CN112154216A - 生物分子探针以及检测基因和蛋白表达的方法 - Google Patents

生物分子探针以及检测基因和蛋白表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明除了其他以外涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多重检测和定量蛋白和/或核酸表达的探针、组合物、方法和试剂盒，其适应于供现有测序技术使用。

Description

生物分子探针以及检测基因和蛋白表达的方法
发明背景
本申请要求2018年2月12日提交的美国临时申请No. 62/629,180和2018年11月26日提交的美国临时申请No. 62/771,212的优先权和利益。每个前述专利申请的内容都整体引入本文作为参考。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，且特此整体引入作为参考。所述ASCII副本于2019年2月1日创建，被命名为“NATE-037_001WO.txt”，并且大小为48.4 KB。
发明背景
标准的免疫组织化学和原位杂交方法允许同时检测最多六到十种蛋白或核酸靶，而三到四种靶是典型的。存在用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多重检测和定量蛋白和/或核酸表达的探针、组合物、方法和试剂盒的需要。此外，需要这种系统可适应于供已经对大量最终用户可用的现有测序技术使用。
发明内容
本公开内容涉及用于在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多重、空间检测和定量蛋白和/或核酸表达的探针、组合物、方法和试剂盒。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸（identifier oligonucleotide）的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）向所述释放的标识符寡核苷酸连接至少一种核酸衔接子，其中所述核酸衔接子包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、包含独特分子标识符（unique molecular identifier）的核酸序列、第一扩增引物结合位点、第二扩增引物结合位点和任选的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列；（5）扩增步骤（4）中产生的连接产物；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）向所述释放的标识符寡核苷酸连接至少一种核酸衔接子，其中所述核酸衔接子包含：包含独特分子标识符的核酸序列、第一扩增引物结合位点、第二扩增引物结合位点和任选的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列，并且其中所述第一或第二扩增引物结合位点中的至少一个鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置；（5）扩增步骤（4）中产生的连接产物；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）向所述释放的标识符寡核苷酸连接至少一种核酸衔接子，其中所述核酸衔接子包含：包含独特分子标识符的核酸序列、第一扩增引物结合位点、第二扩增引物结合位点和任选的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列；（5）使用能够结合所述第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合所述第二扩增引物结合位点的第二扩增引物扩增步骤（4）中产生的延伸产物，其中所述扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
步骤（4）的核酸衔接子可以是部分双链核酸分子。部分双链核酸衔接子可包含双链退火区、第一单链错配区和第二单链错配区。第一单链错配区和第二单链错配区可存在于双链退火区的相对侧。
鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以存在于部分双链核酸衔接子的双链退火区中。
将连接偏差减至最小的恒定核酸序列可以存在于部分双链核酸衔接子的双链退火区中。
独特分子标识符可以存在于部分双链核酸衔接子的第一或第二单链错配区的至少一个中。
第一扩增引物结合位点可存在于部分双链核酸衔接子的第一单链错配区中且第二扩增引物结合位点可以存在于相同的部分双链核酸衔接子的第二单链错配区中。
在前面描述的本公开内容的方法可以进一步包括在步骤（4）之前进行末端修复反应。所述方法还可进一步包括在步骤（4）之前，进行加尾反应以将单核苷酸突出端附着至标识符寡核苷酸的3'端。所述方法可以进一步包括在步骤（4）之前，进行末端修复反应和加尾反应，以将单核苷酸突出端附着至标识符寡核苷酸的3'端。加尾反应和末端修复反应可以顺序或同时进行。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点和鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）向所述释放的标识符寡核苷酸连接至少一种核酸衔接子，其中所述核酸衔接子包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列、第二扩增引物结合位点和任选的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列；（5）扩增步骤（4）中产生的连接产物；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含：第一扩增引物结合位点和鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）向所述释放的标识符寡核苷酸连接至少一种核酸衔接子，其中所述核酸衔接子包含：包含独特分子标识符的核酸序列、第二扩增引物结合位点和任选的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列；（5）使用能够结合所述第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合所述第二扩增引物结合位点的第二扩增引物扩增步骤（4）中产生的延伸产物，其中所述扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
步骤（4）的核酸衔接子可以是部分双链核酸分子。部分双链核酸衔接子可包含双链退火区和单链错配区。
鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以存在于部分双链核酸衔接子的双链退火区中。
将连接偏差减至最小的恒定核酸序列可以存在于部分双链核酸衔接子的双链退火区中。恒定核酸序列也可以包含可切割的部分。可切割的部分可以是酶促可切割的部分。酶促可切割的部分可以是USER序列。
独特分子标识符可以存在于部分双链核酸衔接子的单链错配区中。
第二扩增引物结合位点可以存在于部分双链核酸衔接子的单链错配区中。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点和鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使单链核酸模板与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述核酸模板包含与所述标识符寡核苷酸的独特核酸序列互补的区域、包含独特分子标识符的核酸序列、与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列和任选的亲和分子；（5）延伸步骤（4）的标识符寡核苷酸以形成与所述单链核酸模板互补的延伸产物，其中所述延伸产物包含标识符寡核苷酸、与所述独特分子标识符互补的核酸序列和第二扩增引物结合位点；（6）使用能够结合所述第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合所述第二扩增引物结合位点的第二扩增引物扩增步骤（5）中产生的延伸产物，其中所述扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点和鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使单链核酸模板与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述核酸模板包含与所述标识符寡核苷酸的独特核酸序列互补的区域、鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列、与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列和任选的亲和分子；（5）延伸步骤（4）的标识符寡核苷酸以形成与所述单链核酸模板互补的延伸产物，其中所述延伸产物包含标识符寡核苷酸、与所述鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列互补的核酸序列、与所述独特分子标识符互补的核酸序列和第二扩增引物结合位点；（6）扩增步骤（5）中产生的延伸产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
单链核酸模板可以进一步包含亲和分子。在其中单链核酸模板包含亲和分子的方面，在前面描述的本公开内容的方法可以进一步包括步骤（4）和（5）之间的亲和纯化步骤。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第一扩增引物结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含独特分子标识符的核酸序列和第二扩增引物结合位点，且其中所述第一第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；（5）进行切口修复，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸和第一扩增引物结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸和第二扩增引物结合位点，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含：包含独特分子标识符的核酸序列，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；（5）进行切口修复，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第一扩增引物结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含独特分子标识符的核酸序列和第二扩增引物结合位点，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠；（5）进行缺口延伸和切口修复反应，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸和第一扩增引物结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸和第二扩增引物结合位点，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含：包含独特分子标识符的核酸序列，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠；（5）进行缺口延伸和切口修复反应，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
在其中鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列位于第一核酸探针上的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以位于第一扩增引物结合位点的5'。
在其中独特分子标识符位于第二核酸探针上的方面，所述独特分子标识符可以位于第二扩增引物结合位点的3'。
在其中在第一核酸探针中存在鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符可以位于第一扩增引物结合位点的5'。
在其中在第二核酸探针中存在鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符可以位于第二扩增引物结合位点的3'。
在其中在第一核酸探针中存在独特分子标识符并且在第二核酸探针中存在鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列的方面，所述独特分子标识符可以位于第一扩增引物结合位点的5'，且所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以位于第二扩增结合位点的3'。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、第一扩增引物结合位点、包含第一独特分子标识符的核酸序列和第一流动池（flow cell）结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含第二独特分子标识符的核酸序列、包含第三独特分子标识符的核酸序列和第二流动池结合位点，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；（5）进行切口修复，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、第一扩增引物结合位点、包含第一独特分子标识符的核酸序列和第一流动池结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含第二独特分子标识符的核酸序列和第二流动池结合位点，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含：包含第三独特分子标识符的核酸序列，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列，且其中所述第一第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；（5）进行切口修复，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸互补的核酸、鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、第一扩增引物结合位点、包含第一独特分子标识符的核酸序列和第一流动池结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸互补的核酸、包含第二独特分子标识符的核酸序列、包含第三独特分子标识符的核酸序列和第二流动池结合位点，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠；（5）进行缺口延伸和切口修复反应，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸互补的核酸、第一扩增引物结合位点、包含第一独特分子标识符的核酸序列和第一流动池结合位点，且其中所述第二核酸探针包含与所述标识符寡核苷酸互补的核酸、包含第二独特分子标识符的核酸序列和第二流动池结合位点，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含：包含第三独特分子标识符的核酸序列，并且其中所述第一或第二核酸探针中的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠；（5）进行缺口延伸和切口修复反应，从而使得杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
在其中在第一核酸探针中存在鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第一独特分子标识符的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第一独特分子标识符可以位于第一流动池结合位点的5'。
在其中在第二核酸探针中存在第二和第三独特分子标识符的方面，所述第二和第三独特分子标识符可以位于第二流动池结合位点的3'。
在一些方面，第一独特分子标识符可以存在于第一核酸探针中，并且可以位于第一流动池结合位点的5'。在其他方面，第二独特分子标识符可以存在于第二核酸探针中，并且可以位于第二流动池结合位点的3'。
在一些方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第三独特分子标识符可以存在于第一核酸探针中，并且可以位于第一流动池结合位点的5'。
在一些方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和第三独特分子标识符可以存在于第二核酸探针中，并且可以位于第二流动池结合位点的3'。
在一些方面，第三独特分子标识符可以存在于第一核酸探针中，并且可以位于第一流动池结合位点的5'。在所述相同的方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以存在于第二核酸探针中，并且可以位于第二流动池结合位点的3'。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列、第一扩增引物结合位点和第二扩增引物结合位点；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使用能够结合所述第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合所述第二扩增引物结合位点的第二扩增引物扩增所述释放的标识符寡核苷酸，其中所述扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；（5）通过对步骤（4）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容还提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列、第一扩增引物结合位点和第二扩增引物结合位点；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使用能够结合所述第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合所述第二扩增引物结合位点的第二扩增引物扩增所述释放的标识符寡核苷酸，其中所述扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列，且其中所述扩增引物的至少一种包含：包含独特分子标识符的核酸序列；和（5）通过对步骤（4）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列和捕获探针结合位点；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使捕获探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述捕获探针包含亲和分子和与所述捕获探针结合位点互补的区域；和（5）通过对步骤（4）中产生的扩增的杂交产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列、捕获探针结合位点和多重化探针（multiplexing probe）结合位点；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使捕获探针和多重化探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述捕获探针包含亲和分子和与所述捕获探针结合位点互补的区域，且其中所述多重化探针包含鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列和与所述多重化探针结合位点互补的区域；和（5）通过对步骤（4）中产生的杂交产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，其中所述第一核酸探针包含：与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含独特分子标识符的核酸序列、第一扩增引物结合位点，且其中所述第二核酸探针包含：与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸和第二扩增引物结合位点，且其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；（5）将杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
