KR101994494B1 - 조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물 - Google Patents

조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 또는 공간적 검출을 위해 사용되는 방법 및 생성물에 관한 것으로, 특히 다음 단계들로 이루어지는 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 검출 방법에 관한 것이다: (a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자: (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및 (ii) 포획 도메인을 포함하며; (b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고 조직 샘플의 핵산이 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계; (c) 상기 포획 프로브를 연장 또는 결찰 프라이머로서 사용하여 포획된 핵산 분자로부터 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되고; (d) 임의로 상기 태그가 달린 DNA의 상보하는 가닥을 생성하거나 및/또는 임의로 상기 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계; (e) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 또는 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며; 그리고 (f) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.

Description

조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물{METHOD AND PRODUCT FOR LOCALISED OR SPATIAL DETECTION OF NUCLEIC ACID IN A TISSUE SAMPLE}
본 발명은 일반적으로 조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출에 관한 것이다. 핵산은 RNA이거나 DNA일 수 있다. 그러므로 본 발명은 조직 샘플 중의, 예를 들면 개별적인 세포에서 유전자의 위치, 분포, 또는 실제로 어떠한 게놈성 변화 (반드시 유전자에서만 일어나는 것은 아닌)의 위치 또는 분포에 대한 공간적 정보를 얻기 위해 RNA, 예컨대 RNA 전사물 또는 게놈 DNA를 검출 및/또는 분석하는 방법을 제공한다. 그러므로 본 발명은 공간적 게놈학 및 공간적 전사체학을 가능하게 한다.
보다 구체적으로 본 발명은 조직 샘플의 전사체 또는 게놈 및 특히 전역적 전사체 또는 게놈을 검출 및/또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 특히 그 방법은 공간적 발현 또는 분포 또는 위치 패턴이 조직 샘플 내에 보유되어 있는 경우에, 조직 샘플 중의 게놈 서열의 분포, 위치 또는 발현을 분석하기 위한 정량적 및/또는 정성적 방법에 관한 것이다. 그러므로 새로운 방법은 "공간적 전사체학" 또는 "공간적 게놈학"을 수행하기 위한 방법을 제공하며, 그 방법은 사용자로 하여금 조직 샘플에서 발현된 유전자 또는 조직 샘플에 존재하는 유전자 또는 게놈 유전자좌의 발현 패턴, 또는 위치/분포 패턴을 동시에 측정하는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 특히 고처리율의 DNA 서열화 기술과 결합된 어레이 기술을 토대로 하는데, 그것은 조직 샘플 중의 핵산 분자 (예컨대 RNA 또는 DNA 분자), 특히 mRNA 또는 DNA가 포획되고 위치 태그로 표지화되는 것을 가능하게 한다. 이 단계 후에 조직 샘플의 어떠한 부분 및 모든 부분에서 어떤 유전자가 발현되는 지를 측정하기 위해 서열화되고 분석되는 DNA 분자의 합성이 뒤따른다. 유익하게도, 조직 샘플의 각 세포의 개별적인, 별도의, 그리고 특이한 전사체는 동시에 얻어질 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 조직 샘플 내의 개별적인 세포로부터, 그 연구조사된 조직 샘플 내의 공간적 정보를 손실하지 않으면서 고도로 유사한 포괄적인 전사체 특징을 제공한다고 말할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 어레이 및 본 발명의 어레이를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
사람의 신체는 1014개 이상의 세포를 포함하며 250개 이상의 상이한 기관과 조직으로 조직화된다. 복잡한 기관, 예컨대 뇌의 발달 및 조직화는 아직도 다 알려지지 않았고, 따라서 그런 조직의 발달 및 기능을 조절하는 유전자를 조사하고 측정하기 위한 정량적 방법을 사용하여 그런 조직에서 발현된 유전자의 발현을 분석할 필요가 있다. 기관은 그 자체가 조직화되고 유지되어야 할 모든 생체 기능, 예컨대 영양분 수송, 방어 등을 가능하게 하는 분화된 세포의 혼합체이다. 따라서 세포 기능은 특별한 조직 구조 내에 있는 세포의 위치 및 직접적이든 간접적이든 그 조직 내에서 다른 세포와 공유하는 상호작용에 좌우된다. 그러므로 이들 상호작용이 조직 내에서 전사 수준에서 각 세포에 영향을 미치는 방법을 구별할 필요가 있다.
집중적인 RNA 서열화에 의한 최근의 발견으로 대다수의 전사물이 사람 셀라인에서 검출될 수 있고, 사람 단백질-코딩 유전자의 큰 분획 (75%)이 대부분의 조직에서 발현된다는 것이 입증되었다. 유사하게 사람 게놈의 1%의 상세한 연구 결과, 염색체는 어디에서나 전사되고 모든 염기의 대다수가 일차 전사물에 포함된다는 것이 밝혀졌다. 그러므로 전사 기계는 전역적 수준에서 제멋대로인 것으로 설명될 수 있다.
RNA 번역과 분해 등의 속도가 어떠한 한 전사물로부터 생성되는 단백질의 양에 영향을 미칠 것이기 때문에 전사물은 단순히 단백질 풍부를 대변하는 것이라고 잘 알려져 있다. 이런 측면에서, 최근의 사람 기관 및 조직에 대한 항체-기초 분석은 조직 특이성이 공간 및 시간에서 단백질 수준의 정확한 조절에 의해 이루어지고, 신체의 상이한 조직들은, 그것들의 독특한 특성이 어떤 단백질이 발현되느냐보다는 각 단백질이 얼마나 생성되는 지를 조절함으로써 얻어진다는 것을 시사한다.
그러나 계속되는 전역적 연구에서 전사체 및 단백질체 상관관계가 비교되었고, 그 결과 모든 유전자의 대다수가 발현되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도 개별적인 유전자 생성물에 대한 RNA와 단백질 수준의 변화 사이에는 높은 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 그것은 단백질의 기능적 역할의 맥락에서 개별 세포의 전사체를 연구하는 것이 생물학적으로 유용하다는 것을 시사한다.
실제로, 조직학 및 조직에서의 발현 패턴의 분석은 생체의학 연구 및 진단학의 주춧돌이다. 상이한 염색 기술을 활용하는 조직학은 한 세기도 더 이전부터 첫 번째로 건강한 기관의 기본적인 구조적 조직화 및 통상적인 병리학에서 발생하는 변화를 수립하였다. 이 분야에서의 발달은 면역조직화학에 의한 단백질 분포 및 제자리 혼성화에 의한 유전자 발현의 연구 가능성을 초래하였다.
그러나 점점 더 진보된 조직학적 및 유전자 발현 기법의 유사한 발달은 영상화와 전사체 분석의 분리를 초래하였고, 본 발명의 방법이 있기까지 공간 해상도로 전역적인 전사체 분석을 위해 활용가능한 어떠한 실현 가능한 방법은 없었다.
제자리 기법에 대한 대체방법으로서, 또는 그 외의 방법으로, 단백질 및 핵산의 시험관 내 분석을 위한 방법들, 즉 전체 조직 샘플, 단일 세포 유형, 또는 심지어 단일 세포로부터 분자를 추출하고, 상기 추출물에서 예를 들면 ELISA, qPCR 등에 의해 특이한 분자를 정량함으로써 분석하는 방법들이 개발되었다.
유전자 발현의 분석에서 이루어진 최근의 발달은 마이크로어레이 또는 RNA 서열화를 사용하여 조직의 완전한 전사체를 평가할 수 있는 가능성을 유발하였고, 그런 발달은 생물학적 과정에 대한 우리의 이해와 진단학에 대해 중요한 것이 되었다. 그러나 전사체 분석은 전형적으로 전체 조직 (또는 전체 유기체)로부터 추출된 mRNA에 대해 수행되고, 전사체 분석을 위해 보다 작은 조직 영역이나 개별 세포를 수집하기 위한 방법은 전형적으로 노동 집약적이고, 비용이 들며 정확도가 떨어진다.
그러므로 마이크로어레이 또는 차세대 RNA 서열화를 기초로 한 유전자 발현 연구의 대부분은 많은 세포를 함유하고 있는 대표적인 샘플을 사용한다. 그로써 얻어진 결과는 연구조사된 유전자의 평균 발현 수준을 나타낸다. 표현형적으로 상이한 세포의 분리는 어떤 경우에는 전역적인 유전자 발현 플랫폼과 함께 사용되어 왔고 (Tang F et al., Nat Protoc. 2010; 5:516-35; Wang D & Bodovitz S, Trends Biotechnol. 2010; 28:281-90), 그 결과 세포-대-세포 변형에 대한 매우 정확한 정보를 얻을 수 있었다. 그러나 무상 조직에서 고해상도로 전사 활성을 연구하기 위한 고처리율 방법은 아직까지는 활용되지 못하고 있다.
따라서 유전자 발현 패턴을 분석하기 위한 기존의 기법들은 한 번에 하나 또는 소수의 유전자에 대해서만 공간적인 전사 정보를 제공하거나 위치 정보를 잃어버리는 대가로 샘플 중의 모든 유전자에 대한 전사 정보를 제공한다. 그러므로 샘플 중의 각 세포의 전사체를 동시에, 또는 별도로, 그리고 특이하게 측정하기 위한 방법, 즉 공간 해상도를 포함하여 전사체 정보를 줄 수 있는 조직 샘플 중의 전역적 유전자 발현 분석을 가능하게 하는 방법이 필요하다는 것이 명백하고, 본 발명은 그러한 필요를 해결한다.
본 발명의 방법 및 생성물의 신규한 접근법은 샘플 중의 모든 유전자에 대한 전사 정보를, 한편으로 각 전사물에 대한 위치 정보는 보유하면서 얻기 위해 현재 잘 수립되어 있는 어레이 및 서열화 기술을 활용한다. 당업자에게는 이것이 생명 과학의 획기적인 사건을 대표한다는 것이 명백할 것이다. 신기술은 소위 "공간 전사체학"이라는 새로운 장을 여는데, 그것은 모든 다세포 유기체에서 조직 발달 및 조직 및 세포 기능에 대한 우리의 이해에 대해 난해한 결과를 가져오는 것처럼 보인다. 그런 기법은 특히 질병 상태의 원인과 과정에 대한 우리의 이해 및 암과 같은 질병의 효과적인 치료제 개발에 유용할 것이라는 것이 명백할 것이다. 본 발명의 방법은 또한 수많은 의학적 상태의 진단에도 사용될 것이다.
먼저 전사체 분석의 목적을 마음에 새겨두는 한편, 아래에 상세하게 기술되는 바와 같이 본 발명의 원리와 방법은 또한 DNA의 분석에도 적용될 수 있고, 따라서 게놈 분석에도 적용될 수 있다 ("공간 게놈학"). 따라서 본 발명은 광범위하게 일반적인 핵산의 검출 및/또는 분석에 관련된다.
어레이 기술, 특히 마이크로어레이는 소량의 DNA 올리고뉴클레오티드가 유리 표면에 규칙적인 배열로, 소위 "어레이"로 성공적으로 부착되어 있었고, 그것을 45 유전자의 전사를 모니터하기 위해 사용하였던 스탠포드 대학에서의 연구로부터 유래되었다 (Schena M et al, Science.1995; 270:368-9, 371).
그때로부터 전 세계의 연구자들은 마이크로어레이 기술을 사용하여 30,000 건 이상의 논문을 게재하였다. 다중 유형의 마이크로어레이가 다양한 용도를 위해, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형태 (SNP)를 검출하기 위해 또는 돌연변이 게놈의 유전형 또는 재서열에 대해 개발되었고, 그중에서도 마이크로어레이 기술의 중요한 용도는 유전자 발현의 연구조사를 위한 것이었다. 실제로 유전자 발현 마이크로어레이는 특정 샘플에서 발현된 유전자 물질의 수준을 분석하기 위한 수단으로서 제작되었고, 이때 실제로 많은 유전자의 발현 수준을 동시에 비교할 수 있는 가능성도 열렸다. 여러 가지 상업적인 마이크로어레이 플랫폼이 이들 유형의 실험을 위해 활용가능하지만, 또한 소비자 맞춤형 유전자 발현 어레이를 제작하는 것도 가능하게 되었다.
유전자 발현 연구에서 마이크로어레이의 사용은 현재 아주 흔한 일이 된 한편으로 새롭고 보다 포괄적인 소위 "차세대 DNA 서열화" (NGS) 기술이 많은 용도, 예를 들면 심층적인 전사체 분석에서 DNA 마이크로어레이를 대체하기 시작한 것도 명백하다.
초특급 게놈 서열화를 위해 NGS 기술의 개발은 생명 과학에서 획기적인 사건을 대표한다 (Petterson E et al, Genomics. 2009; 93:105-11). 이런 신기술은 DNA 서열화 비용을 극적으로 감소시켰고, 특이한 개체의 게놈을 포함하여 고등 유기체의 게놈을 유례없는 속도로 측정하는 것을 가능하게 하였다 (Wade CM et al Science. 2009; 326: 865-7; Rubin J et al, Nature 2010; 464:587-91). 고처리율 게놈학의 새로운 진보는 생물학 연구의 풍경을 새롭게 조성하였고, 게놈의 완전한 특성확인 외에 전체 전사체를 디지털 및 정량적 방식으로 연구하는 것도 가능하게 하였다. 이들 포괄적인 데이터 세트를 가시화하고 집약하기 위한 생물정보학 도구들도 또한 최근 수년 동안 상당히 개선되었다.
그러나 놀랍게도 조직학, 마이크로어레이 및 NSG 기술의 독특한 조합이 조직 샘플 중의 다중 세포로부터의 포괄적인 전사 또는 게놈 정보를 산출할 수 있고, 그 정보는 2-차원 공간 해상도에 의해 특성확인된다는 것이 발견되었다. 그로써 한 측면으로는 본 발명의 방법은 샘플 중의 단일 세포의 단일 유전자의 발현을, 그 조직 샘플 중에 그대로 세포를 보유하면서 분석하기 위해 사용될 수 있다. 다른 측면으로, 그리고 바람직한 측면으로는, 본 발명의 방법은 샘플 중의 각 및 모든 세포에서, 실질적으로 모든 세포에서 모든 유전자의 발현, 즉 조직 샘플의 전역적인 공간적 발현 패턴을 동시에 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 중간 분석이 수행되는 것을 가능하게 하는 것이 명백할 것이다.
가장 간단한 형태로 본 발명은 다음과 같이 요약하여 설명될 수 있다. 본 발명은 또한 대상 기판, 예컨대 유리 슬라이드 위에 "어레이"를 생성하기 위해 배치될 독특한 위치 태그 (도메인)을 포함하는 역전사 (RT) 프라이머를 필요로 한다. 독특한 위치 태그는 어레이 상에서 RT 프라이머의 위치에 상응한다 (어레이의 피쳐). 얇은 조직 절편이 어레이 위에 놓이고 역전사 반응이 대상 슬라이드 위에 있는 조직 절편에서 수행된다. 조직 샘플에서 그것에 대해 RNA가 결합 (또는 혼성화)하게 되는 RT 프라이머는 cDNA를 얻기 위해 주형으로서 결합된 RNA를 사용하여 연장되고, 따라서 어레이의 표면에 결합된다. RT 프라이머의 독특한 위치 태그의 결과로서, 각 cDNA 가닥은 조직 절편의 주형 RNA의 위치에 대한 정보를 운반한다. 조직 절편은 가시화되거나 영상화될 수 있는데, 예를 들면 염색되거나 사진촬영되고, 그런 다음 혹은 그 전에 cDNA 합성 단계가 있어서 cDNA 분자의 위치 태그가 조직 샘플 내에 있는 위치와의 상관관계를 알게 해 준다. cDNA가 서열화되면, 그 결과 전사체의 정확한 위치 정보를 알 수 있게 된다. 이 과정의 개략적인 흐름은 도 1에 도시된다. 그런 다음 서열 데이터는 조직 샘플의 위치에 매치될 수 있고, 그것은 조직을 가로지르는 관심의 어떠한 유전자의 발현 패턴을 나타낼 경우에, 서열 데이터를 조직 절편과 함께, 예컨대 컴퓨터를 사용하여 가시화하는 것을 가능하게 한다 (도 2). 유사하게, 컴퓨터 스크린 상에서 조직 절편의 상이한 영역을 표시하고, 관심의 어떠한 선택된 영역들 사이에서 차등적으로 발현된 유전자에 대해 정보를 얻는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 방법은 mRNA 집단을 연구하기 위해 현재 방법을 사용하여 얻어진 데이터와는 아주 대조적인 데이터를 유발하는 것이 분명할 것이다. 예를 들어 제자리 혼성화를 토대로 한 방법은 단일 mRNA 전사물의 상대적인 정보만을 제공한다. 그로써 본 발명의 방법은 현재의 제자리 기술을 뛰어넘는 분명한 장점을 나타낸다. 본 발명의 방법으로부터 얻을 수 있는 전역적인 유전자 발현 정보는 또한 풍부한 전사물의 공동 발현 정보 및 정량적 추정을 가능하게 한다. 일반적으로 이것은 어떠한 종에서든지, 예컨대 동물, 식물, 진균류에서 어떠한 조직의 분석에 활용할 수 있는 적용가능한 전략이라는 것이 명백할 것이다.
상기에서 주지된 바와 같이, 그리고 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 이런 기본적인 방법론은 게놈 DNA의 분석에, 예컨대 하나 또는 그 이상의 특이한 돌연변이를 포함하는 조직 샘플 내에서 세포를 확인하기 위해 쉽게 확장될 수 있을 것임이 명백할 것이다. 예를 들어 게놈 DNA는 단편화되어 프라이머 (상술된 RT 프라이머와 동등함)에 혼성화될 수 있어서, 단편화된 DNA의 포획 (예컨대 프라이머에 상보하는 서열을 가지는 어댑터가 단편 DNA에 결찰되거나 단편 DNA가 예를 들면 추가의 뉴클레오티드를 서열 단부에, 예컨대 폴리-A 꼬리에 통합시키는 효소를 사용하여 확장됨으로써 프라이머에 상보하는 서열을 생성할 수 있다) 및 순간포획된 분자에 상보하는 가닥의 합성을 촉진하는 것이 가능해진다. 분석의 나머지 단계들은 상술된 것과 같을 것이다. 그러므로 전사체 분석의 맥락에서 아래에서 설명되는 본 발명의 특정 구체예들은 또한 필요에 따라 게놈 DNA를 분석하는 방법에서도 사용될 수 있다.
상기 설명으로부터 위치 정보를 전사체 또는 게놈 정보와 결합시키는 것에 막대한 가치가 있다는 것이 드러날 것이다. 예를 들어 고해상도로 전역적인 유전자 발현 지도를 그리는 것이 가능하며, 그것은 수많은 용도, 이를테면 암 연구 및 진단시에 유용하게 활용될 것이다.
나아가 본원에서 설명되는 방법들은 조직 샘플의 전역적 전사체의 분석에 대해 기존에 설명된 방법들과는 상당히 다르며, 그런 차이점들은 수많은 장점을 유발하는 것이 명백하다. 본 발명은 조직 절편의 사용이 어레이의 표면에 결합된 프라이머 (예컨대 역전사 프라이머)에 의해 점화된 DNA (예컨대 cDNA)의 합성을 간섭하지 않는다는 놀라운 발견을 근거로 한다.
그러므로 본 발명은 첫 번째 및 가장 광범위한 측면으로 조직 샘플 중의 핵산을 국지적으로 검출하는 방법을 제공하며, 그 방법은 다음 단계들로 이루어진다:
(a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함하며;
(b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고 조직 샘플의 핵산이 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
(c) 상기 포획 프로브를 연장 또는 결찰 프라이머로서 사용하여 포획된 핵산 분자로부터 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되고;
(d) 임의로 상기 태그가 달린 DNA의 상보하는 가닥을 생성하거나 및/또는 임의로 상기 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계;
(e) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 또는 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며;
(f) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
본 발명의 방법은 해당 기술분야에 공지된 공간적 전사체학에 대한 다른 방법을 능가하는 상당한 진보를 나타낸다. 예를 들어 본원에 기술된 방법은 조직 샘플의 모든 전사물의 전역적이고 공간적인 프로필을 유발한다. 더욱이 모든 유전자의 발현은 어레이 상의 각 위치 또는 피쳐에 대해 정량될 수 있고, 그것은 다중 분석이 단일 분석으로부터의 데이터를 토대로 수행될 수 있는 것을 가능하게 한다. 그러므로 본 발명의 방법은 단일 조직 샘플 중의 모든 유전자의 공간적 발현을 검출 및/또는 정량하는 것을 가능하게 만든다. 더욱이 풍부한 전사물은, 예를 들어 표준 마이크로어레이에 유사한 형광에 의해 직접적으로 가시화되지는 않기 때문에, 상기 전사물이 동일한 샘플 중에 매우 상이한 농도로 존재하는 경우에도 단일 샘플의 유전자의 발현을 동시에 측정하는 것이 가능하다.
따라서 두 번째 및 보다 특별한 측면으로, 본 발명은 다음 단계들로 이루어지는, 조직 샘플의 전사체를 측정 및/또는 분석하기 위한 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다:
(a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 역전사효소 (RT) 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함하며;
(b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고 조직 샘플의 RNA가 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
(c) 상기 포획 프로브를 RT 프라이머로서 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 DNA 분자를 생성시키고, 임의로 상기 cDNA 분자를 증폭시키는 단계;
(d) cDNA 분자 및/또는 임의로 그것의 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 방출된 분자는 첫 번째 가닥 및/또는 두 번째 가닥 cDNA 분자 또는 그것의 암플리콘일 수 있고, 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며;
(e) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 어떠한 핵산 분석 방법이든지 분석 단계에서 사용될 수 있다. 전형적으로 그것은 서열화를 포함하지만, 실제 서열 측정을 반드시 수행할 필요는 없다. 예를 들어 서열-특이적 분석 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 서열-특이적 증폭 반응이, 예를 들면 위치 도메인 및/또는 특이한 표적 서열, 예컨대 검출하고자 하는 특별한 표적 DNA에 대해 특이한 (즉 특별한 cDNA/RNA 또는 유전자 등에 상응하는) 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 분석 방법은 서열-특이적 PCR 반응이다.
단계 (e)에서 얻어진 서열 분석 정보는 샘플의 RNA에 대한 공간적 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 다른 말로 표현하면, 서열 분석 정보는 샘플 중의 RNA의위치에 관한 정보를 제공할 수 있다. 이런 공간 정보는 측정된 서열 분석 정보의 본질로부터 유도될 수 있는데, 예를 들면 사용된 조직 샘플과 관련하여 그 자체로 공간적으로 유익할 수 있는 특별한 RNA의 존재를 나타낼 수 있거나, 및/또는 공간 정보 (예컨대 공간적 국지화)는 서열화 정보와 결합된 어레이 상의 조직 샘플의 위치로부터 유도될 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 위치에 서열 분석 정보를, 예컨대 위치 태그 및 조직 샘플 중의 위치에 대한 그것의 상관관계에 의해 단순히 연관짓는 것을 포함한다. 그러나 상술한 것과 같이, 공간 정보는 서열 분석 데이터를 조직 샘플의 영상에 연관지음으로써 편리하게 얻어질 수 있고, 이것은 본 발명의 한 바람직한 구체예를 나타낸다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 다음 단계:
(f) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계를 포함하고, 이때 조직 샘플은 단계 (c)전이나 후에 영상화된다.
가장 광범위한 측면으로 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 검출에 사용될 수 있다. 그러므로 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직 샘플의 모든 전사체 또는 게놈, 예를 들어 조직 샘플의 전역적 전사체를 측정 및/또는 분석하는 데 사용될 수 있다. 그러나 그 방법은 이것에만 한정되는 것은 아니며 모든 또는 부분적인 전사체 또는 게놈을 측정 및/또는 분석하는 것을 포함한다. 그러므로 방법은 전사체 또는 게놈의 부분 또는 하위세트, 예컨대 하위세트의 유전자에 상응하는 유전자, 예를 들면 예컨대 특정 질병 또는 상태, 조직 유형 등에 관련된 특별한 유전자의 세트를 측정 및/또는 분석하는 것을 포함할 수 있다.
다른 측면으로 보자면, 상기에서 정리된 방법의 단계들은 조직 샘플의 공간적으로 규정된 전사체 또는 게놈, 및 특히 공간적으로 얻어진 전역적 전사체 또는 게놈을 얻기 위한 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다.
또는 달리 본 발명의 방법은 핵산, 그것이 조직 샘플 중의 DNA이거나 RNA이거나 그것의 국지화된 또는 공간적인 검출을 위한 방법, 또는 조직 샘플 중의 핵산 (DNA 또는 RNA)의 국지화된 또는 공간적인 측정 및/또는 분석을 위한 방법이라 할 수 있다. 특히 본 방법은 조직 샘플 중의 유전자 발현 또는 게놈 변화의 국지화된 또는 공간적인 검출 또는 측정 및/또는 분석을 위해 사용될 수 있다. 국지화된/공간적인 검출/측정/분석이란 RNA 또는 DNA가 조직 샘플 중의 세포 또는 조직 내에서 그것의 원래 위치 또는 국지화에 위치할 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로 예를 들어 RNA 또는 DNA는 샘플 중의 세포 또는 세포 그룹, 또는 세포 유형에, 또는 조직 샘플 내의 특별한 영역에 위치할 수 있다. RNA 또는 DNA의 원래의 국지화 또는 위치 (또는 달리 표현하면 조직 샘플 중의 RNA 또는 DNA의 국지화 또는 위치), 예컨대 발현된 유전자 또는 게놈 유전자좌는 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 역전사효소 (RT) 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 어레이를 제공하는 것으로 볼 수 있는데, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 RNA를 포획하기 위한 포획 도메인을 포함한다.
관련된 측면으로, 본 발명은 또한 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 역전사효소 (RT) 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하고, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 RNA를 포획하기 위한 포획 도메인을 포함하는 어레이를, 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 RNA를 포획하기 위하여 사용하는 용도를 제공한다.
바람직하게는 상기 용도는 조직 샘플의 전사체 및 특히 전역적인 전사체를 측정 및/또는 분석하기 위한 것이고, 추가로 다음 단계들을 포함한다:
(a) 포획된 RNA 분자로부터 상기 포획 프로브를 RT 프라이머로서 사용하여 cDNA 분자를 생성시키고, 임의로 그 cDNA 분자를 증폭시키는 단계;
(b) cDNA 분자 및/또는 임의로 그것의 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 방출된 분자는 첫 번째 가닥 및/또는 두 번째 가닥 cDNA 분자 또는 그것의 암플리콘일 수 있고, 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며;
(c) 방출된 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계; 그리고 임의로
(d) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관시키는 단계, 이때 조직 샘플은 단계 (a) 전 또는 후에 영상화된다.
그러므로 본 발명의 어레이는 그 어레이와 접촉하게 되는 조직 샘플의 RNA, 예컨대 mRNA를 포획하기 위해 사용될 수 있는 것을 알 수 있을 것이다. 어레이는 또한 조직 샘플의 부분적인 또는 전역적인 전사체를 측정 및/또는 분석하기 위해 또는 조직 샘플의 공간적으로 규정된 부분 또는 전역적인 전사체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 하나 또는 그 이상의 유전자의 공간적 발현을 정량하는 방법으로도 간주될 수 있다. 달리 표현하면 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 하나 또는 그 이상의 유전자의 공간적 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 또 다르게는 본 발명의 방법은 조직 샘플 내의 하나 또는 그 이상의 위치에서 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 동시에 측정하기 위해 사용될 수 있다. 또 달리 표현하면 본 발명의 방법은 2-차원적인 공간 해상도로 조직 샘플의 부분 또는 전역적인 전사체 분석을 위한 방법으로 볼 수 있다.
RNA는 세포에서 발생할 수 있는 모든 RNA 분자일 수 있다. 그러므로 그것은 mRNA, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA, 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 인 (nucleolar) RNA (snoRNA), 마이크로RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 피위(piwi) 단백질과 상호작용하는 RNA (piRNA), 리보솜성 RNA, 안티센스 RNA 또는 비코딩 RNA일 수 있다. 그러나 바람직한 것은 mRNA이다.
포획된 RNA로부터 cDNA를 생성하는 상기 방법의 단계 (c) (상기 용도에 관한 바람직한 설명에서 단계 (a)에 상응한다)는 cDNA의 합성에 관련될 것으로 볼 수 있다. 이것은 RT 프라이머로서 기능하는 포획 프로브를, 주형으로서 포획된 RNA를 사용하여 연장시키는 포획된 RNA의 역전사 단계를 포함할 것이다. 그런 단계는 소위 첫 번째 가닥 cDNA를 생성한다. 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 두 번째 가닥 cDNA 합성은 임의로 어레이 상에서 일어나거나, 어레이로부터 첫 번째 가닥의 cDNA가 방출된 후에 별도의 단계로 일어날 수 있다. 또한 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 어떤 구체예에서는 두 번째 가닥의 합성은 방출된 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 첫 번째 증폭 단계에서 일어날 수 있다.
일반적으로 핵산 분석, 특히 DNA 분석과 관련하여 사용하기 위한 어레이는 아래에서 논의되고 설명된다. RNA의 맥락에서 사용하기 위해 어레이 및 포획 프로브와 관련하여 본원에서 설명된 구체적인 상세한 설명 및 구체예는 DNA와 함께 사용하기 위한 것을 포함하여 그런 모든 어레이에 동등하게 (필요에 따라) 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "다수의"는 둘 또는 그 이상, 또는 최소한 둘, 예컨대 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 400, 500, 1000, 2000, 5000, 10,000 또는 그 이상 등을 의미한다. 그러므로 예를 들어 포획 프로브의 수는 상기 언급된 수들 중 어떠한 두 수 사이의 어떠한 범위에 있는 어떠한 정수일 수 있다. 그러나 수백, 수천, 수만, 수십만 또는 때로는 수백만 개의 포획 프로브를 포함한 전통적 유형의 어레이도 사용될 수 있는 것으로 예상된다는 것이 인지될 것이다.
그러므로 본원에서 설명되는 방법은 조직 샘플, 예컨대 얇은 조직 샘플 슬라이스, 또는 "절편" 내에 있는 모든 단일 세포로부터의 전사물을 포획하고 표지화하기 위한 "포획 프로브"를 포함하는 고밀도 핵산 어레이를 사용한다. 분석을 위한 조직 샘플 또는 절편은 고도의 병렬 방식으로 생성되어서 절편의 공간적 정보는 보유된다. 각 세포에 대해 포획된 RNA (바람직하게는 mRNA) 분자, 또는 "전사체"는 cDNA로 전사되고 그 결과의 cDNA 분자는 예컨대 고처리율 서열화에 의해 분석된다. 그 결과 생성된 데이터는 원래의 조직 샘플, 예컨대 절편의 영상과, 배열된 핵산 프로브 안에 통합된 소위 바코드 서열 (또는 ID 태그, 본원에서는 위치 도메인으로 규정됨)를 통해 상호연관될 수 있다.
고밀도 핵산 어레이 또는 마이크로어레이는 본원에 기술된 공간적 전사체 표지화 방법의 핵심 요소일 수 있다. 마이크로어레이는 분자 생물학에서 사용되는 복합 기술이다. 전형적인 마이크로어레이는 매우 작은 올리고뉴클레오티드 반점들이 배열된 시리즈로 구성된다 (수십만 개의 반점, 일반적으로 수만 개의 반점이 단일 어레이 상에 통합될 수 있다). 각 핵산 (올리고뉴클레오티드) 반점 (올리고뉴클레오티드/핵산 분자의 각각의 종)의 뚜렷한 위치는 "피쳐"로서 공지되고 (따라서 상기에서 설명된 방법에서 포획 프로브의 각각의 종은 어레이의 특이한 피쳐로서 볼 수 있고, 각 피쳐는 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지한다), 전형적으로 각각의 별도의 피쳐는 피코몰 영역의 특이한 DNA 서열 ("종")을 함유하고, 그것은 "프로브" (또는 "리포터")로서 공지된다. 전형적으로 이것들은 그것에 cDNA 또는 cRNA 샘플 (또는 "표적")이 고엄격성 혼성화 조건 하에서 혼성화할 수 있는 유전자 또는 다른 핵산 요소의 짧은 부분일 수 있다. 그러나 아래에서 설명되는 것과 같이 본 발명의 프로브는 표준 마이크로어레이의 프로브와는 다르다.
유전자 발현 마이크로어레이에서, 프로브-표적 혼성화는 보통 모든 표적 안에 통합되는 가시적인 신호, 예컨대 플루오로포어, 은 이온 또는 화학발광 표지의 검출에 의해 검출되고 정량될 수 있다. 가시적인 신호의 세기는 샘플 중의 각 표적 핵산의 상대적인 풍부성에 연관성이 있다. 어레이가 수만 개의 프로브를 함유할 수 있기 때문에 마이크로어레이 실험은 많은 유전자 시험을 동시에 이룰 수 있다.
표준 마이크로어레이에서, 프로브는 화학적 매트릭스, 예컨대 에폭시-실란, 아미노-실란, 라이신, 폴리아크릴아미드 등에 대한 공유 결합에 의해 고체 표면 또는 기판에 부착된다. 기판은 전형적으로 유리, 플라스틱 또는 실리콘 칩 또는 슬라이드이지만 다른 마이크로어레이 플랫폼, 예컨대 매우 작은 비즈도 알려져 있다.
프로브는 본 발명의 어레이에 어떠한 적당한 수단에 의해 부착될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로브는 어레이의 기판에 화학적 고정화에 의해 고정된다. 이것은 기판 (지지 재료)과 프로브 사이의 화학반응을 토대로 한 상호작용일 수 있다. 그런 화학반응은 전형적으로 열이나 빛을 통한 에너지의 유입에 의존할 뿐 아니라 열을 적용하거나, 예컨대 화학반응을 위해 특정한 최적 온도를 적용하거나, 특정 파장의 빛을 적용함으로써 증강될 수 있다. 예를 들어 화학적 고정화는 기판 상의 기능성 기와 프로브 상의 상응하는 기능성 요소 사이에서 일어날 수 있다. 프로브의 그러한 상응하는 기능성 요소는 프로브의 고유한 화학적 기, 예컨대 히드록실기이거나 추가로 도입될 수 있다. 그러한 기능성 기의 예로는 아민 기가 있다. 전형적으로 고정화될 프로브는 기능성 아민기를 포함하거나 또는 기능성 아민기를 포함하도록 화학적으로 고정된다. 그러한 화학적 고정화를 위한 수단 및 방법은 잘 알려져 있다.
고정화될 프로브 내에 있는 상기 기능성 기를 위치시키는 것은 프로브의 결합 양식 및/또는 방향을 조절하고 조성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 기능성 기는 프로브의 5' 또는 3' 단부에 위치하거나 프로브의 서열 내에 위치할 수 있다. 프로브가 고정될 전형적인 기판은 그러한 프로브, 예컨대 아민-기능화된 핵산에 결합할 수 있는 부분을 포함한다. 그러한 기판의 실례로는 카르복시, 알데하이드 또는 에폭시 기판이 있다. 그런 재료들은 당업자에게 알려져 있다. 아민 기의 도입에 의해 화학적으로 반응할 수 있는 프로브 사이의 연결 반응을 부여하는 기능성 기, 및 어레이 기판은 당업자들에게 알려져 있다.
그 위에 프로브가 고정될 수 있는 또 다른 기판은 예컨대 어레이 기판 위에서 활용될 수 있는 기능성 기의 활성화에 의해 화학적으로 활성화될 필요가 있을 수 있다. 용어 "활성화된 기판"은 상호작용하는 또는 반응성 화학적 기능 기가 당업자들에게 알려져 있는 것과 같은 화학적 변형 과정에 의해 수립되거나 가능하게 되는 물질을 말한다. 예를 들어 카르복실기를 포함하고 있는 기판은 사용 전에 활성화되어야 한다. 나아가 핵산 프로브에 이미 존재하고 있는 특이한 부분과 반응할 수 있는 기능성 기를 함유하는 기판이 활용가능하다.
또는 달리 프로브는 기판 위에서 직접 합성될 수 있다. 그런 접근법에 적당한 방법은 당업자들에게 알려져 있다. 예를 들면 Agilent Inc., Affymetrix Inc., Roche Nimblegen Inc. 또는 Flexgen BV에 의해 개발된 제조 기술이 있다. 전형적으로 뉴클레오티드 첨가가 일어나는 경우 반점을 특이하게 활성화시키는 레이저와 일련의 거울이 사용된다. 그런 접근법은 예를 들면 약 30㎛ 또는 더 큰 반점 크기 (즉 피쳐)를 제공할 수 있다.
그러므로 기판은 당업자들에게 알려져 있는 어떠한 적당한 기판일 수 있다. 기판은 어떠한 적당한 형태 또는 포맷을 취할 수 있는데, 예를 들면 기판은 평평하거나, 구부러져 있다. 예를 들면 기판은 조직 샘플과 기판 사이의 상호작용이 일어나는 구역을 향해 볼록하게 또는 오목하게 구부러져 있다. 특히 바람직한 것은 기판이 평평한 것, 즉 평면이거나, 칩이거나 슬라이드인 경우이다.
전형적으로 기판은 고체 지지체이고, 따라서 기판 위의 프로브의 정확하고 추적가능한 위치측정이 가능해진다. 기판의 실례는 기능성 기, 예컨대 아민 기 또는 아민-기능화된 기를 포함하고 있는 고체 물질 또는 기판이다. 본 발명에 의해 구상되는 기판은 비-다공성 기판이다. 바람직한 비-다공성 기판은 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트이다.
당업자들에게 알려져 있는 적당한 물질이 어느 것이든지 사용될 수 있다. 전형적으로 유리 또는 폴리스티렌이 사용된다. 폴리스티렌은 보통 상태에서는 소수의 친수성 기를 함유하고 있기 때문에 네거티브 전하의 마크로분자를 결합하기에 적당한 소수성 물질이다. 유리 슬라이드 위에 고정된 핵산의 경우, 나아가 유리 표면의 소수성을 증가시킴으로써 핵산의 고정화가 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러한 증강은 상대적으로 더 밀접하게 충전된 구성을 가능하게 한다. 폴리-L-라이신을 사용한 코팅 또는 표면 처리하는 것 외에 기판, 특히 유리는 예컨대 에폭시-실란 또는 아미노-실란을 사용한 실란처리에 의해 또는 실리네이션(silynation)에 의해 또는 폴리아크릴아미드 처리에 의해 처리될 수 있다.
많은 수의 표준 어레이가 상업적으로 활용가능하고 피쳐의 수와 크기는 둘 다 달라질 수 있다. 본 발명에서, 피쳐의 배열은 상이한 조직 또는 유기체에 존재하는 세포의 크기 및/또는 밀도에 상응하여 달라질 수 있다. 예를 들어 동물 세포의 단면은 전형적으로 1 내지 100㎛의 범위인 반면 식물 세포의 단면은 전형적으로 1 내지 10000㎛의 범위일 수 있다. 그러므로 2.1 밀리언 피쳐, 또는 4.2 밀리언 피쳐까지 활용할 수 있고, 피쳐 크기는 13 마이크로미터인 Nimblegen® 어레이가 동물 또는 진균으로부터의 조직 샘플에 바람직한 한편, 식물 조직 샘플에 대해서는 예컨대 8×130k 피쳐를 가지는 다른 포맷이 충분할 것이다. 서열 분석과 관련하여, 그리고 특히 NGS 기술과 관련된 용도에 대해 상업적인 어레이가 또한 활용가능하거나 공지되어 있다. 그런 어레이는 또한 본 발명과 관련하여 어레이 표면으로서 사용될 수 있는데, 예를 들면 일루미나 기초 어레이가 그렇다. 상업적으로 활용가능한 어레이는 그 자체가 주문제작될 수 있다는 것 외에, 관례적이거나 표준외 "내부 (in-house)" 어레이를 만드는 것이 가능하고 어레이를 제조하기 위한 방법이 안정적으로 수립된다. 본 발명의 방법은 아래에서 규정되는 것과 같은 프로브를 포함하는 표준 및 표준외 어레이를 둘 다 활용할 수 있다.
