CN115896252A - 用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品 - Google Patents

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Abstract

一种组织样本中的核酸的局部或空间检测的方法和产物,所述方法包括(a)提供包括基板的阵列，所述基板上固定了多种捕获探针，所述探针每种在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端，其中所述捕获探针的每种都包括核酸分子；(b)令所述阵列与组织样本相接触，以使得阵列上的捕获探针的位置能和组织样本上的位置相关联，并允许组织样本上的核酸与所述捕获探针的捕获域杂交；(c)以所述捕获探针为延长引物或连接引物，从已捕获的核酸分子生成DNA分子，其中所述延长后或连接后的DNA分子以定位域标记；(e)从阵列表面释放至少部分被标记DNA分子和/或他们的互补链或扩增子；以及(f)直接或间接分析被释放DNA分子的序列。

Description

用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品
技术领域
本发明主要涉及组织样本中核酸的局部或空间检测。所述核酸可以是RNA或DNA。因此，本发明提供的方法可用于检测和/或分析RNA(例如RNA转录体)或基因组DNA，以获取组织样本(例如个体细胞)中有关基因定位、分布或表达的空间信息，或确切地说，任何基因组变异(不一定非得是基因中的变异)的定位或分布的空间信息。因此，本发明使空间基因组学和空间转录组学研究成为可能。
一种定量和/或定性的方法，能够分析组织样本中的基因组序列分布、位置或表达，其中所述组织样本中保有空间表达、分布或定位格局。因此，所述新方法提供了一种实施“空间转录组学”或“空间基因组学”研究的流程，令使用者能同时测定组织样本中所含的已表达表达基因、基因或基因组位点的表达格局或定位/分布格局。
具体来说，本发明是基于阵列技术与高通量DNA测序技术的联用，捕获并以定位标记来标记组织样本中的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)，尤其是mRNA或DNA。然后，合成DNA分子，并对其进行测序和分析，以确定该组织样本的任何部分中哪些基因获得了表达。优选地，可以同时获取该组织样本中每个细胞单独、分开、特定的转录组。因此，本发明的方法可说是提供了组织样本中个体细胞高度并行的综合转录组签名，且不会丢失所述受测组织样本中的空间信息。本发明还提供了一种实施本发明方法的阵列及制作本发明阵列的方法。
背景技术
人体含有超过100万亿个细胞，这些细胞组成了超过250个不同的器官和组织。我们还远未理解大脑等复杂器官的发育和组织，因此，还有必要利用量化的方法剖析这些组织中所表达基因的表达形式，确定控制这些组织发育和功能的基因。这些器官自身便是分化细胞的混合体，所述细胞使得如营养运输、防御等各种身体机能得到协同和维持。因此，细胞功能取决于该细胞在特定组织结构中的位置和它与该组织中其它细胞间直接和间接的相互作用。因此，有必要理清这些相互作用如何在转录水平上影响组织中的每个细胞。
RNA深度测序的最新发现表明，人体细胞系中的大多数转录体都能被检测，且大部分(75％)的人类蛋白质编码基因都在大多数组织中有所表达。类似地，一项针对1％的人类基因组的详细研究表明，染色体进行的是泛转录，全部碱基中有大部分被包含在初级转录体中。因此，可以说该转录机制在全局水平上是混杂的。
众所周知，转录体仅是蛋白质丰度的近似指标，因为从任何一个转录体生成的蛋白质数量都受到RNA翻译、降解速度等的影响。对此，最近有一项人体器官和组织的免疫分析暗示，组织特异性是通过对蛋白质水平的精确时间、空间控制来获得的，且身体不同组织获取其独有特质的途径，并非通过控制蛋白质表达的种类，而是通过控制每种蛋白质的表达数量。
然而，接下来有全局研究比较了转录组和蛋白质组的相关性，证明全体基因中的大部分都得到了表达。有趣的是，研究发现个体基因产物的RNA变化和蛋白质水平间存在高相关性，这就表明，对个体细胞转录组的研究对了解蛋白质的功能角色上具有生物学意义。
的确，对生物组织的细胞组织和表达格局的分析，是生物医学研究和诊断学上的里程碑。细胞组织学运用各种染色技术，在一个多世纪前便首先确定了健康器官的基本结构机制和常见病理学变化。该领域的发展，带来了以免疫组织化学和原位杂交的基因表达来研究蛋白质分布的可能性。
但是，愈发先进的组织学和基因表达技术并行发展，却导致了成像技术与转录组分析的分离，因而在本发明提供的方法之前，还没有任何将空间分辨率用于全转录组分析的可行办法。
作为原位技术的替代方式或补充方式，蛋白质和核酸的体外分析方法也得到了发展，即：从完整组织样本、单一细胞类型或甚至单个细胞中提取分子，并在所述提取物中通过ELISA、qPRC等方法对特定分子进行定量。
基因表达分析的最新发展，为利用微阵列或RNA测序评估组织的完整转录组提供了可能，这些发展有助于我们对生物过程的理解和诊断学研究。然而，典型的转录组分析以从整块组织(或者甚至完整生物体)提取的mRNA为实施对象，但是要收集较小的组织区域或个体细胞用于转录组分析，却一般非常费力、费钱且精确度低。
因此，大多数基于微阵列或下一代RNA测序的基因表达研究，都采用包含许多细胞的代表性样本，由此一来，研究结果代表的是受测基因的平均表达水平。在某些情况下，除全局基因表达平台外，还对具有显著差异的细胞进行了分离(Tang F et al,NatProtoc.2010；5:516-35；Wang D&Bodovitz S,Trends Biotechnol.2010；28:281-90)，获得了关于细胞间差异的非常精确的信息。然而，至今为止，还没有以高分辨率来研究完整组织中的转录活性的高通量方法。
发明内容
因此，基因表达格局分析的现有技术一次仅能提供一个或几个基因的转录信息，或在提供同一样本中的所有基因信息的同时损失其位置信息。因此，显然需要能够同时、分别、特异测定样本中每个细胞的转录组的方法，即是说，需要能够提供含空间分辨率的转录信息的组织样本全局基因表达分析方法，而本发明就满足了这一需要。
本发明中所述方法和产物的创新途径，采用了目前业已完善的阵列和测序技术来获得一个样本中全部基因的转录信息，且同时保留每个转录体的位置信息。对本领域技术人员来说，这显然是生命科学中的一个里程碑。该新技术开创了所谓“空间转录组学”的新领域，并可能将对我们对所有多细胞生物的组织发育和组织、细胞功能方面的认识带来深远的影响。显然，这样的技术在促进对疾病状态的成因和发展的理解和开发针对这些疾病的有效治疗措施方面将尤其有用，例如癌症。本发明的方法还可应用在许多疾病的诊断中。
虽然如下具体所述，本发明最初的目的在于转录组研究，本发明的原理和方法还可以应用于DNA分析，由此也能用于基因组分析(“空间基因组学”)。由此一来，在最广泛意义上，本发明主要可用于核酸的检测和/或分析。
阵列技术，特别是微阵列，发源于斯坦福大学的研究，该研究将少量DNA寡核苷酸成功地贴附在玻璃表面，呈有序排列，即所谓的“阵列”，并用其监控了45个基因的转录(Schena M et al,Science.1995；270:368-9,371)。
自此以后，全世界的科学家们运用微阵列技术已经发表了超过3万篇论文。多种微阵列被开发出来，以适应各种应用，例如，检测单核苷酸多态性(SNPs)或基因型或重新测序突变基因组，且微阵列技术的一项重要应用是基因表达分析。的确，基因表达微阵列的发明目的是用作一种分析特定样本中已表达基因材料水平的方法，但其真正的成功却在于为同时比较许多基因的表达水平带来了可能。针对此类实验，市场上有若干现成的微阵列平台商品，但也可以制作定制的基因表达阵列。
虽然微阵列在基因表达研究中的应用现已普及，但显然，更加先进并全面的所谓“下一代DNA测序”(NGS)技术正开始替代DNA微阵列在许多应用中的位置，例如，深度转录组分析。
用于超快速基因组测序的NGS技术的开发，是生命科学中的一座里程碑(Petterson E et al,Genomics.2009；93:105-11)。这些新技术已经急剧地降低了DNA测序的成本，并能在前所未有的速度下测定高等生物的基因组，包括特定个体的基因组(WadeCM et al Science.2009；326:865-7；Rubin J et al,Nature 2010；464:587-91)。高通量基因组学的新进展已给生物学研究格局带来了天翻地覆的变化，除基因组完整鉴定外，还能用数字化定量的方式来研究全转录组。近年来，用于此类全方位数据组的可视化和整合的生物信息学工具也得到了显著的进步。
然而，人们惊奇地发现，对于以二维空间分辨率为其信息特征的组织样本来说，利用细胞组织学技术、微阵列技术和NGS技术的独特结合，可从该样本的多个细胞获得全面的转录或基因组信息。因此，从一个极端角度来说，本发明的方法可用于分析样本中单一细胞的单一基因的表达，同时保留该细胞在其组织样本中的空间信息；而从另一个极端及本发明的优选方面来说，所述方法可用于同时确定一个样本中每个细胞，或基本上所有细胞的每个基因的表达，即：一个组织样本中的全局空间表达格局。显然，本发明的方法也可用于中间分析。
以下简要说明本发明的最简化形式。本发明需要反转录(RT)引物，该引物还包括独有的定位标记(结构域)，并将该引物在如玻璃载片等目标基板上排列产生“阵列”。这些独有的定位标记对应于该RT引物在阵列上的位置(阵列特征)。将组织薄片放置于阵列上，并在目标载片上进行反转录反应。该RT引物与组织样本中的RNA结合(或杂交)，以结合的RNA作为模版并延长获得cDNA，所得cNDA也因此贴附在所述阵列表面。由于RT引物的独一无二定位标记的存在，每个cDNA序列都载有模版RNA在组织切片中的位置信息。在cDNA合成步骤之前或之后，可通过染色或拍照等方法令该组织薄片可视化或成像，令cDNA分子中的定位标记得以与组织样本中的某个位置相关联。对该cDNA进行测序，获得含有准确位置信息的转录组结果。该过程的示意图如图1所示。然后，可将测序数据与组织样本中的某个位置配对，令测序数据与组织切片共同可视化，如借由电脑，例如，展示整个组织上任何感兴趣的基因的表达格局(图2)。类似地，还可以在电脑屏幕上标记组织切片的不同区域，选取任意感兴趣的区域并获得所选区域间不同的表达基因的信息。显然，本发明的方法可获得的数据与运用研究mRNA群的现有方法获得的数据具有鲜明对比。举例来说，基于原位杂交的方法仅能提供单一mRNA转录体的相对信息。因此，本发明的方法比现有的原位技术具有明显的优势。本发明的方法可获得的全局基因表达信息还可包括共表达信息和转录丰度的定量估计。显然，本方法是一种广泛适用的方法策略，可应用于任何物种，例如，动物、植物和真菌的任何组织的分析。
如上所述，并将在下文中详细论述，该基本方法显然还可以容易地扩展应用于基因组DNA分析，例如，用于包含一个或多个特异突变的组织样本的细胞鉴定。举例来说，可以将基因组DNA断裂成片段，并与引物(相当于如上所述的RT引物)杂交，该引物能捕获DNA片段(例如，可在所述DNA片段上连接一个具有所述引物的互补序列的接合物，或可用酶促等方法延长DNA片段，向其序列末端加入额外的核苷酸，如poly-A尾，来生成能与该引物互补的序列)并引导对捕获分子的互补链的合成。该分析的余下步骤可如上所述。因此，下文中基于转录体分析的背景来描述的本发明具体实施例，也可在适宜情形下用于基因组DNA的分析方法中。
从以上说明中可以看出，与位置信息结合的转录组或基因组信息具有巨大的价值。举例来说，它能够以高分辨率进行全局基因表达绘图，而这一技术可应用于许多方面，例如包括癌症研究和诊断学研究。
进一步来说，显然本发明所述方法与前述用于组织样本全转录组分析的方法间具有显著差异，且这些差异具有众多优点。本发明基于一项令人惊奇的发现，即：使用组织薄片并不会干扰由贴附于阵列表面的引物(例如反转录引物)所引导的DNA(例如，cDNA)的合成。
因此，在其首要且最广泛的意义上，本发明提供一种组织样本中的核酸局部检测方法，包括：
(a)提供包括基板的阵列，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，每一种类所述探针在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端以使所述探针能作为引导延长反应或连接反应的引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，和
(ii)捕获域；
(b)令所述阵列与组织样本接触，以使得阵列上的捕获探针的位置能和所述组织样本上的位置相关联，并允许组织样本上的核酸与所述捕获探针的捕获域杂交；
(c)以所述捕获探针作为延长引物或连接引物，从已捕获的核酸分子上产生DNA分子，其中所述被延长或连接的DNA分子以定位域标记；
(d)可选地，生成所述被标记DNA的互补链和/或可选地，扩增所述被标记DNA；
(e)从阵列表面释放至少部分被标记DNA分子和/或它们的互补链或扩增子，其中所述部分包括定位域或其互补链；
(f)直接或间接分析被释放DNA分子的序列。
本发明的方法与本领域其他空间转录组学方法相比具有显著优势。例如，本发明描述的方法可获得组织样本中所有转录体的全局和空间分布；此外，还可以量化阵列上的每个位置或特征上的每个基因的表达，因此能在一个简单阵列的数据基础上实施多种分析。因此，本发明的方法使检测和/或量化单一组织样本的所有基因的空间表达成为可能。此外，由于转录体的丰度非直接可视，例如，通过荧光反应，与标准微阵列相似，即使同一样本中的所述转录体以迥然相异的浓度存在，也可以测量单一样本中的基因表达。
相应地，在另一个更具体的方面，本发明可看作提供了一种用于测定和/或分析组织样本转录组的方法，包括：
(a)提供包括基板的阵列，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，每一种类所述探针在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端以使所述探针能作为反转录(RT)引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，和
(ii)捕获域；
(b)令所述组织样本与阵列接触，以使阵列上的捕获探针的位置与组织样本上的位置相关联，且允许该组织样本上的RNA与所述捕获探针上的捕获域杂交；
(c)利用所述捕获探针作为RT引物，从已捕获的RNA分子生成cDNA分子，且可选地，扩增所述cDNA分子；
(d)从阵列表面释放至少部分所述cDNA分子和/或可选地，其扩增子，其中所述被释放的分子可以是cDNA的第一和/或第二链分子或其扩增子，且其中所述部分包括定位域或其互补链；
(e)直接或间接地分析被释放分子的序列。
如下文所述，所述分析步骤中可以采用任何核酸分析方法。典型地，该步骤可以包括测序，但进行序列测定实际上并非必要步骤。举例来说，可以采用序列特异性分析方法。例如，可以实施序列特异性扩增反应，比如通过使用引物，且该引物对所述定位域和/或一种特定的目标序列，例如，一种待测的特定目标DNA(即：与一种特定的cDNA/RNA或基因相对应等)，具有特异性。一种典范性的分析方法是序列特异性的PCR反应。
按照步骤(e)所得到的的序列分析信息可被用于获得样本中RNA的空间信息。换句话说，该序列分析信息可以提供有关样本中RNA的位置信息。该空间信息可从测得的序列分析信息的性质来推定，例如，其可以揭示一种特定RNA的存在，而该RNA可能在所用组织样本的环境中本身就具有空间信息意义，以及/或者可以结合阵列上组织样本的位置和测序信息来推定空间信息(例如，空间定位)。因此，本方法可以仅包括将序列分析信息与组织样本的某个位置相关联的步骤，例如，利用定位标记和其与组织样本上某位置间的关联性。但是，如上所述，作为本发明的一种优选实施方式，可以通过关联序列分析数据和组织样本图像来便利地获得空间信息。相应地，在一个优选实施例中，所述方法还可以包括一个步骤，即：
(f)将所述序列分析信息与所述组织样本的图像相关联，其中该组织样本在步骤(c)之前或之后成像。
从其最广义上来说，本发明的方法可以用于组织样本中某一核酸的局部检测。因此，在一个实施例中，本发明的方法可用于测定和/或分析组织样本中的全部转录组或基因组，例如，组织样本的全转录组。但是，本方法并不局限于此，而是包括测定和/或分析全部或部分转录组或基因组。因此，本方法可以包括测定和/或分析转录组或基因组的部分或子集，例如与一个基因子集相对应的转录组，又如，一个特定基因子集，如与一种特定的疾病或症状、组织类型等相关的基因子集。
从另一方面来看，如上所述的本方法步骤可以看作是提供了一种用于获取具有空间限定的转录组或基因组的方法，特别是含空间限定的组织样本全局转录组或基因组。
从另一方面来看，本发明的方法可被看做是一种用于组织样本中的核酸(即DNA或RNA)的局部或空间检测方法，或用于组织样本核酸(DNA或RNA)的局部或空间测定和/或分析的方法。特别地，本方法可用于组织样本中基因表达或基因组变异的局部或空间检测、确定和/或分析。该局部/空间检测/确定/分析意味着可对RNA或DNA在组织样本的细胞或组织中的天然位置或位点进行定位。因此，举例来说，可将RNA或DNA定位于样本上的一个细胞、细胞群或细胞类型，或组织样本中的特定区域。所述RNA或DNA的天然位点或位置(或者换句话说，所述RNA或DNA在组织样本中的位点或位置)，例如，一个已表达的基因或基因组位点，可得到确定。
本发明还可被看作是提供了一种用于本发明的方法中的阵列，包括基板，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，每一种类所述探针在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端以使所述探针能作为反转录(RT)引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上含有：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，和
(ii)捕获域，用于捕获与所述阵列相接触的组织样本的RNA。
在一个相关方面上，本发明还提供了一种阵列的用途，该阵列包括基板，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，每一种类所述探针在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端以使所述探针具有反转录(RT)引物的功能，其中所述捕获探针的每一种类包括一个核酸分子，该核酸分子从5’端至3’端的方向上含有：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，和
(ii)捕获域；
用于捕获与所述阵列相接触的组织样本的RNA。
优选地，所述用途是用于测定和/或分析组织样本的转录组，特别是全转录组，且进一步包括以下步骤：
(a)以所述捕获探针作为RT引物，从已捕获的核酸分子生成cDNA分子，且可选地，扩增所述cDNA分子；
(b)从所述阵列表面释放至少部分所述cDNA分子和/或可选地，其扩增子，其中所述被释放的分子可以是cDNA分子的第一和/或第二链或其扩增子，且其中所述部分包括定位域或其互补链；
(c)直接或间接地分析被释放分子的序列；且可选地
(d)将所述序列分析信息与所述组织样本的图像相关联，其中所述组织样本在步骤(a)之前或之后成像。
因此可知晓，本发明的阵列可用于捕获RNA，例如与所述阵列接触的组织样本的mRNA。所述阵列还可以用于测定和/或分析组织样本的全转录组或部分转录组，或用于获取组织样本中含空间限定的部分或全局转录组。本发明的方法因此可看作组织样本中一个和多个基因的空间表达的量化方法。换句话说，本发明的方法可用于检测组织样本中一个或多个基因的空间表达。再换句话说，本发明的方法可用于同时测定组织样本中一个或多个位点的一个或多个基因的表达。更进一步，本发明的方法可看作是用二维空间分辨率对组织样本进行部分或全局转录组分析的方法。
所述RNA可以是细胞中存在的任何RNA分子。因此，它可以是mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干涉RNA(siRNA)、与piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、核糖体RNA、反义RNA或非编码RNA。但是，优选为mRNA。
上述方法中(与上述优选使用形式中的步骤(a)相对应的)步骤(c)，从已捕获的RNA为模板生成cDNA，可看作涉及cDNA的合成。其包括已捕获的RNA的反转录步骤，以已捕获的RNA为模板，延长具有RT引物功能的捕获探针。该步骤产生所谓的cDNA第一链。下面将详细叙述，在从阵列上释放cDNA第一链之后，可以可选地在阵列上进行cDNA第二链的合成，或在一个分开的步骤中进行。下面还将详细叙述，在某些实施例中，第二链的合成可以发生在被释放的cDNA分子第一链扩增的第一个步骤中。
下文将讨论及描述阵列在核酸分析中的一般应用和在DNA分析中的具体应用。在此描述的运用于RNA环境下的阵列和捕获探针的具体细节和实施方式，(在适当情况下)同样适用于所有此类阵列，包括用于DNA的阵列。
本发明中的措辞“多种”意为两种或以上，或至少两种，例如，3、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、400、500、1000、2000、5000、10000，或更多，等等。因此，举例来说，捕获探针的数目可以是上述任意两个数字之间的任一整数。但是，可知晓，根据设想，也可以使用含有成百、上千、上万、十万或甚至百万个捕获探针的传统型阵列。
因此，在此概述的方法采用了高密度核酸阵列，所述阵列含有“捕获探针”，用以捕获和标记组织样本中所有单个细胞的转录体,，所述组织样本例如组织样品薄片，即“切片”。用于分析的组织样本或切片以高度平行的方式制备，以保存所述切片中的空间信息。每个细胞中已捕获的RNA(优选为mRNA)分子，或“转录组”，被转录为cDNA并进行cDNA分析，例如，进行高通量测序。可通过整合在排布于阵列中的核酸探针上的所谓识别码序列(或ID标记，在此定义为定位域)，将所得数据与切片等原始组织样本的图像相关联。
高密度核酸阵列或微阵列，是在此所述的空间转录组标记方法的核心部分。微阵列是一种用于分子生物学的多重技术。一个典型的微阵列包括一系列阵列排布的寡核苷酸微点(一个阵列上可整合成千上万个微点，通常为上万个)。每个核酸(寡核苷酸)微点的不同位置(每一种类的寡核苷酸/核酸分子)称为“特征”(因此上述方法中捕获探针的每一种类皆可看作是阵列的一个特定特征；每一特征在阵列上占有不同的位置)，且典型地，每个单独的特征含有皮摩尔(10-12摩尔)量级的特定DNA序列(一种“种类”)，即所称的“探针”(或“报告子”)。典型情况下，所述探针可以是一小段基因或其他核酸成分，能够在高严格度的杂交条件下与cDNA或cRNA样本(即“目标”)进行杂交。但是，如下所述，本发明中的探针不同于标准微阵列中的探针。
在基因表达微阵列中，以探针为目标的杂交反应常通过对视觉信号的检测来进行检测和量化，例如连接在所有目标上的荧光团、银离子或化学荧光标记。该视觉信号的强度与样本中每个目标核酸的相对丰度有关。由于一个阵列可以含有上万个探针，一个微阵列实验可以完成许多基因的并行测试。
在标准微阵列中，探针与环氧硅烷、氨基硅烷、赖氨酸或聚丙烯酰胺等化学基质通过共价键结合附着在固体表面或基板上。典型的基板是玻璃、塑料、硅质芯片或载片，但也有其他的已知微阵列平台，例如微珠。
探针可通过任何适当的方法附着在本发明的阵列上。在一个优选实施例中，探针通过化学固定法固定在基板上，所述化学固定法可以是基板(支撑材料)和探针间基于化学反应的相互作用。这样的化学反应一般不依赖于热或光的能量输入，但可以通过施加热量(例如给予化学反应的某个理想温度)或某波长的光来促进反应。举例来说，基板上的功能基团和探针上的对应功能要素之间可以发生化学固定反应。探针的此类对应功能要素可以是探针所固有的化学基团，例如羟基，或另外引入的基团。此类功能基团的一个例子是胺基。典型情况下，待固定的探针含有功能性胺基，或通过化学修饰引入了功能性胺基。此类化学修饰的方法和途径已被熟知。
待固定的探针中的所述功能基团的定位，可用于控制和塑造探针的结合行为和/或方向，例如，该功能基团可以放置于探针的5’端、3’端或探针序列之中。待固定的探针的典型基板含有能与该探针相结合的基团，例如，能与胺基功能化的核酸相结合的基团。此类基板的示例包括羧基、醛类或环氧基板。此类材料已为本领域技术人员所知。能在由于引入胺基而具有化学活性的探针间引发连接反应的功能基团，以及阵列基板，都为本领域技术人员所知晓。
可用于探针固定的可选基板可能需要经过化学活化，例如，对阵列基板上的功能基团的活化。术语“活化的基板”涉及一种材料，该材料含有能够相互作用或具有反应活性的化学基团，且所述基团已通过本领域技术人员所知的化学修饰步骤建立或启动。例如，一种含有羧基的基板必须经过活化才能使用。进一步来说，有现成的含有能与核酸探针已有特定基团相反应的功能基团的基板。
可选地，所述探针可以直接在基板上合成。此类方法的适当步骤为本领域技术人员所知。例如，Agilent Inc.、Affymetrix Inc.、Roche Nimblegen Inc.或Flexgen BV所开发的制造技术。典型情况下，采用激光和镜组对待添加核苷酸的微点进行特定活化。此类方法可以提供如30μm或以上的光斑大小(即特征)
因此，所述基板可以是本领域技术人员所知的任何适当基板。该基板可以采取任何恰当的形式或格式，例如，可以是扁平的，或弯曲的，如相对于组织样本和基板发生相互作用的区域凸起或凹进。特别优选地，基板是一种平面，即二维的芯片或载片。
典型地，基板是固相载体，因此基板上的探针能获得准确并可追溯的定位。基板的一个示例是含有功能性化学基团的固相材料或基板，所述化学基团为例如胺基或胺基功能化基团。本发明所设想的基板为无孔基板。优选的无孔基板为玻璃、硅、聚赖氨酸涂层材料、硝化纤维、聚苯乙烯、环状烯烃共聚物(COCs)、环状烯烃高分子(COPs)、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。
可采用任何本领域技术人员所知的适当材料。典型情况下采用的是玻璃或聚苯乙烯。聚苯乙烯是疏水性材料，适合用于结合负电荷大分子，因为其通常几乎不含亲水性基团。对于固定于玻璃载片上的核酸来说，进一步已知，通过增加玻璃表面的疏水性，可增进核酸固定。这一增进可允许相对来说更为密集的阵型。除聚赖氨酸涂层或表面处理外，该基板，尤其是玻璃基板，还可以进行硅烷化处理，例如，进行环氧硅烷或氨基硅烷处理，烷化处理，或聚丙烯酰胺处理。
市场上有若干现成的标准阵列商品，其特征的数量和大小都可以变化。本发明中，特征的排列可随着不同组织或器官所具有的细胞尺寸和/或密度而改变。例如，典型的动物细胞横断面在1-100μm左右，而典型的植物细胞的横断面可能在1-10000μm范围内变化。因此，对动物或真菌的组织样本，优选采用具有多达210万特征或420万特征，且特征大小为13微米的
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阵列，而对植物组织样本来说，其他格式，例如8x130k特征的格式就足够了。对于序列分析，尤其是NGS技术，也有现成的商品阵列，或已知可用于此领域的商品阵列。此类阵列亦可用作本发明范围中的阵列表面，例如，Illumina微珠阵列。除本身可以定制化的现成商品阵列外，还可以制作定制或非标准的“自制”阵列，且制作阵列的方法已经完善确立。无论标准和非标准阵列，只要含有下文定义的探针，便可在本发明的方法中使用。
优选地，取决于阵列的化学基质，微阵列上的探针通过5’或3’端固定在阵列上，即：附着或结合于阵列上。典型情况下，对于可购得的商品阵列来说，探针通过3’端的连接实现附着，因此留下5’端为自由端。但是，也有通过5’端的连接实现附着，留下3’端为探针自由端的阵列，且如本发明其他部分所述，此类阵列可以通过本领域公知的标准技术加以合成。
将核酸探针连接在阵列基板上的共价键，既可看作直接连接，也可看作间接连接，因为虽然探针的附着是通过“直接”的共价键实现的，但可能存在某些化学部分或连接物，将核酸探针的“第一个”核苷酸从玻璃或硅质等材料的基板上分隔开，即：间接连接。就本发明的目的而言，利用共价键和/或化学连接物固定到基板上的探针，一般看作是直接固定或附着于基板上。
本发明的捕获探针可以直接或间接固定于阵列或与阵列相互作用，对此，下文中将会更详细地加以描述。因此，捕获探针无需直接结合在阵列上，而是可以间接地相互作用，例如，与一个直接或间接地结合在阵列上的分子相结合(例如，捕获探针可以和捕获探针结合伴侣相互作用(例如，结合或与之杂交)，所述结合伴侣即直接或间接结合在阵列上的表面探针)。但是，一般来说，捕获探针将直接或间接(通过一种或多种中间媒介)地结合或固定在阵列上。
本发明的用途、方法和阵列可以包括通过5’或3’端固定的探针。但是，当捕获探针直接固定到阵列基板上时，其采用的固定方式必须保证捕获探针的3’端可供自由延长，例如，通过5’端固定该探针。可以间接固定该捕获探针，以使其具有自由的3'端，即可供延长的3’端。
已延长或可延长的3’端，意味着可以将更多的核苷酸添加于核酸分子(例如捕获探针)的3’端末端核苷酸上，以延长核酸分子的长度，即：利用标准聚合反应来延长核酸分子，例如，利用聚合酶催化的模版化聚合反应。
因此，在一个实施例中，阵列含有以其3’端直接固定的探针，即下文中定义的所谓表面探针。每一种类的表面探针都含有与一种种类的捕获探针互补的区域，以能令捕获探针与表面探针杂交，形成具有自由可延长的3’端的捕获探针。本发明的一种优选方面中，若阵列含有表面探针，则在阵列上原位合成捕获探针。
阵列探针可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，以及能够参与Watson-Crick或类似类型的碱基互配反应的合成核苷酸残基所组成。因此，所述核酸可以是DNA或RNA或其任何修饰产物，例如，PNA或其他含有非核苷酸骨架的衍生物。但是，在转录组分析环境中，捕获探针的捕获域必须能够引导反转录反应，生成与已捕获的RNA分子互补的cDNA。下文中会进一步详细叙述，在基因组分析环境中，捕获探针的捕获域必须能够与DNA片段结合，结合对象可以是DNA片段上添加的结合域。在一些实施例中，所述捕获探针的捕获域可以引导DNA延长(聚合酶)反应，生成与已捕获的DNA分子互补的DNA。在其他一些实施例中，捕获域可以作为模版参与已捕获的DNA分子和直接或间接固定于基板上的表面探针间的连接反应。在其他一些实施例中，捕获域可以连接至已捕获的DNA分子的其中一条链上。
本发明的一个优选实施例中，捕获探针至少在其捕获域中含有或只含有脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。在一个特定的优选实施例中，整个捕获探针都含有或只含有脱氧核糖核苷酸。
本发明的一个优选实施例中，捕获探针直接固定在阵列基板上，即：通过其5’端固定，其3’端自由可延长。
本发明的捕获探针含有至少两种结构域，即捕获域和定位域(或特征标识标签或特征标识域；可选地，所述定位域可定义为标识(ID)域或标签，或定位标签)。捕获探针可以进一步含有如下文中定义的通用域。当捕获探针通过与表面探针杂交而间接附着于阵列表面时，捕获探针需有与表面探针互补的序列(例如，一个部分或结构域)。此类互补序列可以与表面探针的定位/标识域和/或通用域互补。换句话说，定位域和/或通用域可以构成探针上与表面探针互补的区域或部分。但是，捕获探针还可以含有与表面探针互补的附加域(或区域、部分或序列)。如下文所述，为便于合成，此类与表面探针互补的区域可以是捕获域中的部分或捕获域的延长部分(此类部分或延长部分自身不用于或不能够与RNA等目标核酸结合)。
典型的捕获域位于捕获探针的3’端，且含有可供延长的自由3’端，例如，通过模版化的聚合反应。捕获域含有能够跟与阵列接触的组织样本中的细胞的核酸杂交的核苷酸序列，所述核酸例如RNA(优选为mRNA)。
优选地，可以对捕获域进行选择或设计，使其可以选择性或特异性地结合(或更宽泛地说，可以有能力结合)特定核酸，例如所需检测或分析的RNA。举例来说，捕获域可以经过选择或设计来选择性地捕获mRNA，如本领域中熟知，基于与mRNA的poly-A尾的杂交反应实现。因此，在一个优选实施例中，捕获域含有poly-T DNA寡核苷酸，即：一系列以磷酸二酯键连接的连续脱氧胸腺嘧啶核苷残基，能够与mRNA的poly-A尾杂交。可选地，捕获域可以含有与poly-T功能类似或结构类似的核苷酸，即有能力选择性地与poly-A选择性结合的核苷酸，例如poly-U寡核苷酸，或由脱氧胸腺嘧啶核苷类似物组成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸保留了与poly-A结合的功能特性。在一个特定的优选实施例中，捕获域，或更具体地说，捕获域的poly-T元件，含有至少10个核苷酸，优选为至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一个进一步的实施例中，捕获域，或更具体地说，捕获域的poly-T元件，含有至少25、30或35个核苷酸。
如本领域所知，捕获核酸还可以用随机序列，例如，随机六聚体或类似序列，因此，此类随机序列可用于组成全部或部分捕获域。举例来说，随机序列可与poly-T(或poly-T类似物等)序列共同使用。因此，含有poly-T(或“poly-T类似物”)寡核苷酸的捕获域，还可以含有随机寡核苷酸序列。例如，所述随机寡核苷酸序列可以位于poly-T序列的5’或3’端方向，例如位于捕获探针的3’端，但此类随机序列的位置并无关键意义。这样的结构有利于捕获mRNA的poly-A尾的起始端。可选地，捕获域可以整个是随机序列。再者，如本领域所知原理，还可以使用简并捕获域。
捕获域能够选择性地与所需的核酸亚型或子类结合，举例来说，RNA，例如某个特定种类的RNA，如前述列举的mRNA或rRNA等；或者，能够与指定RNA类型的特定子集结合，例如，一种特定的mRNA，如与某一特定基因或基因群对应的mRNA。此类捕获探针可以基于想要捕获的RNA的序列来选择或设计，因此可以是针对特定RNA目标或群体目标(目标群等)的序列特异性捕获探针。因此，按照本领域熟知的原理，所述捕获探针可以是基于特定基因序列或特定序列基元或共有/保守序列等。
一些实施例中，捕获探针通过例如与表面探针的杂交而间接固定于阵列基板上，其捕获域可以进一步含有能够与表面探针的5’端杂交的一个上游序列(位于与RNA等组织样本核酸杂交的序列的5’端方向)。单独来看，捕获探针的捕获域可以看作是捕获域寡核苷酸，在捕获探针间接固定在阵列上的实施例中，所述捕获域寡核苷酸可用于捕获探针的合成。