本公开内容提供了一种用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含：鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列、第一扩增引物结合位点和第二扩增引物结合位点；（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；（3）收集释放的标识符寡核苷酸；（4）扩增所述收集的标识符寡核苷酸；（5）通过对步骤（4）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
在本公开内容的所有方法中，连接过程可以是切口连接过程。切口连接过程可以是切口修复过程。
在本公开内容的所有方法中，测序可以是无酶测序方法。
在本公开内容的所有方法中，标识符寡核苷酸可以是双链的。在其中标识符寡核苷酸是双链的方面，所述标识符寡核苷酸的两条链中的至少一条可以包含至少两个分开的核酸分子。另一方面，标识符寡核苷酸的至少一个3'端可以包含单核苷酸突出端。
在本公开内容的所有方法中，标识符寡核苷酸可以是单链的。
在本公开内容的所有方法中，鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列可包含约5个核苷酸至约40个核苷酸，优选约35个核苷酸，更优选约10个核苷酸。
在本公开内容的所有方法中，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可包含约6个核苷酸至约15个核苷酸，优选约12个核苷酸，更优选约10个核苷酸。
在本公开内容的所有方法中，第一核酸探针或第二核酸探针中的至少一种可包含亲和分子。例如，第一核酸探针或第二核酸探针中的至少一种可以包含生物素。
在本公开内容的所有方法中，扩增引物结合位点可包含约18个核苷酸至约40个核苷酸，优选约32个核苷酸，更优选约25个核苷酸。扩增引物结合位点可包含i7序列，其中所述i7序列包含SEQ ID NO：1所示的序列。扩增引物结合位点可包含i5序列，其中所述i5序列包含SEQ ID NO：2所示的序列。
在本公开内容的所有方法中，扩增引物可包含流动池衔接子序列，其中所述流动池衔接子序列适合于测序。扩增引物可包含P5流动池衔接子序列，其中所述P5流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：3所示的序列。扩增引物可包含P7流动池衔接子序列，其中所述P7流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：4所示的序列。
在本公开内容的所有方法中，流动池结合位点可包含流动池衔接子序列，其中所述流动池衔接子序列适合于测序。流动池结合位点可包含P5流动池衔接子序列，其中所述P5流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：3所示的序列。流动池结合位点可包含P7流动池衔接子序列，其中所述P7流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：4所示的序列。
在本发明的所有方法中，扩增引物的至少一种可包含亲和分子。例如，扩增引物的至少一种可包含生物素。
在本公开内容的所有方法中，扩增可以包括进行PCR。进行PCR可以包括扩增引物。
扩增引物可包含流动池结合位点。扩增引物可包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列。扩增引物可包含与扩增引物结合位点互补的核酸序列。
上述方面中的任何一个都可以与任何其他方面组合。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在本说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确规定；例如，术语“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”被理解为单数或复数，并且术语“或”被理解为是包括在内的。作为例子，“一个要素”是指一个或多个要素。在整个说明书中，单词“包含（comprising）”或诸如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”的变化形式将被理解为意味着包括陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组。约可以被理解为在陈述的值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%之内。除非另外根据上下文是清楚的，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中，但是在下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都整体引入作为参考。本文引用的参考文献不被认为是请求保护的发明的现有技术。在有冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的，并不意图是限制性的。根据下面的详述和权利要求，本公开内容的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
当连同附图一起理解时，根据下面的详述，将更清楚地理解上述以及进一步的特征。
图1是本公开内容的双端（two-ended）衔接子连接方法的示意图。
图2是本公开内容的单端（one-ended）衔接子连接方法的示意图。
图3是本公开内容的具模板引物延伸方法的示意图。
图4是本公开内容的模板延伸的标识符寡核苷酸的示意图。
图5是本公开内容的短探针杂交方法的示意图。
图6是本公开内容的短探针杂交方法的示意图。
图7是本公开内容的短探针杂交方法的示意图。
图8是本公开内容的长探针杂交方法的示意图。
图9是本公开内容的长探针杂交方法的示意图。
图10是本公开内容的长探针杂交方法的示意图。
图11是本公开内容的直接-PCR方法的示意图。
图12是本公开内容的无酶方法的示意图。
图13是本公开内容的多重无酶方法的示意图。
图14是间接结合靶核酸的本公开内容的探针的示意图。
图15是本公开内容的标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图。
图16是本公开内容的短探针杂交方法的示意图。
图17是本公开内容的标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图。
图18是本公开内容的短探针杂交方法的示意图。
图19是本公开内容的直接-PCR方法的示意图。
图20是本公开内容的方法的示意概述。
图21显示了使用本公开内容的方法对蛋白靶分析物的空间检测。
图22显示了使用本公开内容的方法对RNA靶分析物的空间检测。
图23显示了使用本公开内容的方法对蛋白靶分析物的空间检测。
图24显示了使用本公开内容的方法对RNA靶分析物的空间检测。
图25显示了使用本公开内容的方法对蛋白靶分析物的空间检测。
图26是本公开内容的探针的示意图。
图27显示了在本公开内容的方法中探针平铺（tiling）的使用。
图28显示了在组织微阵列上选择的感兴趣的区域。
图29是显示使用本公开内容的方法实现的读长（read）深度的一系列图。
图30是显示使用本公开内容的方法在阴性对照样品中RNA靶分析物的空间检测的一系列图。
图31是显示使用本公开内容的方法在HEK293样品（上图）和Jurkat细胞样品（下图）中RNA靶分析物的空间检测的一系列图。
图32是显示使用本公开内容的方法在十六种FFPE样品中RNA靶分析物的空间检测的一系列图。
图33是显示使用本公开内容的方法在HEK293样品中的RNA靶分析物的空间检测的图。
图34是显示使用本公开内容的方法在Jurkat细胞样品中的RNA靶分析物的空间检测的图。
发明详述
本公开内容部分基于用于使用现有的测序方法在用户定义的组织区域、用户定义的细胞和/或用户定义的细胞内亚细胞结构中同时、多重空间检测和定量蛋白和/或核酸表达的探针、组合物、方法和试剂盒。
本公开内容提供了存在于第一感兴趣的区域（例如，组织类型、细胞（包括正常和异常细胞）以及细胞内的亚细胞结构）中的靶蛋白和/或靶核酸的特性和丰度与存在于第二感兴趣的区域中的靶蛋白和/或靶核酸的特性和丰度的比较。对感兴趣的区域和可进行的比较的数目没有预定的上限；上限涉及相对于样品的大小的感兴趣区域的大小。例如，当单个细胞代表感兴趣的区域时，那么切片可能有数百到数千个感兴趣的区域；然而，如果组织切片仅包括两种细胞类型，则所述切片可能仅具有两个感兴趣的区域（每个区域仅包括一种细胞类型）。
本公开内容提供了比用标准免疫组织化学或原位杂交方法所可能的更高程度的多重化。标准的免疫组织化学方法允许最多6至10种蛋白靶的同时检测，而3至4种蛋白靶是更典型的。类似地，原位杂交方法限于少于十种核酸靶的同时检测。本公开内容提供了检测来自样品的限定区域的核酸靶和/或蛋白靶的大的组合。本公开内容通过数字定量以及增加的可靠性和一致性提供了客观测量结果的增加，从而使得能够比较多个中心之间的结果。
本文详细描述了本公开内容的各种组合物和方法。
在一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“双端衔接子连接方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的双端衔接子连接方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。本文进一步详细描述了本公开内容的探针和样品。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，双端衔接子连接方法可以进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域。
在释放标识符寡核苷酸之后，双端衔接子连接方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，双端衔接子连接方法可以进一步包括：（4）将至少一种核酸衔接子与在步骤（3）中收集的释放的标识符寡核苷酸连接。
核酸衔接子可以包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。例如，如果标识符寡核苷酸从指定为“ROI #1”的样品的位置释放，则核酸衔接子将包含对应于“ROI #1”的核酸序列。
核酸衔接子还可包含独特分子标识符。
核酸衔接子还可包含第一扩增引物结合位点。在其他方面，核酸衔接子还可包含第二扩增引物结合位点。
在一些方面，核酸衔接子还可以包含恒定核酸序列，以将由特定标识符寡核苷酸的序列中的差异引起的连接偏差减至最小。
核酸衔接子可以是部分双链核酸分子。在其中核酸衔接子是部分双链的方面，核酸衔接子包含双链退火区、第一单链错配区和第二单链错配区。第一单链错配区和第二单链错配区可存在于双链退火区的相对侧。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列可以存在于核酸衔接子的双链退火区中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列的方面，所述将连接偏差减至最小的恒定核酸序列可以存在于核酸衔接子的双链退火区中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含独特分子标识符的方面，所述独特分子标识符可以存在于核酸衔接子的第一或第二单链错配区中的至少一个中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含第一和第二扩增引物结合位点的方面，所述第一扩增引物结合位点可以存在于核酸衔接子的第一单链错配区中且所述第二扩增引物结合位点可存在于核酸衔接子的第二单链错配区中。
在连接至少一种核酸衔接子之后，双端衔接子连接方法可以进一步包括：（5）使用与第一和第二扩增引物结合位点结合的扩增引物扩增在步骤（4）中产生的连接产物；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的双端衔接子连接方法可以进一步包括，在步骤（4）之前，使用本领域已知的方法进行末端修复反应。所述方法还可以进一步包括，在步骤（4）之前，使用本领域已知的方法进行加尾反应以将单核苷酸突出端附着至标识符寡核苷酸的3'端。在各个方面，可以顺序或同时进行末端修复反应和加尾反应。
在双端衔接子连接方法的优选方面，将核酸衔接子连接到释放和收集的标识符寡核苷酸的两端。
在双端衔接子连接方法的其他方面，步骤（5）中用于扩增步骤（4）中产生的连接产物的扩增引物中的至少一种包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列。例如，如果标识符寡核苷酸从指定为“ROI #1”的样品的位置释放，则扩增引物中的至少一种将包含对应于“ROI #1”的核酸序列。
图1显示了本公开内容的双端衔接子连接方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与靶蛋白结合的抗体。在左上图中，探针与靶蛋白结合。在右上图中，位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头被切割，从而释放所述标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含鉴定结合至靶结合结构域的靶蛋白的独特核酸序列。在底部图中，将核酸衔接子连接至标识符寡核苷酸的两端。在所述非限制性实例中，核酸衔接子是部分双链的，并且包含双链退火区、第一单链错配区和第二单链错配区。存在于双链退火区中的是将连接偏差减至最小的恒定核酸序列和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。存在于第一单链错配区中的是第一扩增引物结合位点。存在于第二单链错配区中的是独特分子标识符和第二扩增引物结合位点。在核酸衔接子与标识符寡核苷酸连接后，使用结合第一和第二扩增引物结合位点的扩增引物扩增产物，并进行测序以鉴定由探针结合的靶蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的双重连接至两个核酸衔接子的标识符寡核苷酸的组合物。与两个核酸衔接子双重连接的标识符寡核苷酸包含标识符寡核苷酸，其中所述标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸的每端附着至核酸衔接子分子，其中所述核酸衔接子分子是部分双链的，并且包含双链退火区、第一单链错配区和第二单链错配区。第一单链错配区和第二单链错配区存在于双链退火区的相对侧。双链错配区包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列和能够鉴定样品的特定位置的核酸序列核酸序列。第一单链错配区包含第一扩增引物结合位点。第二单链错配区包含第二扩增引物结合位点和包含独特分子标识符的核酸序列。双重连接至两个核酸衔接子的标识符寡核苷酸的示意图示于图1的底部图中。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“单端衔接子连接方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的单端衔接子连接方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸还可包含第一扩增引物结合位点。在一些方面，标识符寡核苷酸还包含至少一个具有单核苷酸突出端的3'端。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，单端衔接子连接方法可以进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，单端衔接子连接方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，单端衔接子连接方法可以进一步包括：（4）将至少一种核酸衔接子与在步骤（3）中收集的释放的寡核苷酸连接；
核酸衔接子可以包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。例如，如果标识符寡核苷酸从指定为“ROI #1”的样品的位置释放，则核酸衔接子将包含对应于“ROI #1”的核酸序列。核酸衔接子还可包含独特分子标识符。核酸衔接子还可包含第二扩增引物结合位点。
在一些方面，核酸衔接子还可以包含恒定核酸序列，以将由特定标识符寡核苷酸的序列中的差异引起的连接偏差减至最小。恒定核酸序列可以包含可切割的部分。可切割的部分可以是酶促可切割的。在非限制性实例中，酶促可切割的部分可以是USER序列，其中所述USER序列包含序列GUGUATUG。
核酸衔接子可以包含上述特征的任何组合。
核酸衔接子可以是部分双链核酸分子。在其中核酸衔接子是部分双链的方面，核酸衔接子包含双链退火区和单链错配区。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列的方面，所述鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列可以存在于核酸衔接子的双链退火区中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列的方面，所述将连接偏差减至最小的恒定核酸序列可以存在于核酸衔接子的双链退火区中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含独特分子标识符的方面，所述独特分子标识符可以存在于单链错配区中。
在其中核酸衔接子是部分双链的并且包含第二扩增引物结合位点的方面，所述第二扩增引物结合位点可存在于核酸衔接子的单链错配区中。
在连接至少一种核酸衔接子之后，双端衔接子连接方法可以进一步包括：（5）扩增在步骤（4）中产生的连接产物；和（6）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在本公开内容的单端衔接子连接方法的其他方面，步骤（5）中用于扩增步骤（4）中产生的连接产物的扩增引物中的至少一种包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列。例如，如果标识符寡核苷酸从指定为“ROI #1”的样品的位置释放，则扩增引物中的至少一种将包含对应于“ROI #1”的核酸序列。
图2显示了本公开内容的单端衔接子连接方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是与靶蛋白结合的抗体。在左上图中，探针与靶蛋白结合。在右上图中，位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头被切割，从而释放所述标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含鉴定靶蛋白的独特核酸序列和第一扩增引物结合位点。在所述非限制性实例中，标识符寡核苷酸是双链的，而一条链包含三个分开的核酸分子。标识符寡核苷酸还包含一个具有单核苷酸突出端的3'端。