마이크로어레이 상의 프로브는 어레이의 화학적 매트릭스에 따라 바람직하게는 5' 또는 3' 단부를 통하여 어레이에 고정, 즉 부착되거나 결합될 수 있다. 전형적으로, 상업적으로 활용할 수 있는 어레이의 경우 프로브는 3' 연쇄를 경유하여 부착되고, 그로써 유리 5' 단부가 남게 된다. 그러나 프로브를 포함하고 있는 어레이는 5' 연쇄를 경유하여 기판에 부착되고, 그로써 유리 3' 단부가 남게 되며, 그것은 해당 기술분야에 잘 알려져 있거나 본원의 다른 곳에서 기술되는 표준 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
핵산 프로브를 어레이 기판에 결합시키기 위해 사용된 공유 연쇄는, 비록 프로브가 "직접" 공유 결합에 의해 부착되지만 핵산 프로브의 "첫 번째" 뉴클레오티드를 예컨대 유리 또는 실리콘 기판으로부터 분리시키는 화학적 부분 또는 링커, 즉 간접 연쇄가 있을 수 있다는 점에서 직접 및 간접 연쇄 둘 다로 볼 수 있다. 본 발명의 목적에 대해 공유 결합 및/또는 화학적 링커에 의해 기판에 고정된 프로브는 일반적으로 기판에 직접 고정되거나 부착된 것으로 본다.
아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 본 발명의 포획 프로브는 직접 또는 간접적으로 어레이 위에 고정되거나 어레이와 상호작용할 수 있다. 그러므로 포획 프로브는 직접 어레이에 결합할 필요가 없지만, 예를 들어 그 자체가 어레이에 직접 또는 간접적으로 결합하는 분자에 결합함으로써 간접적으로 상호작용할 수 있다 (예를 들어 포획 프로브는 포획 프로브, 즉 그 자체가 직접 또는 간접적으로 어레이에 결합되어 있는 표면 프로브에 대한 결합 파트너와 상호작용 (예컨대 결합 또는 혼성화)할 수 있다). 그러나 일반적으로 말하면 포획 프로브는 직접 또는 간접적으로 (하나 또는 그 이상의 매개체에 의해) 어레이에 결합되거나 그 위에 고정될 것이다.
본 발명의 용도, 방법 및 어레이는 그것의 5' 또는 3' 단부를 경유하여 고정되는 프로브를 포함할 수 있다. 그러나 포획 프로브가 직접 어레이 기판에 고정될 경우 포획 프로브의 3' 단부가 유리되어 연장될 수 있는 방식으로만 고정될 수 있다. 예컨대 그것의 5' 단부에서 고정된다. 포획 프로브는 간접적으로 고정될 수 있고, 그 결과 유리, 즉 연장가능한 3' 단부가 남게 된다.
연장된 또는 연장가능한 3' 단부란 추가의 뉴클레오티드가 핵산 분자, 예컨대 포획 프로브의 가장 바깥쪽 3' 뉴클레오티드에 첨가되어 핵산 분자의 길이를 연장시킬 수 있다는 것, 즉 핵산 분자를 연장시키기 위해 활용된 표준 중합반응, 예컨대 중합효소에 의해 촉진되는 주형을 사용하는 중합반응을 의미한다.
그러므로 한 구체예에서, 어레이는 그것의 3' 단부를 경유하여 직접 고정되는 프로브, 아래에서 규정되는 것과 같은 소위 표면 프로브를 포함한다. 표면 프로브의 각각의 종은 포획 프로브의 각각의 종에 대한 상보성 영역을 포함함으로써 포획 프로브는 표면 프로브에 혼성화할 수 있고, 그 결과 포획 프로브는 연장가능한 유리 3' 단부를 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면으로, 어레이가 표면 프로브를 포함하는 경우 포획 프로브는 어레이 상에서 제자리 합성된다.
어레이 프로브는 왓슨-크릭형 또는 유사한 염기쌍 상호작용으로 참여할 수 있는 합성 뉴클레오티드 잔기뿐 아니라 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 그러므로 핵산 도메인은 DNA 또는 RNA 또는 그것들의 어떠한 변형, 예컨대 PNA 또는 비-뉴클레오티드 골격을 함유하고 있는 다른 유도체일 수 있다. 그러나 전사체 분석과 관련하여 포획 프로브의 포획 도메인은 포획된 RNA 분자에 상보하는 cDNA를 생성하기 위하여 역전사 반응을 프라이밍할 수 있어야 한다. 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 게놈 분석과 관련하여, 포획 프로브의 포획 도메인은 DNA 단편에 결합할 수 있어야 하고, 그것은 단편화된 DNA에 첨가되어 있는 결합 도메인에 대한 결합을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 포획 프로브의 포획 도메인은 포획된 DNA 분자에 상보하는 DNA를 생성하기 위하여 DNA 연장 (중합효소) 반응을 프라임할 수 있다. 다른 구체예에서 포획 도메인은 포획된 DNA 분자와 기판 위에서 직접 또는 간접적으로 고정된 표면 프로브 사이의 결찰 반응에 대한 주형이 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 포획 도메인은 포획된 DNA 분자의 한 가닥에 결찰될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 포획 프로브의 최소한 포획 도메인은 데옥시리보뉴클레오티드 (dNTP)를 포함하거나 그것으로 구성된다. 특히 바람직한 구체예에서, 전체 포획 프로브는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하거나 그것으로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 포획 프로브는 어레이의 기판 위에서 직접적으로, 즉 그것들의 5' 단부에 의해 고정되고, 그 결과 연장가능한 유리 3' 단부가 생성된다.
본 발명의 포획 프로브는 최소한 두 개의 도메인, 즉 포획 도메인과 위치 도메인 (또는 피쳐 식별 태그 또는 도메인; 위치 도메인은 다르게는 식별 (ID) 도메인 또는 태그, 또는 위치 태그로서 규정될 수 있다)을 포함한다. 포획 프로브는 추가로 아래에서 추가로 정의되는 것과 같은 보편적 도메인을 포함할 수 있다. 포획 프로브가 표면 프로브와의 혼성화를 경유하여 어레이 표면에 간접적으로 부착되는 경우에, 포획 프로브는 표면 프로브에 상보하는 서열 (예컨대 부분 또는 도메인)을 필요로 한다. 그런 상보하는 서열은 표면 프로브에 있는 위치/식별 도메인 및/또는 보편적 도메인에 상보할 수 있다. 달리 표현하면 위치 도메인 및/또는 보편적 도메인은 표면 프로브에 상보하는 프로브의 영역 또는 부분을 구성할 수 있다. 그러나 포획 프로브는 또한 표면 프로브에 상보하는 추가의 도메인 (또는 영역, 부분 또는 서열)을 포함할 수 있다. 합성의 용이함을 위해, 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 그런 표면 프로브-상보성 영역은 포획 도메인의 부분으로서, 또는 연장부로서 제공될 수 있다 (그러한 부분 또는 연장부는 그 자체로는 표적 핵산, 예컨대 RNA에 결합하기 위해 사용되거나, 또는 결합할 수 있는 것이 아니다).
포획 도메인은 전형적으로 포획 프로브의 3' 단부에 위치하고, 예컨대 주형 의존성 중합반응에 의해 연장될 수 있는 유리 3' 단부를 포함한다. 포획 도메인은 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 세포에 존재하는 핵산, 예컨대 RNA (바람직하게는 mRNA)에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
유익하게도 포획 도메인은 검출 또는 분석하기를 원하는 특별한 핵산, 예컨대 RNA에 선택적으로 또는 특이하게 결합하도록 선택되거나 디자인될 수 있다 (또는 보다 일반적으로는 결합할 수 있다). 예를 들어 포획 도메인은 mRNA의 선택적인 포획을 위해 선택되거나 디자인될 수 있다. 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 이것은 mRNA의 폴리-A 꼬리에 대한 혼성화를 기초로 한 것일 수 있다. 그러므로 바람직한 구체예에서, 포획 도메인은 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화할 수 있는 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드, 즉 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 일련의 연속적인 데옥시티미딘 잔기를 포함한다. 또는 달리 포획 도메인은 폴리-T에 기능적으로 또는 구조적으로 유사한, 즉 폴리-A에 선택적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드, 예를 들면 폴리-U 올리고뉴클레오티드 또는 데옥시티미딘 유사체로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리-A에 결합하는 기능적 특성을 보유한다. 특히 바람직한 구체예에서, 포획 도메인, 또는 보다 구체적으로는 포획 도메인의 폴리-T 요소는 최소한 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 최소한 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 포획 도메인, 또는 보다 구체적으로는 포획 도메인의 폴리-T 요소는 최소한 25, 30 또는 35개의 뉴클레오티드를 포함한다.
해당 기술분야에서 알려져 있는 것과 같이, 무작위 서열, 예컨대 무작위 헥사머 또는 유사한 서열 또한 핵산의 포획에 사용될 수 있고, 따라서 그런 무작위 서열은 포획 도메인의 전부 또는 부분을 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 무작위 서열은 폴리-T (또는 폴리-T 유사체 등) 서열과 결합하여 사용될 수 있다. 그러므로 포획 도메인이 폴리-T (또는 "폴리-T-유사") 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우 그것은 또한 무작위 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이것은 예를 들면 폴리-T 서열의 5' 또는 3', 예컨대 포획 프로브의 3' 단부에 위치할 수 있지만, 그런 무작위 서열의 위치 정하기는 중요하지 않다. 그런 구성물은 mRNA의 폴리-A의 처음 부분의 포획을 촉진할 수 있다. 또는 달리 포획 도메인은 전체적인 무작위 서열일 수 있다. 축퇴성 포획 도메인이 또한 해당 기술분야의 원리에 따라 사용될 수 있다.
포획 도메인은 핵산의 원하는 하위유형 또는 하위세트, 예컨대 RNA, 예를 들면 RNA의 특정 유형, 예를 들면 상기에서 열거된 mRNA 또는 rRNA 등, 또는 주어진 RNA 유형의 특정 하위세트, 예를 들면 특정 유전자 또는 유전자 그룹에 상응하는 특별한 mRNA 종에 선택적으로 결합할 수 있다. 그런 포획 프로브는 포획하기를 바라는 RNA의 서열을 기초로 선택되거나 디자인될 수 있다. 그러므로 그것은 특별한 RNA 표적 또는 표적 그룹 (표적 그룹 등)에 특이한 서열-특이적 포획 프로브일 수 있다. 그러므로 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 원리에 따라, 특별한 유전자 서열 또는 특별한 모티프 서열 또는 통상적인/보존된 서열 등을 토대로 할 수 있다.
포획 프로브가 어레이의 기판 위에 간접적으로, 예컨대 표면 프로브에의 혼성화를 경유하여 고정되는 구체예에서, 포획 프로브는 추가로 표면 프로브의 5' 단부에 혼성화할 수 있는 상류 서열 (조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA에 혼성화하는 서열에 대해 5'쪽)을 포함할 수 있다. 포획 프로브의 포획 도메인은 그것만으로 포획 도메인 올리고뉴클레오티드로 볼 수 있으며, 그것은 포획 프로브가 어레이 상에서 간접적으로 고정되는 구체예에서 포획 프로브의 합성에 사용될 수 있다.
포획 프로브의 위치 도메인 (피쳐 식별 도메인 또는 태그)은 직접 또는 간접적으로 상류에, 즉 포획 도메인의 포획 프로브 핵산 분자의 5' 단부에 가깝게 위치한다. 바람직하게는 위치 도메인은 포획 도메인에 직접 인접한다. 즉 포획 도메인과 위치 도메인 사이에 중간 서열이 없다. 어떤 구체예에서, 위치 도메인은 포획 프로브의 5' 단부를 형성하고, 그것은 어레이의 기판 위에서 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있다.
상기에서 논의된 것과 같이, 어레이의 각각의 피쳐 (뚜렷한 위치)는 일종의 핵산 프로브의 반점을 포함하며, 이때 각 피쳐에서의 위치 도메인은 독특하다. 그러므로 포획 프로브의 "종"은 그것의 위치 도메인과 관련하여 정의된다. 단일 종의 포획 프로브는 동일한 위치 도메인을 가질 것이다. 그러나 포획 프로브의 종의 각 구성원들이 전체적으로 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 특히 포획 도메인이 무작위 또는 축퇴성 서열이거나 그런 서열을 포함할 수 있기 때문에 한 종 내에 있는 개별 프로브의 포획 도메인은 다를 수 있다. 따라서 포획 프로브의 포획 도메인이 동일한 어떤 구체예에서, 각 피쳐는 단일한 프로브 서열을 포함한다. 그러나 포획 프로브가 달라지는 다른 구체예에서, 한 종의 프로브 구성원들은 정확하게 동일한 서열을 가지지 않을 것이지만, 종의 각 구성원의 위치 도메인의 서열은 동일할 것이다. 필요한 것은 어레이의 각 피쳐 또는 위치가 단일 종의 포획 프로브를 운반하는 것이다 (구체적으로 각 피쳐 또는 위치는 동일한 위치 태그를 가지는 포획 프로브를 운반한다. 즉 각 피쳐 또는 위치에는 하나의 위치 도메인이 있다). 각각의 종은 종을 식별하는 상이한 위치 도메인을 가진다. 그러나 종의 각 구성원은 본원에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 어떤 경우에는 상이한 포획 도메인을 가질 수 있는데, 왜냐하면 포획 도메인은 무작위거나 축퇴성일 수 있거나 또는 무작위 또는 축퇴성 요소를 가질 수 있기 때문이다. 이것은 주어진 피쳐 또는 위치 내에서 프로브의 포획 도메인이 다를 수 있다는 것을 의미한다.
그러므로 반드시 모든 구체예에서는 아니지만 어떤 구체예에서, 특정 피쳐에서 고정된 어떠한 한 프로브 분자의 뉴클레오티드 서열은 동일한 피쳐에서 고정된 다른 프로브 분자와 동일하지만, 각 피쳐에서 프로브의 뉴클레오티드 서열은 모든 다른 피쳐에서 고정된 프로브와 상이하거나, 뚜렷하게 다르거나 구별된다. 바람직하게는 각 피쳐는 상이한 종의 프로브를 포함하는 것이다. 그러나 어떤 구체예에서, 피쳐 그룹의 경우 동일한 프로브 종을 포함하는 것, 즉 효과적으로 단일 피쳐보다 큰 어레이의 면적을 커버하는 피쳐를 생성하는 것, 예컨대 어레이의 해상도를 낮추는 것이 유익할 것이다. 어레이의 다른 구체예에서, 특정 피쳐에서 고정된 어떠한 한 프로브 분자의 위치 도메인의 뉴클레오티드 서열은 동일한 피쳐에서 고정된 다른 프로브 분자와 동일하지만 포획 도메인은 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 포획 도메인은 동일한 유형의 분자, 예컨대 일반적으로 mRNA를 포획하기 위해 디자인될 수 있다.
포획 프로브의 위치 도메인 (또는 태그)는 각 피쳐에 독특하고 위치 또는 공간 마커 (식별 태그)로서 작용하는 서열을 포함한다. 이런 방법으로 조직 샘플, 예컨대 조직의 각 세포의 각 영역 또는 도메인은 핵산, 예컨대 RNA (예컨대 전사물)에 결합되어 있는 어레이를 가로지르는 공간 해상도에 의해 특정 세포를 포획 프로브의 독특한 위치 도메인 서열과 식별할 수 있을 것이다. 위치 도메인에 의해 어레이의 포획 프로브는 조직 샘플의 위치에 연관될 수 있는데, 예를 들면 그것은 샘플 중의 세포에 연관될 수 있다. 그러므로 포획 도메인의 위치 도메인은 핵산 태그 (식별 태그)로서 볼 수 있다.
어떠한 적당한 서열은 본 발명의 포획 프로브의 위치 도메인으로서 사용될 수 있다. 적당한 서열이란 위치 도메인이 조직 샘플의 RNA와 포획 프로브의 포획 도메인 사이의 상호작용을 간섭 (즉 억제 또는 왜곡)하지 않아야 하는 것을 의미한다. 예를 들어 위치 도메인은 조직 샘플 중의 핵산 분자가 위치 도메인에 특이하게 혼성화하지 않도록 디자인되어야 한다. 바람직하게는, 포획 프로브의 위치 도메인의 핵산 서열은 조직 샘플 중의 핵산 서열에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 가지는 것이 좋다. 바람직하게도, 포획 프로브의 위치 도메인은 조직 샘플 중의 핵산 분자의 실질적인 부분을 가로질러 70%, 60%, 50%, 또는 40% 미만의 서열 동일성을 가진다. 서열 동일성은 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 적절한 방법에 의하여, 예를 들면 BLAST 일렬배열 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 포획 프로브의 각 종의 위치 도메인은 독특한 바코드 서열을 함유한다. 바코드 서열은 무작위 서열 생성을 사용하여 생성될 수 있다. 무작위 서열 생성 후에는, 바코드 서열이 핵산, 예컨대 조직 샘플로부터 RNA의 포획을 간섭하지 않고 어려움 없이 상호 간에 구별하게 될 것을 보장하기 위하여 모든 공통적인 참조 종의 게놈에 대해 지도화하고, 미리 설정된 Tm 간격, GC 함량 및 다른 바코드 서열에 대한 차이의 규정된 거리를 사용하여 엄격하게 여과하는 단계가 이어진다.
상기에서 및 바람직한 구체예에서 언급된 것과 같이, 포획 프로브는 또한 보편적 도메인 (또는 링커 도메인 또는 태그)을 포함한다. 포획 프로브의 보편적 도메인은 위치 도메인의 상류에, 즉 포획 프로브 핵산 분자의 5' 단부에 더 가깝게 직접 또는 간접적으로 위치한다. 바람직하게는 보편적 도메인은 위치 도메인에 직접적으로 인접한다. 즉 위치 도메인과 보편적 도메인 사에에 중간 서열이 없다. 포획 프로브가 보편적 도메인을 포함하는 구체예에서, 도메인은 포획 프로브의 5' 단부를 형성할 것이고, 그것은 어레이의 기판 위에 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있다.
보편적 도메인은 본 발명의 방법 및 용도에서 다양한 방식으로 활용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법은 적어도 일부분의 합성된 (즉 연장된 또는 결찰된) 핵산, 예컨대 cDNA 분자를 어레이의 표면으로부터 방출시키는 (예컨대 제거하는) 단계를 포함한다. 본원의 다른 곳에서 설명되는 것과 같이, 이것은 많은 방법으로 이루어질 수 있는데, 그중 한 가지는 핵산, 예컨대 cDNA 분자를 어레이의 표면으로부터 절단하는 것을 포함한다. 그러므로 보편적 도메인은 그 자체가 절단 도메인, 즉 특이하게, 화학적으로 또는 바람직하게는 효소적으로 절단할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
그러므로 절단 도메인은 핵산 분자를 절단할 수 있는, 즉 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 연쇄를 깰 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소에 의해 인지되는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 절단 도메인은 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소) 인지 서열을 포함할 수 있다. 제한 효소는 제한 부위로 알려져 있는 특이한 인지 뉴클레오티드 서열에서 이중 가닥 또는 단일 가닥의 DNA를 절단하고, 그런 적당한 효소들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 핵산, 예컨대 cDNA 분자의 그 밖의 곳에서의 절단 가능성을 감소시키기 위해 드물게 절단하는 (rare-cutting) 제한 효소, 즉 긴 인지 부위 (최소한 8개의 염기쌍 길이)를 가지는 효소를 사용하는 것이 특히 유익하다. 이런 관점에서 보면, 최소한 일부분의 핵산, 예컨대 cDNA 분자를 제거 또는 방출시키는 것은 핵산, 예컨대 cDNA의 위치 도메인 및 그 도메인의 아래쪽에 있는 모든 서열, 즉 위치 도메인의 3' 쪽에 있는 모든 서열을 포함하는 부분을 방출시키는 것을 필요로 하는 것을 알 수 있을 것이다. 그러므로 핵산, 예컨대 cDNA 분자의 절단은 위치 도메인의 5' 쪽에서 일어나야 한다.
실례로서, 절단 도메인은 상업적으로 USERTM 효소로 알려져 있는 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG) 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII의 혼합물에 의해 절단될 수 있는 폴리-U 서열을 포함할 수 있다.
절단 도메인의 추가의 실례는 포획 프로브가 어레이 기판에 간접적으로, 즉 표면 프로브를 통하여 고정되어 있는 경우의 구체예에서 활용될 수 있다. 절단 도메인은 하나 또는 그 이상의 잘못 매치된, 즉 표면 프로브와 포획 프로브의 상보하는 부분이 100% 상보하지 않는 경우의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그런 잘못된 매치는 예컨대 MutY 및 T7 엔도뉴클레아제 I 효소에 의해 인지되고, 그 결과 잘못 매치된 위치에서 핵산 분자의 절단이 일어난다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 포획 프로브의 위치 도메인은 절단 도메인을 포함하는데, 이때 이 절단 도메인은 위치 도메인의 5' 단부에 위치한다.
보편적 도메인은 또한 증폭 도메인을 포함할 수 있다. 이것은 절단 도메인 외에 존재하거나, 또는 그것 대신일 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 본원의 다른 곳에서 설명되는 것과 같이 핵산, 예컨대 cDNA 분자를, 예를 들면 그것이 어레이 기판으로부터 방출된 (예컨대 제거 또는 절단된) 후에 증폭시키는 것이 유익할 수 있다. 그러나 초기 주기의 증폭, 또는 실제로는 어떠한 또는 모든 추가 주기의 증폭은 또한 어레이 상에서 제자리에서 일어날 수 있다. 증폭 도메인은 거기에 증폭 프라이머가 혼성화될 수 있는 뚜렷한 서열을 포함한다. 포획 프로브의 보편적 도메인의 증폭 도메인은 바람직하게는 각각의 종의 포획 프로브와 동일하다. 그러므로 단일 증폭 반응은 핵산, 예컨대 cDNA 분자 전체 (그것은 증폭 전에 어레이 기판으로부터 방출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다)를 증폭시키기에 충분할 것이다.
적당한 서열은 어느 것이든지 본 발명의 포획 프로브의 증폭 도메인으로서 사용될 수 있다. 적당한 서열이란 증폭 도메인이 조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA와 포획 프로브의 포획 도메인 사이의 상호작용을 간섭 (즉 억제 또는 왜곡)하지 않아야 하는 것을 의미한다. 나아가 증폭 도메인은 조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA의 어떠한 서열과도 동일하거나 실질적으로 동일하지 않아서 증폭 반응에 사용된 프라이머가 반응의 증폭 조건 하에서 증폭 도메인에만 혼성화할 수 있어야 하는 서열을 포함해야 한다.
예를 들어 증폭 도메인은 조직 샘플 중의 핵산 분자가 증폭 도메인 또는 증폭 도메인의 상보 서열에 특이하게 혼성화하지 않도록 디자인되어야 한다. 바람직하게는 포획 프로브의 증폭 도메인의 핵산 서열 및 그것의 상보물은 조직 샘플 중의 핵산 서열과 80% 미만의 서열 동일성을 가지는 것이 좋다. 바람직하게는 포획 프로브의 위치 도메인은 조직 샘플 중의 핵산 분자의 실질적인 부분을 가로질러 70%, 60%, 50%, 또는 40% 미만의 서열 동일성을 가진다. 서열 동일성은 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 적절한 방법에 의해, 예컨대 BLAST 일렬배열 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
그러므로 이런 사실만으로도 포획 프로브의 보편적 도메인은 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드로서 볼 수 있고, 그것은 포획 프로브가 어레이 상에 간접적으로 고정되는 구체예에서 포획 프로브의 합성에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 대표적인 구체예에서, 포획 프로브의 각각의 종의 위치 도메인만큼은 독특하다. 그러므로 포획 도메인과 보편적 도메인 (존재하는 경우)은 한 구체예에서, 핵산, 예컨대 조직 샘플로부터의 RNA의 포획이 어레이 전체에 걸쳐 균일한 것을 보장하기 위해 어떠한 특정 어레이에 대해 포획 프로브의 모든 종에 대해 동일하다. 그러나 상기에서 논의된 것처럼 어떤 구체예에서는, 포획 도메인은 무작위 또는 축퇴성 서열을 포함하기 때문에 다를 수 있다.
포획 프로브가 어레이의 기판 위에 간접적으로, 예를 들면 표면 프로브에의 혼성화를 통해 고정되는 경우의 구체예에서, 포획 프로브는 아래에서 설명되는 것과 같이 어레이 상에서 합성될 수 있다.
표면 프로브는 예컨대 그것의 3' 단부에 의해 또는 3' 단부에서 직접적으로 어레이의 기판 위에 고정된다. 각각의 종의 표면 프로브는 어레이의 각 피쳐 (뚜렷한 위치)에 독특하고, 부분적으로는 상기에서 규정된 포획 프로브에 상보한다.
그러므로 표면 프로브는 그것의 5' 단부에 핵산, 예컨대 조직 샘플의 RNA에 결합하지 않는 포획 도메인의 부분에 상보하는 도메인 (상보성 포획 도메인)을 포함한다. 달리 표현하면, 그것은 포획 도메인 올리고뉴클레오티드의 최소한 부분에 혼성화할 수 있는 도메인을 포함한다. 표면 프로브는 추가로 포획 프로브의 위치 도메인에 상보하는 도메인 (상보성 위치 도메인 또는 상보성 피쳐 식별 도메인)을 포함한다. 상보성 위치 도메인은 상보성 포획 도메인의 하류에 직접 또는 간접적으로 (즉 3' 단부에서) 위치한다. 즉 상보성 위치 도메인과 상보성 포획 도메인을 분리하는 중간 또는 링커 서열이 있을 수 있다. 포획 프로브가 어레이 표면 상에서 합성되는 구체예에서, 어레이의 표면 프로브는 언제나 표면 프로브의 3' 단부에서, 즉 위치 도메인의 직접 또는 간접적으로 하류에서 도메인 (상보성 보편적 도메인)을 포함하고, 그것은 포획 프로브의 보편적 도메인에 상보한다. 달리 표현하면, 그것은 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드의 최소한 부분에 혼성화할 수 있는 도메인을 포함한다.
본 발명의 어떤 구체예에서 표면 프로브의 서열은 위치 및 보편적 도메인에 대해, 그리고 조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA에 결합하지 않는 포획 도메인의 부분에 대해 100% 상보성 또는 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 표면 프로브의 서열은 포획 프로브의 도메인에 대해 100% 미만, 예컨대 99% 미만, 98% 미만, 97% 미만, 96% 미만, 95% 미만, 94% 미만, 93% 미만, 92% 미만, 91% 미만, 또는 90% 미만의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 특히 바람직한 본 발명의 구체예에서, 상보성 보편적 도메인은 포획 프로브의 보편적 도메인에 대해 100% 미만의 서열 동일성을 공유한다.
본 발명의 한 구체예에서, 포획 프로브는 어레이의 기판 위에서 합성되거나 생성된다. 대표적인 구체예에서 (도 3 참조), 어레이는 상기에서 규정된 것과 같은 표면 프로브를 포함한다. 포획 프로브의 포획 도메인과 보편적 도메인에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 어레이와 접촉하여 표면 프로브의 상보성 도메인에 혼성화하는 것을 가능하게 한다. 과잉 올리고뉴클레오티드는 표준 혼성화 조건 하에서 어레이를 세척함으로써 제거될 수 있다. 그 결과의 어레이는 부분적으로 단일 가닥의 프로브를 포함하며, 이때 표면 프로브의 5' 및 3' 단부는 이중 가닥이고, 상보성 위치 도메인은 단일 가닥 상태이다. 어레이는 중합효소로 처리되어 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드의 3' 단부가, 주형 의존성 방식으로 연장됨으로써 포획 프로브의 위치 도메인이 합성될 수 있다. 그런 다음 합성된 위치 도메인의 3' 단부는 예를 들면 결찰효소를 사용하여 포획 도메인 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에 결찰되어 포획 프로브가 생성된다. 이런 관점에서 포획 도메인 올리고뉴클레오티드의 5' 단부는 결찰이 일어나는 것을 가능하게 하기 위해 인산화된다는 것이 인지될 것이다. 표면 프로브의 각각의 종이 독특한 상보성 위치 도메인을 포함하기 때문에 각각의 종의 포획 프로브는 독특한 위치 도메인을 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "혼성화" 또는 "혼성화한다"는 것은 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 이중나선을 형성하기에 충분히 상보하는 뉴클레오티드 서열 사이에 이중나선을 형성하는 것을 말한다. 두 개의 뉴클레오티드 서열은 이들 분자가 염기쌍 조직화 상동성을 공유할 때 상호 간에 "상보한다". "상보성" 뉴클레오티드 서열은 특이성과 조합하여 적절한 혼성화 조건 하에서 안정한 이중나선을 형성할 것이다. 예를 들어 두 서열은 첫 번째 서열 절편이 정반대 방향의 센스의 두 번째 서열 절편에 결합할 수 있을 때 상보성이고, 이때 각 서열의 3'-단부는 다른 서열의 5'-단부에 결합하고, 그런 다음 한 서열의 A, T(U), G 및 C는 각각 다른 서열의 T(U), A, C 및 G와 일렬배열된다. RNA 서열은 또한 상보하는 G=U 또는 U=G 염기쌍을 포함할 수 있다. 그러므로 두 서열은 본 발명 하에서는 "상보하는" 상태가 되기 위해 완벽한 상동성을 가질 필요가 없다. 보통 두 서열은 뉴클레오티드의 최소한 약 90% (바람직하게는 최소한 약 95%)가 분자의 규정된 길이에 걸쳐 염기쌍 조직화를 공유할 때 충분히 상보한다. 그러므로 포획 및 표면 프로브의 도메인들은 상보성 영역을 함유한다. 나아가 포획 프로브의 포획 도메인은 조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA (바람직하게는 mRNA)에 대한 상보성 영역을 함유한다.
포획 프로브는 또한 중합효소 연장 (상기에서 설명된 것과 유사함) 및 말단 트란스페라제 효소를 사용하여 어레이 기판 위에서 합성될 수 있어서 포획 도메인을 구성할 수 있는 "꼬리"를 첨가할 수 있다. 이 과정은 아래의 실시예 7에서 추가로 설명하기로 한다. 뉴클레오티드 서열을 올리고뉴클레오티드의 단부에 추가하기 위해, 예를 들어 단일중합체 꼬리, 예컨대 폴리-T 꼬리를 도입하기 위해 말단 트란스페라제를 사용하는 것은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 따라서 그런 합성에서 포획 프로브의 보편적 도메인에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 어레이와 접촉할 수 있고, 표면 프로브의 상보성 도메인에 혼성화되는 것이 가능해진다. 과잉 올리고뉴클레오티드는 표준 혼성화 조건 하에서 어레이를 세척함으로써 제거될 수 있다. 그 결과의 어레이는 부분적으로 단일 가닥의 프로브를 포함하는데, 이때 표면 프로브의 5' 단부는 이중 가닥이고 상보성 위치 도메인은 단일 가닥이다. 어레이는 중합효소로 처리되어 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드의 3' 단부가 주형 의존성 방식으로 연장될 수 있음으로써 포획 프로브의 위치 도메인이 합성된다. 그런 다음 예컨대 폴리-T 서열을 포함하는 포획 도메인은 말단 트란스페라제를 사용하여 폴리-T 꼬리를 첨가하기 위해 도입되어 포획 프로브가 생성된다.
본 발명의, 그리고 본 발명의 방법에 사용하기 위한 전형적인 어레이는 다수의 반점, 또는 "피쳐"를 함유할 수 있다. 피쳐는 그곳에서 단일 종의 포획 프로브가 고정되는 어레이 기판 상의 지역 또는 뚜렷한 위치로서 규정될 수 있다. 그러므로 각 피쳐는 동일한 종의 다수의 프로브 분자를 포함할 것이다. 이런 맥락에서 동일한 종의 각각의 포획 프로브는 동일한 서열을 가질 수 있다고 함축되는 한편으로, 모든 경우가 반드시 그럴 필요는 없다는 것이 인지될 것이다. 포획 프로브의 각 종은 동일한 위치 도메인을 가지겠지만 (즉 종의 각 구성원, 및 따라서 피쳐의 각 프로브는 동일하게 "태그"될 것이겠지만), 피쳐 (종)의 각 구성원의 서열은 다를 수 있는데, 왜냐하면 포획 도메인의 서열이 다를 수 있기 때문이다. 상기에서 설명된 것과 같이 무작위 또는 축퇴성 포획 도메인이 사용될 수 있다. 그러므로 피쳐 내의 포획 프로브는 상이한 무작위 또는 축퇴성 서열을 포함할 수 있다. 어레이 상의 피쳐의 수 및 밀도는 어레이의 해상도, 즉 조직 샘플의 전사체 또는 게놈이 분석될 수 있는 상세함의 수준을 결정할 것이다. 그러므로 보다 높은 밀도의 피쳐는 전형적으로 어레이의 해상도를 증가시킬 것이다.
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 어레이 상의 피쳐의 크기 및 수는 조직 샘플의 본질 및 필요한 해상도에 따라 좌우될 것이다. 그러므로 만약 조직 샘플 내의 세포의 영역에 대해서만 전사체 또는 게놈을 측정하기 위해서는 (또는 샘플이 큰 세포를 함유할 때는) 어레이 상의 피쳐의 수 및/또는 밀도는 감소될 수 있고 (즉 피쳐의 가능한 최대 수보다 낮다) 및/또는 피쳐의 크기는 증가될 수 있다 (즉 각 피쳐의 지역은 가능한 가장 작은 피쳐보다 클 수 있다). 예를 들면 소수의 큰 피쳐를 포함하는 어레이를 생각할 수 있다. 또는 달리, 샘플 내의 개별 세포의 전사체 또는 게놈을 측정하는 것이 바람직하다면 가능한 피쳐의 최대 수를 사용하는 것이 필요할 수 있고, 그것은 가능한 가장 작은 피쳐 크기, 예컨대 많은 작은 피쳐를 포함하고 있는 어레이를 사용하는 것을 필요로 하게 될 것이다.
단일 세포 해상도가 바람직하고 본 발명의 유익한 특징인 한편, 이것을 반드시 이루어야 하는 것은 아니며, 세포 그룹 수준에서의 해상도, 예를 들면 특정 세포 유형 또는 조직 영역, 예컨대 정상 대 종양 세포를 검출 또는 구별하는 것도 또한 관심의 대상이다.
본 발명의 대표적인 구체예에서, 어레이는 최소한 2, 5, 10, 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000, 10000, 20000, 40000, 50000, 75000, 100000, 150000, 200000, 300000, 400000, 500000, 750000, 800000, 1000000, 1200000, 1500000, 1750000, 2000000, 2100000, 3000000, 3500000, 4000000 또는 4200000개의 피쳐를 함유할 수 있다. 4200000은 현재 상업적인 어레이 상에서 활용할 수 있는 피쳐의 최대 수를 나타내는 한편, 이것을 초과하는 수의 피쳐를 가지는 어레이가 제조될 수 있고, 그런 어레이는 본 발명에서 관심의 대상이라는 것이 예상된다. 상기에서 주지된 바와 같이, 피쳐의 크기는 감소될 수 있고, 이것은 동일한 또는 유사한 구역 내에서 수용될 수 있는 피쳐의 수가 더 커지는 것을 가능하게 한다. 예를 들면 이들 피쳐는 약 20cm2, 10cm2, 5cm2, 1cm2, 1mm2, 또는 100μm2 미만의 구역에 포함될 수 있다.
그러므로 본 발명의 어떤 구체예에서, 각 피쳐의 구역은 약 1μm2, 2μm2, 3μm2, 4μm2, 5μm2, 10μm2, 12μm2, 15μm2, 20μm2, 50μm2, 75μm2, 100μm2, 150μm2, 200μm2, 250μm2, 300μm2, 400μm2, 또는 500μm2일 수 있다.
어떠한 유기체, 예컨대 식물, 동물 또는 진균류로부터의 조직 샘플은 본 발명의 방법에 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 본 발명의 어레이는 전사 및/또는 번역될 수 있는 세포에 존재하는 어떠한 핵산, 예컨대 mRNA 분자의 포획을 가능하게 한다. 본 발명의 어레이 및 방법은 특히 샘플 내의 세포의 전사체 또는 게놈을 분리하고 분석하는 데 적당하며, 이때 예컨대 세포가 인접한 세포들과 상호연결되거나 직접 접촉하게 되는 경우에 전사체 또는 게놈의 공간 해상도가 바람직하다. 그러나 당업자에게는 본 발명의 방법이 또한 샘플, 예컨대 혈액 샘플 내의 상이한 세포 또는 세포 유형의 전사체 또는 게놈의 분석에도 유용할 수 있고, 이때 상기 세포가 직접 상호작용하지 않는 경우에도 유용하다는 것이 드러날 것이다. 달리 표현하면, 세포는 조직과 관련하여 존재할 필요가 없고, 단일 세포로서 어레이에 적용될 수 있다 (예컨대 고정되지 않은 조직으로부터 분리된 세포). 그런 단일 세포는 조직에서 특정 위치에 반드시 고정될 필요가 없는 한편, 그럼에도 불구하고 어레이 상의 특정 위치에 적용되고 개별적으로 확인될 수 있다. 그러므로 직접 상호작용하지 않거나 조직 안에 존재하지 않는 세포를 분석하는 것과 관련하여, 기술된 방법의 공간적 특성들은 개별 세포로부터 독특한 또는 독립적인 전사체 또는 게놈 정보를 얻거나 회수하기 위해 적용될 수 있다.
그러므로 샘플은 수득되거나 생검된 조직 샘플이거나 또는 가능하게는 배양된 샘플이다. 대표적인 샘플로는 임상적 샘플, 예컨대 전혈 또는 전혈-유도된 생성물, 혈구, 조직, 생검 시편, 또는 배양된 조직 또는 세포 등이며, 세포 현탁액을 아우른다. 인공 조직은 예를 들면 세포 현탁액 (예컨대 혈액 세포를 포함하여)으로부터 제조될 수 있다. 세포는 매트릭스 (예컨대 겔 매트릭스, 예컨대 아가, 아가로오스 등)에 포획될 수 있고, 그런 다음 종래 방식으로 절편화될 수 있다. 그런 과정은 면역조직화학의 맥락에서 해당 기술분야에 알려져 있다 (Andersson et al 2006, J. Histochem. Cytochem. 54(12):1413-23. Epub 2006 Sep 6).
조직 제조 방식 및 그 결과의 샘플의 취급 방법은 본 발명의 방법의 전사체 또는 게놈 분석에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이 다양한 조직 샘플은 상이한 물리적 특성을 가질 것이고, 당업자에게는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조직 샘플을 만들기 위해 필요한 조작을 수행하는 것이 잘 알려져 있다. 그러나 본원의 개시 내용으로부터, 본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 조직 샘플을 얻기 위해 어떠한 샘플 제조 방법이든지 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들어 대략 1 세포 또는 그것보다 적은 두께를 가지는 어떠한 세포 층도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 조직 샘플의 두께는 세포의 단면의 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1보다 적을 수 있다. 그러나 상기에서 주지된 바와 같이 본 발명은 단일 세포 해상도에 제한되지 않고, 따라서 조직 샘플의 두께가 1 세포 직경 또는 그 미만이어야 할 필요는 없기 때문에, 필요하다면 더 두꺼운 조직 샘플이 사용될 수 있다. 예를 들어 예컨대 10 내지 20㎛ 두께의 동결 절편이 사용될 수 있다.
조직 샘플은 어떠한 편리한 또는 원하는 방식으로 제조될 수 있고, 본 발명은 조직 제조의 어떠한 특정 유형에 제한되지 않는다. 신선하고, 냉동된, 고정된 또는 고정되지 않은 조직이 사용될 수 있다. 어떠한 원하는 편리한 과정이, 해당 기술분야에 기술되고 공지되어 있는 것처럼 조직 샘플을 고정 또는 삽입시키기 위해 사용될 수 있다. 그러므로 어떠한 공지된 고정액 또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 조직 샘플의 첫 번째 대표적인 실례로서, 조직은 조직 구조의 통합성 (즉 물리적 특성)을 유지 또는 보존하기에 적당한 온도, 예컨대 -20℃보다 낮은, 바람직하게는 -25, -30, -40, -50, -60, -70 또는 -80℃보다 낮은 온도에서 초저온 냉동에 의해 제조될 수 있다. 냉동된 조직 샘플은 어떠한 적당한 수단에 의해 어레이 표면 위에 절편화될 수 있다. 즉 얇게 슬라이스될 수 있다. 예를 들어 조직 샘플은 조직 샘플의 구조적 통합성과 샘플 중의 핵산의 화학적 특성을 둘 다 유지하기에 적당한 온도, 예컨대 -15℃보다 낮은 온도, 바람직하게는 -20 또는 -25℃보다 낮은 온도에서 설치된 저온 마이크로톰, 저온 유지 장치를 사용하여 제조될 수 있다. 그러므로 샘플은 조직의 핵산, 예컨대 RNA의 변성 또는 분해를 최소화하도록 처리되어야 한다. 그런 조건은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있고, 어떠한 분해의 정도는 핵산 추출, 예컨대 총 RNA 추출 및 계속해서 조직 샘플의 제조의 다양한 단계에서 정성 분석을 통해 모니터될 수 있다.
