JP5730908B2 - ビタミンｄ３、ビタミンｄ２、およびこれらの代謝体の定量分析 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１月２５日に出願された、先願米国仮特許出願第６１／２９７，９１７号明細書の利益を主張する。

本教示は、マススペクトロメトリーおよびマススペクトロメトリーに有用なタグ化試薬の分野に関するものである。

ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、ならびに２５−ヒドロキシおよび１，２５ジヒドロキシ類似体などのビタミンＤ３およびビタミンＤ２の代謝体を含む、ビタミンＤファミリーの代謝体の分析は、これらの分析物が血漿などの測定基質中に低レベルで存在するために、従来は困難であった。ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、およびそれらの代謝体の従来の分析方法は、さらなる欠点を有する。ビタミンＤ３およびその代謝体を分析するために用いられるイムノアッセイおよびＬＣ／ＵＶ法は、例えば、特異的ではなく、試料処理が複雑である。また、分析物の誘導体化を利用するためにＬＣ／ＭＳＭＳを伴う戦略は、アッセイが臨床状況で実行可能とされるのに必要な検出限界を達成しておらず、多重化能も欠いている（Ｓｈｉｍａｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９１，Ｖｏｌ １１６，１３９３−１３９７；Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５４（１１），１４７９−１４８５（２００６））。これらの欠点を克服する、これらの分析物を定量する方法の必要性が存在する。

誘導体化に利用することができる、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、ならびにビタミンＤ３およびビタミンＤ２の代謝体中の２つの官能基が、ヒドロキシル基と共役ジエン官能基とを含むことが分かっている。ＳｈｉｍａｄａらおよびＨｉｇａｓｈｉらにより記載されているクックソン試薬は、ディールス・アルダー化学を利用して、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、およびそれらの代謝体中のジエン官能基を通してトリアゾロン誘導体を付加する。

様々な実施形態によって、本教示の方法は、本明細書でビタミンＤ分析物と総称される、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、およびそれらの代謝体を定量する方法を提供する。この代謝体は、例えば、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３のモノヒドロキシおよびジヒドロキシ代謝体を含むことができる。ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ならびにビタミンＤ２およびビタミンＤ３のモノヒドロキシおよびジヒドロキシ代謝体の定量は、マススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬を用いる分析物の標識、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）作業フローを用いる標識分析物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を含むことができる。標識分析物は、逆相カラム上での異なる保持時間と、異なる質量とを有することができる。高エネルギー衝突下で、レポーター基を生成させることができる。各レポーター基について検出される強度またはピーク面積を同定にだけでなく、定量にも用いることができる。

いくつかの実施形態では、ビタミンＤ分析物のファミリー中のジエン官能基を利用する２段階誘導体化プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、ビタミンＤ分析物は、１段階プロセスで誘導体化される。試験試料中の分析物の定量は、ＬＣ−ＭＳＭＳおよびＭＲＭ作業フローを用いて達成することができる。試薬設計によって、アッセイの感度が高まり、多重化能が提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル含有１段階タグ化試薬で処理して、標識ディールス・アルダー付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること
を含む、方法。
（項目２）
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：

（式中、

である。）を有する化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：

（式中、

である。）を有する化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物を１段階ジエノフィル含有標識ディールス・アルダー試薬で処理して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること；
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記標準を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含み、かつ前記試料を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、前記第１の同重体タグとは異なる前記同重体タグのセットに由来する第２の同重体タグを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ビタミンＤ分析物が、複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ビタミンＤ２の代謝体がビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記ディールス・アルダー付加物をアミノキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で標識して、標識付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること、
を含む、方法。
（項目１２）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目１１に記載の方法。

（項目１３）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、標準ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記標準ディールス・アルダー付加物をアミノキシＭＳタグ化試薬で標識して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記標準ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含み、かつ前記ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、前記第１の同重体タグとは異なる前記同重体タグのセットに由来する第２の同重体タグを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時に荷電フラグメントを失う、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成させる、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記ビタミンＤ分析物が複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
前記ビタミンＤ２の代謝体が、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２４）
包装中に、ジエノフィル試薬およびアミノキシＭＳタグ化試薬を含むキット。
（項目２５）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２７）
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２８）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２９）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、同重体タグのセットに由来する同重体タグを含み、かつ前記キットが、前記同重体タグのセットに由来する同重体タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目３０）
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、項目２４に記載のキット。
（項目３１）
包装中に、ジエノフィルを含有する標識ディールス・アルダー試薬を含む、キット。
（項目３２）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、以下の構造：

（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：

（式中、

である。）を有する化合物を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３４）
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３５）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３６）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、同重体タグのセットに由来する同重体タグを含み、かつ前記キットが、前記同重体タグのセットに由来するそれぞれの同重体タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、項目３１に記載のキット。
（項目３７）
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３８）
前記複数の異なるタグ化試薬が同重体タグを含む、項目８に記載の方法。
（項目３９）
前記同重体タグが以下の構造：

から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、項目８に記載の方法。
（項目４１）
前記質量差タグが以下の構造：

から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記複数の異なるタグ化試薬が同重体タグを含む、項目２１に記載の方法。
（項目４３）
前記同重体タグが以下の構造：

から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、項目２１に記載の方法。
（項目４５）
前記質量差タグが以下の構造：

から選択される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来する質量差タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目４７）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来するそれぞれの質量差タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、項目３１に記載のキット。