捕获探针的定位域(特征标识域或特征标识标签)位于捕获域的直接上游或间接上游，即靠近捕获探针核酸分子的5’端。优选地，定位域与捕获域直接相邻，即捕获域和定位域之间没有间隔序列。在一些实施例中，定位域构成捕获探针的5’端，能直接或间接固定在序列基板上。
如上文论述，阵列的每一特征(即不同位置)都含有一种核酸探针的微点，其中每个特征中存在的定位域都是独一无二的。因此，探针“种类”根据其具有的定位域来限定；同一种类的捕获探针具有同样的定位域。但是，并不要求一个种类下的每个捕获探针都具有完全相同的序列。特别是，由于捕获域可以是或可以含有随机或简并序列，因此一个种类中的个体探针的捕获域可能多种多样。相应地，一些实施例中，捕获探针的捕获域相同，每个特征中存在单一的探针序列，但是在另一些实施例中，捕获探针则各不相同，一个探针种类下的成员不会含有一模一样的序列，虽然该种类中每个成员的定位域序列是相同的。需要满足的要求是：阵列的每个特征或位置各自具有单一种类的捕获探针(具体来说，每一特征或位置载有的捕获探针具有等同的定位标签，即每个特征或位置上具有单一定位域)。每个种类的探针具有不同的定位域，以区分种类。但是，一个种类下的每个成员，在一些情况下，如在此进一步详细叙述所说，可以具有不同的捕获域，因为捕获域可以是随机或简并的，或含有随机或简并的组件。这意味着，在一个指定的特征或位置上，探针的捕获域可以不同。
因此，在其中一些实施例，但不一定是全部实施例中，固定在特定特征上的任一探针分子与固定于同一特征的其他探针分子具有相同的核苷酸序列，但每个特征上的探针与固定在其他各特征的探针的核苷酸序列彼此之间各不相同、差别迥异或可以区别。优选地，每个特征含有一种不同种类的探针。但是，在一些实施例中，优选地，可以制作一个含有相同种类探针的特征群，即制造一个有效覆盖阵列某一区域的特征，该特征大于单一特征，例如，可降低阵列的解析度。在该阵列的其他实施例中，一个特定特征上固定的任一探针分子可以和固定在同一特征的其他探针分子具有相同的定位域核苷酸序列，但其捕获域可以不同。但是，捕获域通常可以设计成捕获相同种类的分子，例如mRNA。
捕获探针的定位域(或标签)含有专属于每个特征的序列，充当定位或空间标记(标识标签)。这样一来，通过将某一细胞中的核酸如RNA(例如转录体)等连接到阵列中捕获探针的独有定位域序列上，就能利用所述阵列的全阵列空间解析度辨识组织样本的每个区域或结构域，例如组织中的每个细胞。通过定位域，阵列中的捕获探针可以与组织样本的某一位置相关联，例如，可以与样本中的某一细胞相关联。因此，捕获探针的定位域可被看作是核酸标签(标识标签)。
任何合适的序列都可以用作本发明的捕获探针的定位域。合适的序列的意思是，其作为定位域，不会干涉(即抑制或扭曲)组织样本的RNA和捕获探针的捕获域之间的反应。例如，定位域应当设计为不具有与组织样本中的核酸分子相杂交的特异性。优选地，捕获探针定位域的核酸序列与组织样本核酸序列之间的序列一致性低于80％。优选地，捕获探针的定位域与组织样本中大部分的核酸分子的序列一致性低于70％、60％、50％或40％。序列一致性可以通过本领域已知的适当方法测定，例如，使用BLAST比对算法。
在一个优选实施例中，每种捕获探针的定位域都含有独一无二的识别码序列。识别码序列可以通过随机序列生成。接下来，所述随机生成的序列可通过映射于所有种类的常见参考基因组和预设的Tm间隔、GC含量和与其他识别码序列间的限定距差来进行严格筛选，以保证识别码序列不会对核酸捕获过程形成干涉，例如不会对来自组织样本的RNA的捕获形成干涉，并且识别码序列之间能够毫无困难地相互区分。
如上所述，在一个优选实施例中，捕获探针还包括一个通用域(或连接域或连接标签)。捕获探针的通用域位于定位域的直接上游或间接上游，即靠近捕获探针核酸分子的5’端。优选地，通用域与定位域直接相邻，即定位域和通用域之间没有间隔序列。在一些实施例中，捕获探针含有通用域，所述通用域形成捕获探针的5’端，用以直接或间接固定在阵列基板上。
本发明的方法和用途中，通用域可以有多种用途。举例来说，本发明的方法包括从阵列表面释放(例如移除)至少一部分已合成的(即已延长或连接的)核酸(例如cDNA)分子的步骤。如本发明其它部分所述，这一步骤可以用多种方法实现，其中一种方法包括将核酸(例如cDNA)分子从阵列表面上剪切下来。因此，通用域自身可以含有一个剪切域，即：可以通过化学方法，或优选地，通过酶促方法，进行特异剪切的序列。
因此，剪切域可以含有可被一个或多个具有核酸分子剪切功能(即有能力断开两个或以上核苷酸之间的磷酸二酯键)的酶所识别的序列。例如，剪切域可以含有限制性核酸内切酶(限制酶)识别序列。限制性酶在称为“限制性位点”的特异识别核酸序列处切断双链或单链DNA，适用的酶为本领域所熟知。例如，特别优选地，可以使用稀有剪切限制酶，即具有长限制性位点(长度至少为8个碱基对)的酶，以降低误剪cDNA等核酸分子上其他位置的可能性。在此方面，可知晓，移除或释放至少部分cDNA等核酸分子，需释放的部分为cDNA等核酸分子中含有定位域的部分及其下游的整个序列，即：定位域后3’端方向的整个序列。因此，cDNA等核酸分子的剪切应当在定位域的5’端方向实施。
举例来说，剪切域可以含有poly-U序列，对所述poly-U序列的剪切可以用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和市场上称为USERTM酶的DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII。
剪切域的进一步运用示例可见于捕获探针间接(即通过表面探针)固定在阵列基板上的实施例。其中，剪切域可以含有一个或多个错配的核苷酸，即：表面探针的互补部分和捕获探针并非100％互补。此类错配通过例如MutY和T7核酸内切酶I来识别，结果为对错配位点的核酸分子的剪切。
本发明的一些实施例中，捕获探针的定位域含有剪切域，其中所述剪切域位于定位域的5’端。
通用域还可以含有扩增域，作为剪切域的附加或替代部分。本发明的一些实施例中，如本发明其他部分所述，优选地，可以在核酸分子(如cDNA)从阵列基板释放(例如移除或切除)后对其进行扩增。但是可知晓，扩增的初始循环，或者以及其后的任一或全部的后续扩增循环还可以在阵列上原位实施。扩增域含有能与扩增引物杂交的独特序列。优选地，每个种类的捕获探针的通用域的扩增域相同。因此，一次扩增反应将足以扩增所有核酸分子(如cDNA等)(无论所述核酸分子是否在扩增反应前从阵列基板上释放)。
任何合适的序列都可用作本发明的捕获探针的扩增域。“合适的序列”的意思是，其作为扩增域不会干涉(即抑制或扭曲)组织样本核酸(如RNA等)和捕获探针的捕获域之间的相互作用。进一步来说，所述扩增域应当含有与组织样本核酸(如RNA)的任何序列不同或大体不同的序列，以保证扩增反应的引物在反应的扩增条件下仅能同扩增域杂交。
举例来说，所述扩增域应当设计为，该扩增域或其互补序列不会与组织样本中的核酸分子特异杂交。优选地，捕获探针扩增域的核酸序列及其互补链与组织样本核酸序列的序列一致性低于80％。优选地，捕获探针的扩增域与组织样本中大部分核酸分子的序列一致性低于70％、60％或40％。序列一致性可以通过本领域已知的适当方法测定，例如，使用BLAST比对算法。
因此，单独来看，捕获探针的通用域可以看做是一个通用域寡核苷酸，在捕获探针间接固定于阵列上的实施例中，所述通用域寡核苷酸可用于捕获探针的合成。
本发明的一个代表性实施例中，只有每种捕获探针的定位域是独一无二的。因此，同一实施例中的任何特定阵列上，每种捕获探针的捕获域和通用域(若适用)分别相同，以保证对组织样本核酸(例如RNA)的捕获具有全阵列一致性。但是，如上文论述，在一些实施例中，一些捕获域可能因为包含了随机或简并序列而产生区别。
在一些实施例中，捕获探针间接固定(例如通过与表面探针杂交)在阵列基板上，此类捕获探针可按下文所述在阵列上合成。
表面探针直接用其3’端或于其3’端固定在阵列基板上。表面探针的每个种类与阵列上的每个特征(不同位置)为唯一对应关系，并与上文中定义的捕获探针部分互补。
因此，表面探针的5’端含有一个结构域(互补捕获域)，所述互补捕获域能与捕获域中不与组织样本核酸(如RNA)结合的部分相互互补。换句话说，所述互补捕获域能与捕获域寡核苷酸至少部分杂交。表面探针进一步含有一个与捕获探针的定位域互补的结构域(互补定位域或互补特征标识域)，该互补定位域位于互补捕获域的直接下游或间接下游(即其3’端方向)，即：互补定位域和互补捕获域之间可以用一个间隔序列或连接序列相分隔。在一些实施例中，捕获探针在阵列表面合成，所述阵列的表面探针总在其3’端方向，即定位域的直接或间接下游方向，含有一个与捕获探针的通用域互补的域(互补通用域)，换句话说，含有一个能与通用域寡核苷酸至少部分杂交的域。
本发明的一些实施例中，表面探针的序列与定位域和通用域之间，以及与捕获域中不与组织样本核酸(如RNA)结合的部分之间，具有100％的互补性或序列一致性。在其他实施例中，表面探针序列与捕获探针的这些结构域之间的序列一致性则可能低于100％，例如，低于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％。本发明的一个特定优选实施例中，互补通用域与捕获探针的通用域之间的序列一致性低于100％。
本发明的一个实施例中，捕获探针在阵列基板上合成或生成。在一个代表性实施例中(见图3)，阵列含有如上文定义的表面探针。与捕获探针的捕获域和通用域相对应的寡核苷酸与阵列相接触，并能够与表面探针的互补域相杂交。过量的寡核苷酸可以通过在标准杂交条件下进行洗涤来移除。所得的阵列含有部分单链探针，其中表面探针的5’和3’端均为双链，而互补定位域为单链。可以用聚合酶来处理阵列，依靠模版来延长通用域寡核苷酸的3’端，以合成捕获探针的定位域。可利用连接酶等连接已合成的定位域的3’端与捕获域寡核苷酸的5’端，来生成捕获探针。可知晓，为达成此目的，可以使捕获域寡核苷酸的5’端磷酸化来实现连接反应。由于每一种类的表面探针都含有独一无二的互补定位域，因此每一种类的捕获探针将含有独一无二的定位域。
在此使用的术语“杂交反应”或“杂交”，指的是具有足够的互补性，可通过Watson-Crick碱基配对结合成双链的核苷酸序列之间的双链形成反应。两个核苷酸序列相互“互补”，指的是其分子的碱基配对具有组织结构同源性。“互补”的核苷酸序列在适当的杂交条件下特异结合，形成稳定的双链。举例来说，如果第一条序列上的一部分与第二条序列上的一部分能够以逆向平行的方式相结合，其中一个序列的3’端与对方序列的5’端相结合，且序列之一的每个A、T(U)、G和C都能与对方序列的T(U)、A、C和G分别结合，则这两条序列互补。RNA序列还可以含有互补的G＝U或U＝G碱基序列。因此，本发明中的两个“互补”序列无需具有完美的同源性。一般来说，如果两条序列在其分子的一段指定长度上，至少有90％(优选为至少约95％)的核苷酸的碱基配对组织结构相同，则这两条序列具有足够的互补性。因此，捕获探针和表面探针的结构域中含有一个互补区域。进一步地，捕获探针的捕获域中含有一个互补区域，能与组织样本核酸，例如RNA(优选为mRNA)互补。
还可以利用聚合酶延长反应(与上文所述类似)和末端转移酶加“尾”反应，在阵列基板上合成捕获探针，所加的“尾”可以构成捕获域，下文的实施例7中对此做了进一步描述。使用末端转移酶向寡核苷酸末端添加核苷酸序列的技术为本领域所知，例如，引入一条同聚物尾巴，如poly-T尾。相应地，在此类合成反应中，与捕获探针的通用域对应的寡核苷酸可以与阵列相接触，并与表面探针的互补域杂交。过量的寡核苷酸可以通过在标准杂交条件下进行洗涤来移除。所得的阵列含有部分单链探针，其中表面探针的5’和3’端均为双链，互补定位域为单链。可以用聚合酶来处理阵列，依靠模版来延长通用域寡核苷酸的3’端，以合成捕获探针的定位域。然后，要引入捕获域，例如含有poly-T序列的捕获域，可通过末端转移酶来添加poly-T尾，以生成捕获探针。
本发明的典型阵列以及用于本发明的方法中的阵列，可以含有多个微点，或“特征”。特征可定义为阵列基板上的区域或不同位置，该位置上固定有单一种类的捕获探针。因此，每一特征将含有同一种类的多个探针分子。可知晓，在此设定下，虽然相同种类的每个捕获探针可以具有相同的序列，但这并非必要的条件。捕获探针的每个种类将具有相同的定位域(即：同一种类的每个成员，乃至于同一特征中的每个探针，都具有相同的“标记”)，但同一特征(种类)的每个个体探针的序列可以不同，这是因为捕获域的序列可以有区别。如上所述，可以采用随机或简并的捕获域。因此，同一特征中的捕获探针可以含有不同的随机或简并序列。阵列上的特征数量和密度将决定阵列的解析度，即：组织样本的转录组或基因组用于分析的细节层次。因此，一般来说，特征的密度提高，阵列的解析度也会随之增加。
如上所述，本发明的阵列特征的大小和数量取决于组织样本的性质和所需的解析度。因此，如果只想要确定组织样本内的成片细胞(或样本含有大细胞)的转录组或基因组，便可减少阵列特征的数量和/或密度(即：减少特征的最大可能数量)和/或增加特征的大小(即：每个特征的面积可以大于最小的可能特征)，例如，含有少量大特征的阵列。可选地，如果想要确定样本中个体细胞的转录组或基因组，便可能需要使用最大可能数量且最小可能尺寸的特征，例如，含有许多小特征的阵列。
虽然单一细胞解析度可以是本发明的一个优选特征，但其并非必要目的；细胞群水平的解析度也是本发明的目的之一，例如，检测或分辨特定的细胞类型或组织区域，如正常细胞vs肿瘤细胞。
本发明的代表性实施例中，阵列可以含有至少2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10000、20000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、300000、400000、500000、750000、800000、1000000、1200000、1500000、1750000、2000000、2100000.3000000、3500000、4000000或4200000个特征。虽然4200000代表了目前可购得的商品阵列的最大可能特征数量，但根据本发明的构思，本发明中可以制备特征超过此数量的阵列，且此类阵列为发明目的之一。如上所述，可以降低特征大小并在相同或相似面积中提高特征的数量。举例来说，这些特征可以被容纳在约20cm2、10cm2、5cm2、1cm2、1mm2、or100μm2以下的面积中。
因此，本发明的一些实施例中，每个特征的面积可以是约1μm2、2μm2、3μm2、4μm2、5μm2、10μm2、12μm2、15μm2、20μm2、50μm2、75μm2、100μm2、150μm2、200μm2、250μm2、300μm2、400μm2或500μm2.
可知晓，本发明的方法可以用在任何生物体的组织样本上，例如，植物、动物或真菌。本发明的阵列可用于捕获细胞中任何能够进行转录和/或翻译的核酸，例如mRNA分子。本发明的阵列和方法特别适用于分离和分析样本中的细胞的转录体或基因组，且需要获取转录组或基因组的空间解析度的时候，例如，在细胞相互连通或与相邻细胞直接接触的情况下。然而，对本领域技术人员来说，本发明的方法显然还可以用于样本中不同细胞或不同细胞类型的转录组或基因组分析，哪怕所述细胞并无直接相互作用，例如，血液样本。换句话说，阵列可适用的细胞无需是组织细胞，也可以单个细胞(例如，从未固定组织中分离的细胞)。所述单个细胞无需是固定在组织的某个位置上的细胞，但仍可以放置在阵列的某个位置上，并可单独进行辨认。因此，在对无直接相互作用的细胞或非组织细胞进行分析的时候，所述方法的空间性质可以用于获取或检索个体细胞的独有或独立的转录组或基因组信息。
因此，样本可以是死体或活体组织样本，或可以是培育样本。代表性的示例包括临床样本，例如全血或血制品、血细胞、组织、活体组织或培育组织、细胞等等，包括其细胞悬液。例如，可以用细胞悬液(例如含有血细胞)制备人工样本。可以将细胞固定在一种基质(例如，凝胶基质，如琼脂、琼脂糖等等)中，然后以常规方法切片。此类操作在本领域的免疫组织化学中为人所知(例如，见Andersson et al 2006,J.Histochem.Cytochem.54(12):1413-23.Epub 2006Sep 6)。
组织制备形式和制得样本的处理方式，可能对本发明的转录组或基因组分析造成影响。另外，各种不同的组织样本可能具有不同的物理特征，本领域技术人员可以实施必要的操作来获得本发明的方法中使用的组织样本。但是，从本公开中，显而易见，本发明中可以使用任何适当的样本制备方法来获得组织样本。例如，任何厚度在约1个细胞或更薄的细胞层都可以用在本发明的方法中。在一个实施例中，组织样本的厚度可以薄于细胞横截面的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1倍。然而，如上所述，本发明并不限于单一细胞解析度，因此，并不要求组织样本的厚度薄于单个细胞直径或更小；如果需要，可以采用较厚的组织样本。例如，可以采用冷冻切片，其厚度可能是例如10-20μm。
可以用任何基于方便或需要的方式制备组织样本，本发明不限于任何特定的组织制备类型。新鲜的、冷冻的、固定的、未固定的组织都可以使用。可以基于需要和便利，用本领域中知晓、记载的任何方法对组织样本进行固定或包埋。因此，可以使用任何已知的固定剂或包埋材料。
作为本发明中使用的组织样本的第一个代表性示例，可以在适合保持或保藏组织结构完整性(即物理特征)的温度下对组织进行深度冷冻的制备，例如，低于-20℃，优选地，低于-25、-30、-40、-50、-60、-70或-80℃。可以对冷冻组织样本进行切片，即以任何方法切成薄片且置于阵列表面。举例来说，制备组织样本可以利用冷冻超薄切片机，温度设置适合保持组织样本结构完整性和样本核酸化学性质的低温箱，例如低于-15℃，优选为低于-20或-25℃。因此，对样本的处理应当令组织中的核酸(例如RNA)的退化或降解最小化。此类操作条件为本领域所熟知，任何程度的降解都可以通过核酸提取来监控，例如，在组织样本制备的各阶段进行总RNA提取和质量分析。
在第二个代表性示例中，可以用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的标准办法制备组织，所述方法在本领域中已非常完善。在组织样本固定及以石蜡或树脂封闭物包埋之后，可以对组织样本进行切片，即：切成薄片置于阵列上。如上所述，也可以采用其他固定剂和/或包埋材料。
显然，实施本发明的方法之前，需要处理组织样本切片，来去除样本上的包埋材料，例如，通过脱蜡，即去除石蜡或树脂。该步骤可以通过任何适当的方法来完成，且本领域中去除样本上的石蜡或树脂或其他材料的方法已经建立完善，例如，通过以适当的溶剂，例如二甲苯，(在阵列表面)培养样本，例如培养两次，各10分钟，接着以乙醇淋洗，例如用99.5％的乙醇淋洗2分钟，96％的乙醇淋洗2分钟以及70％的乙醇淋洗2分钟。
对本领域技术人员来说，以FFPE或其他固定和包埋方法制备的组织切片中的RNA，显然比冷冻组织中的RNA更可能产生部分降解。然而，本发明无意受到任何特殊理论的限定，因此，采用前者组织对本发明方法来说可以是一种优选形式。举例来说，如果样本中的RNA部分降解，则相对于未降解的样本来说，其RNA聚核苷酸的平均长度更短，且或多或少得到了随机化。因此可以推定，在本发明其他部分中所述的各种处理步骤中，例如，接合体(扩增域)的连接反应、cDNA分子的扩增及测序中，部分降解的RNA所带来的误差更少。
因此，在本发明的一个实施例中，采用FFPE或其他固定和包埋方法制备组织样本，即与阵列相接触的组织样本的切片。换句话说，样本可以是已固定的，例如，经过固定和包埋的。本发明的一个可选实施例中，通过深度冷冻来制备组织样本。在又一个实施例中，可以采用组织的印片，其操作流程为本领域所知。在另外一些实施例中，可以采用未固定的样本。
本发明的方法中使用的组织样本的厚度，可以依照样本制备方法和组织物理特性来决定。因此，本发明的方法可以使用任何适当厚度的切片。本发明的代表性实施例中，组织样本切片的厚度为至少0.1μm，进一步优选为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm。在另外一些实施例中，组织样本切片的厚度为至少10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。但是，厚度并不是关键性因素，以上列举的仅为代表性的数值。基于需要和方便，可以采用较厚的样本，例如，70或100μm或以上。典型地，组织样本切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但如上所述，还可以使用更厚的样本。
当组织样本切片与阵列接触时，例如移除包埋材料的步骤如脱蜡以后，组织样本中的核酸分子(如RNA)将与固定在阵列上的捕获探针结合。在一些实施例中，优选地，可以对核酸分子(如RNA)与捕获探针的结合予以促进。典型地，促进杂交包括改善杂交发生的条件。能够改善的主要条件包括反转录步骤前，在阵列上培养组织切片的时间和温度，在本发明其他部分中有所描述。
举例来说，当组织样本切片与阵列相接触时，可以将阵列培养至少1小时，以便允许核酸(如RNA)与捕获探针相杂交。优选地，阵列可以培养2、3、5、10、12、15、20、22或24小时，或直到组织样本切片干燥为止。阵列培养时间并非关键条件，任何方便或需要的时间都可以被采用。典型的阵列培养时间可以高达72小时。因此，可以用任何适当的温度进行培养，例如室温，但在一个优选实施例中，阵列上组织样本切片的培养温度至少为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃。本领域中，一般采用至多55℃的培养温度。在一个特定优选实施例中，组织样本切片在阵列上37℃干燥24小时。一旦组织样本切片干燥，便可以将阵列在室温下保存，直至实施反转录步骤。可知晓，如果允许组织样本切片在阵列表面干燥，那么在对已捕获的核酸进行进一步操作前，例如在已捕获的RNA进行反转录步骤前，须得对切片进行补水。
因此，本发明的方法可以含有一个进一步的步骤，即在样本与阵列接触后，对组织样本进行补水。
在一些实施例中，优选地，在捕获探针与阵列上的组织样本相接触前，对捕获探针进行封闭(例如，遮盖或修饰)，尤其是在组织样本中的核酸在已捕获于阵列上之前经过修饰的情况下。具体来说，优选地，对捕获探针的自由3’端进行封闭或修饰。在一个特定实施例中，组织样本中的核酸，例如，可以对基因组DNA片段进行修饰，以便其已捕获探针捕获。举例来说，下文中将会进一步详述，接合体序列(含有能与捕获探针的捕获域相结合的结合域，)可以被添加到核酸(例如基因组DNA片段)的末端。该步骤可以通过例如接合体的连接反应或核酸的延长反应来完成，例如，用酶在序列末端追加核苷酸，例如poly-A尾。在组织样本与阵列接触前，有必要对捕获探针进行封闭或修饰，尤其是捕获探针的自由3’端，以避免捕获探针受到修饰，例如，避免poly-A尾误加至捕获探针的自由3’端。优选地，可以在捕获探针的合成时向其添加封闭域。但是，也可以在捕获探针合成后再添加封闭域。
在一些实施例中，可以用任何适当且可逆的方法来封闭捕获探针，以避免在组织样本与阵列相接触后，捕获域在组织样本核酸修饰过程中发生修饰。换句话说，可以可逆地掩盖或修饰捕获探针，以使得捕获探针的捕获域不含自由3’端，即使得所述3’端被移除、修饰，或不可接触，以令捕获探针不会在组织样本核酸的修饰过程中受到影响，例如通过连接反应或延长反应，或移除附加的核苷酸来露出和/或恢复捕获探针的捕获域的3’端。
举例来说，可以用封闭探针与捕获探针相杂交，以掩盖捕获域的自由3’端，所述封闭探针例如是发夹探针或含部分双链的探针，所述探针的适当示例为本领域所知。捕获域的自由3’端可以用化学修饰加以封闭，例如，将叠氮甲基作为可逆的化学顶帽加入，使得捕获探针不含自由3’端。可选的适当化学顶帽也被本领域熟知，例如捕获域的末端核苷酸可以是可逆的终止子核苷酸，在捕获探针合成期间或之后加入到探针中。
可选地或附加地，可以对捕获探针的捕获域加以修饰，以便移除捕获探针在组织样本核酸分子的修饰过程中获得的任何修饰，例如，附加核苷酸。举例来说，捕获探针可以在捕获域的下游，即捕获域的3’端方向，含有一条附加序列，称为封闭域。其形式可以是，例如，限制性内切酶识别序列或可由特定酶活性切除的核苷酸序列，如尿嘧啶。组织样本的核酸修饰步骤后，可以对捕获探针进行酶促剪切，来移除封闭域或任何在修饰过程中添加到捕获探针3’端的附加核苷酸。封闭域的移除可以露出和/或恢复捕获探针的捕获域的自由3’端。封闭域可以作为捕获探针的一部分来加以合成，或通过原位反应(即：作为现有阵列的修饰)添加给捕获探针，例如，通过与捕获域之间的连接反应。
可以用上述封闭机制的任意组合对捕获探针进行封闭。
组织样本的核酸，例如基因组DNA片段，一旦修饰完成，能够与捕获探针的捕获域相杂交，就必须对捕获探针进行解封，例如，通过解离封闭寡核苷酸，移除化学顶帽和/或封闭域。
为将从阵列的每个特征获得的序列分析或转录组信息或基因组信息与组织样本的分区(即：区域或细胞)相关联，参照阵列特征对组织样本进行定向。换句话说，将组织样本放置于阵列上，使得阵列上的捕获探针的位置与组织样本的位置相关联。由此，便可以辨认每个种类捕获探针的位置(或阵列的每个特征)在组织样本中对应的位置。换句话说，即：可以辨认每个种类捕获探针的位置所对应的组织样本位置。该步骤可以通过阵列上的定位探针来完成，如下文所述。为了方便起见，但非必需步骤，可以在组织样本与阵列接触后对其进行成像。该步骤可以在组织样本核酸的处理步骤之前或之后进行，例如，在本方法的cDNA生成步骤，尤其是通过反转录生成cDNA第一链的步骤之前或之后。在一个优选实施例中，组织样本的成像步骤在释放阵列上的已捕获及已合成(即：已延长或已连接)的DNA(如cDNA)的步骤之前。在一个特定优选实施例中，对组织的成像步骤发生在组织样本核酸的处理步骤之后，例如，在反转录步骤之后；并且，在从阵列上释放分子(如cDNA)之前，移除(例如，洗涤)了阵列上所有残余组织。在一些实施例中，可在处理捕获核酸的步骤(例如反转录步骤)中，去除阵列表面的残余组织，例如，当所使用的组织为以深度冷冻制备的组织时。在此情况下，组织样本的成像可以在处理步骤前发生，例如cDNA合成步骤前。一般来说，成像步骤可以在组织样本与表面接触后的任何时候进行，但应在所有降解或移除组织样本的步骤之前完成。如上所述，这取决于组织样本。
优选地，所述阵列可以含有有助于组织样本或其图像相对于阵列特征进行定向的标记。任何标记阵列的适当方法都可以使用，只要其能在组织样本成像时能够被检测。举例来说，可以将能够生成信号，优选为视觉信号的分子，例如，荧光分子，直接固定在阵列表面。优选地，阵列表面的不同位置上含有至少2种标记，进一步优选地，至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100种标记。可以方便地使用几百或甚至几千种标记。标记可以具有格局，例如，形成阵列外围边框，如阵列特征的整个外框；可以是含信息的其他格局，例如阵列的截线，以便于组织样本图像与阵列的对齐，或者一般来说，阵列特征与组织样本的关联。因此，标记可以是被固定的分子，其能与发送信号的分子相互作用，产生信号。在一个代表性示例中，阵列可以含有标记特征，例如，固定在阵列基板上且与被标记核酸相杂交的核酸探针。举例来说，被标记的核酸分子，即标记核酸，可与能在特定波长(或波长范围)的光线下产生荧光(即被激活)的化学部分相连接或结合。此类标记核酸分子与阵列接触的时机，可以在组织样本为可视化或成像而进行染色之前、之中或之后。但是，标记必须在组织样本成像后能够被检测。因此，在一个优选实施例中，可以采用与可视化组织样本相同的成像条件来对标记进行检测。
本发明的一个特定的优选实施例中，阵列含有标记特征，且所述标记特征与已标记，优选为已荧光标记的标记核酸分子(例如，寡核苷酸)相杂交。
可以使用本领域中任何方便的组织学方法来进行组织成像步骤，例如，光、明视场、暗视场、相位差、荧光、镜像、干涉、共聚显微镜或其组合。典型情况下，组织样本在可视化之前先进行染色，以在组织样本不同区域(例如细胞间)形成对比。采用的染色剂类型取决于组织类型和需染色的细胞区域。此类染色操作流程为本领域所知。在一些实施例中，采用了多种染色剂来可视化(成像)组织样本的不同方面，例如，组织样本的不同区域、特定细胞结构(例如，细胞器)或不同细胞类型。在其他一些实施例中，可以通过组织染色以外的方法进行组织样本可视化或成像，例如，在组织样本已经含有色素，能够提供足够的对比，或者采用了特殊形式的显微镜的情况下。
在一个优选实施例中，采用荧光显微镜对组织样本进行可视化或成像。
如果想要实施成像且未在反转录之前实施成像，则优选地，在从阵列释放cDNA分子的步骤之前移除组织样本，即在反转录步骤和可选的成像步骤后仍与阵列基板相接触的残余组织。因此，本发明的方法可以含有一个洗涤阵列的步骤。残余组织样本的移除可以采用任何适当的方法，取决于组织样本。在最简单的实施例中，可以用水洗涤阵列，水中可含有多种添加剂，例如表面活性剂(例如洗涤剂)、酶等，来帮助清除组织。在一些实施例中，采用含有蛋白酶(及适当的缓冲液)的溶液来洗涤阵列，例如蛋白酶K。在其他的一些实施例中，所述溶液还可以含有，或可选地含有，纤维素酶、半纤维素酶或几丁质酶，例如，当组织样本源自植物或真菌的时候。在进一步的实施例中，洗涤阵列的溶液温度可以是例如至少30℃，优选为至少35、40、45、50或55℃。显然，洗涤溶液对已固定的核酸分子的破坏应当最小化。举例来说，在一些实施例中，核酸分子可以间接地固定在阵列基板上，例如，通过捕获探针和RNA之间以及/或者捕获探针和表面探针之间的杂交，因此，洗涤步骤应当不干扰阵列上已固定的分子间的相互作用，即：应当不引起核酸分子的变性。
阵列和组织样本接触的步骤之后，在组织样本的核酸分子，例如RNA(优选为mRNA)与捕获探针相互杂交的适宜条件下，进行对已杂交的核酸分子的固定(获取)。对已杂交的核酸的固定或获取，包括已杂交核酸的互补链与捕获探针间的共价附着(即：通过核苷酸键，即两个紧邻的核苷酸之间的并置3’-羟基与5’-磷酸盐末端之间形成的磷酸二酯键)，由此标识或标定已捕获的核酸，所述已捕获的核酸带有一个定位域，能与对其进行捕获的特征进行特异结合。
在一些实施例中，对已杂交的核酸(例如单链核酸)进行固定，可以包括延长捕获探针来生成已捕获核酸的副本，例如，从已捕获(已杂交)的RNA生成cDNA。可知晓，此步骤指的是已杂交核酸的互补链的合成，例如，基于已捕获的RNA模版(即杂交于捕获探针捕获域的RNA)生成cDNA。因此，在捕获探针的延长反应(如cDNA生成)的初始步骤中，已捕获(已杂交)的核酸(例如RNA)成为延长步骤(例如反转录)的模版。在其他一些实施例中，如下文所述，对已杂交的核酸(例如含部分双链的DNA)进行固定，可以包括在已杂交的核酸(例如DNA片段)与捕获探针之间进行共价结合，例如，通过连接反应，将捕获探针连接至同捕获探针相杂交的核酸的互补链上。
反转录反应涉及利用反转录酶从RNA，优选为mRNA(信使RNA)合成cDNA(DNA互补链或DNA副本)的步骤。因此，cDNA可看作是在组织样本被采集时存在于细胞中的RNA的副本，即：所述cDNA呈现的是所述细胞在隔离时刻所表达的全部或部分基因。
捕获探针，尤其是捕获探针的捕获域，在为杂交于捕获探针的核酸生成互补链时充当引物，如反转录引物。因此，由延长反应(例如反转录反应)所生成的核酸分子(如cDNA)包含了捕获探针序列，即是说，延长反应(如反转录反应)可以看作是一种对组织样本上与阵列的每个特征相接触的核酸(例如转录体)进行间接标记的方法。因此，所有在特定特征上合成的核酸分子，例如cDNA，将含有相同的核酸“标签”。
在阵列的每个特征上合成的核酸分子(如cDNA)，可以代表与该特征相接触的组织样本的区域或面积上的基因组或表达的基因，例如一种组织、细胞类型、细胞群或其细胞亚群，还可以进一步代表特定条件下所表达的基因，例如在特定时刻、特定环境、特定发育阶段或响应特定刺激等。因此，任一单个特征上的cDNA可能代表着单个细胞中表达的基因，或，在该特征与样本的细胞连接处相接触的情况下，其cDNA可能代表多个细胞中的基因。类似地，如果单个细胞与多个特征相接触，那么每个特征可能代表所述细胞中所表达基因中的一部分。类似地，在一些实施例中，所述已捕获的核酸是DNA，任一单个特征可能代表单个或多个细胞的基因组。可选地，单个细胞的基因组可以由多个特征所代表。
捕获探针的延长步骤，例如反转录，可以利用本领域的许多适当的酶和操作流程中的任一种来实施，如下文所述。但是，显然，无需为核酸(如cDNA)第一链的合成提供引物，因为捕获探针的捕获域即充当了该引物，例如反转录引物。
优选地，本发明的范围中，被绑定的核酸(即：与捕获探针共价结合的核酸)(例如cDNA)经处理含有双链DNA。但是，在一些实施例中，已捕获的DNA可能已经含有双链DNA，例如，在含有部分双链的DNA片段与捕获探针相连接的情况下。从已捕获核酸生成双链DNA的处理步骤可以在仅生成DNA(如cDNA)第二链的单一反应中完成，即：只生成双链的DNA分子而不增加双链DNA分子的数量，或在扩增反应中生成第二链的多个副本，所述副本可以是单链DNA(例如，线性扩增)或双链DNA(例如cDNA)(例如，指数扩增)。
第二链DNA(例如cDNA)的合成步骤可以在阵列上原位进行，既可以是单独的第二链合成步骤，例如如下文中详述的采用随机引物，也可以作为扩增反应的初始步骤。可选地，可以从阵列上释放DNA(例如cDNA)的第一链(所述第一链含有或说结合了捕获探针)，然后再进行第二链合成，例如，在溶液中进行反应，可以作为一个单独步骤或作为扩增反应中的一个步骤。
当第二链合成在阵列上(即原位)进行时，本方法可以包括一个可选的步骤，即在第二链合成前移除已捕获的核酸，如RNA，例如采用RNA硝化酶(RNase)，如RNase H。此步骤的操作流程为本领域所熟知并有记载。但是，此步骤一般并无必要，且在大多数情况下，RNA会自然降解。从阵列上除去组织样本的步骤，一般也会移除阵列上的RNA。若想要增加RNA移除的强度，可采用RNase H。
举例来说，在含有大量RNA的组织样本中，生成双链cDNA的步骤可以产生足量的cDNA，(从阵列释放后)可直接用于测序。在这种情况下，cDNA第二链合成可以如下文所述，通过本领域所知的任何方法来完成。第二链合成反应可以在将cDNA固定在阵列上的同时，或优选地，在cDNA从阵列基本上释放之后，直接在阵列上进行，如下文所述。
在其他的实施例中，有必要增加(即扩增)已绑定的核酸(例如合成的cDNA)，以产生足够进行DNA测序的数量。在该实施例中，已绑定核酸(例如cDNA分子)的第一链，还含有阵列特征的捕获探针，充当了扩增反应中的模版，例如，聚合酶链式反应。该扩增反应的第一反应产物是DNA(如cDNA)的第二链，其自身便可充当扩增反应进一步循环的模版。