두 번째 대표적인 실례로, 조직은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는 포르말린-고정 및 파라핀-삽입 (FFPE)의 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 조직 샘플의 고정과 파라핀 또는 수지 블록에의 삽입 후에, 조직 샘플은 어레이 위에서 절편화, 즉 얇게 슬라이스될 수 있다. 상기에서 주지된 것과 같이, 다른 고정액 및/또는 삽입 물질이 사용될 수 있다.
조직 샘플 절편은 삽입 물질을 제거하기 위해, 예컨대 파라핀 제거를 위해, 즉 본 발명의 방법을 수행하기 전에 샘플로부터 파라핀 또는 수지를 제거하기 위해 처리될 필요가 있을 것이다. 이것은 어떠한 적당한 방법에 의해 이루어질 수 있고, 조직 샘플로부터 파라핀 또는 수지 또는 다른 물질의 제거는 해당 기술분야에 잘 수립되어 있는데, 예를 들면 샘플 (어레이의 표면 위에 있는)을 적절한 용매, 예컨대 크실렌 중에서, 예컨대 10분 동안 2회 인큐베이션하고, 그런 다음 에탄올 세정, 예컨대 99.5% 에탄올 중에서 2분 동안, 96% 에탄올 중에서 2분, 그리고 70% 에탄올 중에서 2분 동안 세정함으로써 이루어질 수 있다.
당업자들에게는 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된 조직 단편 중의 RNA는 냉동된 조직의 경우에서보다 더 잘 부분적으로 분해되는 것으로 보인다는 것이 명백할 것이다. 그러나 어떠한 특별한 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이것은 본 발명의 방법에 유익할 것으로 여겨진다. 예를 들어 만약 샘플 중의 RNA가 부분적으로 분해된다면, RNA 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 분해되지 않은 샘플보다 더 줄어들 것이고 더 무작위가 될 것이다. 그러므로 부분적으로 분해된 RNA는 본원의 다른 곳에서 설명되는 다양한 프로세싱 단계, 예컨대 어댑터 (증폭 도메인)의 결찰, cDNA 분자의 증폭 및 그것들의 서열화에서 덜 편향적이 될 것이다.
그러므로 본 발명의 한 구체예에서, 조직 샘플, 즉 어레이와 접촉된 조직 샘플의 단편은 FFPE 또는 다른 고정 및 삽입 방법을 사용하여 제조된다. 달리 표현하면, 샘플은 고정, 예컨대 고정되고 삽입될 수 있다. 발명의 대체 구체예에서 조직 샘플은 초저온 냉동에 의해 제조된다. 또 다른 구체예에서 해당 기술분야에 공지되어 있는 과정에 따라 조직의 터치 프린트가 사용될 수 있다. 다른 구체예에서는 고정되지 않은 샘플이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 조직 샘플 절편의 두께는 샘플을 제조하기 위해 사용된 방법 및 조직의 물리적 특성에 따라 좌우될 것이다. 그러므로 어떠한 적당한 절편 두께든지 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 대표적인 구체예에서, 조직 샘플 절편의 두께는 최소한 0.1㎛, 더 바람직하게는 최소한 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10㎛일 것이다. 다른 구체예에서 조직 샘플 단편의 두께는 최소한 10, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 또는 50㎛일 것이다. 그러나 두께는 중요하지 않고, 이것들은 단지 대표적인 값이다. 보다 두꺼운 샘플, 예컨대 70 또는 100㎛ 또는 그 이상의 샘플이 바람직하거나 편리하다면 사용될 수 있다. 전형적으로 조직 샘플 절편의 두께는 1 내지 100㎛, 1 내지 50㎛, 1 내지 30㎛, 1 내지 25㎛, 1 내지 20㎛, 1 내지 15㎛, 1 내지 10㎛, 2 내지 8㎛, 3 내지 7㎛ 또는 4 내지 6㎛이지만, 상기에서 언급된 것과 같이 더 두꺼운 샘플도 사용될 수 있다.
조직 샘플 절편이 어레이와 접촉될 때, 예컨대 삽입 물질의 제거, 예컨대 파라핀 제거 과정 후에 조직 샘플 중의 핵산, 예컨대 RNA 분자는 어레이 상에 고정된 포획 프로브에 결합할 것이다. 어떤 구체예에서 핵산, 예컨대 RNA 분자의 포획 프로브에의 혼성화를 촉진하는 것이 유익할 것이다. 전형적으로 혼성화를 촉진하는 것은 혼성화가 일어나는 조건을 변형하는 것을 포함한다. 변형될 수 있는 일차 조건은 역전사 단계 전에 어레이 상의 조직 단편의 인큐베이션의 시간과 온도이고, 그것은 본원의 다른 곳에서 설명된다.
예를 들어 조직 샘플 절편을 어레이와 접촉시킬 때, 어레이는 최소한 1시간 동안 인큐베이션됨으로써 핵산, 예컨대 RNA가 포획 프로브에 혼성화되는 것이 가능해진다. 바람직하게는 어레이는 최소한 2, 3, 5, 10, 12, 15, 20, 22 또는 24시간 동안 또는 조직 샘플 절편이 건조될 때까지 인큐베이션될 수 있다. 어레이 인큐베이션 시간은 중요하지 않으며, 어떠한 편리한 또는 필요한 시간이 사용될 수 있다. 전형적인 어레이 인큐베이션은 72시간까지일 수 있다. 그러므로 인큐베이션은 어떠한 적당한 온도에서, 예를 들면 실온에서 일어날 수 있지만, 바람직한 구체예에서 조직 샘플 절편은 최소한 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37℃의 온도에서 어레이 상에서 인큐베이션된다. 최대 55℃까지의 인큐베이션 온도가 해당 기술분야에서는 다반사이다. 특히 바람직한 구체예에서 조직 샘플 절편은 37℃에서 24시간 동안 어레이 상에서 건조되도록 허용된다. 일단 조직 샘플 절편이 건조되면, 어레이는 역전사 단계가 수행되기 전에 실온에서 보관될 수 있다. 만약 조직 샘플 절편이 어레이의 표면에서 건조되는 것이 가능하다면, 포획된 핵산의 추가의 조작이 이루어질 수 있기 전에, 예컨대 포획된 RNA의 역전사 단계 전에 단편은 재수화될 필요가 있다는 것이 인지될 것이다.
그러므로 본 발명의 방법은 샘플을 어레이와 접촉시키는 단계 후에 조직 샘플을 재수화시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 조직 샘플을 어레이와 접촉시키기 전에, 특히 조직 샘플 중의 핵산이, 그것이 어레이에 포획되기 전에 변형 과정의 대상이 될 때, 포획 프로브를 차단 (예컨대 엄폐 또는 변형)하는 것이 유익할 수 있다. 구체적으로 포획 프로브의 유리 3' 단부를 차단 또는 변형하는 것이 유익할 수 있다. 특정 구체예에서 조직 샘플 중의 핵산, 예컨대 단편화된 게놈 DNA는 포획 프로브에 의해 포획될 수 있도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 그리고 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 어댑터 서열 (포획 프로브의 포획 도메인에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함함)이 핵산, 예컨대 단편화된 게놈 DNA의 단부에 첨가될 수 있다. 이것은 예를 들면 어댑터의 결찰 또는 핵산의 연장에 의해, 예컨대 서열의 단부에서 추가의 뉴클레오티드, 예컨대 폴리-A 꼬리를 통합시키기 위한 효소를 사용하여 이루어질 수 있다. 포획 프로브의 변형을 피하기 위해, 예컨대 포획 프로브의 유리 3' 단부에 폴리-A 꼬리가 첨가되는 것을 피하기 위해 조직 샘플이 어레이와 접촉되기 전에 포획 프로브, 특히 포획 프로브의 유리 3' 단부를 차단 또는 변형하는 것이 필요하다. 바람직하게는 차단 도메인의 통합은 포획 프로브가 합성될 때 그 안에 통합된다. 그러나 차단 도메인은 포획 프로브의 합성 후에 그 안에 통합될 수 있다.
어떤 구체예에서 포획 프로브는 조직 샘플의 핵산이 변형되는 과정 중에 포획 도메인의 변형을 방지할 수 있을 어떠한 적당하고 가역적인 수단에 의해 차단될 수 있고, 그것은 조직 샘플이 어레이와 접촉된 후에 일어난다. 달리 표현하면, 포획 프로브는 포획 프로브의 포획 도메인이 유리 3' 단부를 포함하지 않도록, 즉 3' 단부가 제거되거나 변형되거나, 또는 접근할 수 없게 되어 포획 프로브가 조직 샘플의 핵산을 변형하기 위해 사용되는 과정, 예컨대 결찰 또는 연장을 수행할 수 없거나, 또는 추가의 뉴클레오티드가 포획 프로브의 포획 도메인의 3'단부를 드러내거나 및/또는 복원하기 위해 제거될 수 있도록 가역적으로 엄폐되거나 변형될 수 있다.
예를 들어 차단 프로브는 포획 프로브에 혼성화하여 포획 프로브, 예컨대 헤어핀 프로브 또는 부분적으로 이중 가닥 프로브의 유리 3' 단부를 차단할 수 있고, 그것의 적당한 실례는 해당 기술분야에 알려져 있다. 포획 도메인의 유리 3' 단부는 화학적 변형, 예컨대 화학적으로 가역적인 캡핑 부분으로서 아지도메틸 기의 첨가에 의해 차단될 수 있어서 포획 프로브는 유리 3' 단부를 포함하지 않는다. 적당한 대체 캡핑 부분은 해당 기술분야에 잘 알려져 있는데, 예를 들면 포획 도메인의 말단 뉴클레오티드는 가역적인 터미네이터 뉴클레오티드일 수 있고, 그것은 프로브 합성 중에 또는 후에 포획 프로브에 포함될 수 있다.
또는 달리 또는 추가로, 포획 프로브의 포획 도메인은 조직 샘플의 핵산 분자가 변형될 때 일어나는 포획 프로브의 어떠한 변형, 예컨대 추가의 뉴클레오티드의 제거를 허용하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어 포획 프로브는 포획 도메인의 하류에, 즉 포획 도메인의 3'에 추가의 서열, 즉 차단 도메인을 포함할 수 있다. 이것은 예컨대 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열 또는 특이한 효소 활성에 의해 절단가능한 뉴클레오티드 서열, 예컨대 우라실의 형태일 수 있다. 조직 샘플의 핵산의 변형 후에, 포획 프로브는 효소적 절단이 수행될 수 있고, 그것으로 인해 차단 도메인 및 변형 과정 중에 포획 프로브의 3' 단부에 첨가된 어떠한 추가 뉴클레오티드의 제거가 가능해진다. 차단 도메인의 제거로 포획 프로브의 포획 도메인의 유리 3' 단부가 드러나거나 및/또는 복원될 것이다. 차단 도메인은 포획 프로브의 일부로서 합성될 수 있거나 또는 예컨대 차단 도메인의 결찰에 의해 제자리에서 (즉 기존 어레이의 변형으로서) 포획 프로브에 첨가될 수 있다.
포획 프로브는 상기에서 설명된 차단 메커니즘의 어떠한 조합을 사용하여 차단될 수 있다.
일단 조직 샘플의 핵산, 예컨대 단편화된 게놈 DNA가 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하는 것이 가능해지도록 변형된 후에는, 포획 프로브는 예컨대 차단 올리고뉴클레오티드의 분리, 캡핑 부분 및/또는 차단 도메인의 제거에 의해 차단되지 않아야 한다.
어레이의 각 피쳐로부터 얻어진 서열 분석 또는 전사체 또는 게놈 정보를 조직 샘플의 영역 (즉 구역 또는 세포)과 연관짓기 위해서, 조직 샘플은 어레이 상의 피쳐와 관련하여 배열된다. 달리 표현하면, 조직 샘플은 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 어레이 상에 놓인다. 그러므로 조직 샘플에서 각 종의 포획 프로브 (또는 어레이의 각 피쳐)의 위치가 상응하게 되는 경우 식별될 수 있다. 달리 표현하면, 조직 샘플에서 그 위치에 각 종의 포획 프로브가 상응하게 되는 곳을 식별할 수 있다. 이것은 아래에서 설명되는 것과 같이 어레이 상에 존재하는 위치 마커에 의해 이루어질 수 있다. 편리하게도, 그러나 필수적인 것은 아니지만, 조직 샘플은 그것과 어레이와의 접촉 후에 영상화될 수 있다. 이것은 조직 샘플의 핵산이 프로세스되기 전 또는 후, 예컨대 방법의 cDNA 생성 단계, 특히 역전사에 의해 첫 번째 가닥의 cDNA를 생성하는 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조직 샘플은 포획되고 합성된 (즉 연장되거나 결찰된) DNA, 예컨대 cDNA의 어레이로부터의 방출 전에 영상화된다. 특히 바람직한 구체예에서, 조직은 조직 샘플의 핵산이 프로세스된 후에, 예컨대 역전사 단계 후에 영상화되고, 어떠한 잔류 조직은 분자, 예컨대 cDNA가 어레이로부터 방출되기 전에 어레이로부터 제거 (예컨대 세척)된다. 어떤 구체예에서, 포획된 핵산을 프로세싱하는 단계, 예컨대 역전사 단계는 예컨대 초저온 냉동에 의해 제조되는 조직을 사용할 때 어레이 표면으로부터 잔류 조직을 제거하는 작용을 할 수 있다. 그런 경우에 조직 샘플의 영상화는 프로세싱 단계, 예컨대 cDNA 합성 단계 전에 일어날 수 있다. 일반적으로 영상화는 조직 샘플이 면적과 접촉한 후라면 어느 시간에든지 일어날 수 있지만, 조직 샘플을 분해하거나 제거하는 어떠한 단계 전에 일어날 수 있다. 상기에서 주지된 바와 같이 이것은 조직 샘플에 따라 달라진다.
유익하게도, 어레이는 어레이의 피쳐와 관련하여 조직 샘플의 배향 또는 그것의 영상을 촉진하기 위한 마커를 포함할 수 있다. 조직 샘플이 영상화될 때 검출가능한 것이라면 어떠한 것이든지 어레이를 표시하기 위해 적당한 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어 신호, 바람직하게는 육안으로 볼 수 있는 신호를 생성하는 분자, 예컨대 형광 분자가 어레이의 표면에 직접 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 바람직하게는 어레이는 어레이 표면의 뚜렷한 위치에서 최소한 2개, 더욱 바람직하게는 최소한 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 마커를 포함한다. 편리하게도 수백 개 또는 심지어 수천 개의 마커가 사용될 수 있다. 마커는 예를 들면 어레이의 바깥쪽 가장자리, 예컨대 어레이의 피쳐의 전체 바깥쪽 열을 구성하는 패턴으로 제공될 수 있다. 다른 유익한 패턴, 예를 들면 어레이를 구분하는 라인 패턴도 사용될 수 있다. 이것은 조직 샘플의 영상이 어레이에 일렬배열되는 것, 또는 실제로 일반적으로 어레이의 피쳐를 조직 샘플에 연관짓는 것을 촉진할 수 있다. 그러므로 마커는 신호를 제공하는 분자가 신호를 생성하기 위해 상호작용할 수 있는 고정된 분자일 수 있다. 대표적인 실례에서, 어레이는 마커 피쳐, 예컨대 어레이의 기판 위에 고정된 핵산 프로브를 포함할 수 있는데, 그것에 표지된 핵산이 혼성화할 수 있다. 예를 들어 표지된 핵산 분자, 또는 마커 핵산은 특정 파장 (또는 파장 범위)의 빛에 노출될 때, 즉 여기될 때 형광을 낼 수 있는 화학적 부분에 연결 또는 결합될 수 있다. 그런 마커 핵산 분자는 조직 샘플이 조직 샘플을 가시화하기 위해 또는 영상화하기 위해 염색되기 전, 염색과 동시에 또는 그 후에 어레이와 접촉할 수 있다. 그러나 마커는 조직 샘플이 영상화될 때 검출가능해야 한다. 그러므로 바람직한 구체예에서, 마커는 조직 샘플을 가시화하기 위하여 사용된 동일한 영상화 조건을 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 어레이는 표지된, 바람직하게는 형광 표지된 마커 핵산 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 마커 피쳐를 포함한다.
조직을 영상화하는 단계는 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 편리한 조직학적 수단, 예를 들면 빛, 명시야 (bright field), 암시야 (dark field), 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 그것들의 조합을 사용할 수 있다. 전형적으로 조직 샘플은 조직 샘플의 상이한 영역들, 예컨대 세포 사이의 대조를 보여주기 위한 가시화 단계 전에 염색된다. 사용된 염색의 유형은 조직 유형과 염색하고자 하는 세포의 영역에 따라 좌우될 것이다. 그런 염색 프로토콜은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 어떤 구체예에서 조직 샘플의 상이한 측면, 예컨대 조직 샘플의 상이한 영역, 특이한 세포 구조 (예컨대 세포기관) 또는 상이한 세포 유형을 가시화 (영상화)하기 위해 하나 이상의 염색이 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 조직 샘플은 예컨대 조직 샘플이 충분한 대조를 제공하는 안료를 이미 함유하고 있거나 특정 형태의 현미경이 사용되는 경우 샘플을 염색하는 일 없이 가시화되거나 영상화될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 조직 샘플은 형광 현미경을 사용하여 가시화되거나 영상화된다.
조직 샘플, 즉 역전사 단계 및 임의로 영상화 단계 후에도 어레이 기판과 접촉을 유지하고 있는 어떠한 잔류 조직은 만약 영상화가 바람직하고 역전사 전에 수행되지 않았다면, 바람직하게는 어레이로부터 cDNA 분자가 방출되는 단계 전에 제거되어야 한다. 그러므로 본 발명의 방법은 어레이의 세척 단계를 포함할 수 있다. 잔류 조직 샘플의 제거는 어떠한 적당한 수단을 사용하여 수행될 수 있고, 조직 샘플에 따라 좌우될 것이다. 가장 간단한 구체예에서, 어레이는 물로 세척될 수 있다. 물은 조직의 제거를 촉진하기 위해 다양한 첨가제, 예를 들면 계면활성제 (예컨대 세제), 효소 등을 함유할 수 있다. 어떤 구체예에서, 어레이는 단백질 분해효소 K와 같은 단백질 분해효소 (및 적당한 완충제)를 포함하는 용액으로 세척된다. 다른 구체예에서, 용액은 또한 또는 다르게는 예컨대 조직 샘플이 식물 또는 진균류 공급원으로부터 얻어진 것이라면 셀룰라제, 헤미셀룰라제 또는 키티나제 효소를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 어레이를 세척하기 위해 사용된 용액의 온도는 예컨대 최소한 30℃, 바람직하게는 최소한 35, 40, 45, 50 또는 55℃일 수 있다. 세척 용액은 고정된 핵산 분자의 파괴를 최소화해야 한다는 것은 명백할 것이다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 핵산 분자는 어레이의 기판 위에 간접적으로, 예컨대 포획 프로브와 RNA 및/또는 포획 프로브와 표면 프로브의 혼성화를 통해 고정될 수 있고, 그로써 세척 단계는 어레이 위에 고정된 분자 사이의 상호작용을 간섭해서는 안된다, 즉 핵산 분자가 변성되는 것을 유발해서는 안된다.
조직 샘플의 핵산, 예컨대 RNA (바람직하게는 mRNA)와 포획 프로브 사이에 혼성화가 일어나는 것이 허용되기에 충분한 조건 하에서 어레이가 조직 샘플과 접촉하는 단계에 이어서, 혼성화된 핵산의 확보 (획득) 단계가 일어난다. 포획된 핵산의 확보 또는 획득은 혼성화된 핵산의 상보하는 가닥이 포획 프로브에 공유 부착되는 것을 포함하고 (즉 뉴클레오티드 결합, 두 개의 바로 인접한 뉴클레오티드의 나란히 놓여 있는 3'-히드록실과 5'-포스페이트 말단 사이의 포스포디에스테르 결합을 통해), 그로써 포획된 핵산은, 그 위에서 핵산이 포획되는 피쳐에 특이한 위치 도메인으로 꼬리표가 달리거나 표시된다.
어떤 구체예에서, 혼성화된 핵산, 예컨대 단일 가닥의 핵산을 확보하는 것은 포획 프로브를 연장하여 포획된 핵산의 복사물을 생성하는 것, 예컨대 포획된 (혼성화된) RNA로부터 cDNA를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 혼성화된 핵산의 상보하는 가닥의 합성, 예컨대 포획된 RNA 주형 (포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화된 RNA)을 토대로 한 cDNA의 생성을 말하는 것임이 인지될 것이다. 그러므로 포획 프로브를 연장하는 초기 단계에서, 예컨대 cDNA 생성 단계에서, 포획된 (혼성화된) 핵산, 예컨대 RNA는 연장에 대해, 예컨대 역전사 단계에서 주형으로서 작용한다. 다른 구체예에서, 아래에서 설명되는 것과 같이 혼성화된 핵산, 예컨대 부분적으로 이중 가닥의 DNA를 확보하는 것은 혼성화된 핵산, 예컨대 단편화된 DNA를 포획 프로브에 공유 결합시키는 것, 예컨대 결찰 반응에서 포획 프로브에 혼성화된 핵산의 상보하는 가닥을 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함할 수 있다.
역전사는 RNA로부터, 바람직하게는 mRNA (메신저 RNA)로부터, 역전사효소에 의해 cDNA (상보성 또는 복사 DNA)를 합성하는 단계에 관한 것이다. 그러므로 cDNA는 조직 샘플이 취해지는 시간에 세포에 존재하는 RNA의 복사물일 것으로 간주될 수 있다. 즉 그것은 분리시에 상기 세포에서 발현된 유전자의 전부 또는 일부를 나타낸다.
포획 프로브, 구체적으로 포획 프로브의 포획 도메인은 포획 프로브에 혼성화된 핵산의 상보성 가닥을 생성하기 위한 프라이머, 예컨대 역전사를 위한 프라이머로서 작용한다. 그러므로 예컨대 포획 프로브의 서열을 통합시키는 연장 반응, 예컨대 역전사 반응에 의해 생성된 핵산, 예컨대 cDNA 분자는 어레이의 각 피쳐와 접촉하게 되는 조직 샘플의 핵산, 예컨대 전사물을 간접적으로 표지화하는 방법으로 볼 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 포획 프로브의 각각의 종은 어레이의 각 피쳐에 대해 독특한 서열을 나타내는 위치 도메인 (피쳐 식별 태그)을 포함한다. 그러므로 특이한 피쳐에서 합성된 모든 핵산, 예컨대 cDNA는 동일한 핵산 "태그"를 포함할 것이다.
어레이의 각 피쳐에서 합성된 핵산, 예컨대 cDNA 분자는 그 피쳐와 접촉하는 조직 샘플, 예컨대 조직 또는 세포 유형 또는 그룹 또는 그것의 하위 그룹의 영역 또는 지역의 게놈, 또는 그것으로부터 발현된 유전자를 나타내는 것일 수 있고, 나아가 특정 조건, 예컨대 특정한 시간 하에 특정 환경에서, 발달 단계에서 또는 자극에 대한 반응으로 등 특정 조건 하에서 발현된 유전자를 나타낼 수 있다. 그러므로 어떠한 단일 피쳐에서의 cDNA는 단일 세포에서 발현된 유전자를 나타내거나, 또는 만약 피쳐가 세포 접합부에서 샘플과 접촉하게 되면 cDNA는 한 세포 이상의 세포에서 발현된 유전자를 나타낼 수 있다. 유사하게 만약 단일 세포가 다수의 피쳐와 접촉하게 된다면, 그때에는 각 피쳐는 상기 세포에서 발현된 유전자의 비율을 나타낼 수 있다. 유사하게, 포획된 핵산이 DNA인 구체예에서, 어떠한 단일 피쳐는 단일 세포 또는 하나 이상의 세포의 게놈을 대표할 것이다. 또는 달리, 단일 세포의 게놈은 다수의 피쳐에 의해 나타낼 수 있다.
포획 프로브를 연장시키는 단계, 예컨대 역전사는 어떠한 적당한 효소를 사용하여 수행될 수 있고, 그것의 프로토콜은 해당 기술분야에 이미 알려져 있으며, 아래에서 상세하게 설명되는 것과 같다. 그러나 첫 번째 핵산, 예컨대 cDNA 가닥의 합성을 위한 프라이머를 제공하는 것이 반드시 필요한 것이 아니라는 것은 명백할 것인데, 왜냐하면 포획 프로브의 포획 도메인이 프라이머, 예컨대 역전사 프라이머로서 작용하기 때문이다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 확보된 핵산 (즉 포획 프로브에 공유 부착된 핵산), 예컨대 cDNA는 이중 가닥 DNA를 포함하도록 처리된다. 그러나 어떤 구체예에서, 예컨대 부분적으로 이중 가닥인 단편화된 DNA가 포획 프로브에 결찰된 경우에는 포획된 DNA는 이미 이중 가닥 DNA를 포함한다. 포획된 핵산을, 이중 가닥 DNA를 생성하도록 처리하는 것은 두 번째 DNA, 예컨대 cDNA 가닥만을 생성하기 위한, 즉 이중 가닥 DNA 분자의 수를 증가시키지 않으면서 이중 가닥 DNA 분자를 생성하기 위한 단일 반응에서, 또는 단일 가닥 DNA의 형태 (예컨대 선형 증폭) 또는 이중 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 형태 (예컨대 지수형 증폭)일 수 있는 두 번째 가닥의 다수의 복사물을 생성하기 위한 증폭 반응에서 이루어질 수 있다.
두 번째 가닥 DNA, 예컨대 cDNA의 합성 단계는 어레이 상에서 제자리에서, 예컨대 아래에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이 무작위 프라이머를 사용하여 두 번째 가닥 합성의 별개의 단계로서, 또는 증폭 반응의 초기 단계로 일어날 수 있다. 또는 달리 첫 번째 가닥의 DNA, 예컨대 cDNA (포획 프로브를 포함하는, 즉 통합하는 가닥)는 어레이로부터 방출될 수 있고, 두 번째 가닥 합성은 그것이 별개의 단계로서든 또는 증폭 반응으로든 계속해서, 예컨대 용액 중에서 수행되는 반응으로서 일어날 수 있다.
두 번째 가닥 합성이 어레이 상에서 (즉 제자리에서) 일어나는 경우, 그 방법은 포획된 핵산, 예컨대 RNA를 두 번째 가닥 합성 전에, 예를 들면 RNA 소화 효소, 예컨대 RNaes H를 사용하여 제거하는 임의의 단계를 포함할 수 있다. 이것에 대한 과정은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고 설명되어 있다. 그러나 이것은 일반적으로는 필요하지 않으며, 대부분의 경우에 RNA는 자연스럽게 분해된다. 어레이로부터 조직 샘플의 제거는 보통은 어레이로부터 RNA를 제거할 것이다. RNase H는 왕성한 RNA 제거를 증가시키고자 할 때 사용될 수 있다.
예를 들어 다량의 RNA를 포함하는 조직 샘플에서, 이중 가닥 cDNA를 생성하는 단계로 인해 직접 서열화될 수 있는 (어레이로부터 방출된 후에) cDNA의 충분한 양이 생성될 것이다. 이런 경우에, 두 번째 가닥 cDNA 합성은 해당 기술분야에 공지되어 있고, 아래에서 설명되는 어떠한 수단에 의해서든 이루어질 수 있다. 두 번째 가닥 합성 반응은 어레이 상에서 직접적으로, 즉 cDNA가 어레이 상에 고정되는 중에 수행될 수 있거나, 또는 바람직하게는 아래에서 설명되는 것과 같이 cDNA가 어레이 기판으로부터 방출된 후에 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, 확보된 핵산, 예컨대 합성된 cDNA의 양을, DNA 서열화에 충분한 양을 생산하기 위해 증강, 즉 증폭시키는 것이 필요할 것이다. 이런 구체예에서 확보된 핵산, 예컨대 어레이의 피쳐의 포획 프로브를 또한 포함하는 cDNA 분자의 첫 번째 가닥은 증폭 반응, 예컨대 중합효소 연쇄 반응에 대한 주형으로서 작용한다. 증폭의 첫 번째 반응 생성물은 DNA, 예컨대 cDNA의 두 번째 가닥일 것이고, 그것은 그 자체로 증폭 반응의 추가의 주기에 대한 주형으로서 작용할 것이다.
상기에서 설명된 구체예의 어느 것에서든지, DNA, 예컨대 cDNA의 두 번째 가닥은 포획 프로브의 상보물을 포함할 것이다. 만약 포획 프로브가 보편적 도메인, 및 특히 보편적 도메인 내에 증폭 도메인을 포함한다면, 이것은 DNA, 예컨대 cDNA의 계속되는 증폭에 대해 사용될 수 있다. 예컨대 증폭 반응은 증폭 도메인과 동일한 서열을 가지는 프라이머, 즉 증폭 도메인의 상보물에 상보하는 (즉 혼성화하는) 프라이머를 포함할 수 있다. 증폭 도메인이 포획 프로브의 위치 도메인의 위쪽에 있다 (확보된 핵산, 예컨대 첫 번째 cDNA 가닥에서)는 사실의 관점에서, 위치 도메인의 상보물은 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 두 번째 가닥에 통합될 것이다.
DNA, 예컨대 cDNA의 두 번째 가닥이 단일 반응에서 생성되는 구체예에서, 두 번째 가닥 합성은 어떠한 적당한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는, 반드시 필수적인 것은 아니지만 어레이 기판으로부터 방출된 첫 번째 가닥 cDNA는 무작위 프라이머, 예컨대 헥사머 프라이머 및 DNA 중합효소, 바람직하게는 가닥 대체 중합효소, 예컨대 클레노우 (exo)와 주형이 있는 DNA 합성이 일어나기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 이 과정으로 다양한 길이의 이중 가닥 cDNA 분자가 생성될 것이고, 전체 길이의 cDNA 분자, 즉 그것들의 합성되는 전체 mRNA에 상응하는 cDNA 분자는 생성되지 않는 것으로 보인다. 무작위 프라이머는 무작위 위치에서, 즉 서열의 단부에서보다는 서열 내부에서 첫 번째 가닥의 cDNA 분자에 혼성화할 것이다.
만약 전-길이의 DNA, 예컨대 cDNA 분자, 즉 포획된 핵산, 예컨대 RNA 분자 전체에 상응하는 분자를 생성하는 것이 바람직하다면 (만약 핵산, 예컨대 RNA가 부분적으로 조직 샘플에서 분해되었다면, 그때에는 포획된 핵산, 예컨대 RNA 분자는 "전-길이" 전사물이 아니거나 게놈 DNA의 초기 단편과 동일한 길이가 아닐 것이다), 확보된 핵산, 예컨대 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3' 단부가 변형될 수 있다. 예를 들어 링커 또는 어댑터는 cDNA 분자의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 이것은 T4 RNA 결찰 효소 또는 CircligaseTM (Epicentre Biotechnologies)과 같은 단일 가닥의 결찰 효소를 사용하여 이루어질 수 있다.
또는 달리 헬퍼 프로브 (첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3' 단부에 혼성화할 수 있는 부분적으로 이중 가닥 DNA 분자)가 확보된 핵산, 예컨대 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3' 단부에, T4 DNA 결찰 효소와 같은 이중 가닥 결찰 효소를 사용하여 결찰될 수 있다. 결찰 단계에 적절한 다른 효소들은 해당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 Tth DNA 결찰 효소, Taq DNA 결찰 효소, 써모코쿠스 종 (스트레인 9°N) DNA 결찰 효소 (9°NTM DNA 결찰 효소, New England Biolabs), 및 AmpligaseTM (Epicentre Biotechnologies)이 있다. 헬퍼 프로브는 또한 그것으로부터 두 번째 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 합성이 확보된 핵산, 예컨대 첫 번째 cDNA 가닥에 결찰된 헬퍼 프로브의 부분에 상보하는 프라이머를 사용하여 프라임될 수 있는 특이한 서열을 포함한다. 추가의 대체물은 폴리뉴클레오티드 꼬리, 예컨대 폴리-A 꼬리를 확보된 핵산, 예컨대 cDNA의 첫 번째 가닥 분자의 3' 단부에 통합시키기 위해 말단 트란스페라제 활성 효소를 사용하는 것을 포함한다. 두 번째 가닥 합성은 폴리-T 프라이머를 사용하여 프라임될 수 있는데, 그것은 또한 추가의 증폭을 위한 특이한 증폭 도메인을 포함할 수 있다. "전-길이" 이중 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 생성 (또는 최대 길이의 두 번째 가닥 합성)하기 위한 다른 방법은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있다.
어떤 구체예에서, 두 번째 가닥 합성은 예컨대 Clontech®로부터의 SMARTTM 기술을 사용하여 주형 전환 방법을 사용할 수 있다. SMART (RAN 주형의 5' 단부에서의 전환 메커니즘) 기술은 해당 기술분야에 잘 수립되어 있고, 역전사 효소, 예를 들면 Superscript® II (Invitrogen)가 연장된 cDNA 분자의 3' 단부에서 몇 개의 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다는 발견, 즉 3' 단부에서 단일 가닥 DNA 돌출부로 DNA/RNA 하이브리드를 생성하는 것을 토대로 한다. DNA 돌출부는 그것에 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화되어 cDNA 분자의 추가의 연장을 위한 추가 주형을 제공하기 위한 표적 서열을 제공할 수 있다. 유익하게도 cDNA 돌출부에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 증폭 도메인 서열을 함유하고, 그것의 상보물은 합성된 첫 번째 가닥 cDNA 생성물에 통합된다. 증폭 도메인 서열을 함유하고 cDNA 첫 번째 가닥에 통합된 상보성 증폭 도메인 서열에 혼성화하게 될 프라이머는, 반응 혼합물에 첨가되어 적당한 중합효소 및 주형으로서 cDNA 첫 번째 가닥을 사용하여 두 번째 가닥 합성을 프라임할 수 있다. 이 방법은 어댑터를 cDNA 첫 번째 가닥의 3'단부에 결찰시킬 필요성을 피하게 해준다. 주형 전환이 원래 5' 캡 구조를 가지고 있는 전-길이 mRNA에 대해 개발된 한편, 캡 구조가 없는 절단된 mRNA를 사용했을 때에도 마찬가지로 잘 작업할 수 있다는 것이 입증되어 왔다. 그러므로 주형 전환은 본 발명의 방법에서 전 길이 및/또는 부분 또는 절단된 cDNA 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 바람직한 구체예에서, 두 번째 가닥 합성은 주형 전환을 활용하거나, 또는 그것에 의해 이루어질 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서 주형 전환 반응, 즉 상보하는 증폭 도메인을 통합시키기 위한 cDNA 첫 번째 가닥의 추가의 연장은 제자리에서 수행된다 (한편 포획 프로브는 여전히 직접 또는 간접적으로 어레이에 부착된다). 바람직하게는 두 번째 가닥 합성 반응도 또한 제자리에서 수행된다.
DNA, 예컨대 cDNA 분자를 증강, 풍부화 또는 증폭시키는 것이 필요하거나 유익한 구체예에서, 증폭 도메인은 DNA, 예컨대 cDNA 분자에 통합될 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같이, 첫 번째 증폭 도메인은 포획 프로브가 증폭 도메인을 포함하고 있는 보편적 도메인을 포함하고 있을 때 확보된 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자의 첫 번째 가닥 안에 통합될 수 있다. 이들 구체예에서, 두 번째 가닥 합성은 두 번째 증폭 도메인을 통합할 수 있다. 예를 들어 두 번째 가닥 cDNA를 생성하기 위해 사용되고 헬퍼 프로브에 상보하는 프라이머, 예컨대 무작위 헥사머 프라이머, 폴리-T 프라이머는 그것의 5' 단부에 증폭 도메인, 즉 그것에 증폭 프라이머가 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 그 결과의 이중 가닥 DNA는 이중 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 각 5' 단부에 또는 5' 단부를 향한 증폭 도메인을 포함할 수 있다. 이들 증폭 도메인은 증폭 반응, 예컨대 RCA에서 사용되는 프라이머에 대한 표적으로서 사용될 수 있다. 또는 달리 확보된 핵산 분자, 예컨대 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3' 단부에 결찰된 링커 또는 어댑터는 두 번째 증폭 도메인을 포함하는 두 번째 보편적 도메인을 포함할 수 있다. 유사하게, 두 번째 증폭 도메인은 주형 전환에 의해 첫 번째 가닥 cDNA 분자에 통합될 수 있다.
포획 프로브가 보편적 도메인을 포함하지 않는 경우, 특히 증폭 도메인을 포함하고 있는 구체예에서, cDNA 분자의 두 번째 가닥은 상기 설명에 따라 합성될 수 있다. 그 결과의 이중 가닥 DNA 분자는 첫 번째 DNA, 예컨대 cDNA 가닥의 5' 단부에 증폭 도메인을 통합시키기 위해 (첫 번째 증폭 도메인), 그리고 두 번째 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 합성 단계에서 통합되지 않았다면 두 번째 DNA, 예컨대 cDNA 가닥의 5' 단부에 증폭 도메인을 통합시키기 위해 (두 번째 증폭 도메인) 변형될 수 있다. 그런 증폭 도메인은 예를 들면 이중 가닥 어댑터를 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 단부들에 결찰시킴으로써 통합될 수 있다. 결찰 단계에 적절한 효소들은 해당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면 Tth DNA 결찰 효소, Taq DNA 결찰 효소, 써모코쿠스 종 (스트레인 9°N) DNA 결찰 효소 (9°NTM DNA 결찰 효소, New England Biolabs), AmpligaseTM (Epicentre Biotechnologies) 및 T4 DNA 결찰효소가 있다. 바람직한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 증폭 도메인은 상이한 서열을 포함한다.
그러므로 상기 설명으로부터 증폭 도메인을 포함할 수 있는 보편적 도메인이 확보된 (즉 연장되거나 결찰된) DNA 분자, 예를 들면 cDNA 분자, 또는 그것의 상보물 (예컨대 두 번째 가닥)에 다양한 방법과 기술 및 해당 기술분야에 공지되어 있는 그런 기술에 의해, 예컨대 그런 도메인, 어댑터의 결찰, 말단 트란스퍼라제 효소의 사용에 의해 및/또는 주형 전환 방법에 의해 첨가될 수 있다는 것이 명백하다. 본원에서 논의된 것으로부터 명백한 것처럼, 그런 도메인은 어레이로부터 DNA 분자가 방출되기 전 또는 후에 첨가될 수 있다.
상기 설명으로부터, 본 발명의 방법에 의해 합성된 단일 어레이로부터의 모든 DNA, 예컨대 cDMA 분자는 동일한 첫 번째 및 두 번째 증폭 도메인을 모두 포함할 것이다. 따라서 단일 증폭 반응, 예컨대 PCR은 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 전부를 증폭시키기에 충분할 것이다. 그러므로 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 증폭 단계는 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 어레이의 기판으로부터의 방출 후에 수행된다. 다른 구체예에서, 증폭은 어레이 상에서 (즉 어레이 상의 제자리에서) 수행될 수 있다. 증폭 반응은 그런 반응을 수행하기 위해 존재하는 어레이 및 온-칩 써모사이클러 상에서 수행될 수 있는 것으로 해당 기술분야에 알려져 있다. 그러므로 한 구체예에서, 해당 기술분야에서 서열화 플랫폼으로서 또는 서열 분석의 어떠한 형태에서 (예컨대 차세대 서열화 기술에서 또는 그것에 의해) 사용하기 위해 알려져 있는 어레이는 본 발명의 어레이의 토대로서 사용될 수 있다 (예컨대 일루미나 비드 어레이 등).
