirían marcadores diseminados en un intervalo de aproximadamente 1.000 Daltons y probablemente más, ya que no es trivial generar grandes matrices de marcadores separados exactamente por 4 Daltons. Este intervalo de masas dará como resultado casi con certeza marcadores de masa que tendrán un efecto distinto sobre cualquier procedimiento de separación que preceda la detección mediante espectrometría de masas. Esto también tiene implicaciones para el diseño del aparato, ya que a medida que el intervalo de masas a lo largo del cual se pueden detectar iones aumenta, aumenta el coste del aparato.

Por tanto es un objeto de esta invención resolver los problemas asociados con la técnica anterior, y proporcionar marcadores de masa que se puedan detectar en un fondo de contaminación y cuya identidad como marcadores de masa se pueda confirmar. Además es un objeto de esta invención proporcionar matrices de marcadores que se puedan resolver en un intervalo de masas comprimido de manera que los marcadores no interfieran tanto en los procedimientos de separación y que se puedan detectar fácilmente en un espectrómetro de masas que detecte iones a lo largo de un intervalo limitado de razones de masa a carga.

También es un objeto de esta invención proporcionar métodos de análisis de biomoléculas que exploten los marcadores de esta invención para maximizar el rendimiento, las razones de señal a ruido y la sensibilidad de tales análisis, concretamente para el análisis de péptidos.

En un primer aspecto la invención proporciona un conjunto de dos o más marcadores de masa, comprendiendo cada marcador del conjunto un radical señalizador de masas anclado por medio de al menos un enlace amida a un radical de normalización de masas, donde la masa agregada de cada marcador del conjunto puede ser igual o diferente y la masa del radical señalizador de masas de cada marcador del conjunto puede ser igual o diferente, y donde el conjunto comprende un grupo de marcadores que tienen un radical señalizador de masas de una masa común o el conjunto comprende un grupo de marcadores que tienen una masa agregada común y donde en cualquier grupo de marcadores del conjunto que tenga un radical señalizador de masas de una masa común cada marcador tiene una masa agregada diferente de la de todos los demás marcadores de ese grupo, y donde en cualquier grupo de marcadores del conjunto que tenga una masa agregada común cada marcador tiene un radical señalizador de masas que tiene una masa diferente de la de todos los demás radicales señalizadores de masa de ese grupo, de manera que todos los marcadores de masa del conjunto son distinguibles entre sí mediante espectrometría de masas, y donde el radical señalizador de masas comprende un aminoácido y el radical de normalización de masas comprende un aminoácido.

Se pretende que el término radical señalizador de masas utilizado en el presente contexto haga referencia a un radical que va a ser detectado mediante espectrometría de masas, mientras se pretende que el término radical de normalización de masas utilizado en el presente contexto haga referencia a un radical que no va a ser detectado necesariamente mediante espectrometría de masa, pero está presente para asegurarse de que un marcador de masa tiene la masa agregada deseada. El número de marcadores del conjunto no está especialmente limitado, siempre que el conjunto comprenda una pluralidad de marcadores. No obstante, se prefiere que el conjunto comprenda dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más marcadores.

La presente invención también proporciona una matriz de marcadores de masa, que comprende dos o más conjuntos de marcadores de masa como se han definido antes, donde la masa agregada de cada uno de los marcadores de masa en uno cualquiera de los conjuntos es diferente de la masa agregada de cada uno de los marcadores de masa de cualquier otro conjunto de la matriz. El radical señalizador de masas y el radical de normalización de masas comprenden ambos al menos un aminoácido. Sin embargo, los radicales pueden comprender grupos adicionales, si se desea, tales como más grupos aminoácido, y/o grupos ariléter. De este modo los radicales pueden ser aminoácidos modificados, o pueden ser péptidos. Las masas de los diferentes conjuntos de la matriz se pueden distinguir añadiendo más grupos aminoácido a cualquiera o a ambos radicales según se requiera.

Adicionalmente la invención proporciona un método de análisis, cuyo método comprende detectar un analito identificando mediante espectrometría de masas un marcador de masa o una combinación de marcadores de masa única para el analito, donde el marcador de masa es un marcador de masa de un conjunto o una matriz de marcadores de masa como se ha definido antes.

En ciertas realizaciones de esta invención las etiquetas de masa pueden comprender funcionalidades reactivas que facilitan el anclaje de las etiquetas de masa a moléculas de analito. Las etiquetas de esta realización son preferiblemente de la siguiente forma:

aminoácido 1 - enlace amida - aminoácido 2 - funcionalidad reactiva

donde el radical señalizador de masas y el radical de normalización de masas pueden ser el aminoácido 1 o el aminoácido 2.

En las realizaciones preferidas de la invención, las matrices de etiquetas son todas preferiblemente químicamente idénticas y las masas de los radicales de normalización de masa y señalizadores de masa (p. ej. los aminoácidos 1 y 2 anteriores) están alteradas por sustituciones con isótopos.

En las realizaciones preferidas de esta invención, las etiquetas pueden comprender un grupo potenciador de la sensibilidad. Las etiquetas son preferiblemente de la forma:

grupo potenciador de la sensibilidad - aminoácido 1 - enlace amida - aminoácido 2 - funcionalidad reactiva

En este ejemplo el grupo potenciador de la sensibilidad está anclado normalmente al radical señalizador de masa, puesto que está destinado a incrementar la sensibilidad de la detección de este radical en el espectrómetro de masas. Se demuestra que la funcionalidad reactiva está presente y anclada a un radical diferente que el grupo potenciador de la sensibilidad. No obstante, las etiquetas no necesitan estar limitadas de esta manera y en algunos casos comprenden el grupo potenciador de la sensibilidad sin la funcionalidad reactiva. En otras realizaciones el grupo potenciador de la sensibilidad puede estar anclado al mismo radical que la funcionalidad reactiva.

En ciertas realizaciones de la invención las etiquetas de masa comprenden un reactivo de captura por afinidad. Preferiblemente, el ligando de captura de afinidad es la biotina. El ligando de captura por afinidad permite separar los analitos marcados de los analitos no marcados capturándolos, p. ej. sobre una fase sólida con avidina añadida.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para analizar una biomolécula o una mezcla de biomoléculas. Este método comprende preferiblemente las etapas de:

1.

Hacer reaccionar la biomolécula o mezcla de biomoléculas con un señalizador de masas de acuerdo con esta invención;

2.

Separar opcionalmente la biomolécula marcada electroforéticamente o cromatográficamente;

3.

Ionizar la biomolécula marcada;

4.

Seleccionar los iones de una razón de masa a carga predeterminada correspondiente a la razón de masa a carga de los iones preferidos de la biomolécula cargada en un analizador de masa;

5.

Inducir la disociación de estos iones seleccionados mediante colisión;

6.

Detectar los productos de la colisión para identificar los iones producto de la colisión que son indicativos de los marcadores de masa.

En esta realización, cuando las etiquetas de masa comprenden una etiqueta de afinidad, se pueden capturar biomoléculas etiquetadas por afinidad por medio de un ligando contador para permitir que las biomoléculas marcadas se separen de las biomoléculas no marcadas. Esta etapa tiene lugar preferiblemente antes de la segunda etapa opcional anterior.

En ciertas realizaciones la etapa de selección de los iones de una razón de masa a carga predeterminada se realiza en el primer analizador de masas de un aparato en serie. Los iones seleccionados se canalizan después en una célula de colisión separada donde se hacen colisionar con un gas o una superficie sólida de acuerdo con la cuarta etapa del primer aspecto de la invención. Los productos de la colisión se canalizan después en un analizador de masas adicional de un aparato en serie para detectar los productos de la colisión de acuerdo con la quinta etapa del primer aspecto de esta invención. Los aparatos en serie típicos incluyen un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple, aparatos de sector en tándem y espectrómetros de masas de tiempo de vuelo cuadrupolares.

En otras realizaciones, la etapa de selección de iones de una razón masa a carga predeterminada, la etapa de hacer colisionar los iones seleccionados con un gas y la etapa de detectar los productos de la colisión se realizan en la misma zona del espectrómetro de masas. Esto puede tener efecto sobre los analizadores de masas de tipo trampa de iones y espectrómetros de masas de Resonancia de Ión Ciclotrón por Transformada de Fourier, por ejemplo.

En otro aspecto, esta invención proporciona conjuntos o matrices de moléculas sometidas a marcaje de masas de la forma:

analito - enlazador - marcador

donde el marcador es un señalizador de masas de un conjunto o matriz de acuerdo con esta invención, el enlazador es un enlazador como se describe más abajo y el analito puede ser cualquier analito de interés tal como una biomolécula. Un aspecto preferido de esta realización se produce cuando los analitos (uno, más de uno o incluso todos los analitos) del conjunto o la matriz son analitos patrón con una masa conocida o con propiedades cromatográficas predeterminadas. Tales patrones se pueden emplear en los métodos de la presente invención para la comparación con analitos desconocidos, por ejemplo cuando se analizan los resultados de una etapa de separación cromato-
gráfica.

En esta invención se describen señalizadores de masa que pueden ser producidos fácilmente en un sintetizador de péptidos. De hecho, los compuestos utilizados en esta invención comprenden péptidos y péptidos modificados. La síntesis de péptidos proporciona diversidad química que permite producir una amplia gama de señalizadores con propiedades seleccionadas de una manera automatizada.

El término "MS/MS" en el contexto del espectrómetro de masas hace referencia a un espectrómetro de masas capaz de seleccionar iones, someter los iones seleccionados a Disociación Inducida por Colisión (CID) y someter los iones fragmentados a un análisis adicional.

El término "aparato en serie" hace referencia a espectrómetros de masas susceptibles de MS/MS en los cuales los analizadores de masa se organizan en serie y cada una de las etapas del proceso de MS/MS se realiza una detrás de otra en analizadores de masa enlazados. Los aparatos en serie típicos incluyen un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple, aparatos de sector en tándem y espectrómetros de masas de tiempo de vuelo cuadrupolares.

La invención se describirá ahora con más detalle por medio de ejemplos, solamente, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un conjunto de 3 etiquetas de masa derivadas de lisina;

La Figura 2 muestra un conjunto de 5 etiquetas de masa derivadas de alanina;

La Figura 3 muestra un conjunto de 5 etiquetas de masa derivadas de alanina y tirosina;

La Figura 4 muestra un conjunto de 4 etiquetas de masa derivadas de formas fluoradas de fenilglicina;

La Figura 5 muestra un conjunto de 4 etiquetas de masa derivadas de formas fluoradas de fenilglicina y fenilalanina;

La Figura 6a muestra un conjunto de 2 etiquetas de masa de afinidad por el ligando derivadas de de metionina con una funcionalidad hidrazida para el marcaje de carbohidratos;

La Figure 6b muestra un conjunto de 2 etiquetas de masa de afinidad por el ligando derivadas de metionina con una funcionalidad ácido borónico para el marcaje de carbohidratos;

La Figura 7 muestra un conjunto de 2 etiquetas de masa de afinidad por el ligando derivadas de metionina con una funcionalidad tiol para el marcaje de restos deshidroalanina y metildeshidroalanina;

La Figura 8 muestra un conjunto de 2 etiquetas de masa de afinidad por el ligando derivadas de metionina con una funcionalidad maleimida para el marcaje de tioles libres;

La Figura 9a muestra una ruta sintética para la preparación de un resto metionina deuterado, protegido con FMOC y la figura 9b muestra una ruta sintética para la preparación de un enlazador reactivo que puede actuar como potenciador de la sensibilidad;

La Figura 10 muestra un par de péptidos ejemplares derivados de diferentes formas isotópicas de metionina sintetizadas para demostrar las características de esta invención;

La Figura 11 muestra un espectro de masas por electropulverización de una mezcla de los dos péptidos mostrados en la Figura 10;

La Figura 12 muestra un espectro por electropulverización de la fragmentación de cada uno de los dos péptidos mostrados en la Figura 10;

La Figura 13 muestra un mecanismo de fragmentación hipotético que es probable que represente los espectros mostrados en las Figuras 12 y 14;

La Figura 14 muestra un espectro de electropulverización de la fragmentación de una mezcla 70:30 de los dos péptidos mostrados en la Figura 10;

La Figura 15 muestra un gráfico que presenta las razones esperadas de los péptidos A y B (Figura 10) frente a las razones observadas los péptidos A y B encontrados en una serie de análisis ESI-MS/MS de las mezclas A y B;

Las Figuras 16a-16c representan los mecanismos de fragmentación propuestos;

Las Figuras 17a-17d ilustran etiquetas que explotan la potenciación de la escisión en el enlace amida escindible;

Las Figuras 18a y 18b muestran las estructuras de dos versiones de los marcadores TMT;

La Figura 19a y 19b muestran los espectros CID típicos para un péptido marcado con TMT de primera generación en las energías de colisión de 40V (Figura 19a) y 70V (Figura 19b);

La Figura 20a, 20b y 20c muestran los espectros EM y EM/EM para iones triplemente cargados del péptido 2 (véase la Tabla 7) marcado con TMT de primera y segunda generación;

La Figura 21 muestra un espectro CID típico para un péptido (péptido 2 de la Tabla 7) marcado con un TMT de segunda generación;

La Figura 22 muestra que el estado de carga del péptido etiquetado con TMT no afecta a la apariencia de los fragmentos de la etiqueta en el espectro CID de los péptidos marcados;

La Figura 23 muestra mezclas de péptidos con las razones de abundancia esperadas y medidas para las etiquetas de primera y segunda generación;

La Figura 24 muestra la elución simultánea de cada par de péptidos, péptidos A y B para cada péptido de la Tabla 7;

La Figura 25 muestra un estudio de rango dinámico de los pares de péptidos TMT 3A/3B, que están presentes en una razón de 40:60 y han sido analizados a diluciones en el intervalo de 100 fmoles a 100 pmoles; y

Las Figuras 26a, 26b y 26c muestran los resultados de un experimento de adición ("spiking") en el cual pares de péptidos 3A y 3B (500 fmoles en total, en una proporción de 40:60 respectivamente) que portan TMT de segunda generación se mezclaron con un producto digerido con tripsina de Seralbúmina Bovina (2 pmoles).

Las Figuras 1 a 5 ilustran numerosas características importantes de las etiquetas de esta invención. Las etiquetas de todas las figuras 1 a 5 se muestran unidas a una "funcionalidad reactiva", que podría ser un enlazador a un éster de N-hidroxisuccinimida por ejemplo o cualquier número de posibilidades distintas algunas de las cuales se comentan más abajo. Las Figuras 1, 2 y 4 muestran que se pueden generar numerosas etiquetas combinando diferentes formas de masa modificada del mismo aminoácido en una serie de dipéptidos. Las Figuras 3 y 5 muestran conjuntos de etiquetas, que se crean combinando diferentes aminoácidos en heterodímeros. Las Figuras 1 a 3 ilustran etiquetas, que tienen todas la misma masa total y que son químicamente idénticas. Estas etiquetas difieren en la distribución de isótopos en las moléculas, mientras en las Figuras 4 y 5 que tienen todas la misma masa total pero no son químicamente idénticas, estas etiquetas difieren en la distribución de sustituyentes flúor en las etiquetas.

La Figura 1 se comentará ahora con más detalle. La Figura 1 muestra 3 homodímeros de lisina. La lisina ha sido bloqueada en los grupos épsilon amino con cloruro de metilsulfonilo. La conexión sulfonamida es más resistente a la fragmentación que una conexión amida convencional, de manera que el grupo protector terminal no se perderá cuando la etiqueta se fragmente en un espectrómetro de masas utilizando la disociación inducida por colisión a energías suficientes para escindir el enlace amida del esqueleto convencional entre el par de restos lisina modificados. El grupo protector terminal se utiliza para inhibir la protonación en la posición épsilon durante la ionización de las etiquetas en un espectrómetro de masas. La lisina protegida terminalmente se puede preparar antes de la síntesis de las etiquetas de masa. El grupo épsilon amino se puede modificar selectivamente acoplando el aminoácido a cloruro de metilsulfonilo en presencia de iones cobre, por ejemplo. Las funcionalidades amina y ácido en la posición alfa pueden formar quelatos con diversos cationes divalentes volviendo no reactivo el grupo alfa amino. El grupo alfa amino del dipéptido se ha convertido en un grupo guanidino para promover la protonación en esta posición en la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas y para diferenciar la masa del producto de fragmentación del segundo resto alanina y los restos alanina naturales en la proteína. La guanidinación de la posición alfa se puede realizar como última etapa de una síntesis de péptidos convencional antes de la desprotección del péptido y la escisión de la resina (Z. Tian y R.W. Roeske, Int. J. Peptide Protein Res. 37: 425-429, "Guanidination of a peptide side chain amino group on a solid support", 1991). Se podrían utilizar diferentes formas deuteradas de lisina para preparar las tres etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las tres etiquetas es la misma pero la lisina N-terminal de cada etiqueta difiere de las otras dos en al menos cuatro Daltons. Esta diferencia de masa es normalmente suficiente para evitar los picos de isótopos naturales de las porciones fragmentadas de cada etiqueta del solapamiento en el espectro de masas con los picos del isótopo de las porciones fragmentadas de otras etiquetas.

La Figura 2 se comentará ahora con más detalle. La Figura 2 muestra 5 homodímeros de alanina. Se utilizarían diferentes formas sustituidas isotópicamente de alanina para preparar las cinco etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las cinco etiquetas es la misma pero la alanina N-terminal de cada etiqueta difiere de las otras cuatro en al menos un Dalton. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido metilado para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido del producto de fragmentación del segundo resto alanina y los restos alanina naturales de la proteína y para promover la protonación en esta posición de la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas.

La Figura 3 se comentará ahora con más detalle. La Figura 3 muestra 5 heterodímeros de alanina y tirosina. Se utilizarían diferentes formas sustituidas isotópicamente de alanina y tirosina para preparar las cinco etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las cinco etiquetas es la misma pero la alanina N-terminal de cada etiqueta difiere de las otras cuatro en al menos un dalton. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido metilado para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido de los productos de fragmentación de los restos alanina naturales de la proteína y para promover la protonación en esta posición de la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas.