在图2的底部图中，将核酸衔接子连接至包含3'单核苷酸突出端的标识符寡核苷酸的末端。在所述非限制性实例中，核酸衔接子是部分双链的，并且包含双链退火区和单链错配区。存在于双链退火区中的是将连接偏差减至最小的恒定核酸序列和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。存在于单链错配区中的是独特分子标识符和第二扩增引物结合位点。在核酸衔接子与标识符寡核苷酸连接后，使用结合至第一和第二扩增引物结合位点的扩增引物扩增产物，并进行测序以鉴定由探针结合的靶蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的连接至一个核酸衔接子的标识符寡核苷酸的组合物。与一个核酸衔接子连接的标识符寡核苷酸包含标识符寡核苷酸，其中所述标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中靶分析物的独特核酸序列和第一扩增引物结合位点。标识符寡核苷酸的一端附着至核酸衔接子分子，其中所述核酸衔接子分子是部分双链的，并且包含双链退火区和单链错配区和第二单链错配区。双链错配区包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列和能够鉴定样品的特定位置的核酸序列核酸序列。单链错配区包含第二扩增引物结合位点。连接至一个核酸衔接子的标识符寡核苷酸的示意图示于图2的底部图中。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“具模板引物延伸方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的具模板引物延伸方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸还可包含第一扩增引物结合位点。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，具模板引物延伸方法可以进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，具模板引物延伸方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，具模板引物延伸方法可以进一步包括：（4）使单链核酸模板与在步骤（3）中收集的释放的标识符寡核苷酸杂交。
单链核酸模板可包含与标识符寡核苷酸的独特核酸序列互补的区域，从而允许单链核酸模板与收集的标识符寡核苷酸杂交。
单链核酸模板还可包含：包含独特分子标识符的核酸序列。
单链核酸模板还可包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。
单链核酸模板还可包含与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。
单链核酸模板可包含上述特征的任何组合。
在标识符寡核苷酸与单链核酸模板杂交之后，具模板引物延伸方法可以进一步包括：（5）延伸步骤（4）的标识符寡核苷酸以形成与所述单链核酸模板互补的延伸产物，其中，所述延伸产物包含标识符寡核苷酸和与所述单链核酸模板互补的序列；（6）使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物扩增步骤（6）的延伸产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在一些方面，单链核酸模板可包含亲和分子。在其中单链核酸模板包含亲和分子的方面，具模板引物延伸方法可以进一步包括在步骤（4）和（5）之间的亲和纯化步骤。
图3显示了本公开内容的具模板引物延伸方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是与靶蛋白结合的抗体。在左上图中，探针与靶蛋白结合。在右上图中，位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头被切割，从而释放所述标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含鉴定靶蛋白的独特核酸序列和第一扩增引物结合位点。在右下图中，标识符寡核苷酸与单链核酸模板杂交。在所述非限制性实例中，单链核酸模板包含亲和分子、与标识符寡核苷酸的独特核酸序列互补的核酸序列、第一独特分子标识符以及与第二扩增引物结合位点互补的序列。延伸标识符寡核苷酸以形成与单链核酸模板互补的延伸产物。如左下图中所示的，延伸产物包含标识符寡核苷酸、与第一独特分子标识符互补的核酸序列和第二扩增引物结合位点。延伸反应后，使用与第一和第二扩增引物结合位点结合的扩增引物扩增引物延伸产物。在所述非限制性实例中，扩增引物之一包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。然后对扩增产物进行测序，以鉴定由探针结合的靶蛋白。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的模板延伸的标识符寡核苷酸的组合物。模板延伸的标识符寡核苷酸包含适合于测序的第一流动池衔接子序列，后面是第一独特分子标识符，后面是标识符寡核苷酸，后面是第二独特分子标识符，后面是第二扩增引物结合位点，后面是第三独特分子标识符，后面是适合于测序的第二流动池衔接子序列。标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点和能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列。模板延伸的标识符寡核苷酸的示意图示于图4的底部图中。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“短探针杂交方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的短探针杂交方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，短探针杂交方法可以进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，短探针杂交方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，短探针杂交方法可以进一步包括：（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与释放标识符寡核苷酸杂交。
第一或第二核酸探针可包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。第一或第二核酸探针还可包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。第一或第二核酸探针还可包含：包含独特分子标识符的核酸序列。第一核酸探针可包含第一扩增引物结合位点。第二核酸探针可包含第二扩增引物结合位点。
第一或第二核酸探针可以包含上述特征的任何组合。在图5中描绘的优选方面，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在相同的优选方面，第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述优选方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列位于第一扩增引物结合位点的5'，且独特分子标识符位于第二扩增引物结合位点的3'。
在图6中描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述相同的优选方面，第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述优选方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符位于第一扩增引物结合位点的5'。
在图7中描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述相同的优选方面，第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述优选方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和独特分子标识符位于第二扩增引物结合位点的3'。
在图15中描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在相同的优选方面，第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述优选方面，包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增结合位点的3'。
在图17中描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在相同的优选方面，第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述优选方面，包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增结合位点的5'。
第一核酸探针和第二核酸探针可以与标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻并且不重叠。另一方面，第一核酸探针和第二核酸探针可以与标识符寡核苷酸杂交，从而使得第一和第二核酸探针不相邻并且不重叠。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交之后，短探针杂交方法可以进一步包括：（5）在其中第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得所述第一和第二核酸探针相邻并且不重叠的方面，例如，通过进行切口修复反应将第一和第二核酸探针连接在一起。另一方面，在其中第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠的方面，方法包括，例如，通过进行缺口延伸反应和切口修复反应，将第一和第二核酸探针连接在一起，从而使得所述第一和第二核酸探针连接在一起。
连接第一和第二核酸探针后，短探针杂交方法可以进一步包括：（6）使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的组合物。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体包含与第一核酸探针和第二核酸探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列。第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点，后面是能够鉴定样品中的特定位置的独特核酸序列，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点，后面是包含独特分子标识符的核酸序列，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图在图5中描绘。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的组合物。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体包含与第一核酸探针和第二核酸探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列。第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点，后面是包含独特分子标识符的核酸序列，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域，其中包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增引物结合位点的3'。第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图在图15中描绘。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的组合物。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体包含与第一核酸探针和第二核酸探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列。第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点，后面是包含独特分子标识符的核酸序列，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域，其中包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增引物结合位点的5'。第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图在图17中描绘。
图16显示了本公开内容的示例性短探针杂交方法的示意概述。首先使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结构域的靶分析物的独特核酸序列。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，然后对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。释放后收集标识符寡核苷酸，如图16的顶部图中所示的。
如从图16的顶部起的第二个图中所示的，然后使释放的标识符寡核苷酸与第一核酸探针和第二核酸探针杂交。在所述非限制性实例中，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增引物结合位点的3'。第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述非限制性实例中，第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交，从而使得第一和第二核酸探针相邻且不重叠。与标识符寡核苷酸杂交后，例如通过进行切口修复反应将第一和第二探针连接在一起。
连接第一和第二核酸探针后，使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物经由PCR扩增连接产物。如从图16的底部起的第二个图中所示的，与第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第一流动池结合位点、第一鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。与第一扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第二流动池结合位点、第二鉴定从其释放标识符寡核苷酸的特定位置的核酸序列和与第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。然后，对图16底部图中所示的PCR产物进行测序，以鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
图18显示了本公开内容的示例性短探针杂交方法的示意概述。首先，使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结构域的靶分析物的独特核酸序列。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，然后对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。释放后收集标识符寡核苷酸，如图18的顶部图中所示的。
如从图18的顶部起的第二个图中所示的，然后使释放的标识符寡核苷酸与第一核酸探针和第二核酸探针杂交。在所述非限制性实例中，第一核酸探针包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。包含独特分子标识符的核酸序列位于第一扩增引物结合位点的5'。第二核酸探针包含第二扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。在所述非限制性实例中，第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交，从而使得第一和第二核酸探针相邻且不重叠。与标识符寡核苷酸杂交后，例如通过进行切口修复反应将第一和第二探针连接在一起。
连接第一和第二核酸探针后，使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物经由PCR扩增连接产物。如从图18的底部起的第二个图中所示的，与第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第一流动池结合位点、第一鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。与第一扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第二流动池结合位点、第二鉴定从其释放标识符寡核苷酸的特定位置的核酸序列和与第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。然后，对图18底部图中所示的PCR产物进行测序，以鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“长探针杂交方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的长探针杂交方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，长探针杂交方法可以进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，长探针杂交方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集一种或多种释放的标识符寡核苷酸之后，长探针杂交方法可以进一步包括：（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与释放标识符寡核苷酸杂交。
第一或第二核酸探针可包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列。第一或第二核酸探针还可包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。
第一或第二核酸探针还可包含第一独特分子标识符。第一或第二核酸探针还可包含第二独特分子标识符。第一或第二核酸探针还可包含第三独特分子标识符。
第一核酸探针可以包含第一扩增引物结合位点。
第一核酸探针还可包含第一流动池结合位点。第二核酸探针可以包含第二流动池结合位点。
第一和第二核酸探针可以包含上述特征的任何组合。在图8描绘的优选方面，第一核酸探针包含第一流动池结合位点、第一独特分子标识符、第一扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在相同的优选方面，第二核酸探针包含第二流动池结合位点、第二独特分子标识符、第三独特分子标识符和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述优选方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和第一独特分子标识符位于第一流动池结合位点的5'且第二和第三独特分子标识符位于第二流动池结合位点的3'。
在图9描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一流动池结合位点、第一独特分子标识符、第二独特分子标识符、第一扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在相同的优选方面，第二核酸探针包含第二流动池结合位点、第三独特分子标识符和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述优选方面，第一独特分子标识符、第二独特分子标识符和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列位于第一流动池结合位点的5'且第三独特分子标识符位于第二流动池结合位点的3'。
在图10中描绘的另一个优选方面，第一核酸探针包含第一流动池结合位点、第一独特分子标识符、第一扩增引物结合位点和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述相同的优选方面，第二核酸探针包含第二流动池结合位点、第二独特分子标识符、第三独特分子标识符、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与标识符寡核苷酸互补的核酸序列。在所述优选方面，第一独特分子标识符位于第一流动池结合位点的5'，且第二独特分子标识符、第三独特分子标识符和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列位于第二扩增引物结合位点的3'。