本教示は、添付の図面を参照してより完全に理解されるであろう。図面は、本教示を説明するためのものであって、限定するためのものではない。

本教示の様々な実施形態によるビタミンＤ分析物を標識するために用いることができる２段階化学反応の反応スキームを示す。 本教示の様々な実施形態による４重アッセイで用いることができる４つのアミノキシタグ化試薬の例示的セットを示す。 本教示の様々な実施形態による４重アッセイで用いることができる４つのアミノキシタグ化試薬の例示的セットを示す。 本教示の様々な実施形態による、荷電分析物種をレポーターイオンとして残すアミノキシ試薬を用いて、モノヒドロキシビタミンＤ３のレポーターイオンを生成させるフラグメンテーションパターンを示す反応スキームである。 本教示の様々な実施形態による、荷電分析物種をレポーターイオンとして残すアミノキシ試薬を用いて、ジヒドロキシビタミンＤ３のレポーターイオンを生成させるフラグメンテーションパターンを示す反応スキームである。 本教示の様々な実施形態による、タグフラグメントをレポーターイオンとして生じるアミノキシ試薬を用いて、モノヒドロキシビタミンＤ３のレポーターイオンを生成させるフラグメンテーションパターンを示す反応スキームである。 本教示の様々な実施形態による２重アッセイでの相対定量に関わる様々な工程を示す模式的流れ図である。 本教示の様々な実施形態による２重アッセイでの絶対定量に関わる様々な工程を示す模式的流れ図である。 本教示の様々な実施形態による４重アッセイでの相対定量に関わる様々な工程を示す模式的流れ図である。 本教示の様々な実施形態による４重アッセイでの絶対定量に関わる様々な工程を示す模式的流れ図である。 本教示の様々な実施形態による２つの例示的質量差試薬ペアを示す。 本教示の様々な実施形態による標識分析物のＨＰＬＣ分離を示すスペクトグラムである。 本教示の様々な実施形態によって得られた、標識ビタミンＤ３のＭＳＭＳスペクトグラムである。 本教示の様々な実施形態によって得られた、標識ビタミンＤ３のＭＳ^３スペクトグラムを示す。 本教示の様々な実施形態によって得られた、標識モノヒドロキシビタミンＤ３のＭＳＭＳスペクトグラムを示す。 本教示の様々な実施形態によって得られた、標識ジヒドロキシビタミンＤ３のＭＳＭＳスペクトグラムを示す。 本教示の様々な実施形態によって得られた、標識ビタミンＤ２のＭＳＭＳスペクトグラムを示す。 ビタミンＤ分析物の１段階タグ化方法で用いることができる一般式および例示的置換基を示す。 ビタミンＤ分析物の１段階タグ化方法で用いることができる一般式および例示的置換基を示す。 本教示の様々な実施形態によるビタミンＤ分析物を標識するために用いることができる、１段階化学反応の反応スキーム、およびタグ化分子の例示的置換基を示す。 本教示の様々な実施形態によるビタミンＤ分析物を標識および定量するために用いることができる、１段階化学反応の反応スキーム、タグ化分子に用いることができる例示的置換基、およびＭＳＭＳ作業フローを示す。 本教示の様々な実施形態によるジヒドロキシビタミンＤ３分析物を標識および定量するために用いることができる、１段階化学反応の反応スキーム、タグ化分子に用いることができる例示的置換基、およびＭＳＭＳ作業フローを示す。 本教示の様々な実施形態によるモノヒドロキシビタミンＤ３分析物を標識および定量するために用いることができる、１段階化学反応の反応スキーム、タグ化分子に用いることができる例示的置換基、およびＭＳＭＳ作業フローを示す。 各セットが本教示の様々な実施形態による４重アッセイで用いることができる４つの異なる試薬を含む、例示的同重体タグの２つの異なるセットを示す。 各セットが本教示の様々な実施形態による４重アッセイで用いることができる４つの異なる試薬を含む、例示的質量差タグの２つの異なるセットを示す。 本教示の様々な実施形態による、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、および非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の比較を示す。 本教示の様々な実施形態による、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、および非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の感度の比較を示す。 本教示の様々な実施形態による、ビタミン−Ｄ_３異性体の分離を示す。 本教示の様々な実施形態による、ヒト血清試料中での１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３からのビタミン−Ｄ_３異性体の分離を示す。 本教示の様々な実施形態による、ヒト血清試料の分析における１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３からのビタミン−Ｄ_３異性体の分離を示す。 本教示の様々な実施形態による、２回の試行（ｔｗｏ ｒｕｎｓ）由来の男性血清試料中に検出された１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の量を示す。 本教示の様々な実施形態による、２回の試行（ｔｗｏ ｒｕｎｓ）由来の女性血清試料中に検出された１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の量を示す。

様々な実施形態によって、試料中のビタミンＤ分析物を定量する方法が提供される。ビタミンＤ分析物は、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させることを含む。その後、ディールス・アルダー付加物をアミノキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で標識して、標識付加物を形成させる。その後、マススペクトロメトリーを用いて、標識付加物を分析する。他の実施形態では、１段階タグ化試薬、例えば、ジエノフィルを含有する標識ディールス・アルダー試薬を用いる。

２段階化学を用いる様々な実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬は、以下の構造を有する化合物を含むことができる。
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
いくつかの実施形態では、アミノキシＭＳタグ化試薬は、以下の構造を有する化合物を含むことができる。
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数であることができるが、これらに限定されず、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
本方法はさらに、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること、この標準の既知ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、標準ディールス・アルダー付加物を形成させること、およびこの標準ディールス・アルダー付加物をアミノキシＭＳタグ化試薬で標識して、標識標準付加物を形成させることを含むことができる。その後、標識標準を試料から得られた付加物および標識付加物と混合して、混合物を形成させることができる。その後、この混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させることができ、この分離された分析物を分析することができる。

いくつかの実施形態では、標準ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられるアミノキシＭＳタグ化試薬は、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含むことができる。試料由来のディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられるアミノキシＭＳタグ化試薬は、同重体タグの同じセットに由来するが、第１の同重体タグとは異なる第２の同重体タグを含むことができる。標識付加物は、マススペクトロメトリーを用いて、標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いて、これらの組合せを用いて、または同様の方法を用いて、分析することができる。

いくつかの実施形態では、標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を、三連四重極ＭＳプラットフォームを用いて実施する。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８ Ａ１号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、アミノキシＭＳタグ化試薬は、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す。いくつかの実施形態では、アミノキシＭＳタグ化試薬は、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成させる。

様々な実施形態によって、ビタミンＤ分析物は、複数の異なるビタミンＤ分析物を含むことができ、かつ標識することが、複数の異なるそれぞれのタグ化試薬、例えば、各々の異なるタイプの分析物のための異なるタグ化試薬で各々標識することを含むことができる。分析すべき代謝体であって、その検出のためにキットを構成することができる代謝体は、ビタミンＤ２の分析物、例えば、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはビタミンＤ２のジヒドロキシ代謝体を含むことができる。いくつかの実施形態では、代謝体はビタミンＤ３の代謝体であり、かつビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはビタミンＤ３のジヒドロキシ代謝体を含むことができる。

本教示のさらに他の実施形態によって、ジエノフィル試薬および１種以上のアミノキシ
ＭＳタグ化試薬を含むキットが提供される。アミノキシＭＳタグ化試薬は、以下の構造を有する化合物を含むことができる。
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
本キットは、以下の構造を有する化合物を含むアミノキシＭＳタグ化試薬を含むことができる。
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数であることができるが、これらに限定されず、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
本キットは、既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含むことができる。標準は、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含むことができる。いくつかの実施形態では、本キットに含まれるアミノキシＭＳタグ化試薬は、同重体タグのセットに由来する１種以上の同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、本キットは、同重体タグのセットに由来する複数の異なる同重体タグを含むことができる。

本キットは、ビタミンＤ分析物を標識するための指示書、例えば、紙の指示書または例えば、コンパクトディスク上の電子ファイルにフォーマット化された指示書を含むこともできる。いくつかの実施形態では、本キットは、試料しか添加する必要がない、単一の容器中のホモジニアスアッセイを含むことができる。本キットの他の構成要素は、緩衝液、他の試薬、１種以上の標準、混合用容器などを含むことができる。

様々な実施形態によって、本教示は、本明細書でビタミンＤ分析物と総称される、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、および／またはビタミンＤファミリー由来の代謝体のうちの１つまたは複数の定量方法を提供する。ビタミンＤ分析物は、例えば、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ならびに／またはビタミンＤ２もしくはビタミンＤ３もしくは構造関連化合物もしくはジエン官能基を有する任意の分析物のモノヒドロキシ、ジヒドロキシおよびトリヒドロキシ代謝体を含むことができる。様々な実施形態によって、１種以上のビタミンＤ分析物の定量方法は、分析物を修飾し、その後、マススペクトロメトリーを用いて質量分析する２段階化学反応を含むことができる。様々な実施形態によって、この２段階化学反応は、ビタミンＤ分析物中の共役ジエン官能基を誘導体化して、標識を分析物に付着させ
ることを含むことができる。