La Figura 4 se comentará ahora con más detalle. La Figura 4 muestra 4 dímeros de fenilglicina. Se utilizarían diferentes formas de fenilglicina sustituidas con flúor para preparar las 4 etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las 4 etiquetas es la misma pero la fenilglicina N-terminal de cada etiqueta difiere de las otras 3 etiquetas por la masa de al menos un átomo de flúor. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido metilado para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido del producto de fragmentación del segundo resto de fenilglicina y para promover la protonación en la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas.

La Figura 5 se comentará ahora con más detalle. La Figura 5 muestra 4 dímeros que comprenden fenilglicina y fenilalanina. Se utilizarían diferentes formas sustituidas con flúor de fenilglicina y fenilalanina para preparar las 4 etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las cuatro etiquetas es la misma pero la alanina N-terminal de cada etiqueta difiere de las otras 3 etiquetas por la masa de al menos un átomo de flúor. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido metilado, aunque esto sirve solamente para proteger el grupo amino de las reacciones secundarias y para incrementar la protonación puesto que no es necesario para diferenciar el primer aminoácido como producto de la fragmentación sin metilación sería diferente del segundo resto aminoácido del péptido etiqueta. El grupo alfa amino podría ser modificado para promover la protonación en esta posición de la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas mediante metilación o guanidinación si esto fuera deseable.

La presente invención se describirá ahora con más detalle. En una realización preferida, la presente invención proporciona un conjunto de marcadores de masa como se ha definido antes, en el cual cada marcador del conjunto tiene un radical señalizador de masas que tiene una masa común y cada marcador del conjunto tiene una masa agregada única.

En una realización alternativa, más preferida, cada marcador del conjunto tiene una masa agregada común y cada marcador del conjunto tiene un radical señalizador de masas con una masa única.

El conjunto de marcadores no necesita estar limitado a las dos realizaciones preferidas descritas antes, y puede comprender por ejemplo marcadores de ambos tipos, siempre que todos los marcadores sean distinguibles mediante espectrometría de masas, como se ha esbozado antes.

Se prefiere que, en un conjunto de marcadores del segundo tipo, cada radical señalizador de masas del conjunto tenga una estructura básica común y cada radical de normalización de masas del conjunto tenga una estructura básica común, y cada marcador de masa del conjunto comprenda uno o más radicales ajustadores de masa, estando anclados o situados los radicales ajustadores de masas en la estructura básica del radical señalizador de masas y/o la estructura básica del radical de normalización de masas. En esta realización, cada radical señalizador de masas del conjunto comprende un número diferente de radicales ajustadores de masas y cada marcador de masa del conjunto tiene el mismo número de radicales ajustadores de masas.

En toda esta descripción, por estructura básica común, se quiere significar que dos o más radicales comparten una estructura que tiene sustancialmente el mismo esqueleto estructural, armazón o núcleo. Este esqueleto o armazón puede comprender por ejemplo uno o más aminoácidos. Preferiblemente el esqueleto comprende numerosos aminoácidos unidos por enlaces amida. No obstante, también pueden estar presentes otras unidades tales como unidades de éter arílico. El esqueleto o armazón puede comprender sustituyentes pendientes de él, o reposiciones atómicas o isotópicas en él, sin cambiar la estructura básica común.

Típicamente, un conjunto de marcadores de masa del segundo tipo referido antes comprende marcadores de masa con la fórmula:

M(A)_{y}-L-X(A)_{z}

donde M es el radical de normalización de masas, X es el radical señalizador de masas, A es un radical ajustador de masas, L es el enlazador escindible que comprende el enlace amida, y y z son números enteros de 0 o mayores, e y+z es un número entero de 1 o mayor. Preferiblemente, M es un grupo resistente a la fragmentación, L es un enlazador que es susceptible de fragmentación en la colisión con otra molécula o átomo y X es preferiblemente un grupo resistente a la fragmentación, pre-ionizado. La suma de las masas de M y X es la misma para todos los miembros del conjunto. Preferiblemente M y X tienen la misma estructura básica o estructura núcleo, estando modificada esta estructura por radicales ajustadores de masas. El radical ajustador de masas asegura que la suma de las masas de M y X sea la misma para todos los marcadores de masa de un conjunto, pero asegura que cada X tiene una masa distinta
(única).

La presente invención también abarca matrices de una pluralidad de conjuntos de marcadores de masa. Las matrices de marcadores de masa de la presente invención no están particularmente limitadas, siempre que contengan a pluralidad de conjuntos de marcadores de masa según la presente invención. Se prefiere que las matrices comprendan dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más conjuntos de marcadores de masa. Preferiblemente cada uno de los marcadores de masa en la matriz tiene cualquiera de las siguientes estructuras:

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(S)_{x}-M(A)_{y}-L-X(A)_{z}

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M(A)_{y}-(S)_{x}-L-X(A)_{z}

donde S es el grupo modificador de la serie de masas, M es el radical de normalización de masas, X es el radical señalizador de masas, A es el radical ajustador de masas, L es el enlazador escindible que comprende el enlace amida, x es un número entero de 0 o superior, y y z son números enteros de 0 o superiores, e y+z es un número entero de 1 o superior. El grupo modificador de las series de masa separa las masas de los conjuntos entre sí. Este grupo puede ser cualquier tipo de grupo, pero es preferiblemente un aminoácido, o un grupo éter arílico. Los conjuntos se pueden separar por masas al comprender un número diferente de aminoácidos en sus radicales que otras etiquetas de conjuntos diferentes.

Grupos Enlazadores

En el estudio anterior y siguiente se hace referencia a grupos enlazadores que se pueden utilizar para conectar moléculas de interés a los compuestos marcadores de masa de esta invención. Se conocen en la técnica una variedad de enlazadores que se pueden introducir entre los marcadores de masa de esta invención y su analito anclado covalentemente. Algunos de estos enlazadores pueden ser escindibles. Los oligo- o poli-etilenglicoles o sus derivados se pueden utilizar como enlazadores, tales como los descritos por Maskos, U. & Southern, en E.M. Nucleic Acids Research 20: 1679-1684, 1992. Los enlazadores basados en ácido succínico se utilizan también ampliamente, aunque estos son menos preferidos para las aplicaciones que implican el marcaje de oligonucleótidos puesto que son generalmente lábiles frente a las bases y en ese caso son incompatibles con las etapas de desprotección mediadas por las bases utilizadas en numerosos sintetizadores de oligonucleótidos.

El alcohol propargílico es un enlazador bifuncional que proporciona una conexión que es estable en las condiciones de síntesis de oligonucleótidos y es un enlazador preferido para su uso con esta invención en relación con las aplicaciones de oligonucleótidos. De un modo similar el 6-aminohexanol es un reactivo bifuncional útil para conectar moléculas apropiadamente funcionalizadas y es también un enlazador preferido.

Se pueden utilizar una variedad de grupos enlazadores escindibles junto con los compuestos de esta invención, por ejemplo como enlazadores fotoescindibles. Los grupos orto-nitrobencilo son conocidos como enlazadores fotoescindibles, concretamente los ésteres 2-nitrobencílicos y las 2-nitrobencilaminas, que se escinden en el enlace bencilamina. Para una revisión de los enlazadores escindibles véase Lloyd-Williams et al., Tetrahedron 49, 11065-11133, 1993, que cubre una variedad de enlazadores fotoescindibles y escindibles químicamente.

En publicación la publicación WO 00/02895 se describen los compuestos de vinilsulfona como enlazadores escindibles, que son también aplicables para su uso en esta invención, concretamente en aplicaciones que implican el marcaje de polipéptidos, péptidos y aminoácidos.

En la publicación la publicación WO 00/02895 se describe el uso de compuestos de silicio como enlazadores que son escindibles por bases en la fase gaseosa. Estos enlazadores son también aplicables para su uso en esta invención, concretamente en aplicaciones que implican el marcaje de oligonucleótidos.

Se ha mencionado antes que los marcadores de masa de la presente invención pueden comprender funcionalidades reactivas, Re, para ayudar a anclarlos a los analitos. En las realizaciones preferidas de la presente invención, Re es una funcionalidad o grupo reactivo que permite hacer reaccionar covalentemente el marcador de masa con un grupo funcional apropiado en una molécula de analito, tal como, pero no limitado a, un nucleótido, oligonucleótido, polinucleótido, aminoácido, péptido o polipéptido. Re puede estar anclado a los marcadores de masa por medio de un enlazador que puede ser escindible o no. Se pueden introducir una variedad de funcionalidades reactivas en los marcadores de masa de esta invención.

En la Tabla 1 de más abajo se enumeran algunas funcionalidades reactivas que se pueden hacer reaccionar con funcionalidades nucleofílicas que se encuentran en las biomoléculas para generar un enlace covalente entre las dos entidades. Para las aplicaciones que implican oligonucleótidos sintéticos, a menudo se introducen aminas primarias o tioles en los extremos de las moléculas para permitir el marcaje. Cualquiera de las funcionalidades enumeradas más abajo podría ser introducida en los compuestos de esta invención para permitir que los marcadores de masa se anclen a una molécula de interés. Se puede utilizar una funcionalidad reactiva para introducir grupos enlazadores adicionales con una funcionalidad reactiva adicional si se desea esto. No se pretende que la Tabla 1 sea exhaustiva y la presente invención no está limitada al uso de las funcionalidades enumeradas únicamente.

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TABLA 1

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Se debe observar que en aplicaciones que implican el marcaje de oligonucleótidos con los marcadores de masa de esta invención, algunas de las funcionalidades reactivas anteriores o sus grupos enlazadores resultantes tendrían que ser protegidos antes de la introducción en un sintetizador de oligonucleótidos. Preferiblemente se deben evitar los enlaces éster, tioéter y tioéster, amina y amida no protegidos, puesto que usualmente no son estables en un sintetizador de oligonucleótidos. Se conocen en la técnica una amplia variedad de grupos protectores que se pueden utilizar para proteger las uniones de reacciones secundarias no deseadas.

En el estudio de más abajo se hace referencia a "funcionalidades portadoras de carga" y grupos solubilizantes. Estos grupos se pueden introducir en marcadores de masa tales como los marcadores de masa de la invención para promover la ionización y la solubilidad. La elección de los marcadores depende de si se va a utilizar la detección de iones positivos o negativos. En la Tabla 2 de más abajo se enumeran algunas funcionalidades que se pueden introducir en los marcadores de masa para promover la ionización positiva o negativa. No se pretende que la tabla sea una lista exhaustiva, y la presente invención no está limitada al uso de las funcionalidades enumeradas únicamente.

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TABLA 2

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En la publicación la publicación WO 00/02893 se describe el uso de radicales de unión a iones metálicos tales como éteres corona o porfirinas con el fin de mejorar la ionización de los marcadores de masa. Estos radicales también son aplicables para su uso con los marcadores de masa de esta invención.

Los componentes de los marcadores de masa de esta invención son preferiblemente resistentes a la fragmentación de manera que el sitio de fragmentación de los marcadores se puede controlar mediante la introducción de una conexión que es rota fácilmente mediante Disociación Inducida por Colisión. Los éteres arílicos son un ejemplo de una clase de compuestos resistentes a la fragmentación que se pueden utilizar en esta invención. Estos compuestos son también químicamente inertes y térmicamente estables. En la publicación WO 99/32501 se habla del uso de poliéteres en espectrometría de masas con mayor detalle.

En el pasado, el método general para la síntesis de éteres arílicos estaba basado en el acoplamiento de Ullmann de bromuros de arilo con fenoles en presencia de polvo de cobre a aproximadamente 200ºC (referencia representativa: H. Stetter, G. Duve, Chemische Berichte 87 (1954) 1699). Se han desarrollado métodos más suaves para la síntesis de éteres arílicos utilizando un catalizador metálico diferente pero la temperatura de reacción todavía está entre 100 y 120ºC. (M. Iyoda, M. Sakaitani, H. Otsuka, M. Oda, Tetrahedron Letters 26 (1985) 477). Esta es una ruta preferida para la producción de poliéteres marcadores de masa. Véase la síntesis de FT77 proporcionada en los ejemplos más abajo. Un método publicado recientemente proporciona una ruta más preferida para la generación de poliéteres marcadores de masa puesto que se lleva a cabo en condiciones mucho más suaves que las de los primeros métodos (D. E. Evans, J. L. Katz, T. R. West, Tetrahedron Lett. 39 (1998) 2937).

La presente invención también proporciona un conjunto de dos o más sondas, siendo cada sonda en el conjunto diferente y estando anclada a un único marcador de masa o a una combinación única de marcadores de masa, de un conjunto o una matriz de marcadores de masa como se ha definido antes.

Se proporciona adicionalmente una matriz de sondas que comprende dos o más conjuntos de sondas, donde cada sonda en un conjunto cualquiera está anclada a un único marcador de masa, o a una combinación única de marcadores de masa, de un conjunto de marcadores de masa como se ha definido antes, y donde las sondas en un conjunto cualquiera están ancladas a los marcadores de masa del mismo conjunto de marcadores de masa, y cada conjunto de sondas está anclado a los marcadores de masa de los conjuntos de marcadores de masa únicos de una matriz de marcadores de masa como se ha definido antes.

En una realización, cada sonda está anclada preferiblemente a una combinación única de marcadores de masa, siendo distinguida cada combinación por la presencia o ausencia de cada marcador de masa en el conjunto de los marcadores de masa y/o la cantidad de cada marcador de masa anclado a la sonda. Esto se denomina "modo de mezclado" de la presente invención, puesto que las sondas pueden estar ancladas a una mezcla de marcadores de masa.

En los aspectos anteriores, la naturaleza de la sonda no está particularmente limitada. No obstante, preferiblemente cada sonda comprende una biomolécula. Se puede emplear cualquier biomolécula, pero la biomolécula se selecciona preferiblemente entre un ADN, un ARN, un oligonucleótido, una base de ácido nucleico, un péptido, un polipéptido, una proteína y un aminoácido.

En una realización preferida, esta invención proporciona conjuntos y matrices de analitos sometidos a marcaje de masa, tales como nucleótidos, oligonucleótidos y polinucleótidos, de la forma:

Analito-enlazador-marcador

donde el enlazador es un enlazador como se ha definido antes, y el marcador es un marcador de masa de cualquiera de los conjuntos y matrices definidos antes.

En el aspecto anterior, la naturaleza del analito no está particularmente limitada. No obstante, preferiblemente cada analito comprende una biomolécula. Se puede emplear cualquier biomolécula, pero la biomolécula se selecciona preferiblemente entre un ADN, un ARN, un oligonucleótido, una base de ácido nucleico, un péptido, un polipéptido, una proteína y un aminoácido.

En una realización, cada analito está anclado preferiblemente a una combinación única de marcadores de masa, siendo distinguida cada combinación por la presencia o ausencia de cada uno de los marcadores de masa en el conjunto de los marcadores de masa y/o la cantidad de cada uno de los marcadores de masa anclados a la sonda. Como se ha mencionado antes, esto se denomina "modo de mezclado" de la presente invención, puesto que las sondas pueden estar ancladas a una mezcla de marcadores de masa.

Como se ha mencionado antes, la presente invención proporciona un método de análisis, cuyo método comprende detectar un analito identificando mediante espectrometría de masas un marcador de masa o una combinación de marcadores de masa únicos para el analito, donde el marcador de masa es un marcador de masa de un conjunto o una matriz de marcadores de masa como se ha definido antes. El tipo de método no está particularmente limitado, siempre que el método se beneficie del uso de los marcadores de masa de la presente invención para identificar un analito. El método puede ser, por ejemplo, un método de secuenciación de ácido nucleico o un método para perfilar la expresión de uno o más genes detectando cantidades de proteína en una muestra. El método es especialmente ventajoso, puesto que se puede utilizar para analizar fácilmente una pluralidad de analitos simultáneamente. No obstante, el método también tiene ventajas para analizar analitos sencillos individualmente, puesto que utilizando los presentes marcadores de masa, se producen espectros de masas que son más limpios que los espectros convencionales, haciendo el método exacto y sensible.

En una realización preferida adicional, la presente invención proporciona un método cuyo método comprende:

(a) poner en contacto uno o más analitos con un conjunto de sondas, o una matriz de sondas, siendo específica cada sonda en el conjunto o matriz para al menos un analito, donde las sondas se definen como antes,

(b) identificar un analito, detectando la sonda específica para el analito.

En esta realización se prefiere que el marcador de masa sea escindido de la sonda antes de detectar el marcador de masa mediante espectrometría de masas.

La naturaleza de los métodos de esta realización concreta no está limitada especialmente. No obstante, se prefiere que el método comprenda poner en contacto uno o más ácido nucleicos con un conjunto de sondas de hibridación. El conjunto de sondas de hibridación típicamente comprende un conjunto de hasta 256 4-meros, teniendo cada sonda en el conjunto una diferente combinación de bases de ácidos nucleicos. Este método puede ser adecuado para identificar la presencia de ácidos nucleicos diana, o alternativamente se puede utilizar en un método por etapas de secuenciación por prolongación del cebador de uno o más moldes de ácido nucleico.

Los marcadores de masa de la presente invención son concretamente adecuados para su uso en métodos de análisis bidimensional, principalmente debido al gran número de marcadores que se pueden distinguir simultáneamente. Los marcadores se pueden utilizar en ese caso en un método de electroforesis en gel bidimensional, o en un método de espectrometría de masas bidimensional.

Síntesis de Péptidos

La síntesis de muchos ejemplos de las etiquetas de masa peptídicas de esta invención será posible utilizando métodos de síntesis de péptidos convencionales y reactivos disponibles en el mercado. Los aminoácidos modificados que no están disponibles en el mercado también están contemplados para la síntesis de etiquetas de masa peptídicas.