第一核酸探针和第二核酸探针可以与标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻并且不重叠。另一方面，第一核酸探针和第二核酸探针可以与标识符寡核苷酸杂交，从而使得第一和第二核酸探针不相邻并且不重叠。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交之后，长探针杂交方法可以进一步包括：（5）在其中第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得所述第一和第二核酸探针相邻并且不重叠的方面，进行切口修复反应，从而使得所述第一和第二核酸探针连接在一起。另一方面，在其中第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得所述第一和第二核酸探针不相邻且不重叠的方面，方法包括进行缺口延伸和切口修复反应，从而使得所述第一和第二核酸探针连接在一起。
所述名称方法可以进一步包括：（6）使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物扩增步骤（5）中产生的连接产物；和（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的标识符寡核苷酸-长核酸探针复合体的组合物。标识符寡核苷酸-长核酸探针复合体包含与第一核酸探针和第二核酸探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列。第一核酸探针包含适合于测序的第一流动池结合位点，后面是第一独特分子标识符，后面是第一扩增引物结合位点，后面是能够鉴定样品中的特定位置的独特核酸序列，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。第二核酸探针包含第二流动池结合位点，后面是第二独特分子标识符，后面是第三独特分子标识符，后面是与标识符寡核苷酸互补的区域。标识符寡核苷酸-短核酸探针复合体的示意图在图8中描绘。
在另一个方面，本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“直接PCR方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的直接PCR方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸还可包含第一扩增引物结合位点、第二扩增引物结合位点或独特分子标识符。标识符寡核苷酸可包含这些特征的任何组合。这些特征中的任何一种也可以侧接包含约1个核苷酸至约10个核苷酸的恒定核酸序列的区域。
在使至少一种分析物与至少一种探针接触之后，直接PCR方法进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
直接PCR方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在释放标识符寡核苷酸之后，直接PCR方法可以进一步包括：（4）使用能够结合第一扩增引物结合位点的第一扩增引物和能够结合第二扩增引物结合位点的第二扩增引物来扩增所述释放的标识符寡核苷酸。在一些方面，扩增引物的至少一种包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。例如，如果标识符寡核苷酸从指定为“ROI#1”的样品的位置释放，则扩增引物中的至少一种将包含对应于“ROI #1”的核酸序列。在再其他方面，扩增引物中的至少一种包含独特分子标识符。
扩增之后，本公开内容的直接PCR方法可以进一步包括：（5）通过对步骤（5）中产生的扩增产物进行测序来鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
图11显示了本公开内容的直接PCR方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与靶核酸互补的核酸序列。在上图中，探针与靶核酸杂交。在下图中，切割位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头，从而释放标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点、第二扩增引物结合位点、独特分子标识符和鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。位于这四个特征之间的是长度为3个核苷酸的恒定间隔区。标识符寡核苷酸是双链的，并包含包含3个分开的核酸分子的链。释放后，使用与第一扩增引物结合位点杂交并包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列的第一扩增引物扩增和与第二扩增引物结合位点杂交的第二扩增引物扩增标识符寡核苷酸。然后对扩增的产物进行测序以鉴定由探针结合的靶核酸。
图19显示了本公开内容的直接PCR方法的优选方面的示意图。在这个方面，标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列、鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列和第二扩增引物结合位点，如图19的顶部图中所示的。使用与第一和第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物扩增标识符寡核苷酸。如图19的中部图中所示的，与第二扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第一流动池结合位点、第一鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。与第一扩增引物结合位点杂交的扩增引物包含第二流动池结合位点、第二鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。对图19底部图中所示的PCR产物进行测序，以鉴定释放的寡核苷酸，从而空间检测样品中的至少一种靶分析物。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的直接-PCR相容的标识符寡核苷酸的组合物。直接-PCR相容的标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点，后面是能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列，后面是独特分子标识符，后面是第二扩增引物结合位点。直接-PCR相容的标识符寡核苷酸的示意图在图11下图中描绘。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的直接-PCR相容的标识符寡核苷酸的组合物。直接-PCR相容的标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点，后面是包含独特分子标识符的核酸序列，后面是能够鉴定样品中的靶分析物的独特核酸序列，后面是第二扩增引物结合位点。直接-PCR相容的标识符寡核苷酸的示意图在图19顶部图中显示。
在本公开内容的方法的一些方面，至少一种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或至少七种，或至少八种，或至少九种，或至少十种，或至少十一种，或至少十二种，或至少十三种，或至少十四种，或至少十五种，或至少十六种，或至少十七种，或至少十八种，或至少十九种，或至少二十种，或至少三十种，或至少四十种，或至少五十种，或至少六十种，或至少七十种，或至少八十种，或至少九十种，或至少一百种探针可以结合于单个靶分析物。如本文所用的，术语“平铺（tiling）”用于描述当不止一种本公开内容的探针结合至靶分析物时。图27的顶部图显示了探针平铺到靶RNA上。将多种探针平铺在靶分析物上意味着每种靶分析物将被单独检测多次，从而提高了测量的总准确性。在非限制性实例中，如图27底部图中所示的，在将10种探针平铺到单个靶RNA上的情况中，一种探针可能被错误地太多次检测（异常值高计数探针），而另一种探针可能被错误地太少次检测（异常值低计数探针）。然而，其他8种探针可能以相似的水平检测，从而表明在分析过程中应抛弃所述两个异常值，并且来自8种探针的信号用于产生更准确的靶RNA丰度的测量结果。
本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“无酶方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的无酶方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸还可包含捕获探针结合位点。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，无酶方法可进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，无酶方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，无酶方法可以进一步包括：（4）使捕获探针与释放的标识符寡核苷酸杂交。
捕获探针可包含与捕获探针结合位点互补的区域。捕获探针还可以包含亲和分子。
在捕获探针杂交之后，无酶方法可以进一步包括：（5）通过对步骤（4）中产生的杂交产物进行测序来鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
可以使用无酶测序方法对步骤（4）中产生的杂交产物进行测序。无酶测序方法已经在例如US2014946386和US15/819,151中描述，其各自整体引入本文作为参考。
图12显示了本公开内容的无酶方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与靶核酸互补的核酸序列。在顶部图中，探针与靶核酸杂交。在中部图中，切割位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头，从而释放标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含鉴定结合至靶结合结构域的靶核酸的独特核酸序列和捕获探针结合位点。释放后，标识符寡核苷酸与捕获探针杂交，如底部图中所示的。捕获探针包含与捕获探针结合位点互补的核酸序列和亲和分子。然后使用无酶测序方法对杂交的产物进行测序以鉴定由探针结合的靶核酸。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针复合体的组合物。杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针复合体包含与捕获探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的特定靶分析物的独特核酸序列和捕获探针结合位点。捕获探针包含亲和分子和与捕获探针结合位点互补的区域。在图12底部图中描绘了杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针复合体的示意图。
本公开内容提供了组合物和方法，所述组合物和方法用于在本文中称为“多重无酶方法”的方法中使用本公开内容的探针空间检测样品中的至少一种靶分析物。
本公开内容的多重无酶方法可以包括：（1）使样品中的至少一种靶分析物与本公开内容的至少一种探针接触。所述至少一种靶分析物可以是靶蛋白或靶核酸。在至少一种靶分析物是靶蛋白的方面，探针可以包含靶结合结构域，所述靶结合结构域是可以与感兴趣的靶蛋白特异性结合的靶蛋白结合区。在至少一种靶分析物是靶核酸的方面，探针可以包含靶核酸结合区，所述靶核酸结合区可以直接或间接地与感兴趣的靶核酸杂交。探针进一步包含标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸可包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。标识符寡核苷酸还可包含捕获探针结合位点。标识符寡核苷酸还可包含多重化探针结合位点。
在使至少一种靶分析物与至少一种探针接触之后，多重无酶方法可进一步包括：（2）对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力。在非限制性实例中，在其中探针包含在标识符寡核苷酸和靶结合结构域之间的可光切割的接头的方面，用能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光激发感兴趣的区域（ROI）。
在释放标识符寡核苷酸之后，多重无酶方法可进一步包括：（3）收集释放的标识符寡核苷酸。通过在步骤（2）中仅将力对准特定位置，标识符寡核苷酸仅从所述位置内的探针释放，而不从所述位置外的探针释放。因此，在步骤（3）中仅收集对于结合至所述位置内的靶的探针的标识符寡核苷酸，从而允许检测仅位于所述位置内的靶（蛋白和/或核酸）的特性和量。
在收集释放的标识符寡核苷酸之后，多重无酶方法可以进一步包括：（4）使捕获探针和多重化探针与释放的标识符寡核苷酸杂交。
捕获探针可包含与捕获探针结合位点互补的区域。捕获探针还可以包含亲和分子。
多重化探针可包含与多重化探针结合位点互补的区域。多重化探针还可以包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列以及与多重化探针结合位点互补的区域。
在捕获探针和多重化探针杂交之后，多重无酶方法可以进一步包括：（5）通过对步骤（4）中产生的杂交产物进行测序来鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
可以使用无酶测序方法对步骤（4）中产生的杂交产物进行测序。无酶测序方法已经在例如US2014946386和US15/819,151中描述，其各自整体引入本文作为参考。
图13显示了本公开内容的多重无酶方法的优选方面的示意图。在这个方面，探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与靶核酸互补的核酸序列。在顶部图中，探针与靶核酸杂交。在中部图中，切割位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可紫外线光切割的接头，从而释放标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列、捕获探针结合位点和多重化探针结合位点，如中部图中所示的。释放后，标识符寡核苷酸与捕获探针和多重化探针杂交，如在下图中所示的。捕获探针包含与捕获探针结合位点互补的核酸序列和亲和分子。多重化探针包含与多重化探针结合位点互补的核酸序列和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列。然后使用无酶测序方法对杂交的产物进行测序以鉴定由探针结合的靶核酸。
在一个方面，本公开内容提供了用于空间检测样品中的至少一种靶分析物的杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针-多重探针复合体的组合物。杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针-多重探针复合体包含与捕获探针和多重化探针杂交的标识符寡核苷酸。标识符寡核苷酸包含能够鉴定样品中的特定靶分析物的独特核酸序列、捕获探针结合位点和多重化探针结合位点。捕获探针包含亲和分子和与捕获探针结合位点互补的区域。多重化探针包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列和与多重化探针结合位点互补的区域。在图13底部图中描绘了杂交的标识符寡核苷酸-捕获探针-多重探针复合体的示意图。
图20是本公开内容的方法的概述的示例性示意图。首先，使显微镜载玻片上的样品与许多本公开内容的探针接触（图20中的步骤1）。然后将载玻片成像，并选择特定的感兴趣的区域（ROIs）（图20中的步骤2）。然后，用紫外线照射特定的ROI，以从结合在ROI中的探针释放标识符寡核苷酸。然后通过用微细管吸出收集释放的标识符寡核苷酸。吸出后，将标识符寡核苷酸转移到96孔平板内的特定孔中。然后，对步骤2中确定的每个ROI重复步骤4和5。在所有ROIs均已被照射并收集了所有释放的标识符寡核苷酸后，使用下一代测序方法对标识符寡核苷酸进行测序，以空间检测样品中的至少一种靶分析物。
如前面所述的，本公开内容提供了用于空间检测样品中至少一种靶分析物的组合物和方法的探针。本公开内容提供了包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针。靶结合结构域是探针的区域，其与样品中的至少一种靶分析物特异性结合。
本公开内容的探针可用于空间检测靶核酸。在这个方面，靶结合结构域可以是靶核酸结合区。靶核酸结合区优选长度为至少15个核苷酸，且更优选长度为至少20个核苷酸。在特定方面，靶核酸结合区长度为约10至500、20至400、25、30至300、35、40至200或50至100个核苷酸。用于结合和鉴定靶核酸的探针和方法已经在例如US2003/0013091、US2007/0166708、US2010/0015607、US2010/0261026、US2010/0262374、US2010/0112710、US2010/0047924和US2014/0371088中描述，其各自整体引入本文作为参考。
靶核酸结合区可以直接与样品中存在的靶核酸杂交。另一方面，本公开内容的探针可以与样品中存在的靶核酸间接杂交（经由中间寡核苷酸）。图14举例说明了所述方面的探针（或组合物）。所述探针包含与合成的寡核苷酸（中间寡核苷酸）结合的靶核酸结合结构域，所述合成的寡核苷酸本身又与生物样品中的靶核酸结合。可以说，中间寡核苷酸是如本文所定义的探针，这是因为它包含核酸主链并且能够结合靶核酸。在这些方面，探针的靶核酸结合区与中间寡核苷酸（即，合成的寡核苷酸）的区域杂交，所述区域不同于样品中存在的靶核酸。因此，探针的靶结合区与样品中的最终靶核酸无关。这提供了测定设计中经济和快速的灵活性，这是因为测定的靶（存在于样品中）特异性组分包含在廉价且可广泛得到的合成的DNA寡核苷酸而不是更昂贵的探针中。通过包含与样品中存在的靶核酸杂交的区域和与探针杂交的区域来简单地设计这种合成的寡核苷酸。因此，单组间接结合探针可以仅通过置换测定的靶特异性（合成的）寡核苷酸部分用于在不同实验中检测无限多种靶核酸（存在于样品中）。
靶核酸可以是DNA或RNA，且优选信使RNA（mRNA）或miRNA。
本公开内容的探针可用于检测靶蛋白。在这个方面，靶结合结构域可以是靶蛋白结合区。靶蛋白结合区包括被进行设计以与至少一种靶蛋白、至少一种靶蛋白代用品或两者结合的分子或组件（assembles），并且可以在适当条件下形成包含探针和靶蛋白的分子复合体。靶蛋白结合区可包括抗体、肽、适配体或拟肽。抗体可以从多种来源获得，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、重组表达的抗体、人源化抗体、植物产抗体等。术语蛋白、多肽、肽和氨基酸序列在本文可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸或合成的氨基酸中断。所述术语还包括已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化（lipidation）、乙酰化、磷酸化或任何其他操作（例如与标记组分缀合）修饰的氨基酸聚合物。如本文所用的，术语氨基酸是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L旋光异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物（peptidomimetics）。例如，在US2011/0086774中已描述了用于结合和鉴定靶蛋白的探针和方法，其内容整体引入本文作为参考。
标识符寡核苷酸是鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的核酸分子。标识符寡核苷酸包含鉴定结合至探针的靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列。在非限制性实例中，具有与蛋白P53结合的靶结合结构域的探针包含具有对应于P53的独特核酸序列的标识符寡核苷酸，而具有与蛋白P97结合的靶结合结构域的探针包含具有对应于P97的独特核酸序列的标识符寡核苷酸。
标识符寡核苷酸可以是DNA、RNA或DNA和RNA的组合。
在一些方面，标识符寡核苷酸可包含至少一个扩增引物结合位点。扩增引物结合位点是能够结合扩增引物的核酸序列。扩增引物可使用本领域中已知的方法，包括但不限于聚合酶链反应（PCR），用于扩增与其结合的核酸分子。
在一些方面，标识符寡核苷酸可包含至少一个独特分子标识符。
标识符寡核苷酸可以是单链、双链或部分双链的核酸分子。在其中标识符寡核苷酸是双链或部分双链的方面，两条链中的至少一条可包含至少两个分开的核酸分子，其在不受理论约束的情况下允许于较低的温度使标识符寡核苷酸变性。