図１に示すように、２段階化学反応は、まず、ビタミンＤ分析物をアセチル基を有するジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させることを含むことができる。次に、ディールス・アルダー付加物をマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で処理することができる。いくつかの実施形態によって、液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、修飾された分析物を分析することができる。様々な分析物の付加物は、逆相カラム上での様々な異なる保持時間と、異なる質量とを有することができ、かつカラムから別々の時間に溶出させることができる。カラムからの溶出物をＭＳＭＳ分析に供することができる。高エネルギー衝突下で、レポーター基を生成させることができる。レポーター基の強度またはピーク面積を同定および／または定量に用いることができる。

様々な実施形態によって、１種以上のビタミンＤ分析物を標識またはタグ化するための複数のマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬が提供される。いくつかの実施形態によって、ＭＳタグ化試薬は十分にフラグメント化し、強いレポーターイオンを提供することができる。いくつかの実施形態によって、ＭＳタグ化試薬は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイ用に特別に設計されているアミノキシＭＳタグ化試薬を含むことができる。いくつかの実施形態によって、少なくとも２つの異なるカテゴリーのアミノキシＭＳタグ化試薬を用いて、高エネルギー衝突下でレポーター基を生成させることができる。使用可能な第１のカテゴリーおよび第２のカテゴリーまたは第１のセットおよび第２のセットのアミノキシＭＳタグ化試薬由来の例示的な化合物を以下に示す：
第１のカテゴリー
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）；
第２のカテゴリー
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数であることができるが、これらに限定されず、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
図３Ａおよび３Ｂに示すように、第１のカテゴリーのアミノキシＭＳタグ化試薬由来の
アミノキシＭＳタグ化試薬は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）時にニュートラルロスを経て、後にＭＳ^３分析に供することができるレポーターイオンとして荷電分析物種を残すことができる。図３Ａに示すビタミンＤ分析物は、モノヒドロキシビタミンＤ３である。図３Ｂに示すビタミンＤ分析物は、ジヒドロキシビタミンＤ３である。第２のカテゴリーのアミノキシＭＳタグ化試薬由来のアミノキシＭＳタグ化試薬は、図３Ｃに示すように、高エネルギー衝突によって、レポーターイオンとしてのタグフラグメントを生じさせることができる。図３Ｃに示すビタミンＤ分析物は、モノヒドロキシビタミンＤ３である。

様々な実施形態によって、各々のタイプのアミノキシＭＳタグ化試薬について、複数の同重体タグ化または質量差タグ化試薬を調合し、用いることができる。図２Ａおよび２Ｂは、各々それぞれ、同重体４重アミノキシＭＳタグ化試薬のセットを示している。同重体タグ化試薬の各々のセットは、同一の化学構造および質量を有することができるが、異なる組合せおよび／または位置の同位体を含むことができる。

様々な実施形態によって、ある同重体試薬のセットに由来する第１の同重体タグを、例えば、既知濃度の、既知ビタミンＤ分析物を含むことができる標準と接触させることができる。接触は、第１の同重体タグと標準の反応に有利に働く条件の下で行なうことができる。第１の同重体タグと同じ同重体試薬のセットに由来する第２の同重体タグを、未知濃度のビタミンＤ分析物を含む試料と接触させることができる。以下でさらに記載するように、標準および試料のタグ化分析物を一緒に混合し、分析して、試料中の分析物の濃度を決定することができる。分析は、混合物を分離して、分離された分析物を形成させること、およびこの分離された分析物を分析することを含むことができる。使用可能な分離方法としては、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、他のクロマトグラフィー法、電気泳動法、電気浸透法、質量差分離法などが挙げられる。例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィーを用いて、混合物中の様々な分析物を分離し、それにより、分離された分析物を形成させる。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー分離を逆相カラム上で実施することができ、このカラムから溶出するピークをその後の分析に供することができる。いくつかの実施形態では、その後の分析は、マススペクトロメトリー、またはより具体的には、親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を含むことができる。ＰＤＩＴＭの結果を比較することによって、以下でさらに詳細に記載するように、試料中のビタミンＤ分析物の濃度を決定することができる。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８ Ａ１号明細書に見出すことができる。

いくつかの実施形態によって、同重体タグ化試薬の代わりに質量差タグ化試薬を用いることができる。例示的な質量差試薬ペアを図５に示す。

様々な実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬を、多重アッセイでの相対定量および絶対定量に用いることができる。いくつかの実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬を、２重、３重、４重、および他の多重アッセイに用いることができる。

例示的な定量方法を、それぞれ、２重アッセイの相対定量および絶対定量を示す、図４Ａおよび４Ｂを参照しながら示す。図４Ａに記載されているように、本方法は、既知ビタミンＤ分析物を含む第１の試料を標識することから始めることができる。第１の試料は、例えば、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準であることができる（図４Ｂ）。第１の試料を同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグで標識することができる。次に、未知濃度の未知分析物を有する第２の試料を同重体タグの同じセットに由来する第２の同重体タグで標識することができる。その後、標識した第１の試料を、標識した第２の試料と組み合わせて、混合物を形成させることができる。その後、混合物を、例えば、逆相カラム上での液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供することができる。標識分析物は、カラム上でのその様々な、異なる保持時間のために、別々の時間にカラムから溶出することができる。逆相カラムから溶出したピークは、第１の試料由来の標識分析物を含むピークと、第２の試料由来の標識分析物を含むピークとを含むことができる。次に、カラムから溶出した各々のピークを親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）に供することができる。図４Ａに示すように、第２の試料から生成されたレポーターシグナルと比べた、第１の試料から生成されたレポーターシグナルのピーク面積のシグナル強度の比から、試験試料中の分析物の相対濃度が得られる。標識標準の濃度が既知の場合、図４Ｂに示すように、試料中の分析物の具体的な濃度を決定することができる。

別の例示的な相対定量および絶対定量の方法を、それぞれ、４重アッセイの相対定量および絶対定量を示す、図４Ｃおよび４Ｄを参照しながら示す。図４Ｃに記載されているように、本方法は、４つの試料を、同じ同重体タグのセットに由来する第１、第２、第３、および第４の同重体タグでそれぞれ標識することから始めることができる。図４Ｄに示すように、これらの試料のうちの１つは、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を有する標準であることができる。標識試料を組み合わせて、混合物を形成させることができる。その後、混合物を、例えば、逆相カラム上での液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離などの分離に供することができる。標識分析物は、カラム上でのその様々な、異なる保持時間のために、別々の時間にカラムから溶出させることができる。逆相カラムから溶出したピークは、標識分析物を含むピークと、標識標準を含むピークとを含むことができる。次に、カラムから溶出した各々のピークを親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）に供することができる。図４Ｃに示すように、標識試験試料から生成されたレポーターシグナルと比べた、標識標準から生成されたレポーターシグナルのピーク面積のシグナル強度の比から、試験試料中の分析物の相対濃度が得られる。標識標準の濃度が既知の場合、図４Ｄに示すように、試料中の分析物の具体的な濃度を決定することができる。