La síntesis peptídica moderna se lleva a cabo típicamente sobre soportes en fase sólida en aparatos sintetizadores automatizados, que liberan todos los reactivos necesarios para cada etapa de la síntesis peptídica en el soporte sólido y separan los reactivos agotados y los reactivos en exceso que no han reaccionado al final de cada etapa del ciclo. No obstante, la síntesis peptídica en fase sólida se realiza a menudo manualmente, concretamente cuando se están sometiendo a ensayo por primera vez reactivos especialistas. En esencia la síntesis peptídica implica la adición de aminoácidos N-protegidos al soporte sólido. El péptido se sintetiza normalmente con el grupo carboxilo C-terminal del péptido anclado al soporte, y la secuencia del péptido se construye a partir del aminoácido C-terminal hacia el aminoácido N-terminal. El aminoácido C-terminal es acoplado al soporte mediante una conexión escindible. El grupo alfa amino protegido en N de cada aminoácido es desprotegido para permitir el acoplamiento del grupo carboxilo del siguiente aminoácido al péptido en crecimiento sobre el soporte sólido. Para la mayoría de los propósitos, la síntesis peptídica se realiza por medio de dos procedimientos sintéticos diferentes, que se distinguen por las condiciones necesarias para separar el grupo protector de N. El grupo t-butoxicarbonilo (t-BOC) es escindido por las condiciones débilmente ácidas, p. ej. ácido trifluoroacético en diclorometano, mientras el grupo fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) es escindido por condiciones débilmente alcalinas, p. ej. piperidina en dimetilformamida al 20%. Las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos también necesitan protección durante los ciclos de formación de los enlaces amida. Estas cadenas laterales incluyen el grupo épsilon amino de la lisina, la cadena lateral guanidino de la arginina, la funcionalidad tiol de la cisteína, las funcionalidades hidroxilo de la serina, la treonina y la tirosina, el anillo de indol del triptófano y el anillo de imidazol de la histidina. La elección de los grupos protectores utilizados para la protección de la cadena lateral se determina mediante las condiciones de escisión de los grupos de protección del alfa amino, ya que los grupos de protección de las cadenas laterales deben ser resistentes a las condiciones de desprotección utilizadas para separar los grupos de protección del alfa amino. Un primer grupo protector se dice que es "ortogonal" con respecto a un segundo grupo protector si el primer grupo protector es resistente a la desprotección en las condiciones utilizadas para la desprotección del segundo grupo protector y si las condiciones de desprotección del primer grupo protector no ocasionan la desprotección del segundo grupo protector.

Los ejemplos de los grupos de protección de la cadena lateral compatibles con la síntesis FMOC se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

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Otros grupos protectores de la cadena lateral que son ortogonales con respecto a la protección con FMOC serán conocidos por los expertos en la técnica y se pueden aplicar en esta invención (véase por ejemplo Fields G.B. & Noble R.L., Int J Pept Protein Res 35(3): 161-214, "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids". 1990).

Los grupos de protección para las funcionalidades laterales compatibles con la síntesis t-Boc se muestran más abajo en la Tabla 4.

TABLA 4

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De nuevo, el experto en la técnica será consciente de otros grupos protectores para su uso con las cadenas laterales reactivas que son ortogonales con respecto a la protección del alfa amino t-BOC. Diversos soportes sólidos y resinas diferentes están disponibles en el mercado para la síntesis de péptidos utilizando los procedimientos con FMOC o t-BOC (para una revisión de los soportes sólidos véase Meldal. M., Methods Enzymol 289: 83-104, "Properties of solid supports". 1997).

Aminoácidos de masa modificada

Se pueden utilizar una variedad de aminoácidos en el radical señalizador de masas y el radical de normalización de masas. Se prefieren los aminoácidos neutros en el radical de normalización de masas y se prefieren los aminoácidos cargados en los radicales marcadores de masa (ya que esto facilita la ionización y aumenta la sensibilidad) p. ej. en la posición marcada como aminoácido 1 y aminoácido 2 en las realizaciones primera y cuarta de esta invención. En la siguiente Tabla 5 se muestran numerosos aminoácidos de masa modificada isotópicamente disponibles en el mercado. Se prefiere cualquier combinación de 1, 2, 3, o 4 o más aminoácidos de esta lista en cada uno de los radicales de acuerdo con la presente invención.

TABLA 5

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Para muchos de los aminoácidos anteriores, se encuentran disponibles tanto las formas D como L (de ISOTEC Inc., Miamisburg, Ohio por ejemplo), cualquiera de las cuales se puede utilizar en la preparación de las etiquetas de esta invención. También se encuentran disponibles mezclas de las formas D y L pero son menos preferidas si las etiquetas de esta invención se van a utilizar en separaciones cromatográficas. Para algunas, también se encuentran disponibles derivados protegidos con FMOC o t-BOC. Los aminoácidos de masa modificada basados en la sustitución de deuterio por hidrógeno y en la sustitución de los isótopos C^{13} y N^{15} por los isótopos C^{12} y N^{13} también se encuentran disponibles y son igualmente aplicables para la síntesis de las etiquetas de esta invención. También se pueden utilizar diversos aminoácidos que no se encuentran típicamente en los péptidos en las etiquetas de esta invención, por ejemplo se encuentran disponibles en el mercado formas deuteradas de ácido aminobutírico. Para los fines de esta invención se prefieren
isótopos no radiactivos, estables por razones de seguridad pero no es necesaria una limitación a isótopos estables.

Los derivados fluorados de numerosos aminoácidos también se encuentran disponibles. Algunos aminoácidos fluorados disponibles en el mercado se muestran en la siguiente Tabla 6.

TABLA 6

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Para la mayor parte de los aminoácidos fluorados anteriores, los reactivos se encuentran disponibles en forma de mezclas de las formas D y L. En general, las variantes fluoradas de los aminoácidos son menos preferidas que las variantes sustituidas con isótopos. Los compuestos fluorados se puede utilizar para generar una gama de etiquetas de masa con la misma masa pero cada etiqueta será químicamente diferente, lo que significa que su comportamiento en el espectrómetro de masas variará más que las etiquetas sustituidas con isótopos. Por otra parte, las etiquetas no tendrán propiedades cromatográficas idénticas si las etiquetas se van a utilizar en separaciones cromatográficas.

Funcionalidades Reactivas

En algunos aspectos de esta invención, como ya se ha explicado, las etiquetas de masa de la invención comprenden una funcionalidad reactiva. En las realizaciones más simples ésta puede ser un éster de N-hidroxisuccinimida introducido mediante activación del extremo C de los péptidos etiqueta de esta invención. En la síntesis peptídica convencional, esta etapa de activación tendría que producirse después de que la etiqueta de masa peptídica se haya escindido del soporte sólido utilizado para su síntesis. También se podría hacer reaccionar con hidrazina una etiqueta peptídica activada con N-hidroxisuccinimida para dar una funcionalidad reactiva de hidrazida, que se puede utilizar para marcar radicales azúcar oxidados con peryodato, por ejemplo. Se pueden utilizar grupos amino o tioles como funcionalidades reactivas en algunas aplicaciones y estos se pueden introducir añadiendo lisina o cisteína después del aminoácido 2 del péptido etiqueta. Se puede utilizar lisina para acoplar etiquetas a funcionalidades carboxilo libres utilizando una carbodiimida como reactivo de acoplamiento. También se puede utilizar lisina como punto de partida para la introducción de otras funcionalidades reactivas en los péptidos etiqueta de esta invención. La funcionalidad maleimida reactiva con tiol se puede introducir mediante reacción del grupo épsilon amino de la lisina con anhídrido maleico. El grupo tiol de la cisteína se puede utilizar como punto de partida para la síntesis de una variedad de compuestos alquenilsulfona, que son reactivos de marcaje de proteínas útiles que reaccionan con tioles y aminas. Se pueden utilizar compuestos tales como ácido aminohexanoico para proporcionar un espaciador entre los aminoácidos con la masa modificada y la funcionalidad reactiva.

Ligandos de Captura por Afinidad

En ciertas realizaciones del primer aspecto de esta invención los marcadores de masa comprenden un ligando de captura por afinidad. Los ligandos de captura por afinidad son ligandos, que tienen compañeros de unión altamente específicos. Estos compañeros de unión permiten que las moléculas marcadas con el ligando sean capturadas selectivamente por el compañero de unión. Preferiblemente se transforma un soporte sólido con el compañero de unión de manera que las moléculas etiquetadas con el ligando de afinidad se puedan capturar selectivamente sobre el soporte en fase sólida. Un ligando de captura por afinidad preferido es la biotina, que puede ser introducida en las etiquetas de masa peptídicas de esta invención mediante métodos normalizados conocidos en la técnica. En particular se puede incorporar un resto lisina después del aminoácido 2 a través del cual se puede conectar una biotina reactiva con amina a las etiquetas de masa peptídicas (véase por ejemplo Geahlen R.L. et al., Anal Biochem 202(1): 68-67, "A general method for preparation of peptides biotinylated at the carboxy terminus". 1992; Sawutz D.G. et al., Peptides 12(5): 1019-1012, "Synthesis and molecular characterization of a biotinylated analog of [Lys]bradykinin". 1991; Natarajan S. et al., Int J Pept Protein Res 40(6): 567-567, "Site-specific biotinylation. A novel approach and its application to endothelin-1 analogs and PTH-analog"., 1992). También es aplicable la iminobiotina. Se encuentran disponibles una variedad de ligandos contadores de avidina para biotina, que incluyen avidina y estreptavidina monomérica y tetramérica, todos los cuales se encuentran disponibles sobre numerosos soportes sólidos.

Otros ligandos de captura por afinidad incluyen digoxigenina, fluoresceína, radicales nitrofenilo y numerosos epítopos peptídicos, tales como el epítopo c-myc, para los cuales existen anticuerpos monoclonales selectivos como ligandos contadores. También son aplicables los ligandos de unión a iones metálicos tales como hexahistidina, que se une fácilmente a los iones Ni^{2+}. Las resinas cromatográficas, que presentan iones Ni^{2+} quelados con ácido iminodiacético, por ejemplo, se encuentran disponibles en el mercado. Estas columnas de níquel inmovilizadas se pueden utilizar para capturar etiquetas de masa peptídicas, que comprenden histidina oligomérica. Como alternativa adicional, una funcionalidad de captura por afinidad puede ser reactiva de manera selectiva con un soporte en fase sólida apropiadamente transformado. Se sabe que el ácido borónico, por ejemplo, reacciona selectivamente con dioles en cis próximos y ligandos químicamente similares, tales como ácido salicilhidroxámico. Los reactivos que comprenden ácido borónico han sido desarrollados para la captura de proteínas sobre soportes sólidos transformados con ácido salicilhidroxámico (Stolowitz M.L. et al., Bioconjug Chem 12(2): 229-239, "Phenylboronic Acid-Salicylhydroxamic Acid Bioconjugates. 1. A Novel Boronic Acid Complex for Protein Immobilization". 2001; Wiley J.P. et al., Bioconjug Chem 12(2): 240-250, "Phenylboronic Acid-Salicylhydroxamic Acid Bioconjugates. 2. Polyvalent Immobilization of Protein Ligands for Affinity Chromatography". 2001, Prolinx, Inc, Washington State, USA). Se prevé que debería ser relativamente simple conectar una funcionalidad ácido fenilborónico a una etiqueta de masa peptídica de acuerdo con esta invención para generar reactivos de captura que puedan ser capturados mediante reacciones químicas selectivas. El uso de esta clase de química no sería directamente compatible con biomoléculas que porten azúcares que contengan dioles en cis próximos, no obstante estas clases de azúcares podrían ser bloqueados con ácido fenilborónico o reactivos relacionados antes de la reacción con los reactivos de etiquetas de masa peptídicas transformadas con ácido borónico.

Grupos Potenciadores de la Sensibilidad de la Espectrometría de Masas y Diferenciación de Masas

En realizaciones preferidas de estos primer y cuarto aspectos de la invención las etiquetas de masa peptídica comprenden Grupos Potenciadores de la Sensibilidad. Las Figuras 1 a 5 ilustran el uso de la metilación y la guanidinación como métodos para mejorar la sensibilidad. Además, estos Grupos Potenciadores de la Sensibilidad pueden diferenciar los productos de fragmentación del aminoácido N-terminal de los productos de fragmentación del segundo aminoácido de la etiqueta peptídica y de los restos aminoácido naturales de la proteína, si éste es el mismo que el primer aminoácido. El grupo potenciador de la sensibilidad también puede distinguir los productos de fragmentación del aminoácido N-terminal de la etiqueta de masa peptídica de los productos de fragmentación de los aminoácidos naturales cuando se utilizan las etiquetas de esta invención para marcar péptidos y proteínas. El grupo guanidino y el grupo amino terciario son ambos Grupos Potenciadores de la Sensibilidad útiles para la espectrometría de masas por electropulverización.

También se han desarrollado otros métodos para transformar péptidos. Estos incluyen el uso de derivados de amonio cuaternario, derivados de fosfonio cuaternario y derivados de piridilo para la espectrometría de masas de iones positivos. Los compuestos halogenados, concretamente los compuestos aromáticos halogenados son electróforos bien conocidos, esto es seleccionan electrones térmicos muy fácilmente. Se han desarrollado una variedad de reactivos de transformación basados en compuestos aromáticos fluorados (Bian N. et al., Rapid Commun Mass Spectrom 11(16): 1781-1784, "Detection via laser desorption and mass spectrometry of multiplex electrophore-labelled albumin". 1997) para la detección de la captura de electrones, que es un proceso de ionización y detección altamente sensible que se puede utilizar con la espectrometría de masa de iones negativos (Abdel-Baky S. & Giese R.W., Anal Chem 63(24):2986-2989, "Gas chromatography/electron capture negative-ion mass spectrometry at the zeptomole level". 1991). También se podría utilizar un grupo aromático fluorado como grupo potenciador de la sensibilidad. Los ácidos sulfónicos aromáticos también han sido utilizados para mejorar la sensibilidad en la espectrometría de masa de iones negativos.

Cada tipo de Grupo Potenciador de la Sensibilidad tiene ventajas diferentes, que dependen del método de ionización utilizado y de los métodos de análisis de masa utilizados. El mecanismo mediante el cual se potencia la sensibilidad también puede ser diferente para cada tipo de grupo. Algunos métodos de transformación aumentan el carácter alcalino y de este modo promueven la protonación y la localización de la carga, mientras otros métodos aumentan la actividad superficial de los péptidos etiquetados, lo que mejora la sensibilidad en las técnicas de desorción en superficie como la Ionización/Desorción mediante Láser Asistida por Matriz (MALDI) y el Bombardeo de Átomos Rápidos (FAB). La espectrometría de masa de iones negativos es a menudo más sensible debido a que hay menos ruido de fondo. La transformación de la carga también puede cambiar los productos de fragmentación de los péptidos transformados, cuando se utiliza la disociación inducida por colisión. En particular algunas técnicas de transformación simplifican los patrones de fragmentación, lo que resulta muy ventajoso. La elección del Grupo Potenciador de la Sensibilidad está determinada por las técnicas de espectrometría de masas que se van a emplear (para una revisión véase Roth et al., Mass Spectrometry Reviews 17:255-274, "Charge derivatisation of peptides for analysis by mass spectrometry", 1998). Para los fines de esta invención se podrían utilizar todas las técnicas de transformación conocidas con las etiquetas de masa peptídicas de esta invención. Los protocolos publicados se podrían utilizar sin modificación para transformar las etiquetas de masa peptídicas de esta invención después de la síntesis peptídica en fase sólida o se podrían adaptar fácilmente los protocolos para su uso durante la síntesis en fase sólida si se desea.

Análisis de péptidos mediante Espetrometría de Masas

Las características esenciales de un espectrómetro de masas son las siguientes:

Sistema de Entrada -> Fuente de Iones -> Analizador de Masa -> Detector de Iones ->
Sistema de Captura de Datos

Hay sistemas de entrada, fuentes de iones y analizadores de masa preferidos para el análisis de péptidos.

Sistemas de Entrada

En el segundo aspecto de esta invención se prefiere una separación cromatográfica o electroforética para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis mediante espectrometría de masas. Una variedad técnicas de espectrometría de masas es compatible con las tecnologías de separación concretamente la electroforesis capilar de zona y la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). La elección de la fuente de ionización está limitada hasta cierto punto si se requiere una separación ya que las técnicas de ionización tales como MALDI y FAB (comentadas más abajo) que separan el material de una superficie sólida son menos adecuadas para las separaciones cromatográficas. Para la mayoría de los propósitos, ha sido muy costoso conectar una separación cromatográfica en línea con un análisis espectrométrico de masas por medio de una de estas técnicas. Las técnicas dinámicas de FAB e ionización basadas en la pulverización tales como la electropulverización, la termopulverización y APCI son todas fácilmente compatibles con las separaciones cromatográficas en línea y el equipo para realizar semejante análisis de cromatografía de líquidos -
espectrometría de masas está disponible en el mercado.

Técnicas de Ionización

Para muchas aplicaciones biológicas de la espectrometría de masas se utilizan las denominadas técnicas de ionización "suaves". Estas permiten ionizar grandes moléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos esencialmente intactos. Las técnicas en fase líquida permiten introducir grandes biomoléculas en el espectrómetro de masas en soluciones con un pH suave y a bajas concentraciones. Numerosas técnicas son apropiadas para su uso con esta invención incluyendo pero no limitadas a la Espectrometría de Masas con Ionización por Electropulverización (ESI-MS), Bombardeo de Átomos Rápidos (FAB), Espectrometría de Masas con Ionización/Desorción mediante Láser Asistida por Matriz (MALDI MS) y Espectrometría de Masas con Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI-MS).