如上所述的任一实施例中，DNA(如cDNA)的第二链含有捕获探针的互补链。如果捕获探针含有通用域，尤其在该通用域中含有扩增域，则其可以用在DNA(例如cDNA)的后续扩增反应中，例如该扩增反应可以包括含有与扩增域相同序列的引物，即与扩增域的互补链互补(即杂交)的引物。在捕获探针上，扩增域处于定位域的上游(在已绑定的核酸如cDNA第一链中)，从此角度来看，定位域的互补链将并入DNA(例如cDNA分子)的第二链中。
在一些实施例中，DNA(例如cDNA)的第二链在单一反应中生成，第二链合成可以通过任何适当的方法达成。举例来说，从阵列基板上释放的cDNA的第一链，优选地但非必需地，可以用随机引物(例如六聚体引物)和DNA聚合酶，优选为链置换聚合酶(例如klenow(exo))，在适宜进行模版化DNA合成的条件下加以培养。该过程将产生各种长度的双链cDNA分子，并不大可能生成完整长度的cDNA分子，即与作为合成模板的整个mRNA相对应的cDNA分子。随机引物会与cDNA分子第一链的随机位点(即在序列中而不是序列末端)杂交。
倘若想要生成完整长度的DNA(例如cDNA)分子，即与整个已捕获的核酸(例如，RNA分子)相对应的分子(若该核酸如RNA在组织样本中部分降解，则已捕获的核酸分子，例如RNA，将不会是“完整长度”的转录体，也不会与基因组DNA的初始片段长度相同)，那么，可以对已0绑定的核酸分子(如cDNA第一链)进行修饰。举例来说，可以为cDNA分子的3’端连接一个连接子或接合体。该步骤可以采用单链合成酶来完成，例如T4 RNA连接酶或CircligaseTM(Epicentre Biotechnologies)。
可选地，可以利用双链连接酶，例如T4 DNA连接酶，将一个助手探针(能够与cDNA分子第一链的3’端相杂交的部分双链DNA分子)与已绑定的核酸(如cDNA第一链)分子的3’端相连接。本领域中还有其他适合用于该链接步骤的已知酶，包括例如Tth DNA ligase、Taq DNA ligase、Thermococcus sp.(strain 9°N)DNAligase(9°NTM DNA ligase、NewEngland Biolabs)和AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)。所述助手探针还含有一个特定序列；利用助手探针与已绑定的核酸(如cDNA第一链)相连接的部分的互补链作为引物，可从所述特定序列引导DNA(例如cDNA)分子的第二链合成。进一步，一种可选方法包括使用末端转移酶活性酶来将聚核苷酸尾(例如poly-A尾)并入被结合的核酸(例如cDNA第一链)分子的3’端。第二链合成可以用poly-T引物来引导，所述引物也可以含有特定扩增域，用于进一步扩增。生成“全长”双链DNA(例如cDNA)分子(或最大长度第二链合成)的其他方法为本领域所熟知。
在一些实施例中，第二链合成可以采用模板转换的方法，例如，采用
Figure BDA0004017774520000251
的SMARTTM技术。SMART(RNA模版5’端转换装置，即Switching Mechanism at 5’End of RNATemplate)技术已在本领域中发展完善，该技术基于
Figure BDA0004017774520000252
II(Invitrogen)等反转录酶能够在延长的cDNA分子的3’端添加若干核苷酸的发现，即生成在3’端悬有单链DNA的DNA/RNA杂交产物。该外悬DNA可以提供一条目标序列，作为寡核苷酸探针的杂交目标，为cDNA分子的进一步延长提供附加的模版。优选地，与外悬的cDNA杂交的寡核苷酸探针含有一个扩增域序列，所述扩增域序列的互补链并入cDNA第一链合成产物。含有扩增域序列的引物，将与并入cDNA第一链的互补扩增域序列杂交；可以将所述引物加入反应混合物引导第二链合成，并使用适当的聚合酶和cDNA第一链作为模版。该方法避免了将接合体连接到cDNA第一链3’端的要求。虽然模版转换法最初是为具有5’帽结构的全长mRNAs而开发，该方法已被证明可以同样良好运用于无帽结构的截短mRNAs。因此，模板转换可以用于本发明的方法中，以生成全长和/或部分或截短的cDNA分子。因此，在本发明的一个优选实施例中，第二链的合成可以利用模版转换，或通过模版转换完成。在一个特定优选实施例中，原位实施(即在捕获探针仍旧直接或间接固定于阵列的同时)模版转换反应，即进一步延长cDNA第一链以并入互补扩增域的反应。优选地，第二链合成反应也原位实施。
在一些实施例中，可能有必要，或优选地，增加、丰富或扩增DNA(例如cDNA)分子，则可以将扩增域并入DNA(例如cDNA)分子。如上所述，当捕获探针具有含扩增域的通用域时，第一扩增域可以并入被绑定的核酸分子，例如cDNA分子的第一链。在这些实施例中，第二链合成可以合并第二个扩增域。举例来说，用于生成cDNA第二链的引物，例如，随机六聚体引物，poly-T引物、与助手探针互补的引物，可能在5’端含有扩增域，即可以与扩增引物杂交的核苷酸序列。因此，所得的双链DNA可以在双链DNA(例如cDNA)分子的两个5’端，或靠近两个5’端的方向上，含有一个扩增域。这些扩增域可以用做扩增反应(如PCR)中引物的目标。可选地，与被绑定的核酸分子(例如cDNA第一链分子)的3’端连接的连接子或接合体，可以含有第二个通用域，所述通用域含有第二个扩增域。类似地，第二个扩增域可以通过模版转换并入cDNA第一链分子。
在一些实施例中其捕获探针不含有通用域，尤其是含有扩增域的通用域，则可以按照前文描述合成cDNA分子的第二链。所得双链DNA分子产物可以通过修饰，在DNA(例如cDNA)分子的第一链的5’端合并一个扩增域，以及并入DNA(如cDNA)第二链的5’端(第二个扩增域)，如果后者未在DNA(如cDNA)第二链合成步骤中完成的话。此类扩增域可以通过例如将双链接合体连接至DNA(如cDNA)分子的末端来并入。该链接步骤适用的酶为本领域所知，包括例如TthDNA连接酶、Taq DNA ligase、Thermococcus sp.(9°N菌株)DNAligase(9°NTM DNA连接酶，New England Biolabs)、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和T4DNA连接酶。在一个优选实施例中，第一和第二扩增域含有不同的序列。
由上可知，显然，通用域可以含有扩增域，能通过本领域中的各种方法、技术及技术组合添加到已绑定(即已延长或连接)的DNA(例如cDNA)分子或其互补链(例如第二链)上，例如，通过使用含有此域的引物、接合体的连接反应、末端转移酶的使用和/或模版转换方法。如上述可知，此类结构域可以在DNA分子从阵列上释放之前或之后添加。
从上文叙述中可见，显然，从按照本发明的方法合成的单一阵列中的所有DNA(例如cDNA)分子可以全部含有相同的第一和第二扩增域。由此一来，单一的扩增反应，例如PCR，便足以扩增所有的DNA(例如cDNA)分子。因此，在一个优选实施例中，本发明的方法可以含有一个DNA(例如cDNA)分子的扩增步骤。在一个实施例中，扩增步骤在DNA(例如cDNA)分子从阵列基板上释放之后实施。在其他的实施例中，扩增反应可以在阵列(即：在阵列上原位)上实施。本领域已知，扩增反应可以在阵列上实施，且已有可实施此类反应的片上热循环仪。因此，在一个实施例中，本领域已知作为测序平台或用于任何形式的序列分析(例如，在下一代测序技术中)的阵列，均可以用作本发明的阵列的基础(例如，Illumina微珠阵列等)。
对于DNA(例如cDNA)第二链的合成，如果从阵列基板上释放的cDNA含有部分双链核酸分子，则优选采用链置换聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Bst(exo-)DNA聚合酶、klenow(exo-)DNA聚合酶)。举例来说，在一些实施例中，捕获探针通过表面探针间接固定在阵列基板上，且释放DNA(例如cDNA)分子的步骤含有一个剪切步骤，则被释放的核酸至少为部分双链(例如，DNA：DNA、DNA：RNA或DNA：DNA/RNA杂合物)。为保证cDNA第二链合成反应将定位域(特征标识域)的互补链并入DNA(例如cDNA)第二链，链置换聚合酶是必要的。
显然，从阵列表面或基板上释放至少部分DNA(例如cDNA)分子或其扩增子的步骤，可以通过许多方法来完成。该释放步骤的主要目的在于产生能合并(或包含)捕获探针的定位域(或其互补链)的分子，以便所述DNA(例如cDNA)分子或其扩增子能根据其在阵列上的特征(或位置)被“标记”。因此，该释放步骤从阵列上除去了DNA(例如cDNA)分子或其扩增子，且所述DNA(例如cDNA)分子或其扩增子合并了定位域或其互补链(通过借由例如捕获探针的延长将其并入已绑定的核酸(例如cDNA第一链)，并可选地，如果在阵列上进行第二链合成，也拷入DNA第二链，或者如果在阵列上进行扩增，便拷入扩增子)。因此，为了生成能够与组织样本的各种区域相关联的序列分析数据，被释放的分子中含有捕获探针的定位域(或其互补链)是必要条件。
由于被释放的分子可以是DNA(例如cDNA)分子或扩增子的第一链或第二链，且由于捕获探针可以间接固定在阵列上，可知晓，虽释放步骤中可能含有将DNA(例如cDNA)分子从阵列上剪切的步骤，所述释放步骤并非必需核酸剪切步骤；DNA(例如cDNA)分子或其扩增子可以仅通过令双链分子变性来释放，例如从cDNA第一链释放cDNA第二链，或从模版上释放扩增子，或从表面探针释放cDNA分子第一链(即：已延长的捕获探针)。相应地，DNA(例如cDNA)分子可以通过核酸剪切和/或变性(例如，通过加热来令双链分子变性)来从阵列上释放。若在阵列上原位实施扩增反应，则显然需要将变性释放扩增子包含在循环反应中。
在一些实施例中，DNA(例如cDNA)分子在剪切域处由酶促剪切释放，所述剪切域可以位于捕获探针的通用域或定位域中。如上所述，该剪切域必须位于定位域的上游(5’端方向)，以便令被释放的DNA(例如cDNA)分子中含有定位(标识)域。适宜用于核酸剪切的酶包括限制性内切酶，例如Rsal。其他的酶，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化-裂解内切酶VIII(USERTM酶)的混合物，或MutY和T7核酸内切酶I的组合，是本发明方法的优选实施方式。
在一个可选实施例中，DNA(例如cDNA)分子可以通过物理方法从阵列的表面或基板上释放。举例来说，在一些实施例中，捕获探针间接地(例如，通过与表面探针杂交)固定在阵列基板上，那么，破坏核酸分子之间的相互作用就足够了。破坏核酸分子间相互作用的方法，例如令双链核酸分子变性，为本领域所熟知。释放DNA(例如cDNA)分子的一种直接办法(即将合成的DNA(例如cDNA)分子从阵列上剥落的方法)是使用能够干扰双链分子的氢键的溶液。在本发明的一个优选实施例中，可以通过热水处理来释放DNA(例如cDNA)分子，例如，使用温度至少在85℃的水或缓冲液，优选为至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃。除足以破坏氢键的温度外，作为一种替代或补充方式，该溶液还可以含有盐、表面活性剂等，进一步动摇核酸分子间的相互作用，达成DNA(例如cDNA)分子的释放。
可知晓，使用高温溶液，例如90-99℃的水，可能足以破坏用以将捕获探针或表面探针固定在阵列基板上的共价键。因此，在一个优选实施例中，可以通过向阵列施加热水，破坏共价固定的捕获探针或表面探针的方法来释放DNA(例如cDNA)分子。
不言而喻，被释放的DNA(例如cDNA)分子(含有被释放的DNA(例如cDNA)分子的溶液)将被收集起来，用于进一步操作，例如，第二链合成和/或扩增。尽管如此，本发明的方法可以含有收集或回收被释放的DNA(例如cDNA)分子的步骤。如上所述，在原位扩增的情况下，被释放的分子可以包含已绑定的核酸(例如cDNA)的扩增子。
本发明的一些实施例中，可能需要去除所有未延长或未连接的捕获探针。例如，该步骤可能处于从阵列释放DNA分子的步骤之后。可以用任何想用或方便的方法来进行此类移除，包括，例如，使用酶来降解未延长或未连接的探针，例如核酸外切酶。
DNA(例如cDNA)分子或其扩增子从阵列上释放之后，可能已获得如上所述的修饰，接着对其进行分析研究(例如，测定序列，虽然如上所述，并不要求实际的序列测定，但可以使用任何序列分析方法)。因此，可以采用任何核酸分析方法。序列分析步骤可以识别定位域，由此将接受分析的分子定位在组织样本的某个位点上。类似地，可以测定分析对象分子的性质或身份。以此方式，可以测定阵列上乃至组织样本上指定位置的核酸，例如RNA。由此一来，该分析步骤可以包括或使用任何方法来辨认分析对象分子(乃至“目标”分子)及其定位域。一般来说，此类方法是序列特异性方法。举例来说，该方法可以使用序列特异性引物或探针，尤其是定位域和/或待检测或待分析的特定核酸分子的特异引物或探针，例如，与待测的核酸分子(如RNA或cDNA)相对应的DNA分子。典型地，在此类方法中，可以使用序列特异性扩增引物，例如PCR引物。
在一些实施例中，可能需要分析目标相关分子的子集或同族，例如，共享序列相似度和/或保守结构域的一种特定蛋白组(例如一种受体蛋白族)的所有编码序列。因此，此述扩增和/或分析方法可以采用简并的或基因家族特异性的引物或探针，来实现与已捕获的核酸或其衍生核酸(例如扩增子)相杂交。在一个特定的优选实施例中，扩增和/或分析方法可以同时采用通用引物(即：所有已捕获序列通用的引物)和简并或对目标分子的子集具有特异性的基因家族特异性的引物。
因此，在一个实施例中，采用了基于扩增反应，特别是基于PCR反应的序列分析方法。
但是，修饰和/或扩增被释放的DNA(例如cDNA)分子的步骤可能在样本中引入其他的成分，例如，酶、引物、核苷酸等。因此，本发明的方法，可以在序列分析之前，进一步包括一个对含有被释放的DNA(例如cDNA)分子或扩增子的样本的纯化步骤，例如，移除可能干扰测序反应的寡核苷酸引物、核苷酸、盐等。可以采用任何适当的DNA(例如cDNA)分子纯化方法。
如上所述，可以对被释放的DNA进行直接或间接的序列分析。因此，序列分析基质(可看作是面临序列分析步骤或流程的分子)可以是直接从阵列上释放的分子，或可以是其衍生物。因此，举例来说，在包含测序反应的序列分析步骤中，测序模版可以是从阵列释放的分子或其衍生分子。举例来说，从阵列释放的DNA(例如cDNA)分子的第一链和/或第二链可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或作为测序分子或以其它方式辨认的分子)。在原位扩增的情况下，被释放的分子可以是扩增子。可选地，被释放的分子可以在序列分析(例如，测序或其他辨认方式)前，进行第二链合成步骤或扩增步骤。因此，序列分析基质(例如模版)可以是扩增子，或从阵列直接释放的分子的第二链。
双链分子的两条链都可以进行序列分析(例如，测序)，但本发明并不限于此，还可以分析(例如，测序)单链分子(例如，cDNA)。举例来说，可以采用各种测序技术来进行单分子测序，例如，Helicos或Pacbio技术，或正在开发中的纳米孔测序技术。因此，在一个实施例中，可以对DNA(例如cDNA)的第一链进行测序。DNA(例如cDNA)分子的第一链可能需要经过3’端修饰才能进行单分子测序。该步骤可以通过与处理DNA(例如cDNA)分子第二链类似的方法完成。此类操作为本领域所知。
本发明的一个优选方面中，序列分析会辨认或揭示部分已捕获的核酸(如RNA)序列和定位域的序列。定位域(或标签)的序列会标识捕获mRNA等核酸分子的特征。已捕获的核酸分子(例如RNA)的序列可以与样本来源生物的序列数据库进行对比，以确定其对应的基因。通过确定组织样本的哪一区域(例如，细胞)与特征接触，便可能确定组织样本的哪一区域正在表达所述基因(或含有该基因，例如，在空间基因组学研究中)。此分析可以用于本发明的方法中制得的所有DNA(例如cDNA)分子，获得组织样本的空间转录组或基因组。
在一个代表性示例中，可以分析测序数据来将捕获探针按照特定种类分类，例如，按照定位域的序列。例如，该步骤可以通过使用FastX软件工具盒的FASTQ识别码分解器工具，将序列按照捕获探针定位域(标签)序列分别归入单独文档。可以对每一种类(即来自每一特征)的序列加以分析，以确定转录体的身份。举例来说，可以使用如Bastn软件来辨认序列，将序列与一种或多种基因组数据库相比较，优选为组织样本来源生物的数据库。若某数据库序列与本发明的方法制得的序列相似度最高，则将所述数据库序列的身份分配给本发明制得的序列。一般来说，只有确定性为至少1e-6，优选为1e-7、1e-8或1e-9的匹配会被看作是成功辨认。
显然，任何核酸测序方法都可以用于本发明的方法中。但是，所谓的“下一代测序”技术在本发明尤为适用。高通量测序在本发明的方法中尤为有用，因为它对大量核酸在非常短的时间内进行部分测序。从近期爆发式增长的全部或部分得到测序的基因组数量来看，要确定每个分子所对应的基因，并不是非得对制得的DNA(例如cDNA)分子进行全长测序不可。举例来说，DNA(例如cDNA)分子各端的前100个核苷酸应该足够用来辨认捕获原核酸(例如mRNA)的特征和所表达的基因。从DNA(例如cDNA)分子的“捕获探针端”的序列反应可以获得定位域的序列以及转录体特异序列数据中至少约20个碱基，优选为30或40个碱基。“非捕获探针端”的序列反应可以获得转录体特异序列数据中至少约70个碱基，优选为80、90或100个碱基。
在一个代表性示例中，测序反应可以基于可逆染色终止剂，例如用于IlluminaTM技术中。举例来说，DNA分子可以先在例如玻璃片或硅片上与引物连接并扩增，形成局部克隆群落(桥式扩增)。加入4种ddNTPs，并洗除未结合的核苷酸。与焦磷酸测序不同的是，DNA一次可以只延长1个核苷酸。用照相机对荧光标记核苷酸拍照，然后用化学方法移除染色剂和DNA上的3’端末端封闭物，以便进行下一次循环。可重复该步骤直至获得要求的序列数据。使用这一技术，可以在仅仅一块载片上对上千核酸进行同时测序。
其他高通量测序技术也可以同样适用于本发明的方法，例如，焦磷酸测序。该方法中，DNA扩增反应在油溶液(微乳液PCR)中的水滴中进行，每一水滴含有附着于涂有单一引物的微珠之上的单一DNA模版，然后形成克隆群落。测序仪器含有许多皮升容量孔，每孔含有一个微珠及测序酶。焦磷酸测序采用荧光素酶发光来检测添加至新生DNA的个体核苷酸，并用合并数据生成序列读数。
正在开发中的技术的一个示例，是对DNA聚合反应中释放的氢离子的检测。用单一种类的核苷酸关注含有待测序的模版DNA链的微孔。若引入的核苷酸与模版的前导核苷酸互补，则将其加入增长中的互补链；随之释放的一个氢离子，触动高灵敏度的离子感应器，从而指示反应的发生。如果模版序列中存在同聚物重复，则单个循环中便会有多个核苷酸得到结合，从而引起对应数量的氢离子的释放，以及成比例的较高电信号。
因此，显然未来的测序形式正在缓慢地成为可用形式；这些平台的主要特点之一在于运行时间更短，显然，其他的测序技术将来也会用于本发明的方法中。
本发明的一个必要特点，如上所述，是将已捕获的核酸分子的互补链结合在捕获探针上的步骤，例如，对已捕获的RNA分子进行反转录。反转录反应为本领域所熟知，且代表性的反转录反应中，反应混合物包括反转录酶、dNTP和适当的缓冲液。反应混合物可以含有其他成分，例如Rnase抑制物。引物和模版分别是捕获探针的捕获域和已捕获的RNA分子，如上所述。在所述方法主题中，典型地，每种dNTP的用量在10-5000μM之间，通常是从约20-1000μM。显然，可以使用DNA聚合酶活性的酶，通过等同的反应来生成捕获的DNA分子的互补链。此类反应为本领域所熟知，且下文中将会进一步详细叙述。
所需的反转录酶活性可以由一种或多种不同的酶来提供，其中适合的例子有：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM以及
Figure BDA0004017774520000311
I、IIIII酶。
反转录酶反应可以在任何适当温度下进行，取决于酶的性质。典型地，反转录酶反应在37-55℃间实施，但此范围之外的温度也可能适合。反应时间可以短至1、2、3、4或5分钟，或者长达48小时。典型地，反应时间在5-120分钟之间，根据选择，优选为5-60、5-45或5-30分钟，或者1-10或1-5分钟。反应时间并非关键因素，根据意愿可以采用任何的反应时间长度。
如上所述，本方法的某些实施例包括扩增步骤，用以增加所制得的DNA(例如cDNA)分子的拷贝数，例如为了充实样本，以更好地表现从组织样本中捕获的核酸(转录体)。根据需要，扩增反应可以是线性的或者指数的，适用的代表性扩增反应操作流程包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR)；等温扩增反应，等等。
聚合酶链式反应(PCR)为本领域所熟知，如申请号为4,683,202；4,683,195；4,800,159；4,965,188和5,512,462的美国专利中所述，所述专利以援引的方式并入本公开。在代表性的PCR扩增反应中，反应混合物含有上述从阵列释放的DNA(例如cDNA)分子，所述DNA(例如cDNA)分子与一种或多种用于引物延长反应中的引物合并，例如，与第一和/第二扩增域相杂交的PCR引物(例如用于几何(或指数)扩增反应的正向引物和反向引物，或用于线性扩增反应的单个引物)。与被释放的DNA(例如cDNA)分子(方便起见，下文中称为模版DNA)相接触的寡核苷酸引物将具有足够的长度，来支持退火处理条件下与互补模板DNA的杂交反应(下文中将更详细叙述)。引物的长度取决于扩增域的长度，但总地来说至少有10bp，通常至少15bp，更常见的是至少16bp长，且可以长达30bp或以上；引物的长度范围一般可在18-50bp之间，通常是约20-35bp。模版DNA可以与单个引物或一对引物(正向引物和反向引物)接触，取决于是否需要进行模版DNA的引物延长、线性或指数扩增。
除上述成分以外，本方法主题中制得的典型反应混合物还包括聚合酶和脱氧核糖核酸三磷酸盐(dNTPs)。可以通过一种或多种不同的聚合酶来提供所需的聚合酶活性。在许多实施例中，反应混合物至少包括A族(Family A)聚合酶，且适用的典型A族聚合酶包括，但不限于：栖热水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶，包括天然聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物，例如Klentaq(如Barnes et al,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220所述)；嗜热细菌(Thermus thermophilus)聚合酶，包括天然聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物，以及类似物。在某些实施例中，所实施的扩增反应是高保真度反应，反应混合物可以进一步包括具有3’-5’端核酸外切酶活性的聚合酶，例如，可以有B族(Family B)聚合酶提供该酶活性，且适用的B族聚合酶包括，但不限于：海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)，如Perler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:5577-5581所述；热球菌属物种GB-D(Pyrococcus species GB-D)(Deep Vent)；如Lundberg et al.,Gene(1991)108:1-6所述的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)以及类似物。若反应混合物中同时含有A族和B族聚合酶，则反应混合物中的A族聚合酶的含量可以高于B族聚合酶，其活性差通常至少为10倍，更常见的是至少约100倍。一般来说，反应混合物包括4中不同类型的dNTPs，与4种天然碱基相对应，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本方法主题中，典型地，每种dNTP的含量范围约在10-5000μM，通常在约20-1000μM之间。
本方法主题的反转录酶和/或扩增反应步骤中制得的反应混合物可以进一步包括一种水性缓冲介质，所述介质中含有一价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可以采用任何便于使用的一价离子源，例如KCl、醋酸钾、醋酸铵、谷氨酸钾、NH4Cl、硫酸铵及类似物。二价阳离子可以是镁、锰、锌及类似物，且阳离子一般是镁。任何便利的镁离子源都可以采用，包括MgCl2、醋酸镁及类似物。缓冲液中Mg2+的含量范围可以在0.5-10mM之间，但优选范围在3-6mM之间，理想值为5mM。缓冲液中可能存在的代表性缓冲介质或盐类包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸(Tricine)、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙磺酸(MOPS)及类似物，其中缓冲剂的典型含量范围在约5-150mM之间，通常为约10-100mM之间，更常见的是约20-50mM，且在某些优选实施例中，缓冲介质的含量足以提供约为6.0-9.5的pH范围，其中最为优选的是72℃时pH为7.3。缓冲介质中可以含有的其他介质包括螯合剂，例如EDTA、EGTA及类似物。
在本方法主题的各步骤所需的反转录酶、DNA延长或扩增反应混合物的制备中，可以按照任何方便的顺序合并各种成分。举例来说，在扩增反应中，可以先向缓冲液中加入引物、聚合酶，然后是模版DNA，或者同时混合所有的各种成分来制备反应混合物。
如上所述，本发明的一个优选实施例中，可以通过向核酸分子的末端添加扩增域来修饰DNA(例如cDNA)分子，该过程可以包括连接反应。当捕获探针间接固定在阵列表面的时候，阵列上捕获探针的原位合成也需要通过连接反应来完成。
如本领域中所知，连接酶催化两个紧邻的核酸间并置的3’-羟基和5’-磷酸末端之间的磷酸二酯键的形成。可以采用任何方便的连接酶，其中适用的代表性连接酶包括，但不限于：热敏性和热稳定性连接酶。热敏性连接酶包括，但不限于，噬菌体T4 DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌连接酶。热稳定性连接酶包括，但不限于，Taq连接酶、Tth连接酶和Pfu连接酶。热稳定性连接酶可以从嗜热或者极端嗜热的生物中获得，包括但不限于，原核生物、真核生物或古细菌。本发明的方法中可以采用某些RNA连接酶。
该链接步骤中，将适当的连接酶和根据必要性和/或医院选用的任何试剂与反应混合物合并，并在适合相关寡核苷酸进行连接反应的条件下维持。连接反应条件为本领域技术人员所熟知。连接反应中，某些实施例中的反应混合物可以保持在约4℃至约50℃，例如在约20℃至约37℃的温度下保持一段时间，所述时间为约5秒钟至约16小时，例如从约1分钟至约1小时。但在其他一些实施例中，反应混合物可以在约35℃至约45℃的范围内，例如从约37℃至约42℃，如在(约)38℃、39℃、40℃或41℃维持一段时间，所述时间范围在约5秒钟至约16小时之间，例如从约1分钟至约1小时，包括从约2分钟至约8小时。在一个代表性实施例中，连接反应混合物包括50mM Tris(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25mg/ml BSA、0.25units/ml RNase抑制物和0.125units/ml T4 DNA连接酶。在又一个代表性实施例中，采用了2.125mM镁离子、0.2units/ml RNase抑制物和0.125units/ml RNase DNA连接酶。反应中所用的接合体含量取决于样本中的DNA(例如cDNA)分子的浓度，通常在DNA(例如cDNA)的摩尔含量的10-100倍之间。
在一个代表性示例中，本发明的方法可以含有以下步骤：
(a)将阵列与组织样本相接触，其中所述阵列包括基板，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，且每一种类在所述阵列中各占不同位置，且所述探针定向为具有3’自由端，以使所述探针能作为反转录酶(RT)引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与阵列上的捕获探针位置相对应的定位域，和
(ii)捕获域；
以令组织样本的RNA与所述捕获探针相杂交。
(b)对阵列上的组织样本成像；
(c)对捕获的mRNA分子进行反转录以生成cDNA分子；
(d)洗涤阵列以去除残余组织；
(e)从阵列表面释放至少部分cDNA分子；
(f)对释放的cDNA分子实施cDNA第二链合成；
以及
(g)分析(例如测序)cDNA分子的序列。
在一个可选的代表性示例中，本发明的方法可以含有以下步骤：
(a)将阵列与组织样本相接触，其中所述阵列包括基板，所述基板上直接或间接地固定了至少两种捕获探针，且每一种类在所述阵列中各占不同位置，且所述探针定向为具有3’自由端，以使所述探针能作为反转录酶(RT)引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与阵列上的捕获探针位置相对应的定位域，和
(ii)捕获域；
以令组织样本的RNA与所述捕获探针相杂交；
(b)可选地，对组织样本进行补水；
(c)对已捕获的mRNA分子进行反转录，以生成cDNA分子的第一链，且可选地，合成cDNA分子的第二链；
(d)对阵列上的组织样本成像；
(e)洗涤阵列以去除残余组织；
(f)从阵列表面释放至少部分cDNA分子；
(g)对释放的cDNA分子实施cDNA第二链合成；
以及
(h)分析(例如测序)cDNA分子的序列。
在一个代表性示例中，本发明的方法可以含有以下步骤：
(a)将阵列与组织样本相接触，其中所述阵列包括基板，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，且每一种类在所述阵列中各占不同位置，且所述探针定向为具有3’自由端，以使所述探针能充当反转录酶(RT)引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与阵列上的捕获探针位置相对应的定位域，和
(ii)捕获域；
以令组织样本的RNA与所述捕获探针相杂交。
(b)可选地，对阵列上的组织样本成像；
(c)对捕获的mRNA分子进行反转录以生成cDNA分子；
(d)可选地，若未进行步骤(b)的成像步骤，则对阵列上的组织样本成像；
(e)洗涤阵列以去除残余组织；
(f)从阵列表面释放至少部分cDNA分子；
(g)对已释放的cDNA分子实施cDNA第二链合成；
(h)扩增双链cDNA分子；
(i)可选地，纯化cDNA分子，以除去可能干扰测序反应的成分；
以及
(j)分析(例如测序)cDNA分子的序列。
本发明包括上述方法中各步骤的任何适当组合。可知晓，本发明还包括这些方法的变形，例如，在阵列上进行原位扩增，以及包括了省略成像步骤的方法。
本发明还可以被看做是包括一种制作或生产阵列的方法，所述阵列(i)用于从与其相接触的组织样本上捕获mRNA；或(ii)用于确定和/或分析组织样本的(例如，部分或全局)转录组，所述方法包括在阵列基板上直接或间接地固定多种捕获探针，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与阵列上的捕获探针位置相对应的定位域，和
(ii)捕获域；
本发明用于生产阵列的方法可以进一步限定为，固定在阵列上的每种捕获探针都作为一个特征。
将捕获探针固定于阵列的方法，可以采用如上所述的任何适当方法来完成。当捕获探针间接固定在阵列上时，捕获探针可以在阵列上合成。所述方法可以含有一个或多个以下任意步骤：
(a)将多种表面探针直接或间接固定在阵列基板上，其中表面探针含有：
(i)能够与部分捕获域寡核苷酸(不用于捕获RNA等核酸的部分)相杂交的结构域；
(ii)互补定位域；以及
(iii)互补通用域；
(b)将捕获域寡核苷酸和通用域寡核苷酸与固定在阵列上的表面探针相杂交；
(c)通过模版化的聚合反应，延长通用域寡核苷酸，以生成捕获探针的定位域；以及
(d)将定位域连接至捕获域寡核苷酸，以生成捕获寡核苷酸。
步骤(d)中的连接反应可以与步骤(c)中的延长反应同时进行，因此，该反应并非必须在单独的一步中进行，当然，根据意愿也可以这样做。
按照本发明的上述阵列生产方法制造出来的阵列，其特征可以如上所述进行进一步限定。
虽然如上所述，本发明涉及RNA的检测或分析以及转录组的分析或检测，但可知晓，所述原理可以同理应用于细胞DNA的检测或分析以及用于基因组研究。因此，从更广阔的视角来看，本发明一般说来可以看做是用于检测核酸，从更具体的方面来说，可以看作是提供了DNA的分析或检测方法。空间信息可能会对基因组学相关研究具有价值，即带空间解析度的DNA分子检测和/或分析。根据本发明，这可以通过基因组标签来达成。此类局部或空间检测方法可以会在例如组织的不同细胞或区域中的基因组变异研究中有用，例如比较正常和病态细胞或组织(如正常vs.肿瘤细胞或组织)，或研究疾病进程中的基因组变化等。举例来说，肿瘤细胞可以包含具有不同的基因组变异体的细胞异源种群(例如，变异和/或其他基因异常，如染色体重排、染色体扩增/删除/插入等)。不同细胞中基因组变异或不同基因组位点的局部检测，在这样的情况下会有用，例如，研究基因组变异的空间分布。此方法的一个主要用途在于肿瘤分析。例如，在本发明的范围中，可以制备出为捕获一个特征的整个细胞的基因组所设计的阵列。因此，可以比较组织样本的不同细胞。显然，本发明并不局限于这一设计，而可能存在其他可能的变化方式，其中对DNA进行局部检测，且阵列上DNA的捕获位置与组织样本的某个位置或位点相关联。
相应地，在一个更广泛的方面，本发明可以看作是提供了组织样本中核酸的局部检测方法，包括：
(a)提供一种阵列，所述阵列包括基板，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，令每一种类探针在所述阵列中各占不同位置且定向为具有3’自由端，以使所述探针能充当延长反应或引物连接反应的引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与所述阵列上的所述探针的位置对应的定位域，和
(ii)捕获域；
(b)令所述阵列与组织样本接触，以使得阵列上捕获探针的位置能与所述组织样本上的某个位置相关联，并允许组织样本上的核酸与所述捕获探针的捕获域杂交；