标识符寡核苷酸还可包含至少一个包含单核苷酸突出端的3'端。
标识符寡核苷酸还可包含捕获探针结合位点。捕获探针结合位点是捕获探针可以与其结合的核酸序列。
本公开内容的捕获探针可以包含与捕获探针结合位点互补的核酸序列。捕获探针还可以包含亲和分子。
标识符寡核苷酸还可包含多重化探针结合位点。多重化探针结合位点是多重化探针可以与其结合的核酸序列。
本公开内容的多重化探针可包含与多重化探针结合位点互补的核酸序列。多重化探针还可以包含鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列。
本公开内容的探针可包含允许在应用合适的力后释放标识符寡核苷酸的区域。在一个非限制性实例中，所述区域是可切割的基序（例如，限制酶位点或可切割的接头）。可切割的基序允许从结合的靶核酸或蛋白释放标识符寡核苷酸，且然后可以收集和检测标识符寡核苷酸。允许释放标识符寡核苷酸的区域可以位于靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间，从而允许从靶结合结构域释放标识符寡核苷酸。当可将标识符寡核苷酸与探针的剩余部分分离（即，切割并释放）时，所述标识符寡核苷酸被认为是可释放的。可切割的基序的实例包括但不限于可光切割的接头。可光切割的接头可被合适的相干光源（例如，激光和紫外线光源）或合适的不相干光源（例如，弧光灯和发光二极管（LED））提供的光切割。
在一些方面，从邻近释放标识符寡核苷酸的点或至少一个细胞（例如，至少紧接地在其上方或周围）的溶液收集标识符寡核苷酸。可以通过例如经由移液管、毛细管、微阵列针、包括孔的流动池或本领域已知的另一种合适的吸出系统或其任何组合吸出来收集邻近溶液。毛细管可以包括能够将光力如紫外线传递到至少一个细胞的光学设备。移液管或微阵列针可以附着到包括许多移液管或微阵列针的阵列。邻近溶液可以包含阴离子聚合物，例如，硫酸葡聚糖和/或鲑精DNA，和/或收集的信号寡核苷酸可以添加到包含阴离子聚合物例如硫酸葡聚糖和/或鲑精DNA的溶液中。除了鲑精DNA之外或代替鲑精DNA，可以使用本领域已知的其他非特异性封闭剂。
在一些方面，经由液体层流、湍流或过渡流（transitional flow）从组织、至少一个细胞或邻近释放标识符寡核苷酸的点收集标识符寡核苷酸。所述流可以经由例如在组织与放置在组织上的流体设备或不透性屏障之间具有25至500 m深度的通道。
在探针的靶结合结构域是抗体的方面，可以使用半胱氨酸生物缀合（bioconjugation）方法制备探针，所述方法优选对抗体的铰链区重链是稳定的、位点特异性的。所述制备方法提供了相对可控的标识符寡核苷酸与抗体化学计量比。探针可每抗体包含许多（即，不止一个，例如2个、3个、4个、5个或更多个）标识符寡核苷酸。通常，每抗体包含3或4个标识符寡核苷酸的“较重”探针比缺乏标识符寡核苷酸的抗体或每抗体包含1个或2个标识符寡核苷酸的“较轻”探针显著更不灵敏。
在各方面，以一般低于用于免疫组织化学（IHC）或用于原位杂交（ISH）的浓度的浓度向样品提供探针。另一方面，浓度可能显著低于用于IHC或ISH的浓度。例如，探针浓度可以为1/2、1/5、1/10、1/20、1/25、1/30、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000或更低以及其间的任何数字。在各方面，以100 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2nM、0.1 nM、0.09 nM、0.08 nM、0.07 nM、0.06 nM、0.05 nM、0.04 nM、0.03 nM、0.02 nM、0.01 nM和更低的浓度以及其间的任何浓度提供探针。
通过进行完整探针分子的负纯化（negative purification），可以减少蛋白检测过程中的背景噪声。这可以通过在从感兴趣的区域收集洗脱物之后进行抗体或可光切割的接头的亲和纯化来完成。通常，释放的信号寡核苷酸将不被从溶液拉出。在移液管顶端、管或平板中的蛋白-G或-O机制可用于所述步骤。这种设备和试剂可商购获得。
通过进行完整探针分子的负纯化，可以减少核酸检测过程中的背景噪声。这可以通过在从感兴趣的区域收集洗脱物之后进行靶结合结构域或可光切割的接头的亲和纯化来完成。通常，释放的信号寡核苷酸将不被从溶液拉出。为了帮助进行负纯化，通用纯化序列可以包含在探针中，例如在靶结合结构域中。
蛋白靶向探针和核酸靶向探针可以同时应用，只要条件允许蛋白靶和核酸靶两者的结合。另一方面，当允许蛋白靶和核酸靶两者结合的条件是不可能的时，可以顺序应用蛋白靶向探针和核酸靶向探针。
一组探针与探针的组合物同义。一组探针包括至少一个种类的探针，即针对一种靶。一组探针优选包括至少两个，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个种类的探针。探针组可以包括每个种类的探针的一个或多个拷贝。
仅第一组探针可以应用于样品。另一方面，第二组（或更高数目）的探针可以较后应用于样品。第一组和第二（或更高数目）可以靶向仅仅核酸、仅仅蛋白或其组合。
在本公开内容中，检测了两种或更多种靶（即，蛋白、核酸或其组合）；检测了3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多种靶，以及其间的任何数目。
可以基于要靶向的细胞类型或组织类型来预定一组探针。例如，如果组织是乳癌，则探针组将包括针对与乳癌细胞有关的蛋白（例如，Her2、EGFR和PR）的探针和/或针对与正常乳组织有关的蛋白的探针。另外，可以基于要靶向的细胞或组织的发育状态来预定探针组。另一方面，可以基于感兴趣的亚细胞定位（例如，细胞核、细胞质和膜）来预定探针组。例如，针对Foxp3、组蛋白H3或P-S6的抗体标记细胞核，针对CD3、CD4、PD-1或CD45RO的抗体标记细胞质，且针对PD-L1的抗体标记膜。
探针可以化学合成，或者可以使用已向其中克隆了编码所述探针的核酸的载体生物地生产。
本文描述的任何探针或探针组均可用于本公开内容的方法和试剂盒中。
对于本文描述的探针，独特核酸序列与特定的靶核酸或靶蛋白的缔合不是固定的。
如前面所述的，本公开内容的探针可以用于检测存在于任何样品例如生物样品中的靶核酸或靶蛋白。如本领域技术人员将理解的，样品可以包括许多东西，包括，但不限于：细胞（包括原代细胞和培养的细胞系两者）和组织（包括培养的或外植的）。在各方面，将组织样品（固定或未固定的）包埋，连续切片并固定在显微镜载玻片上。如众所周知的，一对连续切片将包括在两个连续切片中都存在的至少一个细胞。位于第一连续切片上的结构和细胞类型将在相邻的连续切片上具有相似的位置。样品可以是已固定在载玻片上的培养的细胞或解离的细胞（固定或未固定的）。样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE）组织样品。
在各方面，组织样品是活组织检查的肿瘤或其一部分，即，临床上相关的组织样品。例如，肿瘤可以来自乳癌。样品可以是切除的淋巴结。
样品可以从实际上任何生物获得，包括多细胞生物，例如，植物、真菌和动物界的生物；优选地，样品获自动物，例如，哺乳动物。人样品是特别优选的。
在一些方面，本文所述的探针、组合物、方法和试剂盒用于状况的诊断。如本文中所使用的，术语诊断状况或状况的诊断包括预测或诊断状况，确定对状况的易感性，监控状况的治疗，诊断疾病的治疗反应，以及状况、状况进展以及对状况的特殊治疗的反应的预后。例如，可以根据本文所述的任何探针、方法或试剂盒对组织样品进行测定，以确定样品中疾病或恶性细胞类型的标记的存在和/或量（相对于非疾病状况），从而诊断或分期疾病或癌症。
通常，附着到载玻片的样品可以首先使用荧光（例如荧光抗体或荧光染色剂（例如DAPI））进行成像，以鉴定形态学、感兴趣的区域、感兴趣的细胞类型和单个细胞，且然后蛋白和/或核酸的表达可以从相同载玻片上的样品进行数字计数。
本公开内容的组合物和试剂盒可以包含探针和其他试剂，例如，缓冲液和本领域已知的其他试剂，以促进样品中蛋白和/或核酸的结合，即，用于进行杂交反应。
试剂盒还将包括用于使用试剂盒组分的说明书，包括，但不限于，使标记的寡核苷酸与探针杂交、使探针与靶特异性寡核苷酸杂交、使靶特异性寡核苷酸与靶核酸杂交和/或使探针与靶蛋白杂交所必需的信息。
感兴趣的区域可以是样品中存在的组织类型、细胞类型、细胞或细胞内的亚细胞结构。
可以使用本公开内容的方法一起进行存在于第一感兴趣的区域（例如，组织类型、细胞类型（包括正常和异常细胞）以及细胞内的亚细胞结构）中的靶蛋白和/或靶核酸的特性和丰度与存在于第二感兴趣的区域或更多感兴趣的区域中的所述靶蛋白和/或靶核酸的特性和丰度的比较。
如前面所述的，通过本公开内容的方法产生的产物可以用于核酸扩增。在优选的方面，核酸扩增可以是固相核酸扩增。因此，在进一步的方面，本发明提供了模板多核苷酸分子的固相核酸扩增的方法，其包括：使用本公开内容的方法制备在其5'和3'端具有共同序列的模板多核苷酸分子的文库，和进行固相核酸扩增反应，其中所述模板多核苷酸分子被扩增。用于核酸扩增和测序的组合物和方法已在例如US9376678中描述，其整体引入本文作为参考。
如本文所用的术语“固相扩增”是指在固相支持体上或与固相支持体结合进行的任何核酸扩增反应，从而使得全部或部分扩增的产物在形成时被固定在固相支持体上。特别地，所述术语包括固相聚合酶链反应（固相PCR），其是类似于标准液相PCR的反应，只是正向和反向扩增引物之一或两者固定在固相支持体上。
尽管本发明包括“固相”扩增方法，其中仅固定了一种扩增引物（另一种引物通常存在于游离溶液中），但优选的是提供正向和反向引物两者均固定的固相支持体。在实践中，因为PCR过程需要过量的引物以维持扩增，所以将存在固定在固相支持体上的“许多”相同的正向引物和/或“许多”相同的反向引物。除非上下文另外指出，否则本文对正向和反向引物的提及要因此解释为包括“许多”这种引物。
如熟练的读者将理解的，任何给定的PCR反应都需要对要扩增的模板特异的至少一种类型的正向引物和至少一种类型的反向引物。然而，在某些方面，正向和反向引物可以包含相同序列的模板特异性部分，并且可以具有完全相同的核苷酸序列和结构（包括任何非核苷酸修饰）。换句话说，可能使用仅一种类型的引物进行固相扩增，并且这种单引物方法包括在本发明的范围内。其他方面可以使用正向和反向引物，其含有相同的模板特异性序列，但是在一些其他结构特征方面不同。例如，一种类型的引物可以含有在另一种中不存在的非核苷酸修饰。
在本发明的其他方面，正向和反向引物可以含有不同序列的模板特异性部分。
用于固相PCR的扩增引物优选通过在引物5'端或其附近共价附着于固相支持体而固定，从而使引物的模板特异性部分自由用于与其关联模板退火且使3'羟基自由用于引物延伸。为此目的，可以使用本领域已知的任何合适的共价附着方法。选择的附着化学将取决于固相支持体的特性以及应用于其的任何衍生化或官能作用。引物本身可以包含可以是非核苷酸化学修饰的部分，以促进附着。在一个特别优选的方面，引物可在5'端包含含硫的亲核物质，例如硫代磷酸酯或硫代磷酸。在固体支持的聚丙烯酰胺水凝胶的情况下（如下所述的），所述亲核物质将结合在水凝胶中存在的“C”基团。将引物和模板附着至固相支持体的最优选方法是经由5'硫代磷酸酯附着至包含聚合的丙烯酰胺和N-(5-溴乙酰氨基戊基)丙烯酰胺（BRAPA）的水凝胶。
术语“簇”和“集落”在本文可互换使用，以指固相支持体上的不连续的点，其包含许多相同的固定的核酸链和许多相同的固定的互补核酸链。术语“簇生的阵列”是指由这种簇或集落形成的阵列。在所述上下文中，术语“阵列”不应被理解为需要簇的有序排列。
本发明还包括对通过固相扩增产生的扩增的核酸进行测序的方法。因此，本发明提供了核酸测序的方法，其包括通过上述本公开内容的方法扩增核酸模板的文库，使用如上所述的固相扩增以在固相支持体上扩增所述文库，并进行核酸测序反应，以确定在固相扩增反应中产生的至少一条扩增的核酸链的全部或一部分的序列。
如本文所提到的，测序可以使用任何合适的“通过合成进行测序（sequencing-by-synthesis）”技术进行，其中将核苷酸连续地添加至游离的3'羟基，从而导致以5'至3'的方向合成多核苷酸链。优选在每次核苷酸添加后确定添加的核苷酸的特性。
测序反应的起始点可以通过将测序引物退火至全基因组或固相扩增反应的产物来提供。就此而论，在模板文库的形成过程中添加的一个或两个衔接子可以包含核苷酸序列，其允许将测序引物退火至通过模板文库的全基因组或固相扩增得到的扩增产物。
其中正向和反向扩增引物均共价固定在固体表面上的固相扩增反应的产物是通过由固定的多核苷酸链和固定的互补链对的退火形成的所谓的“桥连”结构，两条链均在5'端附着至固相支持体。包含这种桥连结构的阵列为核酸测序提供了效率低的模板，这是因为与在标准杂交条件下所述链与其固定的互补链的退火相比，常规测序引物与固定的链之一的杂交是不利的。
为了提供用于核酸测序的更合适的模板，优选去除“桥连”结构中固定的链之一的基本上全部或至少一部分，以产生至少部分为单链的模板。单链的模板的部分将因此可用于与测序引物杂交。去除“桥连”双链核酸结构中一条固定的链的全部或部分的过程在本文中可称为“线性化”。
可通过用限制性内切核酸酶切割一条或两条链或通过用产生切口内切核酸酶切割一条链来使桥连的模板结构线性化。切割的其他方法可以用作限制酶或产生切口酶的替换物，除了别的以外包括化学切割（例如，用高碘酸盐切割二醇键）、通过用内切核酸酶切割或通过暴露于热或碱来切割脱碱基位点、参入否则包含脱氧核糖核苷酸的扩增产物的核糖核苷酸的切割、光化学切割或肽接头的切割。
将理解的是，如果用仅一种共价固定的引物和在游离溶液中的另一种进行固相扩增反应，则线性化步骤可能不是必需的。
为了产生适合于测序的线性化模板，必须去除通过扩增形成的桥连结构中“不相等”量的互补链，以便留下完全或部分单链的用于测序的线性化模板。最优选地，桥连结构的一条链被基本上或完全去除。
在切割步骤之后，不管用于切割的方法如何，均可使切割反应的产物经受变性条件，以去除未附着至固相支持体的一条或多条切割的链的一个或多个部分。参考标准分子生物学规程，合适的变性条件对熟练的读者将是显而易见的。
变性（和后来的切割的链的重退火）导致部分或基本上单链的测序模板的产生。然后可以通过使测序引物与模板的单链部分杂交来起始测序反应。
因此，核酸测序反应可以包括使测序引物与线性化的扩增产物的单链区域杂交、顺序地将一个或多个核苷酸参入与待测序的扩增的模板链区域互补的多核苷酸链中、鉴定存在于一个或多个参入的核苷酸中的碱基并从而确定模板链区域的序列。
可以根据本发明使用的一种优选的测序方法依赖于可以充当链终止剂（terminator）的修饰的核苷酸的使用。一旦修饰的核苷酸已经被参入到与正被测序的模板区域互补的生长中的多核苷酸链中，就没有游离的3'-OH基团可用于指导进一步的序列延伸，且因此聚合酶不能添加进一步的核苷酸。一旦已确定了参入到生长中的链中的碱基的特性，就可以去除3'封闭以允许添加下一个连续核苷酸。通过整理使用这些修饰的核苷酸衍生的产物，可能推导DNA模板的DNA序列。如果每种修饰的核苷酸都附着有已知对应于特定碱基的不同标记以促进区分每个参入步骤中添加的碱基，则可以在单个实验中完成这种反应。另一方面，可以分别进行含有每种修饰的核苷酸的单独反应。
修饰的核苷酸可以带有标记以促进其检测。优选地，这是荧光标记。每种核苷酸类型可以带有不同的荧光标记。然而，可检测的标记不需要是荧光标记。可以使用允许检测参入的核苷酸的任何标记。
一种用于检测荧光标记核苷酸的方法包括使用对标记的核苷酸特异性的波长的激光，或使用其他合适的照射源。来自核苷酸上的标记的荧光可以通过CCD照相机或其他合适的检测工具来检测。
本发明不意图限于使用上面概述的测序方法，这是因为基本上可以使用依赖于核苷酸连续参入多核苷酸链中的任何测序方法。合适的备择技术包括，例如，焦磷酸测序（Pyrosequencing）、FISSEQ（荧光原位测序）、MPSS（大规模平行标签测序（massivelyparallel signature sequencing））和基于通过连接测序（sequencing by ligation）的方法。
在本公开内容的方法中，存在于探针的标识符寡核苷酸中的鉴定结合至探针的靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列可以包含约5个核苷酸至约50个核苷酸。优选地，所述序列包含约20个核苷酸至约40个核苷酸。甚至更优选地，所述序列包含约35个核苷酸。在一些优选的方面，所述序列包含10个核苷酸。
在本公开内容的方法中，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列包含约6个核苷酸至约15个核苷酸。优选地，所述序列包含约12个核苷酸。
在本公开内容的方法中，扩增引物结合位点包含约18个核苷酸至约40个核苷酸。优选地，扩增引物结合位点包含约32个核苷酸。
在本公开内容的方法的一些方面，扩增引物结合位点可以包含i7序列，其中所述i7序列包含SEQ ID NO：1所示的序列。
在本公开内容的方法的一些方面，扩增引物结合位点可以包含i5序列，其中所述i5序列包含SEQ ID NO：2所示的序列。
在本公开内容的方法的一些方面，扩增引物可以包含流动池衔接子序列，其中所述流动池衔接子序列适合于测序。优选地，用于本公开内容的方法的至少一种扩增引物包含P5流动池衔接子序列，其中所述P5流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：3所示的序列。仍然优选地，用于本公开内容的方法的至少一种扩增引物包含P7流动池衔接子序列，其中所述P7流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：4所示的序列。
在本公开内容的方法中，独特分子标识符可以包含约6个核苷酸至约30个核苷酸。优选地，独特分子标识符可以包含约15个核苷酸。术语独特分子标识符和随机分子标签在本文可互换使用。使用所述领域中已知的方法，独特分子标识符是可用于在测序之前校正扩增中的偏差的随机序列。
在本公开内容的方法中，将连接偏差减至最小的恒定核酸序列包含约1个核苷酸至约15个核苷酸。优选地，恒定序列包含约8个核苷酸。
在一些方面，流动池结合位点可包含约15至约40个核苷酸。流动池结合位点可包含约29个核苷酸。流动池结合位点可包含约24个核苷酸。
在一些方面，靶结合结构域可包含约10至约70个核苷酸。靶结合结构域可包含约30至约55个核苷酸。靶结合结构域可包含约35至约50个核苷酸。
在一些方面，鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列可包含约20至约40。鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列可包含约25个核苷酸，或约35个核苷酸，或约12个核苷酸。
在一些方面，扩增引物结合位点可包含约20至约50个核苷酸。扩增引物结合位点可包含约33个核苷酸或约34个核苷酸。
在一些方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以包含约1至约20个核苷酸。鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以包含约8个核苷酸。
在一些方面，包含独特分子标识符的核酸序列可包含约5至约20个核苷酸。包含独特分子标识符的核酸序列可包含约14个核苷酸。
如本文所用的，术语“感兴趣的区域”和“ROI”在其最广义使用以指样品中使用本公开内容的方法进行分析的特定位置。
如本文所用的，术语“相邻的”可以意指在约1个核苷酸内、或在约2个核苷酸内、或在约3个核苷酸内、或在约4个核苷酸内、或在约5个核苷酸内、或在约6个核苷酸内、或在约7个核苷酸内、或在约8个核苷酸内、或在约9个核苷酸内、或在约10个核苷酸内、或在约11个核苷酸内、或在约12个核苷酸内、或在约13个核苷酸内、或在约14个核苷酸内、或在约15个核苷酸内、或在约16个核苷酸内、或在约17个核苷酸内、或在约18个核苷酸内、或在约19个核苷酸内、或在约20个核苷酸内、或在约21个核苷酸内、或在约22个核苷酸内、或在约23个核苷酸内、或在约24个核苷酸内、或在约25个核苷酸内、或在约26个核苷酸内、或在约27个核苷酸内、或在约28个核苷酸内、或在约29个核苷酸内、或在约30个核苷酸内、或在约40个核苷酸内、或在约核苷酸内、或在约50个核苷酸内、或在约60个核苷酸内、或在约70个核苷酸内、或在约80个核苷酸内、或在约90个核苷酸内、或在约100个核苷酸内。