Ionización por Electropulverización

La ionización por electropulverización requiere que la solución de producto diluido de la molécula analito sea "atomizada" en el espectrómetro, esto es inyectada en forma de una pulverización fina. La solución es pulverizada, por ejemplo, desde la punta de una aguja cargada en una corriente de nitrógeno seco y un campo electrostático. El mecanismo de ionización no se conoce completamente pero se piensa que funciona a grosso modo como sigue. Se evapora el disolvente en una corriente de nitrógeno. Con una gotita pequeña, esto da como resultado la concentración de la molécula de analito. Dado que la mayor parte de las biomoléculas tienen una carga neta esto incrementa la repulsión electrostática de la molécula disuelta. A medida que la evaporación continúa esta repulsión se vuelve finalmente mayor que la tensión superficial de la gotita y la gotita se desintegra en gotitas más pequeñas. Ese proceso es referido a veces como "explosión Coulómbica". El campo electrostático ayuda a superar adicionalmente la tensión superficial de las gotitas y ayuda al proceso de pulverización. La evaporación continúa desde las gotitas más pequeñas que, a su vez, explotan iterativamente hasta que esencialmente las biomoléculas están en fase de vapor, como está todo el disolvente. Esta técnica es de particular importancia en el uso de marcadores de masa ya que la técnica confiere una cantidad de energía relativamente pequeña a los iones en el proceso de ionización y la distribución de energía en la población tiende a caer a un intervalo más estrecho cuando se compara con otras técnicas. Los iones son acelerados fuera de la cámara de ionización mediante el uso de campos eléctricos que están constituidos por electrodos adecuadamente situados. La polaridad de los campos puede ser alterada para extraer iones negativos o positivos. La diferencia de potencial entre estos electrodos determina si pasan al analizador de masa los iones positivos o los negativos y también la energía cinética con la que estos iones entran en el espectrómetro de masas. Esto tiene trascendencia cuando se considera la fragmentación de los iones en el espectrómetro de masas. A mayor energía conferida a la población de iones mayor probabilidad de que se produzca la fragmentación por medio de la colisión de las moléculas de analitos con el gas del baño presente en la fuente. Ajustando el campo eléctrico utilizado para acelerar los iones desde la cámara de ionización es posible controlar la fragmentación de los iones. Esto resulta ventajoso cuando la fragmentación de los iones se va a utilizar como medio para separar las etiquetas de una biomolécula marcada. La ionización por electropulverización resulta particularmente ventajosa ya que se puede utilizar en línea con una cromatografía líquida, referida como Cromatografía Líquida - Espectrometría de Masas (LC-MS).

Ionización/Desorción mediante Láser Asistida por Matriz (MALDI)

En MALDI se requiere que la solución de biomolécula esté embebida en un gran exceso molar de una "matriz" foto-excitable. La aplicación de luz láser de la frecuencia apropiada da como resultado la excitación de la matriz que a su vez conduce a la rápida evaporación de la matriz junto con su biomolécula atrapada. La transferencia de protones desde la matriz ácida a la biomolécula da lugar a formas protonadas de la biomolécula que pueden ser detectadas por espectrometría de masas de iones positivos, concretamente espectrometría de masas de Tiempo-de-Vuelo (TOF). La espectrometría de masas de iones negativos también es posible mediante MALDI TOF. Esta técnica confiere una cantidad de energía traslacional significativa a los iones, pero a pesar de esto tiende a no inducir una fragmentación excesiva. Sin embargo los voltajes de aceleración se pueden utilizar de nuevo para controlar la fragmentación con esta técnica.

Bombardeo de Átomos Rápidos

El Bombardeo de Átomos Rápidos (FAB) ha llegado a describir numerosas técnicas de evaporación e ionización de moléculas relativamente no volátiles. En estas técnicas se desorbe una muestra de una superficie mediante colisión de la muestra con un haz de átomos de xenón o iones cesio de alta energía. La superficie de la muestra se recubre con una matriz simple, típicamente un material no volátil, p. ej. alcohol m-nitrobencílico (NBA) o glicerol. Las técnicas FAB también son compatibles con sistemas de entrada en fase líquida - el líquido que eluye de una entrada para electroforesis capilar o un sistema de cromatografía líquida a alta presión se hace pasar a través de una frita, recubriendo esencialmente la superficie del frita con la solución de analito que puede ser ionizado de la superficie de la frita mediante bombardeo de átomos.

Analizadores de Masas

La fragmentación de péptidos mediante disociación inducida por colisión se utiliza en esta invención para identificar etiquetas de proteínas. Se pueden utilizar diversas geometrías de analizadores de masas para fragmentar péptidos y para determinar la masa de los fragmentos.

Análisis de péptidos MS/MS y MS^{n}

Los espectrómetros de masas en tándem permiten seleccionar iones con una razón de masa a carga predeterminada y fragmentarlos mediante disociación inducida por colisión (CID). Los fragmentos pueden ser detectados después proporcionando información estructural acerca del ión seleccionado. Cuando se analizan péptidos mediante CID en un espectrómetro de masas en tándem, se observan patrones de escisión característicos, que permiten determinar la secuencia del péptido que se va a determinar. Los péptidos naturales se fragmentan típicamente al azar en los enlaces amida del esqueleto peptídico para dar una serie de iones que son característicos del péptido. La serie de fragmentos de CID se denominan a_{n}, b_{n}, c_{n}, etc. para la escisión en el enlace peptídico nº cuando la carga del ión es conservada en el fragmento N-terminal del ión. De un modo similar, la serie de fragmentos se denomina x_{n}, y_{n}, z_{n}, etc. cuando la carga es conservada sobre el fragmento C-terminal del ión.

13

La tripsina y la trombina son agentes que favorecen la escisión para la espectrometría de masas en tándem ya que producen péptidos con grupos alcalinos en ambos extremos de la molécula, esto es el grupo alfa amino en el extremo N y las cadenas laterales de lisina o arginina en el extremo C. Esto favorece la formación de iones doblemente cargados, en los cuales los centros cargados están en extremos opuestos de la molécula. Estos iones doblemente cargados producen series de iones tanto C-terminales como N-terminales después de la CID. Esto ayuda a determinar la secuencia del péptido. En general solamente se observan una o dos de las posibles series de iones en los espectros CID de un péptido dado. En las colisiones de baja energía típicas de los aparatos basados en cuadrupolos predominan las series b de los fragmentos N-terminales o las series y de los fragmentos C-terminales. Si se analizan iones doblemente cargados a menudo se detectan ambas series. En general, los iones de las series y predominan sobre las series b.

En general los péptidos se fragmentan por medio de un mecanismo que implica la protonación del esqueleto amídico seguido del ataque nucleofílico intramolecular que conduce a la formación de una estructura de oxazolona de 5 miembros y la escisión del enlace amida que estaba protonado (Schlosser A. y Lehmann W.D. J. Mass Spectrom. 35: 1382-1390, "Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low-energy collision induced dissociation", 2000). La Figura 16a muestra un mecanismo propuesto por medio del cual tiene lugar esta clase de fragmentación. Este mecanismo requiere un grupo carbonilo de un enlace amida adyacente a una amida protonada en el lado N-terminal de la amida protonada para llevar a cabo el ataque nucleofílico. Un ión oxazolonio cargado da lugar a iones de la serie b, mientras la transferencia de protones desde el fragmento N-terminal al fragmento C-terminal da lugar a iones de la serie y como se muestra en la Figura 16a. Este requerimiento de un grupo carbonilo apropiadamente localizado no es responsable de la escisión en los enlaces amida adyacentes al aminoácido N-terminal, cuando el extremo N no está protegido y, en general, no se observan iones de la serie b para la amida entre el extremo N y el segundo aminoácido de un péptido. No obstante, los péptidos con extremos N acetilados satisfacen los requerimientos estructurales de este mecanismo y por medio de este mecanismo la fragmentación puede tener lugar en el enlace amida inmediatamente después del primer aminoácido. Los péptidos con extremos N tioacetilados, como se muestra en la Figura 16c, se escindirán de manera particularmente fácil por medio del mecanismo de la oxazolona ya que el átomo de azufre es más nucleofílico que un átomo de oxígeno en la misma posición. La fragmentación del esqueleto amídico de un péptido también puede ser modulada mediante la metilación del esqueleto. La metilación de un nitrógeno amídico en un péptido puede promover la fragmentación del siguiente enlace amida C-terminal a la amida metilada y asimismo favorece la formación de iones b. La fragmentación intensificada se puede deber parcialmente al efecto donador de electrones del grupo metilo que incrementa el carácter nucleofílico del grupo carbonilo de la amida metilada, a la vez que el aumento de formación de iones b puede ser el resultado de la incapacidad del ión oxazolonio que se forma para transferir protones al fragmento C-terminal como se muestra en la figura 16b. En el contexto de esta invención se puede utilizar la tioacetilación del extremo N de un dipéptido etiqueta para potenciar la escisión del péptido etiqueta en el enlace amida próximo. De un modo similar, la metilación del átomo de nitrógeno de un grupo acetilo o tioacetilo N-terminal también potenciará la escisión del enlace amida adyacente. Las Figuras 17a y 17b ilustra pares de etiquetas que explotan estos métodos de potenciación de la escisión en la conexión amida
marcada.

La facilidad de fragmentación del esqueleto amídico de un polipéptido o péptido también es significativamente modulada por las funcionalidades de las cadenas laterales del péptido. De este modo la secuencia de un péptido determina dónde se fragmentará más fácilmente. En general es difícil predecir qué enlaces amida se fragmentarán fácilmente en una secuencia peptídica. Esto tiene consecuencias importantes para el diseño de las etiquetas de masa peptídicas de esta invención. No obstante, se han realizado ciertas observaciones que permiten diseñar etiquetas de masa peptídicas que se fragmentan en el enlace amida deseado. Por ejemplo, se sabe que la prolina promueve la fragmentación en su enlace amida N-terminal (Schwartz B.L., Bursey M.M., Biol. Mass Spectrom. 21:92, 1997) ya que la fragmentación en la amida C-terminal da lugar a una estructura de oxazolona bicíclica deformada energéticamente desfavorable. El ácido aspártico también promueve la fragmentación en su enlace amida N-terminal. Sin embargo, las conexiones Asp-Pro son particularmente lábiles en el análisis CID de baja energía (Wysocki V.H. et al., J Mass Spectrom. 35(12): 1399-1406, "Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation". 2000) y en esta situación el ácido aspártico parece promover la escisión del enlace amida en su lado C-terminal. De este modo, la prolina, y las conexiones asp-pro también se pueden utilizar en los péptidos etiqueta de esta invención para promover la fragmentación en localizaciones especificadas dentro de un péptido. Las figuras 17c y 17d ilustran pares de etiquetas que explotan estos métodos de potenciación de la escisión en la conexión amida marcada. La figura 17c ilustra un par de etiquetas tripeptídicas con una secuencia alanina-prolina-alanina. La conexión prolina promueve la escisión en su amida N-terminal. Esto está potenciado por la presencia de un grupo protector tioacetilo en el extremo N del tripéptido y la escindibilidad es potenciada adicionalmente por la metilación del nitrógeno N-terminal. La etiquetas tienen la misma masa pero en la primera etiqueta hay un resto alanina con isótopos pesados en la tercera posición del tripéptido mientras en la segunda etiqueta hay un resto alanina con isótopos pesados en la primera posición del tripéptido. La figura 17d ilustra un par de etiquetas tripeptídicas con la secuencia ácido aspártico-prolina-alanina. La conexión prolina promueve la escisión en su amida N-terminal. Esto está potenciado por la presencia del resto ácido aspártico. El extremo N del tripéptido está metilado para promover aquí la protonación localizada. Las etiquetas tienen la misma masa pero en la primera etiqueta hay un resto alanina con isótopos pesados en la tercera posición del tripéptido mientras en la segunda etiqueta hay un resto ácido aspártico con isótopos pesados en la primera posición del tripéptido.

Una geometría del espectrómetro de masas en tándem típica es un cuadrupolo triple que comprende dos analizadores de masa cuadrupolares separados por una cámara de colisión, también un cuadrupolo. Este cuadrupolo de colisión actúa como una guía de iones entre dos cuadrupolos analizadores de masa. Se puede introducir un gas en el cuadrupolo de colisión para permitir la colisión con la corriente de iones del primer analizador de masa. El primer analizador de masa selecciona iones basándose en su razón masa/carga que pasa a través de la celda de colisión donde se fragmentan. Los iones fragmentados se separan y se detectan en el tercer cuadrupolo. La escisión inducida se puede realizar en geometrías distintas de los analizadores en tándem. El espectrómetro de masas con trampa de iones puede promover la fragmentación a través de la introducción de un gas en la propia trampa con el cual colisionarán los iones atrapados. Las trampas de iones contienen generalmente un gas de baño, tal como helio pero la adición de neón, por ejemplo, promueve la fragmentación. De un modo similar la fragmentación inducida por fotones se podría aplicar a iones atrapados. Otra geometría favorable es un aparato en tándem de Tiempo de Vuelo Cuadrupolo/Ortogonal donde la elevada velocidad de barrido de un cuadrupolo se acopla a la mayor sensibilidad de un analizador de masas TOF reflectron para identificar los productos de fragmentación.

Los aparatos de "sector" convencionales son otra geometría común utilizada en la espectrometría de masas en tándem. Un analizador de masa de sector comprende dos "sectores" separados, un sector eléctrico que enfoca un haz de iones dejando una fuente en una corriente de iones con la misma energía cinética utilizando campos eléctricos. El sector magnético separa los iones basándose en su masa para generar un espectro en un detector. Para la espectrometría de masas en tándem se puede utilizar un analizador de masa de dos sectores de esta clase donde el sector eléctrico proporciona la primera fase del analizador de masa, el sector magnético proporciona el segundo analizador de masa, con una celda de colisión situada entre los dos sectores. También se pueden utilizar dos analizadores de masa de sector completo separados por una celda de colisión para el análisis de péptidos de masa etiquetada.

Trampas de Iones

Los analizadores de masas de tipo Trampa de Iones están relacionados con los analizadores de masas de cuadrupolo. La trampa de iones tiene generalmente una construcción de 3 electrodos - un electrodo cilíndrico con electrodos "protegidos terminalmente" en cada extremo formando una cavidad. Se aplica un potencial de frecuencia de radio sinusoidal al electrodo cilíndrico mientras los electrodos protegidos terminalmente se polarizan con potenciales de CC o CA. Los iones inyectados en la cavidad están constreñidos a una trayectoria circular estable por el campo eléctrico oscilante del electrodo cilíndrico. Sin embargo, para una amplitud del potencial oscilatorio dada, ciertos iones tendrán una trayectoria inestable y serán expulsados de la trampa. Una muestra de iones inyectados en la trampa puede ser expulsada sucesivamente de la trampa según su razón masa/carga alterando el potencial de frecuencia de de radio oscilante. Los iones expulsados pueden ser detectados después permitiendo que se produzca un espectro de masas.

Las trampas de iones se hacen funcionar generalmente con una pequeña cantidad de un "gas de baño", tal como helio, presente en la cavidad de la trampa de iones. Esto incrementa tanto la resolución como la sensibilidad del dispositivo ya que los iones que entran en la trampa son esencialmente enfriados a la temperatura ambiente del gas del baño por medio de la colisión con el gas del baño. Las colisiones incrementan la ionización cuando una muestra es introducida en la trampa y moderan la amplitud y la velocidad de las trayectorias de los iones manteniéndolos más próximos del centro de la trampa. Esto significa que cuando cambia el potencial oscilante, los iones cuyas trayectorias se vuelven inestables ganan energía más rápidamente, en relación con los iones circulantes moderados y salen de la trampa en un grupo más apretado dando picos más grandes más estrechos.

Las trampas de iones pueden imitar las geometrías de los espectrómetros de masas en tándem, de hecho pueden imitar las geometrías de los espectrómetros de masas múltiples permitiendo análisis complejos de los iones atrapados. Una especie de masa sencilla de una muestra se puede retener en una trampa, esto es, todas las demás especies se pueden expulsar y después la especie retenida se puede excitar cuidadosamente superponiendo una segunda frecuencia oscilante sobre la primera. Los iones excitados colisionarán después con el gas del baño y se fragmentarán si están suficientemente excitados. Los fragmentos pueden ser analizados después adicionalmente. Es posible retener un ión fragmentado para su análisis convencional expulsando otros iones y excitando después el ión fragmentado. Este procedimiento se puede repetir en tanto exista suficiente muestra para permitir el análisis adicional. Se debe observar que estos aparatos conservan generalmente una elevada proporción de iones fragmentados después de la fragmentación inducida. Estos aparatos y el espectrómetro de masas FTICR (comentado más abajo) representan una forma de espectrometría de masas en tándem resuelta temporalmente en lugar de la espectrometría de masas en tándem resuelta espacialmente que se encuentra en el espectrómetro de masas lineal.

Espectrometría de Masas de Resonancia del Ciclotrón del Ión por Transformada de Fourier (FTICR MS)

La espectrometría de masas FTICR tiene características similares a las trampas de iones ya que una muestra de iones es retenida en una cavidad pero en la FTICR MS los iones son atrapados en una cámara de alto vacío por campos eléctricos y magnéticos cruzados. El campo eléctrico es generado por un par de electrodos de placa que forman dos lados de una caja. La caja está contenida en el campo de un imán superconductor que junto con las dos placas, las placas trampa, restringen los iones inyectados a una trayectoria circular entre las placas trampa, perpendicular al campo magnético aplicado. Los iones se excitan a órbitas más grandes aplicando un pulso de radiofrecuencia a dos "placas transmisoras" que forman dos lados puestos de la caja. El movimiento cicloideo de los iones genera los correspondientes campos eléctricos en los dos lados opuestos restantes de la caja que comprende las "placas receptoras". Los pulsos de excitación excitan los iones a órbitas más grandes que decaen a medida que los movimientos coherentes de los iones se pierden por las colisiones. Las señales correspondientes detectadas por las placas receptoras se convierten en un espectro de masas por análisis de Transformada de Fourier (FT).

Para los experimentos de fragmentación inducida estos aparatos pueden funcionar de una manera similar a una trampa de iones - todos los iones excepto una especie única de interés pueden ser expulsados de la trampa. Se puede introducir un gas de colisión en la trampa y se puede inducir la fragmentación. Los iones fragmentados pueden ser analizados con posterioridad. Los productos de la fragmentación y el gas del baño generalmente se combinan para dar una escasa resolución si se analizan mediante análisis FT las señales detectadas por las "placas receptoras", no obstante los iones fragmentados pueden ser expulsados de la cavidad y analizados en una configuración en tándem con un cuadrupolo, por ejemplo.

Separación de péptidos marcados mediante cromatografía o electroforesis

En la segunda etapa opcional del segundo aspecto de esta invención, las biomoléculas marcadas se someten a separación cromatográfica antes del análisis mediante espectrometría de masas. Esta es preferiblemente una Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) que se puede acoplar directamente a un espectrómetro de masas para el análisis en línea de los péptidos a medida que eluyen de la columna cromatográfica. Se pueden realizar una variedad de técnicas de separación mediante HPLC pero la cromatografía en fase reversa es un método popular para la separación de péptidos antes de la espectrometría de masas. La electroforesis capilar de zona es otro método de separación que se puede acoplar directamente a un espectrómetro de masas para el análisis automático de las muestras en elución. Estas y otras técnicas de fraccionamiento se pueden aplicar para reducir la complejidad de una mezcla de biomoléculas antes del análisis mediante espectrometría de masas.