(c)以所述捕获探针作为延长引物或连接引物，从已捕获的核酸分子上生成DNA分子，其中所述被延长或连接的DNA分子通过定位域来标记；
(d)可选地，产生一条所述被标记DNA的互补链，和/或可选地，扩增所述被标记DNA；
(e)从所述阵列表面释放至少部分被标记DNA分子和/或他们的互补链或扩增子，其中所述部分包括定位域或其互补链；
(f)直接或间接分析被释放DNA分子的序列(例如，测序)。
如上文中更为详细的描述，任何核酸分析方法都可以用来进行分析步骤；典型地，可以包括测序，但实施序列确定并不是必要的。例如，可以采用序列特异性的分析方法。例如可以实施序列特异性的扩增方式，如使用定位域特异性的引物和/或针对特定目标序列的引物，例如，待测的特定目标DNA(即：与特定的cDNA/RNA、基因、基因变异体、基因组位点或基因组变异体等相对应的DNA).一种范例分析方法是序列特异性PCR反应。
步骤(f)中获得的序列分析(例如测序)信息可以用于获得样本的核酸相关的空间信息。换句话说，序列分析信息可以提供样本的核酸的位置相关信息。该空间信息可以来自已确定或辨认的序列等的分析信息，例如可以揭示特定核酸分子的存在，该特定核酸分子的存在可能本身在所用组织样本中就含有有用空间信息，和/或可以结合组织样本在阵列上的位置与序列分析信息来推定空间信息(例如，空间定位)。但是，如上所述，可以通过将序列分析数据与组织样本的图像相关联来方便地获取空间信息，这体现在本发明的一个优选实施例中。
相应地，在一个优选的实施例中，本方法还可以包括如下步骤：
(g)将所述阵列分析信息与所述组织样本图像相关联，其中组织样本在步骤(c)之前或之后成像。
步骤(a)中涉及的引物延长反应可以限定为聚合酶催化的延长反应，其作用在于，获取与捕获探针共价连接的已捕获核酸分子的互补链，也就是，以捕获探针作为引物和以已捕获的核酸作为模版，合成互补链。换句话说，所述延长反应可以是通过任何聚合酶来实施的任何引物延长反应。所述核酸可以是RNA或DNA。相应地，所述聚合酶可以是任何聚合酶；可以是反转录酶或DNA聚合酶。连接反应可以通过任何连接酶实施，其作用在于将已捕获的核酸分子的互补链绑定在捕获探针上，即：其中已捕获的核酸分子(杂交于捕获探针上)含部分双链，且其互补链与捕获探针相连接。
这一方法的一个优选实施例，即为如上所述用于转录组的确定和/或分析或者用于RNA测定的方法。在一个替代方式的优选实施例中，所述待测核酸分子为DNA。在此种实施例中，本发明提供了一种组织样本中DNA的局部检测方法，包括：
(a)提供包括基板的阵列，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，且每一种类在所述阵列中各占不同位置，且其方向上具有3’自由端，以使所述探针能作为引物引导引物延长反应或引物连接反应，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与所述阵列上的所述探针的位置对应的定位域，和
(ii)捕获域；
(b)将所述阵列与组织样本接触，以使得阵列上的捕获探针的位置能和所述组织样本上的位置相关联，并允许所述组织样本上的DNA与所述捕获探针的捕获域杂交；
(c)将所述组织样本中的DNA片段化，其中所述片段化在阵列与组织样本相接触的步骤(b)之前、之中或者之后实施；
(d)以已捕获的DNA片段作为模版，通过引物延长反应来延长所述捕获探针，或通过连接反应将已捕获的DNA片段连接在捕获探针上，以产生DNA分子，其中所述被延长或连接的DNA分子通过定位域来标记；
(e)可选地，产生一条所述被标记DNA的互补链和/或可选地，扩增所述被标记DNA；
(f)从所述阵列表面释放至少部分被标记DNA分子和/或他们的互补链或扩增子，其中所述部分包括所述定位域或其互补链；
(g)直接或间接分析被释放DNA分子的序列。
该方法还可以进一步包括以下步骤：
(h)将所述阵列分析信息与所述组织样本的图像相关联，其中组织样本在步骤(d)之前或之后成像。
在空间基因组学研究中，且目标核酸是DNA时，某些情况下优选包括成像步骤以及图像关联步骤。
在一些捕获DNA的实施例中，所述DNA可以是细胞中出现的任何DNA分子。因此，它可以是基因组(即细胞核的)DNA、线粒体DNA或质粒DNA，如叶绿体DNA。在一个优选实施例中，所述DNA为基因组DNA。
可知晓，当在步骤(b)所述接触(即在组织样本放置于阵列上)之后才实施片段化时，DNA的片段化发生于同捕获域相杂交之前。换句话说，DNA片段与所述捕获探针的捕获域相杂交(或更具体地说，允许杂交)。
本发明在此方面的一个特定实施例中，优选地，但并非必须地，可以为组织样本的DNA片段引入一个结合域，来允许或促进阵列上的捕获探针对所述片段的捕获。相应地，所述结合域能够与捕获探针的捕获域杂交。因此，所述结合域可以被看做是捕获域的互补链(即：可以被看做是互补捕获域)，但并不要求捕获域和结合域之间的绝对互补，仅要求结合域的互补程度足以允许有效杂交的发生，即：令组织样本中的DNA片段能够与捕获探针的捕获域相杂交。引入这样一个结合域，可以保证样本DNA直到片段化步骤之后才与捕获探针结合。可以通过本领域熟知的操作流程向DNA片段提供结合域，例如，通过令可含有结合域的接合体或连接子序列相连接。举例来说，可以使用含有一个伸出端的连接子序列。结合域可以存在于此连接子的单链部分，以便于接下来该连接子与DNA片段的连接；含有结合域的单链部分能用于与捕获探针的捕获域的杂交。可选地，在一个优选实施例中，可以通过末端转移酶引入聚核苷酸尾(例如，同聚体尾，如poly-A结构域)来引入结合域。该步骤可以通过使用与上述RNA方法中引入通用域的类似操作来实施。因此，在优选的实施例中，可以引入一个共同结合域。换句话说，就是所有DNA片段共同的结合域，可以用于达成阵列上的片段捕获。
实施加尾反应来引入(共同)结合域时，可以保护阵列上的捕获探针不受加尾影响，即：可如前文封闭或遮蔽捕获探针。该步骤可以通过，例如用封闭寡核苷酸与捕获探针杂交来达成，例如与捕获探针的伸出端(如单链部分)杂交。举例来说，当捕获域含有poly-T序列时，该封闭寡核苷酸可以是poly-A寡核苷酸。该封闭寡核苷酸可以含有已封闭的3’端(即：无法延长或加尾的一端)。如上所述，对捕获探针，还可以通过化学和/或酶促修饰的方法来加以保护，即加以封闭。
当按照前文通过连接子的连接反应来引入结合域时，可知晓，与其延长捕获探针来生成一个含有捕获探针引物的定位标签的已捕获DNA片段互补副本，还可以将DNA片段连接至捕获探针3’端。如上所述，连接反应要求待连接的5’端磷酸化。相应地，在一个实施例中，新增的连接子的5’端，即将要连接至捕获探针的一端(即新增至DNA片段的连接子的非伸出端)，会经过磷酸化。在该连接反应的实施例中，相应地，可知晓，可以将一个连接子连接到双链DNA片段上，所述连接子具有含有结合域的单链伸出3’端。与阵列接触之时，所述伸出端便与捕获探针的捕获域相杂交。该杂交反应将捕获探针的3’端与新增的连接子的5’端(非伸出端)并置及连接。因此，捕获探针，乃至定位域，都通过该连接反应并入已捕获的DNA片段。该实施例的原理如图21所示。
因此，在一种更具体的实施方式中，本发明在该方面的方法可以包括：
(a)提供包括基板的阵列，所述基板上直接或间接地固定了多种捕获探针，每一种类在所述阵列中各占不同位置，且定向为具有3’自由端，以使所述探针能充当延长反应或引物连接反应的引物，其中所述捕获探针的每一种类都包括一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’方向上包括：
(i)与阵列上的探针位置对应的定位域，和
(ii)捕获域；
(b)将所述阵列与组织样本接触，以使得阵列上的捕获探针的位置能和所述组织样本上的位置相关联；
(c)将所述组织样本中的DNA片段化，其中所述片段化在阵列与组织样本相接触的步骤(b)之前、之中或之后实施；
(d)为所述DNA片段引入一个结合域，所述结合域可以与所述捕获域杂交；
(e)允许所述DNA片段与所述捕获探针的捕获域杂交；
(f)以已捕获的DNA片段作为模版，通过引物延长反应延长所述捕获探针，或通过连接反应将已捕获的DNA片段连接在捕获探针上，以生成DNA分子，其中所述被延长或连接的DNA分子通过定位域来标记；
(g)可选地，产生一条所述被标记DNA的互补链和/或可选地，扩增所述被标记DNA；
(h)从所述阵列表面释放至少部分被标记DNA分子和/或他们的互补链或扩增子，其中所述部分包括所述定位域或其互补链；
(i)直接或间接分析被释放DNA分子的序列。
可选地，该方法还可以进一步包括以下步骤：
(j)将所述阵列分析信息与所述组织样本的图像相关联，其中组织样本在步骤(f)之前或之后成像。
如上所述的核酸或DNA检测方法中，生成被标记核酸/DNA的互补副本亦或扩增被标记DNA的可选步骤，可以包括按照前文RNA/转录组分析/检测方法中所述的原理，使用链置换聚合酶。适当的链置换聚合酶如上所述。该步骤的目的在于，保证定位域被复制引入所述互补副本或扩增子，尤其是在捕获探针通过与表面探针杂交固定在阵列上的情况下。
但是，本步骤中，链置换聚合酶的使用并不是必要的。举例来说，可以同时利用非链置换聚合酶和与定位域杂交的寡核苷酸的连接反应。该流程类同于上述捕获探针在阵列上的合成。
在一个实施例中，本发明的方法可以用于确定和/或分析组织样本的全部基因组，例如，组织样本的全基因组。但是，本方法并不限于此，还包括确定和/或分析全部或部分基因组。因此，本方法可以包括确定和/或分析基因组的部分或子集，例如，对应于染色体的一个基因子集或基因群的部分基因组，如特定基因群或染色体群、或基因组的特定区域或部分，例如涉及某一特定疾病、状况、组织类型等。因此，本方法可以用于检测或分析肿瘤组织与正常组织相比之下的基因组序列或基因组位点，或者甚至一个组织样本中的不同细胞类型。还可以检测不同细胞、细胞群、组织、局部组织、组织类型的不同基因组变异或位点的存在、缺失、分布或定位。
从另一方面来看，本方法的上述步骤可以看作是提供了一种获取关于核酸的空间信息的方法，例如组织样本的基因组序列、变异体或位点。换句话说，本发明的方法可以用于标记(或标识)基因组，尤其是个体或空间分布的基因组。
从另一角度来看，本发明的方法可以看作是一种组织样本的DNA的空间检测方法，或一种以空间解析度检测DNA的方法，或一种对组织样本的DNA进行局部或空间确定和/或分析的方法。尤其是，本方法可以用于组织样本中基因或基因组序列或基因组变异体或位点(例如，基因组变异体或位点的分布)的局部或空间检测、确定和/或分析。局部/空间检测/确定/分析的意思是，可以对组织样本DNA在细胞或组织中的原生位置或位点进行定位。因此，举例来说，可以将DNA在样本中的一个细胞、细胞群或细胞类型，或组织样本的特定区域进行定位。可以确定DNA(或换句话说，组织样本中DNA的位点或位置)的原生位点或位置，例如基因组变异体或位点。
因此，可知晓，本发明的阵列可以用于捕获核酸，例如，与所述阵列相接触的组织样本DNA。该阵列还可以用于确定和/或分析组织样本的部分或全局基因组，或用于获取组织样本中含空间限定信息的部分或全局基因组。因此，本发明的方法可以被看做是组织样本中一种或多种基因组序列(或变异体，或基因位点)的空间分布的量化方法。换句话说，本发明的方法可以用于检测组织样本中一种或多种基因组序列、基因组变异体或基因组基因位点。再换句话说，本发明的方法可用于同时确定组织样本中一种或多种基因组序列、基因组变异体或基因组基因位点的位置或分布。更进一步地，该方法可以看做是以空间解析度，例如二维空间解析度，对组织样本的核酸(如DNA))进行部分或全局分析的方法。
本发明还可以看作是为本发明的方法提供一种阵列，所述阵列包括基板，所述基板上含有多种直接或间接固定的捕获探针，且每种探针在阵列上占据不同位置并定向为具有自由3’端，以能令所述探针具有延长引物或连接引物的作用，其中所述捕获探针的每个种类都含有一个核酸分子，所述核酸分子在其5’至3’端的方向上含有：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，以及
(ii)捕获域，用于捕获与所述阵列相接触的组织样本的核酸。
在其中一个方面中，已捕获的核酸分子为DNA。捕获域可以针对待检测的一种特定DNA或DNA的特定种类、群组具有特异性，例如，按照前文所述RNA检测的类同方法，令捕获域与目标DNA特定基元序列，如保守序列，进行特异性杂交。可选地，可以为待捕获的DNA引入一个结合域，例如，如上所述的共同结合域，所述结合域可以被捕获探针的捕获域识别。因此，如上所述，结合域可以是例如同聚物序列，如poly-A。同样地，可以按照类似前文所述设计RNA/转录组分析或检测的原理和方法来获得该结合域。在此情形下，捕获域可以与被引入组织样本DNA分子的结合域互补。
如前文RNA相关内容所述，捕获域可以是一个随机或简并序列。因此，可以通过令DNA与一个随机或简并捕获域结合，或与含有至少部分随机或简并序列的捕获域结合，来捕获DNA。
在一个相关的方面，本发明还提供一种阵列的应用，包括基板，所述基板上直接或间接固定了多种捕获探针，每种探针在阵列上居于不同位置且定向为具有3’端自由端，以便使所述探针能够充当延长反应或连接反应的引物，其中所述探针的每个种类都含有一个核酸分子，所述核酸分子在5’至3’端的方向上含有：
(i)定位域，与阵列上的捕获探针的位置相对应，以及
(ii)捕获域；
所述捕获域用于捕获与所述阵列相接触的组织样本的核酸，如DNA或RNA。
优选地，所述应用用于组织样本核酸的局部检测，且进一步包含以下步骤：
(a)利用所述捕获探针作为延长引物或连接引物，从已捕获的核酸分子生成DNA分子，其中所述被延长或连接的分子通过定位域加以标记；
(b)可选地，生成所述被标记核酸的互补链和/或扩增所述被标记的核酸；
(c)从阵列表面释放至少部分被标记的DNA分子和/或其互补链或扩增子，其中所述部分包括定位域或其互补链；
(d)直接或间接分析被释放的DNA分子的序列；且可选地
(e)将所述的序列分析信息与所述组织样本的图像相关联，其中所述组织样本的成像完成于步骤(a)。
组织样本DNA片段化的步骤可以根据意愿，通过任何本领域所知方法实施。因此，可以采用物理方法实施片段化，例如声波降解法或超声处理。相关化学方法亦已知晓。还可以采用酶促方法实现片段化，例如，利用核酸内切酶，如限制性酶。同样地，该步骤的方法和酶为本领域所熟知。片段化可以在制备待用于阵列的组织样本的步骤(例如制备组织切片的步骤)之前、之中或者之后。方便的是，固定组织的步骤就可能造成片段化。因此，举例来说，福尔马林固定可以造成DNA的片段化。其他的固定剂可以带来类似结果。
关于本发明的这些方面中制备和使用阵列的细节，可知晓，前文中所述RNA方法中给出的描述和细节也可同理应用于此述的更为广泛的核酸检测和DNA检测方法。因此，上述的所有方面和细节同理可用。举例来说，关于反转录酶引物和反应等的论述可同理适用于上述延长引物、聚合酶反应等的任何方面。同样地，cDNA第一链和第二链合成的参考方法也可以同理适用于被标记的DNA分子及其互补链。序列分析可以采用如上所述的方法。
举例来说，捕获域可以如上述用于捕获探针。含有或仅含有poly-T的捕获域可用于，例如，向DNA片段引入含有poly-A序列的结合域的情况。
可为捕获探针/标记DNA分子(即：带标记并经延长或连接的分子)引入上述的通用域，例如，用于扩增和/或剪切。
附图说明
下面将结合非限制性的实施例并引用如下附图，对本发明作进一步描述。
图1所示为利用“识别码”寡脱氧胸苷酸探针的阵列来从组织切片捕获mRNA并用于转录组分析的整体概念。
图2所示为相应组织切片的转录体丰度可视化的原理示意图。
图3所示为3’至5’表面探针的构成以及间接固定于阵列表面的5’至3’方向的捕获探针的合成。
图4所示为自制阵列的酶促(USER或Rsal)剪切效率和Agilent生产的阵列在99℃热水中的剪切效率，以探针释放后，荧光标记的探针与阵列表面的杂交反应来测定。
图5所示为Agilent生产的商品阵列在99℃热水介导下进行DNA表面探针释放后所捕捉的荧光图像。热水处理后，进行了荧光检测探针的杂交。最上方的阵列为未处理的对照组。
图6所示为固定于转录组捕获阵列之上的小鼠脑组织切片，已经过cDNA合成并分别以胞质染色剂(上，标记为NeuN)和核酸染色剂(中，标记为Nuclei)处理，两种染色剂都展示于合并图像中(下，标记为merge)。
图7所示为表格，列出了示意图所示的低密度自制DNA捕获阵列中按来源位点分类的Read。
图8所示为一个识别码微阵列中，以核酸和Map2特异染色剂染色的FFPE小鼠脑组织。
图9所示为以核酸染色剂(白色)染色的FFPE小鼠脑嗅球及可见形态。
图10所示为以核酸染色剂(白色)染色的FFPE小鼠脑嗅球(约2x2mm)，与低分辨率阵列的理论点样格局相重叠。
图11所示为以核酸染色剂(白色)染色的FFPE小鼠脑嗅球(约2x2mm)，与中等分辨率阵列的理论点样格局相重叠。
图12所示为FFPE小鼠脑嗅球的小球区域的放大显示(即图9右上部)。
图13所示为在扩增反应中，用由B_handle连接的随机六聚体引物(R6)(B_R6)进行USER释放的所得产物；产物以生物分析仪绘制。
图14所示为在扩增反应中，用由B_handle连接的随机八聚体引物(R8)(B_R8)进行USER释放的所得产物；产物以生物分析仪绘制。
图15所示为一项在覆盖整个阵列的FFPE脑组织上进行的实验的结果。在表面合成及释放cDNA后，以ID特异性及基因特异性引物(B2M外显子4)扩增的ID5(左)和ID20(右)；扩增后的ID5和ID20。
图16所示为实施例4中所述方法的原理的示意图，即固定有载有空间标记序列(定位域)的DNA寡核苷酸(捕获探针)的微阵列的使用。所述微阵列的寡核苷酸的每一特征都载有1)特有的标记(定位域)和2)捕获序列(捕获域)。
图17所示为实施例5中以预先片段化为平均大小为200bp的基因组DNA来实施所述的空间基因组实验流程所得的实验结果。在阵列上扩增内部产物，标记并合成了DNA。测得的峰值大小符合预期。
图18所示为实施例5中以预先片段化为平均大小为700bp的基因组DNA来实施所述的空间基因组实验流程所得的实验结果。在阵列上扩增内部产物，标记并合成了DNA。测得的峰值大小符合预期。
图19所示为以预先片段化为平均大小为200bp的基因组DNA来实施实施例5中所述的空间基因组实验流程所得的实验结果。以表面寡核苷酸所含的一个内引物和一个通用序列对产物进行扩增。在阵列上进行扩增，标记并合成了DNA。由于随机片段化和基因组DNA的末端转移酶标记会产生极为多样化的样本池，预期产物具有拖尾。
图20所示为以预先片段化为700bp的基因组DNA来实施实施例5中所述的空间基因组实验流程所得的实验结果。以表面寡核苷酸所含的一个内引物和一个通用序列对产物进行扩增。在阵列上进行扩增，标记并合成了DNA。由于随机片段化和基因组DNA的末端转移酶标记会产生极为多样化的样本池，预期产物具有拖尾。
图21所示为连接子连接到DNA片段的连接反应示意图，该反应在poly-T捕获域中引入用于杂交的结合域，以达成与捕获探针的后续连接。
图22所示为高密度捕获阵列中所采用的5’至3’方向的捕获探针的构成。
图23所示为高密度阵列的框架，用于组织样本的定向，通过荧光标记探针的杂交可视化。
图24所示为高密度阵列上已剪切和未剪切的捕获探针，其中框架探针由于不含尿嘧啶碱基而未被剪切。捕获探针以与poly-A寡核苷酸链接的荧光素加以标记。
图25所示为以从小鼠嗅球捕获的转录体所制备的文库的生物分析仪制图。
图26所示为从小鼠嗅球所提取的总RNA中所捕获的转录体的Matlab可视化。
图27所示为采用Matlab可视化程序对从小鼠嗅球组织捕获的Olfr(嗅觉受体)转录体的全捕获阵列可视化。
图28所示为自制41-ID-标记微阵列的喷点格局。
图29所示为捕获具有poly-A尾的基因组片段再进行A431特异性易位后制得的空间基因组文库。
图30所示为在捕获阵列上，在10％和50％上具有峰值的含poly-A尾的基因组片段被捕获后，经过A431特异性易位成为含poly-A尾的U2OS基因组片段的检测结果。
图31所示为将在41-ID标记的自制阵列上从小鼠嗅球组织所捕获的含ID标记的转录体，经Matlab可视化后，与组织图像的重叠。为清晰起见，对辨识出特定基因的特定特征加以了圈定。
具体实施方式
实施例1
阵列的制备
以下实验展示了如何将寡核苷酸探针通过其5'或3'端附着于阵列基板上，来得到含有能与mRNA杂交的捕获探针的阵列。
制备含5'至3'端方向的探针的自制喷点微阵列
在玻璃载片上点样20个各有标记序列的RNA捕获寡核苷酸(标记1-20，表1)作为捕获探针。所述探针以一个5’-端氨基连接子和一个C6间隔子合成。所有的探针均由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合成。RNA捕获探针以150mM的磷酸钠制成浓度为20μM、pH为8.5的悬液，并以Nanoplotter NP2.1/E喷点系统(Gesim,Grosserkmannsdorf,Germany)在CodeLinkTMActivated微阵列载片(7.5cm x 2.5cm；Surmodics,Eden Prairie,MN,USA)上点样。喷点完成后，按照厂家说明书进行表面封闭。所述探针在载片上喷为16个等同阵列，且每个阵列含有一种预设的喷点格局。杂交反应中，所述16个子阵以16格遮光框(ChipClipTMSchleicher&Schuell BioScience,Keene,NH,USA)进行分隔。
 
Figure BDA0004017774520000451
Figure BDA0004017774520000461
制备含3'至5'端方向的探针的自制喷点微阵列及合成5'至3'端方向的探针
表面探针寡核苷酸的喷点方法与上文的5'至3'端方向探针的情形相同，且其3’端有一个氨基-C7连接子，如表1所示。
为杂交制取用于捕获探针合成的引物，将含有0.1％ SDS的4xSSC、2μM延长引物(通用域寡核苷酸)和2μM连接引物(捕获域寡核苷酸)的杂交溶液在50℃下培养4分钟。同时，将自制阵列附着于ChipClip片基夹(Whatman)上。然后，向阵列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃和300rpm下培养30分钟。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上拿下来，按照以下3个步骤洗涤：1)50℃下，以含0.1％ SDS的2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤6分钟；2)以0.2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)以0.1xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将所述阵列甩干，并放回ChipClip片基夹。
为进行延长和连接反应(以生成所述捕获探针的定位域)，向每孔加入50μL含有10xAmpligase缓冲液、2.5U扩增型耐热DNA聚合酶Stoffel片段(AmpliTaq DNA PolymeraseStoffel Fragment)(Applied Biosystems)、10U Ampligase(EpicentreBiotechnologies)、dNTPs(Fermentas)各2mM和水的酶混合物。然后，将该阵列在55℃下培养30分钟。培养完成后，按照前述阵列洗涤方法对阵列进行洗涤，但步骤1)的持续时间从6分钟改变为10分钟。
所述方法如图3所示。
组织的制备
以下实验展示了如何制备用于本发明方法的组织样本切片。
制备新鲜冷冻组织并切片置于捕获探针阵列上
取新鲜未固定的小鼠脑组织，根据需要切边，以-40℃异戊烷降温冷冻，然后在低温箱中切成10μm薄片。在每个待用捕获指针阵列上放置一片组织切片。
制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织
取小鼠脑组织，以4％福尔马林在4℃下固定24小时，然后按照如下步骤进行培养：70％乙醇中培养1小时3次；80％乙醇中培养1小时1次；96％乙醇中培养1小时1次；100％乙醇中培养1小时3次；以及二甲苯中室温培养1小时2次。
然后，将脱水样本在低熔点液态石蜡中以52-54℃培养至多3小时，其间更换一次石蜡以洗除残余二甲苯。将完成的组织块在室温下保藏。然后，用超薄切片机在石蜡中将组织切成4μm薄片，置于每个待用的捕获探针阵列上。
所述切片在阵列载片上以37℃干燥24小时，并在室温下保藏。
FFPE组织的脱蜡
附着于CodeLink载片上的福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑组织10μm切片在二甲苯中脱蜡2次，各10分钟；99.5％乙醇中2分钟；96％乙醇中2分钟；70％乙醇中2分钟；然后风干。
cDNA合成
以下实验展示了将捕获在阵列上的组织样本切片mRNA用作cDNA合成模版。
芯片上的cDNA合成
将购自Whatman的16孔遮光框和ChipClip片基夹与CodeLink载片连接。cDNA的合成采用了购自Invitrogen的带含
Figure BDA0004017774520000481
耐热性DNA聚合酶的SuperScriptTMII一步RT-PCR体系(SuperScriptTMIII One-step RT-PCR System with
Figure BDA0004017774520000482
Taq DNAPolymerase)。每次反应中，将25μl 2x反应混合物(即含
Figure BDA0004017774520000483
耐热性DNA聚合酶的SuperScriptTMII一步RT-PCR体系)、22.5μl水和0.5μl 100xBSA混合并加热至50℃。每次反应向反应混合物中加入2μl SuperScript III/Platinum Taq酶混合物，且向芯片上每孔加入50μl反应混合物。在50℃下培养芯片30分钟(Thermomixer Comfort,Eppendorf)。
移除孔中的反应混合物，以如下试剂洗涤载片：2xSSC,0.1％ SDS：50℃下10分钟；0.2xSSC：室温下1分钟；以及0.1xSSC：室温下1分钟。然后将芯片甩干。
对于FFPE组织切片，可在移除组织前对切片进行染色及可视化，见下文关于可视化的部分。
可视化
染色前的荧光标记探针杂交
在放置组织切片前，将荧光标记探针与含有喷至捕获探针阵列上的标记寡核苷酸的特征相杂交。组织可视化后，所述荧光标记探针有助于所得图像的定向，允许所得图像与测序所得的各个捕获探针“标记”(定位域)序列表达谱的合并。为完成荧光探针的杂交，取含0.1％ SDS的4xSSC和2μM检测探针(P)的杂交溶液，在50℃下培养4分钟。同时，将自制序列附着于ChipClip片基夹(Whatman)。然后，向序列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃和300rpm摇速下培养30分钟。
培养完成后，从ChipClip片基夹上取下序列，按照下列步骤洗涤：1)2xSSC,0.1％SDS：50℃和300rpm摇速下6分钟；2)0.2xSSC：300rpm摇速下1分钟；以及3)0.1xSSC：300rpm摇速下1分钟。然后，将序列甩干。
cDNA合成前或合成后对FFPE组织切片的整体组织学染色
对固定在捕获探针序列上的FFPE组织切片，在脱蜡之后、cDNA合成之前，如前述步骤进行洗涤和补水，或在cDNA合成之后，如前述步骤进行洗涤。然后，按如下步骤处理组织切片：在苏木精中培养3分钟；以去离子水淋洗；在自来水中培养5分钟；快速地浸入酸化乙醇中8-12次；以自来水洗涤2次各1分钟；以去离子水洗涤2分钟；在曙红中培养30秒；在95％乙醇中洗涤3次各5分钟；以100％乙醇洗涤3次各5分钟；以二甲苯冲洗3次各10分钟(可过夜)；将盖片覆盖于载片上，以DPX封片；令载片在通风橱中干燥过夜。
cDNA合成前或合成后对FFPE组织切片的目标蛋白的整体免疫组织化学染色
对固定在捕获探针序列上的FFPE组织切片，在脱蜡之后、cDNA合成之前，如前述步骤进行洗涤和补水，或在cDNA合成之后，如前述步骤进行洗涤。然后，按如下步骤处理组织切片，且在整个染色过程中保持切片湿润：以一级抗体(以含1x三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(Tris buffered saline)(50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.6)、4％驴血清和0.1％triton-x的封闭液稀释一级抗体)在湿室中对切片进行室温过夜培养；以1xTBS淋洗3次；以接合荧光素(FITC、Cy3或Cy5)的配对二级抗体在湿室中对切片进行室温培养1小时。以1xTBS淋洗3次，尽可能地除去TBS后，以ProLong Gold+DAPI(苯基吲哚)试剂(Invitrogen)封藏切片，然后以荧光显微镜和匹配滤光片组加以分析。
去除残余组织
冷冻组织
对于新鲜冷冻的小鼠脑组织，cDNA合成后的洗涤步骤足以完全去除组织。
FFPE组织
取附有福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑组织切片的载片，装上ChipClip片基夹及16孔遮光框(Whatman)。取RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)的蛋白酶K消化缓冲液(ProteinaseK Digest Buffer)，每150μl加入10μl蛋白酶K溶液(Proteinase K Solution)(Qiagen)。向每孔加入50μl最终混合物，并在56℃下培养载片30分钟。
捕获探针(cDNA)的释放
以能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕获探针(共价附着的探针)
将16孔遮光框和CodeLink载片装上ChipClip片基夹(Whatman)。取50μl含有含1.8mM MgCl2的1x快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High Fidelity ReactionBuffer with 1.8 mM MgCl2)(Roche)、200μM dNTPs(New England Biolabs)和0.1U/1μlUSER Enzyme(New England Biolabs)的混合物，加热至37℃后，加入每孔中，并在37℃下进行30分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixer comfort；Eppendorf)。然后，用移液枪从孔中回收含有已释放的cDNA和探针的反应混合物。
以能切除尿嘧啶的USER酶混合物的TdT(末端转移酶)缓冲液释放捕获探针(共价 附着的探针)
取50μl含有1x TdT缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH7.9)、50mM乙酸钾和10mM乙酸镁)(New England Biolabs,www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)和0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)的混合物，加热至37℃，加入每孔中，并在37℃下进行30分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixer comfort；Eppendorf)。然后，用移液枪从孔中回收含有已释放的cDNA和探针的反应混合物。
以烫水释放捕获探针(共价附着的探针)
将16孔遮光框和CodeLink载片装上ChipClip片基夹(Whatman)。用移液枪向每孔注入50μl99℃热水，并反应30分钟。然后，用移液枪从孔中回收含有释放的cDNA和探针的反应混合物。
以加热的PCR缓冲液释放捕获探针(原位杂交的合成捕获探针，即与表面探针杂交 的捕获探针)
取50μl含有1x TdT缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH7.9)、50mM乙酸钾和10mM乙酸镁)(New England Biolabs,www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)和0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)的混合物，预热至95℃后加入每孔中，并在95℃下进行5分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixercomfort；Eppendorf)。然后，从孔中回收含有释放的探针的反应混合物。
以加热的TdT(末端转移酶)缓冲液释放捕获探针(原位杂交的合成捕获探针，即与 表面探针杂交的捕获探针)
取50μl含有1xTdT缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH7.9)、50mM乙酸钾和10mM乙酸镁)(New England Biolabs,www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)和0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)的混合物，预热至95℃后加入每孔中，并在95℃下进行5分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixercomfort；Eppendorf)。然后，从孔中回收含有释放的探针的反应混合物。
用USER酶和加热到99℃的热水处理序列的效率如图4所示。用USER酶和Rsal酶在前述自制序列上实施酶切(图4)。用热水在Agilent制造的商品序列上实施DNA表面探针的释放(见图5)。
探针的收集和连接子的引入
下列实验显示，可以对从阵列表面释放的cDNA第一链进行修饰，来生产双链DNA并进行扩增。
以Picoplex全基因组扩增试剂盒来进行全转录组扩增(含定位域(标记)序列的捕 获探针序列未保留在所得dsDNA末端)
以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液(对共价附着的探针)或加热的PCR缓冲液(对原位杂交的合成捕获探针，即与表面探针杂交的捕获探针)来释放捕获探针.