如本文所用的，术语“空间检测”以其最广义使用以指鉴定样品中特定感兴趣的区域内特定靶分析物的存在。空间检测可以包括对样品中特定感兴趣的区域内存在的特定靶分析物的量进行定量。空间检测可以进一步包括与样品中特定兴趣的区域内至少第二靶分析物的量相比，定量样品中特定兴趣的区域内第一靶分析物的相对量。空间检测还可以包括与相同样品或不同样品中至少第二感兴趣的区域中的相同靶分析物的量相比，定量样品中第一感兴趣的区域内特定靶分析物的相对量。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，靶分析物可以是样品中将被空间检测的任何分子。靶分析物包括，但不限于，核酸分子和蛋白分子。当靶分析物是蛋白时，所述蛋白可以称为靶蛋白。当靶分析物是核酸时，所述核酸可以称为靶核酸。靶核酸可以包括，但不限于，mRNA分子、微小RNA（miRNA）分子、tRNA分子、rRNA分子、gDNA或样品中存在的任何其他核酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，术语靶结合结构域以其最广义使用以指本公开内容的探针的一部分，其直接或间接地与位于样品中的靶分析物结合。靶结合结构域可包含核酸、蛋白、至少一种抗体、适配体或其任何组合。靶结合结构域可包含DNA、RNA或其任何组合。靶结合结构域可包括任何数目的修饰的核苷酸和/或核酸类似物。
在要空间检测的靶分析物是靶蛋白的方面，靶结合结构域可以是蛋白-靶结合结构域。蛋白-靶结合结构域可以包含与靶蛋白结合的抗体或抗体片段。
在要空间检测的靶分析物是靶核酸的方面，靶结合结构域可以是靶核酸结合区。靶核酸结合区可包含与要空间检测的靶核酸互补的核酸。靶核酸结合区可以包含与要检测的靶核酸杂交的核酸。
如本文所用的，术语“杂交”以其最广义使用以指形成稳定的核酸双链体。在一个方面，“稳定的双链体”意指在如例如在双链体链的Tm以下约5℃或以上约5℃的温度和低一价盐浓度例如小于0.2 M或小于0.1 M或本领域技术人员已知的盐浓度的条件下不被严格洗涤破坏的双链体结构。双链体可以“完全配对的”，从而使得形成双链体的多核苷酸和/或寡核苷酸链彼此形成双链结构，从而使得每条链中的每个核苷酸都与另一条链中的核苷酸经历沃森-克里克碱基配对。术语“双链体”包括但不限于可以使用的核苷类似物，例如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤的核苷、PNAs等的配对。双链体可以包含至少一个错配，其中术语“错配”意指双链体中的一对核苷酸不能经历沃森-克里克键合。
如本文所用的，术语“杂交条件”将一般包括小于约1 M，更通常小于约500 mM，且甚至更通常小于约200 mM的盐浓度。杂交温度可以低至5℃，但一般大于22℃，更一般大于约30℃，并且经常超过约37℃。杂交通常在严格条件下进行，例如，探针将与其靶分析物特异性杂交的条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况中不同。更长的片段可需要更高的杂交温度用于特异性杂交。由于其他因素可影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在以及碱基错配的程度，所以参数的组合比单独任何一项的绝对量度更为重要。某些杂交条件将促进靶结合结构域的全长和靶分析物之间的双链体形成。其他杂交条件将促进仅沿着靶结合结构域的某些部分的双链体的形成。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，探针可包含直接或间接连接至标识符寡核苷酸的靶结合结构域。在探针的上下文中，标识符寡核苷酸是包含鉴定与所述探针的靶结合结构域结合的靶分析物的核酸序列的多核苷酸。也就是说，标识符寡核苷酸包含特定的核酸序列，所述特定的核酸序列先验地分配给与标识符寡核苷酸所附着的靶结合结合的特定靶分析物。在非限制性实例中，进行设计以空间检测“靶分析物X”的被称为“探针X”的探针包含与被称为“标识符寡核苷酸X”的标识符寡核苷酸连接的被称为“靶结合结构域X”的靶结合结构域。靶结合结构域X与靶分析物X结合，并且标识符寡核苷酸X包含被称为“核酸序列X”的核酸序列，其对应于靶分析物X。因此，如果实践本公开内容的方法的技术人员将收集从样品中的感兴趣的区域释放的标识符寡核苷酸并在测序后获得核酸序列X，那么本领域技术人员将理解这表明靶分析物X存在于所述感兴趣的区域中。核酸序列X的量或测序读长的数目可用于绝对或相对地确定感兴趣的区域内的靶分析物X的量的定量。
如本文所用的，术语“扩增引物结合位点”以其最广义使用以指与至少一种扩增引物互补或至少部分互补的核酸序列，其中扩增引物是短的单链或部分单链的寡核苷酸，其足以引发DNA和/或RNA合成，例如，通过PCR。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，靶结合结构域可以通过可切割的接头与标识符寡核苷酸连接。合适的可切割的接头包括，但不限于，可化学切割的接头（例如当暴露于特定化学物质、化学物质的组合或反应条件时切割的接头）、可光切割的接头（例如在暴露于具有足够波长的光或包含足够波长范围的光时切割的接头）或可酶促切割的接头（例如被特定酶或一类酶切割的接头）。因此，如本文所用是，短语“对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力”以其最广义使用以描述样品中某一感兴趣的区域内条件的改变，从而使得对于任何结合至所述感兴趣的区域内的靶分析物上的探针，探针的靶结合结构域和探针的标识符寡核苷酸之间的接头被切割，从而将标识符寡核苷酸与靶结合结构域分离，以便可以接着从溶液收集标识符寡核苷酸。例如，在其中探针包含在靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可化学切割的接头的方面，对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力可以包括将所述样品的位置暴露于催化接头切割的特定的化学物质、化学物质的组合或反应条件。在另一个非限制性实例中，在其中探针包含在靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可光切割的接头的方面，对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力可以包括用具有能够切割所述可光切割的接头的足够波长的光对所述样品的位置进行暴露/激发。在另一个非限制性实例中，在其中探针包含在靶结合结构域和标识符寡核苷酸之间的可酶促切割的接头的方面，对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力可包括将所述样品的位置暴露于足以催化接头切割的量的酶。
对样品的位置提供足以释放标识符寡核苷酸的力可导致至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约99％的结合至样品的所述位置内的靶分析物的探针经历连接靶结合结构域和标识符寡核苷酸的接头的切割。
如本领域技术人员将理解的，术语“独特分子标识符”或“UMI”是指短核酸序列，其用于定量和减少测序反应之前核酸扩增引起的定量偏差。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，亲和部分可以包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、核酸或其任何组合。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，探针可包含至少至少约5、约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，靶结合结构域可以包含至少至少约5、约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，标识符寡核苷酸可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，扩增引物可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，核酸探针可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，包含分子标识符的核酸序列可包含至少约5，或至少约10个核苷酸，或至少约15，或至少约20，或至少约25，或至少约30，或至少约35，或至少约40，或至少约45，或至少约50个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，扩增引物结合位点可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65或至少约70个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，适合于测序的流动池衔接子序列可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，流动池结合位点可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约90、至少约95或至少约100个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列可以包含至少约5，或至少约10个核苷酸，或至少约15，或至少约20，或至少约25，或至少约30，或至少约35，或至少约40，或至少约45，或至少约50个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列可包含至少约5、至少约10、至少约15、至少约20。至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约90、至少约95或至少约100个核苷酸。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，探针、靶结合结构域、标识符寡核苷酸、扩增引物、核酸探针、与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含分子标识符的核酸序列、扩增引物结合位点、流动池衔接子序列、流动池结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列或其任何组合可包含至少一种天然碱基，可不包含天然碱基，可包含至少一种修饰的核苷酸或核酸类似物，可不包含修饰的核苷酸或核酸类似物，可包含至少一种通用碱基，可不包含通用碱基，可包含至少一种简并碱基或可不包含简并碱基。
在本公开内容的方法和组合物的一些方面，探针、靶结合结构域、标识符寡核苷酸、扩增引物、核酸探针、与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸、包含分子标识符的核酸序列、扩增引物结合位点、流动池衔接子序列、流动池结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列、鉴定结合至靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列或其任何组合可包含任意组合天然碱基（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个天然碱基）、修饰的核苷酸或核酸类似物（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个修饰的或类似物核苷酸）、通用碱基（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通用碱基）或简并碱基（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个简并碱基）。当组合存在时，天然碱基、修饰的核苷酸或核酸类似物、通用碱基和简并碱基可以以任何顺序排列。
术语“修饰的核苷酸”或“核酸类似物”包括，但不限于，锁定核酸（LNA）、桥连核酸（BNA）、丙炔修饰的核酸、拉链核酸（zip nucleic acids）（ZNA®）、异鸟嘌呤和异胞嘧啶。优选地，修饰的核苷酸或核酸类似物是锁定核酸（LNAs）。
如本文所用的术语“锁定核酸（LNA）”包括，但不限于，修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分包含连接2'氧和4'碳的亚甲桥。所述亚甲桥以在A-型RNA双链体中发现的3'-内构象（也称为“北”构象）锁定核糖。术语不可及的RNA可与LNA互换使用。如本文所用的术语“桥连核酸（BNA）”包括，但不限于，包含具有固定的3'-内构象（也称为北构象）的五元或六元桥连结构的修饰的RNA分子。桥连结构将核糖的2'氧与核糖的4'碳连接。含有碳、氮和氢原子的各种不同的桥结构是可能的。如本文所用的术语“丙炔修饰的核酸”包括，但不限于，在核酸碱基的C5位置包含丙炔修饰的嘧啶，即胞嘧啶和胸腺嘧啶/尿嘧啶。如本文所用的术语“拉链核酸（ZNA®）”包括，但不限于，与阳离子精胺部分缀合的寡核苷酸。
如本文所用的术语“通用碱基”包括，但不限于，不遵循沃森-克里克碱基对规则，而是可以结合位于靶核酸上的四种规范碱基（A、T/U、C、G）中的任何一种的核苷酸碱基。如本文所用的术语“简并碱基”包括，但不限于，不遵循沃森-克里克碱基对规则而是可以结合四种规范碱基A、T/U、C、G）中的至少两种但不是所有四种的核苷酸碱基。简并碱基也可以称为摆动碱基；这些术语在本文可互换使用。
如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“所述（the）”包括复数对像，除非上下文另外清楚地指出。
除非特别说明或从上下文中显而易见的，否则如本文所用的，术语“或”理解为包括性的并且包括“或”以及“和”两者。
除非特别说明或从上下文中显而易见的，否则如本文所用的，术语“约”理解为在本领域的正常容限范围内，例如在平均值的2个标准差之内。约可以被理解为在陈述的值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%之内。除非另外根据上下文是清楚的，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管与本文所述的那些相似或等同的其他探针、组合物、方法和试剂盒可以用于本公开内容的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。要理解的是，本文所使用的术语仅是为了描述特定方面起见，且不意图是限制性的。
实施例
实施例1——用于96多重样品的双端衔接子连接方法
在所述实施例中，本公开内容的双端衔接子连接方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。所述实验中使用的核酸衔接子是部分双链的。核酸衔接子包含第一链和第二链。第一链包含用于连接的5'磷酸部分。第一链还包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列（GCGTAGTG）、包含独特分子标识符的核酸序列、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列和第一扩增引物结合位点（SEQ ID NO：2）。第二链包含在3'端的单个突出的胸腺嘧啶核苷酸、与第一链中存在的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列互补的序列、与第一链中存在的鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列互补的序列和第二扩增引物结合位点（SEQ ID NO：1）。
为了形成部分双链核酸衔接子，以等摩尔比例组合第一链寡核苷酸和第二链寡核苷酸达在包含50 mM NaCl的缓冲液中28 µM的最终的总寡核苷酸浓度。将寡核苷酸混合物于95℃加热2分钟，并于环境温度冷却30分钟，从而使第一链和第二链寡核苷酸在一起退火以形成部分双链核酸衔接子。在10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20的溶液中，将退火的核酸衔接子稀释至0.02 µM至0.002 µM的终浓度。
使用改良的规程，使用用于Illumina的NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒（New England Biolabs），对收集的标识符寡核苷酸进行末端修复和A-加尾。通过组合下述制备末端修复/A加尾主混合物（master mix）：627.8 µL PCR-级H2O、143.9 µL NEBNextUltra II End Prep反应缓冲液和61.7 µL NEBNext Ultra II End Prep酶混合物。将8.3µL的末端修复/A-加尾主混合物添加到4 µL的每种标识符寡核苷酸样品中。将反应在＞75℃的加热盖的情况下于20℃温育30分钟，继之以于65℃第二次温育30分钟。然后将修复的/A-加尾的标识符寡核苷酸混合物贮藏于4℃。
末端修复和A-加尾后，通过将6.4 µL NEBNext Ultra II连接主混合物、0.2 µLNEBNext连接增强剂（Ligation Enhancer）和1 µL核酸衔接子稀释物添加到每种修复的/A-加尾的标识符寡核苷酸混合物中，将核酸衔接子连接到修复的/A-加尾的标识符寡核苷酸。在关闭加热盖的情况下，将这些反应于20℃温育15分钟，且接着用1 µL 0.5M EDTA猝灭。然后将所有反应合并到单个15 mL圆锥形管中，以形成合并的衔接子连接的样品。
使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化合并的衔接子连接的样品，所述磁珠是通过组合350 µL AMPure XP珠和3.15 mL AMPureXP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用3.5 mL稀释的AMPure XP珠进行AMPure XP珠提纯，且在200 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。然后用400 µL AMPure XP珠重复AMPure XP珠提纯，并在20 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20，以获得纯化的衔接子连接的样品。
AMPure XP提纯后，准备用纯化的衔接子连接的样品的PCR反应，以扩增衔接子连接的标识符寡核苷酸。向6 µL的纯化的衔接子连接的样品中，添加10 µL的NEBNext UltraII Q5主混合物、0.2 µL的100 µM正向和反向引物和3.6 µL的PCR-级H2O。正向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第一链上的第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。表1提供了使用的正向引物的序列。
表1. 用于双端衔接子连接的正向引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
反向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第二链上的第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。表2提供了使用的反向引物的序列。
表2. 用于双端衔接子连接的反向引物
Figure 588574DEST_PATH_IMAGE002
通过重复三次的PCR反应以实验为根据确定最佳的PCR循环数。另一方面，可以已使用实时/qPCR确定最佳的PCR循环数。使用的PCR程序包括以下步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃1分钟
(4) 将步骤(2)和(3)重复9次
(5) 于65℃5分钟
使用18 µL AMPure XP珠纯化扩增的产物，并用20 µL缓冲液洗脱，所述缓冲液包含10mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）和用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems）评估扩增的产物。还将扩增的产物稀释至15 pM，用于使用包含核苷酸序列ACACTCTTTAAGACGACGTCGCTATGGCCTCTCC（SEQ ID NO：25）的定制掺入（spike-in）引物根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例2——用于96多重样品的单端衔接子连接方法
在所述实施例中，本公开内容的单端衔接子连接方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。所述实验中使用的核酸衔接子是部分双链的。核酸衔接子包含第一链和第二链。第一链包含用于连接的5'磷酸部分。第一链还包含将连接偏差减至最小的恒定核酸序列（CACTACGC）、包含独特分子标识符的核酸序列、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列和第一扩增引物结合位点（SEQ ID NO：1）。第二链包含在3'端的单个突出的胸腺嘧啶核苷酸、与第一链中存在的将连接偏差减至最小的恒定核酸序列互补的序列和与第一链中存在的鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列互补的序列。