Aplicaciones de la invención Marcaje de péptidos y polipéptidos y análisis mediante LC-MS-MS

En las realizaciones preferidas del segundo aspecto de esta invención, se utilizan etiquetas para el análisis de mezclas de péptidos mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en modo tándem (LC-MS-MS). El uso de los marcadores de masa de esta invención de acuerdo con los segundos aspectos se comentará ahora en el contexto del análisis de péptidos. Se pueden utilizar etiquetas de masa peptídica tales como las de las figuras 1 y 2 para marcar péptidos. Si la funcionalidad reactiva de estos compuestos es un éster de N-hidroxisuccinimida las etiquetas serán reactivas con los grupos amino libres tales como los grupos alfa amino y los grupos épsilon amino de la lisina.

Tras el anclaje de las etiquetas, los péptidos marcados tendrán una masa que estará desplazada por la masa de la etiqueta. La masa del péptido puede ser suficiente para identificar la proteína de la fuente. En este caso solamente se necesita detectar la etiqueta lo que se puede lograr mediante la verificación de la reacción seleccionada con un cuadrupolo triple, comentado con más detalle más abajo. Brevemente, el primer cuadrupolo del cuadrupolo triple se ajusta para dejar atravesar los iones cuya razón de masa a carga corresponde con la del péptido de interés, ajustado para la masa del marcador. Los iones seleccionados se someten después a disociación inducida por colisión (CID) en el segundo cuadrupolo. En la clase de condiciones utilizadas en el análisis de péptidos los iones se fragmentarán principalmente en los enlaces amida de la molécula. Los marcadores de las figuras 1 y 2 tienen un enlace amida, que libera la porción N-terminal de la etiqueta en la escisión. Aunque las etiquetas tienen todas la misma masa, la porción terminal es diferente debido a las diferencias en los sustituyentes de cualquier lado del enlace amida. De este modo se pueden distinguir los marcadores entre sí. La presencia del fragmento del marcador asociado con un ión de una masa específica debe confirmar que el ión era un péptido y las alturas relativas de los picos de las etiquetas de las diferentes muestras dará información a cerca de las cantidades relativas de los péptidos de sus muestras. Si la masa no es suficiente para identificar un péptido, ya sea porque un número de péptidos terminales de la muestra tienen la misma masa terminal o porque el péptido no es conocido, la información de la secuencia se puede determinar mediante el análisis del espectro CID completo. Los picos de fragmentación de péptidos se pueden utilizar para identificar los péptidos
mientras los picos de la etiqueta de masa proporcionan información a cerca de las cantidades relativas de los péptidos.

Los análisis de proteínas mediante espectrometría de masas en modo tándem, concretamente de las mezclas de péptidos, es complicado por el "ruido" del espectro obtenido. Los péptidos aislados de las muestras biológicas a menudo son contaminados con reactivos tamponadores, desnaturalizantes y detergentes, todos los cuales introducen picos en el espectro de masas. Como resultado, a menudo hay más picos de contaminación en el espectro que picos de péptidos y la identificación de los picos que corresponden a los péptidos es el principal problema, especialmente con muestras pequeñas de proteína que son difíciles de aislar. Como resultado se utilizan diversos métodos para determinar qué picos corresponden a los péptidos antes de realizar el análisis CID detallado. Los aparatos basados en el cuadrupolo triple permiten el "barrido de iones precursores" (véase Wilm M. et al., Anal Chem 68(3):527-33, "Parent ion scans of unseparated peptide mixtures". (1996)). El cuadrupolo triple se hace funcionar en el modo "monitorización de una sola reacción", en el cual el primer cuadrupolo barre el intervalo de masas completo y cada ión entrante se somete a CID en el segundo cuadrupolo. El tercer cuadrupolo se ajusta para detectar solamente el ión fragmentado específico, que es normalmente un ión fragmentado característico de un péptido tal como los iones amonio. La presencia de grupos fosfato también puede ser detectada utilizando esta clase de técnica. Un método alternativo utilizado con el espectrómetro de masas de cuadrupolo/tiempo de vuelo barre los iones cargados doblemente identificando los iones que cuando se someten a CID producen iones hijo con razones de masa a carga más altas que las del ión parental. Un método adicional de identificación de iones doblemente cargados consiste en buscar conjuntos de picos en el espectro que estén solamente a 0,5 daltons con razones de intensidad apropiadas que indicarían que los iones son los mismos difiriendo solamente en la proporción de C^{13} presente en la molécula.

Mediante el marcaje de péptidos con los marcadores de masa de esta invención, se puede concebir una forma novedosa de barrido de iones precursores en la que se identifican los picos del péptido por medio de la presencia de los fragmentos correspondientes a los marcadores de masa de esta invención después de someter los péptidos marcados a CID. En particular, los péptidos aislados de cada muestra mediante los métodos de esta invención se pueden marcar con más de una etiqueta. Se utiliza una mezcla equimolar de una etiqueta de "barrido de iones precursores" en todas las muestras y se puede utilizar una etiqueta específica de la muestra para marcar los péptidos de cada muestra. De este modo los cambios en el nivel de péptidos de las diferentes muestras no tendrán un efecto adverso sobre la identificación de los picos de péptidos en un barrido de iones precursores.

Habiendo identificado y seleccionado un ión peptídico, éste se somete a CID. Los espectros de CID son a menudo bastante complejos y la determinación de qué picos del espectro CID corresponden a una serie de fragmentos peptídicos significativa es un problema adicional en la determinación de la secuencia de un péptido mediante espectrometría de masas. Shevchenko et al., Rapid Commun. Mass Spec. 11 : 1015-1024 (1997) describen un método adicional, que implica tratar las proteínas para el análisis con tripsina en agua O^{16}/O^{18} 1:1. La reacción de hidrólisis da como resultado dos poblaciones de péptidos, la primera cuyo carboxilo terminal contiene O^{16} y la segunda cuyo carboxilo terminal contiene O^{18}. De este modo para cada péptido de la muestra debe haber un doble pico de igual intensidad para cada péptido donde el doble pico está a 2 Daltons. Esto se complica ligeramente por los picos del isótopo peptídico intrínseco pero permite el barrido automatizado del espectro CID en cuanto a los dobletes. Las diferencias en la masa entre los dobletes se pueden determinar para identificar el aminoácido por el que los dos fragmentos difieren. Este método puede ser aplicable con los métodos de esta invención si se aíslan los péptidos N-terminales.

Perfilado de la Expresión de la Proteína

Para comprender los cambios en un tejido canceroso, por ejemplo, se requiere comprender todos los cambios moleculares en ese tejido, relacionando idealmente estos cambios con el tejido normal. Para determinar todos los cambios moleculares se requiere la capacidad de medir los cambios en la expresión génica, la expresión de proteínas y por último los cambios en los metabolitos. Es posible comparar la expresión, entre muestras de tejidos diferentes, de grandes números de genes simultáneamente a nivel de ARN mensajero (ARNm) utilizando la tecnología de micromatrices (véase por ejemplo Iyer V.R. et al., Science 283(5398):83-87, "The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum". 1999), no obstante los niveles de ARNm no se corresponden directamente con los niveles de proteína en un tejido. Para determinar el perfil de expresión de una proteína para un tejido, se utiliza ampliamente la electroforesis en gel bidimensional. Desafortunadamente, esta técnica es extremadamente laboriosa y es difícil comparar dos o más muestras simultáneamente en un gel 2-D debido a la dificultad de lograr la reproducibilidad. Como se ha mencionado antes se pueden analizar eficazmente péptidos utilizando los métodos de esta invención.

Las etiquetas de esta invención permiten identificar el mismo péptido de diferentes muestras utilizando la LC-MS-MS. Además, se pueden determinar cantidades relativas del mismo péptido en diferentes muestras. La capacidad para determinar rápida y sensiblemente la identidad y las cantidades relativas de péptidos en un número de muestras permite el perfilado de la expresión. Por lo tanto un objeto de esta invención es proporcionar métodos mejorados para el análisis comparativo de muestras de proteína complejas basados en el aislamiento y marcaje selectivo de los péptidos. Se comentan dos enfoques publicados para el análisis global de la expresión de proteínas y también se describen más abajo diversos métodos para el análisis de estados concretos de las proteínas, tales como la fosforilación y la modificación con carbohidratos.

Aislamiento del péptido terminal para el perfilado de la expresión global de la proteína

El aislamiento de los péptidos N o C terminales ha sido descrito como un método para determinar un perfil de expresión global de una muestra de proteína. El aislamiento de los péptidos terminales asegura que al menos un péptido y sólo uno por proteína es aislado asegurando de este modo que la complejidad de la muestra que es analizada no tiene más componentes que la muestra original. La reducción de polipéptidos grandes a péptidos más cortos hace la muestra más susceptible de análisis mediante espectrometría de masas la muestra. Los métodos para aislar péptidos a partir de los extremos de los polipéptidos se comentan en las publicaciones PCT/GB98/00201, PCT/GB99/03258.

Aislamiento de péptidos que contienen cisteína

Como se ha comentado antes, Gygi et al. (Nature Biotechnology 17: 994 - 999 1999) describen el uso de "etiquetas de afinidad codificadas con isótopos" para la captura de péptidos de proteínas, para permitir el análisis de la expresión de la proteína. Los autores informan de que una gran proporción de proteínas (>90%) de la levadura tienen al menos un resto cisteína (de media hay \sim5 restos cisteína por proteína). La reducción de enlaces disulfuro en una muestra de proteína y la protección terminal de los tioles libres con yodoacetamidilbiotina da como resultado el marcaje de todos los restos cisteína. Las proteínas marcadas son digeridas después, por ejemplo con tripsina, y los péptidos con las cisteínas marcadas pueden ser aislados utilizando cuentas con avidina. Estos péptidos capturados pueden ser analizados después mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en modo tándem (LC-MS/MS) para determinar un perfil de expresión para la muestra de proteína. Se pueden comparar dos muestras de proteína marcando los restos cisteína con una etiqueta de biotina modificada isotópicamente. Este enfoque es ligeramente más redundante que el enfoque basado en el aislamiento de los péptidos terminales ya que, como media, se aísla más de un péptido por proteína de manera que hay más especies de péptidos en la muestra que especies de proteína. Este incremento en la complejidad se vuelve peor por la naturaleza de las etiquetas utilizadas por Gygi et al.

Como se ha comentado antes las etiquetas de afinidad descritas por Gygi et al. tienen algunas desventajas. El marcaje de cada muestra con una variante isotópica diferente de la etiqueta de afinidad da como resultado un pico adicional en el espectro de masas para cada péptido de cada muestra. Esto significa que si se analizan dos muestras juntas habrá el doble de picos en el espectro. De un modo similar, si se analizan tres muestras juntas, el espectro será tres veces más complejo que para una muestra sola. Una limitación adicional, que es referida por los autores de la publicación anterior, es el cambio de movilidad causado por las etiquetas. Los autores informan de que los péptidos marcados con una etiqueta de biotina deuterada eluyen ligeramente después que el mismo péptido marcado con una etiqueta no deuterada. Esto significa que el análisis comparativo de múltiples muestras será muy difícil utilizando los métodos de Gygi et al. debido a la complejidad de los espectros de masas y la complejidad de las etapas cromatográficas si se analizan más de 2 muestras.

Se concibe un método mejorado para analizar muestras de proteína mediante el marcaje de restos cisteína utilizando etiquetas de la forma mostrada en la Figura 8. Esta Figura ilustra un par de etiquetas de afinidad mejoradas derivadas de metionina. Se utilizarían formas sustituidas isotópicamente diferentes de metionina para preparar las dos etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las dos etiquetas es la misma pero la metionina N-terminal de cada etiqueta difiere de la otra etiqueta en tres Daltons. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido con guanidina añadida para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido del producto de fragmentación del segundo resto metionina y los restos metionina naturales de la proteína y para promover la protonación en esta posición en la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas. Además estas etiquetas comprenden una funcionalidad maleimida reactiva con tiol.

En una realización del segundo aspecto de esta invención, un protocolo para el análisis de una muestra de proteína que contiene polipéptidos con restos cisteína comprende las etapas de:

1.

Reducir y hacer reaccionar todos los restos cisteína de al menos una muestra de proteína con una etiqueta de masa de ligando por afinidad de maleimida,

2.

Escindir los polipéptidos con una endoproteasa específica de la secuencia;

3.

Capturar los péptidos etiquetados sobre un soporte sólido transformado con avidina; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados capturados mediante LC-MS-MS.

Las muestras de proteína pueden ser digeridas con la endoproteasa específica de la secuencia antes o después de la reacción de la muestra con la etiqueta de masa del ligando de afinidad.

Aislamiento de proteínas modificadas con carbohidratos

Los carbohidratos están presentes a menudo como modificación post-traduccional de las proteínas.

Se conocen diversas técnicas de cromatografía por afinidad para el aislamiento de estas clases de proteínas (Para una revisión véase Gerard C., Methods Enzymol. 182: 529-539, "Purification of glycoproteins". 1990). Se conocen una variedad de receptores de proteínas naturales para los carbohidratos. Los miembros de esta clase de receptores, conocidos como lectinas, son altamente selectivos para las funcionalidades de los carbohidratos concretos. Se pueden utilizar columnas de afinidad transformadas con lectinas específicas para aislar proteínas con modificaciones de carbohidratos concretos, a la vez que se podrían utilizar columnas de afinidad que comprenden una variedad de lectinas diferentes para aislar poblaciones de proteínas con una variedad de modificaciones de carbohidratos diferentes. En una realización del segundo aspecto de esta invención, un protocolo para el análisis de una muestra de proteínas, que contiene proteínas modificadas con carbohidratos, comprende las etapas de:

1.

Tratar la muestra con un reactivo de escisión específico de la secuencia tal como Tripsina y Lys-C;

2.

Hacer pasar la muestra de proteína a través de columnas de afinidad que contienen lectinas o derivados de ácido borónico para aislar solamente los péptidos modificados con carbohidratos;

3.

Marcar los péptidos modificados con azúcar capturados en el grupo alfa amino generado por la escisión específica de la secuencia, utilizando las etiquetas de masa peptídicas de esta invención; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados mediante LC-MS-MS.

Se podría utilizar una etiqueta de N-hidroxisuccinimida activada para marcar los grupos alfa amino libres. Si se utiliza Lys-C después cada péptido modificado con carbohidrato tendrá un grupo épsilon amino libre así como un grupo alfa amino libre, ambos los cuales pueden estar etiquetados.

Muchos carbohidratos tienen presentes grupos diol próximos, esto es grupos hidroxilo presentes en átomos de carbono adyacentes. Los carbohidratos que contienen diol que contienen dioles próximos en una configuración 1,2-cis-diol reaccionarán con derivados de ácido borónico para formar ésteres cíclicos. Esta reacción es favorecida por un pH alcalino pero es fácilmente revertida a pH ácido. Los derivados de ácido fenilborónico inmovilizados en la resina se han utilizado como ligandos para la captura por afinidad de proteínas con carbohidratos que contienen diol en cis. En una realización del cuarto aspecto de esta invención se puede sintetizar un conjunto de etiquetas de masa peptídica con ligandos de afinidad que comprenden biotina unido a una entidad de ácido fenilborónico, como se muestra en la Figura 6b. Estas etiquetas de ácido borónico se podrían utilizar para marcar dos muestras separadas que comprenden péptidos o proteínas con modificaciones de carbohidratos que contienen dioles en cis próximos. En otra realización del segundo aspecto de esta invención, un protocolo para el análisis de una muestra de proteína que contiene polipéptidos modificados con carbohidratos comprende las etapas de:

1.

Hacer reaccionar al menos una muestra de proteína a pH alcalino con una etiqueta de masa con ligando de afinidad de ácido borónico,

2.

Escindir los polipéptidos con una endoproteasa específica de la secuencia,

3.

Capturar péptidos etiquetados sobre un soporte sólido transformado con avidina; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados capturados mediante LC-MS-MS.

La muestra puede ser digerida con la endoproteasa específica de la secuencia antes o después de la reacción de la muestra con la etiqueta de masa con ligando de afinidad.

Los dioles próximos, en los ácidos siálicos por ejemplo, también se pueden convertir en grupos carbonilo mediante escisión oxidativa con peryodato. La oxidación enzimática de azúcares que contienen galactosa o galactosamina terminal con galactosa oxidasa también puede convertir los grupos hidroxilo de estos azúcares en grupos carbonilo. Los carbohidratos complejos también se pueden tratar con enzimas de escisión de carbohidratos, tales como neuraminidasa, que separa selectivamente las modificaciones de los azúcares dejando detrás los azúcares, que pueden ser oxidados. Estos grupos carbonilo pueden ser etiquetados permitiendo que las proteínas porten tales modificaciones para ser detectadas o aisladas. Los reactivos de hidrazida, tales como la hidrazida Biocytin (Pierce & Warriner Ltd, Chester, UK) reaccionarán con los grupos carbonilo de las especies de carbohidratos que contienen carbonilo (E.A. Bayer et al., Anal. Biochem. 170: 271 - 281, "Biocytin hydrazide - a selective label for sialic acids, galactose, and other sugars in glycoconjugates using avidin biotin technology", 1988). Alternativamente, se puede etiquetar un grupo carbonilo con una biotina modificada con amina, tal como Biocytin y EZ-Link^{TM} PEO-Biotin (Pierce & Warriner Ltd, Chester, UK), utilizando la alquilación reductiva (Means G.E., Methods Enzymol 47: 469-478, "Reductive alkylation of amino groups". 1977; Rayment I., Methods Enzymol 276: 171-179, "Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins". 1997). Las proteínas que portan modificaciones de carbohidratos que contienen dioles próximos en una mezcla compleja pueden ser biotiniladas de este modo. Las proteínas biotiniladas, modificadas por tanto con carbohidratos, se pueden aislar después utilizando un soporte sólido con avidina
añadida.