두 번째 가닥의 DNA, 예컨대 cDNA의 합성을 위해서는, 만약 어레이의 기판으로부터 방출된 cDNA가 부분적으로 이중 가닥의 핵산 분자를 포함하고 있다면 가닥 대체 중합효소 (예컨대 φ29 DNA 중합효소, Bst(exo-) DNA 중합효소, 클레노우 (exo-) DNA 중합효소)를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 방출된 핵산은, 포획 프로브가 표면 프로브를 통하여 어레이의 기판 위에 간접적으로 고정되어 있고, DNA, 예컨대 cDNA 분자의 방출 단계가 절단 단계를 포함하고 있는 구체예에서는 최소한 부분적으로 이중 가닥일 것이다 (예컨대 DNA:DNA, DNA:RNA 또는 DNA:DNA/RNA 하이브리드). 가닥 대체 중합효소는 두 번째 cDNA 가닥 합성이 위치 도메인의 상보물 (피쳐 식별 도메인)을 두 번째 DNA, 예컨대 cDNA 가닥 안으로 통합시키는 것을 보장하기 위해 필요하다.
최소한 일부분의 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 그것의 암플리콘을 어레이의 표면 또는 기판으로부터 방출시키는 단계는 많은 방법을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 방출 단계의 일차 목적은 그 안에 포획 프로브의 위치 도메인 (또는 그것의 상보물)이 통합되어 (또는 포함되어) 그로써 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 그것의 암플리콘이 어레이 상의 그것의 피쳐 (또는 위치)에 따라 "태그"되는 분자를 생산하는 것이다. 그러므로 방출 단계는 어레이로부터 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 그것의 암플리콘을 제거하고, 그 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 암플리콘은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함한다 (확보된 핵산, 예컨대 첫 번째 가닥 cDNA 안으로, 예를 들면 포획 프로브의 연장에 의해 통합되어 있음으로써, 그리고 임의로 만약 두 번째 가닥 합성이 어레이 상에서 일어난다면 두 번째 가닥에 복사되거나 또는 만약 증폭이 어레이 상에서 일어난다면 암플리콘 안으로 복사된다). 그러므로 조직 샘플 중의 다양한 영역과 연관될 수 있는 서열 분석 데이터를 얻기 위해서는 방출된 분자가 포획 프로브의 위치 도메인 (또는 그것의 상보물)을 포함하는 것이 필수적이다.
방출된 분자는 첫 번째 및/또는 두 번째 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 암플리콘일 수 있기 때문에, 그리고 포획 프로브는 간접적으로 어레이 위에 고정될 수 있기 때문에, 방출 단계가 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 어레이로부터 절단하는 단계를 포함할 수 있는 한편으로 방출 단계는 핵산 절단 단계를 필요로 하지 않고, DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 암플리콘은 이중 가닥 분자를 변성시킴으로써, 예를 들면 두 번째 cDNA 가닥을 첫 번째 cDNA 가닥으로부터 방출시키거나, 암플리콘을 그것의 주형으로부터 방출시키거나, 또는 첫 번째 가닥 cDNA 분자 (즉 연장된 포획 프로브)를 표면 프로브로부터 방출시킴으로써 간단하게 방출될 수 있다. 따라서, DNA, 예컨대 cDNA 분자는 어레이로부터 핵산 절단에 의해 및/또는 변성에 의해 (예컨대 이중 가닥 분자를 변성시키기 위해 가열함으로써) 방출될 수 있다. 증폭이 어레이 위에서 제자리 수행되는 경우, 이것은 물론 순환 반응에서 변성에 의해 암플리콘을 방출시키는 것을 포함할 것이다.
어떤 구체예에서, DNA, 예컨대 cDNA 분자는 포획 프로브의 보편적 도메인 또는 위치 도메인에 위치할 수 있는 절단 도메인의 효소적 절단에 의해 방출된다. 상기에서 언급된 것처럼 절단 도메인은 위치 도메인의 상류에 (5' 단부에) 위치해서 방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자가 위치 (식별) 도메인을 포함해야 한다. 핵산 절단에 적당한 효소로는 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대 RsaI이 있다. 다른 효소, 예컨대 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)와 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII의 혼합물 (USERTM-효소) 또는 MutY와 T7 엔도뉴클레아제 I 효소의 조합도 본 발명의 방법에 바람직한 구체예이다.
또 다른 구체예에서, DNA, 예컨대 cDNA 분자는 물리적 수단에 의해 어레이의 표면 또는 기판으로부터 방출될 수 있다. 예를 들어 포획 프로브가 간접적으로, 예컨대 표면 프로브에의 혼성화를 통해 어레이의 기판 위에 고정되는 경우의 구체예에서, 그것은 핵산 분자들 사이의 상호작용을 파괴하기에 충분할 수 있다. 핵산 분자들 사이의 상호작용을 파괴하기 위한 방법, 예컨대 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 것은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. DNA, 예컨대 cDNA 분자를 방출시키기 위한 간단한 방법 (즉 합성된 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 어레이를 스트리핑하는 방법)은 이중 가닥 분자의 수소 결합을 간섭하는 용액을 사용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, DNA, 예컨대 cDNA 분자는 가열된 물, 예컨대 최소한 85℃, 바람직하게는 최소한 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99℃의 물 또는 완충액을 적용함으로써 방출될 수 있다. 수소 결합을 파괴하기에 충분한 온도를 사용하는 것에 대한 대안으로서 또는 그 외에, 용액은 추가로 핵산 분자간의 상호작용을 탈안정화시킬 수 있는 염, 계면활성제 등을 포함할 수 있고, 그 결과 DNA, 예컨대 cDNA 분자가 방출된다.
고온 용액, 예컨대 90 내지 99℃의 물의 적용은 어레이 기판에 포획 프로브 또는 표면 프로브를 고정시키기 위해 사용된 공유 결합을 파괴하기에 충분할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러므로 바람직한 구체예에서, DNA, 예컨대 cDNA 분자는 공유 고정된 포획 또는 표면 프로브를 파괴하기 위해 어레이에 고온수를 적용함으로써 방출될 수 있다.
방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자 (방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 포함하고 있는 용액)가 추가의 조작, 예컨대 두 번째 가닥 합성 및/또는 증폭을 위해 수집된다는 것은 함축적이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 방법은 방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 수집 또는 회수하는 단계를 포함하는 것으로 볼 수 있다. 상기에서 주지된 바와 같이 제자리 증폭의 맥락에서 방출된 분자들은 확보된 핵산, 예컨대 cDNA의 암플리콘을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 구체예에서, 연장되지 않은 또는 결찰되지 않은 어떠한 포획 프로브든지 제거되는 것이 바람직할 것이다. 이것은 예를 들면 어레이로부커 DNA 분자를 방출시키는 단계 후에 이루어질 수 있다. 원하는 또는 편리한 어떠한 방법이든지 그런 제거를 위해 사용될 수 있는데, 이를테면 연장되지 않았거나 결찰되지 않은 프로브, 예컨대 엑소뉴클레아제를 분해하기 위해 효소를 사용하는 것을 포함한다.
어레이로부터 방출되었고, 상기에서 논의된 것과 같이 변형될 수 있는 DNA, 예컨대 cDNA 분자, 또는 암플리콘은 연구조사를 위해 분석된다 (예컨대 상기에서 주지된 것과 같이 실제 서열 측정이 필요하지 않더라도 서열을 측정하기 위해. 이때 어떠한 서열 분석 방법이든지 사용될 수 있다). 그러므로 핵산 분석의 어떠한 방법이든지 사용될 수 있다. 서열 분석 단계는 위치 도메인을 식별할 것이고, 그에 따라 분석된 분자가 조직 샘플 중의 어느 위치에든 자리를 잡는 것이 가능해진다. 유사하게, 분석된 분자의 성질 또는 정체성도 측정될 수 있다. 이런 방식으로 어레이의 주어진 위치에서 및 조직 샘플 중에서 핵산, 예컨대 RNA가 측정될 수 있다. 그러므로 분석 단계는 분석된 분자 (및 그에 따라 "표적" 분자)와 그것의 위치 도메인을 식별하는 어떠한 방법이든지 포함하거나 사용할 수 있다. 일반적으로 그런 방법은 서열-특이적 방법일 것이다. 예를 들어 방법은 서열-특이적 프라이머 또는 프로브, 특히 위치 도메인에 대해 및/또는 검출 및 분석하고자 하는 특이한 핵산 분자, 예컨대 핵산, 예를 들면 검출하고자 하는 RNA 또는 cDNA 분자에 상응하는 DNA 분자에 대해 특이한 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있다. 전형적으로 그런 방법에서는 서열 특이적 증폭 프라이머, 예컨대 PCR 프라이머가 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, 표적 관련 분자의 하위세트 또는 패밀리, 예컨대 서열 유사성 및/또는 보존된 도메인을 공유하는 단백질의 특정 그룹, 예컨대 수용체 패밀리를 코드화하는 모든 서열을 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로 본원에 기술된 증폭 및/또는 분석 방법은 포획된 핵산 또는 그것으로부터 유도된 핵산, 예컨대 암플리콘의 하위세트에 혼성화하는 축퇴성 또는 유전자 패밀리 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 증폭 및/또는 분석 방법은 표적 분자의 하위세트에 대해 특이적인 축퇴성 또는 유전자 패밀리 특이적 프라이머와 조합하여 보편적 프라이머 (즉 모든 포획된 서열에 공통적인 프라이머)를 활용할 수 있다.
그러므로 한 구체예에서, 증폭-기초, 특히 PCR-기초 서열 분석 방법이 사용된다.
그러나 방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 변형 및/또는 증폭 단계는 샘플에 추가 성분, 예컨대 효소, 프라이머, 뉴클레오티드 등을 도입할 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자 또는 암플리콘을 포함하는 샘플을 서열 분석 전에, 예컨대 서열화 반응을 간섭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 뉴클레오티드, 염 등을 제거하기 위해 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. DNA, 예컨대 cDNA 분자를 정제하는 어떠한 방법이든지 사용될 수 있다.
상기에서 주지된 것처럼, 방출된 DNA 분자의 서열 분석은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 그러므로 서열 분석 기질 (서열화 분석 단계 또는 과정의 수행대상인 분자로 볼 수 있다)은 직접 어레이로부터 방출된 분자이거나 그것으로부터 유도된 분자일 수 있다. 그러므로 예를 들어 서열화 반응을 포함하는 서열 분석 단계의 맥락에서, 서열화 주형은 어레이로부터 방출된 분자이거나 그것으로부터 유도된 분자일 수 있다. 예를 들어 어레이로부터 방출된 첫 번째 및/또는 두 번째 가닥 DNA, 예컨대 cDNA 분자는 직접 서열 분석이 된다 (예컨대 서열화), 즉 직접 서열 분석 반응 또는 과정에 참여하게 된다 (예컨대 서열화 반응 또는 서열화 과정, 또는 서열화 또는 그렇지 않으면 식별되는 분자가 된다). 제자리 증폭의 맥락에서 방출된 분자는 암플리콘일 수 있다. 또는 달리 방출된 분자는 서열 분석 (예컨대 서열화 또는 다른 수단에 의한 식별) 전에 두 번째 가닥 합성 또는 증폭 단계가 이루어질 수 있다. 그러므로 서열 분석 기질 (예컨대 주형)은 어레이로부터 직접 방출된 분자의 암플리콘이거나 두 번째 가닥일 수 있다.
이중 가닥 분자의 두 가닥은 모두 서열 분석 (예컨대 서열화)이 될 수 있지만 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 단일 가닥 분자 (예컨대 cDNA)도 분석될 수 있다 (예컨대 서열화). 예를 들어 다양한 서열화 기술들이 단일 분자 서열화를 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 Helicos 또는 Pacbio 기술, 또는 현재 개발 중인 나노포어 서열화 기술이 있다. 그러므로 한 구체예에서, DNA, 예컨대 cDNA의 첫 번째 가닥이 서열화될 수 있다. DNA, 예컨대 cDNA의 첫 번째 가닥은 단일 분자 서열화를 가능하게 하기 위해 3' 단부에서 변형될 필요가 있다. 이것은 두 번째 DNA, 예컨대 cDNA 가닥의 취급을 위한 것과 유사한 과정에 의해 이루어질 수 있다. 그런 과정은 해당 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 측면으로, 서열 분석은 포획된 핵산, 예컨대 RNA 서열과 위치 도메인의 서열의 일부를 식별하거나 드러낼 것이다. 위치 도메인 (또는 태그)의 서열은 그것에 핵산, 예컨대 mRNA 분자가 포획되는 피쳐를 식별할 것이다. 포획된 핵산, 예컨대 RNA 분자의 서열은 그것에 상응하는 유전자를 측정하기 위해 샘플이 기원하는 유기체의 서열 데이터베이스와 비교될 수 있다. 조직 샘플의 어떤 영역 (예컨대 세포)이 피쳐와 접촉하는지를 측정함으로써, 조직 샘플의 어떤 영역이 상기 유전자 (또는 예컨대 공간적 게놈학의 경우 함유된 유전자)를 발현하는지를 측정할 수 있다. 이 분석은 본 발명의 방법에 의해 생성된 모든 DNA, 예컨대 cDNA에 대해 이루어질 수 있고, 그 결과 조직 샘플의 공간적 전사체 또는 게놈이 얻어진다.
대표적인 실례에 의하면, 서열화 데이터는 포획 프로브의 특이한 종으로 서열을 분류하기 위해, 즉 위치 도메인의 서열에 따라 분석될 수 있다. 이것은 대표적인 포획 프로브 위치 도메인 (태그) 서열에 대해 개별적인 파일로 서열을 분류하기 위해 예를 들면 FastX 툴키트 FASTQ 바코드 스플리터 툴을 사용하여 이루어질 수 있다. 각 종의 서열, 즉 각 피쳐로부터의 서열은 분석되어 전사물의 정체성이 측정될 수 있다. 예를 들어 서열은 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터베이스, 바람직하게는 그것으로부터 조직 샘플이 얻어진 유기체에 대한 데이터베이스와 서열을 비교하기 위하여 예컨대 Blastn 소프트웨어를 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 서열에 가장 큰 유사성을 보이는 데이터베이스 서열의 정체가 상기 서열로 인정될 것이다. 일반적으로 최소한 1e-6, 바람직하게는 1e-7, 1e-8, 또는 1e-9의 확실성을 가지는 히트만이 성공적으로 확인된 것으로 간주될 것이다.
어떠한 핵산 서열화 방법이든지 본 발명의 방법에 활용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그러나 소위 "차세대 서열화" 기술이 특히 본 발명에 활용될 수 있다. 고처리율 서열화가 특히 본 발명의 방법에 유용한데, 왜냐하면 그것이 대다수의 핵산이 매우 짧은 시간 동안 부분적으로 서열화되는 것을 가능하게 하기 때문이다. 전체적으로 또는 부분적으로 서열화된 많은 게놈에 있어 최근의 폭발적인 관점에서 볼 때, 각 분자에 상응하는 유전자를 측정하기 위하여 생성된 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 전 길이를 서열화할 필요는 없다. 예를 들어 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 각 단부로부터 처음 100 뉴클레오티드는 그것에 핵산, 예컨대 mRNA가 포획되는 피쳐 (즉 어레이 상의 그것의 위치)와 발현된 유전자 두 가지를 모두 확인하기에 충분해야 한다. DNA, 예컨대 cDNA 분자의 "포획 프로브 단부"로부터의 서열 반응으로 위치 도메인의 서열과 전사물 특이적 서열 데이터의 최소한 약 20 염기, 바람직하게는 30 또는 40 염기의 서열이 산출된다. "비-포획 프로브 단부"로부터의 서열 반응으로는 전사물 특이적 서열 데이터의 최소한 약 70 염기, 바람직하게는 80, 90 또는 100 염기가 산출된다.
대표적인 실례로서, 서열화 반응은 예컨대 IlluminaTM 기술에서 사용된 것과 같은 가역적인 염료-터미네이터 (dye-terminator)를 토대로 할 수 있다. 예를 들어 DNA 분자는 먼저 예컨대 유리 또는 실리콘 슬라이드 위의 프라이머에 부착되고, 증폭되어 국소적인 클론성 콜로니가 형성된다 (브리지 증폭). 네 가지 유형의 ddNTP가 첨가되고, 통합되지 않은 뉴클레오티드는 세척되어 제거된다. 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)과는 달리 DNA는 한 번에 한 뉴클레오티드만 연장될 수 있다. 카메라는 형광 표지된 뉴클레오티드를 촬영하고, 그런 다음 말단 3' 차단제와 함께 염료가 DNA로부터 제거되면 다음 주기가 이어진다. 이것은 필요한 서열 데이터가 얻어질 때까지 반복될 수 있다. 이 기술을 사용하여 수천 개의 핵산이 단일 슬라이드 상에서 동시에 서열화될 수 있다.
다른 고처리율 서열화 기법, 예컨대 파이로시퀀싱도 본 발명의 방법에 마찬가지로 적당할 것이다. 이 방법에서 DNA는 오일 용액 중의 물방울 내부에서 증폭되는데 (에멀션 PCR), 이때 각 방울은 단일 프라이머-코팅된 비드에 부착된 단일 DNA 주형을 함유하고, 그런 다음 클론성 콜로니가 형성된다. 서열화 기계는 피코리터 부피의 많은 웰을 함유하고 있고, 각 웰은 단일 비드와 서열화 효소를 함유하고 있다. 파이로시퀀싱은 초기 DNA에 첨가된 개별 뉴클레오티드의 검출을 위해 빛을 생성하기 위해 루시페라제를 사용하고, 조합된 데이터는 서열 판독 결과를 생성하기 위해 사용된다.
개발중인 기술의 실례는 DNA의 중합반응 중에 방출된 수소 이온의 검출을 토대로 한다. 서열화하고자 하는 주형 DNA 가닥을 함유하고 있는 마이크로웰은 단일 유형의 뉴클레오티드로 넘치게 된다. 만약 도입된 뉴클레오티드가 리더 주형 뉴클레오티드에 상보한다면 그것은 늘어나고 있는 상보성 가닥에 통합된다. 이것은 민감성 이온 센서를 야기하는 수소 이온의 방출을 유발하고, 그것은 반응이 일어났음을 가리킨다. 만약 단일중합체 반복부가 주형 서열에 존재한다면, 다수의 뉴클레오티드가 단일 주기에 통합될 것이다. 이것은 상응하는 수의 수소 이온 방출 및 그와 비례하여 더 높은 이온 신호를 유도한다.
그러므로 미래의 서열화 방식은 더디게 실용화되고 있지만, 그런 플랫폼의 주요 특징 중 하나로서 더 짧은 작동 시간을 나타내는 것이 분명하며, 다른 서열화 기술들도 본 발명의 방법에서 유용할 것임이 명백할 것이다.
본 발명의 본질적인 특징은, 상기에서 설명된 것과 같이 포획 프로브에 포획된 핵산 분자의 상보성 가닥을 확보하는 단계, 예컨대 포획된 RNA 분자의 역전사이다. 역전사 반응은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 대표적인 역전사 반응에서 반응 혼합물은 역전사 효소, dNTP 및 적당한 완충제를 포함한다. 반응 혼합물은 다른 성분, 예컨대 RNase 억제제(들)을 포함할 수 있다. 프라이머와 주형은 포획 프로브의 포획 도메인이고 포획된 RNA 분자는 상기에서 설명되었다. 본 방법에서 각각의 dNTP는 전형적으로 약 10 내지 5000μM, 통상적으로 약 20 내지 1000μM의 범위의양으로 존재할 것이다. 동등한 반응이 포획된 DNA 분자의 상보하는 가닥을 생성하기 위하여, DNA 중합효소 활성을 가지는 효소를 사용하여 수행될 수 있음이 명백할 것이다. 이런 유형의 반응은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
원하는 역전사 효소 활성은 하나 또는 그 이상의 뚜렷한 효소에 의해 제공될 수 있는데, 이때 적당한 실례는 M-MLV, MuLV, AMV, HIV, ArrayScriptTM, MultiScribeTM, 및 SuperScript® I, II, 및 III 효소이다.
역전사 효소 반응은 어떠한 적당한 온도에서 수행될 수 있는데, 그것은 효소의 특성에 따라 좌우될 것이다. 전형적으로 역전사 효소 반응은 37 내지 55℃에서 수행되지만 이 범위 밖의 온도도 적절할 수 있다. 반응 시간은 1, 2, 3, 4 또는 5분 정도로 짧거나 48시간으로 길 수도 있다. 전형적으로 반응은 5 내지 120분 동안, 바람직하게는 5 내지 60분, 5 내지 45분 또는 5 내지 30분 동안 또는 선택에 따라 1 내지 10분 또는 1 내지 5분 동안 수행될 것이다. 반응 시간은 중요하지 않으며, 원하는 반응 시간이 어떠하든지 사용될 수 있다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 방법의 특정 구체예는 증폭 단계를 포함하고, 이때 생성된 DNA, 예컨대 cDNA 분자의 복사물 수는 예컨대 샘플을 풍부하게 하기 위해 증가되어 더 좋은 핵산의 대표, 예컨대 조직 샘플로부터 포획된 전사물이 얻어진다. 증폭은 필요에 따라 선형 또는 지수형일 수 있고, 대표적인 관심의 증폭 프로토콜로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 등온 증폭 등이 있다.
중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 미국 특허 4,683,202호; 4,683,195호; 4,800,159호; 4,965,188호 및 5,512,462호에 설명되어 있다. 대표적인 PCR 증폭 반응에서, 상기 어레이로부터 방출된 DNA, 예컨대 cDNA 분자를 포함하는 반응 혼합물은 프라이머 연장 반응에 사용된 하나 또는 그 이상의 프라이머, 예컨대 첫 번째 및/또는 두 번째 증폭 도메인에 혼성화하는 PCR 프라이머 (예컨대 기하학적 (또는 지수적) 증폭에 사용된 전방 및 역 프라이머 또는 선형 증폭에 사용된 단일 프라이머)와 조합된다. 방출된 DNA, 예컨대 cDNA (이하 편리를 위해 주형 DNA로 언급한다)가 접촉하게 될 올리고뉴클레오티드 프라이머는 아닐링 조건 (아래에서 보다 상세하게 설명함) 하에서 상보하는 주형 DNA에 대한 혼성화를 제공하기에 충분한 길이일 것이다. 프라이머의 길이는 증폭 도메인의 길이에 따라 좌우되겠지만, 일반적으로는 최소한 10bp 길이, 보통 약 15bp 길이, 보다 통상적으로는 최소한 16bp 길이일 것이며, 30bp 길이 또는 그 이상으로 길 수 있고, 이때 프라이머의 길이는 일반적으로 18 내지 50bp 길이, 통상 약 20 내지 35bp 길이의 범위일 것이다. 주형 DNA는 프라이머 연장, 즉 주형 DNA의 선형 또는 지수형 증폭 중 어느 것이 바람직한지에 따라 단일 프라이머 또는 두 개의 프라이머 세트 (전방 및 역 프라이머)와 접촉될 수 있다.
상기 성분 외에, 본 발명의 방법으로 생성된 반응 혼합물은 전형적으로 중합효소 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함한다. 원하는 중합효소 활성은 하나 또는 그 이상의 뚜렷한 중합효소에 의해 제공될 수 있다. 많은 구체예에서, 반응 혼합물은 최소한 패밀리 A 중합효소를 포함하는데, 이때 관심의 대표적인 패밀리 A 중합효소로는 그것에 한정되는 것은 아니지만 테라무스 아쿠아티쿠스 중합효소, 이를테면 자연 발생 중합효소 (Taq) 및 그것의 유도체와 상동체, 예컨대 Klentaq (Barnes et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1994) 91:2216-2220); 테라무스 써모필루스 중합효소, 이를테면 자연 발생 중합효소 (Tth) 및 그것의 유도체와 상동체 등이 있다. 수행되는 증폭 반응이 고충실도의 반응인 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 추가로 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소, 예컨대 패밀리 B 중합효소로 제공되는 것을 포함하며, 이때 관심의 패밀리 B 중합효소는 그것에 한정되는 것은 아니지만 써모코쿠스 리토랄리스 DNA 중합효소 (Vent) (Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:5577-5581); 파이로코쿠스 종 GB-D (Deep Vent); 파이로코쿠스 퓨리오수스 DNA 중합효소 (Pfu) (Lundberg et al., Gene (1991) 108:1-6); 파이로코쿠스 워세이 (Pwo) 등이 있다. 반응 혼합물이 패밀리 A와 패밀리 B 중합효소를 둘 다 포함하는 경우에 패밀리 A 중합효소는 패밀리 B 중합효소보다 더 많은 양으로 반응 혼합물에 존재할 수 있고, 이때 활성의 차이는 보통 최소한 10배, 보다 통상적으로는 최소한 약 100배일 것이다. 보통 반응 혼합물은 존재하는 4가지의 자연 발생 염기에 상응하는 4가지의 상이한 유형의 dNTP, 즉 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP를 포함할 것이다. 본 발명의 방법에서 각각의 dNTP는 전형적으로 약 10 내지 5000μM, 통상적으로는 약 20 내지 1000μM의 범위의 양으로 존재할 것이다.
본 발명의 방법의 역전사 효소 및/또는 증폭 단계에서 제조된 반응 혼합물은 추가로 일가 이온의 공급원, 이가 양이온의 공급원 및 완충제를 포함하는 수성 완충 매체를 포함할 수 있다. 일가 이온의 편리한 공급원은 어떠한 것이든지, 예컨대 KCl, K-아세테이트, NH4-아세테이트, K-글루타메이트, NH4Cl, 암모늄 술페이트, 등이 사용될 수 있다. 이가 양이온은 마그네슘, 망간, 아연 등일 수 있고, 이때 양이온은 전형적으로 망간일 것이다. 마그네슘 양이온의 어떠한 편리한 공급원, 이를테면 MgCl2, Mg-아세테이트 등이 사용될 수 있다. 완충액에 존재하는 Mg2 +의 양은 0.5 내지 10mM의 범위이겠지만 바람직하게는 약 3 내지 6mM이고, 이상적으로는 약 5mM일 것이다. 완충액에 존재할 수 있는 대표적인 완충제 또는 염은 트리스, 트리신, HEPES, MOPS 등이며, 이때 완충제의 양은 전형적으로 약 5 내지 150mM, 보통 액 10 내지 100mM, 보다 통상적으로는 약 20 내지 50mM의 범위일 것이고, 바람직한 특정 구체예에서 완충제는 72℃에서 약 6.0 내지 9.5, 가장 바람직하게는 7.3의 pH를 제공하기에 충분한 양으로 존재할 것이다. 완충 매체에 존재할 수 있는 다른 제제로는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, EGTA 등이 있다.
본 발명의 방법의 단계들의 역전사 효소, DNA 연장 또는 증폭 반응 혼합물을 제조할 때 다양한 구성성분들은 어떠한 편리한 순서로든지 조합될 수 있다. 예를 들어 증폭 반응에서 완충제는 프라이머, 중합효소와 조합된 후 주형 DNA와 조합될 수 있고, 또는 다양한 구성성분들이 모두 한 번에 조합되어 반응 혼합물이 생성될 수도 있다.
상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 바람직한 구체예에서 DNA, 예컨대 cDNA 분자는 증폭 도메인을 핵산 분자의 단부에 첨가함으로써 변형될 수 있는데, 그것은 결찰 반응을 포함한다. 결찰 반응은 또한 어레이 상에서의 포획 프로브의 제자리 합성에도 필요한데, 이때 포획 프로브는 어레이 표면 상에 간접적으로 고정된다.
해당 기술분야에서 알 수 있는 것과 같이, 결찰 효소는 두 개의 바로 인접한 핵산의 나란히 놓인 3'-히드록실 및 5'-포스페이트 말단 사이에 포스포디에스테르 결합이 형성되는 것을 촉매한다. 어떠한 편리한 결찰 효소든지 사용될 수 있는데, 관심의 결찰 효소의 대표적인 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 온도 민감성 및 열안정성 결찰 효소가 있다. 온도 민감성 결찰 효소로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 박테리오파지 T4 DNA 결찰 효소, 박테리오파지 T7 결찰 효소, 및 대장균 결찰 효소가 있다. 열안정성 결찰 효소로는 그것에 한정되는 것은 아니지만 Taq 결찰 효소, Tth 결찰 효소, 및 Pfu 결찰 효소가 있다. 열안정성 결찰 효소는 호열성 또는 초호열성 유기체, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 원핵, 진핵, 또는 원시적 유기체로부터 얻어질 수 있다. 특정 RNA 결찰 효소가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
이 결찰 단계에서 적당한 결찰 효소와 필요하거나 및/또는 바람직한 어떠한 시약이 반응 혼합물과 조합되고 관련된 올리고뉴클레오티드의 결찰이 일어나기에 충분한 조건 하에서 유지된다. 결찰 반응 조건은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 특정 구체예에서, 결찰 반응 중의 반응 혼합물은 약 4℃ 내지 약 50℃, 예컨대 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 약 5초 내지 약 16시간, 예컨대 약 1분 내지 약 1시간 범위의 시간 동안 유지될 수 있다. 다른 구체예에서, 반응 혼합물은 약 35℃ 내지 약 45℃, 예컨대 약 37℃ 내지 약 42℃ 범위의 온도에서, 예를 들면 약 38℃, 39℃, 40℃ 또는 41℃ 또는 바로 그 온도에서 약 5초 내지 약 16시간, 예컨대 약 1분 내지 약 1시간, 이를테면 약 2분 내지 약 8시간 동안 유지될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 결찰 반응 혼합물은 50mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25mg/ml의 BSA, 0.25 유닛/ml의 RNase 억제제, 및 0.125 유닛/ml의 T4 DNA 결찰 효소를 포함한다. 또 다른 대표적인 구체예에서는, 2.125mM의 마그네슘 이온, 0.2 유닛/ml의 RNase 억제제, 및 0.125 유닛/ml의 DNA 결찰 효소가 사용된다. 반응의 어댑터의 양은 DNA, 예컨대 샘플 중의 cDNA의 농도에 따라 좌우될 것이고, 일반적으로는 DNA, 예컨대 cDNA의 몰 양의 10 내지 100배 사이의 양으로 존재할 것이다.
대표적인 실례로서 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 어레이를 조직 샘플과 접촉시키는 단계, 이때 어레이는 그 위에서 다수의 종의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어서 각각의 종이 어레이 상의 뚜렷한 위치를 차지하고 상기 프로브가 역전사 (RT) 효소로서 기능하는 것을 가능하게 하기 위해 유리 3' 단부를 가지도록 배향되는 기판을 포함하며, 각각의 종의 상기 포획 프로브는 5'에서 3'쪽으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함함으로써 조직 샘플의 RNA가 상기 포획 프로브와 혼성화하는 단계;
(b) 조직 샘플을 어레이 위에서 영상화하는 단계;
(c) 포획된 mRNA 분자를 역전사하여 cDNA 분자를 생성하는 단계;
(d) 어레이를 세척하여 잔류 조직을 제거하는 단계;
(e) 최소한 일부분의 cDNA 분자를 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계;
(f) 방출된 cDNA 분자에 대해 두 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하는 단계; 그리고
(g) cDNA 분자의 서열을 분석 (예컨대 서열화)하는 단계.
또 다른 대표적인 실례로서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 어레이를 조직 샘플과 접촉시키는 단계, 이때 어레이는 그 위에서 다수의 종의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어서 각각의 종이 어레이 상의 뚜렷한 위치를 차지하고 상기 프로브가 역전사 (RT) 효소로서 기능하는 것을 가능하게 하기 위해 유리 3' 단부를 가지도록 배향되는 기판을 포함하며, 각각의 종의 상기 포획 프로브는 5'에서 3'쪽으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함함으로써 조직 샘플의 RNA가 상기 포획 프로브와 혼성화하는 단계;
(b) 조직 샘플을 임의로 재수화하는 단계;
(c) 포획된 mRNA 분자를 역전사하여 첫 번째 가닥 cDNA 분자를 생성하고, 임의로 두 번째 가닥 cDNA 분자를 합성하는 단계;
(d) 조직 샘플을 어레이 상에서 영상화하는 단계;
(e) 어레이를 세척하여 잔류 조직을 제거하는 단계;
(f) 최소한 일부분의 cDNA 분자를 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계;
(g) 방출된 cDNA 분자를 증폭시키는 단계; 그리고
(h) 증폭된 cDNA 분자의 서열을 분석 (예컨대 서열화)하는 단계.
추가의 대표적인 실례로서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 어레이를 조직 샘플과 접촉시키는 단계, 이때 어레이는 그 위에서 다수의 종의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어서 각각의 종이 어레이 상의 뚜렷한 위치를 차지하고 상기 프로브가 역전사 (RT) 효소로서 기능하는 것을 가능하게 하기 위해 유리 3' 단부를 가지도록 배향되는 기판을 포함하며, 각각의 종의 상기 포획 프로브는 5'에서 3'쪽으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함함으로써 조직 샘플의 RNA가 상기 포획 프로브와 혼성화하는 단계;
(b) 조직 샘플을 어레이 위에서 임의로 영상화하는 단계;
(c) 포획된 mRNA 분자를 역전사하여 cDNA 분자를 생성하는 단계;
(d) 단계 (b)에서 이미 수행되지 않았다면 임의로 조직 샘플을 어레이 상에서 영상화하는 단계;
(e) 어레이를 세척하여 잔류 조직을 제거하는 단계;
(f) 최소한 일부분의 cDNA 분자를 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계;
(g) 방출된 cDNA 분자에 대해 두 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하는 단계;
(h) 이중 가닥 cDNA 분자를 증폭시키는 단계;
(i) 임의로 cDNA 분자를 정제하여 서열화 반응을 간섭할 수 있는 성분을 제거하는 단계; 그리고
(j) 증폭된 DNA 분자의 서열을 분석 (예컨대 서열화)하는 단계.
본 발명은 상기에서 설명된 방법의 단계들의 어떠한 적당한 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 이들 방법의 변형, 예를 들면 증폭이 어레이 상에서 제자리 수행되는 것을 포함하는 것이 인지될 것이다. 또한 영상화 단계를 생략한 방법도 포함된다.
본 발명은 또한 (i) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플로부터 mRNA를 포획하는 데 사용하기 위해, 또는 (ii) 조직 샘플의 (예컨대 부분 또는 전역적) 전사체를 측정 및/또는 분석하는 데 사용하기 위해 어레이를 제작 또는 제조하는 방법을 포함하는 것으로 볼 수 있는데, 이때 상기 방법은 다수의 종의 포획 프로브를 어레이 기판에 직접 또는 간접적으로 고정시키는 것을 포함하며, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 다음의 핵산 분자를 5'에서 3'쪽으로 포함한다:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인.
본 발명의 어레이를 제조하는 방법은 포획 프로브의 각각의 종이 어레이 상의 피쳐로서 고정되도록 추가로 규정될 수 있다.
어레이 위에 포획 프로브를 고정시키는 방법은 본원에서 설명된 어떠한 적당한 수단을 사용하여 이루어질 수 있다. 포획 프로브가 어레이 상에 간접적으로 고정되는 경우에, 포획 프로브는 어레이 상에서 합성될 수 있다. 상기 방법은 다음 단계들 중 어떠한 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
(a) 다수의 표면 프로브를 어레이 기판에 고정시키는 단계, 이때 표면 프로브는
(i) 포획 도메인 올리고뉴클레오티드의 일부분 (핵산, 예컨대 RNA의 포획에 포함되지 않은 일부분)에 혼성화할 수 있는 도메인;
(ii) 상보하는 위치 도메인; 및
(iii) 상보하는 보편적 도메인을 포함하고;
(b) 어레이 상에 고정된 표면 프로브에 포획 도메인 올리고뉴클레오티드 및 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드를 혼성화하는 단계;
(c) 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드를 주형이 있는 중합반응에 의해 연장시켜서 포획 프로브의 위치 도메인을 생성시키는 단계; 그리고
(d) 위치 도메인을 포획 도메인 올리고뉴클레오티드에 결찰시켜서 포획 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계.
단계 (d)에서 결찰은 단계 (c)에서의 연장과 동시에 일어날 수 있다. 그러므로 별도의 단계로서 수행될 필요는 없지만 필요하다면 당연히 포함된다.
상기 본 발명의 어레이의 제조 방법에 의해 생성된 어레이의 특징은 상기 설명에 따라 추가로 규정될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에서 RNA의 검출 또는 분석과 관련하여, 그리고 전사체 분석 또는 검출과 관련하여 설명되었지만, 기술된 원리는 세포 중의 DNA의 검출 또는 분석과 게놈 연구에 비슷하게 적용될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러므로 보다 광범위하게 본다면, 본 발명은 일반적으로 핵산의 검출에 적용될 수 있을 것으로 보이고, 추가로 더 특별한 측면, 예컨대 DNA의 분석 또는 검출을 위한 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다. 공간적 정보는 또한 게놈학 맥락에서 가치있는 것인데, 즉 공간 해상도로 DNA 분자를 검출 및/또는 분석할 수 있다. 이것은 본 발명에 따라 게놈에 태그를 붙임으로써 이루어질 수 있다. 그렇게 국지화된 또는 공간적 검출 방법은 예를 들어 조직의 상이한 세포 또는 영역에서 게놈 변이를 연구하는 것과 관련하여, 예를 들면 정상과 질병에 걸린 세포 또는 조직을 비교하거나 (예컨대 정상 대 종양 세포 또는 조직) 또는 질병 진행시 게놈 변화를 연구하는 등에서 유용할 수 있다. 예를 들어 종양 조직은 그것이 함유하는 게놈 변이체에서 상이할 수 있는 세포의 이질 집단을 포함할 수 있다 (예컨대 돌연변이 및/또는 다른 유전자 일탈, 예를 들면 염색체 재배열, 염색체 증폭/결실/삽입 등). 국지화된 방식으로 상이한 세포에서 게놈 변이, 또는 상이한 게놈 유전자좌를 검출하는 것은 그런 맥락에서, 예컨대 게놈 변이의 공간 분포를 연구하는 데 유용할 수 있다. 그런 방법의 기본적인 활용성은 종양 분석에서 발휘될 것이다. 본 발명의 맥락에서 어레이는 예를 들면 하나의 피쳐 상에서 전체 세포의 게놈을 포획하도록 디자인되고 제조될 수 있다. 조직 샘플 중의 상이한 세포들은 그렇게 비교될 수 있다. 물론 본 발명은 그런 디자인에 한정되지 않고, 다른 변이도 가능하며, 이때 DNA는 국지화된 방식으로 검출되고 어레이 상에 포획된 DNA의 위치는 조직 샘플 중의 위치 또는 장소에 연관된다.
따라서 보다 일반적인 측면으로, 본 발명은 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 검출을 위한 방법을 제공하며, 그 방법은 다음의 단계들로 이루어진다:
(a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함하며;
(b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고 조직 샘플의 핵산이 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
(c) 상기 포획 프로브를 연장 또는 결찰 프라이머로서 사용하여 포획된 핵산 분자로부터 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되고;
(d) 임의로 상기 태그가 달린 DNA의 상보하는 가닥을 생성하거나 및/또는 임의로 상기 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계;
(e) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 또는 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며;
(f) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
상기에서 보다 상세하게 설명되는 것과 같이, 핵산을 분석하는 어떠한 방법이든지 분석 단계에서 사용될 수 있다. 전형적으로 이것은 서열화를 포함할 수 있지만, 실제로 서열을 측정하기 위해서 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어 서열-특이적 분석 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 서열-특이적 증폭 반응은 예컨대 위치 도메인에 특이한 및/또는 표적 서열, 예컨대 검출하고자 하는 특별한 표적 DNA에 특이한 프라이머 (즉 특별한 cDNA/RNA 또는 유전자 또는 유전자 변이체 또는 게놈 유전자좌 또는 게놈 변이체 등에 상응하는)를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 분석 방법은 서열-특이적 PCR 반응이다.
단계 (f)에서 얻어진 서열 분석 (예컨대 서열화) 정보는 샘플 중의 핵산에 대한 것과 같은 공간 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 달리 표현하면 서열 분석 정보는 샘플 중의 핵산의 위치와 같은 정보를 제공할 수 있다. 이런 공간 정보는 예컨대 측정되거나 확인된 서열로부터 얻어진 서열 분석 정보의 본질로부터 유도될 수 있고, 예를 들면 그것은 그 자체로서 사용된 조직 샘플과 관련하여 공간적인 정보를 줄 수 있는 특별한 핵산 분자의 존재를 나타낼 수 있고, 및/또는 공간 정보 (예컨대 공간 정위)는 어레이 상의 조직 샘플의 위치로부터 얻어질 수 있고, 그것은 서열 분석 정보와 결합되어 있다. 그러나 상기에서 설명된 것과 같이, 공간 정보는 편리하게도 서열 분석 데이터를 조직 샘플의 영상과 연관지음으로써 얻어질 수 있고, 그것은 본 발명의 바람직한 한 구체예를 나타낸다.