按照厂家说明，以Picoplex(Rubicon Genomics)随机引物全基因组扩增方法对释放的cDNA进行扩增。
以末端转移酶(TdT)dA加尾来进行全转录组扩增(含定位域(标记)序列的捕获探 针序列保留在所得dsDNA末端)
以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的TdT(末端转移酶)缓冲液(对共价附着的探针)或加热的PCR缓冲液(对原位杂交的合成捕获探针，即与表面探针杂交的捕获探针)来释放捕获探针。
取38μl剪切混合物，放入干净的0.2mlPCR管中。所述混合物含有：1xTdT缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH 7.9)、50mM乙酸钾和10mM乙酸镁)(NewEngland Biolabs，www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)、0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)(不可用于加热释放)；已释放的cDNA(从表面探针伸出)和已释放的表面探针。向PCR管中加入0.5μl RNase H(5U/μl，终浓度为0.06U/μl)、1μl TdT(20U/μl，终浓度为0.5U/μl)和0.5μl dATPs(100mM，终浓度为1.25mM)。为进行dA加尾，在热循环仪(Applied Biosystems)中以37℃培养PCR管15分钟，再以70℃培养10分钟以令TdT失活。dA加尾完成后，制备PCR预混液。所述预混液含有：含1.8mM MgCl2的1x快速启动高保真PCR缓冲液(Faststart HiFi PCR Buffer)(Roche)、每种dNTP各0.2mM(Fermentas)、A(与捕获探针的扩增域互补)和B_(dT)24(Eurofins MWG Operon)(与待连接至cDNA第一链3’端的poly-A尾互补)每种引物各0.2μM和0.1U/μl快速启动高保真DNA聚合酶(Faststart HiFiDNA polymerase)(Roche)。取23μl PCR预混液，放入9只干净的0.2ml PCR管中，向其中8只管中加入2μl dA加尾混合物，而向最后1只管中加入2μl水(不含RNase/DNase)(阴性对照)。按照以下程序实施PCR扩增：95℃热启动2分钟，50℃2分钟和72℃3分钟的第二链合成，30个PCR扩增循环，每个循环中依序为95℃30秒，65℃1分钟，72℃3分钟，以及最后延长72℃10分钟。
反应后的清理和分析
将4种扩增子合并，并流经Qiaquick PCR净化柱(Qiagen)处理，以30μl EB(10mMTris-Cl,pH 8.5)洗脱。以生物分析仪(Agilent)对产物进行分析，按照厂家说明书使用DNA1000试剂盒。
测序
Illumina测序
按照厂家说明书，用样品索引建立用于Illumina测序的dsDNA文库。用HiSeq2000平台(Illumina)进行测序。
生物信息学研究
从以dA加尾末端转移酶方法扩增的全转录组文库的测序数据中获取数码转录组 信息
以FastX工具盒中的FASTQ识别码分离工具，将测序数据按各自的捕获探针定位域(标记)序列分类整理为各个文件。然后，以Tophat映射工具将各个被标记的测序数据映射到小鼠基因组上加以分析。以HTseq-count软件处理获取所得SAM文件中转录体计数。
从以Picoplex全基因组扩增试剂盒方法扩增的全转录组文库的测序数据中获取 数码转录组信息用FastX工具盒中的FASTQ-to-FASTA转换工具，将测序数据从FASTQ格式转换为FASTA格式。用Blastn工具将测序Read与捕获探针的定位域(标记)序列对齐，并将每个标记序列中匹配率优于1e-6的Read挑选出来，分别归入各序列标记的单独文件中。然后，用Blastn工具将标记序列Read文件与小鼠转录组对齐，获取匹配记录。
合并可视化数据和表达谱
利用染色，将各个捕获探针定位域(标记)序列的表达谱与从组织切片获得的空间信息组合起来。如此一来，即可用直接对比的方式来分析从组织切片的细胞区室中获得的转录组信息，还能在预定的结构环境中分辨不同细胞亚型的区别表达特征。
实施例2
图8至图12展示了置于以识别码标示的转录组捕获阵列上的染色FFPE小鼠脑组织(嗅球)切片的成功可视化，操作参照实施例中所述的通用流程。与实施例1中的新鲜冷冻组织的实验相比，图8所示的FFPE组织形态更佳。图9和图10展示了如何将组织定位于不同探针密度类型的阵列上。
实施例3
以随机引物第二链合成和通用端扩增反应进行全转录组扩增(含标记序列的捕获 探针序列保留在所得dsDNA的末端)
在以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕获探针之后(共价附着的探针)
或
在以加热的PCR缓冲液释放捕获探针之后(原位杂交的合成捕获探针)
向2只管中各加入40μl 1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真PCR缓冲液(Faststart HiFi PCR Buffer with 1.8mM MgCl2)(pH 8.3)(Roche，www.roche-applied-science.com)、dNTP各0.2mM(Fermentas，www.fermentas.com)、0.1μg/μl BSA(NewEngland Biolabs，www.neb.com)、0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)、已释放的cDNA(从表面探针延长)和已释放的表面探针，再加入1μl RNaseH(5U/μl)。然后，将2只管在热循环仪(Applied Biosystems，www.appliedbiosystems.com)中以37℃培养30分钟，再以70℃处理20分钟。向2只管中加入1μl克列诺片段(Klenow Fragment)(3’to 5’exo minus)(Illumina,www.illumina.com)和1μl连接通用端的随机引物(10μM)(Eurofins MWGOperon,www.eurofinsdna.com)(其中一只加入B_R8(八聚体)，另一只加入B_R6(六聚体))，终浓度为0.23μM。将2只管在热循环仪(Applied Biosystems)中依次以15℃培养15分钟，25℃培养15分钟，37℃培养15分钟，最后以75℃培养20分钟。培养完成后，向两管中各加入引物A_P和B(10μM)各1μl(Eurofins MWG Operon)，终浓度各为0.22μM；再向管中各加入1μl快速启动高保真DNA聚合酶(Faststart HiFi DNA polymerase)(5U/μl)(Roche)，终浓度为0.11U/μl。按照下列程序在热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR扩增：94℃热启动2min后，进行50个如下循环：94℃ 15秒，55℃ 30秒，68℃1分钟，以及最终延长68℃ 5分钟。扩增完成后，从每管中各取40μl，以Qiaquick PCR净化柱(Qiagen，www.qiagen.com)纯化，并以30μl EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)洗脱。用生物分析仪(Agilent，www.home.agilent.com)和DNA 7500试剂盒分析纯化产物。所得结果如图13和图14所示。
本实施例展示了以随机六聚体和随机八聚体的第二链合成及其后的扩增反应来生成大群已释放的cDNA分子的方法。
实施例4
cDNA合成和探针的收集后对ID-特异性及基因特异性产物的扩增
在以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液对捕捉探针(共价附着的探针)进行释放后：
对剪切后的cDNA进行扩增，反应混合液最终容量为10μl。7μl切除后的模版、1μlID-特异性正向引物(2μM)、1μl基因特异性反向引物(2μM)和1μl含有快速启动高保真混合酶(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)的1.4x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High Fidelity Reaction Buffer with 1.8mM MgCl2)的混合液，共计10μl，并与1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High FidelityReaction Buffer with 1.8mM MgCl2)和1U快速启动高保真混合酶(FastStart HighFidelity Enzyme Blend)进行终反应.PCR扩增反应在热循环仪(Applied Biosystems)中按照如下程序进行：94℃热启动2分钟，然后进行50个如下循环：94℃下15秒，55℃下30秒，68℃下1分钟，以及最终延长68℃下5分钟。
引物序列，所得产物约为250bp
Beta-2w微球蛋白(B2M)引物
5’-TGGGGGTGAGAATTGCTAAG-3’(SEQ ID NO:43)
ID-1引物
5'-CCTTCTCCTTCTCCTTCACC-3'(SEQ ID NO:44)
ID-5引物
5'-GTCCTCTATTCCGTCACCAT-3'(SEQ ID NO:45)
ID-20引物
5'-CTGCTTCTTCCTGGAACTCA-3'(SEQ ID NO:46)
所得结果如图15所示，显示了用两种不同ID引物(即：对定位于微阵列上不同位置的ID标记具有特异性)和源于脑组织且通用于所有探针的同一基因特异性引物，对ID特异性和基因特异性产物的成功扩增。相应地，本实验证明，可以用ID标记特异性或目标核酸特异性的扩增反应对产物加以鉴定，且进一步证明，不同ID标记可以被区分开来。第二次实验中，仅以组织覆盖阵列中一半的ID探针(即捕获探针)，则从得到组织覆盖的微点上得到了阳性结果。
实施例5
空间基因组学研究
背景：本方法的目的在于从保有空间信息的组织样本中捕获DNA分子，以便能够确定特定的DNA片段起源于组织的哪个部分。
方法：本方法的原理在于利用固定了带空间标记标签序列(定位域)的DNA寡核苷酸(捕获探针)的微阵列。所述微阵列的寡核苷酸的每一特征都载有1)独一无二的标记标签(定位域)以及2)捕获序列(捕获域)。追踪某一标记标签在阵列表面上的地域位置，便可能从每个标记标签上提取二维定位信息。可以通过例如添加FFPE处理组织的薄切片，来向微阵列添加基因组DNA片段。该组织切片中的基因组DNA已通过固定处理而预先片段化。
组织薄片放上阵列后，利用末端转移酶进行通用加尾反应。该加尾反应为组织中的基因组DNA片段的伸出3’端加上polydA尾。利用末端转移酶进行加尾反应，形成杂交且3’端封闭的polydA探针，从而对表面寡核苷酸实施了封闭。
末端转移酶加尾反应后，基因组DNA片段便能通过polydA尾与表面寡核苷酸的polydT捕获序列的接触，从而与附近带有空间标记的寡核苷酸杂交。杂交反应完成后，Klenow exo-等链置换聚合酶能利用表面寡核苷酸作为引物，制造一条与所述杂交基因组DNA片段互补的DNA新链。此时，该DNA新链亦带有表面寡核苷酸标记标签所含的定位信息。
作为最后一步，以酶促、变性或物理方法将新合成且带标记的DNA链从表面切下，收集起来，并通过引入通用端、特定扩增子的扩增反应、和/或测序，来对整个链集进行下游扩增。
图16是该过程的原理示意图。
材料和方法
以5’到3’方向的探针制备自制喷点微阵列
将20个各带标签序列的DNA捕获寡核苷酸(表1)点样到载玻片上，充当捕获探针。所述探针是以5’-端氨基连接子和C6间隔子合成所得。所有的探针均由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合成。将浓度为20μM的DNA捕获探针以150mM磷酸钠制成pH8.5的悬浮液，并用Nanoplotter NP2.1/E喷点系统(Gesim,Grosserkmannsdorf,Germany)点样在CodeLinkTM活化微阵列载片(7.5cm x 2.5cm；Surmodics,Eden Prairie,MN,USA)上。喷点完成后，按照厂商说明实施表面封闭。探针在载片上喷点为16个相同的阵列，每个阵列都含有预设的喷点格局。所述16个子阵列在杂交反应时，以16版遮光框(ChipClipTMSchleicher&Schuell BioScience,Keene,NH,USA)分隔。
以3’到5’方向的探针制备自制喷点微阵列并合成5’到3’方向的捕获探针
寡核苷酸的喷点操作与上文所述5’到3’方向的探针的操作方法相同。
为杂交制取用于捕获探针合成的引物，将含有带0.1％ SDS的4xSSC、2μM延长引物(A_primer)和2μM连接引物(p_poly_dT)的杂交溶液在50℃下培养4分钟。与此同时，将自制阵列附着于ChipClip片基夹(Whatman)上。然后，在所述阵列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃及300rpm摇速下培养30分钟。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上取下，并按照下列3个步骤洗涤：1)带0.1％ SDS的2xSSC溶液，50℃、300rpm摇速下洗涤6分钟；2)0.2xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)0.1xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将阵列甩干，放回ChipClip片基夹。
为进行延长和连接反应，向每孔加入50μL含有10xAmpligase缓冲液、2.5U扩增型耐热DNA聚合酶Stoffel片段(AmpliTaq DNA Polymerase Stoffel Fragment)(AppliedBiosystems)、10U Ampligase(Epicentre Biotechnologies)、dNTPs各2mM(Fermentas)和水的酶混合物。然后，将阵列在55℃下培养30分钟，随后按前述阵列洗涤方法进行洗涤，但第一步中的持续时间由6分钟改为10分钟。
对polydA探针进行杂交以保护表面寡核苷酸不受dA尾影响
为保护表面寡核苷酸捕获序列，需要杂交形成3’-生物素封闭的polydA探针，将含有含0.1％SDS的4xSSC和2μM 3’bio-polydA的杂交溶液在50℃下培养4分钟。与此同时，将自制阵列附着于ChipClip片基夹(Whatman)上。然后，在所述阵列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃及300rpm摇速下培养30分钟。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上取下，并按照下列3个步骤洗涤：1)带0.1％ SDS的2xSSC溶液，50℃、300rpm摇速下洗涤6分钟；2)0.2xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)0.1xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将阵列甩干，放回ChipClip片基夹。
制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织
以4％福尔马林在4℃下对小鼠脑组织进行24小时固定。然后，按照如下步骤对其进行培养：70％乙醇培养1小时3次，80％乙醇培养1小时1次，96％乙醇培养1小时1次，100％乙醇1培养1小时1次，二甲苯室温下培养1小时2次。
然后，将脱水样本在液态低熔点石蜡中以52-54℃培养至多3小时，期间置换石蜡一次，以洗除残余二甲苯。完成后的组织块在室温下保藏，使用时，以超薄切片机切成4μm切片，置于每个待用的捕获探针序列上。
切片在阵列载片上37℃干燥24小时，室温保藏。
FFPE组织的脱蜡
附着于CodeLink载片上的福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑组织10μm切片在二甲苯中脱蜡2次，各10分钟；99.5％乙醇中2分钟；96％乙醇中2分钟；70％乙醇中2分钟；然后空气中干燥。
基因组DNA的通用加尾反应
为实施dA加尾，制备50μl含有1x TdT缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH 7.9)，50mM乙酸钾和10mM乙酸镁)(New England Biolabs,www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)、1μl TdT(20U/μl)和0.5μl dATPs(100mM)的反应混合物。将所述混合物加至阵列表面，并在热循环仪(Apllied Biosystems)中以37℃培养15分钟，再以70℃培养10分钟以令TdT失活。然后，将温度再次降至50℃，以允许带dA尾的基因组片段与表面寡核苷酸捕获序列相杂交。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上取下，并按照下列3个步骤洗涤：1)带0.1％ SDS的2xSSC溶液，50℃、300rpm摇速下洗涤6分钟；2)0.2xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)0.1xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将阵列甩干。
标记DNA的延长
取50μl含有1x克列诺缓冲液(Klenow buffer)、200μM dNTPs(New EnglandBiolabs)和1μl克列诺片段(Klenow Fragment)(3’to 5’exo minus)的混合物的反应混合物，加热至37℃，加入每孔中，并在37℃下进行30分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixer comfort；Eppendorf)。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上取下，并按照下列3个步骤洗涤：1)带0.1％ SDS的2xSSC溶液，50℃、300rpm摇速下洗涤6分钟；2)0.2xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)0.1xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将阵列甩干。
去除残余组织
取附有福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑组织切片的载片，装上ChipClip片基夹及16孔遮光框(Whatman)。对每150μl RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)的蛋白酶K消化缓冲液(Proteinase K Digest Buffer)，加入10μl蛋白酶K溶液(Proteinase K Solution)(Qiagen)。向每孔加入50μl最终混合物，并在56℃下培养载片30分钟。
以能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕获探针(共价附着的探针)
将16孔遮光框和CodeLink载片装上ChipClip片基夹(Whatman)。取50μl含有：含1.8mM MgCl2的1x快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High Fidelity ReactionBuffer with 1.8mM MgCl2)(Roche)、200μM dNTPs(New England Biolabs)和0.1U/1μlUSER酶(New England Biolabs)的混合物，加热至37℃后，加入每孔中，并在37℃下进行30分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixer comfort；Eppendorf)。然后，用移液枪从孔中回收含有释放的cDNA和探针的反应混合物。
已标记DNA的合成及探针收集后对ID-特异性及基因特异性产物的扩增
在以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕捉探针(共价附着的探针)后：
对已剪切的cDNA进行扩增，最终反应容量为10μl。7μl已剪切的模版，1μl ID特异性正向引物(2μM)，1μl基因特异性反向引物(2μM)和1μl快速启动高保真混合酶(FastStartHigh Fidelity Enzyme Blend)和1.4x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High Fidelity Reaction Buffer with 1.8mM MgCl2)的混合液，共计10μl，并与1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart High FidelityReaction Buffer with 1.8mM MgCl2)和1U快速启动高保真混合酶(FastStart HighFidelity Enzyme Blend)进行终反应.
PCR扩增反应在热循环仪(Applied Biosystems)中按照如下程序进行：94℃热启动2分钟，然后进行50次如下循环：94℃下15秒，55℃下30秒，68℃下1分钟，以及最终延长68℃下5分钟。
以随机引物第二链合成和通用端扩增反应进行全基因组扩增(含标记序列的捕获 探针序列保留在所得dsDNA的末端)
在以含能剪切尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕获探针之后(共价附着的探针)
含有40μl 1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真PCR缓冲液(Faststart HiFi PCRBuffer)(pH8.3)(Roche，www.roche-applied-science.com)、dNTP各0.2mM(Fermentas，www.fermentas.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs，www.neb.com)、0.1U/μl USER酶(New England Biolabs)、已释放的DNA(从表面探针上延伸)和已释放的表面探针的反应混合物。然后，将PCR管在热循环仪(Applied Biosystems，www.appliedbiosystems.com)中以37℃培养30分钟，再以70℃处理20分钟。向管中加入1μl克列诺片段(Klenow Fragment)(3’to 5’exo minus)(Illumina,www.illumina.com)和1μl连接通用端的随机引物(10μM)(Eurofins MWG Operon,www.eurofinsdna.com)。然后，将PCR管在热循环仪(AppliedBiosystems，www.appliedbiosystems.com)中以15℃培养15分钟，以25℃培养15分钟，,37℃培养15分钟，最后以75℃培养20分钟。培养完成后，向管中加入A_P and B(10μM)引物各1μl(Eurofins MWG Operon)及1μl快速启动高保真DNA聚合酶(Faststart HiFiDNApolymerase)(5U/μl)(Roche)。按照下列程序在热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR扩增：94℃热启动2min后，进行50个循环，所述循环为：94℃ 15秒，55℃ 30秒，68℃ 1分钟，以及最终延长68℃ 5分钟。扩增完成后，从每管中各取40μl，以Qiaquick PCR净化柱(Qiagen，www.qiagen.com)纯化，并以30μl EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)洗脱。用生物分析仪(Agilent，www.home.agilent.com)和DNA 7500试剂盒分析纯化产物。
可视化
染色前的荧光标记探针杂交
在放置组织切片前，将荧光标记探针与含有喷至捕获探针阵列上的指定标记序列相杂交。组织可视化后，所述荧光标记探针有助于为所得图像定向，允许所得图像与测序后所得的各个捕获探针标记序列的序列表达谱合并。为完成荧光探针的杂交，取含0.1％ SDS的4xSSC和2μM检测探针(P)的杂交溶液，在50℃下培养4分钟。同时，将自制序列附着于ChipClip片基夹(Whatman)。然后，向序列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃和300rpm摇速下培养30分钟。
培养完成后，从ChipClip片基夹上取下序列，按照下列步骤洗涤：1)2xSSC,0.1％SDS：50℃和300rpm摇速下6分钟；2)0.2xSSC：300rpm摇速下1分钟；以及3)0.1xSSC：300rpm摇速下1分钟。然后，将序列甩干。
标记DNA合成前或合成后对FFPE组织切片的整体组织学染色
对固定在捕获探针序列上的FFPE组织切片，在脱蜡之后、标记DNA合成之前，如前述步骤进行洗涤和补水，或在标记DNA合成之后，如前述步骤进行洗涤。然后，按如下步骤处理组织切片：在苏木精中培养3分钟；以去离子水淋洗；在自来水中培养5分钟；快速地浸入酸化乙醇中8-12次；以自来水洗涤2次各1分钟；以去离子水洗涤2分钟；在曙红中培养30秒；在95％乙醇中洗涤3次各5分钟；以100％乙醇洗涤3次各5分钟；以二甲苯冲洗3次各10分钟(可过夜)；将盖片覆盖于载片上，以DPX封片；令载片在通风橱中干燥过夜。
标记DNA合成前或合成后对FFPE组织切片的目标蛋白的整体免疫组织化学染色
对固定在捕获探针序列上的FFPE组织切片，在脱蜡之后、标记DNA合成之前，如前述步骤进行洗涤和补水，或在DNA合成之后，如前述步骤进行洗涤。然后，按如下步骤处理组织切片，且在整个染色过程中保持切片湿润：以封闭液(含1x三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(Tris buffered saline)(50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.6)、4％驴血清和0.1％triton-x)稀释一级抗体，并以一级抗体在湿室中对切片进行室温过夜培养；以1xTBS淋洗3次；以接合荧光素(FITC、Cy3或Cy5)的配对二级抗体在湿室中对切片进行室温培养1小时。以1xTBS淋洗3次，尽可能地除去TBS后，以ProLong Gold+DAPI(苯基吲哚)试剂(Invitrogen)封藏切片，然后以荧光显微镜和匹配滤光片组加以分析。
实施例6
本实验按照实施例5的原理进行，但在阵列上使用了基因组DNA片段而非组织。所述基因组DNA分别预先片段化至200bp和700bp的平均大小。本实验表明，所述原理能够实现。片段化的基因组DNA与FFPE组织非常相似。
标记DNA合成及探针收集后对内部基因特异性产物的扩增
以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕捉探针(共价附着的探针)，所述缓冲液含有1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart HighFidelity Reaction Buffer with 1.8mM MgCl2)(Roche)、200μM dNTPs(New EnglandBiolabs)和0.1U/1μl USER Enzyme(New England Biolabs)。
对经过剪切的DNA进行扩增，最终反应容量为50μl。向47μl经剪切的模版中加入1μl ID-特异性正向引物(10μM)，1μl基因特异性反向引物(10μM)和1μl快速启动高保真酶混合物(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)。PCR扩增反应在热循环仪(AppliedBiosystems)中按照如下程序进行：94℃热启动2分钟，然后进行50个循环，所述循环包括：94℃下15秒，55℃下30秒，68℃下1分钟，以及最终延长68℃下5分钟。
标记DNA合成及探针收集后对标记特异性及基因特异性产物的扩增
以含能切除尿嘧啶的USER酶混合物的PCR缓冲液释放捕捉探针(共价附着的探针)，所述缓冲液含有1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart HighFidelity Reaction Buffer with 1.8mM MgCl2)(Roche)、200μM dNTPs(New EnglandBiolabs)和0.1U/1μl USER Enzyme(New England Biolabs)，然后：
对经过剪切的DNA进行扩增，最终反应容量为50μl。向47μl经剪切的模版中加入1μl标记特异性正向引物(10μM)，1μl基因特异性反向引物(10μM)和1μl快速启动高保真酶混合物(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)。PCR扩增反应在热循环仪(AppliedBiosystems)中按照如下程序进行：94℃热启动2分钟，然后进行50个循环，所述循环包括：94℃下15秒，55℃下30秒，68℃下1分钟，以及最终延长68℃下5分钟。
正向-人类基因组DNA引物
5’-GACTGCTCTTTTCACCCATC-3’(SEQ ID NO:47)
反向-人类基因组DNA引物
5’-GGAGCTGCTGGTGCAGGG-3’(SEQ ID NO:48)
P-标记特异引物
5’-ATCTCGACTGCCACTCTGAA-3’(SEQ ID NO:49)
实验结果如图17和图20所示。图中显示了阵列上扩增的内部产物——图17和图18中测得的峰值大小符合期望值。因此，这表明基因组DNA可以被捕获和扩增。在图19和图20中，鉴于基因组DNA的随机片段化和末端转移酶会产生多样性极高的样本池，因此，标记期望产物具有拖尾。
实施例7
利用聚合酶延长反应和末端转移酶加尾反应对5’至3’方向的捕获探针进行别种 合成
为杂交制备用于捕获探针合成中的引物，将含有4xSSC和0.1％ SDS和2μM延长引物(A_primer)的杂交溶液在50℃下培养4分钟。同时，将自制阵列(见实施例1)附着于ChipClip片基夹(Whatman)上。然后，向阵列每孔加入50μL杂交溶液，在50℃和300rpm下培养30分钟。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上取下，按照以下3个步骤洗涤：1)50℃下，以含0.1％SDS的2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤6分钟；2)以0.2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)以0.1xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将所述阵列甩干，并放回ChipClip片基夹。
取1μl克列诺片段(Klenow Fragment)(3’to 5’exo minus)(Illumina,www.illumina.com)和10x克列诺缓冲液(Klenow buffer)、dNTPs各2mM(Fermentas)和水，混合成50μl反应物，用移液枪注入各孔。
在Eppendorf Thermomixer热循环仪中培养阵列：15℃15分钟，25℃15分钟，37℃15分钟，最后是75℃20分钟。
培养完成后，将阵列从ChipClip片基夹上拿下来，按照以下3个步骤洗涤：1)50℃下，以含0.1％ SDS的2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤6分钟；2)以0.2xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟；以及3)以0.1xSSC溶液在300rpm摇速下洗涤1分钟。然后，将所述阵列甩干，并放回ChipClip片基夹。
为进行dT加尾，制备50μl反应混合物，含1x TdT buffer(20mM三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)(pH 7.9)、50mM乙酸钙和10mM醋酸镁)(New England Biolabs,www.neb.com)、0.1μg/μl BSA(New England Biolabs)、0.5μl RNase H(5U/μl)、1μl TdT(20U/μl)和0.5μl dTTPs(100mM)。将混合物添加至阵列表面，并将阵列在热循环仪(Applied Biosystems)中以37℃培养15分钟，再以70℃培养10分钟以令TdT失活。
实施例8
利用5’至3’高探针密度阵列和福尔马林固定冷冻(FF-frozen)的组织、USER体系 剪切和末端转移酶催化的扩增反应进行空间转录组学研究
制备阵列
从Roche-Nimblegen(Madison,WI,USA)订购预制高密度微阵列芯片。每个捕获探针阵列含有135,000个特征，其中132,460个特征载有含独有ID-标签序列(定位域)和捕获区域(捕获域)的捕获探针。每个特征大小为13x13μm。每个捕获探针在5’至3’方向上的构成包括含有5个dUTP碱基(剪切域)和常规扩增域的通用域、ID标签(定位域)和捕获区域(捕获域)(图22和表2)。每个阵列还配备了标记探针的框架(图23)，该框架载有30bp通用序列(表2)，以启动荧光探针的杂交，有助于阵列可视化中的定向。
组织制备——福尔马林固定冷冻组织的制备
向动物(小鼠)灌注50ml PBS和100ml 4％福尔马林溶液。切除嗅球后，将其放入4％福尔马林浴，进行24小时后固定。然后，以溶于PBS的30％蔗糖对组织进行24小时的蔗糖处理，以稳定形态及移除多余的福尔马林。以控制速度降温，将组织冷冻至-40℃，并在实验间以-20℃保存。平行标本的制备方法亦同，但后固定时间为3小时，或省略后固定步骤。用2％福尔马林灌注并省略后固定步骤也可以进行成功制作。类似地，还可以省略蔗糖处理步骤。将组织封藏在低温箱中，切成10μm切片。向待用的每个捕获探针序列上放置一片组织切片。可选地，为达到更好的组织粘附，可以将阵列芯片50℃处理15分钟。
可选对照-切片组织的总RNA制备
按照厂商说明用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)提取单个组织切片(10μm)的总RNA。将从组织切片获得的总RNA用于对照试验，同将组织切片上的RNA直接捕获在阵列上的实验相比较。相应地，在向阵列实施总RNA操作的情况下，染色、可视化和组织降解步骤皆省略。
片上反应
标记探针与框架探针的杂交、反转录、核染色、组织消化和探针剪切反应都在16孔硅胶衬垫(ArrayIt,Sunnyvale,CA,USA)上进行，反应容量为每孔50μl。为避免蒸发，以封板(In Vitro AB,Stockholm,Sweden)覆盖杂交盒。
可选-cDNA合成前的组织透化
用Proteinase K(Qiagen,Hilden,Germany)实施透化，用PBS将Proteinase K稀释为1μg/ml。将溶液加入孔中，将载片在室温下培养5分钟，随后在10分钟内将温度逐渐提高到80℃。反转录反应前，以PBS对载片进行简短洗涤。
可选地，组织附着后，可以用微波实施透化，将载片放入装有50ml 0.2xSSC(Sigma-Aldrich)的玻璃罐底，在微波炉中以800W功率加热1分钟。微波处理之后，紧接着将载片放在纸巾上，在隔绝不必要空气接触的容器中干燥30分钟。干燥后，将载片简短浸入水(不含RNase/DNase)中，最后在开始cDNA合成前，以离心机甩干。
cDNA合成
采用SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq(LifeTechnologies/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)实施反转录反应。反转录反应终容量为50μl，含有1x反应混合物、1x BSA (New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)和2μlSuperScript III RT/Platinum Taq mix。该溶液先加热至50℃，再施于组织切片上，以50℃反应30分钟。随后，将反转录溶液从孔中移除，令载片在空气中干燥2小时。
组织可视化
cDNA合成完成后，同时实施核染色及标记探针与框架探针(附着于阵列基板上，用于对阵列上的组织样本进行定向的探针)的杂交。制备含300nM DAPI和170nM标记探针的PBS溶液。将该溶液加入孔中，并将载片在室温下培养5分钟，然后以PBS简短洗涤，并甩干。
可选地，在将组织放在阵列上之前，可令标记探针与框架探针杂交。然后，用杂交缓冲液(4xSSC,0.1％ SDS)将标记探针稀释到170nM。将该溶液加热到50℃，置于芯片上，以50℃和300rpm进行30分钟杂交反应。杂交完成后，洗涤载片：先以2xSSC，0.1％ SDS在50℃和300rpm下对载片洗涤10分钟，然后以0.2xSSC在300rpm下洗涤1分钟，最后以0.1xSSC在300rpm下洗涤1分钟。在此情况下，cDNA合成后的染色溶液仅含有以PBS稀释到300nM的DAPI核染色剂。将溶液加入孔中，将载片在室温下培养5分钟，然后以PBS简短洗涤并甩干。
以Zeiss Axio Imager Z2显微镜对切片进行检查，并以MetaSystems进行处理。
移除组织
为消化组织切片，用RNeasy FFPE试剂盒中的PKD缓冲液将Proteinase K(均来自Qiagen)稀释到1.25μg/μl，然后以该溶液在56℃下培养组织切片30分钟，期间按先300rpm3秒再静止6秒进行间歇混合。然后，洗涤载片：先以2xSSC,0.1％ SDS在50℃和300rpm下洗涤10分钟，然后以0.2xSSC在300rpm下洗涤1分钟，最后以0.1xSSC在300rpm下洗涤1分钟。
释放探针
将带硅胶衬垫的16孔杂交盒(ArrayIt)预热至37oC，并附着于Nimblegen载片上。将50μl含有未知浓度裂解缓冲液(Takara)、0.1U/μl USER酶(NEB)和0.1μg/μl BSA的剪切混合物预热到37oC，并注入含有固定于表面的cDNA的各孔中。除去气泡，将载片封闭，并在Thermomixer舒适型恒温混匀仪中以37℃培养30分钟，期间按先300rpm 3秒再静止6秒进行间歇混合。培养完成后，从每个经反应的孔中收集45μl剪切混合物，置入0.2ml PCR管中(图24)。
准备文库
核酸外切酶处理
令各溶液在冰上冷却2分钟后，加入核酸外切酶I(NEB)，以去除未延长的cDNA探针，反应终容量为46.2μl，终浓度为0.52U/μl。以热循环仪(Applied Biosystems)在37℃下培养PCR管30分钟，接着在80℃处理25分钟，令核酸外切酶失活。
以末端转移酶进行dA-加尾
核酸外切酶处理步骤后，按照厂商说明配制含TdT缓冲液(Takara)、3mM dATP(Takara)和厂商TdT酶混合物(TdT及RNase H)(Takara)的polyA加尾反应混合物，向各样本加入45μl。将所得混合物在热循环仪中以37℃培养15分钟，接着在70℃处理10分钟，令核酸外切酶失活。
第二链的合成及PCR扩增
dA加尾反应后，每个样本取4个新的0.2ml PCR管，加入23μl PCR预混液，并向每管中加入2μl样本作为模版。最终PCR反应液中含有1x Ex Taq缓冲液(Takara)、dNTP各200μM(Takara)、600nM A_primer(MWG)、600nM B_dT20VN_primer(MWG)以及0.025U/μl Ex Taq聚合酶(Takara)(表2)。在热循环仪中进行一次如下循环来制造cDNA第二链：95℃ 3分钟，50℃ 2分钟，72℃ 3分钟。然后，按如下程序进行20(准备文库)或30(确认cDNA的存在)次循环，来扩增样本：95℃ 30秒，67℃ 1分钟，72℃ 3分钟，然后是72℃ 10分钟的最后延长。
文库清理
扩增完成后，向所述4管PCR反应液(100μl)中混入500μl结合缓冲液(Qiagen)，放入Qiaquick PCR净化柱(Qiagen)中，17,900x g甩1分钟以将扩增的cDNA结合在膜上。然后，以含有乙醇的洗涤液(Qiagen)洗涤该膜，最后以50μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)通过CA-纯化(即以与羧酸结合的超顺磁微珠进行纯化)对样本进行进一步纯化和浓缩。最后，以10％的PEG溶液来移除150-200bp以下的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
文库质量分析
以Agilent生物分析仪(Agilent)对经过30个循环扩增的样本加以分析，依照样本材料的多少选用DNA 高灵敏度(DNA High Sensitivity)试剂盒或DNA 1000试剂盒，以确认扩增后的cDNA文库的存在。
准备测序文库
建立文库索引
使用经20个循环扩增的样本来准备测序文库。为每个样本制备一种索引PCR预混液，取23μl所述预混液加入6个0.2ml PCR管中，并向每管中加入2μl已扩增并纯化的cDNA作为模版，使得PCR反应液含1x Phusion预混液(Fermentas)、500nM InPE1.0(Illumina)、500nM Index 1-12(Illumina)和0.4nM InPE2.0(Illumina)。将所述样本在热循环仪中按照下列程序经18个循环扩增：98℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 1分钟，接着是最后延长72℃ 5分钟。
测序文库清理
扩增完成后，向所述6管PCR反应液(150μl)中混入750μl结合缓冲液(Qiagen)，放入Qiaquick PCR净化柱(Qiagen)中，17,900x g甩1分钟以将扩增的cDNA结合在膜上(由于样本体积大(900μl)，因此将样本分作两份(每份450μl)，在两个步骤中分别结合)。然后，以含有乙醇的洗涤液(Qiagen)洗涤该膜，最后以50μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)通过CA-纯化对样本进行进一步的纯化和浓缩。最后，以7.8％的PEG溶液来移除300-350bp以下的片段。令已扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。以Agilent生物分析仪(Agilent)对样本加以分析，按照厂商说明，依照样本材料的多少选用DNA高灵敏度(DNA High Sensitivity)试剂盒或DNA 1000试剂盒，以确认扩增后的完成后的文库的存在和大小。
测序
按照所需数据通量和厂商说明，选用Illumina Hiseq2000或Miseq对文库进行测序。对Read2，可选地，采用引物B_r2进行定制测序，以免测序经过20T均聚物延展。
数据分析
修剪Read 1在5’端的42个碱基和Read 2在5’端的25个碱基(可选地，如果采用了定制引物，则无需修剪Read 2的碱基)。然后，用bowtie软件将read数据映射到屏蔽重复序列的Mus musculus9基因组集合，并将输出数据整理为SAM文件格式。提取映射后的read数据并以UCSC refGene基因注释加以注释。用“indexFinder”(一种用于索引检索的自制软件)检索数据。至此，便建立了包含所有已捕获的转录体及其各自的芯片索引位置信息的mongo DB数据库。
将matlab实现软件与数据库相连接，既能允许对数据的空间可视化与分析(图26)。
可选地，利用荧光标记的框架探针令可视化数据与显微图像相重叠，得到准确对齐，并得以实现空间转录组数据的提取。
实施例9
利用3’至5’高探针密度阵列和FFPE组织以MutY体系剪切反应和TdT催化的扩增反 应进行空间转录组学研究
制备阵列
从Roche-Nimblegen(Madison,WI,USA)订购预制型高密度微阵列芯片。每个捕获探针阵列含有72，000个特征，其中66,022个特征载有含独有ID-标签互补序列。每个特征大小为16x16μm。每个捕获探针在3’至5’方向上的构成与自制喷点3’至5’阵列中所用探针相同，但在探针的上游通用端(P’)上增加了3个额外的碱基，将其变为P’的加长版本，即LP’(表2)。每个阵列还配备了标记探针的框架，该框架载有30bp通用序列，以启动荧光探针的杂交，帮助阵列可视化中的定向。
5’至3’方向的捕获探针的合成
高密度阵列上5’至3’方向的捕获探针的合成步骤与自制喷点阵列相同，但区别在于其延长和连接步骤是先55℃下进行15分钟，再在72oC下进行15分钟。A-handle探针(表2)中包含了一个A/G错配，以允许通过MutY酶促系统进行的后续探针释放，如下所述。P-探针被较长的LP版本所取代，来与表面的较长探针相匹配。
福尔马林固定石蜡包埋组织的制备和脱蜡
该步骤实施方法与上述自制序列的操作流程相同。
cDNA的合成和染色
cDNA的合成和染色按照5’至3’方向的高密度Nimblegen阵列的操作流程进行，但cDNA合成中加入了生物素标记的dCTPs和dATP以及4种常规dNTPs(每种比生物素标记的核苷三磷酸多25倍)。
组织的移除
组织的移除按照如实施例8所述的5’至3’方向的高密度Nimblegen阵列的操作流程进行。
以MutY进行探针剪切
将带硅胶衬垫的16孔杂交盒(ArrayIt)预热至37℃，并附着于Codelink载片上。将50μl含有1x核酸内切酶VIII缓冲液(Endonuclease VIII Buffer)(NEB)、10U/μl MutY(Trevigen)、10U/μl核酸内切酶VIII(Endonuclease VIII)(NEB)和0.1μg/μl BSA的剪切混合物预热到37℃，并注入含有固定于表面的cDNA的各孔中。除去气泡，将载片封闭并在Thermomixer舒适型恒温混匀仪(Thermomixer comfort)中,以37℃下培养30分钟，期间按先300rpm 3秒再静止6秒进行间歇混合。培养完成后，移除封闭液，从每个经反应的孔中收集40μl剪切混合物，置入PCR管中。
准备文库
生物素-链亲和素介导的文库清理
为移除未延长的cDNA探针并改换缓冲液，对样本进行纯化，具体是通过将生物素标记的cDNA与涂有链亲和素的C1微珠(Invitrogen)结合，并以0.1M NaOH(现配现用)洗涤微珠。纯化以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)实施，令生物素标记的cDNA与C1微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以20μl水洗脱，具体洗脱方法是将微珠-水溶液加热到80℃，以破坏生物素-链亲和素的链接。
以末端转移酶进行dA-加尾
纯化步骤后，按照厂商说明配制含裂解缓冲液(Takara,Cellamp WholeTranscriptome Amplification kit)\TdT缓冲液(Takara)、1.5mM dATP(Takara)和TdT酶混合物(TdT及RNase H)(Takara)的polyA加尾反应混合物；每种样本各取18μl，加入新的0.2ml PCR管中，并加入22μl polyA加尾预混液予以混合，形成40μl的反应混合物。将所得混合物在热循环仪中以37℃培养15分钟，接着以70℃处理10分钟，令TdT失活。
第二链的合成及PCR扩增
dA加尾反应后，每个样本取4个新的0.2ml PCR管，加入23μl PCR预混液，并向每管中加入2μl样本作为模版。最终PCR反应液中含有1x Ex Taq缓冲液(Takara)、dNTP各200μM(Takara)、600nM A_primer(MWG)、600nM B_dT20VN_primer(MWG)以及0.025U/μl Ex Taq聚合酶(Takara)。在热循环仪中进行如下循环1次，来制造cDNA第二链：95℃ 3分钟，50℃ 2分钟，72℃ 3分钟。然后，按如下程序进行20(准备文库)或30(确认cDNA的存在)次循环，来扩增样本：95℃ 30秒，67℃ 1分钟，72℃ 3分钟，然后是72℃ 10分钟的最后延长。
文库清理
扩增完成后，向所述4管PCR反应液(100μl)中混入500μl结合缓冲液(Qiagen)，放入Qiaquick PCR净化柱(Qiagen)中，17,900x g甩1分钟以将扩增的cDNA结合在膜上。然后，以含有乙醇的洗涤液(Qiagen)洗涤该膜，最后以50μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)通过CA-纯化(即以与羧酸结合的超顺磁微珠进行纯化)对样本进行进一步的纯化和浓缩。最后，以10％的PEG溶液来移除150-200bp以下的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
第二次PCR扩增
最终PCR反应液含有1x Ex Taq缓冲液(Takara)、dNTP各200μM(Takara)、600nM A_primer(MWG)、600nM B_primer(MWG)和0.025U/μl Ex Taq聚合酶(Takara)；将该样本加热到95℃维持3分钟，然后按照如下程序进行30次循环：95℃ 30秒，65℃ 1分钟，72℃ 3分钟，接着是最后延长：72℃ 10分钟。
第二次文库清理
扩增完成后，向所述4管PCR反应液(100μl)中混入500μl结合缓冲液(Qiagen)，放入Qiaquick PCR净化柱(Qiagen)中，17,900x g甩1分钟以将扩增的cDNA结合在膜上。然后，以含有乙醇的洗涤液(Qiagen)洗涤该膜，最后以50μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)通过CA-纯化(即以与羧酸结合的超顺磁微珠进行纯化)对样本进行进一步纯化和浓缩。最后，以10％的PEG溶液来移除150-200bp的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl 10mM、pH8.5的Tris-Cl洗脱。
准备测序文库
建立文库索引
使用经20个循环扩增的样本来准备测序文库。为每个样本制备一种索引PCR预混液，取23μl加入6个0.2ml PCR管中，并向每管中加入2μl经扩增和纯化的cDNA作为模版，使得PCR反应液含1x Phusion预混液(Fermentas)、500nM InPE1.0(Illumina)、500nM Index1-12(Illumina)和0.4nM InPE2.0(Illumina)。将所述样本在热循环仪中按照下列程序经18个循环扩增：98℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 1分钟，接着是最后延长72℃ 5分钟。
测序文库清理
扩增反应后，以连接MBS robot(Magnetic Biosolutions)的CA-纯化反应对样本进行纯化和浓缩。最后，以7.8％的PEG溶液来移除300-350bp以下的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
取10μl扩增和纯化后的样本，置于Caliper XT芯片上，并以Caliper XT(Caliper)切除长度在480bp和720bp间的片段。使用DNA 高灵敏度(DNA High Sensitivity)试剂盒，以Agilent生物分析仪(Agilent)对样本加以分析，以确认扩增后的完成后的文库的存在和大小。
测序及数据分析
测序及生物信息学分析按照实施例8中所述的5’至3’方向的高密度Nimblegen阵列的操作流程实施。但是，在数据分析中，未用read 1进行对转录体的映射。可用Matlab可视化工具选出特定的Olfr转录体(图27)。
实施例10
利用5’至3’方向探针的自制喷点41-标签微阵列、以ProteinaseK或以User体系剪 切反应微波处理进行透化的福尔马林固定冷冻(FF-frozen)组织和以TdT进行的扩增反应 进行空间转录组学研究
阵列的制备
自制阵列的喷点方法如前所述，但采用的格局含有41个带独有ID标签的探针，所述探针的构成与实施例8中的5’至3’方向的高密度阵列相同。
所有其他步骤的实施方式均与实施例8中所述相同。
实施例11
实施cDNA合成步骤的替代方法
前述的片上cDNA合成还可以结合模版转换，通过向cDNA合成反应中加入模板转换引物来制造第二链(表2)。通过反转录酶向cDNA第一链的3’端添加末端碱基，所述碱基可以结合并引入第二扩增域，所述第二扩增域引导第二链的合成。双链合成产物一旦从阵列表面释放，便可方便地直接扩增成文库。
实施例12
利用5’至3’方向探针的自制喷点41-标签微阵列、以User体系剪切的poly-A尾 gDNA片段和以TdT加尾引物或易位特定引物引导的扩增反应来进行空间基因组学研究
阵列的制备
如前述方法，用Codelink载片(Surmodics)自制喷点阵列，但所用格局含有41个各带独有ID标签的探针，所述探针的构成与实施例8中的5’至3’方向的高密度阵列相同。
细胞的总DNA制备
DNA的碎裂
以DNeasy kit(Qiagen)按照厂商说明提取A431和U2OS细胞系的基因组DNA(gDNA)。用Covaris超声波样本震碎机(Covaris)按照厂商说明将DNA碎裂成500bp的片段。
以MBS机器人(Magnetic Biosolutions)通过CA-纯化(即以与羧酸结合的超顺磁微珠进行纯化)对样本进行纯化和浓缩。最后，以10％的PEG溶液来移除150-200bp以下的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl 10mM、pH8.5的Tris-Cl洗脱。
可选对照-不同细胞系的峰值
通过A431 DNA转化U2OS DNA的峰值，测定不同的捕获灵敏度水平，例如峰值为A431 DNA的1％、10％或50％。
以末端转移酶进行dA-加尾
按照厂商说明配制含TdT Buffer(Takara)、3mM dATP(Takara)和TdT酶混合物(TdT及RNase H)(Takara)的polyA加尾反应混合物，取45μl所述混合物与0.5μg DNA片段混合。将所得混合物在热循环仪中以37℃培养30分钟，接着在80℃处理20分钟令TdT失活。然后，以Qiaquick(Qiagen)柱按照厂商说明对含dA尾的片段进行清洗，并以Qubit体系(Invitrogen)按照厂商说明测定浓度。
片上实验
杂交、第二链合成和剪切反应都在16孔硅胶衬垫(ArrayIt,Sunnyvale,CA,USA)上进行。为避免蒸发，以封板覆盖杂交盒。
杂交
将117ng DNA沉淀于预热阵列(50℃)的孔中，加入1x NEB buffer(New EnglandBiolabs)和1x BSA至总体积45μl。在配有MTP微孔板的舒适型恒温混匀器(ThermomixerComfort)(Eppendorf)中以37℃、300rpm摇速培养该混合物30分钟。
第二链合成
无需移除杂交混合物，向孔中加入15μl含有1x NEB buffer、1.5μl Klenow聚合酶和3.75μl dNTPs(各2mM)的Klenow延长反应混合物。在舒适型恒温混匀器(ThermomixerComfort)(Eppendorf)中以37℃培养该混合物30分钟，不加摇动。
然后，洗涤载片：0.1％ SDS的2xSSC溶液，50℃、300rpm摇速下洗涤10分钟；0.2xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟；以及0.1xSSC溶液，300rpm摇速下洗涤1分钟。
释放探针
取50μl含有1x含1.8mM MgCl2的快速启动高保真反应缓冲液(FastStart HighFidelity Reaction Buffer with 1.8mM MgCl2)(Roche)、200μM dNTPs(New EnglandBiolabs)和0.1U/1μl USER Enzyme(New England Biolabs)的混合物，加热至37℃后，加入每孔中，并在37℃下进行30分钟培养并混合(300rpm摇速3秒，静止6秒)(Thermomixercomfort；Eppendorf)。然后，用移液枪从孔中回收含有已释放的DNA的反应混合物。
准备文库
扩增反应
以含有7.5μl释放的样本、每种引物各1μl和0.5μl enzyme(Roche,FastStartHiFi PCR体系)的10μl反应液进行扩增反应。按照如下程序进行反应：94℃2分钟；以下循环1次：94℃15秒，55℃2分钟，72℃2分钟；以下循环30次：94℃15秒，65℃30秒，72℃90秒，最后延长：72℃5分钟。
在测序文库的准备中，两种引物包括表面探针A-handle和与B-handle相连的特定易位引物(A431)或特定SNP引物之一(表2)。
以连接MBS机器人(Magnetic Biosolutions)的CA-纯化反应(即以与羧酸结合的超顺磁微珠进行纯化)对样本进行进一步的纯化和浓缩。最后，以10％的PEG溶液来移除150-200bp以下的片段。令扩增的cDNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl的10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。
文库质量分析
以Agilent生物分析仪(Agilent)对样本加以分析，依照样本材料的多少选用DNA高灵敏度(DNA High Sensitivity)试剂盒或DNA 1000试剂盒，以确认扩增后的cDNA文库的存在。
建立文库索引
使用经20个循环扩增的样本来准备测序文库。为每个样本制备一种索引PCR预混液，取其中23μl加入6个0.2ml PCR管中，并向每管中加入2μl扩增并纯化的cDNA作为模版，制得的PCR反应液中含有1x Phusion预混液(Fermentas)、500nM InPE1.0(Illumina)、500nM Index 1-12(Illumina)和0.4nM InPE2.0(Illumina)。将所述样本在热循环仪中按照下列程序经18个循环扩增：98℃30秒、65℃30秒、72℃1分钟；接着是最后延长：72℃5分钟。
测序文库清理
以连接MBS robot(Magnetic Biosolutions)的CA-纯化反应对样本进行进一步的纯化和浓缩。最后，以7.8％的PEG溶液来移除300-350bp以下的片段。令扩增的DNA与CA-微珠(Invitrogen)进行10分钟的结合反应，然后以15μl 10mM、pH 8.5的Tris-Cl洗脱。以Agilent生物分析仪(Agilent)对样本加以分析，按照厂商说明，依照样本材料的多少选用DNA高灵敏度(DNA High Sensitivity)试剂盒或DNA 1000试剂盒，以确认扩增后的完成后的文库的存在和大小(图29)。
测序
按照实施例8中所述的5’至3’方向的高密度Nimblegen阵列的操作流程进行测序。
数据分析
通过数据分析，确定阵列中的ID-捕获探针的捕获灵敏度。以read 2所含的易位引物或SNP引物对其进行整理分类，然后按照Read 1中所含的此类read的ID对这些read进行整理。
可选对照-细胞系特定易位的直接扩增
本步骤用于直接以PCR测定具有峰值的细胞系的捕获灵敏度。利用A431易位的正向和反向引物(表2)，尝试并检测复制并释放的第二链产物中是否存在易位(图30)。
表2.用于空间转录组学和空间基因组学研究的寡核苷酸
Figure BDA0004017774520000711
Figure BDA0004017774520000721
Figure BDA0004017774520000731

Claims (148)

1.用于在组织切片中局部检测RNA的方法，该方法包括：
(a)在基板上提供包括多个特征的阵列，其中每个特征占据所述阵列上的不同位置，其中所述多个特征中的特征包括固定在其上的多个捕获探针，并且其中所述多个捕获探针包含具有以下从5'至3'取向的结构域的核酸分子：
(i)包含定位域的第一序列，该定位域包含所述特征所特有的核苷酸序列；和
(ii)包含捕获域的第二序列，该捕获域包含与待检测的RNA互补的核苷酸序列；
(b)使所述阵列与组织切片接触并允许所述组织切片的至少一种RNA与捕获探针的捕获域杂交；
(c)通过使用杂交的RNA作为延长模板延长捕获探针，产生cDNA分子，使得产生的cDNA分子包含所述定位域的核苷酸序列；
(d)从所述阵列释放所产生的cDNA分子或其部分，或与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链，和
(e)鉴定释放的cDNA分子中所述定位域的核苷酸序列，或其互补链；和
(f)将所述定位域的核苷酸序列与所述阵列上的不同位置相关联，从而检测所述组织切片中的RNA。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，进一步在步骤(c)和(d)之间包括：产生与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括：通过变性，从所述捕获探针的捕获域中释放所产生的cDNA分子或其部分，或与所产生的cDNA分子或其部分互补的第二链。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，进一步包括扩增从阵列释放的所产生的cDNA或其部分、与所产生的cDNA或其部分互补的第二链的步骤。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含位于所述定位域的5'侧的剪切域。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，进一步包括剪切所述捕获探针的剪切域，其中剪切包括应用剪切酶，该剪切酶识别剪切域中的核苷酸序列，并在定位域5’侧的一个位置处剪切所产生的cDNA分子，从而从所述阵列上的特征释放所产生的cDNA分子或其部分，或所述第二链或其部分。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述RNA选自mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶RNA、反义RNA和非编码RNA。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述RNA是mRNA。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述捕获探针的捕获域与mRNA的poly-A尾杂交。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly-T序列。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于，该方法进一步包括在步骤(c)之前对组织切片进行染色的步骤。
12.根据权利要求1的方法，进一步包括将步骤(f)中获得的核苷酸序列与组织切片的成像相关联，其中该方法包括在步骤(c)之前对组织切片进行成像的步骤。
13.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述多个捕获探针中的捕获探针具有自由的3'端。
14.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针通过接头固定在所述基板上。
15.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述阵列是珠阵列并且所述捕获探针固定在所述珠阵列的珠上。
16.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述阵列包括至少1,000个特征。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阵列的特征具有约小于100微米、约小于50微米、约小于约20微米或约小于10微米的平均直径。
18.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述基板包括一个或多个阵列。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述一个或多个阵列包含相同的定位域。
20.根据权利要求18的方法，其特征在于，所述一个或多个阵列包含不同定位域。
21.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含引物结合位点。
22.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述组织切片包括固定的或新鲜冷冻的组织切片。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于，固定的组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。
24.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述多个特征包括印刷或光刻沉积特征。
25.根据权利要求1的方法，其特征在于，鉴定所述定位域的核苷酸序列包括测序。
26.组合物，包括：
多个mRNA分子，其与基板上包含多个特征的阵列的多个捕获探针的捕获域杂交，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：
核酸序列，其附着在基板上的多个特征中的特征上；和
定位域，其包含对所述多个特征中的特征而言独有的核酸序列。
27.根据权利要求26的组合物，其特征在于，所述捕获探针通过其5'端附着在所述特征上。
28.根据权利要求26或27的组合物，其特征在于，所述基板适合用作测序平台。
29.根据权利要求28的组合物，其特征在于，所述测序平台是下一代测序平台。
30.根据权利要求26-29中任一项的组合物，其特征在于，所述阵列是珠阵列。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获域包含poly(T)序列。
32.根据权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述poly(T)序列包含至少10个脱氧胸苷残基。
33.根据权利要求26-32中任一项的组合物，其特征在于，所述捕获探针包含剪切域。
34.根据权利要求33的组合物，其特征在于，所述剪切域包含至少五个dUTP碱基或一个或多个错配核苷酸。
35.根据权利要求26-34中任一项所述的组合物，其中所述捕获探针进一步包含扩增域。
36.根据权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针在5'至3'方向包含以下结构域：
i)剪切域；
ii)扩增域；
iii)定位域；和
iv)捕获域。
37.根据权利要求26-36中任一项的组合物，其特征在于，使用所述杂交的mRNA分子作为模板延长了所述捕获探针的3'端，以产生与所述杂交的mRNA互补的序列。
38.根据权利要求26-37中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针包含DNA、RNA、PNA或其组合。
39.根据权利要求26-38中任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获探针具有自由的3'端。
40.根据权利要求26-39中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含反转录酶。
41.用于检测组织切片中的核酸的位置的方法，包括：
(a)提供包括多个捕获探针的基板，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：
(i)与核酸结合的捕获域，和
(ii)包含核苷酸序列的定位域，其中每个所述定位域的所述核苷酸序列唯一对应所述基板上的不同位置；
(b)令所述组织切片与所述基板接触；
(c)从所述基板释放所述捕获探针；
(d)使用与所述捕获域相结合的所述组织切片的所述核酸作为模板，延长所述捕获探针的3’端，以产生延长的核酸产物；和
(e)确定(i)与所述捕获域结合的组织切片的核酸或其互补链的全部或部分核苷酸序列，和(ii)所述定位域的核苷酸序列或其互补链，其中(i)和(ii)的核苷酸序列指示所述核酸是通过所述捕获探针从基板上不同位置处的组织切片获得，从而确定所述组织切片中所述核酸的位置。
42.根据根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述基板包含聚合物。
43.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。
44.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。
45.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获mRNA的核苷酸序列，其中在所述捕获域中包含poly-T序列。
46.根据权利要求42的方法，其特征在于，将所述聚合物附着到固体支持物上。
47.根据权利要求42的方法，其特征在于，所述固体支持物包括玻璃、硅、聚赖氨酸涂层材料、硝化纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯、和聚碳酸酯中的一种。
48.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(d)中的延长包括进行反转录反应，并且其中产生的延长核酸产物是cDNA。
49.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(e)中的确定包括扩增全部或部分所述延长的核酸产物或其互补链，以产生一种或多种扩增的核酸产物。
50.根据权利要求49的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从所述基板释放所述一种或多种扩增的核酸产物。
51.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述步骤(e)中的确定包括测序。
52.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述方法还包括对组织切片进行成像，并且所述方法还包括将所述定位域的核苷酸序列与被成像的组织切片中的位置相关联。
53.根据权利要求27的方法，其特征在于，所述成像包括以下一项或多项：光、明视场、暗视场、相位差、荧光显微术、镜像、干涉和共聚显微镜。
54.根据权利要求41的方法，其特征在于，所述捕获探针包含以下5'至3'取向的结构域：
(i)剪切域，
(ii)定位域，以及
(iii)捕获域；
其中从基板释放捕获探针的步骤包括剪切所述剪切域。
55.根据权利要求41的方法，其特征在于，步骤(c)中的释放包括酶促裂解、化学裂解或加热。
56.用于检测组织切片中的核酸的位置的方法，包括：
(a)提供包括多个捕获探针的基板，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包括：
(i)与核酸结合的捕获域，和
(ii)包含核苷酸序列的定位域，其中每个所述定位域的所述核苷酸序列唯一对应所述基板上的不同位置；
(b)令所述组织切片与所述基板接触；
(c)对一个或多个荧光标记探针进行成像；
(d)从所述基板释放所述捕获探针；
(e)使用与所述捕获域相结合的所述组织切片的所述核酸作为模板，延长所述捕获探针的3’端，以产生延长的核酸产物；和