Un conjunto de etiquetas de masa peptídicas de acuerdo con esta invención se puede sintetizar para el análisis de péptidos modificados con carbohidratos que han sido oxidados con peryodato, como se muestra en la Figura 6a. La Figura 6a muestra un conjunto de seis etiquetas derivadas de metionina. Las diferentes formas de metionina sustituidas isotópicamente se utilizarían para preparar las dos etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las dos etiquetas es la misma pero la metionina N-terminal de cada etiqueta difiere de la otra etiqueta en tres Daltons. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica se ha sometido a guanidinación para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido del producto de fragmentación del segundo resto metionina y promover la protonación en esta posición en la etiqueta durante la ionización en el espectrómetro de masas. Una realización adicional del segundo aspecto de esta invención comprende las etapas de:

1.

Tratar una muestra de polipéptidos con peryodato, de manera que los carbohidratos con dioles cis próximos de los glicopéptidos ganarán una funcionalidad carbonilo;

2.

Marcar esta funcionalidad con una etiqueta de masa peptídica activada con hidrazida unida a biotina, como se muestra en la Figura 6a;

3.

Digerir la muestra de proteína con una endoproteasa específica de la secuencia;

4.

Capturar los péptidos etiquetados sobre un soporte sólido transformado con avidina; y

5.

Analizar los péptidos biotiniliados mediante LC-MS-MS.

La muestra de proteína puede ser digerida con la endoproteasa específica de la secuencia antes o después de la reacción de la muestra con la etiqueta de masa con el ligando de afinidad.

Aislamiento de Fosfopéptidos

La fosforilación es una modificación post-traduccional reversible ubicua que aparece en la mayoría de las rutas de señalización de casi todos los organismos ya que la fosforilación es ampliamente utilizada como señal transitoria para mediar los cambios en el estado de las proteínas individuales. Es un área importante de búsqueda y las herramientas que permiten el análisis de la dinámica de la fosforilación son esenciales para una completa comprensión de cómo responden las células anfitrionas a los estímulos, lo que incluye las respuestas de las células a los fármacos.

Las técnicas para el análisis de péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina son bien conocidas. Una clase de tales métodos se basa en una reacción bien conocida para la beta-eliminación de fosfatos. Esta reacción da como resultado fosfoserina y fosfotreonina que forman deshidroalanina y metildeshidroalanina, ambas las cuales son aceptores de Michael y reaccionarán con los tioles. Esto se ha utilizado para introducir grupos hidrófobos para la cromatografía de afinidad (Véase por ejemplo Holmes C.F., FEBS Lett 215(1): 21-24, "A new method for the selective isolation of phosphoserine-containing peptides". 1987). Los enlazadores de ditiol también han sido utilizados para introducir fluoresceína y biotina en péptidos que contienen fosfoserina y fosfotreonina (Fadden P, Haystead TA, Anal Biochem 225(1): 81-8, "Quantitative and selective fluorophore labelling of phosphoserine on peptides and proteins: characterization at the attomole level by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence". 1995; Yoshida O. et al., Nature Biotech 19: 379 - 382, "Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome", 2001). El método de Yoshida et al. para el enriquecimiento de afinidad de proteínas fosforiladas en serina y treonina se podría mejorar utilizando la etiqueta de maleimida mostrada en la figura 8 para permitir la comparación de múltiples muestras. Esto resultaría particularmente útil para el análisis de la dinámica de las cascadas de
fosforilación.

Un péptido etiqueta de la forma mostrada en la figura 7 permitiría el marcaje directo de los restos fosfotreonina y fosfoserina eliminados en beta sin un enlazador de ditiol. El tetrapéptido etiqueta de la figura 7 está transformado con metionina. Las diferentes formas de metionina isotópicamente sustituidas se utilizarían para preparar las dos etiquetas diferentes. La masa total de cada una de las dos etiquetas es la misma pero la metionina N-terminal de cada etiqueta difiere de la otra etiqueta en tres Daltons. El grupo alfa amino de la etiqueta dipeptídica ha sido sometido a guanidinación para diferenciar el producto de fragmentación de este aminoácido del producto de fragmentación del segundo resto metionina y los restos metionina naturales de las proteínas y para promover la protonación en esta posición en la etiqueta durante la ionización en un espectrómetro de masas. El péptido etiquetado es sometido a guanidinación en el extremo N para proporcionar un aumento de la sensibilidad y para distinguir el resto N-terminal del resto C-terminal. El resto cisteína proporciona un tiol libre, que puede atacar nucleofílicamente la deshidroalanina y la metildeshidroalanina. Se conoce un protocolo mejorado para la eliminación en beta basado en el procedimiento de marcaje. Este procedimiento mejorado implica el análisis con bario (Byford M.F., Biochem J. 280: 261-261, "Rapid and selective modification of phosphoserine residues catalysed by Ba2+ ions for their detection during peptide microsequencing" 1991). Esta catálisis hace la reacción 20 veces más rápida reduciendo las reacciones secundarias a niveles indetectables. El péptido etiqueta mostrado en la figura 7 se podría acoplar fácilmente a la deshidroalanina o metildeshidroalanina generada a partir de la eliminación en beta de fosfatos utilizando la catálisis con bario. De este modo en una realización adicional del segundo aspecto de esta invención, se pueden analizar los péptidos fosforilados en serina y treonina en un método que comprende las etapas de:

1.

Tratar una muestra de polipéptidos con hidróxido de bario para eliminar en beta los grupos fosfato de fosfoserina y fosfotreoinina;

2.

Marcar las funcionalidades deshidroalanina o metildeshidroalanina resultantes con etiquetas de masa peptídicas activadas con tiol unidas a biotina, como se muestra en la Figura 7;

3.

Digerir la muestra de proteína con una endoproteasa específica de la secuencia,

4.

Capturar los péptidos etiquetados sobre un soporte sólido derivado de avidina; y

5.

Analizar los péptidos biotinilados mediante LC-MS-MS.

La muestra de proteína puede ser digerida con la endoproteasa específica de la secuencia antes o después de la reacción de la muestra con la etiqueta de masa con el ligando de afinidad.

Numerosos grupos de investigación han informado sobre la producción de anticuerpos, que se unen a restos fosfotirosina en una amplia variedad de proteínas. (véase por ejemplo A.R. Frackelton et al., Methods Enzymol 201: 79-92, "Generation of monoclonal antibodies against phosphotyrosine and their use for affinity purification of phosphotyrosine-containing proteins", 1991 y otros artículos sobre esta cuestión de Methods Enzymol.). Esto significa que una proporción significativa de proteínas que han sido modificadas post-traduccionalmente mediante fosforilación de la tirosina pueden ser aisladas mediante cromatografía de afinidad utilizando estos anticuerpos como ligando de la columna de afinidad.

Se pueden utilizar estos anticuerpos de unión a fosfotirosina en el contexto de esta invención para aislar péptidos de proteínas que contienen restos fosfotirosina. Las proteínas fosforiladas en tirosina en una mezcla compleja se pueden aislar utilizando columnas de afinidad con anticuerpos anti-fosfotirosina. En una realización adicional del segundo aspecto de esta invención, un protocolo para el análisis de una muestra de proteínas, que contiene proteínas fosforiladas en la tirosina, comprende las etapas de:

1.

Tratar la muestra con un reactivo de escisión específico de la secuencia tal como Tripsina o Lys-C;

2.

Hacer pasar la muestra de proteína a través de columnas de afinidad que contienen anticuerpos anti-fosfotirosina para aislar solamente los péptidos modificados con fosfotirosina;

3.

Marcar los fosfopéptidos capturados en el grupo alfa amino libre generado mediante escisión específica de la secuencia, utilizando las etiquetas de masa peptídicas de esta invención; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados mediante LC-MS-MS.

Se podría utilizar una etiqueta activada con N-hidroxisuccinimida para marcar los grupos alfa amino libres.

La Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados (IMAC) representa una técnica adicional para el aislamiento de fosfoproteínas y fosfopéptidos. Los fosfatos se adhieren a resinas que comprenden iones metálicos trivalentes concretamente a iones Galio (III) (Posewitch, M.C. y Tempst, P., Anal. Chem., 71: 2883-2892, "Immobilized Gallium (III) Affinity Chromatography of Phosphopeptides", 1999). Esta técnica es ventajosa ya que puede aislar péptidos y proteínas fosforilados en serina/treonina y fosforilados en tirosina simultáneamente.

La IMAC también se puede utilizar por lo tanto en el contexto de esta invención para el análisis de muestras de proteínas fosforiladas. En una realización adicional del segundo aspecto de esta invención, un protocolo para el análisis de una muestra de proteínas, que contiene proteínas fosforiladas, comprende las etapas de:

1.

Tratar la muestra con un reactivo de escisión específico de la secuencia tal como Tripsina o Lys-C;

2.

Hacer pasar la muestra de proteína a través de una columna de afinidad que comprende iones metálicos inmovilizados para aislar solamente péptidos fosforilados;

3.

Marcar los fosfopéptidos capturados en el grupo alfa amino libre generado por la escisión específica de la secuencia, utilizando las etiquetas de masa peptídicas de esta invención; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados mediante LC-MS-MS.

Una etiqueta activada con N-hidroxisuccinimida se podría utilizar para marcar los grupos alfa amino libres.

En una realización alternativa del segundo aspecto de esta invención, se puede analizar una muestra de proteínas fosforiladas aislando las proteínas fosforiladas seguido de análisis de los péptidos N o C terminales de las fosfoproteínas. Las técnicas para el aislamiento de péptidos terminales se describen en numerosas solicitudes de patente, p. ej. la publicación WO98/32876, la publicación WO 00/20870 y EP 01304975.4. Un protocolo para el análisis de una muestra de proteínas, que contiene proteínas fosforiladas, comprendería las etapas de:

1.

Hacer pasar la muestra de proteína a través de una columna de afinidad que comprende iones metálicos inmovilizados para aislar solamente proteínas fosforiladas;

2.

Aislar péptidos C y/o N terminales de las proteínas fosforiladas capturadas;

3.

Marcar los péptidos terminales capturados, utilizando las etiquetas de masa peptídicas de esta invención; y

4.

Analizar los péptidos etiquetados mediante LC-MS-MS.

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Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de X-Metd^{3}-Met-Gly-OH (A) y de X-Met-Metd^{3}-Gly-OH (B)

Se sintetizaron un par de péptidos utilizando técnicas de síntesis automatizada convencionales para ilustrar las características de esta invención (partiendo ambas de resina Fmoc-Gly-Trt-PS disponible en el marcado de Rapp Polymere, Alemania). Los dos péptidos A y B se muestran en la Figura 10 y serán referidos como los dos péptidos Met-Met-Gly (D3).

La metionina deuterada (Metd^{3}) es asequible de ISOTEC Inc, Miamisburg, Ohio, USA. El reactivo Fmoc para su uso en un sintetizador peptídico debe ser sintetizado, sin embargo manualmente a partir de metionina deuterada no protegida.

Síntesis de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)-L-metionina-metil-d3 (Fmoc-Metd^{3})

La síntesis de Fmoc-Metd^{3} (mostrada en la Figura 9a) se llevó a cabo en dos etapas.

1. Síntesis de Carbonato de 9-fluorenilmetil-pentafluorfenilo

Se añadieron 8,4 mL (60 mmoles) de trietilamina a 0ºC a una mezcla de 11 g (60 mmoles) de Pentafluorofenol y 15,5g (60 mmoles) de éster (9-fluorenilmetílico) de ácido clorofórmico en 100 mL de éter seco. Después de 2 horas de reacción, se vertieron 20 ml de agua fría en la solución. La capa orgánica se lavó dos veces con agua, se secó. Tras la evaporación del disolvente, el producto obtenido se cristalizó en heptano. Rendimiento: 16,4 g (67%)

2. Síntesis de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)-L-metionina-metil-d3

Se suspendieron 2,2 g (14,5 mmoles) de L-metionina-metil-d3 (Metd^{3}) en 50 ml de acetona. Se añadieron 2,5 g (29 mmoles) de hidrogenocarbonato de sodio y 60 mL de agua y después 5,7 g (14 mmoles) de Carbonato de 9-fluorenilmetil-pentafluorofenilo a la suspensión agitada. Después de 48 horas de reacción, el pH de la solución clara se alteró a pH 3 y la capa orgánica se extrajo con acetato de etilo. Después de secar la capa orgánica, se evaporó el acetato de etilo y el producto se precipitó mediante la adición de heptano. Ese procedimiento (dilución con acetato de etilo y precipitación con hexano) se repitió dos veces antes de obtener el producto puro, Fmoc-Metd^{3}. (Rendimiento: 5,0 g (92%); Pf: 126-128ºC; [a]_{D}^{20}= - 30º, c=1, DMF)

Las secuencias de reacción del sintetizador peptídico para la preparación de los dos péptidos mostrados en la Figura 10 se enumeran más abajo.

Secuencia Peptídica (A)

\bullet

Aumento de volumen de 50 mg de resina Fmoc-Gly-Trt-PS durante 5 min en 2 ml de dimetilformamida (DMF);

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo los protocolos normalizados;

\bullet

Disolución de 49 mg (0,32 mmoles) de 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) en 800 \mul de DMF;

\bullet

Adición de 120 mg (0,32 mmoles) de Fmoc-Met a la solución de HOBt; esta solución se añadió a la resina y se incubó durante 3 min;

\bullet

Después se añadieron 50 \mul (0,32 mmoles) de diisopropilcarbodiimida (DIC); tiempo de acoplamiento (aminoácido activado 0,4M)

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo protocolos normalizados.

\bullet

Disolución de 49 mg (0,32 mmoles) de HOBt en 800 \mul de DMF;

\bullet

Adición a 120 mg (0,32 mmoles) de Fmoc-Metd^{3}; esta solución se añadió a la resina y se incubó durante 3 min;

\bullet

Después se añadieron 50 \mul (0,32 mmoles) de DIC; tiempo de acoplamiento (aminoácido activado 0,4M)

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo los protocolos normalizados;

\bullet

Se disolvieron 150 mg (0,32 mmoles) de "Boc_{2}X-OSu" en 800 \mul de DMF y esta solución se añadió a la resina;

\bullet

Después se añadieron 53 \mul of Diisopropiletilamina (DIPEA) a la resina, y se dejó que el acoplamiento prosiguiere durante 3 horas (especies activadas 0,4M);

\bullet

Después de lavar la resina se escindió la sustancia deseada de la resina con 1 ml de TFA que contenía H_{2}O al 2,5%, Et_{3}SiH y tioanisol cada uno en 1 hora;

\bullet

Adición de 30 ml de agua a la solución de TFA tras la filtración, eliminando todo el disolvente mediante liofilización.

Se produjo un polvo de color blanco de secuencia peptídica (A).

Secuencia Peptídica (B)

\bullet

Aumento de volumen de 50 mg de resina 5 min en 2 ml de DMF;

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo protocolos normalizados;

\bullet

Disolución de 49 mg (0,32 mmoles) de HOBt en 800 \mul de DMF;

\bullet

Adición a 120 mg (0,32 mmoles) de Fmoc-Metd^{3}; esta solución se añadió a la resina y se incubó durante 3 min;

\bullet

Se añadieron 50 \mul (0,32 mmoles) de DIC; tiempo de acoplamiento (aminoácido activado 0,4M)

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo los protocolos normalizados;

\bullet

Disolución de 49 mg (0,32 mmoles) de HOBt en 800 \mul de DMF;

\bullet

Adición a 120 mg (0,32 mmoles) de Fmoc-Met; esta solución se añadió a la resina y se incubó durante 3 min;

\bullet

Se añadieron 50 \mul (0,32 mmoles) de DIC; tiempo de acoplamiento (aminoácido activado 0,4M)

\bullet

Eliminación del grupo Fmoc con piperidina en DMF siguiendo protocolos normalizados;

\bullet

Se disolvieron 150 mg (0,32 mmoles) de "Boc_{2}X-OSu" en 800 \mul de DMF y esta solución se añadió a la resina;

\bullet

Se añadieron 53 \mul de DIPEA, tiempo de acoplamiento 3 h (especie activada 0,4M)

\bullet

Después de lavar la resina se escindió la sustancia deseada de la resina con 1 ml de TFA que contenía H_{2}O al 2,5%, Et_{3}SiH y tioanisol cada uno en 1 h;

\bullet

Adición de 30 ml de agua a la solución de TFA después de la filtración, y eliminación de todo el disolvente mediante liofilización.

Se produjo un polvo de color amarillo claro de la secuencia peptídica (B).

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HPLC

Después de la escisión, se obtuvo un producto puro aproximadamente en un 80% para cada péptido. Los productos se purificaron después mediante HPCL.

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MS

La identidad de los péptidos A y B se confirmó mediante espectrometría de masas. Se observó una razón de masa a carga de 496 como pico principal en los espectros de masa tanto MALDI como ESI para ambos productos, lo que se ajusta a la masa calculada de ambos péptidos. En la Figura 11 se muestra un espectro de masas del análisis de una mezcla de los péptidos A y B mediante espectrometría de masas ESI. Se puede observar que los dos péptidos tienen espectros de masas que se solapan casi exactamente, que es lo esperado.

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MS/MS

La Figura 13 muestra el mecanismo de fragmentación propuesto para los productos de la disociación inducida por colisión de los péptidos modelo A y B mostrados en la figura 10. La Figura 12 muestra un par de espectros ESI MS/MS generados mediante un espectrómetro de masas con trampa de iones LCQ de Finnigan MAT. Los espectros ESI MS/MS muestran los productos de fragmentación de los péptidos A y B. El ión fragmento b2 deseado (véase la Figura 10) tiene una gran intensidad para ambas sustancias (273 después de la pérdida de amoníaco para A y 270 después de la pérdida de amoníaco para B). La figura 14 muestra un espectro ESI-MS/MS de los productos de fragmentación del análisis de una mezcla de péptidos A y B. A y B estaban presentes en la mezcla a una razón de 70:30 respectivamente. Esta razón se puede observar en las intensidades de los picos del ión fragmento b2 a m/z 273 y 270 para los péptidos A y B respectivamente. Este espectro muestra que las etiquetas pueden revelar la razón de sus péptidos asociados cuando se comparan pares de muestras. La figura 15 muestra una curva de regresión lineal para una serie de experimentos ESI-MS/MS con los péptidos A y B. El gráfico muestra un cuadro de la razón de A a B en la mezcla frente a las intensidades observadas de los iones fragmento b2 a partir del análisis ESI-MS/MS de las mezclas. El gráfico muestra que hay una buena correspondencia entre las razones esperadas y observadas.