따라서 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은 또한 다음 단계:
(g) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계를 포함하고, 이때 조직 샘플은 단계 (c) 전 또는 후에 영상화된다.
단계 (a)에서 언급된 프라이머 연장 반응은 중합효소-촉매된 연장 반응으로서 규정될 수 있고, 포획 프로브에 공유 부착된 포획된 핵산 분자의 상보하는 가닥을 얻기 위해 작용하는데, 다시 말하면 상보성 가닥을 합성함으로써 포획 프로브를 프라이머로서 활용하고 포획된 핵산을 주형으로서 사용한다. 달리 표현하면 그것은 어떠한 중합효소에 의해 수행된 어떠한 프라이머 연장 반응일 수 있다. 핵산은 RNA이거나 또는 DNA일 수 있다. 따라서 중합효소는 어떠한 중합효소든지 될 수 있다. 그것은 역전사효소이거나 DNA 중합효소일 수 있다. 결찰 반응은 어떠한 결찰 효소에 의해서든지 수행될 수 있고, 포획 프로브에 포획된 핵산 분자의 상보 가닥을 확보하는 역할을 하는데, 즉 포획된 핵산 분자 (포획 프로브에 혼성화됨)는 부분적으로 이중 가닥이고, 상보하는 가닥은 포획 프로브에 결찰된다.
그런 방법의 바람직한 한 가지 구체예는 상기에서 전사체의 측정 및/또는 분석을 위해, 또는 RNA의 검출을 위해 설명된 방법이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 검출된 핵산 분자는 DNA이다. 그런 구체예에서, 본 발명은 조직 샘플 중의 DNA의 국지화된 검출을 위한 방법을 제공하며, 그 방법은 다음 단계들로 이루어진다:
(a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함하며;
(b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고 조직 샘플의 DNA가 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화할 수 있도록 하는 단계;
(c) 상기 조직 샘플 중의 DNA를 단편화하는 단계, 이때 상기 단편화는 단계 (b)에서 어레이를 조직 샘플과 접촉시키기 전에, 중에 또는 후에 수행되고;
(d) 상기 프라이머 연장 반응 중의 포획 프로브를 포획된 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 연장시켜서 연장된 DNA 분자를 생성하거나, 또는 포획된 DNA 단편을 결찰 반응 중의 포획 프로브에 결찰시켜서 결찰된 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되며;
(e) 임의로 상기 태그가 달린 DNA의 상보성 가닥을 생성하거나 및/또는 임의로 상기 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계;
(f) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 및/또는 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하고;
(g) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
본 발명의 방법은 추가로 다음 단계:
(h) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계를 포함하며, 이때 조직 샘플은 단계 (d) 전 또는 후에 영상화된다.
공간적 게놈과 관련하여, 표적 핵산은 DNA이고, 어떤 상황에서는 영상화 및 영상화 연관 단계를 포함시키는 것이 바람직하다.
DNA가 포획되는 구체예에서 DNA는 세포에서 일어날 수 있는 어떠한 DNA 분자일 수 있다. 그러므로 그것은 게놈성, 즉 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 색소체 DNA, 예컨대 엽록체 DNA일 수 있다. 바람직한 구체예에서 DNA는 게놈 DNA이다.
단편화가 단계 (b)에서의 접촉 후에 수행되는 경우에, 즉 조직 샘플이 어레이 상에 놓인 후에 단편화는 DNA가 포획 도메인에 혼성화되기 전에 일어난다는 것이 인지될 것이다. 달리 표현하면, DNA 단편은 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화된다 (또는 보다 구체적으로는 혼성화가 허용된다).
반드시 필수적이지는 않지만 유익하게도, 본 발명의 이런 측면의 특별한 구체예에서, 조직 샘플의 DNA 단편은 어레이 상의 포획 프로브에 의한 포획을 가능하게 하거나 촉진하는 결합 도메인이 있는 채로 제공될 수 있다. 따라서 결합 도메인은 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화할 수 있다. 그러므로 그런 결합 도메인은 포획 도메인의 상보물로서 간주될 수 있지만 (즉 상보하는 포획 도메인으로서 볼 수 있지만), 포획 도메인과 결합 도메인 사이의 완벽한 상보성은 필요하지 않으며, 단지 결합 도메인은 반복성 혼성화가 일어나는 것이 허용될 정도로 충분히 상보하면 된다. 즉 조직 샘플 중의 DNA 단편은 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화할 수 있다. 그런 결합 도메인이라면 샘플 중의 DNA가 단편화 단계 후까지도 포획 프로브에 결합하지 않는 것을 보장할 수 있을 것이다. 결합 도메인은 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 과정에 의하여, 예컨대 결합 도메인을 함유할 수 있는 어댑터 또는 링커 서열의 결찰에 의해 DNA 단편에 제공될 수 있다. 예를 들어 돌출된 단부를 가지는 링커 서열이 사용될 수 있다. 결합 도메인은 그런 링커의 단일 가닥 부분에 제공될 수 있어서, 링커가 DNA 단편에 결찰된 후에, 결합 도메인을 함유하는 단일 가닥의 부분이 포획 프로브의 포획 도메인에 대한 혼성화에 활용될 수 있다. 또는 달리 및 바람직한 구체예에서, 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 꼬리, 예컨대 폴리-A 도메인과 같은 단일중합체 꼬리를 도입하기 위해 말단 트란스페라제 효소를 사용함으로써 도입될 수 있다. 이것은 RNA 방법과 관련하여 보편적 도메인을 도입하기 위해 상기에서 설명된 것과 유사한 과정을 사용하여 수행될 수 있다. 그러므로 유익한 구체예에서, 통상적인 결합 도메인이 도입될 수 있다. 달리 표현하면, 결합 도메인은 모든 DNA 단편에 대해 공통적이고, 어레이 상의 단편의 포획을 이루기 위해 사용될 수 있다.
꼬리 달기 반응이 (공통적인) 결합 도메인을 도입하기 위해 수행되는 경우, 어레이 상의 포획 프로브는 꼬리 달기 반응으로부터 보호될 수 있다. 즉 포획 프로브는 상기에서 설명된 것과 같이 차단 또는 엄폐될 수 있다. 이것은 예를 들면 차단하는 올리고뉴클레오티드를 포획 프로브, 예컨대 포획 프로브의 돌출된 단부 (예컨대 단일 가닥 부분)에 혼성화시킴으로써 이루어질 수 있다. 포획 도메인이 예를 들어 폴리-T 서열을 포함하는 경우 그런 차단 올리고뉴클레오티드는 폴리-A 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 차단 올리고뉴클레오티드는 차단된 3' 단부 (즉 연장되거나 꼬리가 달릴 수 없는 단부)를 가질 수 있다. 포획 프로브는 또한 상기에서 상세하게 설명된 것과 같이 화학적 및/또는 효소적 변형에 의해 보호, 즉 차단될 수 있다.
결합 도메인이 상기에서 설명된 것과 같이 링커의 결찰에 의해 제공되는 경우, 포획 프로브 프라이머의 위치 태그를 포함하는 포획된 DNA 단편의 상보하는 복사물을 생성하기 위해 포획 프로브를 연장하기보다는 DNA 단편이 포획 프로브의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 상기에서 주지된 바와 같이 결찰은 결찰하고자 하는 5' 단부가 인산화될 것을 필요로 한다. 따라서 한 구체예에서, 첨가된 링커의 5' 단부, 즉 포획 프로브에 결찰시키고자 하는 단부 (즉 DNA 단편에 첨가된 링커의 돌출하지 않은 단부)는 인산화될 것이다. 그런 결찰 구체예에서, 따라서 링커가 이중 가닥 DNA 단편에 결찰될 수 있고, 상기 링커는 결합 도메인을 함유하는 단일 가닥의 돌출된 3' 단부를 가지는 것으로 볼 수 있을 것이다. 어레이와 접촉될 때 돌출된 단부는 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화한다. 이 혼성화로 인해 포획 프로브의 3' 단부가 첨가된 링커의 5' (돌출되지 않은) 단부에의 결찰을 위해 병렬위치로 놓이게 된다. 포획 프로브와, 그로 인해 위치 도메인은 따라서 이 결찰에 의해 포획된 DNA 단편 안에 통합된다. 그런 구체예는 도 21에 개략적으로 도시된다.
그러므로 본 발명의 이 측면의 방법은 보다 특별한 구체예에서 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
(i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 포획 도메인을 포함하며;
(b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치를 조직 샘플의 위치와 연관시키는 단계;
(c) 상기 조직 샘플 중의 DNA를 단편화하는 단계, 이때 상기 단편화는 단계 (b)에서 어레이를 조직 샘플과 접촉시키기 전에, 중에 또는 후에 수행되고;
(d) 상기 DNA 단편에 상기 포획 도메인에 혼성화할 수 있는 결합 도메인을 제공하는 단계;
(e) 상기 DNA 단편을 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화시키는 단계;
(f) 상기 프라이머 연장 반응 중의 포획 프로브를 포획된 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 연장시켜서 연장된 DNA 분자를 생성하거나, 또는 포획된 DNA 단편을 결찰 반응 중의 포획 프로브에 결찰시켜서 결찰된 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되며;
(g) 임의로 상기 태그가 달린 DNA의 상보성 가닥을 생성하거나 및/또는 임의로 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계;
(h) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 및/또는 암플리콘의 최소한 일부분을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하고;
(i) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
본 발명의 방법은 추가로 다음 단계:
(j) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 연상과 연관짓는 단계를 포함하며, 이때 조직 샘플은 단계 (f) 전 또는 후에 영상화된다.
상기에서 설명된 핵산 또는 DNA 검출 방법에서, 태그가 달린 핵산/DNA의 상보하는 복사물을 생성하는 단계 또는 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계는 RNA/전사체 분석/검출 방법과 관련하여 상기에서 설명된 원리를 따라 가닥 대체 중합효소를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 적당한 가닥 대체 중합효소는 상기에서 논의되었다. 이것은 상보하는 복사물 또는 암플리콘에 위치 도메인이 복사되는 것을 보장한다. 이것은 특히 포획 프로브가 표면 프로브에 혼성화함으로써 어레이 상에 고정되는 경우일 것이다.
그러나 이 단계에서 가닥 대체 중합효소를 사용하는 것은 필수는 아니다. 예를 들어 비-가닥 대체 중합효소는 위치 도메인에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 결찰과 함께 사용될 수 있다. 그런 과정은 어레이 상에서 포획 프로브의 합성을 위해 상기에서 설명된 것과 유사하다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직 샘플의 전역적 게놈과 같은 조직 샘플의 게놈 전부를 측정 및/또는 분석하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 그 방법은 이것에 한정되지 않으며, 게놈의 전부 또는 일부를 측정 및/또는 분석하는 것을 포함한다. 그러므로 방법은 게놈의 부분 또는 하위세트, 예컨대 유전자 또는 염색체의 하위세트 또는 그룹, 예컨대 예를 들어 특별한 질병 또는 질환, 조직 유형 등에 관련된 특별한 유전자 또는 염색체 세트 또는 게놈의 특별한 영역 또는 부분에 상응하는 부분적인 게놈을 측정하고 및/또는 분석하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로 방법은 정상 조직과 비교할 때, 또는 심지어 조직 샘플 중의 세포의 상이한 유형 내에서도 종양 조직으로부터의 게놈 서열 또는 게놈 유전자좌를 검출 또는 분석하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 세포, 세포 그룹, 조직 또는 조직의 일부 또는 유형의 상이한 게놈 변이체 또는 유전자좌의 존재 또는 부재, 또는 분포 또는 위치가 조사될 수 있다.
다른 측면으로 보면, 상기에서 설명된 방법의 단계들은 핵산, 예컨대 조직 샘플의 게놈 서열, 변이체 또는 유전자좌에 관련된 공간 정보를 얻는 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다. 달리 보면 본 발명은 게놈, 특별히 개별적인 또는 공간적으로 분포된 게놈을 표지화 (또는 태그 달기)하기 위해 사용될 수 있다.
또는 달리 보자면, 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 DNA의 공간적 검출을 위한 방법, 또는 공간 해상도를 가지는 DNA를 검출하기 위한, 또는 조직 샘플 중의 DNA의 국지화된 또는 공간적 측정 및/또는 분석을 위한 방법으로서 볼 수 있다. 특히 방법은 조직 샘플 중의 유전자 또는 게놈 서열 또는 게놈 변이체 또는 유전자좌의 국지화된 또는 공간적 검출 또는 측정 및/또는 분석 (예컨대 게놈 변이체 또는 유전자좌의 분포)를 위해 사용될 수 있다. 국지화된/공간적 검출/측정/분석이란 DNA가 조직 샘플 중의 세포 또는 조직 내에서 그것의 본래 위치 또는 장소에 국지화될 수 있음을 의미한다. 그러므로 예를 들어 DNA는 세포 또는 세포 그룹에, 또는 샘플 중의 세포 유형에, 또는 조직 샘플 내의 지역의 특별한 영역에 국지화될 수 있다. DNA, 예컨대 게놈 변이체 또는 유전자좌의 본래 위치 또는 장소 (또는 달리 표현하면, 조직 샘플 중의 DNA의 장소 또는 위치)가 측정될 수 있다.
그러므로 본 발명의 어레이는 그 어레이와 접촉하게 되는 조직 샘플의 핵산, 예컨대 DNA를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 어레이는 또한 조직 샘플의 부분적인 또는 전역적인 게놈을 측정 및/또는 분석하기 위해 또는 조직 샘플의 공간적으로 규정된 부분적인 또는 전역적인 게놈을 얻기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 그러므로 조직 샘플에서 하나 또는 그 이상의 게놈 서열 (또는 변이체 또는 유전자좌)의 공간적 분포를 정량하는 방법으로서 간주될 수 있다. 달리 표현하면, 본 발명의 방법은 조직 샘플 중의 하나 또는 그 이상의 게놈 서열 또는 게놈 변이체 또는 게놈 유전자좌의 공간적 분포를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 다른 방식으로 표현하면, 본 발명의 방법은 조직 샘플 내에 있는 하나 또는 그 이상의 위치에서 하나 또는 그 이상의 게놈 서열 또는 게놈 변이체 또는 게놈 유전자좌의 위치 또는 분포를 동시에 측정하기 위해 사용될 수 있다. 여전히 다르게 표현하면, 본 발명의 방법은 공간 해상도, 예컨대 2차원 공간 해상도로 조직 샘플의 핵산, 예컨대 DNA를 부분적으로 또는 전역적으로 분석하기 위한 방법으로 볼 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 어레이를 제공하는 것으로 볼 수 있는데, 그 어레이는 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어서 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고, 상기 프로브가 연장 또는 결찰 프라이머로서 기능하는 것을 가능하게 하기 위해 유리 3' 단부를 가지도록 배향된 기판을 포함하며, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함하는 핵산 분자를 포함한다:
(i) 어레이 상에서 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 핵산을 포획하기 위한 포획 도메인.
한 측면으로 포획될 핵산 분자는 DNA이다. 포획 도메인은 상기 RNA 검출과 관련하여 설명된 방법과 유사하게, 검출하고자 하는 특정 DNA에, 또는 특정 부류 또는 그룹의 DNA에 대해, 예컨대 표적 DNA, 예컨대 보존된 서열의 특이한 모티프 서열에 특이적으로 혼성화함으로써, 특이적일 수 있다. 또는 달리 포획하고자 하는 DNA에는 결합 도메인, 예컨대 상기에서 설명된 것과 같은 공통적인 결합 도메인이 제공될 수 있고, 그 결합 도메인은 포획 프로브의 포획 도메인에 의해 인지될 수 있다. 그러므로 상기에서 주지된 바와 같이, 결합 도메인은 예를 들어 단일중합체 서열, 예컨대 폴리-A일 수 있다. 그런 결합 도메인은 상기에서 RNA/전사체 분석 또는 검출에 대한 방법과 관련하여 제공될 수 있는 원리 및 방법에 따라 또는 그와 유사하게 제공될 수 있다. 그런 경우에 포획 도메인은 조직 샘플의 DNA 분자 안에 도입된 결합 도메인에 상보할 수 있다.
또한 상기의 RNA 맥락에서 설명된 것과 같이, 포획 도메인은 무작위 또는 축퇴성 서열일 수 있다. 그러므로 DNA는 무작위 또는 축퇴성 포획 도메인 또는 최소한 부분적으로 무작위 또는 축퇴성 서열을 포함하는 포획 도메인에 대한 결합에 의해 비특이적으로 포획될 수 있다.
관련된 측면으로 본 발명은 또한 그 위에서 다수의 포획 프로브 종이 직접 또는 간접적으로 고정되어서 각각의 종이 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고, 상기 프로브가 연장 또는 결찰 프라이머로서 기능하는 것을 가능하게 하기 위해 유리 3' 단부를 가지도록 배향된 기판을 포함하는 어레이의, 그 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA를 포획하기 위해 사용되는 용도를 제공하며, 이때 상기 포획 프로브의 각각의 종은 5'에서 3' 방향으로 다음:
(i) 어레이 상에서 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
(ii) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 핵산을 포획하기 위한 포획 도메인을 가지는 핵산 분자를 포함한다.
바람직하게는 상기 용도는 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 검출을 위한 것으로 다음의 단계들로 이루어진다:
(a) 포획된 핵산 분자로부터 상기 포획 프로브를 연장 또는 결찰 프라이머로서 사용하여 생성하는 단계, 이때 상기 연장된 또는 결찰된 분자는 위치 도메인에 의해 태그되고;
(b) 임의로 상기 태그가 달린 핵산의 상보하는 가닥을 생성하고 및/또는 상기 태그가 달린 핵산을 증폭시키는 단계;
(c) 태그가 달린 DNA 분자 및/또는 그것의 상보물 또는 암플리콘의 최소한 일부을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며;
(d) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계; 그리고 임의로
(e) 상기 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계, 이때 조직 샘플은 단계 (a) 전 또는 후에 영상화된다.
조직 샘플 중의 DNA를 단편화하는 단계는 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 원하는 과정을 사용하여 수행될 수 있다. 그러므로 물리적인 단편화 방법, 예컨대 초음파 처리 또는 초음파 분쇄 처리가 사용될 수 있다. 화학적 방법 또한 알려져 있다. 효소적인 단편화 방법이 또한 사용될 수 있는데, 예를 들면 엔도뉴클레아제, 예컨대 제한 효소를 사용한다. 이것에 대한 방법 및 효소들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 단편화는 어레이 상에 놓기 위해 조직 샘플을 제조하는 전에, 중에 또는 후에 이루어질 수 있는데, 예를 들면 조직 절편을 제조하는 것이 있다. 편리하게도, 단편화는 세포를 고정하는 단계에서 이루어질 수 있다. 그러므로 예를 들어 포르말린 고정은 DNA의 단편화를 유발할 것이다. 다른 고정액도 유사한 결과를 불러올 수 있다.
본 발명의 이들 측면에서 어레이를 제조하고 사용하는 상세한 설명의 관점에서, RNA 방법과 관련하여 상기에서 주어진 설명 및 상세한 묘사는 본원에서 설명된 보다 일반적인 핵산 검출 및 DNA 검출 방법에도 유사하게 적용된다는 것이 인지될 것이다. 그러므로 상기에서 논의된 모든 측면 및 상세한 설명은 유사하게 적용된다. 예를 들어 역전사 효소 프라이머와 반응 등에 대한 논의는 상기에서 언급된 연장 프라이머, 중합효소 반응 등의 어떠한 측면에든지 유사하게 적용될 수 있다. 마찬가지로 첫 번째 및 두 번째 가닥 cDNA 합성에 대한 참고문헌도 태그가 달린 DNA 분자 및 그것의 상보물에 대해 유사하게 적용될 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같은 서열 분석 방법이 사용될 수 있다.
실례로서, 포획 도메인은 상기 포획 프로브에 대해 설명된 것과 같을 수 있다. 폴리-T 또는 폴리-T-함유 포획 도메인이 예를 들면 DNA 단편에 폴리-A 서열을 포함하고 있는 결합 도메인이 제공되어 있는 실례에 대해 사용될 수 있다.
포획 프로브/태그가 달린 DNA 분자 (즉 태그가 달린 연장된 또는 결찰된 분자)에는 상기에서 설명된 것과 같이 보편적 도메인이 예컨대 증폭 및/또는 절단을 위해 제공될 수 있다.
본 발명을 다음의 도면과 관련하여 다음의 비-제한적인 실례를 참조로 하여 추가로 설명하기로 한다.
도 1은 전사체 분석을 위하여 조직 절편으로부터 mRNA를 포획하기 위해 배열된 "바코드" 올리고-dT 프로브를 사용하는 전체적인 개념을 도시한다.
도 2는 상응하는 조직 절편에 대한 풍부한 전사물을 가시화하기 위한 개략도이다.
도 3은 3'에서 5' 방향의 표면 프로브 조성과 어레이 표면에 간접적으로 고정된 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 합성을 도시한다.
도 4는 프로브 방출 후 어레이 표면에 대해 형광 표지된 프로브의 혼성화에 의해 측정된, 내부 제조된 어레이로부터의 효소적 절단 (USER 또는 RsaI) 및 Agilent사에 의해 제조된 어레이로부터 99℃ 물에 의한 절단의 효율을 입증하는 막대 그래프도이다.
도 5는 Agilent사에 의해 제조된 상업적 어레이로부터 DNA 표면 프로브의 99℃ 물 중재된 방출 후에 포획된 형광 영상을 도시한다. 형광 검출 프로브는 고온수 처리 후에 혼성화되었다. 상부 어레이는 미처리 대조표준이다.
도 6은 cDNA 합성 후 및 각각 세포질 (상부) 및 핵 염색 (중간)으로 처리된 전사체 포획 어레이의 상부에 있는 고정된 마우스 뇌 조직 절편과, 두 가지 염색을 나타내는 합쳐진 영상 (하부)을 도시한다.
도 7은 개략도에서 볼 수 있는 것과 같은 저밀도 내부 제조된 DNA-포획 어레이를 가로질러 그것의 기원에 대해 분류된 판독값의 목록인 표를 도시한다.
도 8은 바코드가 찍힌 마이크로어레이를 사용하는 핵 및 Map2로 특이적 염색된 FFPE 마우스 뇌 조직을 도시한다.
도 9는 핵 염색 (흰색)과 육안 형태학으로 본 FFPE 마우스 뇌 후 신경구를 도시한다.
도 10은 저해상도 어레이에 대해 이론적인 반점 패턴으로 덧씌워진, 핵 염색된 (흰색) FFPE 마우스 뇌 후 신경구 (대략 2×2mm)를 도시한다.
도 11은 중간-고해상도 어레이에 대해 이론적인 반점 패턴으로 덧씌워진, 핵 염색된 (흰색) FFPE 마우스 뇌 후 신경구 (대략 2×2mm)를 도시한다.
도 12는 신사구체 지역에서 확대된 FFPE 마우스 뇌 후 신경구를 도시한다 (도 9의 오른쪽 상부).
도 13은 증폭 중에 B_핸들 (B_R6)에 결합된 무작위 헥사머 프라이머 (R6)를 사용하여 USER 방출된 결과의 생성물을 도시한다. 생성물은 생체 분석기 상에 묘사된다.
도 14는 증폭 중에 B_핸들 (B_R8)에 결합된 무작위 옥타머 프라이머 (R8)를 사용하여 USER 방출된 결과의 생성물을 도시한다. 생성물은 생체 분석기 상에 묘사된다.
도 15는 전체 어레이를 덮는 FFPE 뇌 조직에 대해 수행된 실험 결과를 도시한다. ID5 (왼쪽) 및 ID20 (오른쪽)은 합성 및 표면으로부터의 cDNA의 방출 후에 ID 특이적 및 유전자 특이적 프라이머 (B2M 엑손4)로 증폭되었다. ID5와 ID20은 증폭되었다.
도 16은 실시예 4에서 설명된 방법의 원리에 대한, 즉 공간적 표지화 태그 서열 (위치 도메인)을 운반하는 고정된 DNA 올리고 (포획 프로브)를 포함하는 마이크로어레이의 사용을 나타내는 개략도이다. 마이크로어레이의 올리고의 각각의 피쳐는 1) 독특한 표지화 태그 (위치 도메인) 및 2) 포획 서열 (포획 도메인)을 운반한다.
도 17은 평균 크기가 200bp로 사전-단편화된 게놈 DNA로 수행된 실시예 5에서 설명된 공간적 게놈학 프로토콜의 결과를 도시한다. 중간 생성물은 어레이 표지되고 합성된 DNA에 대해 증폭되었다. 검출된 피크는 예상된 크기의 것이다.
도 18은 평균 크기가 700bp로 사전-단편화된 게놈 DNA로 수행된 실시예 5에서 설명된 공간적 게놈학 프로토콜의 결과를 도시한다. 중간 생성물은 어레이 표지되고 합성된 DNA에 대해 증폭되었다. 검출된 피크는 예상된 크기의 것이다.
도 19는 평균 크기가 200bp로 사전-단편화된 게놈 DNA로 수행된 실시예 5에서 설명된 공간적 게놈학 프로토콜의 결과를 도시한다. 생성물은 표면 올리고에 함유된 하나의 내부 프라이머 및 하나의 보편적 서열을 사용하여 증폭된다. 증폭은 어레이 표지되고 합성된 DNA에 대해 수행되었다. 예상된 생성물은 게놈 DNA의 무작위 단편화 및 말단 트란스페라제 표지화가 매우 다양한 샘플 푸울을 생성할 것을 가정한다면 미미하다.
도 20은 평균 크기가 700bp로 사전-단편화된 게놈 DNA로 수행된 실시예 5에서 설명된 공간적 게놈학 프로토콜의 결과를 도시한다. 생성물은 표면 올리고에 함유된 하나의 내부 프라이머 및 하나의 보편적 서열을 사용하여 증폭된다. 증폭은 어레이 표지되고 합성된 DNA에 대해 수행되었다. 예상된 생성물은 게놈 DNA의 무작위 단편화 및 말단 트란스페라제 표지화가 매우 다양한 샘플 푸울을 생성할 것을 가정한다면 미미하다.
도 21은 폴리-T 포획 도메인에 대한 혼성화를 위해 결합 도메인을 도입하기 위해 DNA 단편에 링커를 결찰하고, 계속해서 포획 프로브에 결찰하는 것을 예시하는 개략도이다.
도 22는 고밀도 포획 어레이 상에서 사용된 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 조성을 도시한다.
도 23은 형광 마커 프로브의 혼성화에 의해 가시화된, 조직 샘플을 배향하기 위해 사용된 고밀도 어레이의 프레임을 도시한다.
도 24는 고밀도 어레이로부터 절단되고 절단되지 않은 포획 프로브를 도시하는데, 이때 프레임 프로브는 그것이 우라실 염기를 함유하지 않기 때문에 절단되지 않는다. 포획 프로브는 폴리-A 올리고뉴클레오티드에 결합된 플루오로포어로 표지되었다.
도 25는 마우스 후 신경구로부터 포획된 전사물을 포함하여 제조된 서열화 라이브러리의 생체 분석기 영상을 도시한다.
도 26은 마우스 후 신경구로부터 추출된 총 RNA로부터 포획된 전사물의 Matlab 가시화를 도시한다.
도 27은 마우스 후 신경구 조직으로부터 포획한 후 Matlab 가시화를 사용하여 포획 어레이를 가로질로 가시화된 것으로서 Olfr (후각 수용체) 전사물을 도시한다.
도 28은 내부 41-ID-태그 마이크로어레이에 대한 인쇄 패턴을 도시한다.
도 29는 포획 어레이 상의 폴리-A 꼬리 달린 게놈 단편의 포획 후에 A431 특이적 전위로부터 생성된 공간적 게놈학 라이브러리를 도시한다.
도 30은 포획 어레이 상의 폴리-A 꼬리 달린 U2OS 게놈 단편으로의 스파이크 10% 및 50% 폴리-A 꼬리 달린 A431 게놈 단편의 포획 후에 A431 특이적 전위의 검출을 도시한다.
도 31은 조직 영상으로 덮여진 41-ID-태그 내부 어레이 상에서 마우스 후 신경구 조직으로부터의 포획된 ID-태그 달린 전사물의 Matlab 가시화를 도시한다. 명료하게 하기 위해 그것에 대한 특별한 유전자가 확인된 특이한 피쳐는 원으로 표시하였다.
어레이의 제조
다음의 실험은 올리고뉴클레오티드 프로브가 어레이 기판에 5' 또는 3' 단부 중 어느 단부에 의해 부착되어 mRNA에 혼성화할 수 있는 포획 프로브가 포함된 어레이를 생성하는지를 입증한다.
5'에서 3' 배향된 프로브를 포함하는 내부 인쇄된 마이크로어레이의 제조
개별적인 태그 서열 (태그 1 내지 20, 표 1)을 포함하는 20 RNA-포획 올리고뉴클레오티드를 유리 슬라이드 위에 포획 프로브로서 기능하도록 스포팅하였다. 그 프로브를 C6 스페이서가 포함된 5'-말단 아미노 링커를 사용하여 합성하였다. 모든 프로브를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에 의해 합성하였다. RNA-포획 프로브를 150mM 인산 나트륨, pH 8.5에 20μM의 농도로 현탁하고, 나노플로터(Nanoplotter) NP2.1/E (Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany)를 사용하여 CodeLinkTM 활성화된 마이크로어레이 슬라이드 (7.5cm×2.5cm; Surmodics, Eden Prairie, MN, USA) 위에 스포팅하였다. 인쇄 후에 표면 차단을 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 프로브를 16개의 동일한 어레이에서 슬라이드 위에 인쇄하였고, 각각의 어레이는 사전에 규정된 인쇄 패턴을 함유하였다. 16개의 하위-어레이를 16-패드 마스크 (ChipClipTM Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA)에 의해 혼성화 중에 분리하였다.
명칭 서열 5'mod 3'mod 길이
유리 3' 포획 프로브에 대한 서열
TAP-ID1 UUAAGTACAAATCTCGACTGCCACTCTGAACCTTCTCCTTCTCCTTCACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
(SEQ ID NO: 1)		 아미노-C6 72
효소적 인지 UUAAGTACAA (SEQ ID NO: 2)
보편적 증폭핸들 P ATCTCGACTGCCACTCTGAA (SEQ ID NO: 3) 10
ID1 CCTTCTCCTTCTCCTTCACC (SEQ ID NO: 4) 20
포획 서열 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN (SEQ ID NO: 5) 22
ID1 CCTTCTCCTTCTCCTTCACC (SEQ ID NO: 6) 20
ID2 CCTTGCTGCTTCTCCTCCTC (SEQ ID NO: 7) 20
ID3 ACCTCCTCCGCCTCCTCCTC (SEQ ID NO: 8) 20
ID4 GAGACATACCACCAAGAGAC (SEQ ID NO: 9) 20
ID5 GTCCTCTATTCCGTCACCAT (SEQ ID NO: 10) 20
ID6 GACTGAGCTCGAACATATGG (SEQ ID NO: 11) 20
ID7 TGGAGGATTGACACAGAACG (SEQ ID NO: 12) 20
ID8 CCAGCCTCTCCATTACATCG (SEQ ID NO: 13) 20
ID9 AAGATCTACCAGCCAGCCAG (SEQ ID NO: 14) 20
ID10 CGAACTTCCACTGTCTCCTC (SEQ ID NO: 15) 20
ID11 TTGCGCCTTCTCCAATACAC (SEQ ID NO: 16) 20
ID12 CTCTTCTTAGCATGCCACCT (SEQ ID NO: 17) 20
ID13 ACCACTTCTGCATTACCTCC (SEQ ID NO: 18) 20
ID14 ACAGCCTCCTCTTCTTCCTT (SEQ ID NO: 19) 20
ID15 AATCCTCTCCTTGCCAGTTC (SEQ ID NO: 20) 20
ID16 GATGCCTCCACCTGTAGAAC (SEQ ID NO: 21) 20
ID17 GAAGGAATGGAGGATATCGC (SEQ ID NO: 22) 20
ID18 GATCCAAGGACCATCGACTG (SEQ ID NO: 23) 20
ID19 CCACTGGAACCTGACAACCG (SEQ ID NO: 24) 20
ID20 CTGCTTCTTCCTGGAACTCA (SEQ ID NO: 25) 20
유리 5' 표면 프로브 및 온-칩 유리 3' 포횝 프로브 합성에 대한 서열
유리 5'표면프로브-A GCGTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGCGGCAATCATATCGGACAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG (SEQ ID NO: 26) 아미노 C7 66
유리 5'표면프로브-U GCGTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGCGGCAATCATATCGGACGGCTGCTGGTAAATAGAGATCA (SEQ ID NO: 27) 아미노 C7 66
Nick GCG 3
LP' TTCAGAGTGGCAGTCGAGATCAC (SEQ ID NO: 28) 23
ID' GCGGCAATCATATCGGAC (SEQ ID NO: 29) 18
A' 22bp MutY 미스매치 AGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG (SEQ ID NO: 30) 22
U' 22bp MutY 미스매치 GGCTGCTGGTAAATAGAGATCA (SEQ ID NO: 31)
포획 프로브 합성에 대한 혼성화된 서열
Illumina 증폭 핸들A ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO: 32) 33
보편적 증폭 핸들 U AAGTGTGGAAAGTTGATCGCTATTTACCAGCAGCC (SEQ ID NO: 33) 35
포획_LP_폴리-dTVN GTGATCTCGACTGCCACTCTGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN (SEQ ID NO: 34) 인산화됨 45
포획_LP_폴리-d24T GTGATCTCGACTGCCACTCTGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 35) 인산화됨 47
추가의 이차 보편적 증폭 핸들
Illumina 증폭 핸들 B AGACGTGTGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO: 36) 21
보편적 증폭 핸들X ACGTCTGTGAATAGCCGCAT (SEQ ID NO: 37) 20
B_R6 핸들(또는 X) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNN (SEQ ID NO: 38) 27(26)
B_R8 핸들(또는 X) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 39) 29(28)
B_폴리TVN(또는 X) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN (SEQ ID NO: 40) 43(42)
B_폴리24T(또는 X) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 41) 45(44)
A 핸들을 P 핸들 생성물에 통합시키기 위한 증폭 핸들
A_P 핸들 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCTCGACTGCCACTCTGAA (SEQ ID NO: 42) 53
3'에서 5' 배향된 프로브를 포함하는 내부 인쇄된 마이크로어레이의 제조 및 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 합성
표면 프로브 올리고뉴클레오티드의 인쇄를 상기의 5'에서 3' 배향된 프로브의 경우에서와 같이 수행하되, 표 1에서 알 수 있는 것과 같이 3' 단부에 아미노-C7 링커를 사용하였다.
포획 프로브 합성을 위한 프라이머를 혼성화하기 위하여, 4×SSC 및 0.1% SDS, 2μM 연장 프라이머 (보편적 도메인 올리고뉴클레오티드) 및 2μM 가닥 연결 프라이머 (포획 도메인 올리고뉴클레오티드)를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 계속해서 웰당 50μL의 혼성화 용액을 함유한 어레이를 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 진동하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 포함된 50℃의 2×SSC 용액으로 6분 동안 300rpm에서 진동; 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동; 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전건조시키고 다시 ChipClip에 넣었다.
연장 및 결찰 반응을 위해 (포획 프로브의 위치 도메인을 생성시키기 위하여) 10×Ampligase 완충액, 2.5U의 AmpliTaq DNA 중합효소 Stoffel 단편 (Applied Biosystems), 10U의 Ampligase (Epicentre Biotechnologies), 2mM의 각각의 dNTP (Fermentas) 및 물을 함유한 50μL의 효소 혼합물을 각 웰에 피펫을 사용하여 넣었다. 어레이를 계속해서 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 어레이를 이미 설명한 어레이 세척 방법에 따라 세척하되, 단 첫 번째 단계는 6분 대신 10분 동안 수행하였다. 그 방법은 도 3에 도시된다.
조직 제조
다음의 실험은 본 발명의 방법에 사용하기 위해 조직 샘플 절편을 제조하는 방법을 입증한다.
신선한 냉동 조직의 제조 및 포획 프로브 어레이 위에 절편화하기
신선한 비-고정 마우스 뇌 조직을, 필요하다면 트리밍하고, -40℃의 저온 이소펜탄에 냉동시킨 후 계속해서 절편을 만들기 위해 10㎛ 농도로 저온유지장치에 넣었다. 조직 슬라이스를 사용하고자 하는 각 포획 프로브 어레이 위에 놓았다.
포르말린-고정되고 파라핀-삽입된 ( FFPE ) 조직의 제조
마우스 뇌 조직을 4% 포르말린 중에 4℃에서 24시간 동안 고정시켰다. 그런 다음 다음과 같이 인큐베이션하였다: 70% 에탄올 중에서 1시간 동안 3회 인큐베이션; 80% 에탄올 중에서 1시간 동안 1회 인큐베이션; 96% 에탄올 중에서 1시간 동안 1회 인큐베이션; 100% 에탄올 중에서 1시간 동안 3회 인큐베이션; 그리고 크실렌 중에서 실온에서 1시간 동안 2회 인큐베이션.
그런 다음 탈수된 샘플을 액체 저융점 파라핀에서 52 내지 54℃에서 3시간까지 인큐베이션하고, 그 와중에 파라핀을 한 번 교체하여 잔류 크실렌을 세척하였다. 그런 다음 완료된 조직 블럭을 실온에서 보관하였다. 그런 다음 절편을 파라핀 중에서 마이크로톰을 사용하여 사용하고자 하는 각 포획 프로브 어레이 위에 절단하였다.
절편을 어레이 슬라이드 위에서 37℃에서 24시간 동안 건조시키고 실온에서 보관하였다.
FFPE 조직의 파라핀 제거
CodeLink 슬라이드에 부착되어 있는 포르말린 고정되고 파라핀 처리된 마우스 뇌의 10㎛ 절편을 크실렌 중에서 10분 동안 2회, 99.5% 에탄올 중에서 2분 동안; 96% 에탄올 중에서 2분 동안; 70% 에탄올 중에서 2분 동안; 그리고 공기 건조시킴으로써 파라핀을 제거하였다.
cDNA 합성
다음 실험은 조직 샘플 절편으로부터 어레이 상에 포획된 mRNA가 cDNA 합성에 대한 주형으로서 사용될 수 있음을 입증한다.
칩 상에서의 cDNA 합성
Whatman사 제품인 16 웰 마스크와 Chip Clip 슬라이드 홀더를 CodeLink 슬라이드에 부착시켰다. cDNA 합성을 수행할 때 Invitrogen사 제품인 Platinum®Taq DNA 중합효소를 포함한 SuperScriptTMIII 원-스텝 RT-PCR 시스템을 사용하였다. 각 반응에 대해 25㎕의 2× 반응 혼합물 (Platinum®Taq DNA 중합효소를 포함한 SuperScriptTMIII 원-스텝 RT-PCR 시스템, Invitrogen), 22.5㎕의 물 및 0.5㎕의 100×BSA를 혼합하여 50℃로 가열하였다. SuperScript III/Platinum Taq 효소 혼합물을 반응 혼합물에, 반응당 2㎕로 첨가하고, 50㎕의 반응 혼합물을 칩 상의 각 웰에 첨가하였다. 칩을 50℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다 (Thermomixer Comfort, Eppendorf).
반응 혼합물을 웰로부터 제거하고, 슬라이드를 2×SSC, 0.1% SDS로 50℃에서 10분 동안; 0.2×SSC로 실온에서 1분 동안; 그리고 0.1×SSC로 실온에서 1분 동안 세척하였다. 그런 다음 칩을 회전 건조시켰다.
FFPE 조직 절편의 경우에, 조직을 제거하기 전에 절편을 염색하여 가시화할 수 있다 (아래의 가시화 단원 참조).