(f)确定(i)与所述捕获域结合的组织切片的核酸或其互补链的全部或部分核苷酸序列，和(ii)所述定位域的核苷酸序列或其互补链，其中(i)和(ii)的核苷酸序列指示所述核酸是通过所述捕获探针从基板上不同位置处的组织切片获得，从而确定所述组织切片中所述核酸的位置。
57.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述基板包含聚合物，并且所述聚合物附着到固体支持物上。
58.根据权利要求57的方法，其特征在于，所述固体支持物包括玻璃、硅、聚赖氨酸涂层材料、硝化纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯、和聚碳酸酯中的一种。
59.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述核酸是DNA。
60.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。
61.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获mRNA的核苷酸序列。
62.根据权利要求36的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly-T序列。
63.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(e)中的延长包括进行反转录反应，并且其中产生的延长核酸产物是cDNA。
64.根据权利要求56的方法，其特征在于，(e)中的确定包括扩增全部或部分延长的核酸产物或其互补链，以产生一种或多种扩增的核酸产物。
65.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从所述基板释放所述一种或多种扩增的核酸产物。
66.根据权利要求56的方法，其特征在于，进一步包括将所述定位域的核苷酸序列与被成像的组织切片中的位置相关联。
67.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述捕获探针包含以下5'至3'取向的结构域：
(i)剪切域，
(ii)定位域，以及
(iii)捕获域；
其中从基板释放捕获探针的步骤包括剪切所述剪切域。
68.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(c)中的释放包括酶裂解、化学裂解或加热。
69.根据权利要求56的方法，其特征在于，步骤(e)中的确定包括测序。
70.根据权利要求56的方法，其特征在于，所述成像包括以下一项或多项：光、明视场、暗视场、相位差、荧光显微术、镜像、干涉和共聚显微镜。
71.用于在包含细胞的组织样本中局部检测DNA的方法，所述方法包括：
(a)提供在基板上包含多个特征的阵列，每个特征包含固定在其上的不同捕获探针，使得捕获探针具有自由的3'端，每个特征占据所述阵列上的不同位置并面积为小于约1mm2，每个捕获探针由核酸分子组成，该核酸分子包含以下5'至3'方向的结构域：
(i)包含特定特征所特有的核苷酸序列的定位域；和
(ii)包含与待检测的DNA互补的核苷酸序列的捕获域；
(b)使所述阵列与包含细胞的组织样本接触，使得组织样本在阵列上的不同位置接触多个特征；
(c)对所述包含细胞的组织样本中存在的与固定在所述特征上的捕获探针的捕获序列互补的DNA进行杂交，使得所述DNA被所述特征中的捕获探针的捕获域所捕获；
(d)通过酶促延长捕获探针，从所捕获的DNA产生DNA分子，其中使用(i)所捕获的DNA作为延长或连接模板，使得DNA分子包含所述定位域的核苷酸序列；或(ii)所述捕获探针作为连接模板，使得DNA分子包含与定位域互补的核苷酸序列；
(e)从所述阵列的表面的所述特征中释放至少部分的所述DNA分子，和
(f)鉴定所述定位域的核苷酸序列或与释放的DNA分子中存在的定位域的核苷酸序列互补的序列，其中，给定的特定特征所特有的定位域的核苷酸序列或与所述特定特征所特有的定位域的核苷酸序列互补的序列的的存在，表明所释放的DNA分子是从所述包含细胞的组织样本中存在于所述包含细胞的组织样本与所述特定特征接触的不同位置处的DNA获得的。
72.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括产生所述DNA分子的互补链的步骤。
73.根据权利要求72的方法，其特征在于，从所述阵列的表面释放至少部分DNA分子的步骤包括通过变性释放所述DNA分子的互补链。
74.根据权利要求73的方法，其特征在于，进一步包括扩增所释放的DNA分子互补链的步骤。
75.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括扩增DNA分子的步骤，使得所扩增的DNA分子包含定位域的核苷酸序列和与所述定位序列互补的核苷酸序列。
76.根据权利要求122的方法，其特征在于，所述扩增DNA分子的步骤用作从所述阵列的表面的特征中释放至少部分DNA分子的步骤。
77.根据权利要求71的方法，其特征在于，每个由核酸分子组成的捕获探针包含以下5'至3'取向的结构域：
(i)剪切域；
(ii)包含特定特征所特有的核苷酸序列的定位域；和
(iii)包含与待检测的DNA互补的核苷酸序列的捕获域，
并且其中从所述阵列的表面的特征中释放至少部分DNA分子的步骤包括剪切所述剪切域。
78.根据权利要求77的方法，其特征在于，剪切所述剪切域的步骤包括用剪切酶剪切所述剪切域，所述剪切酶识别所述剪切域中的核苷酸序列并在所述定位域的5'测位置剪切所述DNA分子。
79.根据权利要求71的方法，其特征在于，所述DNA是基因组DNA。
80.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括在所述包含细胞的组织样本中片段化DNA的步骤。
81.根据权利要求80的方法，其特征在于，在使所述阵列与所述包含细胞的组织样本接触之前或之后进行片段化DNA的步骤。
82.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括在所述包含细胞的组织样本中提供具有与所述捕获探针的捕获域杂交的结合域的DNA的步骤。
83.根据权利要求82的方法，其特征在于，所述结合域包含同聚序列。
84.根据权利要求83的方法，其特征在于，所述同聚序列是poly-A序列。
85.根据权利要求84的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly-T序列。
86.根据权利要求71的方法，其特征在于，所述捕获域包含随机六聚体序列。
87.根据权利要求71的方法，其特征在于，在步骤(d)(ii)中，所述捕获探针是部分双链分子，其包括包含与第二链杂交的捕获域的第一链，所述第二链通过其3'端固定在所述阵列的表面上，并且其中所述第一链作为将所捕获的DNA连接到第二链的模板。
88.根据权利要求71的方法，其特征在于，步骤(f)包括对所释放的DNA分子进行测序。
89.根据权利要求88的方法，其特征在于，进一步包括将步骤(f)中获得的序列分析信息与所述包含细胞的组织样本的成像相关联的步骤，其中该方法包括在步骤(b)之后对包含细胞的组织样本进行成像的步骤。
90.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括通过以下方法确定哪些基因存在于所述包含细胞的组织样本的特定不同位置，所述方法包括确定所释放的DNA分子的序列，所述所释放的DNA分子包括所述定位域的相同核苷酸序列或与所述定位域的核苷酸序列互补的序列。
91.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括通过以下方法确定特定基因存在于所述包含细胞的组织样本中的哪个位置，该方法包括鉴定包含与所述特定基因相关联的序列的所释放的DNA分子，并确定该特定基因的哪些核苷酸序列定位域或与该定位域的核苷酸序列互补的序列连接到其上。
92.根据权利要求71的方法，其特征在于，进一步包括将所释放的DNA分子中存在的给定特定特征所特有的定位域的核苷酸序列，或与所述特定特征所特有的定位域的核苷酸序列互补的序列，关联到所述组织样本中的位置。
93.根据权利要求71的方法，其特征在于，所述包含细胞的组织样本是组织切片或细胞悬液。
94.根据权利要求71的方法，其特征在于，所述捕获探针通过化学接头固定在基板上。
95.根据权利要求71的方法，其特征在于，所述阵列是珠阵列并且所述捕获探针固定在所述阵列的珠上。
96.用于空间检测组织样本中的核酸的方法，样本包括：
(a)提供包含多个捕获探针的阵列，其中
所述多个捕获探针中的捕获探针包括：
(i)随机核酸序列，和
(ii)捕获域；
(b)使组织样本与阵列接触并允许组织样本的核酸与捕获探针的捕获域相互作用；
(c)从捕获的核酸产生DNA分子；
(d)分析所产生的DNA分子，从而确定与所捕获的核酸相关联的所述随机核酸序列；和
(e)将确定的随机核酸序列与阵列上的位置相关联。
97.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述核酸是RNA或DNA。
98.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获探针是核酸。
99.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述多个捕获探针的子集各自包含独有的随机核酸序列。
100.根据权利要求96的方法，其特征在于，分析所产生的DNA分子包括对所产生的DNA分子的全部或部分进行测序。
101.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获域包含核酸，并且从所述捕获的核酸产生DNA分子包括使用所述捕获的核酸作为延长模板在所述捕获域中延长所述核酸。
102.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含剪切域。
103.根据权利要求102的方法，其特征在于，该方法进一步包括从阵列释放至少部分所产生的DNA分子并扩增全部或部分释放的DNA分子。
104.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获域包含设计用于选择性捕获mRNA的核苷酸序列。
105.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获域包含poly-T序列。
106.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述多个捕获探针的捕获域包含相同的核苷酸序列。
107.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述多个捕获探针的捕获域包含不同的核苷酸序列。
108.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述多个捕获探针包含随机核酸序列，并且其中所述随机核酸序列的子集在所述多个捕获探针中是唯一的。
109.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述阵列是珠阵列。
110.根据权利要求109的方法，其特征在于，所述多个捕获探针固定在所述珠阵列的珠上。
111.根据权利要求96的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含定位域。
112.用于空间检测组织样本中的核酸的方法，包括：
(a)提供包含多个特征的阵列，其中所述多个特征中的特征包括一个或多个捕获探针，其中来自所述特征的捕获探针包括：
(i)定位域，其包含该特征所特有的核苷酸序列；和
(ii)捕获域；
(b)使所述组织样本与所述阵列接触，并通过所述捕获探针的捕获域来捕获所述组织样本的核酸；
(c)从所捕获的核酸产生DNA分子；
(d)分析所产生的DNA分子，从而确定与所捕获的核酸相关联的定位域的核苷酸序列；和
(e)将所确定的定位域的核苷酸序列与所述阵列上的所述多个特征的所述特征相关联。
113.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述捕获探针进一步包含随机核酸序列，并且其中所述随机核酸序列的子集对于每个捕获探针是独有的。
114.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述多个特征是珠。
115.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述核酸是RNA。
116.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述捕获域包含多poly-T序列。
117.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述DNA分子是cDNA分子。
118.根据权利要求114的方法，其特征在于，所述捕获探针固定在所述阵列的珠上。
119.根据权利要求112的方法，其特征在于，对所述核酸进行计数。
120.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述产生包括对所捕获的核酸进行反转录酶反应。
121.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述产生包括扩增全部或部分所产生的DNA分子，从而形成扩增的DNA分子。
122.根据权利要求112的方法，其特征在于，所述分析包括对全部或部分所产生的DNA分子进行测序，并鉴定所述定位域的核苷酸序列或与产生的DNA中的定位域的核苷酸序列互补的序列分子。
123.根据权利要求112的方法，其特征在于，该方法还包括对阵列上的组织样本进行成像。
124.根据权利要求123的方法，其特征在于，关联包括通过组织样本的成像将定位域的核苷酸序列或与定位域的核苷酸序列互补的序列与阵列上的特征相关联。
125.根据权利要求124的方法，其特征在于，所述成像选自光、明视场、暗视场、相位差、荧光显微术、镜像、干涉和共聚显微镜或其组合。
126.包含多个捕获探针的多孔基板，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含：
(i)定位域，其包含独有唯一对应所述多孔基板中的特定位置的核苷酸序列，和(ii)捕获域，其包含与组织切片中待检测的核酸互补的核苷酸序列。
127.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述多孔基板进一步包含一种或多种标记探针。
128.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述多孔基板包含凝胶。
129.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述多孔基板包含聚合物。
130.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述多孔基板包括琼脂糖。
131.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获RNA的核苷酸序列。
132.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获mRNA的核苷酸序列。
133.根据权利要求132所述的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含poly-T序列。
134.根据权利要求133所述的多孔基板，其特征在于，所述poly-T序列包含至少10个脱氧胸苷残基。
135.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含用于捕获DNA的核苷酸序列。
136.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含简并序列。
137.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述捕获域包含随机序列。
138.根据权利要求126所述的多孔基板，其特征在于，所述捕获探针进一步包含剪切域，并且其中从5'到3'取向为以下域：
(i)剪切域，
(ii)定位域，以及
(iii)捕获域。
139.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述一种或多种标记探针包含一种或多种标记。
140.根据权利要求126的多孔基板，其特征在于，所述一种或多种标记包括荧光标记。
141.根据权利要求126所述的多孔基板，其特征在于，所述捕获探针进一步包含通用结构域。
142.根据权利要求141所述的多孔基板，其特征在于，所述通用结构域包括扩增域。
143.组件，包括：
(a)设置在基板上的高密度阵列，其中所述高密度阵列配置为接触组织样本；和
(b)连接到基板并围绕高密度阵列的框架，其中所述框架配置为定向组织样本。
144.根据权利要求143所述的组件，其特征在于，所述框架包括多个框架探针。
145.根据权利要求144的组件，其特征在于，所述多个框架探针中的每一个包括一个或多个尿嘧啶碱基。
146.根据权利要求143的组件，其特征在于，所述框架进一步包括多个杂交的标记探针。
147.根据权利要求146的组件，其特征在于，所述杂交标记探针中的至少一种包含荧光标记。
148.盒，包括：
(a)多个孔，其中每个孔包含配置为容纳权利要求143-147中任一项的组件的反应体积；和
(b)封板，配置为覆盖所述多个孔。
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RU (1) RU2603074C2 (zh)
WO (1) WO2012140224A1 (zh)

Families Citing this family (285)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
EP4108782B1 (en) 2011-12-22 2023-06-07 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
EP2647426A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
CN104508128A (zh) * 2012-07-30 2015-04-08 株式会社日立制作所 带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2886974C (en) * 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US9909186B2 (en) 2012-12-14 2018-03-06 Chronix Biomedical Personalized biomarkers for cancer
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2997037B1 (en) 2013-05-14 2018-11-21 Genomics USA, Inc. Use of a composition for entrapping a protein on a surface
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
RU2016102922A (ru) * 2013-06-29 2017-08-03 Фирмениш Са Способы идентификации, изоляции и применения рецепторов пахучих веществ и ароматов
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
EP3058091B1 (en) * 2013-10-18 2020-03-25 The Broad Institute, Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
EP3077430A4 (en) 2013-12-05 2017-08-16 Centrillion Technology Holdings Corporation Modified surfaces
US10597715B2 (en) 2013-12-05 2020-03-24 Centrillion Technology Holdings Methods for sequencing nucleic acids
CN111118121A (zh) * 2013-12-05 2020-05-08 生捷科技控股公司 图案化阵列的制备
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
EP2883963A1 (en) * 2013-12-16 2015-06-17 Alacris Theranostics GmbH Method for generating of oligonucleotide arrays using in situ block synthesis approach
US10370630B2 (en) 2014-02-10 2019-08-06 Technion Research & Development Foundation Limited Method and apparatus for cell isolation, growth, replication, manipulation, and analysis
US11060139B2 (en) 2014-03-28 2021-07-13 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
AU2015261440A1 (en) * 2014-05-14 2017-01-05 Barbara BURWINKEL Synthesis of double-stranded nucleic acids
GB201411624D0 (en) * 2014-06-30 2014-08-13 Ge Healthcare Uk Ltd Spatial molecular profiling of solid biological masses and profile storage
KR101634553B1 (ko) * 2014-08-06 2016-06-30 가천대학교 산학협력단 통합형 pc 마이크로 디바이스, 그 제조방법 및 이를 이용한 연속적 dna 정제-증폭 방법
US10590472B2 (en) * 2014-09-05 2020-03-17 Zhi Zheng Methods of detecting nucleic acids and applications thereof
US9897791B2 (en) 2014-10-16 2018-02-20 Illumina, Inc. Optical scanning systems for in situ genetic analysis
CN107407638B (zh) 2014-12-03 2021-01-12 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
SG11201705615UA (en) 2015-01-12 2017-08-30 10X Genomics Inc Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
GB201501907D0 (en) 2015-02-05 2015-03-25 Technion Res & Dev Foundation System and method for single cell genetic analysis
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US11060131B2 (en) 2015-03-25 2021-07-13 Angle Europe Limited Solid phase nucleic acid target capture and replication using strand displacing polymerases
EP3277843A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
JP6395925B2 (ja) 2015-04-09 2018-09-26 株式会社日立製作所 遺伝子解析システム
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
EP3283641B1 (en) * 2015-04-14 2019-11-27 Koninklijke Philips N.V. Spatial mapping of molecular profiles of biological tissue samples
US20180057873A1 (en) * 2015-04-17 2018-03-01 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological materials
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
CA2992492A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
WO2017019456A2 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 Illumina, Inc. Spatial mapping of nucleic acid sequence information
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
WO2017075293A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for encoding cellular spatial position information
JP6882282B2 (ja) 2015-11-03 2021-06-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 三次元核酸含有マトリックスの立体撮像のための方法と装置
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
CN105505755A (zh) * 2015-12-23 2016-04-20 杭州谷禾信息技术有限公司 空间转录组建库测序方法及所用装置
US11542498B2 (en) * 2015-12-28 2023-01-03 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
CA3022290A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
CN109074430B (zh) 2016-05-26 2022-03-29 贝克顿迪金森公司 分子标记计数调整方法
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
EP4050112A1 (en) 2016-06-21 2022-08-31 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
CN109983125A (zh) * 2016-08-31 2019-07-05 哈佛学院董事及会员团体 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法
CN109923216A (zh) 2016-08-31 2019-06-21 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
WO2018058073A2 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US20190262831A1 (en) * 2016-10-17 2019-08-29 Lociomics Corporation High resolution spatial genomic analysis of tissues and cell aggregates
KR20190077061A (ko) 2016-11-08 2019-07-02 셀룰러 리서치, 인크. 세포 표지 분류 방법
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
WO2018089910A2 (en) 2016-11-11 2018-05-17 IsoPlexis Corporation Compositions and methods for the simultaneous genomic, transcriptomic and proteomic analysis of single cells
GB201619458D0 (en) * 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
US11525783B2 (en) 2016-11-22 2022-12-13 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
CN110024037B (zh) * 2016-11-30 2023-06-27 微软技术许可有限责任公司 经由连接的dna随机存取存储系统
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
JP7104048B2 (ja) 2017-01-13 2022-07-20 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 流体チャネルの親水性コーティング
RU2665631C2 (ru) * 2017-01-25 2018-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" Способ специфической идентификации последовательностей днк
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
US20200370105A1 (en) * 2017-05-23 2020-11-26 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological molecules
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
EP3668998A1 (en) 2017-10-06 2020-06-24 Cartana AB Rna templated ligation
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3728636A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
CN112041459A (zh) * 2018-01-29 2020-12-04 圣祖德儿童研究医院 核酸扩增方法
JP7372927B6 (ja) 2018-02-12 2023-11-27 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
US20210207196A1 (en) * 2018-05-18 2021-07-08 Microbix Biosystems Inc. Quality control compositions and whole organism control materials for use in nucleic acid testing
KR102103719B1 (ko) * 2018-05-18 2020-04-23 주식회사 바이나리 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 분석 방법
CA3099525A1 (en) * 2018-05-21 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Single cell mapping and transcriptome analysis
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
WO2020016327A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Method for analyzing cell sample heterogeneity
US20210317528A1 (en) * 2018-07-23 2021-10-14 Genomics Usa, Inc. Blood typing using dna
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
CN109097467A (zh) * 2018-08-08 2018-12-28 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用
CN109136372A (zh) * 2018-08-08 2019-01-04 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种基于illumina平台的乳腺癌分型检测建库试剂盒
WO2020047010A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
WO2020047005A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
EP3864173A4 (en) * 2018-10-10 2022-07-20 Readcoor, LLC SURFACE DETECTION OF TARGETS
AU2019364418A1 (en) * 2018-10-25 2021-04-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN109576357A (zh) * 2018-11-20 2019-04-05 上海欧易生物医学科技有限公司 一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法
JP7332694B2 (ja) * 2018-12-04 2023-08-23 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 細胞標的の空間指向性量子バーコード化
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
US20230242976A1 (en) * 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP3894593A2 (en) 2018-12-13 2021-10-20 DNA Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
GB201820341D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
SG11202102710SA (en) * 2018-12-21 2021-04-29 Illumina Inc Nuclease-based rna depletion
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN109762728A (zh) * 2019-01-07 2019-05-17 东南大学 一种空间转录组检测芯片及方法
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
WO2020160044A1 (en) * 2019-01-28 2020-08-06 The Broad Institute, Inc. In-situ spatial transcriptomics
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
EP3924505A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US20230143569A1 (en) * 2019-02-28 2023-05-11 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
SG11202111242PA (en) 2019-03-11 2021-11-29 10X Genomics Inc Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
CN114174532A (zh) * 2019-04-05 2022-03-11 德克萨斯大学系统董事会 细胞条形码编码的方法和应用
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
EP3971282A4 (en) * 2019-05-15 2023-12-27 BGI Shenzhen ARRANGEMENT AND METHOD FOR COLLECTING SPATIAL INFORMATION FROM NUCLEIC ACIDS
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
AU2020282024A1 (en) 2019-05-31 2021-11-11 10X Genomics, Inc. Method of detecting target nucleic acid molecules
CN114450401A (zh) 2019-06-21 2022-05-06 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 可用于对用于制备下一代测序文库的核酸进行标记的拴系有寡聚核苷酸的三磷酸核苷酸
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US20220251632A1 (en) * 2019-07-23 2022-08-11 University Of Washington Method for spatially barcoding cells in tissue slices
CN114761992B (zh) 2019-10-01 2023-08-08 10X基因组学有限公司 用于识别组织样品中的形态学模式的系统和方法
WO2021066465A1 (ko) * 2019-10-01 2021-04-08 (주)컨투어젠 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법
CN110804654A (zh) * 2019-10-30 2020-02-18 东南大学 一种空间转录组测序方法
US20210130881A1 (en) 2019-11-06 2021-05-06 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20210150707A1 (en) 2019-11-18 2021-05-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for binary tissue classification
US20210155982A1 (en) 2019-11-21 2021-05-27 10X Genomics, Inc. Pipeline for spatial analysis of analytes
EP4062372A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
EP4073241A2 (en) 2019-12-11 2022-10-19 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
EP4087945B1 (en) 2020-01-10 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US20230047782A1 (en) * 2020-02-07 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
CN115151654A (zh) * 2020-02-12 2022-10-04 通用测序技术公司 用于胞内条码化和空间条码化的方法
US20230081381A1 (en) 2020-02-20 2023-03-16 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
JP2023514749A (ja) 2020-02-21 2023-04-07 １０エックス ジェノミクス インコーポレイテッド 統合型インサイチュ空間的アッセイのための方法および組成物
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US20210277460A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-09 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial transcriptomics with sequencing readout
KR102482668B1 (ko) * 2020-03-10 2022-12-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 고유 분자 식별자의 표지 정확도를 증진하는 방법
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
US20230265491A1 (en) 2020-05-04 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomic transfer modes
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US20230194469A1 (en) 2020-05-19 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
WO2021237056A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252576A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022013094A1 (en) 2020-07-15 2022-01-20 Dna Script Massively parallel enzymatic synthesis of polynucleotides
WO2022015913A1 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Materials and methods for localized detection of nucleic acids in a tissue sample
WO2022025965A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
US11492662B2 (en) 2020-08-06 2022-11-08 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for in situ transcriptomics and proteomics
EP4121557A4 (en) 2020-08-06 2024-05-01 Singular Genomics Systems Inc SPATIAL SEQUENCING
US20220064718A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Applied Materials, Inc. Alignment beads for mfish
EP4211508A1 (en) 2020-09-14 2023-07-19 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and systems for multidimensional imaging
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
CN116507739A (zh) 2020-09-16 2023-07-28 10X基因组学有限公司 使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
WO2022061152A2 (en) 2020-09-18 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
AU2021345283A1 (en) 2020-09-18 2023-04-06 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022081643A2 (en) 2020-10-13 2022-04-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating recombinant antigen binding molecules from single cells
AU2021366701A1 (en) 2020-10-22 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
CN116829733A (zh) * 2020-11-06 2023-09-29 10X基因组学有限公司 用于将分析物结合至捕获探针的组合物和方法
US20230407404A1 (en) 2020-11-18 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
US20220186300A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN116601469A (zh) 2020-12-21 2023-08-15 奇异基因组学系统公司 用于多色成像的系统和方法
US20240076723A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
AU2022209365A1 (en) * 2021-01-21 2023-07-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
EP4284942A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
WO2022182682A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022216688A1 (en) 2021-04-05 2022-10-13 10X Genomics, Inc. Recombinant ligase composition and uses thereof
WO2022221425A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
WO2022232571A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Fusion rt variants for improved performance
EP4320271A1 (en) 2021-05-06 2024-02-14 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
EP4341429A1 (en) 2021-05-19 2024-03-27 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Method and system for 3d reconstruction of tissue gene expression data
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
US20220403462A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method of spatial sequencing of genes from tissue using padlocks with gaps on substrate
WO2022271820A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 10X Genomics, Inc. Spatial detection of sars-cov-2 using templated ligation
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
WO2023287765A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
CN113604547B (zh) * 2021-08-06 2023-05-02 吉林大学 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023044071A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for image registration or alignment
EP4155416B1 (en) 2021-09-23 2024-01-10 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for obtaining spatial and sequencing information of m-rna from tissue
CN113930847A (zh) * 2021-09-26 2022-01-14 东南大学 一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用
WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
CN113782103A (zh) * 2021-10-26 2021-12-10 大连大学 一种基于组合式酶切机制的dna矩阵处理方法
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023086824A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods for identification of antigen-binding molecules
WO2023102313A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for identifying regions of aneuploidy in a tissue
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023122033A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
WO2023122746A2 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The General Hospital Corporation Compositions and methods for end to end capture of messenger rnas
WO2023115536A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023116373A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023150163A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from lymphatic tissue
WO2023150098A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, kits, compositions, and systems for spatial analysis
WO2023150171A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from glioblastoma samples
US20230306593A1 (en) 2022-02-15 2023-09-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
WO2023172670A2 (en) 2022-03-11 2023-09-14 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
CN114369650B (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 深圳市仙湖植物园(深圳市园林研究中心) 捕获探针的设计方法、捕获探针及其应用
WO2023201235A2 (en) 2022-04-12 2023-10-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating and characterizing recombinant antigen binding molecules
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023215552A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Molecular barcode readers for analyte detection
WO2023225519A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Modified transposons, compositions and uses thereof
WO2023229988A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Tissue sample mold
WO2023229982A2 (en) 2022-05-24 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Porous structure confinement for convection suppression
WO2023250077A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2024006799A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Covalent attachment of splint oligonucleotides for molecular array generation using ligation
US20240060127A1 (en) 2022-06-29 2024-02-22 10X Genomics, Inc. Methods and systems for light-controlled surface patterning using photomasks
US20240117338A1 (en) 2022-06-29 2024-04-11 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for refining feature boundaries in molecular arrays
US20240026444A1 (en) 2022-06-29 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating molecular arrays using oligonucleotide printing and photolithography
WO2024006816A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for oligonucleotide inversion on arrays
US20240084359A1 (en) 2022-06-29 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for patterned molecular array generation by directed bead delivery
WO2024006832A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Click chemistry-based dna photo-ligation for manufacturing of high-resolution dna arrays
US20240076721A1 (en) 2022-06-29 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Method of generating arrays using microfluidics and photolithography
WO2024006798A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. High definition molecular array feature generation using photoresist
WO2024015862A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for characterization of antigen-binding molecules from biological samples
WO2024015578A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
US20240052404A1 (en) 2022-08-05 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for immunofluorescence quantification
WO2024036191A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for colocalization
WO2024035844A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Methods for reducing capture of analytes
WO2024044703A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for antigenic epitope mapping in biological samples
WO2024081212A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 10X Genomics, Inc. In vitro transcription of spatially captured nucleic acids
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples

Family Cites Families (817)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US468319A (en) 1892-02-09 Reuben m
US4683A (en) 1846-08-08 waring and richard e
US4514388A (en) 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
US4574729A (en) 1984-08-06 1986-03-11 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Chamber block for a cytocentrifuge having centrifugal force responsive supernatant withdrawal means
US5061049A (en) 1984-08-31 1991-10-29 Texas Instruments Incorporated Spatial light modulator and method
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4883867A (en) 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4968601A (en) 1988-02-09 1990-11-06 The United States Of America As Represented By The Dept. Of Health & Human Services Method for diagnosing latent viral infection
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5002882A (en) 1989-04-27 1991-03-26 New England Biolabs, Inc. Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase
RU2145635C1 (ru) * 1989-05-18 2000-02-20 Чирон Корпорейшн Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5559032A (en) 1990-06-29 1996-09-24 Pomeroy; Patrick C. Method and apparatus for post-transfer assaying of material on solid support
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5183053A (en) 1991-04-12 1993-02-02 Acuderm, Inc. Elliptical biopsy punch
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US6759226B1 (en) 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
DE69219610T2 (de) 1991-09-16 1997-10-02 Molecular Probes Inc Dimere unsymmetrische Cyaninfarbstoffe
US5321130A (en) 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain
US5308751A (en) 1992-03-23 1994-05-03 General Atomics Method for sequencing double-stranded DNA
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5410030A (en) 1993-04-05 1995-04-25 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes containing pyridinium moieties
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
WO1995004069A1 (en) 1993-07-30 1995-02-09 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US5610287A (en) 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
KR100230718B1 (ko) 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
CA2195562A1 (en) 1994-08-19 1996-02-29 Pe Corporation (Ny) Coupled amplification and ligation method
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
KR960022566A (ko) 1994-12-30 1996-07-18 김충환 신규한 아미노올리고당 유도체 및 그의 제조방법
US5736351A (en) 1995-01-09 1998-04-07 New Horizons Diagnostics Corporation Method for detection of contaminants
US5959098A (en) * 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5928928A (en) 1995-06-07 1999-07-27 Universiteit Van Amsterdam Human chitinase, its recombinant production, its use for decomposing chitin, its use in therapy or prophylaxis against infection diseases
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
CA2232230C (en) 1995-10-13 2005-06-28 Ralph H. Lambalot Phosphopantetheinyl transferases and uses thereof
US5716825A (en) 1995-11-01 1998-02-10 Hewlett Packard Company Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS
US5763175A (en) * 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6300063B1 (en) 1995-11-29 2001-10-09 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5962271A (en) * 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US6875572B2 (en) 1996-01-24 2005-04-05 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection assays
US6913881B1 (en) 1996-01-24 2005-07-05 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting target sequences
EP0920440B1 (en) 1996-02-09 2012-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
WO1997045559A1 (en) 1996-05-29 1997-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US20050003431A1 (en) 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US6221654B1 (en) 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
DE19639673A1 (de) 1996-09-27 1998-04-09 Daimler Benz Ag In einem Kraftfahrzeug im Bereich der Frontscheibe angeordnetes Display
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6083761A (en) 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US5837466A (en) 1996-12-16 1998-11-17 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP0968223B1 (en) 1997-01-08 2016-12-21 Sigma-Aldrich Co. LLC Bioconjugation of macromolecules
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
KR100566859B1 (ko) 1997-01-21 2006-04-03 제너럴 하스피톨 코포레이션 Ｒｎａ-단백질 융합물을 이용한 단백질의 선별
US8207093B2 (en) 1997-01-21 2012-06-26 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US5837860A (en) 1997-03-05 1998-11-17 Molecular Tool, Inc. Covalent attachment of nucleic acid molecules onto solid-phases via disulfide bonds
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US20020058250A1 (en) 1997-03-21 2002-05-16 Marshall, Gerstein & Borun Extraction and utilisation of vntr alleles
DE69824716D1 (de) 1997-04-01 2004-07-29 Manteia S A Methode zur sequenzierung von nukleinsäuren