様々な実施形態によって、１種以上のビタミンＤ分析物の相対定量の方法は、１種以上の分析物を標識し、その後、マススペクトロメトリーを用いて分析することを含むことができる。いくつかの実施形態によって、１種以上の分析物は、ビタミンＤ３および／またはビタミンＤ３の代謝体であることができる。いくつかの実施形態によって、本方法は、ビタミンＤ３および／またはビタミンＤ３の代謝体を含む標準試料と、試験試料の両方をＭＳタグ化試薬で標識することを含むことができる。いくつかの実施形態によって、ＭＳタグ化試薬は、アミノキシタグ化試薬であることができる。いくつかの実施形態によって、アミノキシタグ化試薬は、同重体タグのセットを含むことができる。いくつかの実施形態によって、標準試料を、図１に示すように、２段階で、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグで標識することができる。第１段階では、標準試料中のビタミンＤ分析物を、アセチル基を有するジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させることができる。第２段階では、ディールス・アルダー付加物を第１の同重体タグで処理することができる。試験試料を、標準試料に対して用いたのと同様の２段階のプロセスで、第１の同重体タグとは異なる、同じ同重体タグのセットに由来する第２の同重体タグで標識することができる。その後、標識標準試料と標識試験試料を組み合わせることができ、得られた混合物を、逆相カラム上での液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離に供することができる。標識ビタミンＤ３および／またはビタミンＤ３代謝体は、異なる保持時間を有することができ、かつ別々の時間にカラムから溶出することができる。溶出ピークは、標識分析物を含むピークと、標識標準を含むピークとを含むことができる。図６は、標識ビタミンＤ３分析物のＨＰＬＣ分離を示す。その後、カラムからの溶出物を、マススペクトロメトリーを用いて分析することができる。

図７は、ＭＳＭＳを用いた標識ビタミンＤ３のマススペクトグラムを示す。いくつかの実施形態によって、同重体タグがアミノキシＭＳタグ化試薬である場合、レポーターシグナルをさらなるフラグメンテーション（ＭＳ^３）に供することができる。レポーターシグナルをさらなるフラグメンテーションに供することによって、標準データベースとの比較による分析物の確認的同定を可能にするピークを提供することができる。いくつかの実施形態によって、カラムからの溶出物を親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）に供することができる。

図８は、ＭＳ^３を用いて得られた標識ビタミンＤ３のマススペクトグラムを示す。試験試料から生成されたレポーターシグナルと比べた標準から生成されたレポーターシグナルのシグナル強度またはピーク面積の比は、標準試料と比べた試験試料中の分析物の濃度を示すことができる。

標準試料が既知濃度のビタミンＤ分析物を有する場合、ビタミンＤ分析物の絶対定量を、相対定量について上に記載したのと同じ方法で行なうことができることが理解されるべきである。また、ビタミンＤ３および／またはビタミンＤ３の代謝体が上述のものである場合、任意のビタミンＤ分析物を用いることができることが理解されるべきである。例えば、図１１は、本教示に従って標識されているビタミンＤ２のＭＳＭＳスペクトグラムを示す。

本教示のタグ化化学および方法論は、既知の方法と比べて増大した感度を提供し、^２Ｈを含有する、^１３Ｃを含有する、^１５Ｎを含有する、および^１８Ｏを含有するビタミンＤ分析物の標準に対する必要性をなくす。いくつかのビタミンＤ分析物の同位体標識標準は市販されておらず、そのため、本教示なしでは、これらの分析物の絶対定量が困難になっている。本教示によって、各分析物は、その独自の内部標準を有することができる。レポーターシグナルは、標準試料に、および試験試料に特異的なものであることができる。

同重体タグは多重化を可能にし、ビタミンＤ分析物の多重化分析についてこれまでに知られている唯一の方法を提供し、また、試料当たりのスループットが高くかつコストが低い分析を提供する。図３Ａおよび３Ｂに示すように、全てのビタミンＤ分析物中に１つの共通の官能基があるので、各分析物に１つのタグしか必要ない。いくつかの実施形態では、ＰＤＩＴＭを用いることによって、特異性が高くなり、エラーのリスクが減る。試薬設計によって、それがＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）適用のための優れたツールになり、分析物の正体の確認を助けるＭＳ^３性能が可能になる。

様々な実施形態によって、試料中のビタミンＤ分析物を定量する方法が提供されており、ここで、この方法は、ビタミンＤ分析物を１段階タグ化試薬、例えば、ディールス・アルダー付加物でタグ化することを含む。その後、生成物をマススペクトロメトリーを用いて分析することができる。様々な実施形態によって、タグ化試薬は、図１２Ａに示す構造を有する化合物を含むことができる。高エネルギー衝突下で、レポーター基を生成させる。レポーター基の強度またはピーク面積を定量に用いる。図１２Ａに示す１段階タグ化試薬は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種を、図１４および１５に示すようなレポーターイオンとして残し、その後、このレポーターイオンをＭＳ^３分析に供することができる。

いくつかの実施形態では、タグ化試薬は、図１２Ｂに示す構造を有する化合物を含むことができる。図１２Ｂに示す１段階タグ化試薬は、高エネルギー衝突によって、図１６に示すようなタグフラグメントを生成させ、その後、このレポーターイオンをＭＳ^３分析に供することができる。

本方法はさらに、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供し、かつ標準の既
知ビタミンＤ分析物を本教示による１段階タグ化試薬でタグ化して、標識標準を形成させることを含むことができる。その後、この標識標準を標識試料と混合して、混合物を形成させることができる。その後、この混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させることができ、かつこの分離された分析物を分析することができる。

いくつかの実施形態では、標識標準に用いられる１段階試薬は、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含むことができる。標識試料は、同じ同重体タグのセットに由来するが、第１の同重体タグとは異なる、第２の同重体タグを含むことができる。その後、標識試料を、マススペクトロメトリー、標識試料のＬＣ−ＭＳＭＳ分析、それらの組合せなどを用いて分析することができる。

いくつかの実施形態では、標識標準に用いられる１段階試薬は、質量差タグのセットに由来する第１の質量差タグを含むことができる。標識試料は、同じ質量差タグのセットに由来するが、第１の質量差タグとは異なる、第２の質量差タグを含むことができる。その後、標識試料を、マススペクトロメトリー、標識試料のＬＣ−ＭＳＭＳ分析、それらの組合せなどを用いて分析することができる。

いくつかの実施形態では、三連四重極ＭＳプラットフォームを用いて標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を行なう。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８ Ａ１号に記載されている。上述のように、いくつかの実施形態では、１段階タグ化試薬は、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す。いくつかの実施形態では、１段階タグ化試薬は、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントとなるレポーターイオンを形成させる。

様々な実施形態によって、ビタミンＤ分析物は、複数の異なるビタミンＤ分析物を含むことができ、標識することは、複数の異なるそれぞれのタグ化試薬、例えば、各々異なるタイプの分析物についての異なるタグ化試薬で各々標識することを含むことができる。分析すべき代謝体であって、その検出のためにキットを構成することができる代謝体は、ビタミンＤ２の分析物、例えば、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはビタミンＤ２のジヒドロキシ代謝体を含むことができる。いくつかの実施形態では、代謝体はビタミンＤ３の代謝体であり、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはビタミンＤ３のジヒドロキシ代謝体を含むことができる。

様々な実施形態によって、本教示は、本明細書でビタミンＤ分析物と総称される、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、および／またはビタミンＤファミリー由来の代謝体のうちの１つまたは複数の定量方法を提供する。ビタミンＤ分析物は、例えば、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ならびに／またはビタミンＤ２もしくはビタミンＤ３のモノヒドロキシ、ジヒドロキシおよびトリヒドロキシ代謝体を含むことができる。様々な実施形態によって、１種以上のビタミンＤ分析物の定量方法は、分析物を修飾し、その後、マススペクトロメトリーを用いて質量分析する１段階化学反応を含むことができる。様々な実施形態によって、この１段階化学反応は、ビタミンＤ分析物中の共役ジエン官能基を誘導体化して、ジエノフィル含有タグ化試薬を分析物に付着させ、図１３〜１６に例示するような、ディールス・アルダー付加物を形成させることができる。図１３〜１６は、４つの異なる１段階タグ化試薬と、それぞれの１段階タグ化試薬の部分を含むことができる例示的な置換基とを用いる、４つの異なるそれぞれの反応を示している。