가시화
염색 전 형광 마커 프로브의 혼성화
조직을 적용하기 전에 형광 마커 프로브를 포획 프로브 어레이 상에 인쇄된 마커 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있는 피쳐에 혼성화시켰다. 형광 마커 크로브는 조직 가시화 후에 그 결과의 영상의 배향을 보조하여, 서열화 후에 얻어진 개별적인 포획 프로브 "태그" (위치 도메인) 서열에 대한 결과의 발현 프로필과 조합되는 것을 가능하게 한다. 형광 프로브를 혼성화하기 위해 4×SSC와 0.1% SDS, 2μM 검출 프로브 (P)를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 계속해서 웰당 50μL의 혼성화 용액을 포함하고 있는 어레이를 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 진동하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS를 포함하고 있는 50℃ 2×SSC 용액으로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전건조시켰다.
cDNA 합성 전 또는 후의 FFPE 조직 절편의 일반적인 조직학적 염색
포획 프로브 어레이 상에 고정된 FFPE 조직 절편을 앞에서 설명한 것과 같이 파라핀을 제거한 후, cDNA 합성 전에 세척하고 재수화하거나, 또는 앞에서 설명한 것과 같이 cDNA 합성 후에 세척하였다. 그런 다음 그것을 다음과 같이 처리하였다: 3분 동안 헤마토크실린 중에서 인큐베이션; 탈이온수로 세정; 5분 동안 수돗물 중에서 인큐베이션; 산 에탄올에 8 내지 12회 빠르게 담금; 수돗물로 1분 동안 2회 세정; 2분 동안 탈이온수로 세정; 30초 동안 에오신 중에서 인큐베이션; 5분 동안 95% 에탄올로 3회 세척; 5분 동안 100% 에탄올로 3회 세척; 10분 동안 크실렌으로 3회 세척 (이 과정은 밤새 수행될 수 있다); DPX를 사용하여 슬라이드 위에 커버슬립을 놓음; 후드에서 밤새 슬라이드를 건조시킴.
cDNA 합성 전 또는 후의 FFPE 조직 절편의 표적 단백질의 일반적인 면역조직화학 염색
포획 프로브 어레이 상에 고정된 FFPE 조직 절편을 앞에서 설명한 것과 같이 파라핀을 제거한 후, cDNA 합성 전에 세척하고 재수화하거나, 또는 앞에서 설명한 것과 같이 cDNA 합성 후에 세척하였다. 그런 다음 그것을 다음과 같이, 전체 염색 과정 중에 건조해지지 않도록 하면서 처리하였다: 절편을 일차 항체 (1×트리스 완충된 식염수 (50mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.6), 4% 당나귀 혈청 및 0.1% 트리톤-x를 포함하고 있는 차단 용액 중에 희석된 일차 항체)와 함께 습식 챔버에서 밤새 RT에서 인큐베이션함; 1×TBS로 3회 세정함; 절편을 형광색소 (FITC, Cy3 또는 Cy5)에 포합된 이차 항체와 매치시켜서 습식 챔버에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션함. 1×TBS로 3회 세정하고, 가능한 많은 TBS를 제거하고 절편을 ProLong Gold+DAPI (Invitrogen)로 보호하고 형광 현미경 및 매칭 필터 세트로 분석하였다.
잔류 조직의 제거
냉동 조직
신선한 냉동 마우스 뇌 조직에 대해 cDNA 합성 후의 직접 세척 단계는 조직을 완전하게 제거하기에 충분하였다.
FFPE 조직
포르말린 고정되고 파라핀 처리된 마우스 뇌 조직 절편이 부착되어 있는 슬라이드를 ChipClip 슬라이드 홀더 및 16웰 마스크 (Whatman)에 부착시켰다. 각각에 대해 RNeasy FFPE 키트 (Qiagen)로부터의 150㎕의 단백질 분해효소 K 소화 완충액, 10㎕의 단백질 분해효소 K 용액 (Qiagen)을 첨가하였다. 50㎕의 최종 혼합물을 각 웰에 첨가하고 슬라이드를 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
포획 프로브 ( cDNA ) 방출
PCR 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물을 사용한 포획 프로브 방출 (공유 부착된 프로브 )
16 웰 마스크 및 CodeLink 슬라이드를 ChipClip 홀더 (Whatman)에 부착시켰다. 1.8mM MgCl2 (Roche), 200μM dNTP (New England Biolabs) 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)와 함께 1×FastStart 고충실성 반응 완충액을 함유하는 50㎕의 혼합물을 37℃로 가열하고 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 cDNA 및 프로브를 함유하고 있는 반응 혼합물을 피펫을 사용하여 웰로부터 회수하였다.
TdT (말단 트란스페라제 ) 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물을 사용한 포획 프로브 방출 (공유 부착된 프로브 )
1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com); 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs); 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)를 함유하고 있는 50㎕의 혼합물을 37℃로 가열하고 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 cDNA 및 프로브를 함유하는 반응 혼합물을 피펫을 사용하여 웰로부터 회수하였다.
끓는 고온수를 사용한 포획 프로브 방출 (공유 부착된 프로브 )
16 웰 마스크 및 CodeLink 슬라이드를 ChipClip 홀더 (Whatman)에 부착시켰다. 99℃의 물 50㎕를 피펫을 사용하여 각 웰에 넣었다. 99℃의 물이 30분 동안 반응하도록 허용하였다. 그런 다음 방출된 cDNA와 프로브를 함유하고 있는 반응 혼합물을 피펫을 사용하여 웰로부터 회수하였다.
가열된 PCR 완충액을 사용한 포획 프로브 방출 ( 혼성화된 제자리 합성된 포획 프로브 , 즉 표면 프로브에 혼성화된 포획 프로브 )
1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com); 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs); 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)를 함유하고 있는 50㎕의 혼합물을 95℃로 예비가열하였다. 그런 다음 그 혼합물을 각 웰에 첨가한 후 95℃에서 5분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 프로브를 함유하고 있는 반응 혼합물을 웰로부터 회수하였다.
가열된 TdT (말단 트란스페라제 ) 완충액을 사용한 포획 프로브 방출 ( 혼성화된 제자리 합성된 포획 프로브 , 즉 표면 프로브에 혼성화된 포획 프로브 )
1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com); 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs); 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)를 함유하는 50㎕의 혼합물을 95℃로 예비가열하였다. 그런 다음 그 혼합물을 각 웰에 첨가하고 95℃에서 5분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 프로브를 함유하고 있는 반응 혼합물을 웰로부터 회수하였다.
USER 효소 및 99℃로 가열된 물을 사용하여 어레이를 처리하는 것의 효율은 도 3에서 알 수 있다. USER 효소 및 RsaI 효소를 사용한 효소적 절단을 상기에서 설명된 "내부" 어레이를 사용하여 수행하였다 (도 4). 고온수 중재된 DNA 표면 프로브의 방출은 Agilent사에 의해 제조된 상업용 어레이를 사용하여 수행하였다 (도 5).
프로브 수집 및 링커 도입
실험은 어레이 표면으로부터 방출된 첫 번째 가닥 cDNA가 이중 가닥 DNA을 생성하기 위해 변형되고 계속해서 증폭될 수 있는 것을 입증한다.
Picoplex 전체 게놈 증폭 키트에 의한 전체 전사체 증폭 (위치 도메인 (태그) 서열을 포함하여 포획 프로브 서열은 그 결과의 dsDNA 의 가장자리에 보유되지 않는다)
포획 프로브를 PCR 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물을 사용하여 (공유 부착된 포획 프로브) 또는 가열된 PCR 완충액을 사용하여 (혼성화된 제자리 합성된 포획 프로브, 즉 표면 프로브에 혼성화된 포획 프로브) 방출시켰다.
방출된 cDNA를 Picoplex (Rubicon Genomics) 무작위 프라이머 전체 게놈 증폭 방법을 제조업체의 지시를 따라 수행하여 증폭하였다.
말단 트란스페라제 ( TdT )로 꼬리를 붙인 dA 에 의한 전체 전사체 증폭 (위치 도메인 (태그) 서열을 포함한 포획 프로브 서열은 그 결과의 dsDNA 의 가장자리에 보유된다)
포획 프로브를 TdT (말단 트란스페라제) 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물을 사용하여 (공유 부착된 포획 프로브) 또는 가열된 TdT (말단 트란스페라제) 완충액을 사용하여 (혼성화된 제자리 합성된 포획 프로브, 즉 표면 프로브에 혼성화된 포획 프로브) 방출시켰다.
38㎕의 절단 혼합물을 투명한 0.2ml의 PCR 튜브에 넣었다. 그 혼합물은 1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com); 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs); 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)(가열된 방출용은 아님); 방출된 cDNA (표면 프로브로부터 연장됨); 및 방출된 표면 프로브를 함유하였다. PCR 튜브에 0.5㎕의 RNase H (5U/㎕, 최종 농도는 0.06U/㎕), 1㎕의 TdT (20U/㎕, 최종 농도는 0.5U/㎕), 및 0.5㎕의 dATP (100mM, 최종 농도는 1.25mM)를 첨가하였다. dA 꼬리달기를 위해서 튜브를 써모사이클러 (Applied Biosystems)에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, TdT를 70℃에서 10분 동안 비활성화시켰다. dA 꼬리 달기 후, PCR 마스터 혼합물을 준비하였다. 혼합물은 다음을 함유한다: 1.8mM MgCl2를 포함한 1×Faststart HiFi PCR 완충액 (pH 8.3)(Roche); 0.2mM의 각 dNTP (Fermentas); 0.2μM의 각 프라이머, A (포획 프로브의 증폭 도메인에 상보한다) 및 B_(dT)24 (Eurofins MWG Operon)(첫 번째 cDNA 가닥의 3' 단부에 첨가될 폴리-A 꼬리에 상보한다); 및 0.1U/㎕의 Faststart HiFi DNA 중합효소 (Roche). 23㎕의 PCR 마스터 혼합물을 9개의 투명한 0.2ml PCR 튜브에 넣었다. 2㎕의 dA 꼬리 달기 혼합물을 8개의 튜브에 첨가하는 한편, 2㎕의 물 (RNase/DNase 없음)을 마지막 튜브에 넣었다 (네거티브 대조표준). PCR 증폭을 다음의 프로그램을 사용하여 수행하였다: 95℃에서 2분 동안 고온 시작, 50℃에서 2분 동안 및 72℃에서 3분 동안 두 번째 가닥 합성, 95℃에서 30초 동안, 65℃에서 1분 동안, 72℃에서 3분 동안의 PCR 주기를 30회 반복하여 증폭, 그리고 72℃에서 10분 동안 마지막 연장.
반응 후 정화 및 분석
4개의 증폭 생성물을 함께 모아서 Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen)을 통해 처리하고 30㎕의 EB (10mM 트리스-Cl, pH 8.5)로 용출하였다. 그 생성물을 Bioanalyzer (Agilent) 상에서 분석하였다. DNA 1000키트를 제조업체의 지시를 따라 사용하였다.
서열화
일루미나 서열화
샘플 색인작성을 사용하는 일루미나 서열화를 위한 dsDNA 라이브러리를 제조업체의 지시를 따라 수행하였다. 서열화는 HiSeq2000 플랫폼 (Illumina) 상에서 수행하였다.
생물정보학
dA 꼬리 달기 말단 트란스페라제 접근법을 사용하여 증폭된 전체 전사체 라이브러리로부터의 서열화 데이터로부터 디지털 전사체 정보 얻기
서열화 데이터를 FastX 툴키트 FASTQ 바코드 스플리터 도구를 통해 각각의 포획 프로브 위치 도메인 (태그) 서열에 대한 개별 파일로 분류하였다. 그런 다음 개별적으로 태그가 달린 서열화 데이터를 Tophat 지도화 도구를 사용하여 마우스 게놈에 대한 지도화를 통해 분석하였다. 그 결과의 SAM 파일을 HTseq-카운트 소프트웨어를 통해 전사물 카운트에 대해 프로세스하였다.
Picoplex 전체 게놈 증폭 키트 접근법을 사용하여 증폭된 전체 전사체 라이브러리로부터의 서열화 데이터로부터 디지털 전사체 정보 얻기
서열화 데이터를 FastX 툴키트 FASTQ-대-FASTA 전환기를 사용하여 FASTQ 포맷으로부터 FASTA 포맷으로 전환하였다. 서열화 판독값을 Blastn을 사용하여 포획 프로브 위치 도메인 (태그) 서열에 대해 일렬 배열하고, 태그 서열 중 하나에 대해 1e-6보다 좋은 히트를 가지는 판독값을 각각의 태그 서열에 대한 개별 파일로 분류해냈다. 그런 다음 태그 서열 판독값의 파일을 Blastn을 사용하여 마우스 전사체에 대해 일렬 배열하고, 히트를 수집하였다.
가시화 데이터와 발현 프로필의 조합
개별적인 포획 프로브 위치 도메인 (태그) 서열에 대한 발현 프로필을 염색을 통해 조직 절편으로부터 얻어진 공간 정보와 조합한다. 그로써 조직 절편의 세포 구획으로부터 얻어진 전사체 데이터를, 주어진 구조적 맥락에서 상이한 세포 하위유형에 대한 뚜렷한 발현 특징을 구별할 수 있는 직접 비교 방식으로 분석할 수 있다.
도 8 내지 12는 실시예 1에 설명된 일반 과정을 따라, 바-코드가 찍힌 전사체 포획 어레이의 상부에서 염색된 FFPE 마우스 뇌 조직 (후신경구)의 성공적인 가시화를 도시한다. 실시예 1의 신선한 냉동 조직을 사용한 실험과 비교하여, 도 8은 FFPE 조직으로 더 좋은 형태학을 나타낸다. 도 9와 10은 조직이 상이한 유형의 프로브 밀도 어레이 위에 위치할 수 있는 방법을 도시한다.
무작위 프라이머 두 번째 가닥 합성과 이어지는 보편적 방식의 증폭에 의한 전체 전사체 증폭 (태그 서열을 포함하는 포획 프로브 서열은 그 결과 생성된 dsDNA의 단부에서 보유된다)
PCR 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브) 또는 가열된 PCR 완충액으로 포획 프로브를 방출한 후 (혼성화된 제자리 합성된 포획 프로브), 1㎕의 RNase H (5U/㎕)를 1.8mM MgCl2가 첨가된 40㎕의 1×Faststart HiFi PCR 완충액 (pH 8.3)(Roche, www.roche-applied-science.com), 0.2mM의 각 dNTP (Fermentas, www.fermentas.com), 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs, www.neb.com), 0.1U/㎕의 USER 효소 (New England Biolabs), 방출된 cDNA (표면 프로브로부터 연장됨) 및 방출된 표면 프로브를 함유하고 있는 두 개의 튜브 각각에, 최종 농도가 0.12U/㎕가 되도록 첨가하였다. 튜브를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 70℃에서 20분 동안 써모사이클러 (Applied Biosystems, www.appliedsystems.com)에서 인큐베이션하였다. 1㎕의 클레노우 단편 (3'에서 5' 방향 엑소 마이너스)(Illumina, www.illumina.com) 및 1㎕의 핸들 결합된 무작위 프라이머 (10μM)(Eurofins MWG Operon, www.eurofinsdna.com)를 두 개의 튜브에, 0.23μM의 최종 농도로 첨가하였다 (튜브 중 하나에는 B_R8 (옥타머)를 첨가하고 다른 튜브에는 B_R6 (헥사머)를 첨가한다). 두 개의 튜브를 15℃에서 15분 동안, 25℃에서 15분 동안, 37℃에서 15분 동안, 그리고 최종적으로 75℃에서 20분 동안 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 1㎕의 각 프라이머, A_P와 B (10μM)(Eurofins MWG Operon)를 양 튜브에 각각 0.22μM의 최종 농도로 첨가하였다. 또한 두 튜브에 1㎕의 Faststart HiFi DNA 중합효소 (5U/㎕)(Roche)를 0.11U/㎕의 최종 농도로 첨가하였다. PCR 증폭을 다음 프로그램을 사용하여 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장. 증폭 후에 두 개의 튜브 각각으로부터 40㎕를 Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen, www.qiagen.com)을 사용하여 정제하고 30㎕의 EB (10mM 트리스-Cl, pH 8.5)로 용출하였다. 정제된 생성물을 생물분석기 (Bioanalyzer) (Agilent, www.home.agilent.com)로 분석하였고, DNA 7500 키트를 사용하였다. 그 결과를 도 13과 14에 도시한다.
이 실시예는 무작위 헥사머 및 무작위 옥타머 두 번째 가닥 합성의 사용과, 이어서 방출된 cDNA 분자로부터 집단을 생성하기 위하여 증폭하는 것을 입증한다.
cDNA 합성 및 프로브 수집 후 ID -특이적 및 유전자 특이적 생성물의 증폭
PCR 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브), 절단된 cDNA를 10㎕의 최종 반응 부피로 증폭시켰다. 1.8mM MgCl2가 첨가된 1.4×FastStart 고충실성 반응 완충액 중의 7㎕의 절단된 주형, 1㎕의 ID-특이적 전방 프라이머 (2μM), 1㎕의 유전자-특이적 역 프라이머 (2μM) 및 1㎕의 FastStart 고충실성 효소 혼합물로, 1.8mM MgCl2와 1U의 FastStart 고충실성 효소 혼합물이 첨가된 1×FastStart 고충실성 반응 완충액을 포함한 최종 반응액 10㎕를 만들었다. PCR 증폭을 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 다음 프로그램을 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장.
프라이머 서열은 대략 250bp의 생성물을 유발한다.
베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 프라이머
5'-TGGGGGTGAGAATTGCTAAG-3' (SEQ ID NO:43)
ID-1 프라이머
5'-CCTTCTCCTTCTCCTTCACC-3' (SEQ ID NO:44)
ID-5 프라이머
5'-GTCCTCTATTCCGTCACCAT-3' (SEQ ID NO:45)
ID-20 프라이머
5'-CTGCTTCTTCCTGGAACTCA-3' (SEQ ID NO:46)
그 결과를 도 15에 도시한다. 그것은 두 개의 상이한 ID 프라이머 (즉 마이크로어레이 상의 상이한 장소에 위치한 ID 태그에 대해 특이적인)와 모든 프로브를 커버하는 뇌 조직으로부터의 동일한 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 ID-특이적 및 유전자-특이적 생성물이 성공적으로 증폭된 것을 나타낸다. 따라서 이 실험은 생성물이 ID 태그-특이적 또는 표적 핵산 특이적 증폭 반응에 의해 확인될 수 있는 것을 정립한다. 또한 상이한 ID 태그는 구별될 수 있는 것으로 정립하였다. 어레이 상의 ID 프로브 (즉 포획 프로브)의 절반만을 커버하는 조직을 사용한 두 번째 실험은 조직으로 덮인 반점에 대해 포지티브 결과 (PCR 생성물)를 유발하였다.
공간적 게놈학
배경
방법의 목적은 공간 해상도가 보유된 조직 샘플로부터 DNA 분자를 포획하는 것으로, 그것은 조직의 어떤 일부가 특별한 DNA 단편 줄기(stem)가 되는지를 측정하는 것을 가능하게 한다.
방법
방법의 원리는 공간 표지화 태그 서열 (위치 도메인)을 운반하는 고정된 DNA 올리고 (포획 프로브)를 포함한 마이크로어레이를 사용하는 것이다. 마이크로어레이의 올리고의 각 피쳐는 1) 독특한 표지화 태그 (위치 도메인) 및 2) 포획 서열 (포획 도메인)을 운반한다. 표지화 태그가 지리학적으로 어레이 표면 위에 놓이게 되는 경우를 유지함으로써 각 표지화 태그로부터 2차원으로 위치 정보를 끌어내는 것이 가능해진다. 예를 들어 FFPE 처리된 조직의 얇은 절편의 첨가를 통해 단편화된 게놈 DNA를 마이크로어레이에 첨가한다. 이 조직 절편의 게놈 DNA는 고정화 처리로 인해 사전에 단편처리된다.
일단 조직 슬라이스가 어레이 위에 놓이게 되면, 보편적인 꼬리 달기 반응을 말단 트란스페라제 효소의 사용을 통해 수행한다. 꼬리 달기 반응은 조직의 게놈 DNA 단편의 돌출된 3' 단부에 폴리dA 꼬리를 첨가한다. 표면의 올리고는 혼성되고 3' 차단된 폴리dA 프로브를 통해 말단 트란스페라제에 의한 꼬리 달기로부터 차단된다.
말단 트란스페라제 꼬리 달기 후에 게놈 DNA 단편은, 표면 올리고 상의 폴리dT 포획 서열을 만나는 폴리dA 꼬리를 통해 근접한 곳에서 공간적으로 태그가 달린 올리고에 혼성화될 수 있다. 혼성화가 완료된 후에 클레노우 엑소-와 같은 가닥 대체 중합효소는 표면 위의 올리고를 혼성화된 게놈 DNA 단편에 상보하는 새로운 DNA 가닥의 생성을 위한 프라이머로서 사용할 수 있다. 새로운 DNA 가닥은 이제 또한 표면 올리고의 표지화 태그의 위치 정보를 함유할 것이다.
마지막 단계로서, 새롭게 생성된 표지된 DNA 가닥을 효소적 수단, 변성 또는 물리적 수단 중 어느 하나를 통해 표면으로부터 절단한다. 그런 다음 가닥을 수집하고, 보편적 핸들의 도입, 특이한 암플리콘의 증폭 및/또는 서열화를 통해 전체 가닥 세트의 하류 증폭을 수행할 수 있다.
도 16은 이 과정을 개략적으로 도시한다.
재료 및 방법
5'에서 3' 배향된 프로브를 포함하는 내부 인쇄된 마이크로어레이의 제조
개별적인 태그 서열을 가지는 20개의 DNA-포획 올리고 (표 1)를 유리 슬라이드 위에 스포팅하여 포획 프로브로서 기능하도록 하였다. 프로브는 C6 스페이서를 포함한 5'-말단 아미노 링커를 사용하여 합성하였다. 모든 프로브를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에 의해 합성하였다. DNA-포획 프로브를 150mM 인산 나트륨, pH 8.5 중에 20μM의 농도로 현탁하고, CodeLinkTM 활성화된 마이크로어레이 슬라이드 (7.5cm×2.5cm; Surmodics, Eden Prairie, MN, USA) 위에 나노플로터 NP2.1/E (Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany)를 사용하여 스포팅하였다. 인쇄 후에 표면 차단을 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 프로브를 슬라이드 위의 16개의 동일한 어레이에 인쇄하였고, 각 어레이는 사전에 규정된 인쇄 패턴을 함유하였다. 16개의 하위 어레이를 혼성화 중에 16-패드 마스크 (ChipClipTM Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA)에 의해 분리하였다.
3'에서 5'배향된 프로브를 포함한 내부 인쇄된 마이크로어레이의 제조 및 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 합성
올리고의 인쇄를 상기 5'에서 3' 배향된 프로브의 경우에서와 같이 수행하였다.
포획 프로브 합성에 대한 프라이머를 혼성화하기 위하여, 4×SSC 및 0.1% SDS, 2μM의 연장 프라이머 (A_프라이머) 및 2μM의 가닥 연결 프라이머 (p_폴리_dT)를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 웰당 50μL의 혼성화 용액을 포함하고 있는 어레이를 계속해서 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 진동하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시키고 다시 ChipClip에 넣는다.
연장 및 결찰 반응을 위해 10×Ampligase 완충액, 2.5U의 AmpliTaq DNA 중합효소 Stoffel 단편 (Applied Biosystems), 10U의 Ampligase (Epicentre Biotechnologies), 2mM의 각각의 dNTP (Fermentas) 및 물을 함유한 50μL의 효소 혼합물을 각 웰에 피펫을 사용하여 넣었다. 어레이를 계속해서 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 어레이를 앞에서 설명한 어레이 세척 방법에 따라 세척하되, 단 첫 번째 단계는 6분 대신 10분 동안 수행하였다.
dA 꼬리 달기로부터 표면 올리고 포획 서열을 보호하기 위한 폴리dA 프로브의 혼성화
표면 올리고 포획 서열의 보호를 위해 3'-비오틴 차단된 폴리dA 프로브를 혼성화하기 위하여 4×SSC 및 0.1% SDS, 2μM의 3' 비오-폴리dA를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 웰당 50μL의 혼성화 용액을 포함하고 있는 어레이를 계속해서 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 진동하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시키고 다시 ChipClip에 넣는다.
포르말린-고정되고 파라핀-삽입된 ( FFPE ) 조직의 제조
마우스 뇌 조직을 4% 포르말린 중에 4℃에서 24시간 동안 고정시켰다. 그런 다음 다음과 같이 인큐베이션하였다: 70% 에탄올 중에서 1시간 동안 3회 인큐베이션; 80% 에탄올 중에서 1시간 동안 1회 인큐베이션; 96% 에탄올 중에서 1시간 동안 1회 인큐베이션; 100% 에탄올 중에서 1시간 동안 3회 인큐베이션; 그리고 크실렌 중에서 실온에서 1시간 동안 2회 인큐베이션.
그런 다음 탈수된 샘플을 액체 저융점 파라핀에서 52 내지 54℃에서 3시간까지 인큐베이션하고, 그 와중에 파라핀을 한 번 교체하여 잔류 크실렌을 세척하여 제거하였다. 그런 다음 완료된 조직 블럭을 실온에서 보관하였다. 그런 다음 절편을 파라핀 중에서 마이크로톰을 사용하여 사용하고자 하는 각 포획 프로브 어레이 위에 절단하였다.
절편을 어레이 슬라이드 위에서 37℃에서 24시간 동안 건조시키고 실온에서 보관하였다.
FFPE 조직의 파라핀 제거
CodeLink 슬라이드에 부착되어 있는 포르말린 고정된 파라핀 처리된 마우스 뇌 10㎛ 절편을 크실렌 중에서 10분 동안 2회, 99.5% 에탄올 중에서 2분 동안; 96% 에탄올 중에서 2분 동안; 70% 에탄올 중에서 2분 동안; 그리고 공기 건조시킴으로써 파라핀을 제거하였다.
게놈 DNA 의 보편적 꼬리 달기
dA 꼬리 달기를 위해 1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com), 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs), 1㎕의 TdT (20U/㎕) 및 0.5㎕의 dATP (100mM)를 함유하는 50㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 그 혼합물을 어레이 표면에 첨가하고, 어레이를 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, TdT를 70℃에서 10분 동안 비활성화시켰다. 이 과정 후에 온도를 50℃로 낮추고 다시 dA 꼬리가 달린 게놈 단편이 표면 올리고 포획 서열에 혼성화하도록 하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시켰다.
표지된 DNA 의 연장
1× 클레노우 완충액, 200μM의 dNTP (New England Biolabs) 및 1㎕의 클레노우 단편 (3'에서 5' 배향 엑소 마이너스)을 함유하는 50㎕의 반응 혼합물을 37℃로 가열하고, 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf).
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시켰다.
잔류 조직의 제거
포르말린 고정되고 파라핀 처리된 마우스 뇌 조직 절편이 부착되어 있는 슬라이드를 ChipClip 슬라이드 홀더 및 16웰 마스크 (Whatman)에 부착시켰다. 각각에 대해 RNeasy FFPE 키트 (Qiagen)로부터의 150㎕의 단백질 분해효소 K 소화 완충액, 10㎕의 단백질 분해효소 K 용액 (Qiagen)을 첨가하였다. 50㎕의 최종 혼합물을 각 웰에 첨가하고 슬라이드를 56℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
PCR 완충액에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물을 사용한 포획 프로브 방출 (공유 부착된 프로브 )
16 웰 마스크 및 CodeLink 슬라이드를 ChipClip 홀더 (Whatman)에 부착시켰다. 1.8mM MgCl2 (Roche), 200μM dNTP (New England Biolabs) 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)와 함께 1×FastStart 고충실성 반응 완충액을 함유하는 50㎕의 혼합물을 37℃로 가열하고 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 cDNA 및 프로브를 함유하는 반응 혼합물을 피펫을 사용하여 웰로부터 회수하였다.
표지된 DNA 의 합성 및 프로브 수집 후 ID -특이적 및 유전자 특이적 생성물의 증폭
PCR 완충액 중에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브), 절단된 DNA를 10㎕의 최종 반응 부피로 증폭시켰다. 1.8mM MgCl2가 첨가된 1.4×FastStart 고충실성 반응 완충액 중의 7㎕의 절단된 주형, 1㎕의 ID-특이적 전방 프라이머 (2μM), 1㎕의 유전자-특이적 역 프라이머 (2μM) 및 1㎕의 FastStart 고충실성 효소 혼합물로, 1.8mM MgCl2와 1U의 FastStart 고충실성 효소 혼합물이 첨가된 1×FastStart 고충실성 반응 완충액을 포함한 최종 반응액 10㎕를 만들었다. PCR 증폭을 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 다음 프로그램을 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장.
무작위 프라이머 두 번째 가닥 합성과 이어지는 보편적 핸들 증폭에 의한 전체 게놈 증폭 (태그 서열을 포함한 포획 프로브 서열은 그 결과로 생성된 dsDNA 의 단부에서 보유된다)
PCR 완충액에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브), 1.8mM MgCl2가 첨가된 40㎕의 1×Faststart HiFi PCR 완충액 (pH 8.3)(Roche, www.roche-applied-science.com), 0.2mM의 각 dNTP (Fermentas, www.fermentas.com), 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs, www.neb.com), 0.1U/㎕의 USER 효소 (New England Biolabs), 방출된 cDNA (표면 프로브로부터 연장됨) 및 방출된 표면 프로브를 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다. 튜브를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 70℃에서 20분 동안 써모사이클러 (Applied Biosystems, www.appliedsystems.com)에서 인큐베이션하였다. 1㎕의 클레노우 단편 (3'에서 5' 방향 엑소 마이너스)(Illumina, www.illumina.com) 및 1㎕의 핸들 결합된 무작위 프라이머 (10μM)(Eurofins MWG Operon, www.eurofinsdna.com)를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 15℃에서 15분 동안, 25℃에서 15분 동안, 37℃에서 15분 동안, 그리고 최종적으로 75℃에서 20분 동안 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 1㎕의 각 프라이머, A_P와 B (10μM)(Eurofins MWG Operon)를 튜브에 첨가하였다. 또한 튜브에 1㎕의 Faststart HiFi DNA 중합효소 (5U/㎕)(Roche)를 첨가하였다. PCR 증폭을 다음 프로그램을 사용하여 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장함. 증폭 후에 튜브로부터 40㎕를 Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen, www.qiagen.com)을 사용하여 정제하고 30㎕의 EB (10mM 트리스-Cl, pH 8.5)로 용출하였다. 정제된 생성물을 Bioanalyzer (Agilent, www.home.agilent.com)로 분석하였고, DNA 7500 키트를 사용하였다.
가시화
염색 전 형광 마커 프로브의 혼성화
조직을 적용하기 전에 형광 마커 프로브를 포획 프로브 어레이 상에 인쇄된 마커 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있는 피쳐에 혼성화시켰다. 형광 마커 프로브는 조직 가시화 후에 그 결과의 영상의 배향을 보조하여, 서열화 후에 얻어진 개별적인 포획 프로브 태그 서열에 대한 결과의 발현 프로필과 조합되는 것을 가능하게 한다. 형광 프로브를 혼성화하기 위해 4×SSC와 0.1% SDS, 2μM 검출 프로브 (P)를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 계속해서 웰당 50μL의 혼성화 용액을 포함하고 있는 어레이를 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 진동하면서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS를 포함하고 있는 50℃ 2×SSC 용액으로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전건조시켰다.
표지된 DNA 의 합성 전 또는 후의 FFPE 조직 절편의 일반적인 조직학적 염색
포획 프로브 어레이 상에 고정된 FFPE 조직 절편을 앞에서 설명한 것과 같이 파라핀을 제거한 후, 표지된 DNA 합성 전에 세척하고 재수화하거나, 또는 앞에서 설명한 것과 같이 표지된 DNA 합성 후에 세척하였다. 그런 다음 그것을 다음과 같이 처리하였다: 3분 동안 헤마토크실린 중에서 인큐베이션; 탈이온수로 세정; 5분 동안 수돗물 중에서 인큐베이션; 산 에탄올에 8 내지 12회 빠르게 담금; 수돗물로 1분 동안 2회 세정; 2분 동안 탈이온수로 세정; 30초 동안 에오신 중에서 인큐베이션; 5분 동안 95% 에탄올로 3회 세척; 5분 동안 100% 에탄올로 3회 세척; 10분 동안 크실렌으로 3회 세척 (이 과정은 밤새 수행될 수 있다); DPX를 사용하여 슬라이드 위에 커버슬립을 놓음; 후드에서 밤새 슬라이드를 건조시킴.
표지된 DNA 의 합성 전 또는 후의 FFPE 조직 절편의 표적 단백질의 일반적인 면역조직화학 염색
포획 프로브 어레이 상에 고정된 FFPE 조직 절편을 앞에서 설명한 것과 같이 파라핀을 제거한 후, 표지된 DNA 합성 전에 세척하고 재수화하거나, 또는 앞에서 설명한 것과 같이 표지된 DNA 합성 후에 세척하였다. 그런 다음 그것을 다음과 같이, 전체 염색 과정 중에 건조해지지 않도록 하면서 처리하였다: 일차 항체를 차단 용액 (1×TBS (트리스 완충된 식염수 (50mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.6), 4% 당나귀 혈청 및 0.1% 트리톤-x)으로 희석하고, 절편을 일차 항체와 함께 습식 챔버에서 밤새 RT에서 인큐베이션하고, 1×TBS로 3회 세정하고, 절편을 형광색소 (FITC, Cy3 또는 Cy5)에 포합된 이차 항체와 매치시켜서 습식 챔버에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 1×TBS로 3회 세정하고, 가능한 많은 TBS를 제거하고 절편을 ProLong Gold+DAPI (Invitrogen)로 보호하고 형광 현미경 및 매칭 필터 세트로 분석한다.
이 실험은 실시예 5의 원리를 따라 수행하되, 단 조직보다는 어레이 상의 단편화된 게놈 DNA를 사용하였다. 게놈 DNA를 평균 크기가 각각 200bp와 700bp인 것으로 미리 단편화하였다. 이 실험은 원리 작업을 나타낸다. 단편화된 게놈 DNA는 FFPE 조직과 매우 유사하다.
표지된 DNA 의 합성 및 프로브 수집 후 내부 유전자 특이적 생성물의 증폭
1.8mM MgCl2가 첨가된 1×FastStart 고충실성 반응 완충액 (Roche), 200μM의 dNTP (New England Biolabs) 및 0.1U/㎕의 USER 효소 (New EnglandBiolabs)를 함유하는 PCR 완충액에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브).
절단된 DNA를 50㎕의 최종 반응 부피로 증폭시켰다. 47㎕의 절단된 주형에 1㎕의 ID-특이적 전방 프라이머 (10μM), 1㎕의 유전자-특이적 역 프라이머 (10μM) 및 1㎕의 FastStart 고충실성 효소 혼합물을 첨가하였다. PCR 증폭을 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 다음 프로그램을 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장함.
표지된 DNA 의 합성 및 프로브 수집 후 표지-특이적 및 유전자 특이적 생성물의 증폭
1.8mM MgCl2가 첨가된 1×FastStart 고충실성 반응 완충액 (Roche), 200μM의 dNTP (New EnglandBiolabs) 및 0.1U/㎕의 USER 효소 (New EnglandBiolabs)를 함유하는 PCR 완충액에서 우라실을 절단하는 USER 효소 혼합물로 포획 프로브를 방출한 후 (공유 부착된 프로브).
절단된 DNA를 50㎕의 최종 반응 부피로 증폭시켰다. 47㎕의 절단된 주형에 1㎕의 표지-특이적 전방 프라이머 (10μM), 1㎕의 유전자-특이적 역 프라이머 (10μM) 및 1㎕의 FastStart 고충실성 효소 혼합물을 첨가하였다. PCR 증폭을 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 다음 프로그램을 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분 동안 고온 시작, 그런 다음 94℃에서 15초 동안, 55℃에서 30초 동안, 68℃에서 1분 동안의 PCR 주기를 50회 반복, 그리고 68℃에서 5분 동안 마지막 연장함.
전방- 게놈 DNA 사람 프라이머
5'-GACTGCTCTTTTCACCCATC-3' (SEQ ID NO:47)
역- 게놈 DNA 사람 프라이머
5'-GGAGCTGCTGGTGCAGGG-3' (SEQ ID NO:48)
P- 표지 특이적 프라이머
5'-ATCTCGACTGCCACTCTGAA-3' (SEQ ID NO:49)
그 결과를 도 17 내지 20에 도시한다. 도면에는 어레이 상에 증폭된 내부 생성물이 나타난다 - 도 17과 18의 검출된 피크는 예상된 크기의 피크이다. 그러므로 이것은 게놈 DNA가 포획되고 증폭될 수 있음을 입증한다. 도 19 및 20에서, 예상된 생성물은 게놈 DNA의 무작위 단편화 및 말단 트란스페라제 표지화가 매우 다양한 샘플 푸울을 생성할 것을 고려한다면 미미하다.
중합효소 연장 및 말단 트란스페라제 꼬리 달기를 사용한 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 대체 합성
포획 프로브 합성을 위한 프라이머를 혼성화하기 위하여, 4×SSC 및 0.1% SDS 및 2μM의 연장 프라이머 (A_프라이머)를 함유하는 혼성화 용액을 4분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 한편 내부 어레이 (실시예 1 참조)를 ChipClip (Whatman)에 부착시켰다. 웰당 50μL의 혼성화 용액을 포함하고 있는 어레이를 계속해서 50℃에서 30분 동안 300rpm 진동에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시키고 다시 ChipClip에 넣었다.
1㎕의 클레노우 단편 (3'에서 5' 엑소 마이너스)(Illumina, www.illumina.com)을 10× 클레노우 완충액, 각각 2mM의 dNTP (Fermentas) 및 물과 함께 혼합하여 50㎕의 반응물로 만들어 피펫을 사용하여 각 웰에 첨가하였다.
어레이를 15℃에서 15분 동안, 25℃에서 15분 동안, 37℃에서 15분 동안, 그리고 마지막으로 75℃에서 20분 동안 에펜도르프 열혼합기에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에 어레이를 ChipClip으로부터 제거하고 다음의 3단계로 세척하였다: 1) 0.1% SDS가 첨가된 50℃의 2×SSC로 6분 동안 300rpm에서 진동, 2) 0.2×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동, 그리고 3) 0.1×SSC로 1분 동안 300rpm에서 진동. 그런 다음 어레이를 회전 건조시키고 다시 ChipClip에 넣었다.
dT 꼬리 달기를 위해 1×TdT 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 (pH 7.9), 50mM 아세트산 칼륨 및 10mM 아세트산 망간)(New England Biolabs, www.neb.com), 0.1㎍/㎕의 BSA (New England Biolabs), 0.5㎕의 RNase H (5U/㎕), 1㎕의 TdT (20U/㎕) 및 0.5㎕의 dTTP (100mM)를 함유하는 50㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 그 혼합물을 어레이 표면에 첨가하고, 어레이를 써모 사이클러 (Applied Biosystems)에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, TdT를 70℃에서 10분 동안 비활성화시켰다.
USER 시스템 절단 및 말단 트란스페라제를 통한 증폭이 포함된 5'에서 3' 고프로브 밀도 어레이 및 포르말린-고정된 냉동 ( FF -냉동) 조직을 사용한 공간 전사체학
어레이 제조
사전 조작된 고밀도 마이크로어레이 칩을 Roche-Nimblegen (Madison, WI, USA)으로부터 주문하였다. 각 포획 프로브 어레이는 135,000개의 피쳐를 함유하였고, 그 중 132,640개의 피쳐는 독특한 ID-태그 서열 (위치 도메인) 및 포획 영역 (포획 도메인)을 포함하고 있는 포획 프로브를 운반하였다. 각 피쳐의 크기는 13×13㎛였다. 포획 프로브는 5'에서 3'으로 dUTP 염기를 함유하는 보편적 도메인 (절단 도메인)과 일반적인 증폭 도메인, ID 태그 (위치 도메인) 및 포획 영역 (포획 도메인)으로 구성되었다 (도 22 및 표 2). 각 어레이에는 또한 어레이 가시화 중에 배향과 함께 형광 프로브의 혼성화를 가능하게 하기 위해 유전자 30bp 서열 (표 2)을 운반하는 마커 프로브 프레임 (도 23)이 갖추어져 있다.
조직 제조 - 포르말린-고정된 냉동 조직의 제조
동물 (마우스)을 50ml의 PBS와 100ml의 4% 포르말린 용액으로 관류시켰다. 후 신경구를 절출한 후에 그 조직을 4% 포르말린 배스에 넣고 24시간 동안 후-고정시켰다. 그런 다음 조직을 PBS에 녹인 30% 슈크로오스에서 24시간 동안 슈크로오스 처리하여 형태학을 안정화시키고 과잉 포르말린을 제거하였다. 조직을 제어된 속도로 -40℃로 냉동하고 실험 사이에 -20℃에서 보관하였다. 유사하게 3시간 동안 후고정된 조직 또는 후고정이 없는 조직의 제조를 병렬 시편에 대해 수행하였다. 후-고정이 없는 2% 포르말린을 사용한 관류를 또한 성공적으로 사용하였다. 유사하게 슈크로오스 처리 단계를 생략할 수 있었다. 조직을 10㎛의 절편을 만들기 위해 저온 유지 장치에 넣었다. 조직 슬라이스를 사용하고자 하는 각 포획 프로브 어레이 위에 놓았다. 임의로 보다 나은 조직 부착을 위해 어레이 칩을 50℃에 15분 동안 놓아 두었다.