为了形成部分双链核酸衔接子，以等摩尔比例组合第一链寡核苷酸和第二链寡核苷酸达在50 mM NaCl中28 µM的最终的总寡核苷酸浓度。将寡核苷酸混合物加热至95℃达2分钟，并于环境温度冷却30分钟，从而使第一链和第二链寡核苷酸在一起退火以形成部分双链核酸衔接子。在10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20的溶液中，将退火的核酸衔接子稀释至0.02 µM至0.002 µM的终浓度。
通过向每种收集的标识符寡核苷酸样品添加10 µL的2X快速连接缓冲液（Enzymatics）、1 µL的T4 DNA快速连接酶（Enzymatics）和1 µL的退火的核酸衔接子稀释物，将核酸衔接子连接到收集的标识符寡核苷酸。在关闭加热盖的情况下，将样品于20℃温育15分钟，且接着用1 µL 0.5M EDTA猝灭。然后将所有反应合并到单个15 mL圆锥形管中，以形成合并的衔接子连接的样品。
使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化合并的衔接子连接的样品，所述磁珠是通过组合350 µL AMPure XP珠和3.15 mL AMPureXP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用3.5 mL稀释的AMPure XP珠进行AMPure XP珠提纯，且在200 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。然后用400 µL AMPure XP珠重复AMPure XP珠提纯，并在20 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20，以获得纯化的衔接子连接的样品。
AMPure XP提纯后，准备用纯化的衔接子连接的样品的PCR反应，以扩增衔接子连接的标识符寡核苷酸。向6 µL的纯化的衔接子连接的样品中，添加10 µL的NEBNext UltraII Q5主混合物、0.2 µL的100 µM正向和反向引物和3.6 µL的PCR-级H2O。正向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第一链上的第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。表3提供了使用的正向引物的序列。
表3. 用于双端衔接子连接的正向引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
反向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第二链上的第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。表4提供了使用的反向引物的序列。
表4. 用于双端衔接子连接的反向引物。
Figure 177818DEST_PATH_IMAGE004
通过重复三次的PCR反应以实验为根据确定最佳的PCR循环数。另一方面，可以已使用实时/qPCR确定最佳的PCR循环数。使用的PCR程序包括以下步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃1分钟
(4) 将步骤(2)和(3)重复9次
(5) 于65℃5分钟
使用18 µL AMPure XP珠纯化扩增的产物，并用20 µL缓冲液洗脱，所述缓冲液包含10mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）和用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems）评估扩增的产物。还将扩增的产物稀释至15 pM，用于使用包含核苷酸序列ACACTCTTTAAGACGACGTCGCTATGGCCTCTCC（SEQ ID NO：25）的定制掺入引物根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例3——用于96多重样品的具模板引物延伸方法
在所述实施例中，本公开内容的具模板引物延伸方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。在所述实施例中使用的单链核酸模板包含3'生物素部分、与收集的标识符寡核苷酸中存在的独特核酸序列互补的区域、包含独特分子标识符的核酸序列和第二扩增引物结合序列（GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，SEQ ID NO：26）。表5提供了在所述实施例中使用的单链核酸模板的序列。
表5. 用于具模板引物延伸方法的单链核酸模板
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 629659DEST_PATH_IMAGE006
单链核酸模板订购自Integrated DNA Technologies, Inc.，并使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量。将各种单链核酸模板相对于标准浓度归一化，且然后合并为等摩尔的。在包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20的缓冲液中将单链核酸模板集合体稀释至0.83 nM。
将收集的标识符寡核苷酸与单链核酸模板杂交，并通过向2 µL的每种标识符寡核苷酸样品添加10 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物（New England Biolabs）、4 µL稀释的单链核酸模板集合体和4 µL H2O进行延伸。下述PCR程序用于延伸标识符寡核苷酸：
(1) 于98℃30秒，10×
(2) 于98℃1分钟，
(3) 于68℃1分钟
(4) 于72℃1分钟
(5) 将步骤(2)-(4)重复10次
(6) 于72℃2分钟
延伸产物贮藏于4℃。在1X结合和洗涤缓冲液（5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1M NaCl）中洗涤磁性链霉抗生物素蛋白珠（MyOne链霉抗生物素蛋白C1珠，Thermo FisherScientific），并将5 µL链霉抗生物素蛋白珠添加到每种延伸产物样品中。将延伸产物样品与珠在轨道式混合器（orbital mixer）上温育至少15分钟。温育后，将样品加热至95℃达3分钟，并转移到磁性平板上。在充分的珠沉淀后立即提取上清液以产生纯化的延伸产物样品。
通过向7.5 µL的每种纯化的延伸产物样品添加12.5 µL的NEBNext Ultra II Q5主混合物、0.25 µL的100 µM正向引物、1 µL的25 µM反向引物和3.8 µL的PCR-级H2O来扩增纯化的延伸产物样品。正向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于标识符寡核苷酸上的第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。表6提供了所述实施例中使用的正向引物的序列。
表6. 用于具模板引物延伸方法的正向引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 556027DEST_PATH_IMAGE008
反向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于单链核酸模板上的第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。表7提供了使用的反向引物的序列。
表7. 用于具模板引物延伸方法的反向引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 42503DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 474752DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE013
用于扩增纯化的延伸产物的PCR程序包括以下步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃30秒
(4) 于72℃30秒
(5) 将步骤(2)-(4)重复18次
(6) 于72℃2分钟
扩增的延伸产物贮藏于4℃。将每个PCR反应的4 µL组合为四个集合体，每个集合体24个样品。
使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化合并的PCR反应，所述磁珠是通过组合100 µL AMPure XP珠和400 µL AMPure XP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用76.8 µL稀释的AMPure XP珠进行纯化，并在20 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。保留珠，并用24 µLAMPure XP缓冲液重复提纯过程，并在20 µL缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH8和0.05％吐温20。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）和用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems）评估纯化的PCR产物。还将纯化的PCR产物稀释至15 pM，用于使用包含核苷酸序列ACACTCTTTAAGACGACGTCGCTATGGCCTCTCC（SEQ IDNO：25）的定制掺入引物根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例4：用于96多重样品的长探针杂交方法
在所述实施例中，本公开内容的长探针杂交方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。在所述实施例中，第一核酸探针包含5'磷酸部分、与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列、包含i7序列（SEQ ID NO：1）的第一扩增引物结合位点、鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列和P7流动池衔接子序列（SEQ ID NO：4）。第二核酸探针包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列、包含i5序列（SEQ ID NO：2）的第二扩增引物结合位点和P5流动池衔接子序列（SEQ ID NO：3）。
第一和第二核酸探针订购自Integrated DNA Technologies, Inc.并使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量。将各种核酸探针相对于标准浓度归一化，合并为等摩尔的，并在包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20的缓冲液中稀释至0.83 nM。通过将0.5 µL稀释的核酸探针集合体与2 µL从样品溶液收集的标识符寡核苷酸混合物在包含50 mM NaCl的缓冲液中组合，来使核酸探针和标识符寡核苷酸杂交。将所述混合物于95℃加热2分钟，并于环境温度冷却30分钟，以产生退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得第一和第二核酸探针不相邻且不重叠的情况中，进行缺口延伸反应。向2.5 µL的每种退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物中，添加3.8 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物和1.3 µL PCR-级H2O。然后使混合物经受下述缺口延伸温度循环：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃1分钟
(3) 于68℃1分钟
(4) 于72℃1分钟，
(5) 将步骤(2)-(4)重复10次
(6) 于72℃2分钟
然后将缺口延伸产物贮藏于4℃。然后，通过向1 µL的缺口延伸产物添加10 µL的2X快速连接缓冲液（Enzymatics）、1 µL的T4 DNA快速连接酶（Enzymatics）和8 µL的PCR-级H2O，使第一和第二核酸探针连接在一起。将这些连接反应于20℃温育15分钟，接着用1 µL 0.5MEDTA猝灭，且合并到单个15 mL圆锥形管中。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得第一和第二核酸探针相邻且不重叠的情况中，进行切口修复连接反应。向2.5 µL的每种退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物中，添加10 µL的2X快速连接缓冲液（Enzymatics）、1 µL的T4 DNA快速连接酶（Enzymatics）和1 µL PCR-级H2O。将这些连接反应于20℃温育15分钟，接着用1 µL的0.5MEDTA猝灭，且合并到单个15 mL圆锥形管中。
然后使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化猝灭的连接反应的集合体，所述磁珠是通过组合350 µL AMPure XP珠和3.15 mLAMPure XP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用3.5 mL稀释的AMPure XP珠进行所述纯化，且在200 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。然后用400 µL AMPure XP珠重复AMPure XP珠提纯，并在20 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
为了扩增纯化的连接产物，准备了具有纯化的连接产物和引物的PCR反应。向6 µL纯化的连接产物中，添加10 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物、0.2 µL的100 µM正向引物（CAAGCAGAAGACGGCATACGA，SEQ ID NO：153）和反向引物（AATGATACGGCGACCACCGA，SEQ IDNO：154）和3.6 µL的PCR-级H2O。用于扩增纯化的延伸产物的PCR程序包括下述步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃30秒
(4) 于72℃30秒
(5) 将步骤(2)-(4)重复18次
(6) 于72℃2分钟
扩增产物贮藏于4℃。将每个PCR反应的4 µL组合为六个集合体，每个集合体16个样品。进一步使用具有64 µL AMPure XP珠的AMPure XP珠提纯纯化扩增的产物，并用20 µL缓冲液洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）和用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems）评估纯化的扩增的产物。还将纯化的扩增的产物稀释至15 pM，用于使用标准测序引物或定制掺入Read1引物（SEQ ID NO：25）根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例5——用于96多重样品的短探针杂交方法
在所述实施例中，本公开内容的短探针杂交方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。在所述实施例中，第一核酸探针包含5'磷酸部分、与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列、包含i7序列（SEQ ID NO：1）的第一扩增引物结合位点和鉴定从其释放标识符寡核苷酸的样品的特定位置的独特核酸序列。第二核酸探针包含与标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸序列、包含独特分子标识符的核酸序列和包含i5序列（SEQ ID NO：2）的第二扩增引物结合位点。
第一和第二核酸探针订购自Integrated DNA Technologies, Inc.并使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量。将各种核酸探针相对于标准浓度归一化，合并为等摩尔的，并在包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20的缓冲液中稀释至0.83 nM。通过将0.5 µL稀释的核酸探针集合体与2 µL从样品溶液收集的标识符寡核苷酸混合物在包含50 mM NaCl的缓冲液中组合，来使核酸探针和标识符寡核苷酸杂交。将所述混合物于95℃加热2分钟，并于环境温度冷却30分钟，以产生退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得第一和第二核酸探针不相邻且不重叠的情况中，进行缺口延伸反应。向2.5 µL的每种退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物中，添加3.8 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物和1.3 µL PCR-级H2O。然后使混合物经受下述缺口延伸温度循环：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃1分钟
(3) 于68℃1分钟
(4) 于72℃1分钟，
(5) 将步骤(2)-(4)重复10次
(6) 于72℃2分钟
然后将缺口延伸产物贮藏于4℃。然后，通过向1 µL的缺口延伸产物添加10 µL的2X快速连接缓冲液（Enzymatics）、1 µL的T4 DNA快速连接酶（Enzymatics）和8 µL的PCR-级H2O，使第一和第二核酸探针连接在一起。将这些连接反应于20℃温育15分钟，用1 µL 0.5MEDTA猝灭，且合并到单个15 mL圆锥形管中。
在第一和第二核酸探针与标识符寡核苷酸杂交从而使得第一和第二核酸探针相邻且不重叠的情况中，进行切口修复连接反应。向2.5 µL的每种退火的标识符寡核苷酸-核酸探针混合物中，添加10 µL的2X快速连接缓冲液（Enzymatics）、1 µL的T4 DNA快速连接酶（Enzymatics）和1 µL PCR-级H2O。将这些连接反应于20℃温育15分钟，接着用1 µL的0.5MEDTA猝灭，且合并到单个15 mL圆锥形管中。
然后使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化猝灭的连接反应的集合体，所述磁珠是通过组合350 µL AMPure XP珠和3.15 mLAMPure XP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用3.5 mL稀释的AMPure XP珠进行所述纯化，且在200 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。然后用400 µL AMPure XP珠重复AMPure XP珠提纯，并在20 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
为了扩增纯化的连接产物，准备了具有纯化的连接产物和引物的PCR反应。向6 µL纯化的连接产物中，添加10 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物、0.2 µL的100 µM正向引物和反向引物和3.6 µL的PCR-级H2O。正向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第一链上的第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。表8提供了使用的正向引物的序列。
表8. 用于短探针杂交方法的正向引物。
Figure 210627DEST_PATH_IMAGE014