図１７は、各々のセットが、本教示の様々な実施形態による、４重アッセイで用いることができる４つの異なる試薬を含む、例示的な２つの異なる同重体タグのセットを示す。様々な実施形態では、重原子同位体を分子上の様々な位置に配置することができる。

図１８は、各々のセットが、本教示の様々な実施形態による、４重アッセイで用いることができる４つの異なる試薬を含む、例示的な２つの異なる質量差タグのセットを示す。様々な実施形態では、重原子同位体を分子上の様々な位置に配置することができる。

図１９は、本教示の様々な実施形態による、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３（ＰＴＡＤはクックソン型試薬である）；および非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３のフラグメンテーションパターンを比較したものである。図１９に示すように、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３は、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３のスペクトルまたは非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３のスペクトルと比べて、きれいなマススペクトルを生成させる。

図２０は、本教示の様々な実施形態による、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３、および非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３のシグナル強度を比較したものである。図２０に示すように、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の場合、ＰＴＡＤ １α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３と比べて、平均１１倍の感度の増大があり、ＱＡＯ−Ｃ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の場合、非誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３と比べて、平均１９２倍の感度の増大があった。

図２１は、液体クロマトグラフィーで分離されている同重体ジヒドロキシビタミンＤ−３代謝体を示す。本教示の様々な実施形態によって、図２１に示すように、分離されなければ、１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３を妨害することがあるビタミン−Ｄ_３異性体が分離される。

図２２は、本教示の様々な実施形態による、ヒト血清試料中のビタミン−Ｄ_３異性体からの１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の分離を示す。

図２３は、本教示の様々な実施形態による、ヒト血清試料の分析におけるビタミン−Ｄ_３異性体からの１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の分離を示す。

図２４は、本教示の様々な実施形態による、２回の試行由来の男性血清試料中で検出された１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の量を示す。

図２５は、本教示の様々な実施形態による、２回の試行由来の女性血清試料中で検出された１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３の量を示す。

いくつかの実施形態では、タグ化化学および本方法は、任意の三連四重極装置、例えば、ＭａｌｄｉソースとともにＦｌａｓｈＱｕａｎｔ（商標）を含む装置を用いて実施することができる。試薬キット、データ分析ソフトウェア、およびＭＳプラットフォームは、いくつかの実施形態では、ビタミンＤ３およびその代謝体の分析器として提供される。同じ方法をビタミンＤ２およびその代謝体に利用することができる。

本教示の様々な実施形態によって用いることができる様々な液体クロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリーの方法、システム、およびソフトウェアとしては、２００９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１８２，７４８号明細書、および２００６年８月１７日に公開された米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８ Ａ１号明細書に記載されているものが挙げられる。これらの参考文献は両方とも、その全体が参照
により本明細書に組み込まれる。

本教示の様々な実施形態によって、ジエノフィル試薬およびアミノキシＭＳタグ化試薬のうちの１つまたは複数を含むことができるキットが提供される。いくつかの実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬は、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、

であり、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、各々独立に、水素原子もしくはアルキル基であり、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、もしくは１〜５であることができる。）；または構造：
Ｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
（式中、Ｒは、次の５つの構造

のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であることができる。）
を有する化合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｒは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｐｐｉｎらに対する米国特許第７，１９５，７５１号明細書に記載のタグ化試薬に関連して記載されているＲ基のいずれかであることができる。

いくつかの実施形態では、キットは、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む少なくとも１つの標準を含むことができる。いくつかの実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬は、同重体タグのセットに由来する同重体タグであることができ、いくつかの実施形態では、キットは、同重体タグのセットに由来する複数の異なる同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態によって、アミノキシＭＳタグ化試薬は、質量差タグのセットに由来する質量差タグであることができ、いくつかの実施形態では、キットは、質量差タグのセットに由来する複数の異なる質量差タグを含むことができる。いくつかの実施形態によって、キットは、ジエノフィル試薬、アミノキシＭＳタグ化試薬、既知ビタミンＤ分析物を含む標準および／または既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含むことができ、かつビタミンＤ分析物を標識するための指示書をさらに含むことができる。

本教示のさらに他の実施形態によって、キットは、図１２Ａに示すような１段階タグ化試薬、図１２Ｂに示すような１段階タグ化試薬、それらの組合せなどを含むことができる。キットは、既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含むこともできる。いくつかの実施形態
では、標準は、既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットに含まれる１段階タグ化試薬は、同重体タグのセットに由来する１種以上の同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、同重体タグのセットに由来する複数の異なる同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットに含まれる１段階タグ化試薬は、質量差タグのセットに由来する１種以上の質量差タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、質量差タグのセットに由来する複数の異なる質量差タグを含むことができる。

様々な実施形態によって、キットは、緩衝液、１つ以上のクロマトグラフィーカラム、および任意でアッセイの実施に有用な他の試薬および／または成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、使用者が試料を添加する必要しかないようなホモジニアスアッセイを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、較正または正規化用の試薬または標準を含むことができる。アッセイを実施するために用いることができるか、またはアッセイを実施するために用いるべき機器の設定に関する情報も、キットに含めることができる。いくつかの実施形態では、試料調製、操作条件、容量、温度設定などに関する情報がキットに含まれる。

キットは、１つ以上の試薬容器および適切な指示書を含む密閉容器に包装することができる。１つ以上のアッセイ、測定値、トランジションペア、操作指示書、操作を実行するためのソフトウェア、それらの組合せなどに関する電子情報をその上に保存した、電子媒体をキットに含めることができる。

様々な実施形態によって、ＱＡＯＣ試薬およびその中間体の合成のための方法を提供することができる。

本教示の態様は、本教示の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない以下の実施例を踏まえてさらに理解することができる。
実施例１
ＱＡＯＣ試薬の合成における工程の説明：

ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルベトキシセミカルバジド（１）の合成：
カルバジン酸エチル（６．４６ｇ、６２．０５ｍｍｏｌ）のトルエン（１００ｍＬ）溶液に、４−アセチルフェニルイソシアネート（１０ｇ、６２．０５ｍｍｏｌ）のトルエン（２５０ｍＬ）溶液を滴加した。反応混合物を室温で２時間、その後、８０℃で２時間撹拌した。反応液中に形成された沈殿を濾過し、真空オーブン中で乾燥させると、ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルベトキシセミカルバジド１（１６．５ｇ、９０％）が得られた。それを、さらに精製することなく、次の反応工程で用いた。（合成は以下の文献から取り入れた：Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．６，ｐ．９３６（１９８８）；Ｖｏｌ．５１，ｐ．１２１（１９７１）．４−ＰＨＥＮＹＬ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＩＮＥ−３，５−ＤＩＯＮＥ）。様々な態様では、本実施例で用いられる成分の各々の値を約５％〜約２０％の範囲の量だけ増加または減少させることができ、例えば、各成分を、本実施例で用いられる値よりも５％少ない量から５％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１０％少ないもしくは１０％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１５％少ない量から１５％多い量で用いることができるか、または各成分を、本実施例で用いられる値よりも２０％少ない量から２０％多い量で用いることができる。様々な態様では、これらの値を約±５％〜２０％だけ変化させることができる。
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール（２）の合成：
ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルベトキシセミカルバジド１（１５ｇ、５６ｍｍｏｌ）を４Ｍ ＫＯＨ水溶液（２８ｍＬ、１１２ｍｍｏｌ）とともに７０℃で約２時間加熱した。残った粒状固体を、焼結フィルター漏斗を用いて濾過除去した。濾液を室温に冷却し、濃ＨＣｌで酸性化した。形成された沈殿を濾過し、真空オーブン中で乾燥させると、ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２が薄黄色の固体（１２．４ｇ、８５％）として得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：ｓ＝１．６５（ｓ，３Ｈ），６．７０（ｄ，２Ｈ），７．１０（ｄ，２Ｈ），９．５０（ｓ，２Ｈ）。（合成は以下の文献から取り入れた：Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．６
，ｐ．９３６（１９８８）；Ｖｏｌ．５１，ｐ．１２１（１９７１）．４−ＰＨＥＮＹＬ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＩＮＥ−３，５−ＤＩＯＮＥ）。様々な態様では、本実施例で用いられる成分の各々の値を約５％〜約２０％の範囲の量だけ増加または減少させることができ、例えば、各成分を、本実施例で用いられる値よりも５％少ない量から５％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１０％少ないもしくは１０％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１５％少ない量から１５％多い量で用いることができるか、または各成分を、本実施例で用いられる値よりも２０％少ない量から２０％多い量で用いることができる。様々な態様では、これらの値を約±５％〜２０％だけ変化させることができる。
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール臭化４級アミノオキシ付加物（４）の合成：
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２（２．１０ｇ、９．５８ｍｍｏｌ）と４級アミノオキシタグ３（１００ｍＬのメタノール−酢酸（９５：５ ｖ／ｖ）中、６．７４ｇ、２０．６ｍｍｏｌの懸濁液（標識試薬としての４級アミノオキシタグは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１−０００３３９５号明細書に記載されている）を周囲温度で４８時間撹拌した。この段階でのＨＰＬＣ分析により、２の生成物ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール４級アミノオキシ付加物４への９５％変換が示された。カラム：ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ１８、３．９×１５０ｍｍ、緩衝液Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル＋０．０８５％ＴＦＡ、波長（シグナル＝２５４ｎｍ、参照＝３６０ｎｍ）、流量＝１ｍＬ／分。分析物の濃度は、メタノール中、約０．２５ｍｇ／ｍＬであった。ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２の保持時間＝５．１分、およびｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール４級アミノオキシ付加物４の保持時間＝５．５分。ＥＳ−ＭＳデータ：Ｍ＋（計算Ｍ＋＝Ｃ_１６Ｈ_２４Ｎ_５Ｏ_３＋＝３３４．１９）、観測Ｍ＋＝３３４．２０および２７５．５０（−Ｍｅ_３Ｎ））。メタノールの除去後、粗生成物を白色の固体として単離した。様々な態様では、本実施例で用いられる成分の各々の値を約５％〜約２０％の範囲の量だけ増加または減少させることができ、例えば、各成分を、本実施例で用いられる値よりも５％少ない量から５％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１０％少ないもしくは１０％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１５％少ない量から１５％多い量で用いることができるか、または各成分を、本実施例で用いられる値よりも２０％少ない量から２０％多い量で用いることができる。様々な態様では、これらの値を約±５％〜２０％だけ変化させることができる。

対イオン交換：そのようにして得られた固体を４０ｍＬの水に溶解させ、そのうちの３０ｍＬ（１１．５０ｍｍｏｌの４）を交換に用いた。（５０ｍＬファルコンチューブ中）この溶液に、ヘプタフルオロ酪酸銀（１５ｍＬの脱イオン水中３．６９ｇ、１１．５３ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加し、チューブをはじいて短く混合した。沈殿を３０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により分離した。ヘプタフルオロ酪酸銀の希釈溶液（１滴）を添加して、上清に臭化物イオン（Ｂｒ−）がないかを調べた。濁りの形成は、Ｂｒ−の存在を示す。臭化物イオンの完全な沈殿を確実にするために、さらに０．２当量（５ｍＬ水中、０．７３８ｍｇ）のヘプタフルオロ酪酸銀を添加し、混合し、遠心分離し、Ｂｒ−がないかを調べた。透明な溶液は、全てのＢｒ−の完全な消費を示す。濾液をシリンジに採取し、５ミクロンフィルター（２５ｍｍ、Ｍｉｌｌｅｘ ＬＣＲ、ＰＴＥＦ、２５ｍＬ／フィルター）に通して再濾過し、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（２回に分けて精製した：４３ｇ、Ｃ１８ Ｉｓｃｏカラム、流量＝４０ｍＬ／分、溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：メタノール、カラムは、１００ｍＬの５０％Ｂ、その後、２５０ｍＬの２％Ｂで平衡化した。試料を溶液としてカラムに充填し、０〜６分間は２％Ｂ、その後、６〜３５分間は２〜８５％Ｂとした。波長＝２５４ｎｍ）。生成物を含む画分を、純度について分析的ＨＰＬＣで分析、純粋な（＞９５％）画分をプールして、ロータリーエバポレーター内で乾燥させると、ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール４級アミノオキシ付加物ヘプタフルオロブチレート５が白色の固体として得られた。固体を２０ｍＬのトルエンとともに共蒸発
させ、水の完全な除去を確実にするために真空下で乾燥させた。最終的な収量およびＨＰＬＣ純度は、２．６ｇ（６５％）および＞９８％であった。様々な態様では、本実施例で用いられる成分の各々の値を約５％〜約２０％の範囲の量だけ増加または減少させることができ、例えば、各成分を、本実施例で用いられる値よりも５％少ない量から５％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１０％少ないもしくは１０％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１５％少ない量から１５％多い量で用いることができるか、または各成分を、本実施例で用いられる値よりも２０％少ない量から２０％多い量で用いることができる。様々な態様では、これらの値を約±５％〜２０％だけ変化させることができる。
ＱＡＯ−Ｃ試薬（６）の合成：
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール４級アミノオキシ付加物ヘプタフルオロブチレート５（８００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、アルゴン雰囲気下）の冷懸濁液に、ｔＢｕＯＣｌ（７ｍＬの無水アセトニトリル中０．１７５ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら滴加した（２〜３分間の添加）。添加し終わった後、反応液を０〜５℃で３０分間撹拌した。アセトニトリルを（窒素を通気した）ロータリーエバポレーターで除去し、ピンク色の固体を（一面のアルゴンの下、パスツールピペットで上から除去される）無水ＥｔＯＡｃで洗浄した。真空下で乾燥させた後、０．６５ｇ（８０％）の６が橙赤色｛とうせきしょく｝の固体として得られた。生成物を湿気をなくして−４０℃で保存し、明る
い光から保護した。様々な態様では、本実施例で用いられる成分の各々の値を約５％〜約２０％の範囲の量だけ増加または減少させることができ、例えば、各成分を、本実施例で用いられる値よりも５％少ない量から５％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１０％少ないもしくは１０％多い量で用いることができるか、各成分を、本実施例で用いられる値よりも１５％少ない量から１５％多い量で用いることができるか、または各成分を、本実施例で用いられる値よりも２０％少ない量から２０％多い量で用いることができる。様々な態様では、これらの値を約±５％〜２０％だけ変化させることができる。
試料の調製および分析に用いられる他の化学物質および試薬：
１．内部標準：１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３（２６，２６，２６，２７，２７，２７−ｄ_６）。［ｄ６−１，２５ ＤＨＶＤ_３］
供給元：Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．Ｐｅｌｈａｍ，ＮＨ．製品番号：Ｄ３２２２、１ｍｇ。