ES2563643T3 (es) 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US5919626A (en) 1997-06-06 1999-07-06 Orchid Bio Computer, Inc. Attachment of unmodified nucleic acids to silanized solid phase surfaces
WO1999005295A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Thomas Jefferson University Composition and method for targeted integration into cells
CA2300940A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
GB9718455D0 (en) 1997-09-02 1997-11-05 Mcgregor Duncan P Chimeric binding peptide library screening method
JP2001519538A (ja) * 1997-10-10 2001-10-23 プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ 核酸アレイのレプリカ増幅
US7456012B2 (en) 1997-11-06 2008-11-25 Cellectricon Ab Method and apparatus for spatially confined electroporation
US6054274A (en) 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
AU2003200718B2 (en) 1997-12-15 2006-10-19 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic biochip
EP1865074B1 (en) 1997-12-22 2011-04-20 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
US6844158B1 (en) 1997-12-22 2005-01-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
WO1999042813A1 (en) 1998-02-23 1999-08-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and apparatus for synthesis of arrays of dna probes
AU754047B2 (en) 1998-02-25 2002-10-31 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling
US6699710B1 (en) 1998-02-25 2004-03-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling
EP1066517B1 (en) 1998-02-25 2006-11-29 THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Cellular arrays for rapid molecular profiling
AU3567099A (en) * 1998-04-16 1999-11-01 Packard Bioscience Company Analysis of polynucleotide sequence
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
US6358475B1 (en) 1998-05-27 2002-03-19 Becton, Dickinson And Company Device for preparing thin liquid for microscopic analysis
WO1999063385A1 (en) 1998-06-04 1999-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Digital optical chemistry micromirror imager
JP2000010058A (ja) 1998-06-18 2000-01-14 Hamamatsu Photonics Kk 空間光変調装置
EP2360271A1 (en) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
WO2000000637A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Visible Genetics Inc. Method for sequencing nucleic acids with reduced errors
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US20040106110A1 (en) 1998-07-30 2004-06-03 Solexa, Ltd. Preparation of polynucleotide arrays
DE69900949T2 (de) 1998-09-18 2002-10-02 Micromet Ag Dns amplifizierung aus einzelnen zellen
US6159736A (en) 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
US6337472B1 (en) 1998-10-19 2002-01-08 The University Of Texas System Board Of Regents Light imaging microscope having spatially resolved images
WO2000024940A1 (en) 1998-10-28 2000-05-04 Vysis, Inc. Cellular arrays and methods of detecting and using genetic disorder markers
US6391937B1 (en) 1998-11-25 2002-05-21 Motorola, Inc. Polyacrylamide hydrogels and hydrogel arrays made from polyacrylamide reactive prepolymers
ATE354675T1 (de) 1998-12-02 2007-03-15 Adnexus Therapeutics Inc Dna-protein fusionen sowie anwendungen derselben
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
AU772281B2 (en) 1998-12-14 2004-04-22 Li-Cor Inc. A system and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis
US6830884B1 (en) 1998-12-15 2004-12-14 Molecular Staging Inc. Method of amplification
ATE440148T1 (de) 1999-01-06 2009-09-15 Callida Genomics Inc Verbesserte sequenzierung mittels hybridisierung durch verwendung von sondengemischen
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
EP1024201B1 (en) 1999-01-27 2003-11-26 Commissariat A L'energie Atomique Microassay for serial analysis of gene expression and applications thereof
US6157432A (en) 1999-01-29 2000-12-05 Hewlett-Packard Company Heated ferroelectric liquid crystal spatial light modulator with improved contrast, improved grayscale resolution, and decreased pixel sticking when operated in a non-DC balanced mode
US20020150909A1 (en) 1999-02-09 2002-10-17 Stuelpnagel John R. Automated information processing in randomly ordered arrays
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6153389A (en) 1999-02-22 2000-11-28 Haarer; Brian K. DNA additives as a mechanism for unambiguously marking biological samples
US20050181440A1 (en) 1999-04-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US6673620B1 (en) 1999-04-20 2004-01-06 Cytologix Corporation Fluid exchange in a chamber on a microscope slide
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
AU4476900A (en) 1999-04-20 2000-11-02 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
WO2000065094A2 (en) 1999-04-22 2000-11-02 The Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Assay of gene expression patterns by multi-fluor fish
US7276336B1 (en) 1999-07-22 2007-10-02 Agilent Technologies, Inc. Methods of fabricating an addressable array of biopolymer probes
US20010055764A1 (en) 1999-05-07 2001-12-27 Empedocles Stephen A. Microarray methods utilizing semiconductor nanocrystals
US6620584B1 (en) 1999-05-20 2003-09-16 Illumina Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6136592A (en) 1999-06-25 2000-10-24 Leighton; Stephen B. Multiple micro-arrays
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
WO2001006012A1 (en) 1999-07-14 2001-01-25 Packard Bioscience Company Derivative nucleic acids and uses thereof
JP4137444B2 (ja) * 1999-07-26 2008-08-20 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッドステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ザ ナショナル インステ 細胞分析用の捕捉領域を有する層状装置
EP1198583A1 (en) 1999-08-02 2002-04-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutant tn5 transposase enzymes and method for their use
WO2001012855A2 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Yale University Binary encoded sequence tags
US7604996B1 (en) * 1999-08-18 2009-10-20 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
EP1212599A2 (en) 1999-08-30 2002-06-12 Illumina, Inc. Methods for improving signal detection from an array
DK1218542T3 (da) 1999-09-13 2004-08-02 Nugen Technologies Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til lineær isotermisk amplifikation af polynukleotidsekvenser
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
EP1218529B1 (en) 1999-09-17 2006-11-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Reverse transfection method
US6291180B1 (en) 1999-09-29 2001-09-18 American Registry Of Pathology Ultrasound-mediated high-speed biological reaction and tissue processing
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
WO2001025188A1 (en) 1999-10-04 2001-04-12 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel carbamates and ureas
WO2001027327A2 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
AU8023500A (en) 1999-10-13 2001-04-23 Mds Sciex System and method for detecting and identifying molecular events in a test sample
US7585632B2 (en) 1999-10-29 2009-09-08 Hologic, Inc. Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6569674B1 (en) 1999-12-15 2003-05-27 Amersham Biosciences Ab Method and apparatus for performing biological reactions on a substrate surface
EP1238286A1 (en) 1999-12-13 2002-09-11 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES High-throughput tissue microarray technology and applications
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US6485926B2 (en) 1999-12-22 2002-11-26 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for measuring protease activity
AU2001238011A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System System for transferring fluid samples through a sensor array
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
WO2001057268A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US20020006617A1 (en) 2000-02-07 2002-01-17 Jian-Bing Fan Nucleic acid detection methods using universal priming
US20010026919A1 (en) 2000-02-08 2001-10-04 Alex Chenchik Nucleic acid assays employing universal arrays
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
AU3839101A (en) 2000-02-15 2001-08-27 Lynx Therapeutics, Inc. Data analysis and display system for ligation-based dna sequencing
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
JP2001284267A (ja) 2000-04-03 2001-10-12 Canon Inc 排気処理方法、プラズマ処理方法及びプラズマ処理装置
JP2003530365A (ja) 2000-04-10 2003-10-14 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート プロテオミック分析
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6291187B1 (en) 2000-05-12 2001-09-18 Molecular Staging, Inc. Poly-primed amplification of nucleic acid sequences
EP1290225A4 (en) * 2000-05-20 2004-09-15 Univ Michigan METHOD FOR PRODUCING A DNA BANK BY POSITIONAL REPRODUCTION
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
JP2004500891A (ja) 2000-06-22 2004-01-15 クリノミクス　バイオサイエンシズ，インク． 凍結組織マイクロアレイ及びその使用法
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences
EP1368460B1 (en) 2000-07-07 2007-10-31 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
US8529743B2 (en) 2000-07-25 2013-09-10 The Regents Of The University Of California Electrowetting-driven micropumping
US7613571B2 (en) 2000-07-28 2009-11-03 Doyle Michael D Method and system for the multidimensional morphological reconstruction of genome expression activity
WO2002014860A1 (en) 2000-08-15 2002-02-21 Discerna Limited Functional protein arrays
DE60134862D1 (de) 2000-08-21 2008-08-28 Apitope Technology Bristol Ltd Tolerogenische Peptide
US6713257B2 (en) 2000-08-25 2004-03-30 Rosetta Inpharmatics Llc Gene discovery using microarrays
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US6942970B2 (en) 2000-09-14 2005-09-13 Zymed Laboratories, Inc. Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment
US20020168639A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-14 Muraca Patrick J. Profile array substrates
WO2002027029A2 (en) 2000-09-27 2002-04-04 Lynx Therapeutics, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
AT411066B (de) 2000-10-24 2003-09-25 Steiner Georg E Verfahren und anordnung zur untersuchung von zellen
EP1348034B1 (en) 2000-11-15 2016-07-20 Minerva Biotechnologies Corporation Oligonucleotide identifiers
WO2002040874A1 (en) 2000-11-16 2002-05-23 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US20030215936A1 (en) 2000-12-13 2003-11-20 Olli Kallioniemi High-throughput tissue microarray technology and applications
US20030017451A1 (en) 2000-12-21 2003-01-23 Hui Wang Methods for detecting transcripts
US7135296B2 (en) 2000-12-28 2006-11-14 Mds Inc. Elemental analysis of tagged biologically active materials
JP4061043B2 (ja) 2000-12-28 2008-03-12 株式会社ポストゲノム研究所 ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法
CA2434139C (en) 2001-01-23 2014-05-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
WO2002059355A2 (en) 2001-01-25 2002-08-01 Tm Bioscience Corporation Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
US20030087232A1 (en) 2001-01-25 2003-05-08 Fred Christians Methods for screening polypeptides
KR20020063359A (ko) 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치
EP1379549A2 (fr) 2001-02-07 2004-01-14 Institut Pasteur Sequence du genome de photorhabdus luminescens souche tto1 et utilisations
US6573051B2 (en) 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
US7297518B2 (en) 2001-03-12 2007-11-20 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
AU785425B2 (en) 2001-03-30 2007-05-17 Genetic Technologies Limited Methods of genomic analysis
US6933117B2 (en) 2001-04-30 2005-08-23 Ventana Medical Systems, Inc. Reagents and methods for automated hybridization
AU2002322457A1 (en) * 2001-06-28 2003-03-03 Illumina, Inc. Multiplex decoding of array sensors with microspheres
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
WO2003008968A2 (en) 2001-07-19 2003-01-30 Signet Laboratories, Inc. Human tissue specific drug screening procedure
US20040091857A1 (en) 2001-07-20 2004-05-13 Nallur Girish N. Gene expression profiling
GB0118031D0 (en) 2001-07-24 2001-09-19 Oxford Glycosciences Uk Ltd Self assembled protein nucleic acid complexes and self assembled protein arrays
US7297778B2 (en) 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
EP1281771B1 (en) 2001-07-31 2006-03-22 Pfizer Products Inc. Phosphodiesterase 10A cell-based assay and sequences
US6696271B2 (en) * 2001-08-23 2004-02-24 The Regents Of The University Of California Frozen tissue microarray technology for analysis of RNA, DNA, and proteins
US7063946B2 (en) 2001-09-10 2006-06-20 Meso Scale Technologies, Llc. Methods, reagents, kits and apparatus for protein function analysis
US20060188875A1 (en) 2001-09-18 2006-08-24 Perlegen Sciences, Inc. Human genomic polymorphisms
US20040019005A1 (en) 2001-10-01 2004-01-29 Jeffrey Van Ness Methods for parallel measurement of genetic variations
US7195913B2 (en) 2001-10-05 2007-03-27 Surmodics, Inc. Randomly ordered arrays and methods of making and using
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US6942972B2 (en) 2001-10-24 2005-09-13 Beckman Coulter, Inc. Efficient synthesis of protein-oligonucleotide conjugates
US20030175947A1 (en) 2001-11-05 2003-09-18 Liu Robin Hui Enhanced mixing in microfluidic devices
CA2466861A1 (en) 2001-11-06 2003-07-10 Agilix Corporation Sensitive coded detection systems
EP1451365A4 (en) 2001-11-13 2006-09-13 Rubicon Genomics Inc DNA AMPLIFICATION AND SEQUENCING WITH DNA MOLECULES CREATED BY RANDOM FRAGMENTATION
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
US7163612B2 (en) 2001-11-26 2007-01-16 Keck Graduate Institute Method, apparatus and article for microfluidic control via electrowetting, for chemical, biochemical and biological assays and the like
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7098041B2 (en) 2001-12-11 2006-08-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Methods to view and analyze the results from diffraction-based diagnostics
AU2003232881A1 (en) 2002-01-16 2003-09-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method and apparatus for image-guided therapy
US7731909B1 (en) 2002-01-22 2010-06-08 Grace Bio-Labs, Inc. Reaction surface array diagnostic apparatus
WO2003069333A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
US20040002090A1 (en) 2002-03-05 2004-01-01 Pascal Mayer Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype
US20030170637A1 (en) 2002-03-06 2003-09-11 Pirrung Michael C. Method of analyzing mRNA splice variants
US7166441B2 (en) 2002-03-12 2007-01-23 Perseptive Biosystems Inc. Method and apparatus for the identification and quantification of biomolecules
US7223371B2 (en) 2002-03-14 2007-05-29 Micronics, Inc. Microfluidic channel network device
JP2005538695A (ja) 2002-04-15 2005-12-22 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 概日リズム障害を治療するためのスクリーニング法および治療法
EP1504111A4 (en) 2002-04-19 2005-11-23 California Inst Of Techn PEPTIDES NUCLEIC ACID PEPTIDE DISPLAY LIBRARS CONTAINING UNNATURELY AMINO-ACID-RESISTANT AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
PT2151250E (pt) 2002-05-06 2013-12-09 Endocyte Inc Agentes de formação de imagem direccionados para vitamina
AU2003302463A1 (en) 2002-05-09 2004-06-18 U.S. Genomics, Inc. Methods for analyzing a nucleic acid
US7375234B2 (en) 2002-05-30 2008-05-20 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
AU2003242605A1 (en) * 2002-06-03 2003-12-19 Pamgene B.V. Novel high density arrays and methods for analyte analysis
US7108976B2 (en) 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
EP1525464A2 (en) 2002-06-18 2005-04-27 Invitrogen Corporation Methods and apparatus for low resistance electrophoresis of prior-cast, hydratable separation media
FR2841063B1 (fr) 2002-06-18 2004-09-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif de deplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces electrostatiques
US7223592B2 (en) 2002-06-21 2007-05-29 Agilent Technologies, Inc. Devices and methods for performing array based assays
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US20050118616A1 (en) 2002-08-16 2005-06-02 Kawashima Tadashi R. Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction
US7205128B2 (en) 2002-08-16 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method for synthesis of the second strand of cDNA
EP3002289B1 (en) 2002-08-23 2018-02-28 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US20040038385A1 (en) 2002-08-26 2004-02-26 Langlois Richard G. System for autonomous monitoring of bioagents
US20070166725A1 (en) 2006-01-18 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Multiplexed diagnostic platform for point-of care pathogen detection
ES2402092T3 (es) 2002-09-11 2013-04-26 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Sistema automatizado para separaciones electroforéticas de alta capacidad de producción
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
WO2004027025A2 (en) 2002-09-20 2004-04-01 New England Biolabs, Inc. Helicase dependent amplification of nucleic acids
US7662594B2 (en) 2002-09-20 2010-02-16 New England Biolabs, Inc. Helicase-dependent amplification of RNA
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US7143785B2 (en) 2002-09-25 2006-12-05 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
US20040259105A1 (en) 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
JP2006512300A (ja) 2002-10-03 2006-04-13 エピミューン インコーポレイテッド Ｈｌａ結合ペプチド及びその使用
US20040067492A1 (en) 2002-10-04 2004-04-08 Allan Peng Reverse transcription on microarrays
AU2003291659A1 (en) 2002-10-31 2004-06-07 University Of Massachusetts Rapid cell block embedding method and apparatus
US7122384B2 (en) 2002-11-06 2006-10-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Resonant light scattering microparticle methods
CA2509520C (en) 2002-12-12 2013-08-20 Chiron Corporation Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of west nile virus
WO2004059283A2 (en) 2002-12-18 2004-07-15 West Virginia University Research Corporation Apparatus and method for edman degradation using a microfluidic system
KR20040062847A (ko) 2003-01-03 2004-07-09 삼성전자주식회사 핵산 어레이의 복제방법
US7547380B2 (en) 2003-01-13 2009-06-16 North Carolina State University Droplet transportation devices and methods having a fluid surface
GB0302058D0 (en) 2003-01-29 2003-02-26 Univ Cranfield Replication of nucleic acid arrays
ES2396245T3 (es) 2003-01-29 2013-02-20 454 Life Sciences Corporation Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos
EP2365095A1 (en) 2003-02-26 2011-09-14 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
DK1601450T3 (da) 2003-03-10 2013-09-08 Expression Pathology Inc Flydende vævspræparat ud fra histopatologisk bearbejdede biologiske prøver, væv og celler
FR2852317B1 (fr) 2003-03-13 2006-08-04 Biopuces a sondes et leurs methodes d'utilisation
US7083980B2 (en) 2003-04-17 2006-08-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Tn5 transposase mutants and the use thereof
CN1300333C (zh) 2003-04-17 2007-02-14 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用
US7267994B2 (en) 2003-04-28 2007-09-11 Regents Of The University Of California Element-coded affinity tags
US20040219588A1 (en) 2003-04-30 2004-11-04 Masaru Furuta Method for dispensing reagents onto biological samples and method for analyzing biological samples
US7666612B2 (en) 2003-05-23 2010-02-23 Epfl-Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Methods for protein labeling based on acyl carrier protein
EP1628753A1 (en) 2003-05-30 2006-03-01 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and spr detection
US20050026188A1 (en) 2003-05-30 2005-02-03 Van Kessel Andrew G. Methods of identifying, characterizing and comparing organism communities
WO2005047543A2 (en) 2003-06-10 2005-05-26 Applera Corporation Ligation assay
US20060216775A1 (en) 2003-06-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of Califoenia Compositions and methods for analysis and manipulation of enzymes in biosynthetic proteomes
EP1636337A4 (en) 2003-06-20 2007-07-04 Illumina Inc METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR THE AMPLIFICATION AND GENOTYPING OF THE GENOME
US20070128656A1 (en) 2003-06-26 2007-06-07 University Of South Florida Direct Fluorescent Label Incorporation Via 1st Strand cDNA Synthesis
US7627171B2 (en) 2003-07-03 2009-12-01 Videoiq, Inc. Methods and systems for detecting objects of interest in spatio-temporal signals
CA2530810A1 (en) 2003-07-03 2005-01-27 The Regents Of The University Of California Genome mapping of functional dna elements and cellular proteins
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
WO2005010494A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Jie Wu Multiplexed analyte detection
WO2005017186A2 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Thomas Jefferson University Method for rapid identification of alternative splicing
US20050031176A1 (en) 2003-08-08 2005-02-10 Hertel Sarah R. Method and apparatus of multi-modality image fusion
US20050037362A1 (en) 2003-08-11 2005-02-17 Eppendorf Array Technologies, S.A. Detection and quantification of siRNA on microarrays
WO2005021794A2 (en) 2003-09-02 2005-03-10 Keygene N.V. Ola-based methods for the detection of target nucleic acid sequences
WO2005074417A2 (en) 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
CA2536565A1 (en) 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US20050266417A1 (en) 2003-09-12 2005-12-01 Francis Barany Methods for identifying target nucleic acid molecules
EP1670939B1 (en) 2003-09-18 2009-11-04 Nuevolution A/S A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
US7541166B2 (en) 2003-09-19 2009-06-02 Microfluidic Systems, Inc. Sonication to selectively lyse different cell types
US20050226780A1 (en) 2003-09-19 2005-10-13 Donald Sandell Manual seal applicator
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
JP2007508552A (ja) 2003-10-10 2007-04-05 プロテイン・デイスカバリー・インコーポレーテツド マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ｍａｌｄｉ）質量分析法（ｍｓ）を包含する化学分析のための被検体の濃縮および精製のための方法および装置
CN100478075C (zh) 2003-11-17 2009-04-15 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于操纵流体实体的系统
CA2545553A1 (en) 2003-11-21 2005-06-09 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing olfactory gpcrs
CA2545006C (en) 2003-12-12 2013-09-17 Saint Louis University Biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US7259258B2 (en) 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
US20050136414A1 (en) 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
US20050147976A1 (en) 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
AU2005222776A1 (en) 2003-12-31 2005-09-29 Genimmune N.V. Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
EP1701785A1 (en) 2004-01-07 2006-09-20 Solexa Ltd. Modified molecular arrays
US7569392B2 (en) 2004-01-08 2009-08-04 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
WO2005067648A2 (en) 2004-01-08 2005-07-28 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
CA2552858A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Lingvitae As Improving polynucleotide ligation reactions
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
US7378242B2 (en) 2004-03-18 2008-05-27 Atom Sciences, Inc. DNA sequence detection by limited primer extension
FR2868638B1 (fr) 2004-03-30 2006-05-19 Sagem Procede d'echange d'informations entre deux reseaux fonctionnant sous des protocoles de routages differents
KR100624420B1 (ko) 2004-04-10 2006-09-19 삼성전자주식회사 마이크로어레이에 대한 정보가 스팟의 형태로 저장되어있는 마이크로어레이, 그를 제조하는 방법 및 그를이용하는 방법
CA2563168A1 (en) 2004-04-14 2005-11-17 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
JP4592060B2 (ja) 2004-04-26 2010-12-01 キヤノン株式会社 Ｐｃｒ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するｐｃｒ増幅反応方法
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
WO2005113804A1 (en) 2004-05-20 2005-12-01 Trillion Genomics Limited Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry
JP4751650B2 (ja) 2004-06-11 2011-08-17 株式会社リコー 微小光学素子、この微小光学素子を用いた空間光変調装置及びプロジェクタ装置
US7906276B2 (en) 2004-06-30 2011-03-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Enzymatic detection techniques
FR2872715B1 (fr) 2004-07-08 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Microreacteur goutte
FR2872809B1 (fr) 2004-07-09 2006-09-15 Commissariat Energie Atomique Methode d'adressage d'electrodes
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
JP2006058031A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置
US7776547B2 (en) 2004-08-26 2010-08-17 Intel Corporation Cellular analysis using Raman surface scanning
US20060228758A1 (en) 2004-09-13 2006-10-12 Xencor, Inc. Analysis of MHC-peptide binding interactions
US20060073506A1 (en) * 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
US7476503B2 (en) 2004-09-17 2009-01-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for performing nucleic acid analysis
CN100396790C (zh) 2004-09-17 2008-06-25 北京大学 溶液识别、表面寻址蛋白质芯片及其制备和检测方法
US7524672B2 (en) 2004-09-22 2009-04-28 Sandia Corporation Microfluidic microarray systems and methods thereof
EP1816192B1 (en) 2004-10-15 2012-12-12 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology LINKER FOR CONSTRUCTING mRNA-PUROMYCIN-PROTEIN CONJUGATE
US7527970B2 (en) 2004-10-15 2009-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of identifying active chromatin domains
ES2534304T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
US7183119B2 (en) 2004-11-15 2007-02-27 Eastman Kodak Company Method for sensitive detection of multiple biological analytes
US7745143B2 (en) 2004-11-19 2010-06-29 Plexera, Llc Plasmon resonance biosensor and method
ATE420170T1 (de) 2004-11-22 2009-01-15 Peter Birk Rasmussen Matrizengerichtete split-and-mix-synthese von bibliotheken kleiner moleküle
ITPD20040301A1 (it) 2004-11-26 2005-02-26 Dimensional Srl P Metodo ed apparato per la separazione simultanea di molecole biologiche mediante elettroforesi bidimensionale
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
EP1828412B2 (en) 2004-12-13 2019-01-09 Illumina Cambridge Limited Improved method of nucleotide detection
US20060292586A1 (en) 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
JP2008526877A (ja) 2005-01-05 2008-07-24 エージェンコート パーソナル ジェノミクス 可逆的ヌクレオチドターミネーターおよびその使用
KR100682920B1 (ko) 2005-01-20 2007-02-15 삼성전자주식회사 다중 바이오어세이용 미세유체 칩 및 그 제조방법
US7458661B2 (en) 2005-01-25 2008-12-02 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for promoting the complete transfer of liquid drops from a nozzle
US7579153B2 (en) 2005-01-25 2009-08-25 Population Genetics Technologies, Ltd. Isothermal DNA amplification
EP2237189B1 (en) 2005-01-27 2018-08-01 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Classifying image features
PL1859330T3 (pl) 2005-01-28 2013-01-31 Univ Duke Urządzenia i sposoby manipulacji kropelkami na płytkach obwodów drukowanych
EP2239342A3 (en) 2005-02-01 2010-11-03 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
EP1851551A2 (en) 2005-02-03 2007-11-07 Perkinelmer Las, Inc. Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060199207A1 (en) 2005-02-24 2006-09-07 Matysiak Stefan M Self-assembly of molecules using combinatorial hybridization
GB0504774D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Lingvitae As Method
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
US7776567B2 (en) 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7303880B2 (en) * 2005-03-18 2007-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Microdissection-based methods for determining genomic features of single chromosomes
US7229769B2 (en) 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
EP1712639B1 (en) 2005-04-06 2008-08-27 Maurice Stroun Method for the diagnosis of cancer by detecting circulating DNA and RNA
GB0508983D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Oxford Gene Tech Ip Ltd Cell analyser
JP4990886B2 (ja) 2005-05-10 2012-08-01 ソレックサ リミテッド 改良ポリメラーゼ
US7803541B2 (en) 2005-05-12 2010-09-28 Panomics, Inc. Multiplex branched-chain DNA assays
US20070003954A1 (en) 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
GB0509833D0 (en) 2005-05-16 2005-06-22 Isis Innovation Cell analysis
EP1894012A2 (en) 2005-05-18 2008-03-05 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
CN100526453C (zh) 2005-05-20 2009-08-12 麦克奥迪实业集团有限公司 激光显微切割后细胞收集方法
EP1885890A4 (en) 2005-05-26 2010-01-20 Univ Boston QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS VIA OLIGONUCLEOTIDE MASS LABELS
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
WO2007145612A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
ATE528644T1 (de) 2005-06-07 2011-10-15 Centre Nat Rech Scient Verwendung ionischer matrizen zur analyse von gewebeabschnitten durch maldi-massenspektrometrie
GB0511717D0 (en) 2005-06-09 2005-07-13 Babraham Inst Repeatable protein arrays
CA2611671C (en) 2005-06-15 2013-10-08 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20090264299A1 (en) 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
US20070087360A1 (en) 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
CN104673903B (zh) 2005-06-20 2018-11-13 领先细胞医疗诊断有限公司 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法
US7873193B2 (en) 2005-06-21 2011-01-18 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Serial section analysis for computer-controlled microscopic imaging
ATE491045T1 (de) 2005-06-23 2010-12-15 Keygene Nv Strategien mit hohem durchsatz zur identifizierung und zum nachweis von polymorphismen
US20070026430A1 (en) 2005-06-30 2007-02-01 Applera Corporation Proximity probing of target proteins comprising restriction and/or extension
US7883848B2 (en) 2005-07-08 2011-02-08 Olink Ab Regulation analysis by cis reactivity, RACR
JP4822753B2 (ja) 2005-07-11 2011-11-24 一般社団法人オンチップ・セロミクス・コンソーシアム 細胞構成物質分取チップならびに細胞構成物質解析システム及びこれらを用いる細胞構成物質解析法
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US20070023292A1 (en) 2005-07-26 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Small object moving on printed circuit board
US7805081B2 (en) 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
JP2009506772A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 プロメガ コーポレイション 細胞ベースの発光及び非発光プロテアソームアッセイ
WO2007030373A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 St. Jude Children's Research Hospital Method for in situ hybridization analysis
JP2007074967A (ja) 2005-09-13 2007-03-29 Canon Inc 識別子プローブ及びそれを用いた核酸増幅方法
US7741106B2 (en) 2005-09-21 2010-06-22 Moyle William R Sensors for biomolecular detection and cell classification
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
JP5237099B2 (ja) 2005-09-29 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 変異させた集団のハイスループットスクリーニング
WO2007041689A2 (en) 2005-10-04 2007-04-12 President And Fellows Of Harvard College Methods of site-specific labeling of molecules and molecules produced thereby
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
US20070116612A1 (en) 2005-11-02 2007-05-24 Biopath Automation, L.L.C. Prefix tissue cassette
EP1951905B1 (en) 2005-11-10 2012-04-11 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
ATE527383T1 (de) 2005-11-22 2011-10-15 Stichting Dienst Landbouwkundi Multiplex-nukleinsäurenachweis
WO2007060599A1 (en) 2005-11-25 2007-05-31 Koninklijke Philips Electronics N.V. Magnetic biosensor for determination of enzymic activity
WO2007100392A2 (en) 2005-11-30 2007-09-07 Biotium, Inc. Enzyme substrate comprising a functional dye and associated technology and methods
US20070161029A1 (en) 2005-12-05 2007-07-12 Panomics, Inc. High throughput profiling of methylation status of promoter regions of genes
US7803751B2 (en) 2005-12-09 2010-09-28 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting phosphomonoester
DE102005060738A1 (de) 2005-12-16 2007-06-21 Qiagen Gmbh Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben
US20070141718A1 (en) 2005-12-19 2007-06-21 Bui Huy A Reduction of scan time in imaging mass spectrometry
US20070178503A1 (en) 2005-12-19 2007-08-02 Feng Jiang In-situ genomic DNA chip for detection of cancer
MX364297B (es) 2005-12-21 2019-04-22 Meso Scale Technologies Llc Modulos de ensayo que tienen reactivos de ensayo y metodos para hacer y utilizar los mismos.