임의 통제 - 절편화된 조직으로부터 총 RNA 의 제조
총 RNA를 단일 조직 절편 (10㎛)으로부터 RNeasy FFPE 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조업체의 지시를 따라 추출하였다. 조직 절편으로부터 얻어진 총 RNA를, RNA가 조직 절편으로부터 직접 어레이 상에 포획된 실험과 비교하기 위하여 대조 실험에 사용하였다. 따라서 총 RNA가 어레이에 적용된 경우에 조직의 염색, 가시화 및 분해 단계를 생략하였다.
온-칩 반응
프레임 프로브에의 마커 프로브의 혼성화, 역전사, 핵 염색, 조직 소화 및 프로브 절단 반응을 모두 16 웰 실리콘 가스킷 (Arraylt, Sunnyvale, CA, USA)에서 웰당 50㎕의 반응 부피로 수행하였다. 증발을 방지하기 위하여 카세트를 플레이트 실러 (In Vitro AB Stockholm, Sweden)로 덮었다.
cDNA 합성 전 임의-조직 투과화
단백질 분해효소 K를 사용한 투과화를 위해 단백질 분해효소 K (Qiagen, Hilden, Germany)를 PBS로 1㎍/ml로 희석하였다. 그 용액을 웰에 첨가하고 슬라이드를 실온에서 5분 동안 인큐베이션 한 후, 점차로 10분에 걸쳐 80℃로 증가시켰다. 슬라이드를 간단히 PBS로 세척한 후 역전사 반응을 시켰다.
또는 달리 마이크로파를 사용한 투과화를 위해, 조직 부착 후에 슬라이드를 50ml의 0.2×SSC (Sigma-Aldrich)를 함유하고 있는 유리 병의 바닥에 넣고 마이크로파 오븐에서 1분 동안 800W로 가열하였다. 마이크로파 처리 직후 슬라이드를 종이 조직 위에 놓고, 30분 동안 불필요한 공기 노출로부터 차단된 챔버에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 간단하게 물에 담그고 (RNase/DNase 없음), 마지막으로 원심분리에 의해 회전 건조시킨 다음 cDNA 합성을 개시하였다.
cDNA 합성
역전사 반응을 위해 플래티넘 Taq를 포함한 SupreScript III 원-스텝 RT-PCR 시스템 (Life Technologies/Invitroge, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였다. 역전사 반응은 1×반응 혼합물, 1×BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 및 2㎕의 SupreScript III RT/플래티넘 Taq 혼합물을 최종 부피 50㎕로 함유하였다. 이 용액을 50℃로 가열한 후 조직 절편에 적용하고, 반응을 50℃에서 30분 동안 수행하였다. 계속해서 웰로부터 역전사 용액을 제거하고 슬라이드를 2시간 동안 공기 중에서 건조시켰다.
조직 가시화
cDNA 합성 후, 핵 염색 및 프레임 프로브 (어레이 상에서의 조직 샘플의 배향을 가능하게 하기 위해 어레이 기판에 부착된 프로브)에의 마커 프로브의 혼성화를 동시에 수행하였다. PBS 중에 300nM 농도의 DAPI와 170nM 농도의 마커 프로브를 포함한 용액을 제조하였다. 이 용액을 웰에 첨가하고, 슬라이드를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 간단하게 PBS로 세척하고 회전 건조시켰다.
또는 달리 마커 프로브를 프레임 프로브에 혼성화시킨 후 조직을 어레이 위에 놓았다. 그런 다음 마커 프로브를 혼성화 완충액 (4×SSC, 0.1% SDS) 중에서 170nM로 희석하였다. 이 용액을 50℃로 가열한 후에 칩에 적용하고, 혼성화를 50℃에서 30분 동안 300rpm에서 혼성화를 수행하였다. 혼성화 후에, 슬라이드를 2×SSC, 0.1% SDS에서 50℃ 및 300rpm에서 10분 동안, 0.2×SSC에서 300rpm에서 1분 동안, 그리고 1×SSC에서 300rpm에서 1분 동안 세척하였다. 그 경우 cDNA 합성 후에 염색 용액은 PBS 중에 300nM로 희석된 핵 DAPI 얼룩만을 함유하였다. 그 용액을 웰에 적용하고, 슬라이드를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후 PBS로 간단하게 세척하고 회전 건조시켰다.
절편을 Zeiss Axio Imager Z2를 사용하여 현미경 조사하였고, MetaSystems 소프트웨어로 프로세스하였다.
조직 제거
조직 절편을 RNeasy FFPE 키트로부터의 PKD 완충액 중에 1.25㎍/㎕로 희석된 단백질 분해효소 K (둘 다 Qiagen 제품)를 사용하여 56℃에서 30분 동안 소화시켰고, 이때 간격은 300rpm에서 3초 동안, 그리고 6초 동안은 휴식하였다. 슬라이드를 계속해서 2×SSC, 0.1% SDS에서 50℃ 및 300rpm에서 10분 동안, 0.2×SSC에서 300rpm에서 1분 동안, 그리고 1×SSC에서 300rpm에서 1분 동안 세척하였다.
프로브 방출
실리콘 가스킷 (Arraylt)이 포함된 16-웰 혼성화 카세트를 37℃로 예열하고 Nimblegen 슬라이드에 부착시켰다. 미지 농도의 용해 완충액 (Takara), 0.1U/㎕의 USER 효소 (NEB) 및 0.1㎍/㎕의 BSA로 구성된 50㎕ 부피의 절단 혼합물을 37℃로 미리 가열하고, 표면 고정된 cDNA를 함유하고 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 거품을 제거한 후 슬라이드를 밀봉하고 37℃에서 30분 동안 써모믹서 콤포트에서 인큐베이션하였고, 이때 주기는 300rpm에서 3초 동안 진동시키고 6초 동안 휴식을 취하는 식이었다. 인큐베이션 후에 45㎕의 절단 혼합물을 각각의 사용한 웰로부터 수집하여 0.2ml의 PCR 튜브에 넣었다 (도 24).
라이브러리 제조
엑소뉴클레아제 처리
용액을 얼음 위에서 2분 동안 냉각시킨 후, 연장되지 않은 cDNA 프로브를 제거하기 위하여 엑소뉴클레아제 I (NEB)을 46.2㎕의 최종 부피 및 0.52U/㎕의 최종 농도로 첨가하였다. 튜브를 써모사이클러 (Applied Biosystems)에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 80℃에서 25분 동안 엑소뉴클레아제를 비활성화하였다.
말단 트란스페라제에 의한 dA -꼬리 달기
엑소뉴클레아제 단계 후에 TdT 완충액 (Takara), 3mM의 dATP (Takara) 및 제조업체의 TdT 효소 혼합물 (TdT 및 RNase H)(Takara)로 구성된 45㎕의 폴리A-꼬리 달기 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 각 샘플에 첨가하였다. 그 혼합물을 써모사이클러에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후 70℃에서 10분 동안 TdT를 비활성화하였다.
두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭
dA-꼬리 달기 후, 23㎕의 PCR 마스터 혼합물을, 샘플 당 4개의 새로운 0.2ml의 PCR 튜브에 넣는데, 각 튜브에 2㎕의 샘플을 주형으로서 첨가하였다. 최종 PCR은 1×Ex Taq 완충액 (Takara), 200μM의 각각의 dNTP (Takara), 600nM의 A_프라이머 (MWG), 600nM의 B_dT20VN_프라이머 (MWG) 및 0.025U/㎕의 Ex Taq 중합효소 (Takara)로 구성되었다 (표 2). 두 번째 cDNA 가닥을 써모사이클러에서 95℃에서 3분 동안, 50℃에서 2분 동안, 그리고 72℃에서 3분 동안의 한 주기를 수행함으로써 제조하였다. 그런 다음 샘플을 95℃에서 30초 동안, 67℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 3분 동안의 주기를 20주기 (라이브러리 제조를 위해) 또는 30주기 (cDNA의 존재를 확고히 하기 위해) 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
라이브러리 정화
증폭 후에 4개의 PCR (100㎕)을 500㎕의 결합 완충액 (Qiagen)과 혼합하고, Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen)에 넣고 1분 동안 17,900×g에서 회전시켜서 증폭된 cDNA를 막에 결합시켰다. 그런 다음 그 막을 에탄올을 함유하고 있는 세척 완충액 (Qiagen)으로 세척하고, 마지막으로 50㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)으로 CA-정제 (카르복실산에 포합된 초상자성 비드에 의한 정제)에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 150 내지 200bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 10%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 cDNA가 CA-비즈 (Invitrogen)에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
라이브러리 정성 분석
30 주기 동안 증폭된 샘플을 증폭된 cDNA 라이브러리의 존재를 확인하기 위하여 Agilent 생체분석기 (Agilent)를 사용하여 분석하였고, 물질의 양에 따라 DNA 고민감성 키트 또는 DNA 1000 키트를 사용하였다.
서열화 라이브러리 제조
라이브러리 색인 작성
20주기 동안 증폭된 샘플을 추가로 서열화 라이브러리를 제조하기 위해 사용하였다. 색인 PCR 마스터 혼합물을 각 샘플에 대해 제조하였고, 23㎕를 6개의 0.2ml 튜브에 넣었다. 2㎕의 증폭되고 정제된 cDNA를 6개의 PCR 각각에 주형으로서 첨가하였고, PCR은 1×Phusion 마스터 혼합물 (Fermentas), 500nM의 InPE1.0 (Illumina), 500nM의 Index 1-12 (Illumina) 및 0.4nM의 IPE2.0 (Illumina)를 함유하였다. 샘플을 써모사이클러에서, 98℃에서 30초 동안, 65℃에서 30초 동안, 그리고 72℃에서 1분 동안으로 이루어진 주기를 18주기 반복하고, 그리고 최종적으로 72℃에서 5분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
서열화 라이브러리 정화
증폭 후에 6개의 PCR (150㎕)을 750㎕의 결합 완충액과 혼합하고, Qiaquick PCR 정제 칼럼에 넣고 1분 동안 17,900×g에서 회전시켜서 증폭된 cDNA를 막에 결합시켰다 (큰 샘플 부피 (900㎕) 때문에 샘플을 둘로 (각각 450㎕) 나누고 두 개의 별도의 단계로 결합시켰다). 그런 다음 그 막을 에탄올을 함유하고 있는 세척 완충액으로 세척하고, 마지막으로 50㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇으로 CA-정제에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 300 내지 350bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 7.8%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 cDNA가 CA-비즈에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다. 샘플을 Agilent 생체분석기를 사용하여 분석함으로써 최종 라이브러리의 존재 및 크기를 확인하였고, 물질의 양에 따라 제조업체의 지시를 따라 DNA 고민감성 키트 또는 DNA 1000 키트를 사용하였다 (도 25).
서열화
라이브러리를 제조업체의 지시를 따라 원하는 데이터 출력에 따라 Illumina Hiseq2000 또는 Miseq 상에서 서열화하였다. 임의로 판독값 2에 대해서 관용적인 서열화 프라이머 B_r2를 사용하여 20T의 단일중합체 스트레치를 통한 서열화를 피하였다.
데이터 분석
판독값 1은 5' 단부에서 42 염기를 트리밍하였다. 판독값 2는 5' 단부에서 25 염기을 트리밍하였다 (임의로 만약 관용적인 프라이머가 사용되었다면 판독값 2로부터 트리밍되는 염기는 없다). 그런 다음 판독값들을 엄폐된 Mus musculus 9 게놈 어셈블리를 반복하기 위하여 보타이(bowtie)로 지도화하였고, 출력을 SAM 파일 포맷으로 포맷하였다. 지도화된 판독값을 추출하고 UCSC refGene유전자 주석 달기로 주석을 달았다. 색인을 'IndexFinder' (색인 검색을 위한 내부 소프트웨어)를 사용하여 검색하였다. 그런 다음 붙잡힌 모든 전사물 및 그것의 각각의 칩 상의 색인 위치에 대한 정보를 함유하는 몽고 DB 데이터베이스를 작성하였다.
매트랩 이행을 데이터베이스와 연결하고 데이터의 공간적 가시화 및 분석을 가능하게 하였다 (도 26).
임의로 데이터 가시화를 정확한 일렬 배열에 대해 형광 표지된 프레임 프로브를 사용하여 현미경 영상과 중복되게 하고 공간적 전사체 데이터 추출을 가능하게 하였다.
MutY 시스템 절단과 TdT 를 통한 증폭을 포함한 3'에서 5' 고 프로브 밀도 어레이 및 FFPE 조직을 사용한 공간적 전사체학
어레이 제조
사전에 제작한 고밀도 마이크로어레이 칩을 Roche-Nimblegen (Madison, WI, USA)로부터 주문하였다. 사용한 포획 프로브 어레이 각각은 72k의 피쳐를 포함하였고, 그 중 66,022개는 독특한 ID-태그 상보성 서열을 함유하였다. 각 피쳐의 크기는 16×16㎛였다. 포획 프로브는 내부 인쇄된 3'에서 5' 방향 어레이에 대해 사용된 프로브와 동일한 방식으로 3'에서 5'으로 구성되었고, 단 프로브의 상부 (P') 일반 핸들에 3개의 추가 염기가 첨가되어 있어서 P'의 긴 버전인 LP'이 만들어질 수 있다 (표 2). 각 어레이에는 또한 어레이 가시화 중에 배향을 도울 수 있는 형광 프로브의 혼성화를 가능하게 하기 위한 포괄적인 30bp 서열을 운반하는 프로브의 프레임이 맞추어져 있다.
5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 합성
고밀도 어레이 상의 5'에서 3' 배향된 포획 프로브의 합성을 내부 인쇄된 어레이의 경우에서와 같이 수행하되, 단 연장 및 결찰 단계를 55℃에서 15분 동안, 그리고 72℃에서 15분 동안 수행하였다. A-핸들 프로브 (표 2)는 아래에서 설명된 MutY 효소 시스템을 통해 프로브의 후속 방출을 가능하게 하는 A/G 미스매치를 포함하였다. P-프로브를 더 긴 LP 버전으로 대체하여 더 긴 프로브를 표면에 매치시켰다.
포르말린-고정되고 파라핀-삽입된 조직의 제조 및 파라핀 제거
이것은 상기에서 내부 프로토콜에서 설명된 것과 같이 수행하였다.
cDNA 합성 및 염색
cDNA 합성 및 염색을 5'에서 3' 배향된 고밀도 Nimblegen 어레이에 대한 프로토콜에서와 같이 수행하되, 단 비오틴 표지된 dCTP와 dATP를 cDNA 합성에 4가지의 정규 dNTP와 함께 첨가하였다 (각각은 비오틴 표지된 것보다 25배 더 많은 양으로 존재하였다).
조직 제거
조직 제거를 실시예 8에서 설명된 5'에서 3' 배향된 고밀도 Nimblegen 어레이에 대한 프로토콜에서와 동일한 방식으로 수행하였다.
MutY 에 의한 프로브 절단
실리콘 가스킷 (ArraylT)이 포함된 16-웰 인큐베이션 챔버를 37℃로 예열하고 CodeLink 슬라이드에 부착시켰다. 1×엔도뉴클레아제 VIII 완충액 (NEB), 10U/㎕의 MutY (Trevigen), 10U/㎕의 엔도뉴클레아제 VIII (NEB), 0.1㎍/㎕의 BSA로 구성된 50㎕의 절단 혼합물을 37℃로 예열하여 표면 고정된 cDNA를 함유하고 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 거품을 제거한 후 슬라이드를 37℃에서 30분 동안 써모믹서 콤포트에서, 300rpm에서 3초 동안 진동시키고 사이사이 6초 동안 휴식하는 주기로 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에 플레이트 밀봉재를 제거하고 40㎕의 절단 혼합물을 각각의 사용한 웰로부터 수집하여 PCR 플레이트에 넣었다.
라이브러리 제조
비오틴- 스트렙트아비딘 중재된 라이브러리 정화
연장되지 않은 cDNA 프로브를 제거하고 완충액을 교체하기 위하여, 비오틴 표지된 cDNA를 스트렙트아비딘 코팅된 C1-비즈 (Invitrogen)에 결합시키고, 그 비즈를 0.1M NaOH (새롭게 제조함)로 세척함으로써 샘플을 정제하였다. 정제는 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)을 사용하여 수행하였고, 비오틴 표지된 cDNA가 C1-비즈에 10분 동안 결합하도록 하였고, 그런 다음 20㎕의 물에 넣고 비드-물 용액을 80℃로 가열하여 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 파괴하도록 함으로써 용출하였다.
말단 트란스페라제에 의한 dA -꼬리 달기
정제 단계 후에, 18㎕의 각 샘플을 새로운 0.2ml의 PCR 튜브에 넣고, 제조업체의 지시에 따라 용해 완충액 (Takara, Cellamp 전체 전사체 증폭 키트), TdT 완충액 (Takara), 1.5mM의 dATP (Takara) 및 TdT 효소 혼합물 (TdT 및 RNase H)(Takara)으로 구성되는 22㎕의 폴리A-꼬리 달기 마스터 혼합물과 혼합하여 40㎕의 반응 혼합물을 만들었다. 그 혼합물을 써모사이클러에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후 70℃에서 10분 동안 TdT를 비활성화하였다.
두 번째 가닥 합성 및 PCR -증폭
dA-꼬리 달기 후, 23㎕의 PCR 마스터 혼합물을, 샘플 당 4개의 새로운 0.2ml의 PCR 튜브에 넣는데, 각 튜브에 2㎕의 샘플을 주형으로서 첨가하였다. 최종 PCR은 1×Ex Taq 완충액 (Takara), 200μM의 각각의 dNTP (Takara), 600nM의 A_프라이머 (MWG), 600nM의 B_dT20VN_프라이머 (MWG) 및 0.025U/㎕의 Ex Taq 중합효소 (Takara)로 구성되었다. 두 번째 cDNA 가닥을 써모사이클러에서 95℃에서 3분 동안, 50℃에서 2분 동안, 그리고 72℃에서 3분 동안의 한 주기를 수행함으로써 제조하였다. 그런 다음 샘플을 95℃에서 30초 동안, 67℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 3분 동안의 주기를 20주기 (라이브러리 제조를 위해) 또는 30주기 (cDNA의 존재를 확고히 하기 위해) 반복한 후 최종적으로 72℃에서 10분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
라이브러리 정화
증폭 후에 4개의 PCR (100㎕)을 500㎕의 결합 완충액 (Qiagen)과 혼합하고, Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen)에 넣고 1분 동안 17,900×g에서 회전시켜서 증폭된 cDNA를 막에 결합시켰다. 그런 다음 그 막을 에탄올을 함유하는 세척 완충액 (Qiagen)으로 세척하고, 마지막으로 50㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)으로 CA-정제 (카르복실산에 포합된 초상자성 비드에 의한 정제)에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 150 내지 200bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 10%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 cDNA가 CA-비즈 (Invitrogen)에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
두 번째 PCR -증폭
최종 PCR은 1×Ex Taq 완충액 (Takara), 200μM의 각각의 dNTP (Takara), 600nM의 A_프라이머 (MWG), 600nM의 B_프라이머 (MWG) 및 0.025U/㎕의 Ex Taq 중합효소 (Takara)로 구성되었다. 샘플을 95℃로 3분 동안 가열한 후 95℃에서 30초 동안, 65℃에서 1분 동안, 그리고 72℃에서 3분 동안의 주기를 10주기 반복한 후 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
두 번째 라이브러리 정화
증폭 후에 4개의 PCR (100㎕)을 500㎕의 결합 완충액 (Qiagen)과 혼합하고, Qiaquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen)에 넣고 1분 동안 17,900×g에서 회전시켜서 증폭된 cDNA를 막에 결합시켰다. 그런 다음 그 막을 에탄올을 함유하는 세척 완충액 (Qiagen)으로 세척하고, 마지막으로 50㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)으로 CA-정제 (카르복실산에 포합된 초상자성 비드에 의한 정제)에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 150 내지 200bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 10%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 cDNA가 CA-비즈 (Invitrogen)에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
서열화 라이브러리 제조
라이브러리 색인 작성
20주기 동안 증폭된 샘플을 추가로 서열화 라이브러리를 제조하기 위해 사용하였다. 색인 PCR 마스터 혼합물을 각 샘플에 대해 제조하였고, 23㎕를 6개의 0.2ml 튜브에 넣었다. 2㎕의 증폭되고 정제된 cDNA를 6개의 PCR 각각에 주형으로서 첨가하였고, PCR은 1×Phusion 마스터 혼합물 (Fermentas), 500nM의 InPE1.0 (Illumina), 500nM의 Index 1-12 (Illumina) 및 0.4nM의 IPE2.0 (Illumina)를 함유하였다. 샘플을 써모사이클러에서, 98℃에서 30초 동안, 65℃에서 30초 동안, 그리고 72℃에서 1분 동안으로 이루어진 주기를 18주기 동안, 그리고 최종적으로 72℃에서 5분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
서열화 라이브러리 정화
증폭 후에 샘플을 MBS 로봇을 사용하여 CA-정제에 의하여 정제하고 농축하였다. 300 내지 350bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 7.8%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 cDNA가 CA-비즈에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
10㎕의 증폭되고 정제된 샘플을 Caliper XT 칩 위에 놓고 480bp 내지 720bp의 단편을 Caliper XT (Caliper)로 절단하였다. 샘플을 Agilent 생체분석기를 사용하여 분석함으로써 완성된 라이브러리의 존재 및 크기를 확인하였고, DNA 고민감성 키트를 사용하였다.
서열화 및 데이터 분석
서열화 및 생물정보학을 실시예 8에서 설명된 5'에서 3' 배향된 고밀도 Nimblegen 어레이에 대한 프로토콜에서와 같은 방법으로 수행하였다. 그러나 데이터 분석에서는 판독값 1을 전사물의 지도화에 사용하지 않았다. 특이한 Olfr 전사물을 매트랩 가시화 도구를 사용하여 분류할 수 있었다 (도 27).
USER 시스템 절단 및 TdT 를 경유한 증폭을 포함한 단백질 분해효소 K 또는 마이크로파를 통한 투과화를 이용하고 5'에서 3' 배향된 프로브 및 포르말린-고정된 냉동 ( FF -냉동) 조직을 포함한 내부 인쇄된 41-태그 마이크로어레이를 사용한 공간적 전사체학
어레이 제조
내부 어레이를 상기에서 설명한 것과 같이 인쇄하되, 41개의 독특한 ID-태그 프로브의 패턴은 실시예 8에서 5'에서 3' 배향된 고밀도 어레이의 프로브와 동일한 조성을 가졌다 (도 28).
다른 모든 단계는 실시예 8에서 설명된 프로토콜에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
cDNA 합성 단계를 수행하기 위한 대체 방법
상기에서 설명한 것과 같은 칩 상에서의 cDNA 합성을 또한 cDNA 합성 반응에 주형 전환 프라이머를 첨가함으로써 두 번째 가닥을 생성하기 위한 주형 전환과 조합할 수 있다 (표 2). 두 번째 증폭 도메인을 첫 번째 cDNA 가닥의 3' 단부에서 역전사 효소에 의해 첨가된 말단 염기에 결합시킴으로써 두 번째 증폭 도메인을 도입하고, 두 번째 가닥의 합성을 준비시킨다. 라이브러리는 이중 가닥 복합체를 어레이 표면으로부터 방출시킨 직후에 쉽게 증폭될 수 있다.
USER 시스템 절단 및 TdT -꼬리 달기 또는 전위 특이적 프라이머를 경유하는 증폭을 사용하는 5'에서 3' 배향된 프로브 및 단편화된 폴리 -A 꼬리 달린 gDNA 를 포함하는 내부 인쇄된 41-태그 마이크로어레이의 공간적 게놈학
어레이 제조
내부 어레이를 상기에서 설명한 것과 같이 Codelink 슬라이드 (Surmodics)를 사용하여 인쇄하되, 41개의 독특한 ID-태그 프로브의 패턴은 실시예 8의 5'에서 3' 배향된 고밀도 프로브와 동일한 조성을 가진다.
세포로부터의 총 DNA 제조
DNA 단편화
게놈 DNA (gDNA)를 제조업체의 지시에 따라 A431 및 U2OS 셀라인으로부터 NDeasy 키트 (Qiagen)에 의해 추출하였다. DNA를 제조업체의 지시에 따라 Covaris 초음파기 (Covaris) 상에서 500bp로 단편화하였다.
샘플을 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)으로 CA-정제 (카르복실산에 포합된 초상자성 비드에 의한 정제)에 의해 정제하고 농축하였다. 150 내지 200bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 10%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 단편화된 cDNA가 CA-비즈 (Invitrogen)에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
임의 통제-상이한 셀라인의 급격한 상승
A431 DNA의 U2OS DNA로의 급격한 상승을 통해, 예를 들면 1%, 10% 또는 50%의 A431 DNA의 급격한 상승으로부터 상이한 수준의 포획 민감성을 측정할 수 있다.
말단 트란스페라제에 의한 dA -꼬리 달기
TdT 완충액 (Takara), 3mM의 dATP (Takara) 및 TdT 효소 혼합물 (TdT 및 RNase H)(Takara)로 구성된 45㎕의 폴리A-꼬리 달기 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 0.5㎕의 단편화된 DNA에 첨가하였다. 그 혼합물을 써모사이클러에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후 80℃에서 20분 동안 TdT를 비활성화하였다. 그런 다음 dA-꼬리 달린 단편을 Qiaquick (Qiagen) 칼럼을 통해 제조업체의 지시에 따라 정화하고, Qubit 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 농도를 측정하였다.
온-칩 실험
혼성화, 두 번째 가닥 합성 및 절단 반응을 16 웰 실리콘 가스킷 (Arraylt, Sunnyvale, CA, USA)에서 칩 상에서 수행하였다. 증발을 방지하기 위하여 카세트를 플레이트 밀봉재 (In Vitro AB, Stockholm, Sweden)로 덮었다.
혼성화
117ng의 DNA를 1×NEB 완충액 (New England Biolabs) 및 1×BSA로 구성된 총 45㎕ 부피로 만들어 미리 덮여놓은 어레이 (50℃) 위의 웰 위에 놓았다. 그 혼합물을 300rpm 진동에서 MTP 블록이 갖추어진 써모믹서 콤포트 (Eppendorf)에서 30분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다.
두 번째 가닥 합성
혼성화 혼합물을 제거하지 않고, 1×NEB 완충액, 1.5㎕의 클레노우 중합효소, 및 3.75㎕의 dNTP (각각 2mM)로 구성된 클레노우 연장 반응 혼합물 15㎕를 각 웰에 첨가하였다. 반응 혼합물을 써모믹서 콤포트 (Eppendorf)에서 37℃에서 30분 동안 진동하지 않고 인큐베이션하였다.
계속해서 슬라이드를 2×SSC, 0.1% SDS에서 50℃에서 300rpm에서 10분 동안, 0.2×SSC, 300rpm에서 1분 동안, 그리고 0.1×SSC, 300rpm에서 1분 동안 세척하였다.
프로브 방출
1.8mM MgCl2 (Roche), 200μM dNTP (New England Biolabs), 1×BSA 및 0.1U/1㎕의 USER 효소 (New England Biolabs)를 포함한 1×FastStart 고충실성 반응 완충액을 함유하고 있는 50㎕ 부피의 혼합물을 37℃로 가열하고 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다 (300rpm에서 3초, 휴식 6초)(Thermomixer comfort; Eppendorf). 그런 다음 방출된 cDNA 및 프로브를 함유하고 있는 반응 혼합물을 피펫을 사용하여 웰로부터 회수하였다.
라이브러리 제조
증폭 반응
증폭은 7.5㎕의 방출된 샘플, 1㎕의 각 프라이머 및 0.5㎕의 효소 (Roche, FastStart HiFi PCR 시스템)으로 구성된 10㎕의 반응액 중에서 수행하였다. 반응을 94℃에서 2분 동안, 그리고 94℃에서 15초, 55℃에서 2분, 72℃에서 2분의 1회 주기, 94℃에서 15초, 65℃에서 30초, 72℃에서 90초의 30주기를 수행하고, 그리고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 신장시켰다.
서열화를 위한 라이브러리의 제조에서는 표면 프로브 A-핸들과 특이한 전위 프라이머 (A431에 대해) 또는 특이한 SNP 프라이머 중 하나로 구성된 두 개의 프라이머를 B-핸들에 결합시켰다 (표 2).
라이브러리 정화
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇 (Magnetic Biosolutions)으로 CA-정제 (카르복실산에 포합된 초상자성 비드에 의한 정제)에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 150 내지 200bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 10%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 DNA가 CA-비즈 (Invitrogen)에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다.
라이브러리 정성 분석
샘플을 증폭된 DNA 라이브러리의 존재를 확인하기 위하여 Agilent 생체분석기 (Agilent)를 사용하여 분석하였고, 물질의 양에 따라 DNA 고민감성 키트 또는 DNA 1000 키트를 사용하였다.
라이브러리 색인 작성
20주기 동안 증폭된 샘플을 추가로 서열화 라이브러리를 제조하기 위해 사용하였다. 색인 PCR 마스터 혼합물을 각 샘플에 대해 제조하였고, 23㎕를 6개의 0.2ml 튜브에 넣었다. 2㎕의 증폭되고 정제된 cDNA를 6개의 PCR 각각에 주형으로서 첨가하였고, PCR은 1×Phusion 마스터 혼합물 (Fermentas), 500nM의 InPE1.0 (Illumina), 500nM의 Index 1-12 (Illumina) 및 0.4nM의 IPE2.0 (Illumina)를 함유하였다. 샘플을 써모사이클러에서, 98℃에서 30초 동안, 65℃에서 30초 동안, 그리고 72℃에서 1분 동안으로 이루어진 주기를 18주기 반복하고, 최종적으로 72℃에서 5분 동안 연장시킴으로써 증폭시켰다.
서열화 라이브러리 정화
정제되고 농축된 샘플을 MBS 로봇으로 CA-정제에 의해 추가로 정제하고 농축하였다. 300 내지 350bp 아래의 단편을 제거하기 위하여 7.8%의 최종 PEG 농도를 사용하였다. 증폭된 DNA가 CA-비즈에 결합할 수 있도록 10분 동안 허용하였고, 그런 다음 15㎕의 10mM 트리스-Cl, pH 8.5로 용출하였다. 샘플을 Agilent 생체분석기를 사용하여 분석함으로써 최종 라이브러리의 존재 및 크기를 확인하였고, 물질의 양에 따라 제조업체의 지시를 따라 DNA 고민감성 키트 또는 DNA 1000 키트를 사용하였다 (도 29).
서열화
서열화를 실시예 8에서 설명된 5'에서 3' 배향된 고밀도 Nimblegen 어레이에 대한 프로토콜에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
데이터 분석
데이터 분석을 어레이된 ID-포획 프로브의 포획 민감성을 측정하기 위해 수행하였다. 판독값 2를 그것의 전위 또는 SNP 프라이머의 함량을 토대로 분류하였다. 그런 다음 이들 판독값을 판독값 1에 함유된 그것들의 ID에 따라 분류하였다.
임의 통제 - 셀라인 특이적 전위의 직접 증폭
이것은 PCR에 의해 직접적으로 급격 상승된 셀라인의 포획 민감성을 측정하기 위하여 사용하였다. A431 전위에 대한 전방 및 역 프라이머 (표 2)를 두 번째 가닥 복사되고 방출된 물질의 전위를 시도하고 그 존재를 검출하기 위하여 사용하였다 (도 30).