２．分析物：１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３
供給元：ＴＲＣ，Ｃａｎａｄａ，製品番号：Ｃ１４４５００、１ｍｇ。

３．溶媒：
ａ）ジイソプロピルエーテル：供給元：Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号３８２７９
ｂ）ヘキサン（ＨＰＬＣ等級）：供給元：ＪＴ ＢＡＫＥＲ、製品番号９３０４−０３
ｃ）イソプロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）：供給元：Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号２７８４７５
ｄ）メタノール（ＨＰＬＣ等級）：供給元、ＡＣＲＯＳ、ＡＣ６１００９−００４０
ｅ）アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）：供給元、ＥＭＤ、製品番号ＡＸ０１４５−１
ｆ）脱イオン水
ｇ）ギ酸（ＭＳ等級）：供給元、Ｆｌｕｋａ、製品番号５６３０２
ｈ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：供給元、Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号２７０５４７
４．ＨＰＬＣおよび固相カートリッジおよび供給元：
ａ）Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ ２４位置コレクションラック：供給元、Ｍａｃｈｅｒｅｙ
Ｎａｇｅｌ、製品番号７３０５０８
ｂ）異なるカラムの組合せ用のＣｈｒｏｍａｂｏｎｄアダプター：供給元、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、製品番号７３０１０１
ｃ）ＣｈｒｏｍａｂｏｎｄカラムＸＴＲ、６ｍｌ、１０００ｍｇ ＢＩＧ：供給元、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、製品番号７３０４８７．２５０
ｄ）Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃシリカカートリッジ６ｃｃ／５００ｍｇ ５５−１０５μｍ ３０本／箱：供給元、Ｗａｔｅｒｓ、製品番号ＷＡＴ０４３４００
ｅ）５ｍＬ ＰＰバイアル：供給元、ＶＷＲ、製品番号１６４６５−２６２
ｆ）ＶＷＲ（登録商標）培養チューブ、使い捨て、Ｆｌｉｎｔ Ｇｌａｓｓ １６×１５０ｍｍ：供給元、ＶＷＲ、製品番号６０８２５−４３５
ｇ）マイクロ遠心チューブ１．７ｍＬ：供給元、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号２０１７２−６９８
ｈ）マイクロ遠心チューブ０．６５ｍＬ：供給元、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号２０１７２−９１０
ｉ）ＨＰＬＣバイアルおよびキャップ：供給元、Ａｇｉｌｅｎｔ、製品番号９３０１−０９７８および５１８２−０５４０
５．機器およびＨＰＬＣカラム：
ａ）１３ｍｍバイアルおよび０．６５ｍＬ遠心分離チューブ用のローターを備えた高速真空濃縮機
ｂ）小型遠心分離機
ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅボルテックスシェーカー
ｄ）タイマー
ｅ）５５００ ＱＴＲＡＰマススペクトロメーター
ｆ）島津ＵＰＬＣ
ｇ）ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ、製品番号１８６００２３５２
ｈ）必要なバイアルラックおよびホルダー
ｉ）交差汚染を避けるために、Ｒａｉｎｉｎ製のＲＴ １０００Ｆ、ＲＴ ２００ＦおよびＲＴ ２０Ｆチップとともに用いられる５ｍＬ、１ｍＬ、２００μＬおよび２０μＬピペット（推奨）。
固相抽出および誘導体化方法
１．シリカカートリッジ上に内部標準（１５μＬのＤＭＦ中、１５０ｐｇのｄ６−ｌ，２５ ＤＨＶＤ_３）をスパイクする。

２．アダプターを用いてコレクションラック上でＣｈｒｏｍａｂｏｎｄ ＸＴＲとシリカカートリッジを組み立てる。Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ ＸＴＲカートリッジが上になるようにする。ガラス管をシリカカートリッジの下に配置して、洗浄液を回収する。

３．血漿または血清試料を周囲温度に平衡化し、短くボルテックス処理して、均一な懸濁液を得、１．７ｍＬマイクロ遠心チューブ中に２００μＬを分注する。７００μＬの水で希釈し、３０秒間ボルテックス処理し、スピンダウンする。

４．希釈した試料をＣｈｒｏｍａｂｏｎｄ ＸＴＲカラムに充填し、１０分間待つ（タイマーを用いる）。

５．シリカカラムに対してジイソプロピルエーテル（４×１ｍＬ）を用いて、Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ ＸＴＲカラムを溶出させる。溶出工程と溶出工程の間で３分間待つ（タイマーを用いる）。

６．Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ ＸＴＲカラムを取り外して廃棄し、ヘキサン中の４％（２×４．５ｍＬ）および６％（２×３ｍＬ）のｉＰｒＯＨでシリカカラムを洗浄する。洗浄液とガラス管を廃棄する。

７．ヘキサン（４．５ｍＬ）中の２５％のｉＰｒＯＨで１，２５ ＤＨＶＤ_３を５ｍＬチューブに溶出させ、スピードバック中、周囲温度で乾燥させる。

８．３００μＬのＭｅＯＨをこの５ｍＬチューブに添加し、１分間ボルテックス処理し、スピンダウンし、このＭｅＯＨ溶液を０．６５ｍＬマイクロ遠心分離チューブに移し、スピードバック中、周囲温度で乾燥させる。

９．誘導体化：ＱＡＯ−クックソン試薬（２０μＬ、アセトニトリル中、０．５ｍｇ／ｍＬ）をこの０．６５ｍＬマイクロ遠心分離チューブに添加し、１５秒間ボルテックス処理し、スピンダウンする。これらの試料全ての１回目のボルテックス処理が終わった後、このボルテックス処理工程をもう１回繰り返す。全てのチューブをスピンダウンし、周囲温度で３０分間待つ。

ＱＡＯ−クックソン試薬溶液を固体試薬から新たに作製し、１時間の誘導体化工程のうちに用いることができる。試薬は、アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬの濃度まで良好な溶解度を有する。

１０．２０μＬの水を添加し、混合し、スピンダウンし、この溶液をＨＰＬＣバイアルに移して、分析する。
ＬＣ−ＭＳ法
コメント：ＤＨＶＤ３＿Ｃ１８＿２．１×１００ｍｍ １．７ｕＡｃｑｕｉｔｙ＿０８５３０２５４１５６ ２１＿Ｄｅｃ０２＿２０１０
同期モード：ＬＣ Ｓｙｎｃ
自動平衡化：オフ
収集時間：３分６０秒
スキャン回数：７７４回
ファイル中の周期：１
収集モジュール：収集方法
ソフトウェアバージョン Ａｎａｌｙｓｔ １．５．１

ＭＳ法の特徴：
周期１：
−−−−−−−−
周期中のスキャン：７７４回
相対開始時間：０．００ｍｓｅｃ
周期中の実験：１
周期１ 実験１：
−−−−−−−−
スキャンタイプ：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
定期ＭＲＭ：なし
極性：ポジティブ
スキャンモード：Ｎ／Ａ
イオン供給源：ターボスプレー
分解能Ｑ１：ユニット
分解能Ｑ３：ユニット
強度閾値：０．００ｃｐｓ
整定時間：０．００００ｍｓｅｃ
ＭＲ一時停止：５．００７０ｍｓｅｃ
ＭＣＡ：なし
段階サイズ：０．００Ｄａ