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Ejemplo 2 Ácido 6-[bis(terc-butil-oxicarbonil)-guanidino]-hexanoico-Ester de N-hidroxisuccinimida

La síntesis del enlazador de éster activo de guanidino mostrado en la Figura 9b se llevó a cabo en las 3 fases mostradas más abajo.

1. Síntesis de ácido amino-iminometanosulfónico

Se añadieron 50 ml de anhídrido acético y 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado a 45 g (397 mmoles) de peróxido de hidrógeno acuoso al 30% enfriando con hielo. Después de 30 minutos, se añadieron 100 ml (1157 mmoles) de anhídrido acético a la solución a 10-12ºC una vez más. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y alcanzó la temperatura ambiente en ese momento. Después de añadir 150 ml de metanol, la solución compuesta de 10 g (131 mmoles) de tiourea en 500 ml de metanol se vertió gota a gota lentamente en la reacción a 15-20ºC. La reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 48 horas. Después de la filtración, la solución se condensó hasta 60 ml. El producto obtenido se filtró y se lavó con etanol y se purificó mediante cristalización en ácido acético (aprox. 1 litro). Rendimiento: 6,0 g (37%).

2. Síntesis de ácido 6-guanidinohexanoico

Se disolvieron 6,5 g (50 mmoles) de ácido 6-aminohexanoico y 6,9 g (50 mmoles) de carbonato de sodio en 50 ml de agua. Se añadieron 6,2 g (50 mmoles) de ácido amino-iminometanosulfónico con agitación a la solución. Después de 20 horas, el producto se filtró y se lavó con ácido acético, metanol y después éter. Rendimiento: 6,6 g (76%).

3. Síntesis de Ácido 6-[bis (terc-butiloxicarbonil) guanidino]hexanoico-Ester de-N-hidroxisuccinimida

Se agitaron 9,5 g (55 mmoles) de ácido 6-guanidinohexanoico y 55 g (270 mmoles) de N,O-Bis-trimetilsililacetamida en 100 ml de diclorometano y se calentaron a reflujo hasta que se obtuvo una solución clara (la reacción se dejó durante aproximadamente 10 horas). Se añadieron 46 g (210 mmoles) de pirocarbonato de di-t-butilo a la solución a la temperatura ambiente y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3 horas después de haber sido agitada a la temperatura ambiente durante 18 horas (durante la noche). La solución se enfrió después a la temperatura ambiente y se lavó con una solución de ácido cítrico al 10% y una solución de cloruro de sodio. Tras la evaporación del disolvente, el pirocarbonato se destiló a 80-90ºC a vacío. El líquido viscoso obtenido (30 g) se disolvió en 100 ml de diclorometano con 8,6 g (75 mmoles) de N-hidroxisuccinimida. Se añadieron 15,5 g (75 mmoles) de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en porciones a la mezcla de reacción con agitación a la temperatura ambiente. Al cabo de 17 horas, la urea se separó por filtración. La solución se lavó con una solución de ácido cítrico al 10% y después de separar el disolvente, el producto se purificó mediante cromatografía (gel de sílice, disolvente: diclorometano/acetato de etilo). El producto se cristalizó después en éter diisopropílico. Rendimiento: 6,0 g (19%). Rf: 0,77 (diclorometano/acetato de etilo : 3/1). Pf: 108-109ºC.

Ejemplo 3 Protocolos Experimentales

Se muestran dos pares de reactivos TMT en las Figuras 18a y 18b. Los reactivos son etiquetas peptídicas de acuerdo con esta invención que comprenden un aminoácido "etiqueta" unido a un grupo de sensibilización ([1], [2], [3]), que es una funcionalidad guanidino, un aminoácido de "normalización de masas" y en el segundo par de etiquetas, un grupo de potenciación de la escisión, que es prolina en este caso ([4]). Estas etiquetas son diseñadas de manera que en el análisis mediante disociación inducida por colisión (CID), el fragmento de la etiqueta es liberado para dar lugar a un ión con una proporción de masa a carga específica. El modelo de escisión del péptido aceptado en la actualidad durante la CID requiere la protonación del esqueleto peptídico seguido del ataque nucleofílico del radical carbonilo de la amida protonada por el siguiente resto carbonilo N-terminal de la cadena peptídica para formar una oxazolona relativamente estable conduciendo a una escisión del enlace amida ([5]). El potenciador de la sensibilización está unido al resto metionina N-terminal por un enlace amida pero la escisión no tiene lugar en esta amida ya que no hay una amida correctamente situada para permitir la ciclación y escisión en esta posición de manera que la escisión solamente tiene lugar entre los dos restos metionina. Esto significa que la metionina N-terminal se distingue de la segunda metionina por la masa del grupo de sensibilización guanidino. De este modo cada par de etiquetas permite distinguir un par de péptidos mediante análisis MS/MS. Cada etiqueta también puede portar una funcionalidad reactiva. En la figura, la funcionalidad reactiva, R, no está especificada pero podría ser un éster de N-hidroxisuccinimida, lo que permite el marcaje específico de los grupos amino. Claramente esta funcionalidad reactiva se puede variar fácilmente para permitir el marcaje de diferentes nucleófilos biológicos. Además, el diseño de la etiqueta se puede modificar claramente para acomodar un ligando de afinidad tal como biotina. Además, debe estar claro que se pueden generar más de dos etiquetas permitiendo la comparación de muestras adicionales o la introducción de patrones marcados.

En los siguientes ejemplos, se han sintetizado péptidos, enumerados en la Tabla 7, como si hubieran sido marcados completamente en el grupo alfa amino con las etiquetas anteriores, esto es, la etiqueta fue "pre-incorporada" durante la síntesis para someter a ensayo el funcionamiento de las etiquetas independientemente de las reacciones de marcaje, de manera que en los siguientes ejemplos el grupo "R" mostrado en la Figura 18a y 18b es la secuencia peptídica a la cual está anclada la etiqueta. Los derivados etiquetados fueron analizados mediante ESI-MS/MS y LC-ESI-MS/MS.

Las Figuras 18a y 18b muestran las estructuras de dos versiones de los marcadores TMT. Las etiquetas son etiquetas modulares que comprenden componentes funcionales diferentes que corresponden a componentes sintéticos individuales en la síntesis automatizada de estos reactivos. Cada etiqueta comprende un grupo de sensibilización y un grupo de masa diferenciado que comprenden juntos el "fragmento etiqueta" que es realmente detectado. El fragmento etiqueta está unido a un grupo de normalización de masas que asegura que cada etiqueta de un par de etiquetas comparte la misma masa global y composición atómica. Las etiquetas de primera y segunda generación se distinguen por la presencia de un grupo potenciador de la fragmentación adicional, prolina, en la etiqueta de segunda generación. Las etiquetas comprenderán adicionalmente una funcionalidad reactiva (R) para permitir el acoplamiento de la etiqueta a cualquier péptido pero en los presentes experimentos, R es una de las numerosas secuencias peptídicas. El fragmento etiqueta propuesto que resulta de los marcadores se muestra en la Figura 18c basándose en las teorías actuales sobre los mecanismos de fragmentación dependientes de la protonación del esqueleto ([5]).

Síntesis de péptidos marcados con TMT

Los péptidos mostrados en la Tabla 7 fueron sintetizados utilizando técnicas de síntesis Fmoc automatizada convencional (partiendo ambos de la resina Fmoc-Gly-Trt-PS disponible en el mercado de Rapp Polymere, Alemania). La metionina deuterada (Metd^{3}) es asequible de ISOTEC Inc, Miamisburg, Ohio, USA. Se sintetizó manualmente un reactivo Fmoc-Metd^{3} para su uso en un sintetizador peptídico a partir de metionina deuterada no protegida como se ha descrito antes. El grupo potenciador de la "sensibilización" guanidino se sintetizó en forma de un éster de N-hidroxisuccinimida (éster NHS) como se ha descrito antes y se añadió a grupos alfa amino desprotegidos de péptidos sintéticos mediante métodos convencionales durante la síntesis peptídica automatizada.

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TABLA 7

14

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Tabla 7: Se realizaron experimentos de razones de abundancia con los péptidos enumerados antes. Se realizaron experimentos de HPLC con las tres primeras secuencias enumeradas antes. Se prepararon pares de péptidos sintéticos con el primer o el segundo TMT pre-incorporado en la secuencia peptídica en el extremo N. Para cada etiqueta se enumeran las secuencias, la masa molecular mono-isotópica y las razones de masa a carga de las especies de iones predominantes.

Análisis MS/MS de los péptidos marcados con TMT

Se realizaron análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas utilizando Finnigan LCQ Deca con un Finnigan Surveyor HPLC System (Columna: 50 x 2,1 mm, 5J.1m.HyPURrfY® Elite C 18) o bien QTOF 2 de Micromass Ltd, Manchester, LTK con un sistema Cap-LC HPLC de LEAP Technologies (Columna: se utilizó PepMap C18 HPLC Column de Dionex con un diámetro interno de 75 \mum; la resina tenía un tamaño de partícula de 3 \mum, tamaño de poro 100A).

Las razones de abundancia de los iones se determinaron sumando y promediando numerosos espectros de un par de péptidos de elución seguido de la determinación de las razones de las intensidades de los picos para los fragmentos etiqueta.

Ejemplo 3a

Comparación de las etiquetas TMT de 1ª y 2ª generación

Para demostrar las ventajas de una etiqueta diseñada con un grupo potenciador de la fragmentación se exploraron dos diseños de TMT diferentes. Las etiquetas difieren por la inclusión de prolina en las etiquetas de segunda generación (Figura 18a y 18b). Se sabe que la prolina potencia la escisión del enlace amida en su lado N-terminal ([4]).

Los experimentos iniciales sobre la fragmentación de la primera generación de TMT en un aparato Micromass QTOF 2 demostraron que la intensidad de los fragmentos de TMT dependía en gran medida de la secuencia de aminoácidos del péptido y a energías de colisión bajas los fragmentos de la etiqueta no reflejaban exactamente las abundancias de los péptidos etiquetados. Como se muestra en la figura 1c los fragmentos etiqueta esperados tenían un m/z de 287 o 290 pero, en las etiquetas de primera generación, se observa un segundo par de iones con razones de masa a carga de 270 o 273. Se piensa que estos fragmentos son el resultado de la pérdida de amoníaco de los fragmentos etiqueta esperados. Un ejemplo de un espectro CID típico para un péptido marcado con las etiquetas de primera generación se muestra en la Figura 19. A energías de colisión más bajas las intensidades de estas dos clases de fragmentos variaban con la secuencia del péptido anclado pero a energías CID más altas se observan casi exclusivamente los fragmentos 270/273. A estas energías de colisión más altas, los fragmentos etiqueta 270/273 reflejaban exactamente las abundancias de los pares de péptidos. Los experimentos adicionales utilizando un espectrómetro de masas con trampas para iones Finnigan LCQ han demostrado el mismo patrón de fragmentación que el QTOF para las unidades de TMT de primera generación. La pérdida de amoníaco observada se produce en los experimentos tanto LCQ como QTOF. Estos instrumentos difieren en la manera en la que se lleva a cabo la CID (activación selectiva y fragmentación solamente del ión parental en LCQ frente a la fragmentación seriada de todos los iones en QTOF). Puesto que la pérdida de NH_{3} tiene lugar en ambos aparatos, esto sugiere que la pérdida de NH_{3} puede tener lugar directamente a partir del ión peptídico parental, en lugar de como resultado de posteriores colisiones del ión fragmentado esperado y es una característica intrínseca de esta estructura de la etiqueta. En ambos aparatos la aparición del fragmento 270/273 es favorecida por energías de colisión más altas. Esto significaba que para obtener un comportamiento coherente de esto, el análisis de las etiquetas tenía que tener lugar a energías de colisión elevadas.

Aunque la CID es más selectiva en la LCQ, esta está limitada desafortunadamente en su uso con TMT ya que no es posible detectar productos de fragmentación CID pequeños de precursores más grandes con este tipo de aparato. En el aparato QTOF, sin embargo, a energías de colisión más altas, las fragmentaciones consecutivas eran problemáticas. En T-TOF, la serie de iones fragmento b o y que proporcionan información de la secuencia se fragmentan adicionalmente para dar especies más pequeñas de manera que no se pudo obtener información de la secuencia a partir del péptido. Como resultado de la necesidad de CID de elevada energía para garantizar la liberación de los fragmentos etiqueta y para obtener una cuantificación exacta, solamente se pueden utilizar de manera fiable las unidades TMT de primera generación para los fines de la cuantificación sin identificación peptídica en QTOF. También se verificará esto de otros aparatos MS/MS en serie.

La Figura 19a y 19b muestran espectros CID típicos para un péptido marcado con TMT de primera generación a energías de colisión de 40V (Figura 19a) y 70V (Figura 19b). En 19a se pueden observar picos débiles de las regiones 270/273 y 287/290 a 40V, pero no representan exactamente las abundancias de los péptidos etiquetados. Se pueden observar algunos iones de la serie y específicos de la secuencia, sin embargo, a este potencial de aceleración. En 19b se pueden observar claramente los picos correspondientes al fragmento de etiqueta en m/z 270 y 273 para TMT de primera generación a una energía de colisión de 70V. A esta energía de colisión las intensidades de estos picos representan exactamente las abundancias relativas de cada péptido (véase el recuadro para el aumento de la región de la etiqueta en la Figura 19b) pero no se pueden determinar datos de la secuencia.

Estos resultados conducen al desarrollo de TMT de segunda generación, que tiene un resto prolina en la unidad de TMT para potenciar la fragmentación. Para cuantificar el efecto de la prolina en las etiquetas de segunda generación se analizó una mezcla 50:50 de un péptido marcado con etiquetas de primera y segunda generación respectivamente mediante MS/MS. Los dos péptidos resultantes, con las secuencias Guanidinocaproil-Met(D3)-Met-GLGEHNIDV
LEGNEQFINAAK y Guanidinocaproil-Met(D3)-Pro-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK, tenían iones correspondientes a la especie [M+3H]^{3+} a razones de masa a carga de aproximadamente 897 y 929 para las etiquetas de primera y segunda generación respectivamente. Para obtener las mismas condiciones de colisión para ambos precursores, primero se mezclaron los péptidos y después se analizaron en un aparato QTOF con el conjunto de cuadrupolos para seleccionar alternativamente iones con m/z en torno a 897 o 929. Cada ión seleccionado se sometió a CID a energías de colisión crecientes.

A energías de colisión de 20V o menos no se observaba fragmentación en absoluto para ningún tipo de TMT. A una energía de colisión de 30V-35V es posible observar los iones fragmento de TMT esperados a m/z de 290 en el espectro CID para el péptido con la etiqueta de segunda generación pero no se podían observar iones fragmento a m/z de 273 en el espectro para el péptido con la etiqueta de primera generación a la misma energía, véase la Figura 20, aunque se puede observar un fragmento débil a m/z de 290. El fragmento etiqueta para el péptido que contiene TMT de primera generación no se observa hasta que se utiliza una energía de colisión de 70 V (datos no mostrados). Los péptidos más pequeños marcados con TMT de primera generación dieron lugar al fragmento etiqueta a energías más bajas pero se requerían energías de colisión elevadas para liberar el fragmento etiqueta de los péptidos más grandes. La dependencia del tamaño del péptido de la energía necesaria para liberar el fragmento etiqueta era mucho más pequeña para TMT de segunda generación. La comparación de los espectros CID de los péptidos marcados con TMT que contenían prolina con los péptidos marcados con TMT sin el prolina muestra claramente que la introducción del aminoácido prolina como potenciador de la fragmentación conduce a la fragmentación en favor del fragmento etiqueta de TMT esperado sin recurrir a energías de colisión muy elevadas. A estas energías más bajas las razones de abundancia también de los iones fragmento de TMT, de los TMT que contienen prolina, reflejan exactamente las razones de las concentraciones de los péptidos etiquetados. Además, también se puede realizar la identificación del péptido por medio de su serie b e y a estas energías de colisión más bajas.

La Figura 20a, 20b y 20c muestran los espectros MS y MS/MS para iones triplemente cargados del péptido 2 (véase la Tabla 7) marcados con TMT de primera y segunda generación. Los péptidos fueron analizados en un aparato QTOF II. La Figura 20a muestra el espectro MS en modo TOF de la mezcla de péptidos. Para el análisis CID se ajustó el primer cuadrupolo para seleccionar alternativamente iones con m/z en torno a 897 o 929. El espectro CID a 35V para Guanidinocaproil-Met(D3)-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK se muestra en la Figura 20b y el espectro CID a 35V de Guanidinocaproil-Met(D3)-Pro-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK se muestra en la Figura 20c. La presencia del fragmento etiqueta esperado a m/z de 273 no es detectada por el TMT de primera generación en la Figura 20b pero el fragmento esperado a 290 es claramente observado para el TMT de segunda generación en la Figura 20c.

El mejor comportamiento del TMT de segunda generación se puede observar en la Figura 21 que muestra un espectro CID típico de un péptido marcado con estas etiquetas. Los fragmentos etiqueta que revelan las razones de abundancia son observados claramente a los valores m/z de 287 y 290 esperados. Además es posible observar iones de la serie b y de la serie y que permiten determinar la secuencia del péptido. Se realizó una CID a una energía de colisión relativamente baja de 40V. Los picos a m/z de 287 y 290 para el TMT de segunda generación a 40V representan las abundancias relativas de cada péptido (véase el recuadro con aumento de la región relevante del espectro de masas).