WO2007073165A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection
JP5198284B2 (ja) 2005-12-22 2013-05-15 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 高処理量配列決定技術を使用する転写産物の特徴づけのための改良された戦略
WO2007076128A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
ES2402939T3 (es) 2005-12-23 2013-05-10 Nanostring Technologies, Inc. Composiciones que comprenden macromoléculas inmovilizadas y orientadas y métodos para su preparación
WO2007073271A1 (en) 2005-12-23 2007-06-28 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method and apparatus for solving data packet traffic congestion.
CN101395281B (zh) 2006-01-04 2013-05-01 骆树恩 用于核酸作图和鉴定核酸的精细结构变化的方法以及用途
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
US20070251824A1 (en) 2006-01-24 2007-11-01 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexed analyte quantitation by two-dimensional planar electrochromatography
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
JP5180845B2 (ja) 2006-02-24 2013-04-10 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
DK1991698T3 (en) 2006-03-01 2014-03-10 Keygene Nv "High-throughput" -sekvensbaseret detection of SNPs using ligeringsassays
JP2007248396A (ja) 2006-03-17 2007-09-27 Toshiba Corp 核酸検出用デバイスおよび核酸検出装置
US20080009420A1 (en) 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
WO2007111937A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Applera Corporation Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
CN101460953B (zh) 2006-03-31 2012-05-30 索雷克萨公司 用于合成分析的序列的系统和装置
ES2545264T3 (es) 2006-04-04 2015-09-09 Keygene N.V. Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
DE602006018794D1 (de) 2006-04-18 2011-01-20 Advanced Liquid Logic Inc Biochemie auf tröpfchenbasis
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
WO2007127458A2 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Nsabp Foundation, Inc. Methods of whole genome or microarray expression profiling using nucleic acids
EP2677039B8 (en) 2006-05-10 2022-10-05 DxTerity Diagnostics Incorporated Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
JP2007304043A (ja) 2006-05-15 2007-11-22 Canon Inc プローブ固定担体の製造方法
ES2620398T3 (es) 2006-05-22 2017-06-28 Nanostring Technologies, Inc. Sistemas y métodos para analizar nanoindicadores
US20080132429A1 (en) 2006-05-23 2008-06-05 Uchicago Argonne Biological microarrays with enhanced signal yield
CN107573445B (zh) 2006-05-27 2021-05-25 富鲁达加拿大公司 聚合物骨架元素标签
US8921073B2 (en) 2006-06-23 2014-12-30 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of DNA cluster arrays
US9149564B2 (en) 2006-06-23 2015-10-06 The Regents Of The University Of California Articles comprising large-surface-area bio-compatible materials and methods for making and using them
US8178316B2 (en) 2006-06-29 2012-05-15 President And Fellows Of Harvard College Evaluating proteins
JP2009542222A (ja) 2006-06-29 2009-12-03 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ チャンバー装置
US8362242B2 (en) 2006-06-30 2013-01-29 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Analyte determination utilizing mass tagging reagents comprising a non-encoded detectable label
US7858305B2 (en) 2006-06-30 2010-12-28 The Invention Science Fund I, Llc Method of combing a nucleic acid
AT503862B1 (de) 2006-07-05 2010-11-15 Arc Austrian Res Centers Gmbh Pathogen-identifizierung anhand eines 16s oder 18s-rrna mikroarray
US7955644B2 (en) 2006-07-10 2011-06-07 California Institute Of Technology Method for selectively anchoring large numbers of nanoscale structures
EP2040082A4 (en) 2006-07-10 2014-04-23 Hitachi High Tech Corp LIQUID TRANSFER DEVICE
EP1878502A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 Roche Diagnostics GmbH Instrument for heating and cooling
CN101522915A (zh) 2006-08-02 2009-09-02 加州理工学院 用于检测和/或分选靶标的方法和系统
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008022332A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Board Of Regents, The University Of Texas System System, method and kit for replicating a dna array
US20080047835A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Macconnell William P Genomic DNA Purifier
WO2008028160A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
US8568979B2 (en) 2006-10-10 2013-10-29 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization
WO2008051530A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US9266076B2 (en) 2006-11-02 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for real-time feedback control of electrical manipulation of droplets on chip
US20080108804A1 (en) 2006-11-02 2008-05-08 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS
US20110045462A1 (en) 2006-11-14 2011-02-24 The Regents Of The University Of California Digital analysis of gene expression
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US7655898B2 (en) 2006-11-30 2010-02-02 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Optical filter assembly with selectable bandwidth and rejection
CN102851369B (zh) 2006-12-13 2015-01-21 卢米耐克斯公司 用于实时pcr多重分析的系统和方法
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
CN101221182A (zh) * 2007-01-08 2008-07-16 山东司马特生物芯片有限公司 一种荧光蛋白质芯片血清肿瘤系列诊断新方法
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080220434A1 (en) 2007-02-07 2008-09-11 Perscitus Biosciences, Llc Detection Of Molecule Proximity
AU2008216303A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Proteonova, Inc. Generation of library of soluble random polypeptides linked to mRNA
KR100819006B1 (ko) 2007-02-13 2008-04-03 삼성전자주식회사 마이크로 어레이용 마스크 세트, 이의 제조 방법, 및마스크 세트를 이용한 마이크로 어레이의 제조 방법
US7919631B2 (en) 2007-02-14 2011-04-05 Eastman Chemical Company Production of ionic liquids
KR101017808B1 (ko) 2007-04-04 2011-02-28 엔에이치엔(주) 편집 파일 자동 생성 방법 및 그 장치
AU2008237018B2 (en) 2007-04-10 2014-04-03 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
WO2008128111A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Sequenom, Inc. Comparative sequence analysis processes and systems
CA2687804A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 Oregon Health & Science University Microarray systems and methods for identifying dna-binding proteins
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
WO2008151127A1 (en) 2007-06-04 2008-12-11 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for chemical ligation
WO2009002447A1 (en) 2007-06-21 2008-12-31 Gen-Probe Incorporated Instrument and receptacles for use in performing processes
US8926811B2 (en) 2007-06-27 2015-01-06 Digital Biosystems Digital microfluidics based apparatus for heat-exchanging chemical processes
EP2395113A1 (en) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US7534991B2 (en) 2007-07-10 2009-05-19 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Athermalized birefringent filter apparatus and method
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
WO2009018003A2 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Ensemble Discovery Corporation Detection assays and use thereof
JP2009036694A (ja) 2007-08-03 2009-02-19 Tokyo Medical & Dental Univ 空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法
WO2009032167A1 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Illumina Cambridge Method for sequencing a polynucleotide template
US9388457B2 (en) * 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
ITBO20070627A1 (it) 2007-09-14 2009-03-15 Twof Inc Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare
WO2009036525A2 (en) 2007-09-21 2009-03-26 Katholieke Universiteit Leuven Tools and methods for genetic tests using next generation sequencing
US8330087B2 (en) 2007-10-16 2012-12-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral imaging system with dynamic optical correction
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US20090181375A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Peter Brian J Method for detection of nucleic acid barcodes
EP3699291A1 (en) 2008-01-17 2020-08-26 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR20090081260A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
CA2715292C (en) 2008-02-15 2015-11-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Thermal cycler with self-adjusting lid
DE102008014687A1 (de) 2008-03-18 2009-09-24 Smartrac Ip B.V. Lagenverbund für einen Kartenkörper und Verfahren zur Herstellung des Lagenverbunds
WO2009117698A2 (en) * 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
US20090253163A1 (en) 2008-04-02 2009-10-08 General Electric Company Iterative staining of biological samples
DE102008023438B4 (de) 2008-05-14 2011-06-30 Bruker Daltonik GmbH, 28359 Verfahren zur Analyse von Gewebeschnitten
US8093064B2 (en) 2008-05-15 2012-01-10 The Regents Of The University Of California Method for using magnetic particles in droplet microfluidics
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
WO2009148560A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US8199999B2 (en) 2008-06-17 2012-06-12 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Image classifier training
GB0811574D0 (en) 2008-06-24 2008-07-30 Trillion Genomics Ltd Characterising planar samples by mass spectrometry
US8198028B2 (en) 2008-07-02 2012-06-12 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
CA2733609C (en) 2008-08-14 2018-03-06 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
CN102203287B (zh) 2008-08-26 2017-09-19 弗卢迪格姆公司 增加样本和/或靶通量的测定方法
US20100055733A1 (en) 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
EP2163900A1 (en) 2008-09-04 2010-03-17 Commissariat A L'energie Atomique New method of imaging by mass spectrometry and new mass tag associated trityl derivatives
US8586310B2 (en) 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
US20110244448A1 (en) 2008-09-08 2011-10-06 Masataka Shirai Dna detecting apparatus, dna detecting device and dna detecting method
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US20100076185A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Nils Adey Selective Processing of Biological Material on a Microarray Substrate
TW201028432A (en) 2008-09-30 2010-08-01 Abbott Lab Improved antibody libraries
US8361298B2 (en) 2008-10-08 2013-01-29 Sage Science, Inc. Multichannel preparative electrophoresis system
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US9751084B2 (en) 2008-10-28 2017-09-05 Emd Millipore Corporation Biological culture assembly
EP2356259A4 (en) 2008-10-30 2012-11-14 Sequenom Inc PRODUCTS AND METHOD FOR MULTIPLEX IDENTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
CA2742529C (en) 2008-11-03 2016-05-17 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Detecting antigen responsive cells in a sample
CN104195227B (zh) 2008-11-07 2017-04-12 适应生物技术公司 通过序列分析监测状况的方法
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
WO2010065775A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Pressure-assisted molecular recovery (pamr) of biomolecules, pressure-assisted antigen retrieval (paar), and pressure-assisted tissue histology (path)
US20110275077A1 (en) 2009-01-12 2011-11-10 William James Oligonucleotide-Coated Affinity Membranes and Uses Thereof
US8790873B2 (en) 2009-01-16 2014-07-29 Affymetrix, Inc. DNA ligation on RNA template
KR101059565B1 (ko) 2009-02-11 2011-08-26 어플라이드 프레시젼, 인코포레이티드 밝은 기준점 표지를 갖는 마이크로어레이 및 그로부터 광 데이터를 수집하는 방법
US8481698B2 (en) 2009-03-19 2013-07-09 The President And Fellows Of Harvard College Parallel proximity ligation event analysis
US20120010091A1 (en) * 2009-03-30 2012-01-12 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
AU2010232439C1 (en) 2009-04-02 2017-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
WO2010115100A1 (en) 2009-04-03 2010-10-07 L&C Diagment, Inc. Multiplex nucleic acid detection methods and systems
CA2760439A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
WO2011008502A2 (en) 2009-06-29 2011-01-20 California Institute Of Technology Isolation of unknown rearranged t-cell receptors from single cells
RU2410439C1 (ru) 2009-07-06 2011-01-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов
WO2011008831A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Mass tags for spectrometric analysis of immunoglobulins
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
WO2011014879A2 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Prognosys Biosciences, Inc. Assay tools and methods of use
WO2011021102A2 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
US8496798B2 (en) 2009-09-01 2013-07-30 Oregon Health & Science University Reversible current gel electrophoresis device for separating biological macromolecules
SG169918A1 (en) 2009-10-02 2011-04-29 Fluidigm Corp Microfluidic devices with removable cover and methods of fabrication and application
CN102612555A (zh) 2009-10-09 2012-07-25 因威瑟堡善迪诺有限公司 用于检测抗原的装置及其应用
JP5954876B2 (ja) 2009-10-13 2016-07-20 ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノレポーターによるタンパク質の検出
US9005891B2 (en) 2009-11-10 2015-04-14 Genomic Health, Inc. Methods for depleting RNA from nucleic acid samples
KR101358549B1 (ko) 2009-11-13 2014-02-05 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 조절 가능한 체적 수용을 위한 박막 프로세싱 장치
US20120277113A1 (en) 2009-11-18 2012-11-01 Ruo-Pan Huang Array-based proximity ligation association assays
CN106701739A (zh) 2009-12-04 2017-05-24 株式会社日立制作所 基因表达解析用解析装置及设备
SG10201407883PA (en) 2009-12-07 2015-01-29 Illumina Inc Multi-sample indexing for multiplex genotyping
JP2013512691A (ja) 2009-12-07 2013-04-18 プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ペプチド提示アレイ
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
WO2011075083A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Agency For Science, Technology And Research Processing of amplified dna fragments for sequencing
US8889416B2 (en) 2010-01-21 2014-11-18 California Institute Of Technology Methods and devices for micro-isolation, extraction, and/or analysis of microscale components
ES2719502T3 (es) 2010-01-29 2019-07-10 Advanced Cell Diagnostics Inc Métodos de detección in situ de ácidos nucleicos
EP2354242A1 (en) 2010-02-03 2011-08-10 Epiontis GmbH Assay for determining the type and/or status of a cell based on the epigenetic pattern and the chromatin structure
ES2647390T3 (es) 2010-02-11 2017-12-21 Nanostring Technologies, Inc Composiciones y métodos para la detección preferencial de ARN pequeños mediante hibridación con puente y ligación
US9945786B2 (en) 2010-02-18 2018-04-17 Bima Limited Immobilised-bead immunomultiplex assay
WO2011112634A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 California Institute Of Technology Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells
JP5665021B2 (ja) 2010-03-08 2015-02-04 国立大学法人東京農工大学 融合ｍｈｃ分子連結磁気微粒子、抗原ペプチドのスクリーニング方法、組換えベクター、及び磁性細菌の形質転換体
US10266876B2 (en) 2010-03-08 2019-04-23 California Institute Of Technology Multiplex detection of molecular species in cells by super-resolution imaging and combinatorial labeling
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US20110245101A1 (en) 2010-04-05 2011-10-06 Prognosys Biosciences, Inc. Co-localization affinity assays
US8462981B2 (en) 2010-04-07 2013-06-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral unmixing for visualization of samples
WO2011143556A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Gen9, Inc. Methods for nucleotide sequencing and high fidelity polynucleotide synthesis
US20130059741A1 (en) 2010-05-13 2013-03-07 Illumina, Inc. Binding assays for markers
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
CN102933721B (zh) 2010-06-09 2015-12-02 凯津公司 用于高通量筛选的组合序列条形码
EP2588144B1 (en) 2010-07-02 2018-05-09 Ventana Medical Systems, Inc. Detecting targets using mass tags and mass spectrometry
WO2012012772A2 (en) 2010-07-22 2012-01-26 The Johns Hopkins University Drug eluting hydrogels for catheter delivery
CA2806621C (en) 2010-08-05 2018-09-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Enhancing visual assessment of samples
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
GB201013767D0 (en) 2010-08-17 2010-09-29 Isis Innovation Identification of ligands and their use
ES2595433T3 (es) 2010-09-21 2016-12-30 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
CA2810931C (en) 2010-09-24 2018-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US9110079B2 (en) 2010-09-29 2015-08-18 Biomerieux Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS
CA2814049C (en) 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US10669569B2 (en) 2010-10-15 2020-06-02 Navinci Diagnostics Ab Dynamic range methods
ES2648564T3 (es) 2010-10-21 2018-01-04 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos
CA2815076C (en) 2010-10-22 2021-01-12 Cold Spring Harbor Laboratory Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information
EP2632593B1 (en) 2010-10-27 2021-09-29 Illumina, Inc. Flow cells for biological or chemical analysis
JP5978220B2 (ja) * 2010-10-29 2016-08-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸ナノ構造バーコードプローブ
EP2635679B1 (en) 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US20130184184A1 (en) 2010-11-22 2013-07-18 The University Of Chicago Methods and/or Use of Oligonucleotide Conjugates Having Varied Degrees of Labeling for Assays and Detections
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
EP2652155B1 (en) 2010-12-16 2016-11-16 Gigagen, Inc. Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
SG191818A1 (en) 2010-12-30 2013-08-30 Foundation Medicine Inc Optimization of multigene analysis of tumor samples
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
BR112013018924A2 (pt) 2011-01-25 2018-05-08 Almac Diagnostics Ltd assinaturas de expressão gênica de câncer de cólon e métodos de uso
EP2675916B1 (en) 2011-02-15 2016-08-24 Leica Biosystems Newcastle Limited METHOD FOR LOCALIZED IN SITU DETECTION OF mRNA
EP2689028B1 (en) 2011-03-23 2017-08-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
EP3150750B1 (en) 2011-04-08 2018-12-26 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide constructs and assay systems
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
ES2625288T3 (es) 2011-04-15 2017-07-19 The Johns Hopkins University Sistema de secuenciación segura
US8946389B2 (en) 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
AU2012251027B2 (en) 2011-05-04 2015-03-26 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection Assay (qNPA) and sequencing (qNPS) improvements
EP2707507B1 (en) 2011-05-09 2017-11-01 Fluidigm Corporation Probe based nucleic acid detection
AU2012255121B2 (en) 2011-05-17 2017-03-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
CA2835942C (en) 2011-05-19 2019-01-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
GB201108678D0 (en) 2011-05-24 2011-07-06 Olink Ab Multiplexed proximity ligation assay
RU2013153507A (ru) 2011-06-06 2015-07-20 Биокарти Нв Селективный лизис клеток с помощью ионных поверхностно-активных веществ
WO2012174535A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Constitution Medical, Inc. Solutions for histoprocessing of biological samples
US8728987B2 (en) 2011-08-03 2014-05-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Filtering small nucleic acids using permeabilized cells
WO2013033271A2 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Derren Barken Method to augment immune system in response to disease or injury
WO2013030620A2 (de) 2011-08-30 2013-03-07 Jacobs University Bremen Ggmbh Gen codiert für ein mhc-klasse-i-molekül, plasmid, expressionssystem protein, multimer, reagenz und kit zum analysieren einer t-zellen-frequenz
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
HUE056246T2 (hu) 2011-09-23 2022-02-28 Illumina Inc Készítmények nukleinsav-szekvenáláshoz
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US8987174B2 (en) 2011-10-28 2015-03-24 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for manufacturing molecular arrays
CA3003082C (en) 2011-10-28 2020-12-15 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
US8637242B2 (en) 2011-11-07 2014-01-28 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
WO2013085710A2 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
US20150031553A1 (en) 2011-12-13 2015-01-29 Sequenta, Inc. Method of measuring immune activation
EP4108782B1 (en) 2011-12-22 2023-06-07 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US9803188B2 (en) 2011-12-22 2017-10-31 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
CA2863257C (en) 2012-02-14 2021-12-14 Cornell University Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
PL2814959T3 (pl) 2012-02-17 2018-07-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Kompozycje i sposoby do dokładnej identyfikacji mutacji
NO2694769T3 (zh) 2012-03-06 2018-03-03
WO2013138536A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Swift Biosciences, Inc. Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase
WO2013138510A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Patel Abhijit Ajit Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing
HUE051845T2 (hu) 2012-03-20 2021-03-29 Univ Washington Through Its Center For Commercialization Módszerek a tömegesen párhuzamos DNS-szekvenálás hibaarányának csökkentésére duplex konszenzus szekvenálással
PL2831279T3 (pl) 2012-03-26 2023-12-04 The Johns Hopkins University Szybkie wykrywanie aneuploidii
WO2013151622A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
AU2013246050B2 (en) 2012-04-13 2017-03-16 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and quantitation of sample contamination in immune repertoire analysis
WO2013158936A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Sequenta, Inc Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in b-cell acute lymphoblastic leukemia
EP2659977B1 (en) 2012-05-02 2019-04-24 IMEC vzw Microfluidics system for sequencing
IN2014MN02418A (zh) 2012-05-22 2015-08-14 Nanostring Technologies Inc
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP2875350A4 (en) 2012-07-18 2016-05-11 Biolog Dynamics Inc MANIPULATION OF MICROPARTICLES IN DIELECTROPHORETIC REGIONS OF LOW FIELD THICKNESS
CN104508128A (zh) 2012-07-30 2015-04-08 株式会社日立制作所 带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置
EP2883030B1 (en) 2012-08-09 2022-08-31 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
MX364957B (es) 2012-08-14 2019-05-15 10X Genomics Inc Composiciones y metodos para microcapsulas.
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
WO2014031735A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Visualization and measurement of cell compartments
WO2014044724A1 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Qiagen Gmbh Method and kit for preparing a target rna depleted sample
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
CA2886647A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
US9518980B2 (en) 2012-10-10 2016-12-13 Howard Hughes Medical Institute Genetically encoded calcium indicators
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP2722105A1 (en) 2012-10-22 2014-04-23 Universität Wien Method of in situ synthesizing microarrays
EP2920324B1 (en) 2012-11-14 2017-12-27 Olink Bioscience AB Localised rca-based amplification method
US10035920B2 (en) 2012-11-27 2018-07-31 Tufts University Biopolymer-based inks and use thereof
EP2929056A4 (en) 2012-12-10 2016-11-09 Resolution Bioscience Inc METHODS FOR TARGETED GENOMIC ANALYSIS
WO2014110025A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Caliper Life Sciences, Inc. Whole slide multispectral imaging systems and methods
EP2943761B1 (en) 2013-01-10 2023-11-29 Akoya Biosciences, Inc. Multispectral imaging system and methods
US9758828B2 (en) 2013-01-31 2017-09-12 Cornell University Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
WO2014130576A1 (en) 2013-02-19 2014-08-28 Biodot, Inc. Automated fish analysis of tissue and cell samples using an isolating barrier for precise dispensing of probe and other reagents on regions of interest
CA2901641C (en) 2013-02-25 2021-02-09 Biocartis N.V. Isolation of nucleic acids
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2969479B1 (en) 2013-03-13 2021-05-05 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
WO2014152397A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Selective purification of rna and rna-bound molecular complexes
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
CN114107458A (zh) 2013-03-15 2022-03-01 血统生物科学公司 测序免疫组库的方法
US10656149B2 (en) 2013-03-15 2020-05-19 The Trustees Of Princeton University Analyte detection enhancement by targeted immobilization, surface amplification, and pixelated reading and analysis
WO2014151117A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
US20160019337A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Subtyping lung cancers
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
WO2014152281A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Ribosomal ribonucleic acid hybridization for organism identification
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
KR102436171B1 (ko) 2013-06-27 2022-08-24 10엑스 제노믹스, 인크. 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
EP3919624A3 (en) 2013-07-01 2021-12-29 Illumina, Inc. Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
WO2015184386A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Regents Of The University Of California Subcellular western blotting of single cells
AU2015271324B2 (en) 2014-06-06 2019-09-12 Herlev Hospital Determining antigen recognition through barcoding of MHC multimers
US11585806B2 (en) 2014-06-13 2023-02-21 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
US10059990B2 (en) 2015-04-14 2018-08-28 Massachusetts Institute Of Technology In situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples
WO2017013170A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of antigen epitopes and immune sequences recognizing the antigens
WO2017044614A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The Regents Of The University Of California Isoelectric focusing arrays and methods of use thereof
CN109983125A (zh) 2016-08-31 2019-07-05 哈佛学院董事及会员团体 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法
CN109923216A (zh) 2016-08-31 2019-06-21 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
EP4026905B1 (en) 2016-10-19 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
WO2020047005A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US20210324457A1 (en) 2018-08-28 2021-10-21 Eswar Prasad Ramachandran Iyer Methods for Generating Spatially Barcoded Arrays
WO2020047010A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN113366311A (zh) 2018-09-28 2021-09-07 丹麦技术大学 使用可加载的检测分子的高通量表位鉴定和t细胞受体特异性测定
EP3864173A4 (en) 2018-10-10 2022-07-20 Readcoor, LLC SURFACE DETECTION OF TARGETS
US20210189475A1 (en) 2018-12-10 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US20230242976A1 (en) 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
US20220049293A1 (en) 2018-12-10 2022-02-17 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
DE102018132378A1 (de) 2018-12-17 2020-06-18 Hamm Ag Bodenbearbeitungsmaschine
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20220267844A1 (en) 2019-11-27 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
WO2020176882A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and methods for increasing droplet formation efficiency
US20230143569A1 (en) 2019-02-28 2023-05-11 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
US20220145361A1 (en) 2019-03-15 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20220017951A1 (en) 2019-03-22 2022-01-20 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2020219901A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 10X Genomics, Inc. Imaging support devices
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20210140982A1 (en) 2019-10-18 2021-05-13 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of brain disorders and methods of using the same
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20210199660A1 (en) 2019-11-22 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Biomarkers of breast cancer
CN115135984A (zh) 2019-12-23 2022-09-30 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US20210198741A1 (en) 2019-12-30 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of heart disorders and methods of using the same
US20220348992A1 (en) 2020-01-10 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
EP4087945B1 (en) 2020-01-10 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
US20210214785A1 (en) 2020-01-13 2021-07-15 Spatial Transcriptomics Ab Methods of decreasing background on a spatial array
US20210223227A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Spatial Transcriptomics Ab Electrophoretic system and method for analyte capture
US20210222253A1 (en) 2020-01-21 2021-07-22 10X Genomics, Inc. Identification of biomarkers of glioblastoma and methods of using the same
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
US20210237022A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US20210238664A1 (en) 2020-02-03 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US20230047782A1 (en) 2020-02-07 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US20230081381A1 (en) 2020-02-20 2023-03-16 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
AU2021224760A1 (en) 2020-02-21 2022-09-15 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
US20230265491A1 (en) 2020-05-04 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomic transfer modes
US20230194469A1 (en) 2020-05-19 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021237056A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252576A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
WO2022025965A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
CN116507739A (zh) 2020-09-16 2023-07-28 10X基因组学有限公司 使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
AU2021366701A1 (en) 2020-10-22 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
WO2022098810A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Assay support devices
CN116829733A (zh) 2020-11-06 2023-09-29 10X基因组学有限公司 用于将分析物结合至捕获探针的组合物和方法
EP4244379A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
US20230407404A1 (en) 2020-11-18 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20240076723A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
EP4284942A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
EP4294571A2 (en) 2021-02-19 2023-12-27 10X Genomics, Inc. Modular assay support devices
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022221425A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
US20220333192A1 (en) 2021-04-20 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Methods and devices for spatial assessment of rna quality
EP4320271A1 (en) 2021-05-06 2024-02-14 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
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US20230042817A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 10X Genomics, Inc. Analyte capture from an embedded biological sample
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
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WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
US20230135010A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Sequential analyte capture
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230175045A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample

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