＠Ｑ１ Ｍａｓｓ（Ｄａ） Ｑ３ Ｍａｓｓ（Ｄａ）Ｄｗｅｌｌ（ｍｓｅｃ） Ｐａｒａｍ Ｓｔａｒｔ Ｓｔｏｐ ＩＤ ７４８．５００ ６８９．４００ １５０．００
ｄ０ＤＨＶＤ３（１，２５：２４，２５，２３：２５）＿ＮｅｕＬ

＠Ｑ１ Ｍａｓｓ（Ｄａ） Ｑ３ Ｍａｓｓ（Ｄａ）Ｄｗｅｌｌ（ｍｓｅｃ） Ｐａｒａｍ Ｓｔａｒｔ Ｓｔｏｐ ＩＤ ７５４．５４０ ６９５．４００ １５０．００
ｄ６ＤＨＶＤ３（１，２５：２４，２５：２３，２５）＿ＮｅｕＬ

パラメータ表（周期１ 実験１）：
ＣＵＲ：２５．００
ＩＳ：３５００．００
ＴＥＭ：６５０．００
ＧＳ１：５０．００
ＧＳ２：５５．００
ＣＡＤ：ミディアム
ＤＰ ８０．００
ＥＰ １０．００
ＣＥ ４３．００
ＣＸＰ １５．００

一体型Ｈａｒｖａｒｄシリンジポンプ法の特徴（未使用）
シリンジ直径（ｍｍ）：４．６１
流速：７．０００ｕＬ／分

島津ＬＣ法の特徴
島津ＬＣシステム平衡時間＝４．００分
島津ＬＣシステム注入容量＝２０．００ｕｌ
島津ＬＣ法パラメータ
ポンプ
＝＝＝＝＝
ポンプＡモデル：ＬＣ−２０ＡＤ
ポンプＢモデル：ＬＣ−２０ＡＤ
ポンプモード：バイナリーフロー
総流量：０．７０００ｍＬ／分
ポンプＢ濃度：５．０％
Ｂ曲線：０
圧力範囲（ポンプＡ／Ｂ）：０〜１４２２ｐｓｉ
オートサンプラー
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
モデル：ＳＩＬ−２０ＡＣ
リンス容量：２００ｕＬ
ニードルストローク：５２ｍｍ
リンス速度：３５ｕＬ／秒
サンプリング速度：１５．０ｕＬ／秒
パージ時間：２５．０分
リンス浸漬時間：０秒
リンスモード：吸引の前後
クーラー対応：あり
クーラー温度：５℃
コントロールバイアルのニードルストローク：５２ｍｍ
ポンプ方法：リンスポートのみ
リンス時間：２秒
オーブン
＝＝＝＝
モデル：ＣＴＯ−２０Ａ
温度調節：可能
温度：４０℃
最大温度：５０℃
システムコントローラ
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
モデル：ＣＢＭ−２０Ａ
電源：オン
イベント１：オフ
イベント２：オフ
イベント３：オフ
イベント４：オフ
時間プログラム
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

本教示の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に開示された本教示の実施から当業者に明らかになるであろう。本明細書および実施例は単に例示的なものと考えられることが意図される。

Claims (39)

1. 試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
   ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させること；
   前記ディールス・アルダー付加物をアミノキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で標識して、標識付加物を形成させること；および
   マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること、
   を含み、
   前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
   Ｒ−（ＣＨ _２ ） _ｎ −ＯＮＨ _２
   （式中、Ｒは、
   
   であり、Ｒ _１ 、Ｒ _２ 、およびＲ _３ は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、
   方法。
2. 既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
   前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、標準ディールス・アルダー付加物を形成させること；
   前記標準ディールス・アルダー付加物をアミノキシＭＳタグ化試薬で標識して、標識標準付加物を形成させること；
   前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
   前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること
   をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記標準ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含み、かつ前記ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、前記第１の同重体タグとは異なる前記同重体タグのセットに由来する第２の同重体タグを含む、請求項２に記載の方法。
4. マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
5. 三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す、請求項４に記載の方法。
7. 前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時に荷電フラグメントを失う、請求項４に記載の方法。
8. 前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成させる、請求項４に記載の方法。
9. 前記ビタミンＤ分析物が複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記ビタミンＤ２の代謝体が、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１に記載の方法。
12. 包装中に、ジエノフィル試薬およびアミノキシＭＳタグ化試薬を含むキットであって、
    前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
    Ｒ−（ＣＨ _２ ） _ｎ −ＯＮＨ _２
    （式中、Ｒは、
    
    であり、Ｒ _１ 、Ｒ _２ 、およびＲ _３ は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、
    キット。
13. 既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項１２に記載のキット。
14. 既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項１２に記載のキット。
15. 前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、同重体タグのセットに由来する同重体タグを含み、かつ前記キットが、前記同重体タグのセットに由来する同重体タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
16. 前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、請求項１２に記載のキット。
17. 試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
    ビタミンＤ分析物をジエノフィル含有１段階タグ化試薬で処理して、標識ディールス・アルダー付加物を形成させること；および
    マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること
    を含み、
    前記１段階タグ化試薬が以下の構造：
    
    （式中、
    
    である。）を有する化合物を含む、
    方法。
18. 既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
    前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物を１段階ジエノフィル含有標識ディールス・アルダー試薬で処理して、標識標準付加物を形成させること；
    前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
    前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること；
    をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記標準を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、同重体タグのセットに由来する第１の同重体タグを含み、かつ前記試料を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、前記第１の同重体タグとは異なる前記同重体タグのセットに由来する第２の同重体タグを含む、請求項１８に記載の方法。
20. マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、請求項１７に記載の方法。
21. 三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ビタミンＤ分析物が、複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、請求項１７に記載の方法。
23. 前記ビタミンＤ２の代謝体がビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１７に記載の方法。
24. 前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１７に記載の方法。
25. 包装中に、ジエノフィルを含有する標識ディールス・アルダー試薬を含む、キットであって、
    前記標識ディールス・アルダー試薬が、以下の構造：
    
    （式中、Ｒは、
    
    であり、Ｒ _１ 、Ｒ _２ 、およびＲ _３ は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、
    キット。
26. 既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項２５に記載のキット。
27. 既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項２５に記載のキット。
28. 前記標識ディールス・アルダー試薬が、同重体タグのセットに由来する同重体タグを含み、かつ前記キットが、前記同重体タグのセットに由来するそれぞれの同重体タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
29. 前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、請求項２５に記載のキット。
30. 前記複数の異なるタグ化試薬が同重体タグを含む、請求項２２に記載の方法。
31. 前記同重体タグが以下の構造：
    から選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、請求項２２に記載の方法。
33. 前記質量差タグが以下の構造：
    から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記複数の異なるタグ化試薬が同重体タグを含む、請求項９に記載の方法。
35. 前記同重体タグが以下の構造：
    から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、請求項９に記載の方法。
37. 前記質量差タグが以下の構造：
    から選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来する質量差タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
39. 前記標識ディールス・アルダー試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来するそれぞれの質量差タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、請求項２５に記載のキット。