反向引物包含适合于测序的流动池衔接子序列、独特分子标识符和与位于核酸衔接子第二链上的第二扩增引物结合位点互补的核酸序列。表9提供了使用的反向引物的序列。
表9. 用于短探针杂交方法的反向引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE015
用于扩增纯化的延伸产物的PCR程序包括下述步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃30秒
(4) 于72℃30秒
(5) 将步骤(2)-(4)重复18次
(6) 于72℃2分钟
扩增产物贮藏于4℃。将每个PCR反应的4 µL组合为六个集合体，每个集合体16个样品。进一步使用具有64 µL AMPure XP珠的AMPure XP珠提纯纯化扩增的产物，并用20 µL缓冲液洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8和0.05％吐温20。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）和用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒（Kapa Biosystems）评估纯化的扩增的产物。还将纯化的扩增的产物稀释至15 pM，用于使用标准测序引物或定制掺入Read1引物（SEQ ID NO：25）根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例6——用于96多重样品的直接PCR方法
在所述实施例中，本公开内容的直接PCR方法用于对从96多重样品收集的标识符寡核苷酸进行测序。在所述实施例中，使用了8个种类的正向扩增引物和12个种类的反向扩增引物。正向引物包含P5流动池衔接子（SEQ ID NO：3）、包含独特分子标识符的核酸序列和与存在于标识符寡核苷酸上的第一扩增引物结合位点互补的区域。表10提供了使用的正向扩增引物的序列。
表10. 用于直接PCR方法的正向扩增引物。
Figure 816052DEST_PATH_IMAGE016
反向引物包含P7流动池衔接子（SEQ ID NO：4）、包含独特分子标识符的核酸序列和与存在于标识符寡核苷酸上的第二扩增引物结合位点互补的区域。表11提供了使用的反向扩增引物的序列。
表11. 用于直接PCR方法的反向扩增引物。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure 281668DEST_PATH_IMAGE018
在8种正向扩增引物和12种反向扩增引物的情况下，当组合来自一对正向和反向引物的独特分子标识符时，可获得总计96种独特的组合，从而允许96种样品的多重化。
为了扩增收集的标识符寡核苷酸用于进行测序，在96-孔平板上准备了用收集的标识符寡核苷酸以及正向和反向扩增引物的PCR反应，其具有2µL的每种标识符寡核苷酸样品、10 µL的NEBNext Ultra II Q5主混合物、2 µL的10 µM正向扩增引物、2 µL的反向扩增引物和4 µL的PCR-级H2O。96-孔平板中的每个孔均含有标识符寡核苷酸样品以及正向和反向扩增引物的独特组合。使用的PCR程序包括下述步骤：
(1) 于98℃30秒
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃30秒
(4) 于72℃30秒
(5) 将步骤(2)-(4)重复6-10次
(6) 于72℃2分钟
扩增的产物贮藏于4℃。将每个PCR反应的10 µL组合到单个15 mL圆锥形管中。
使用稀释的Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter Genomics Inc.）纯化合并的PCR反应，所述磁珠是通过组合115.2 µL AMPure XP珠和1036.8 µL AMPure XP缓冲液（2.5M NaCl，20％PEG8000）制备的。用1152 µL稀释的AMPure XP珠进行纯化，并在60 µL的缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8。用60 µL AMPure XP珠重复纯化过程，并在70 µL缓冲液中洗脱，所述缓冲液包含10 mM Tris pH 8。
在AMPure XP提纯后，使用9 µL合并的直接PCR产物、15 µL NEBNext Ultra II Q5主混合物、3 µL的10 µM通用P7引物（SEQ ID NO：153）和2 µL的10 µM通用P5引物（SEQ IDNO：154）准备用通用引物的PCR反应。使用的PCR程序是：
(1) 于98℃30秒，
(2) 于98℃10秒
(3) 于65℃30秒
(4) 于72℃30秒
(5) 将步骤(2)-(4)重复15-24次
(6) 于72℃2分钟
进行了两轮AMPure XP珠提纯。第一轮用30 µL珠进行，并用20 µL包含10 mM Tris pH8的缓冲液洗脱，且第二轮用20 µL珠进行，并用11 µL包含10 mM Tris pH 8的缓冲液洗脱。
使用2100生物分析仪上的高灵敏度DNA芯片（Agilent Genomics）评估这些纯化的PCR产物。还将纯化的PCR产物稀释，用于使用定制掺入引物（SEQ ID NO：25）根据制造商的说明书（MiSeq试剂盒v3 2×75 bp）在MiSeq（Illumina）上测序。
实施例7——空间检测FFPE样品中的靶分析物
本发明的方法用于在发炎的人扁桃体组织FFPE切片的样品中空间检测许多不同的靶分析物，包括靶蛋白和靶RNAs。
在一个实验中，使用本公开内容的方法在从发炎的人扁桃体组织FFPE切片切割的两个连续切片中空间检测了30种不同的靶蛋白。30种靶蛋白在表12中提出。所述30种靶蛋白包括IgG兔同种型和IgG小鼠同种型作为阴性对照，因为这些靶蛋白在发炎的人类扁桃体样品中不应该存在，且因此不应该已被检测到。
表12. 靶蛋白
Figure DEST_PATH_IMAGE019
为了空间检测30种靶蛋白，使用了本公开内容的30种不同的探针。每种探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与表12中的30种靶蛋白之一特异性结合的抗体。两个连续切片与许多30种不同探针接触。然后鉴定了九十六个感兴趣的区域（ROI）。对于每个ROI，用紫外线照射ROI，以从结合在ROI内的探针中释放标识符寡核苷酸。然后使用本公开内容的短探针杂交方法收集并鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测两个连续切片中的30种靶蛋白。如图21中所示的，两个连续切片的每个ROI中每种靶蛋白的读长数均良好地相关，从而证实所述方法产生了可重复的结果。
在第二个实验中，使用本公开内容的方法在从发炎的人扁桃体组织FFPE切片切割的两个不同连续切片中空间检测了20种不同的靶RNAs。20种不同的靶RNAs在表13中提出。所述20种靶RNA包括不应该已在样品中检测到的6种阴性对照（阴性探针（NegativeProbe））。
表13. 靶RNAs
Figure 681557DEST_PATH_IMAGE020
为了空间检测20种靶RNAs，使用了本公开内容的20种不同的探针。每种探针包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含与所述20种靶RNAs之一的至少一部分互补的核酸序列。两个连续切片与许多20种不同探针接触。然后鉴定了九十六个感兴趣的区域（ROI）。对于每个ROI，用紫外线照射ROI，以从结合在ROI内的探针中释放标识符寡核苷酸。然后使用本公开内容的直接PCR方法收集并鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测两个连续切片中的20种靶RNAs。如图22中所示的，两个连续切片的每个ROI中每种靶RNA的读长数均良好地相关，从而证实所述方法产生了可重复的结果。
实施例8——空间检测荧光染色的FFPE样品中的靶蛋白
在另一个实验中，用4种荧光显示标记对发炎的人扁桃体组织的5 µm FFPE切片进行染色：（1）CD3E，T-细胞标记；（2）PanCK，上皮细胞标记；（3）Ki-67，增殖标记；和（4）SYTO83，DNA染料，如图23左图中所示的。然后使染色的FFPE切片与针对30种靶蛋白的探针接触，如实施例7中所述的。如图23左图中所示的，选择了96个感兴趣的区域（ROIs）。每个ROI是一个直径为500 µm的圆圈。对于每个ROI，用紫外线照射ROI，以从结合在ROI内的探针中释放标识符寡核苷酸。然后使用本公开内容的短探针杂交方法收集并鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测FFPE切片中的30种靶蛋白。如图23右图中所示的，在与其荧光显示标记相关的ROIs中空间检测了PanCK、CD3E和Ki67。因此，通过本公开内容的方法产生的结果与使用确立的免疫组织化学方法产生的结果相关。
实施例9——空间检测FFPE样品中的靶RNAs
在另一个实验中，使来自发炎的人扁桃体组织FFPE块的5 µm切片与针对20种靶RNAs的探针接触，如实施例7中所述的。然后选择96个感兴趣的区域（ROIs）。每个ROI是一个直径为500 µm的圆圈。对于每个ROI，用紫外线照射ROI，以从结合在ROI内的探针中释放标识符寡核苷酸。然后使用本公开内容的直接PCR方法收集并鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测两个连续切片中的20种靶RNAs。然后分离来自相同的发炎的人扁桃体组织FFPE块的20µm切片的总RNA。使用NanoString nCounter®系统分析总RNA。图24显示，使用本公开内容的方法记录的11种不同RNA靶的平均计数数目与使用nCounter®系统记录的相同的11种不同RNA靶的平均计数数目良好相关。因此，使用本公开内容的方法产生的结果与使用确立的直接检测方法产生的结果相关。
实施例10——空间检测ROI的特定亚区中的靶RNAs
在另一个实验中，使来自发炎的人扁桃体组织FFPE块的5 µm切片与针对30种靶蛋白的探针接触，如实施例7中所述的。相同的5 µm切片也用4种荧光显示标记染色：（1）CD3E，T-细胞标记；（2）PanCK，上皮细胞标记；（3）Ki-67，增殖标记；和（4）SYTO83，DNA染料。如图25中所示的，鉴定了48个感兴趣的区域（ROIs）。对于每个ROI，然后基于荧光染色鉴定了两个亚区。对于PanCK荧光染色阳性的ROI区域（PanCK+）称为“肿瘤”亚区，且缺乏PanCK荧光染色的ROI区域称为“微环境”亚区，如图25中所示的。对于每个ROI，通过基于PanCK荧光染色的强度产生定制的掩膜片（mask），分别用紫外线照射肿瘤亚区和微环境亚区，以从结合在每个亚区内的探针中释放标识符寡核苷酸。还分别收集了释放的标识符寡核苷酸。然后，使用本公开内容的短探针杂交方法和NanoString nCounter®系统来分析收集的标识符寡核苷酸。如图25底部图中所示的，使用NanoString nCounter®系统和本公开内容的短探针杂交方法的结果良好地相关。此外，在肿瘤亚区中，与微环境亚区相比，以显著更高的水平检测到PanCK。因此，本公开内容的方法提供的空间检测结果与确立的荧光免疫组织化学方法一致，并允许在样品的高度特定区域内的空间检测。
实施例11——96-重人免疫肿瘤学实验对象组
设计了供本发明的直接-PCR方法之用的96-重人免疫肿瘤学实验对象组。所述实验对象组包含许多可用于使用本公开内容的直接-PCR方法空间检测96种不同的人靶RNAs的探针。表14中显示了96种靶RNAs。
表14. 靶RNAs
Figure DEST_PATH_IMAGE021
所述实验对象组总计包括928种不同的探针。每种探针均包含标识符寡核苷酸，所述标识符寡核苷酸包含第一扩增引物结合位点、包含独特分子标识符的核酸序列、鉴定结合至靶结合结构域的靶RNA的独特核酸序列和第二扩增引物结合位点。图26显示了实验对象组中使用的探针的示意图。对于96种靶RNAs中的每一种，在928种探针组中至少有一种探针包含与所述靶RNA直接或间接杂交的靶结合结构域。对于96种靶RNAs中的大多数，有10种直接或间接与特定靶RNA杂交的不同探针。这10种不同的探针直接或间接与靶RNA的不同位置杂交，以产生“平铺”效应，如图27的顶部图中所示的。将多种探针平铺到靶RNA上意味着每种靶RNA可以被单独检测多次，从而提高了测量的总准确性。例如，如图27底部图中所示的，在将10种探针平铺到单个靶RNA上的情况中，一种探针可能被错误地太多次检测（异常值高计数探针），而另一种探针可能被错误地太少次检测（异常值低计数探针）。然而，其他8种探针可能以相似的水平检测，从而表明在分析过程中应抛弃所述两个异常值，并且来自8种探针的信号用于产生更准确的靶RNA丰度的测量结果。
所述928种探针的组还包括80种阴性对照探针。80种阴性对照探针的每一种均包含靶结合结构域，所述靶结合结构域包含混乱的非特异性核酸序列，其是使用来自外部RNA对照联盟（External RNA Controls Consortium）的指导原则设计的，从而使得靶结合结构域不应与人样品内存在的RNA分子互补。因此，在分析过程中不应检测到这80种阴性对照探针。
96-重人免疫肿瘤学实验对象组用于分析组织微阵列。组织微阵列包含22种常见人细胞系的FFPE样品，包括正常和癌性细胞类型。表15中显示了一些所述细胞系。
表15. 细胞系
Figure 107990DEST_PATH_IMAGE022
组织微阵列还包含一种小鼠细胞系（3T3）作为阴性对照。使微阵列上的每种FFPE样品与许多免疫肿瘤学实验对象组中的928种不同探针接触。如图28中所示的，对于每种FFPE样品，选择至少三个直径为300 µm的圆形的感兴趣的区域（ROIs）。作为阴性对照，还可以在不包含FFPE样品的微阵列区域（玻璃阴性对照）上选择ROIs。对于每个ROI，用紫外线照射ROI，以从结合在ROI内的探针中释放标识符寡核苷酸。然后使用本公开内容的直接PCR方法收集并鉴定释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测组织微阵列上的每种FFPE样品中的96种靶RNAs。
图29显示使用MiSeq v3流动池实现的足够的读长深度。图30的顶部图显示了对于玻璃阴性对照ROIs，未空间检测到靶RNAs。同样，图30的底部图显示在阴性对照小鼠3T3FFPE样品中几乎没有检测到靶RNAs。相反，如图31、33和34中所示的，在HEK293（人胚肾）FFPE样品和Jurkat（人T-细胞淋巴细胞）FFPE样品中成功检测到特异性靶RNAs。图31、33和34显示对于特定靶RNAs，包括AKT1、B2M、CD3E、HIF1A、PTEN、RPS6、STAT1、STAT2、STAT3、VEGF、PTPRC (CD45)和KRT1/10/18/19，检测到“平铺的”探针簇。这些结果表明，在两种不同的细胞系中存在差异转录的某些靶RNAs。还使用NanoString nCounter系统验证了所述实验的结果，以鉴定收集的标识符寡核苷酸。如图27中所示的，使用本公开内容的直接-PCR方法的结果与使用NanoString nCounter系统获得的结果一致。
Figure IDA0002718289890000011
Figure IDA0002718289890000021
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Claims (20)

1.用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：
（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列；
（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；
（3）收集释放的标识符寡核苷酸；
（4）使第一核酸探针和第二核酸探针与所述释放的标识符寡核苷酸杂交，
其中所述第一核酸探针包含：
与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸，
包含独特分子标识符的核酸序列，
第一扩增引物结合位点，且
其中所述第二核酸探针包含：
与所述标识符寡核苷酸的一部分互补的核酸，和
第二扩增引物结合位点，且
其中所述第一和第二核酸探针与所述标识符寡核苷酸杂交，从而使得所述第一和第二核酸探针相邻但不重叠；
（5）将杂交的第一和第二核酸探针连接在一起；
（6）扩增步骤（5）中产生的连接产物；和
（7）通过对步骤（6）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
2.权利要求1的方法，其中扩增所述连接产物包括进行PCR。
3.权利要求2的方法，其中进行PCR包括第一扩增引物和第二扩增引物，
其中所述第一扩增引物包含：
第一流动池结合位点；
第一鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；和
与所述第二扩增引物结合位点互补的核酸序列；且
其中所述第二扩增引物包含：
第二流动池结合位点；
第二鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列；和
与所述第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述扩增引物的至少一种包含亲和分子。
5.权利要求1的方法，其中所述鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列包含约10个核苷酸至约50个核苷酸。
6.权利要求1的方法，其中所述扩增引物结合位点的至少一种包含约20至约50个核苷酸。
7.用于空间检测来自组织样品的至少一种细胞中的至少一种靶分析物的方法，包括：
（1）使组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物与至少一种包含靶结合结构域和标识符寡核苷酸的探针接触，其中所述标识符寡核苷酸包含：
鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列，
包含独特分子标识符的核酸序列，
第一扩增引物结合位点，和
第二扩增引物结合位点；
（2）对所述组织样品的位置提供足以释放所述标识符寡核苷酸的力；
（3）收集释放的标识符寡核苷酸；
（4）扩增收集的标识符寡核苷酸；
（5）通过对步骤（4）中产生的扩增产物进行测序来鉴定所述释放的标识符寡核苷酸，从而空间检测所述组织样品中至少一种细胞中的至少一种靶分析物。
8.权利要求7的方法，其中扩增所述收集的标识符寡核苷酸包括进行PCR。
9.权利要求8的方法，其中进行PCR包括第一扩增引物和第二扩增引物，
其中所述第一扩增引物包含：
第一流动池结合位点；
第一鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列；和
与所述第二扩增引物结合位点互补的核酸序列；且
其中所述第二扩增引物包含：
第二流动池结合位点；
第二鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的样品的特定位置的核酸序列；和
与所述第一扩增引物结合位点互补的核酸序列。
10.权利要求3或9的方法，其中所述流动池结合位点的至少一种包含适合于测序的流动池衔接子序列。
11.权利要求3或9的方法，其中所述流动池结合位点的至少一种包含P5流动池衔接子序列，其中所述P5流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：3所示的序列。
12.权利要求3或9的方法，其中所述流动池结合位点的至少一种包含P7流动池衔接子序列，其中所述P7流动池衔接子序列包含SEQ ID NO：4所示的序列。
13.权利要求3或9的方法，其中所述流动池结合位点的至少一种包含约15至约40个核苷酸。
14.权利要求7的方法，其中所述鉴定结合至所述靶结合结构域的靶分析物的独特核酸序列包含约5个核苷酸至约25个核苷酸。
15.权利要求7的方法，其中所述扩增引物结合位点的至少一种包含约10至约40个核苷酸。
16.权利要求1或7的方法，其中所述扩增引物结合位点的至少一种包含i7序列，其中所述i7序列包含SEQ ID NO：1所示的序列。
17.权利要求1或7的方法，其中所述扩增引物结合位点的至少一种包含i5序列，其中所述i5序列包含SEQ ID NO：2所示的序列。
18.权利要求3或9的方法，其中所述鉴定从其释放所述标识符寡核苷酸的组织样品的特定位置的核酸序列的至少一种包含约1至约20个核苷酸。
19.权利要求1或7的方法，其中所述包含独特分子标识符的核酸序列包含约5至约20个核苷酸。
20.权利要求7的方法，其中所述靶结合结构域包含约10个核苷酸至约70个核苷酸。
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