La Figura 22 muestra claramente que el estado de carga del péptido etiquetado con TMT no afecta a la aparición de los fragmentos etiqueta en los espectros CID de los péptidos marcados. En este ejemplo se muestra un péptido marcado con un TMT de primera generación pero se encuentra el mismo resultado para las etiquetas de segunda generación. Esto resulta ventajoso ya que significa que el barrido del espectro puede tener lugar sin ajustes complejos del soporte lógico de barrido para compensar el estado de carga de cada péptido. En otros procedimientos de etiquetado con isótopos, tales como ICAT, el estado de carga altera la diferencia de masa entre cada par de iones etiquetado, de manera que para los iones doblemente cargados, la diferencia de masa se reduce a la mitad, para los iones triplemente cargados la diferencia de masa es un tercio de la de los iones con carga única, etc. El soporte lógico para el barrido de pares de péptidos utilizando técnicas de marcaje con isótopos convencionales, como ICAT, debe compensar por lo tanto estas clases de problemas permitiendo las distintas diferencias de masa posibles o ignorando ciertas clases de iones, que aumentan la probabilidad de identificación errónea de los pares de péptidos o no aprovechan los pares de iones potenciales que podrían ofrecer información útil.

En la Figura 22, comparación de espectros para el péptido 4 de la Tabla 7 donde la CID se ha realizado en especies [M+4H]^{4+} (espectro inferior) y [M+5H]^{5+} (espectro superior). El péptido anterior contiene TMT de primera generación. El ión 4+ tiene un m/z de 969,3 mientras el ión 5+ tiene un m/z de 775.6. El ión fragmento etiqueta aparece en la razón de masa a carga esperada de 273 en ambos espectros indicando que solamente una carga se localiza hacia el fragmento etiqueta.

La Figura 23 muestra los datos para las razones esperada y observada de péptidos de los análisis ESI-MS/MS de los 4 péptidos enumerados en la Tabla 7. Se analizaron los péptidos con TMT de primera y segunda generación incorporados a ellos. Las razones de abundancia se determinaron analizando el pico máximo de d3 (A) y d0 (B) de los picos del ión fragmento etiqueta después de la normalización del pico a 290 y 287 para TMT2. Las medidas se realizaron en un aparato QTOF. El recuadro de la tabla para la Figura 23 muestra las razones esperada y observada para los iones fragmento b a partir del análisis MS/MS de los péptidos marcados con TMT que eluyen. Se puede observar que ambas generaciones de TMT proporcionan una representación exacta de las razones de abundancia de los péptidos en las mezclas y que las etiquetas muestran un comportamiento lineal a lo largo de todo el intervalo de razones de péptidos sometidas a ensayo.

Ejemplo 3b

Demostración del comportamiento cromatográfico idéntico de las etiquetas TMT en LC-MS

Se sintetizó una mezcla de cuatro pares de péptidos sintéticos con las unidades TMT de segunda generación pre-incorporadas en el extremo N de cada péptido. Los pares de péptidos fueron analizados todos juntos. Cada par de péptidos se preparó a una razón diferente. Las secuencias, las masas mono-isotópicas teóricas, las masas de los iones cargados doblemente se muestran en la Tabla 7. Los péptidos fueron cargados sobre una columna de HPLC en fase reversa C-18 y separados. El propósito de este experimento era demostrar la elución simultánea exacta de los correspondientes pares de péptidos con diferentes etiquetas TMT sin ninguna otra complicación. Las razones de los pares de péptidos fueron las esperadas y se encontró que coincidían a lo largo de todo el tiempo de elución para cada par de péptidos y por tanto un objeto adicional de este experimento fue demostrar que la cuantificación de los pares de péptidos se podría realizar con la determinación simultánea de la secuencia y que sería posible barrer otros péptidos sin esperar a la completa elución del péptido. La completa elución de los pares de péptidos es necesaria para la cuantificación exacta utilizando la estrategia ICAT y otras técnicas de análisis de péptidos utilizando el marcaje con isótopos convencional. Esto restringe enormemente el rendimiento de estos enfoques.

La Figura 24 muestra la elución simultánea de cada par de péptidos, péptidos A y B para cada péptido de la Tabla 7, claramente observados en las trazas de la HPLC en fase reversa C-18. Para cada péptido se registran corrientes de iones a m/z 287 a 290 correspondientes a los fragmentos etiqueta de cada uno de los TMT. La traza inferior para cada péptido es la corriente de iones total. Se muestran los perfiles de elución de 3 péptidos controlados en cada una de las razones masa a carga de los iones b_{2} de los fragmentos etiqueta. Se puede observar claramente que los pares de péptidos eluyen como una única fracción. En el modo MS/MS, la verificación de los iones fragmentos etiqueta produce resultados virtualmente idénticos en cada caso. Para cada par de péptidos las razones observadas coincidían con las razones esperadas en un grado razonable.

Puesto que los péptidos etiquetados eluyen exactamente a la vez, las razones de los pares de péptidos se conservan a lo largo de todo el perfil de elución, lo que significa que no es necesario integrar la corriente de iones total para los iones en elución para determinar la abundancia relativa de cada par peptídico.

Ejemplo 3c

Análisis de la sensibilidad y robustez de la tecnología con TMT

Para proporcionar una mejora eficaz sobre el marcaje con isótopos convencional, la tecnología con TMT debe ser al menos tan sensible como otros métodos de marcaje con isótopos y debe tener un intervalo dinámico similar en términos generales. Además, las propiedades de las etiquetas deben coincidir a lo largo de todo el intervalo dinámico esperado de las muestras que se van a analizar. Finalmente, se necesita demostrar la capacidad de estas etiquetas para superar el ruido del espectrómetro de masas. Para someter a ensayo el intervalo dinámico del sistema y para mostrar que las propiedades de las etiquetas TMT coinciden a lo largo de todo el intervalo dinámico, se examinó la conservación de las razones de péptidos a un intervalo de diferentes concentraciones de uno de los péptidos sintéticos etiquetados (péptido 3A y 3B). Como se puede observar a partir de la Figura 25, una dilución seriada de los péptidos 3A y 3B, mezclada a una razón 40:60, desde 100 pmoles a 100 fmoles, las razones estaban conservadas de forma exacta con una desviación en el 5% en la mayoría de los casos, de la razón esperada. Estos y otros resultados (no mostrados) indican que los péptidos etiqueta no reducen la sensibilidad intrínseca con la cual es detectado un péptido en el modo MS/MS, esto es el análisis de los péptidos marcados con TMT mediante CID tiene esencialmente la misma sensibilidad que el MS/MS de los péptidos no etiquetados. La sensibilidad intrínseca parece ser específica del aparato basándose en comparaciones entre LCQ y QTOF en el análisis de péptidos pequeños (los fragmentos etiqueta de péptidos grandes con TMT no pueden ser detectados en LCQ debido a las limitaciones intrínsecas de la CID con este tipo de aparato). La sensibilidad con la cual es posible determinar la secuencia de los péptidos etiquetados no parece haber sido cambiada en ninguno de los péptidos sometidos a ensayo hasta ahora. Se pueden detectar diferencias significativas en las razones de los péptidos a lo largo de todo el intervalo de concentraciones sometidas a ensayo (Figura 25).

Las Figuras 26a, 26b y 26c muestran los resultados de un experimento de adición en el cual se mezclan pares de péptidos 3A y 3B (500 fmoles en total, a una razón 40:60 respectivamente) que portan un TMT de segunda generación con un producto de la digestión con tripsina de Seralbúmina Bovina (2 pmoles). La Figura 26a muestra el cromatograma del pico base del análisis en el modo MS. Durante el recorrido, los primeros cinco iones más intensos analizados en el modo MS fueron fragmentados automáticamente en el modo MS/MS a 30V. Los pares de péptidos con TMT fueron investigados y localizados sobre el cromatograma del pico base. La razón de los fragmentos con TMT2 se calculó después a partir del espectro MS/MS para la masa [M+3H]^{3+} (un aumento de los fragmentos etiqueta se muestra en la figura 9b y el espectro total se muestra en la figura 9c) comparando la intensidad de las razones de masa a carga del fragmento de TMT d0 y d3 (287 y 290).

En un experimento adicional, se examinó la capacidad para detectar péptidos marcados en un fondo de péptidos contaminantes. Los pares de péptidos 3A y 3B que portan un TMT de segunda generación fueron mezclados con un exceso de 20 veces de un producto de la digestión con tripsina de Seralbúmina Bovina. La mezcla de péptidos fue analizada después en un aparato LC-QTOF. Los cinco iones más intensos de cada barrido de la elución se sometieron a CID para identificar los péptidos. Los péptidos esperados fueron detectados y la región del espectro correspondiente a los fragmentos etiqueta fue analizada para determinar la razón de abundancia de los péptidos detectados. El análisis mediante CID (energía de colisión de 30V), proporciona el espectro mostrado en la Figura 26c. Se encontró que la razón de los péptidos 3A y 3B era de 39,3% a 60,7%, respectivamente, por comparación de las intensidades de los picos a las razones de masa a carga del ión fragmento de 290 (unidad TMT d3) y 287 (unidad TMT d0). La razón esperada fue del 40% 3A al 60% 3B, de este modo se detectó la razón de péptido con un error del 1,7%. La calidad del espectro MS/MS obtenido (Figura 26b y 26c) a la baja energía de colisión utilizada, permite una clara identificación de la secuencia peptídica por medio de la búsqueda en las bases de datos. Este experimento muestra claramente que una mezcla compleja de péptidos sometidos a digestión con tripsina no impide el análisis de los pares de péptidos marcados con etiquetas TMT de segunda generación y los TMT pueden ayudar a superar el ruido de la muestra. Además no parece haber ningún problema de supresión - las razones de péptidos presentes a bajas concentraciones todavía pueden ser determinadas en presencia de otros péptidos que se encuentran a concentraciones elevadas.

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Referencias

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<110> XZILLION GMBH & CO. KG

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<120> MARCADORES DE MASA

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<130> 208649/CMH/AV

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<140> PCT/GB02/04240

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<141> 2002-09-14

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<150> EP01307830.8

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<151> 2001-09-14

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<160> 7

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT

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<400> 1

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\sa{Gly Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg}

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<210> 2

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT

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<400> 2

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\sa{Gly Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe}

\sac{Ile Asn ala Ala Lys}

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT

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<400> 3

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\sa{Gly Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys}

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<210> 4

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<211> 31

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT

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<400> 4

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15

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<210> 5

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT de 1ª generación

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<400> 5

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16

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<210> 6

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> péptido marcado con TMT de 2ª generación

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<400> 6

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17

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<210> 7

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> etiqueta TMT de 2ª generación

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<400> 7

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\sa{Met Pro Met Gly}

Claims (42)

1. Un conjunto de dos o más marcadores de masa, comprendiendo cada marcador del conjunto un radical señalizador de masas anclado por medio de un enlazador escindible que tiene al menos un enlace amida a un radical de normalización de masas, donde cada radical de normalización de masas asegura que un marcador de masa tiene una masa agregada deseada, y donde el conjunto comprende un grupo de marcadores que tienen un radical señalizador de masas con una masa común, y cada marcador tiene una masa agregada diferente de todos los demás marcadores de ese grupo; o un grupo de marcadores que tienen un radical señalizador de masas, teniendo cada radical señalizador de masas una masa diferente de la de todos los demás radicales marcadores de masa de ese grupo, y cada marcador del grupo tiene una masa agregada común; y donde todos los demás marcadores de masa del conjunto son distinguibles entre sí por espectrometría de masas, y donde el radical señalizador de masas comprende un aminoácido y el radical de normalización de masas comprende un aminoácido.

2. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada marcador del conjunto comprende un radical señalizador de masas que tiene una masa común y cada marcador del conjunto tiene una masa agregada única.

3. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que cada marcador del conjunto comprende un radical señalizador de masas que tiene una masa única y cada marcador del conjunto tiene una masa agregada común.

4. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 3, en el que cada radical señalizador de masas del conjunto tiene una estructura básica común, y cada radical de normalización de masas del conjunto tiene una estructura básica común que puede ser igual o diferente de la estructura básica común de los radicales señalizadores de masas, y donde cada marcador de masa del conjunto comprende uno o más radicales ajustadores de masas, estando anclados los radicales ajustadores de masas a o situados en la estructura básica del radical señalizador de masas y/o la estructura básica del radical de normalización de masas, de manera que cada radical señalizador de masas del conjunto comprende un número diferente de radicales ajustadores de masas y cada marcador de masa del conjunto tiene el mismo numero de radicales ajustadores de masas.

5. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 4, teniendo cada marcador de masa del conjunto la siguiente estructura:

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M(A)_{y}-L-X(A)_{z}

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donde M es un radical de normalización de masas que comprende un aminoácido, X es un radical señalizador de masas que comprende un aminoácido, A es un radical ajustador de masas, L es un enlazador escindible que comprende el enlace amida, y y z son números enteros de 0 o mayores, e y+z es un número entero de 1 o mayor.

6. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el radical ajustador de masas se selecciona entre:

(a)

un sustituyente isotópico situado en la estructura básica del radical señalizador de masas y/o en la estructura básica del radical de normalización de masas, y

(b)

átomos o grupos sustituyentes anclados a la estructura básica del radical señalizador de masas y/o anclados a la estructura básica del radical de normalización de masas.

7. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 6, donde el radical ajustador de masas se selecciona entre un átomo de halógeno sustituyente, un grupo metilo sustituyente, y sustituyentes isotópicos H^{2} o
C^{13}.

8. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con la reivindicación 7, donde el radical ajustador de masas es un átomo de flúor sustituyente.

9. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el enlazador escindible que ancla el radical señalizador de masas al radical de normalización de masas es un enlazador escindible por disociación inducida por colisión.

10. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el enlazador escindible comprende prolina y/o ácido aspártico.

11. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el radical señalizador de masas y/o el radical de normalización de masas comprende un grupo resistente a la fragmentación.

12. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el radical señalizador de masas comprende un grupo potenciador de la sensibilidad, tal como un grupo pre-ionizado.

13. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el radical señalizador de masas o el radical de normalización de masas comprende una funcionalidad reactiva.

14. Un conjunto de marcadores de masa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde cada marcador de masa del conjunto comprende un ligando de captura por afinidad, tal como la biotina.

15. Un conjunto de dos o más analitos, siendo diferentes cada analito del conjunto y estando anclado a un marcador de masa único o una única combinación de marcadores de masa, de un conjunto de marcadores de masa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Un conjunto de analitos de acuerdo con la reivindicación 15, donde uno o más analitos del conjunto son un analito patrón que tiene una masa conocida, o propiedades cromatográficas conocidas.

17. Un conjunto de dos o más sondas, siendo cada sonda del conjunto diferente y estando anclada a un único marcador de masa o una única combinación de marcadores de masa, de un conjunto de marcadores de masa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

18. Un conjunto de analitos o sondas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde cada analito o sonda está anclado a una única combinación de marcadores de masa, distinguiéndose cada combinación por la presencia o ausencia de cada marcador de masa del conjunto de marcadores de masa y/o la cantidad de cada marcador de masa anclado a la sonda.

19. Un conjunto de analitos o sondas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde cada analito o sonda comprende una biomolécula.

20. Un conjunto de analitos o sondas de acuerdo con la reivindicación 19, donde la biomolécula se selecciona entre un ADN, un ARN, un oligonucleótido, una base de ácido nucleico, una proteína y/o un aminoácido.

21. Un método de análisis, cuyo método comprende detectar un analito identificando mediante espectrometría de masas un marcador de masa o una combinación de marcadores de masa relacionables con el analito, donde el marcador de masa es un marcador de masa de un conjunto de marcadores de masa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, donde los marcadores de masa empleados son marcadores que comprenden un ligando de captura por afinidad, y los analitos marcados son separados de los analitos no marcados capturando el ligando de captura por afinidad con un ligando contador.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que dos o más analitos son detectados identificando simultáneamente sus marcadores de masa o combinaciones de marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, donde cada analito es identificado por una única combinación de marcadores de masa de un conjunto o matriz de marcadores de masa, distinguiéndose cada combinación por la presencia o ausencia de cada marcador de masa en el conjunto o matriz y/o la cantidad de cada marcador de masa.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-24 para identificar dos o más analitos, donde los analitos se separan de acuerdo con su masa, antes de detectar sus marcadores de masa mediante espectrometría de masas.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, donde los analitos que se van a identificar se mezclan con uno o más analitos patrón, que tienen una masa conocida o propiedades conocidas en el método de separación utilizado, para facilitar la caracterización de los analitos.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, donde los analitos patrón se definen como en la reivindicación 16.

28. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde la separación se lleva a cabo mediante un método cromatográfico o electroforético.

29. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-28, donde el espectrómetro de masas empleado para detectar el marcador de masa comprende uno o más analizadores de masa, cuyos analizadores de masa son capaces de permitir que iones de una masa, o intervalo de masas concretos, pasen a través para la detección y/o son capaces de hacer que los iones se disocien.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 29, donde los iones de una masa o intervalo de masas concretos específicos para uno o más marcadores de masa conocidos se seleccionan utilizando el analizador de masa, los iones seleccionados se disocian, y los productos de la disociación se detectan para identificar los patrones iónicos indicativos de los marcadores de masa seleccionados.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 29 o la reivindicación 30, donde el espectrómetro de masas comprende tres analizadores de masa cuadrupolares.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 31, donde se utiliza un primer analizador de masa para seleccionar los iones de una masa o intervalo de masas concreto, se utiliza un segundo analizador de masa para disociar los iones seleccionados, y se utiliza un tercer analizador de masa para detectar los iones resultantes.

33. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-32, cuyo método comprende:

(a)

poner en contacto uno o más analitos con un conjunto de sondas, donde las sondas se definen como en cualquiera de las reivindicaciones 17-20,

(b)

identificar un analito, detectando una sonda relacionable con ese analito.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, donde el marcador de masa es escindido de la sonda antes de detectar el marcador de masa mediante espectrometría de masas.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 33 o la reivindicación 34, cuyo método comprende poner en contacto uno o más ácidos nucleicos con un conjunto de sondas de hibridación.

36. El uso de un marcador de masa de un conjunto de marcadores como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en un método de análisis.

37. El uso de acuerdo con la reivindicación 36 en un método de análisis electroforético bidimensional.

38. El uso de acuerdo con la reivindicación 36 en un método de análisis de espectrometría de masas bidimensional.

39. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36-38 en un método de secuenciación de uno o más ácidos nucleicos.

40. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36-38 en un método de perfilado de la expresión génica.

41. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36-38 en un método de perfilado de la expresión de proteínas.

42. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36-38 en un método de clasificación de ácidos nucleicos.