공간적 전사체학 및 공간적 게놈학에 대해 사용된 올리고
실시예 8
유리 3' 단부 어레이 프로브를 포함하는 Nimblegen 5'에서 3' 어레이
5'에서 3'
프로브1 (SEQ ID NO: 50) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCCGATATGATTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브2 (SEQ ID NO: 51) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGAGCCGGGTTCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브3 (SEQ ID NO: 52) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGAGGCACTCTGTTGGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브4 (SEQ ID NO: 53) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGATTAGTCGCCATTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브5 (SEQ ID NO: 54) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTGAGGGTAGATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브6 (SEQ ID NO: 55) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGGCCAATACTGTTATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브7 (SEQ ID NO: 56) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGCTACCCTGATTCGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브8 (SEQ ID NO: 57) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCCACTTTCGCCGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브9 (SEQ ID NO: 58) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCAACTTTGAGCAAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브10 (SEQ ID NO: 59) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCAATTCGGAATTCCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브11 (SEQ ID NO: 60) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGCCCAAGGTAATACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브12 (SEQ ID NO: 61) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGCATTTCCTATTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브13 (SEQ ID NO: 62) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGCTAAATCTAACCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브14 (SEQ ID NO: 63) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAATTAAATTCTGATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브15 (SEQ ID NO: 64) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATTACATAGGTGCTAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브16 (SEQ ID NO: 65) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTGACTTGCGCTCGCACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브17 (SEQ ID NO: 66) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATAGTATCTCCCAAGTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브18 (SEQ ID NO: 67) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCGCCTGTAATCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브19 (SEQ ID NO: 68) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCGCCACTCTTTAGGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브20 (SEQ ID NO: 69) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATGCAAGTGATTGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브21 (SEQ ID NO: 70) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAAGCCACGTTTATACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브22 (SEQ ID NO: 71) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCTGATTGCTGTATAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브23 (SEQ ID NO: 72) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGCGCATCTATCCTCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브24 (SEQ ID NO: 73) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCACGCGTAGGACTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프로브25 (SEQ ID NO: 74) UUUUUACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTAAGTATGTAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
프레임 프로브
Layout1 (SEQ ID NO: 75)		 AATTTCGTCTGCTATCGCGCTTCTGTACC
형광 마커 프로브
PS_1 (SEQ ID NO: 76)		 GGTACAGAAGCGCGATAGCAG - Cy3
이차 가닥 합성 및 첫 번째 PCR 증폭 핸들
A_프라이머 (SEQ ID NO:77) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
B_dt20VN_프라이머(SEQ ID NO:78) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
관례적인 서열화 프라이머
B_r2 (SEQ ID NO:79)		 TCA GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T
실시예 9
유리 5' 단부 어레이 프로브를 포함하는 Nimblegen 3'에서 5' 어레이
5'에서 3'
프로브1 (SEQ ID NO: 80) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGCGGCAATCATATCGGACAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브2 (SEQ ID NO: 81) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACAAGATGAACCCGGCTCATAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브3 (SEQ ID NO: 82) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACTCCCAACAGAGTGCCTCAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브4 (SEQ ID NO: 83) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCGAATGGCGACTAATCATAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브5 (SEQ ID NO: 84) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACAAACATCTACCCTCAAGTAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브6 (SEQ ID NO: 85) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGATAACAGTATTGGCCATAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브7 (SEQ ID NO: 86) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGGTCGAATCAGGGTAGCGAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브8 (SEQ ID NO: 87) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACACTACGGCGAAAGTGGGCAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브9 (SEQ ID NO: 88) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACATCTTGCTCAAAGTTGCTAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브10 (SEQ ID NO: 89) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCCGGAATTCCGAATTGGCAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브11 (SEQ ID NO: 90) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACATGTATTACCTTGGGCGAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브12 (SEQ ID NO: 91) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCTCGAATAGGAAATGCGAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브13 (SEQ ID NO: 92) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGGCGGTTAGATTTAGCAAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브14 (SEQ ID NO: 93) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCCATCAGAATTTAATTCCAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브15 (SEQ ID NO: 94) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCTTAGCACCTATGTAATGAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브16 (SEQ ID NO: 95) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGTGCGAGCGCAAGTCAATAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브17 (SEQ ID NO: 96) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGAACTTGGGAGATACTATAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브18 (SEQ ID NO: 97) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACTGCGGATTACAGGCGCACAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브19 (SEQ ID NO: 98) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCTACCTAAAGAGTGGCGCAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브20 (SEQ ID NO: 99) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACAAGCCAATCACTTGCATAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브21 (SEQ ID NO: 100) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACCGTATAAACGTGGCTTGGAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브22 (SEQ ID NO: 101) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGTTATACAGCAATCAGGTAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브23 (SEQ ID NO: 102) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACTAGAGGATAGATGCGCTGAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브24 (SEQ ID NO: 103) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACACTAGTCCTACGCGTGGAAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프로브25 (SEQ ID NO: 104) GTTCAGAGTGGCAGTCGAGATCACGCGCTACATACTTAGTCGAGATCGGAAGAGCGTAGTGTAG
프레임 프로브
Layout1 (SEQ ID NO: 105)		 AAATTTCGTCTGCTATCGCGCTTCTGTACC
포획 프로브
LP_Poly-dTVN (SEQ ID NO: 106 )		 GTGATCTCGACTGCCACTCTGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
증폭 핸들 프로브
A-핸들 (SEQ ID NO:107)		 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
이차 가닥 합성 및 첫 번째 PCR 증폭 핸들
A_프라이머 (SEQ ID NO:108) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
B_dt20VN_프라이머(SEQ ID NO:109) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
이차 PCR
A_프라이머 (SEQ ID NO:110) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
B_프라이머 (SEQ ID NO:111) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
실시예 11
주형 전환
주형전환_longB (SEQ ID NO:112) GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATrGrGrG
실시예 12
공간적 게놈학
A_프라이머 (SEQ ID NO:113) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
B_A431_Chr2+2_FW_A
(SEQ ID NO: 114)		 AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGCTGCCTGAGGCAATG
B_A431_Chr2+2_RE_A
(SEQ ID NO: 115)		 AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCGCTAACAAGCAGAGAGAAC
B_A431_Chr3+7_FW_B
(SEQ ID NO: 116)		 AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAGAACAAGGGGGAAGAG
B_A431_Chr3+7_RE_B
(SEQ ID NO: 117)		 AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGTGAAACAAGCAGGTAAC
B_NT_1_FW (SEQ ID NO: 118) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATTCCCACACTCATCACAC
B_NT_1_RE (SEQ ID NO: 119) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCACACTGGAGAAAGACCC
B_NT_2_FW (SEQ ID NO: 120) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGTTCAGAGTGATTTTTCAG
B_NT_2_RE (SEQ ID NO: 121) AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCGTTTTCTTTCAGTGCC
<110> Spatial Transcriptomics AB <120> METHOD AND PRODUCT FOR LOCALISED OR SPATIAL DETECTION OF NUCLEIC ACID IN A TISSUE SAMPLE <130> PIA01864EP <150> GB1106254.4 <151> 2011-04-13 <150> PCT/EP 2012/056823 <151> 2012-04-13 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAP-ID1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5'-terminus amino linker with a C6 spacer <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, t or u <400> 1 uuaagtacaa atctcgactg ccactctgaa ccttctcctt ctccttcacc tttttttttt 60 tttttttttt vn 72 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enzymatic recognition sequence <400> 2 uuaagtacaa 10 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal amplification handle P <400> 3 atctcgactg ccactctgaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID1 <400> 4 ccttctcctt ctccttcacc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Capture sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 tttttttttt tttttttttt vn 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID1 <400> 6 ccttctcctt ctccttcacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID2 <400> 7 ccttgctgct tctcctcctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID3 <400> 8 acctcctccg cctcctcctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID4 <400> 9 gagacatacc accaagagac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID5 <400> 10 gtcctctatt ccgtcaccat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID6 <400> 11 gactgagctc gaacatatgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID7 <400> 12 tggaggattg acacagaacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID8 <400> 13 ccagcctctc cattacatcg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID9 <400> 14 aagatctacc agccagccag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID10 <400> 15 cgaacttcca ctgtctcctc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID11 <400> 16 ttgcgccttc tccaatacac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID12 <400> 17 ctcttcttag catgccacct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID13 <400> 18 accacttctg cattacctcc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID14 <400> 19 acagcctcct cttcttcctt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID15 <400> 20 aatcctctcc ttgccagttc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID16 <400> 21 gatgcctcca cctgtagaac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID17 <400> 22 gaaggaatgg aggatatcgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID18 <400> 23 gatccaagga ccatcgactg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID19 <400> 24 ccactggaac ctgacaaccg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID20 <400> 25 ctgcttcttc ctggaactca 20 <210> 26 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Free 5' surface probe - A <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> 3'-terminus amino linker with a C7 spacer <400> 26 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgcgg caatcatatc ggacagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Free 5' surface probe - U <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> 3'-terminus amino linker with a C7 spacer <400> 27 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgcgg caatcatatc ggacggctgc tggtaaatag 60 agatca 66 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> LP' <400> 28 ttcagagtgg cagtcgagat cac 23 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID' <400> 29 gcggcaatca tatcggac 18 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A' 22bp MutY mismatch <400> 30 agatcggaag agcgtagtgt ag 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> U' 22bp MutY mismatch <400> 31 ggctgctggt aaatagagat ca 22 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Illumina amplification handle A <400> 32 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Universal amplification handle U <400> 33 aagtgtggaa agttgatcgc tatttaccag cagcc 35 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Capture LP Poly-dTVN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Phosphorylated <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 gtgatctcga ctgccactct gaattttttt tttttttttt tttvn 45 <210> 35 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Capture LP Poly-d24T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Phosphorylated <400> 35 gtgatctcga ctgccactct gaattttttt tttttttttt ttttttt 47 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Illumina amplification handle B <400> 36 agacgtgtgc tcttccgatc t 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Universal amplification handle X <400> 37 acgtctgtga atagccgcat 20 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> B R6 handle (or X) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(29) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnn 29 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> B R8 handle (or X) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(31) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn n 31 <210> 40 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> B polyTVN (or X) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 agacgtgtgc tcttccgatc tttttttttt tttttttttt tvn 43 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> B poly24T (or X) <400> 41 agacgtgtgc tcttccgatc tttttttttt tttttttttt ttttt 45 <210> 42 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A P handle <400> 42 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatctcga ctgccactct gaa 53 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Beta-2 microglobulin (B2M) primer <400> 43 tgggggtgag aattgctaag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID-1 primer <400> 44 ccttctcctt ctccttcacc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID-5 primer <400> 45 gtcctctatt ccgtcaccat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ID-20 primer <400> 46 ctgcttcttc ctggaactca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward - Genomic DNA Human primer <400> 47 gactgctctt ttcacccatc 20 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse - Genomic DNA Human primer <400> 48 ggagctgctg gtgcaggg 18 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> P - label specific primer <400> 49 atctcgactg ccactctgaa 20 <210> 50 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 1 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 50 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgt ccgatatgat tgccgctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 51 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 2 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 51 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat gagccgggtt catctttttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 52 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 3 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 52 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttg aggcactctg ttgggatttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 53 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 4 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 53 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat gattagtcgc cattcgtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 54 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 5 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 54 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctac ttgagggtag atgttttttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 55 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 6 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 55 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat ggccaatact gttatctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 56 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 7 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 56 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctcg ctaccctgat tcgacctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 57 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 8 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 57 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgc ccactttcgc cgtagttttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 58 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 9 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 58 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctag caactttgag caagattttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 59 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 10 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 59 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgc caattcggaa ttccggtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 60 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 11 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 60 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttc gcccaaggta atacattttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 61 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 12 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 61 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttc gcatttccta ttcgagtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 62 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 13 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 62 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttt gctaaatcta accgcctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 63 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 14 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 63 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgg aattaaattc tgatggtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 64 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 15 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 64 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctca ttacataggt gctaagtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 65 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 16 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 65 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat tgacttgcgc tcgcactttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 66 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 17 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 66 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat agtatctccc aagttctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 67 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 18 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 67 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgt gcgcctgtaa tccgcatttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 68 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 19 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 68 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctgc gccactcttt aggtagtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 69 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 20 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 69 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta tgcaagtgat tggctttttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 70 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 21 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 70 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctcc aagccacgtt tatacgtttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 71 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 22 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 71 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctac ctgattgctg tataactttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 72 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 23 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 72 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctca gcgcatctat cctctatttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 73 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 24 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 73 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttc cacgcgtagg actagttttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 74 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 25 <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, t or u <400> 74 uuuuuacact ctttccctac acgacgctct tccgatctcg actaagtatg tagcgctttt 60 tttttttttt ttttttvn 78 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Frame probe - Layout 1 <400> 75 aaatttcgtc tgctatcgcg cttctgtacc 30 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Fluorescent marker probe PS 1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Coupled to cyanine 3 fluorescent dye <400> 76 ggtacagaag cgcgatagca g 21 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second strand synthesis and first PCR amplification handle - A primer <400> 77 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 78 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second strand synthesis and first PCR amplification handle - B dt20VN primer <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 agacgtgtgc tcttccgatc tttttttttt tttttttttt tvn 43 <210> 79 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Custom sequencing primer B r2 <400> 79 tcagacgtgt gctcttccga tctttttttt tttttttttt ttt 43 <210> 80 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 1 <400> 80 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgcgg caatcatatc ggacagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 81 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 2 <400> 81 gcgttcagag tggcagtcga gatcacaaga tgaacccggc tcatagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 82 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 3 <400> 82 gcgttcagag tggcagtcga gatcactccc aacagagtgc ctcaagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 83 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 4 <400> 83 gcgttcagag tggcagtcga gatcaccgaa tggcgactaa tcatagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 84 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 5 <400> 84 gcgttcagag tggcagtcga gatcacaaac atctaccctc aagtagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 85 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 6 <400> 85 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgata acagtattgg ccatagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 86 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 7 <400> 86 gcgttcagag tggcagtcga gatcacggtc gaatcagggt agcgagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 87 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 8 <400> 87 gcgttcagag tggcagtcga gatcacacta cggcgaaagt gggcagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 88 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 9 <400> 88 gcgttcagag tggcagtcga gatcacatct tgctcaaagt tgctagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 89 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 10 <400> 89 gcgttcagag tggcagtcga gatcacccgg aattccgaat tggcagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 90 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 11 <400> 90 gcgttcagag tggcagtcga gatcacatgt attaccttgg gcgaagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 91 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 12 <400> 91 gcgttcagag tggcagtcga gatcacctcg aataggaaat gcgaagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 92 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 13 <400> 92 gcgttcagag tggcagtcga gatcacggcg gttagattta gcaaagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 93 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 14 <400> 93 gcgttcagag tggcagtcga gatcacccat cagaatttaa ttccagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 94 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 15 <400> 94 gcgttcagag tggcagtcga gatcacctta gcacctatgt aatgagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 95 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 16 <400> 95 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgtgc gagcgcaagt caatagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 96 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 17 <400> 96 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgaac ttgggagata ctatagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 97 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 18 <400> 97 gcgttcagag tggcagtcga gatcactgcg gattacaggc gcacagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 98 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 19 <400> 98 gcgttcagag tggcagtcga gatcacctac ctaaagagtg gcgcagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 99 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 20 <400> 99 gcgttcagag tggcagtcga gatcacaagc caatcacttg cataagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 100 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 21 <400> 100 gcgttcagag tggcagtcga gatcaccgta taaacgtggc ttggagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 101 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 22 <400> 101 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgtta tacagcaatc aggtagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 102 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 23 <400> 102 gcgttcagag tggcagtcga gatcactaga ggatagatgc gctgagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 103 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 24 <400> 103 gcgttcagag tggcagtcga gatcacacta gtcctacgcg tggaagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 104 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe 25 <400> 104 gcgttcagag tggcagtcga gatcacgcgc tacatactta gtcgagatcg gaagagcgta 60 gtgtag 66 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Frame probe - layout 1 <400> 105 aaatttcgtc tgctatcgcg cttctgtacc 30 <210> 106 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Capture probe - LP poly-dTVN <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 106 gtgatctcga ctgccactct gaattttttt tttttttttt tttvn 45 <210> 107 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification handle probe A-handle <400> 107 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 108 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second strand synthesis and first PCR amplification handle - A primer <400> 108 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 109 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second strand synthesis and first PCR amplification handle - B dt20VN primer <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 agacgtgtgc tcttccgatc tttttttttt tttttttttt tvn 43 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second PCR - A primer <400> 110 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 111 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Second PCR - B primer <400> 111 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34 <210> 112 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Template Switching primer - longB <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> Ribonucleotides <400> 112 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatggg 39 <210> 113 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - A primer <400> 113 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 114 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B A431 Chr2+2 FW A <400> 114 agacgtgtgc tcttccgatc ttggctgcct gaggcaatg 39 <210> 115 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B A431 Chr2+2 RE A <400> 115 agacgtgtgc tcttccgatc tctcgctaac aagcagagag aac 43 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B A431 Chr3+7 FW B <400> 116 agacgtgtgc tcttccgatc ttgagaacaa gggggaagag 40 <210> 117 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B A431 Chr3+7 RE B <400> 117 agacgtgtgc tcttccgatc tcggtgaaac aagcaggtaa c 41 <210> 118 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B NT 1 FW <400> 118 agacgtgtgc tcttccgatc tcattcccac actcatcaca c 41 <210> 119 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B NT 1 RE <400> 119 agacgtgtgc tcttccgatc ttcacactgg agaaagaccc 40 <210> 120 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B NT 2 FW <400> 120 agacgtgtgc tcttccgatc tggggttcag agtgattttt cag 43 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Spatial genomics - B NT 2 RE <400> 121 agacgtgtgc tcttccgatc ttccgttttc tttcagtgcc 40

Claims (62)

  1. 조직 샘플 중의 핵산의 국지화된 검출 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (a) 기판 위에서 여러 종류의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종류의 포획 프로브가 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있도록 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
    (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
    (ii) 포획 도메인을 포함하며;
    (b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고, 조직 샘플로부터 핵산이 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
    (c) 상기 포획 프로브를 연장 또는 결찰 프라이머로서 사용하여 포획된 핵산 분자로부터 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되고;
    (d) 태그가 달린 DNA 분자의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며; 및
    (e) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 태그가 달린 DNA의 상보적인 가닥을 생성하는 단계를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 태그가 달린 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계(c) 이전 또는 이후에 조직 샘플을 영상화하는 단계를 더 포함하고, 단계(e)로부터 나온 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계를 더 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  5. 하기 단계를 포함하는 조직 샘플의 전사체를 측정 또는 분석하는 방법:
    (a) 기판 위에서 여러 종류의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종류의 포획 프로브가 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 역전사효소(RT) 프라이머로서 기능할 수 있도록 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
    (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
    (ii) 포획 도메인을 포함하며;
    (b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고, 조직 샘플로부터 RNA가 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
    (c) 상기 포획 프로브를 RT 프라이머로서 사용하여 포획된 핵산 분자로부터 cDNA 분자를 생성시키는 단계;
    (d) cDNA 분자의 최소한 일부분을 어레이 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 방출된 분자는 첫 번째 가닥 cDNA 분자, 두 번째 가닥 cDNA 분자, 또는 첫 번째 및 두 번째 가닥 cDNA 분자일 수 있고, 상기 일부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하며; 및
    (e) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 방법은 상기 cDNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 것인 전사체의 측정 또는 분석 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 방법은 상기 단계(c) 이전 또는 이후에 조직 샘플을 영상화하는 단계를 더 포함하고, 상기 단계(e)로부터 나온 서열 분석 정보를 상기 조직 샘플의 영상과 연관짓는 단계를 더 포함하는 것인 전사체의 측정 또는 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 포획 프로브는 DNA 분자인 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 포획 프로브는 추가적으로 위치 도메인에 대해 5'에 있는 보편적 도메인을 포함하고, 이때 상기 보편적 도메인은 다음을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (i) 생성된 DNA 분자를 증폭시키기 위한 증폭 도메인;
    (ii) 어레이의 표면으로부터 생성된 DNA 분자를 방출시키기 위한 절단 도메인; 또는
    (iii) 생성된 DNA 분자를 증폭시키기 위한 증폭 도메인 및 어레이의 표면으로부터 생성된 DNA 분자를 방출시키기 위한 절단 도메인.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 포획 프로브 종류는 상이한 서열을 가진 포획 도메인을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 각 종류의 포획 프로브의 위치 도메인은 독특한 바코드 서열을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 포획 도메인은
    (i) 최소한 10개의 데옥시티미딘 잔기, 또는 무작위 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드;
    (ii) 최소한 10개의 데옥시티미딘 잔기, 및 무작위 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드; 또는
    (iii) 유전자 또는 유전자 그룹에 상보적인 서열을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 포획 프로브는 그것의 5' 단부에 의해 어레이 표면 위에 직접 고정되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 포획 프로브는 표면 프로브에의 혼성화에 의해 어레이 표면에 간접적으로 고정되고, 이때 포획 프로브의 포획 도메인은 어레이 상에 고정된 표면 프로브의 5' 단부에 혼성화할 수 있는 상류 서열을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표면 프로브는 그것의 3' 단부에 의해 어레이 표면에 고정되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 표면 프로브는 다음 서열을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (i) 포획 도메인의 최소한 일부;
    (ii) 위치 도메인; 및
    (iii) 보편적 증폭 도메인의 최소한 일부에 상보하는 서열.
  17. 제2항에 있어서, 상기 상보적인 가닥은 상기 태그된 DNA 분자가 어레이의 표면으로부터 방출되기 전 또는 후에 생성되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 방법은 어댑터를 태그된 DNA 분자 또는 그것의 상보물의 하나 또는 양 단부에 결찰시키는 단계를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계(e) 전이면서, 어레이 표면으로부터 태그가 달린 DNA 분자의 방출 후에 태그된 DNA 분자의 증폭 단계를 추가로 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 증폭 단계는 PCR을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 분자는 어레이의 표면으로부터 다음에 의해 방출되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (i) 핵산 절단;
    (ii) 변성; 또는
    (iii) 물리적 수단.
  22. 제21항에 있어서, 상기 (i)에 있어 분자는 포획 프로브의 보편적 도메인 또는 위치 도메인에 위치하는 절단 도메인의 효소적 절단에 의해 방출되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 (ii) 또는 (iii)에 있어 분자는 고온수 또는 완충액을 어레이에 적용함으로써 방출되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계(e) 전에 방출된 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 실리콘, 폴리-L-라이신 코팅된 물질, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 고리형 올레핀 공중합체 (COC), 고리형 올레핀 중합체 (COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리카보네이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 조직 샘플은 조직 절편인 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조직 절편은 고정된 조직, 또는 초저온 냉동 조직을 사용하여 제조되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 고정된 조직은 포르말린-고정되고 파라핀-삽입된(FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded) 조직인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 방법은 샘플을 어레이와 접촉시킨 후에, 그리고 단계 (c) 전에 조직 샘플을 재수화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 조직 샘플은 식물, 동물 또는 진균류로부터 유래되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 방법은 잔류 조직을 제거하기 위하여 어레이를 세척하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 이 단계는 어레이로부터 분자를 방출하기 전에 수행되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 어레이는 어레이 위의 조직 샘플의 배향을 가능하게 하기 위하여 최소한 하나의 위치 마커를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 어레이는 어레이 표면 위의 뚜렷한 위치에 최소한 10, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 2000개의 위치 마커를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 위치 마커는 표지된 마커 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 표지된 마커 핵산 분자는 형광 표지된 마커 핵산 분자인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  36. 제4항에 있어서, 상기 조직 샘플의 영상화 단계는 빛, 명시야, 암시야, 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 그것들의 조합을 사용하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 조직 샘플의 영상화 단계는 형광 현미경을 사용하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  38. 제1항에 있어서, 상기 서열 분석 단계는 서열화 단계를 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 서열화 단계는 가역성 염료-터미네이터를 토대로 한 서열화 반응을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  40. 조직 샘플 중의 핵산을 국지적으로 검출하는데 사용하기 위한 어레이의 제조 또는 제작 방법으로서,
    상기 방법은 여러 종류의 포획 프로브를 어레이 기판에 직접 또는 간접적으로 고정시키는 것을 포함하고, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 어레이 위에서 뚜렷한 위치를 차지하며, 연장 또는 결찰 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3' 말단을 가지도록 배향되고, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 다음의 핵산 분자를 5'에서 3' 방향으로 포함하고:
    (i) 어레이 위의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인; 및
    (ii) 하기를 포함하는 포획 도메인:
    (a) mRNA의 선택적 포획을 위해 고안된 도메인;
    (b) 무작위 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열; 또는
    (c) 유전자 그룹에 상보적인 서열을 포함하며,
    상기 여러 종류의 포획 프로브는 같은 포획 도메인을 포함하는 기판 위에 고정되어 있는 것인 어레이의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 mRNA 의 선택적 포획을 위해 고안된 포획 도메인은 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화하는 것인 어레이의 제조 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 mRNA 의 선택적 포획을 위해 고안된 포획 도메인은 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 어레이의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개의 데옥시티미딘 잔기를 포함하는 것인 어레이의 제조 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함하는 것인 어레이의 제조 방법:
    (a) 다수의 표면 프로브를 어레이 기판에 직접 또는 간접적으로 고정시키는 단계, 이때 표면 프로브는 다음:
    (i) 포획 도메인 올리고뉴클레오티드의 부분에 혼성화할 수 있는 도메인 (부분은 핵산 포획에 포함되지 않는다);
    (ii) 상보적인 위치 도메인; 및
    (iii) 상보적인 보편적 도메인을 포함하고;
    (b) 어레이 위에 고정된 표면 프로브에 포획 도메인 올리고뉴클레오티드와 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키는 단계;
    (c) 보편적 도메인 올리고뉴클레오티드를 주형이 있는 중합반응에 의해 연장시켜서 포획 도메인의 위치 도메인을 생성시키는 단계; 및
    (d) 위치 도메인을 포획 도메인 올리고뉴클레오티드에 결찰시켜서 포획 올리고뉴클레오티드를 생성시키는 단계.
  45. 조직 샘플 중의 핵산을 국지적으로 검출하는 데 사용하기 위한 어레이로서,
    상기 어레이는 기판 위에서 여러 종류의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종류의 포획 프로브가 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 연장 또는 결찰 반응 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하고, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자를 포함하고:
    (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
    (ii) 상기 어레이와 접촉하는 조직 샘플의 핵산을 포획하기 위한 포획 도메인으로서:
    (a) mRNA의 선택적 포획을 위해 고안된 도메인;
    (b) 무작위 또는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열; 또는
    (c) 유전자 그룹에 상보적인 서열을 포함하며,
    상기 여러 종류의 포획 프로브는 같은 포획 도메인을 포함하는 기판 위에 고정되어 있는 것인 어레이.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 mRNA 의 선택적 포획을 위해 고안된 포획 도메인은 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화하는 것인 어레이.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 mRNA 의 선택적 포획을 위해 고안된 포획 도메인은 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 어레이.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 폴리-T DNA 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개의 데옥시티미딘 잔기를 포함하는 것인 어레이.
  49. 제1항에 있어서, 상기 방법이 다음의 단계들을 포함하는, 조직 샘플 중의 DNA를 국지적으로 검출하기 위한 방법인 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (a) 기판 위에서 여러 종류의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종류의 포획 프로브가 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
    (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
    (ii) 포획 도메인을 포함하며;
    (b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치가 조직 샘플의 위치와 연관될 수 있도록 하고, 조직 샘플로부터 DNA가 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
    (c) 상기 조직 샘플 중의 DNA를 단편화하는 단계, 이때 상기 단편화는 단계 (b)에서 어레이를 조직 샘플과 접촉시키기 전에, 중에 또는 후에 수행되고;
    (d) 상기 프라이머 연장 반응의 포획 프로브를 포획된 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 연장시켜서 연장된 DNA 분자를 생성하거나, 또는 포획된 DNA 단편을 결찰 반응 중의 포획 프로브에 결찰시켜서 결찰된 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되며;
    (e) 태그가 달린 DNA 분자의 최소한 일부분을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하고; 및
    (f) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
  50. 제49항에 있어서, 상기 방법이 다음의 단계들을 포함하는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법:
    (a) 기판 위에서 여러 종류의 포획 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정되어 각 종류의 포획 프로브가 어레이 상에서 뚜렷한 위치를 차지하고 그 프로브가 프라이머 연장 또는 결찰 반응을 위한 프라이머로서 기능할 수 있게 하기 위해 유리 3'을 가지도록 배향되는 기판을 포함하는 어레이를 제공하는 단계, 이때 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 다음의 핵산 분자:
    (i) 어레이 상의 포획 프로브의 위치에 상응하는 위치 도메인, 및
    (ii) 포획 도메인을 포함하며;
    (b) 상기 어레이를 조직 샘플과 접촉시켜서 어레이 상의 포획 프로브의 위치를 조직 샘플의 위치와 연관시키는 단계;
    (c) 상기 조직 샘플 중의 DNA를 단편화하는 단계, 이때 상기 단편화는 단계 (b)에서 어레이를 조직 샘플과 접촉시키기 전에, 중에 또는 후에 수행되고;
    (d) 상기 DNA 단편에 상기 포획 도메인에 혼성화할 수 있는 결합 도메인을 제공하는 단계;
    (e) 상기 DNA 단편을 상기 포획 프로브의 포획 도메인에 혼성화하도록 허용하는 단계;
    (f) 상기 프라이머 연장 반응 중의 포획 프로브를 포획된 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 연장시켜서 연장된 DNA 분자를 생성하거나, 또는 포획된 DNA 단편을 결찰 반응 중의 포획 프로브에 결찰시켜서 결찰된 DNA 분자를 생성시키는 단계, 이때 상기 연장되거나 결찰된 DNA 분자는 위치 도메인에 의해 태그되며;
    (g) 태그가 달린 DNA 분자의 최소한 일부분을 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계, 이때 상기 부분은 위치 도메인 또는 그것의 상보물을 포함하고; 및
    (h) 방출된 DNA 분자의 서열을 직접 또는 간접적으로 분석하는 단계.
  51. 제1항에 있어서, 상기 어레이 기판은 서열화 플랫폼으로 사용하기 위해 적합한 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 어레이 기판은 차세대 서열화 기술에 사용하기 위해 적합한 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  53. 제1항에 있어서, 상기 포획 프로브는 브리지 증폭에 의해 상기 어레이 위에 고정되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  54. 제1항에 있어서, 상기 각 종류의 포획 프로브는 각 종류의 포획 프로브가 상기 어레이 기판 위에서 뚜렷한 위치를 차지하도록 포획 프로브의 국소적인 클론성 콜로니를 형성하기 위한 브리지 증폭에 의해 상기 어레이 기판 위에 고정되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  55. 제1항에 있어서, 상기 어레이는 비드 어레이인 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 각 종류의 포획 프로브는 각 종류의 포획 프로브가 상기 어레이 기판 위에서 뚜렷한 위치를 차지하도록 상이한 비드 위에 고정되는 것인 핵산의 국지화된 검출 방법.
  57. 제45항에 있어서, 상기 어레이 기판은 서열화 플랫폼으로 사용하기 위해 적합한 것인 어레이.
  58. 제57항에 있어서, 상기 어레이 기판은 차세대 서열화 기술에 사용하기 위해 적합한 것인 어레이.
  59. 제45항에 있어서, 상기 포획 프로브는 브릿지 증폭에 의해 상기 어레이 위에 고정되는 것인 어레이.
  60. 제45항에 있어서, 상기 각 종류의 포획 프로브는 각 종류의 포획 프로브가 상기 어레이 기판 위에서 뚜렷한 위치를 차지하도록 포획 프로브의 국소적인 클론성 콜로니를 형성하기 위한 브리지 증폭에 의해 상기 어레이 기판 위에 고정되는 것인 어레이.
  61. 제45항에 있어서, 상기 어레이는 비드 어레이인 것인 어레이.
  62. 제61항에 있어서, 상기 각 종류의 포획 프로브는 각 종류의 포획 프로브가 상기 어레이 기판 위에서 뚜렷한 위치를 차지하도록 상이한 비드 위에 고정되는 것인 어레이.
KR1020137029925A 2011-04-13 2012-04-13 조직 샘플 중의 핵산의 국지적 또는 공간적 검출을 위한 방법 및 그 방법의 생성물 KR101994494B1 (ko)

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Families Citing this family (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
KR101866401B1 (ko) 2010-04-05 2018-06-11 프로그노시스 바이오사이언스, 인코포레이티드 공간적으로 엔코딩된 생물학적 검정
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US10227639B2 (en) 2011-12-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
EP2820174B1 (en) 2012-02-27 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
EP2647426A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
JP5997278B2 (ja) * 2012-07-30 2016-09-28 株式会社日立製作所 タグ配列付き２次元ｃＤＮＡライブラリーデバイス、並びにこれを用いた遺伝子発現解析方法及び遺伝子発現解析装置
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014060483A1 (en) * 2012-10-17 2014-04-24 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
ES2703764T3 (es) 2012-12-14 2019-03-12 Chronix Biomedical Biomarcadores personalizados para el cáncer
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2997037B1 (en) 2013-05-14 2018-11-21 Genomics USA, Inc. Use of a composition for entrapping a protein on a surface
US9868979B2 (en) 2013-06-25 2018-01-16 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
CN105339509A (zh) * 2013-06-29 2016-02-17 弗门尼舍有限公司 鉴定、分离并使用气味和芳香受体的方法
EP3842542A1 (en) 2013-08-28 2021-06-30 Becton, Dickinson and Company Massively parallel single cell analysis
JP2017504307A (ja) 2013-10-07 2017-02-09 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム
EP3058091B1 (en) 2013-10-18 2020-03-25 The Broad Institute, Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
CN107002117B (zh) 2013-12-05 2021-12-10 生捷科技控股公司 核酸测序方法
US10391467B2 (en) * 2013-12-05 2019-08-27 Centrillion Technology Holdings Corporation Fabrication of patterned arrays
EP3077430A4 (en) 2013-12-05 2017-08-16 Centrillion Technology Holdings Corporation Modified surfaces
EP2883963A1 (en) * 2013-12-16 2015-06-17 Alacris Theranostics GmbH Method for generating of oligonucleotide arrays using in situ block synthesis approach
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
CN106164658B (zh) 2014-02-10 2020-06-09 泰克年研究发展基金会公司 用于细胞分离、生长、复制、操作和分析的方法和装置
US11060139B2 (en) 2014-03-28 2021-07-13 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for sequencing nucleic acids
EP3143139B1 (en) * 2014-05-14 2021-12-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Synthesis of double-stranded nucleic acids
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
GB201411624D0 (en) * 2014-06-30 2014-08-13 Ge Healthcare Uk Ltd Spatial molecular profiling of solid biological masses and profile storage
KR101634553B1 (ko) * 2014-08-06 2016-06-30 가천대학교 산학협력단 통합형 pc 마이크로 디바이스, 그 제조방법 및 이를 이용한 연속적 dna 정제-증폭 방법
WO2016037142A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Zhi Zheng Methods of detecting nucleic acids and applications thereof
US9897791B2 (en) 2014-10-16 2018-02-20 Illumina, Inc. Optical scanning systems for in situ genetic analysis
EP3227684B1 (en) 2014-12-03 2019-10-02 Isoplexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
KR102321863B1 (ko) 2015-01-12 2021-11-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
GB201501907D0 (en) * 2015-02-05 2015-03-25 Technion Res & Dev Foundation System and method for single cell genetic analysis
CN107250379B (zh) 2015-02-19 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 结合蛋白质组信息和基因组信息的高通量单细胞分析
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107532219B (zh) * 2015-03-25 2023-05-02 安戈欧洲有限公司 使用链置换聚合酶的固相靶核酸捕获和复制
WO2016160844A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
JP6395925B2 (ja) 2015-04-09 2018-09-26 株式会社日立製作所 遺伝子解析システム
ES2955916T3 (es) 2015-04-10 2023-12-11 Spatial Transcriptomics Ab Análisis múltiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
WO2016166128A1 (en) * 2015-04-14 2016-10-20 Koninklijke Philips N.V. Spatial mapping of molecular profiles of biological tissue samples
CN107636169A (zh) * 2015-04-17 2018-01-26 生捷科技控股公司 对生物分子进行空间概况分析的方法
EP3286326A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
EP3325650B1 (en) 2015-07-17 2024-01-03 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
WO2017019456A2 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 Illumina, Inc. Spatial mapping of nucleic acid sequence information
CN108026524A (zh) 2015-09-11 2018-05-11 赛卢拉研究公司 用于核酸文库标准化的方法和组合物
WO2017075293A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for encoding cellular spatial position information
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
CN105505755A (zh) * 2015-12-23 2016-04-20 杭州谷禾信息技术有限公司 空间转录组建库测序方法及所用装置
US11542498B2 (en) * 2015-12-28 2023-01-03 Pathogendx, Inc. Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof
AU2017257624B2 (en) 2016-04-25 2023-05-25 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
CN109072288A (zh) 2016-05-02 2018-12-21 赛卢拉研究公司 精确的分子条形编码
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
EP3472359B1 (en) 2016-06-21 2022-03-16 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
EP3507364A4 (en) * 2016-08-31 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION
EP3507385A4 (en) 2016-08-31 2020-04-29 President and Fellows of Harvard College METHODS OF COMBINING THE DETECTION OF BIOMOLECULES IN A SINGLE ASSAY USING IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING
SG11201901733PA (en) 2016-09-26 2019-04-29 Cellular Res Inc Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP3526348A4 (en) * 2016-10-17 2020-06-24 Lociomics Corporation HIGH RESOLUTION GENOME SPATIAL ANALYSIS OF TISSUE AND CELL AGGREGATES
EP3538672A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Cellular Research, Inc. Methods for cell label classification
JP7232180B2 (ja) 2016-11-08 2023-03-02 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 発現プロファイル分類の方法
JP7348066B2 (ja) 2016-11-11 2023-09-20 アイソプレキシス コーポレイション 単一細胞のゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームの同時解析のための組成物および方法
GB201619458D0 (en) * 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
WO2018098372A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
WO2018102064A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Microsoft Technology Licensing, Llc. Dna random access storage system via ligation
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018132610A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
RU2665631C2 (ru) * 2017-01-25 2018-09-03 Общество с ограниченной ответственностью "Секвойя Дженетикс" Способ специфической идентификации последовательностей днк
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
EP3577232A1 (en) 2017-02-01 2019-12-11 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
WO2018217862A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Centrillion Technologies, Inc. Methods for performing spatial profiling of biological molecules
AU2018281745B2 (en) 2017-06-05 2022-05-19 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
CA3078158A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Cartana Ab Rna templated ligation
WO2019084165A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN111492068A (zh) 2017-12-19 2020-08-04 贝克顿迪金森公司 与寡核苷酸相关联的颗粒
KR102653725B1 (ko) * 2018-01-29 2024-04-01 세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈, 인코포레이티드 핵산 증폭을 위한 방법
WO2019157445A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Nanostring Technologies, Inc. Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
ES2945191T3 (es) 2018-05-03 2023-06-29 Becton Dickinson Co Análisis de muestras multiómicas de alto rendimiento
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CA3100565A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Microbix Biosystems Inc. Quality control compositions and whole organism control materials for use in nucleic acid testing
KR102103719B1 (ko) * 2018-05-18 2020-04-23 주식회사 바이나리 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 분석 방법
US20210198722A1 (en) * 2018-05-21 2021-07-01 The Regents Of The University Of California Single Cell Mapping and Transcriptome Analysis
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
EP3824098A1 (en) 2018-07-18 2021-05-26 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Method for analyzing cell sample heterogeneity
US20210317528A1 (en) * 2018-07-23 2021-10-14 Genomics Usa, Inc. Blood typing using dna
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
CN109136372A (zh) * 2018-08-08 2019-01-04 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种基于illumina平台的乳腺癌分型检测建库试剂盒
CN109097467A (zh) * 2018-08-08 2018-12-28 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用
EP3844307A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
EP3844308A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
CN112805389A (zh) 2018-10-01 2021-05-14 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
WO2020076979A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Surface capture of targets
CA3113270A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
WO2020097315A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Cellular Research, Inc. Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN109576357A (zh) * 2018-11-20 2019-04-05 上海欧易生物医学科技有限公司 一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法
WO2020117914A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 Roche Sequencing Solutions, Inc. Spatially oriented quantum barcoding of cellular targets
US20230242976A1 (en) * 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
WO2020123301A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
EP3894593A2 (en) 2018-12-13 2021-10-20 DNA Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
GB201820341D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
KR20210107618A (ko) 2018-12-21 2021-09-01 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레아제 기반 rna 고갈
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN109762728A (zh) * 2019-01-07 2019-05-17 东南大学 一种空间转录组检测芯片及方法
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US20220119871A1 (en) * 2019-01-28 2022-04-21 The Broad Institute, Inc. In-situ spatial transcriptomics
WO2020168013A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
US20230159995A1 (en) * 2019-02-28 2023-05-25 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
EP3938537A1 (en) * 2019-03-11 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
EP3887542A1 (en) 2019-03-22 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
EP3947727A4 (en) * 2019-04-05 2023-01-04 Board of Regents, The University of Texas System METHODS AND APPLICATIONS OF CELL BARCODING
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2020228788A1 (zh) * 2019-05-15 2020-11-19 深圳华大生命科学研究院 用于检测核酸空间信息的阵列及检测方法
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CA3139791A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Method of detecting target nucleic acid molecules
US11739316B2 (en) 2019-06-21 2023-08-29 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Oligonucleotide-tethered nucleotides
EP4004231A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 Becton, Dickinson and Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021016379A1 (en) * 2019-07-23 2021-01-28 University Of Washington Method for spatially barcoding cells in tissue slices
WO2021066465A1 (ko) * 2019-10-01 2021-04-08 (주)컨투어젠 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법
CN114761992B (zh) 2019-10-01 2023-08-08 10X基因组学有限公司 用于识别组织样品中的形态学模式的系统和方法
CN110804654A (zh) * 2019-10-30 2020-02-18 东南大学 一种空间转录组测序方法
US20210130881A1 (en) 2019-11-06 2021-05-06 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
AU2020388047A1 (en) 2019-11-18 2022-06-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for tissue classification
US20210155982A1 (en) 2019-11-21 2021-05-27 10X Genomics, Inc. Pipeline for spatial analysis of analytes
EP4062372B1 (en) 2019-11-22 2024-05-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
EP4073241A2 (en) 2019-12-11 2022-10-19 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants
SG11202106899SA (en) * 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
CN115715329A (zh) 2020-01-10 2023-02-24 10X基因组学有限公司 确定生物样品中靶核酸位置的方法
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
JP2023512781A (ja) * 2020-02-12 2023-03-29 ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイション 細胞内バーコード化および空間的バーコード化のための方法
WO2021168278A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
EP4107282A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
CN115698324A (zh) 2020-02-21 2023-02-03 10X基因组学有限公司 用于整合原位空间测定的方法和组合物
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US20210277460A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-09 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial transcriptomics with sequencing readout
KR102482668B1 (ko) * 2020-03-10 2022-12-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 고유 분자 식별자의 표지 정확도를 증진하는 방법
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
CN115803454A (zh) 2020-05-04 2023-03-14 10X基因组学有限公司 空间转录组学转移模式
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
EP4153984A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
WO2021237056A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US20230279474A1 (en) 2020-06-10 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20230313255A1 (en) 2020-07-15 2023-10-05 Dna Script Massively Parallel Enzymatic Synthesis of Polynucleotides
WO2022015913A1 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Materials and methods for localized detection of nucleic acids in a tissue sample
US20230287475A1 (en) 2020-07-31 2023-09-14 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
EP4121557A4 (en) 2020-08-06 2024-05-01 Singular Genomics Systems Inc SPATIAL SEQUENCING
WO2022032194A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for in situ transcriptomics and proteomics
WO2022047198A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Applied Materials, Inc. Methods of mfish using alignment beads
WO2022056385A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and systems for multidimensional imaging
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
EP4214333A1 (en) 2020-09-16 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Methods of determining the location of an analyte in a biological sample using a plurality of wells
EP4213993A2 (en) 2020-09-18 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
US20230351619A1 (en) 2020-09-18 2023-11-02 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022081643A2 (en) 2020-10-13 2022-04-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating recombinant antigen binding molecules from single cells
US20240018572A1 (en) 2020-10-22 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
CN116829733A (zh) * 2020-11-06 2023-09-29 10X基因组学有限公司 用于将分析物结合至捕获探针的组合物和方法
EP4247978A1 (en) 2020-11-18 2023-09-27 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
US20220186300A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022140291A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Singular Genomics Systems, Inc. Systems and methods for multicolor imaging
US20240076723A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
AU2022209365A1 (en) * 2021-01-21 2023-07-20 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
AU2022212231A1 (en) 2021-01-29 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2022216688A1 (en) 2021-04-05 2022-10-13 10X Genomics, Inc. Recombinant ligase composition and uses thereof
EP4305196A1 (en) 2021-04-14 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
WO2022232571A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Fusion rt variants for improved performance
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
WO2022243303A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Method and system for 3d reconstruction of tissue gene expression data
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
US20220403462A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method of spatial sequencing of genes from tissue using padlocks with gaps on substrate
WO2022271820A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 10X Genomics, Inc. Spatial detection of sars-cov-2 using templated ligation
EP4352252A1 (en) 2021-07-13 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
CN113604547B (zh) * 2021-08-06 2023-05-02 吉林大学 一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023044071A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for image registration or alignment
EP4155416B1 (en) 2021-09-23 2024-01-10 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for obtaining spatial and sequencing information of m-rna from tissue
CN113930847A (zh) * 2021-09-26 2022-01-14 东南大学 一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用
CN113782103A (zh) * 2021-10-26 2021-12-10 大连大学 一种基于组合式酶切机制的dna矩阵处理方法
WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
WO2023086824A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods for identification of antigen-binding molecules
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
US20230167495A1 (en) 2021-11-30 2023-06-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for identifying regions of aneuploidy in a tissue
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023122033A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
WO2023122746A2 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The General Hospital Corporation Compositions and methods for end to end capture of messenger rnas
WO2023115536A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023116373A1 (zh) * 2021-12-24 2023-06-29 深圳华大生命科学研究院 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
WO2023150171A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from glioblastoma samples
WO2023150098A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, kits, compositions, and systems for spatial analysis
WO2023150163A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing analytes from lymphatic tissue
US20230306593A1 (en) 2022-02-15 2023-09-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment
WO2023172670A2 (en) 2022-03-11 2023-09-14 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and fluid delivery methods
CN114369650B (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 深圳市仙湖植物园(深圳市园林研究中心) 捕获探针的设计方法、捕获探针及其应用
WO2023201235A2 (en) 2022-04-12 2023-10-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating and characterizing recombinant antigen binding molecules
WO2023215552A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Molecular barcode readers for analyte detection
WO2023215612A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023225519A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Modified transposons, compositions and uses thereof
WO2023229988A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Tissue sample mold
WO2023229982A2 (en) 2022-05-24 2023-11-30 10X Genomics, Inc. Porous structure confinement for convection suppression
WO2023250077A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2024006830A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for patterned molecular array generation by directed bead delivery
US20240026444A1 (en) 2022-06-29 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating molecular arrays using oligonucleotide printing and photolithography
US20240076721A1 (en) 2022-06-29 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Method of generating arrays using microfluidics and photolithography
WO2024006799A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Covalent attachment of splint oligonucleotides for molecular array generation using ligation
WO2024006798A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. High definition molecular array feature generation using photoresist
US20240060127A1 (en) 2022-06-29 2024-02-22 10X Genomics, Inc. Methods and systems for light-controlled surface patterning using photomasks
WO2024006797A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for refining feature boundaries in molecular arrays
US20240002932A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Click chemistry-based dna photo-ligation for manufacturing of high-resolution dna arrays
US20240076722A1 (en) 2022-06-29 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for oligonucleotide inversion on arrays
WO2024015862A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for characterization of antigen-binding molecules from biological samples
WO2024015578A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
WO2024031068A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for immunofluorescence quantification
WO2024036191A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for colocalization
WO2024035844A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Methods for reducing capture of analytes
WO2024044703A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for antigenic epitope mapping in biological samples
WO2024081212A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 10X Genomics, Inc. In vitro transcription of spatially captured nucleic acids
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples
WO2024086167A2 (en) 2022-10-17 2024-04-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090415A2 (en) 2000-05-20 2001-11-29 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a dna library using positional amplification

Family Cites Families (816)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US468319A (en) 1892-02-09 Reuben m
US4683A (en) 1846-08-08 waring and richard e
US4514388A (en) 1983-03-22 1985-04-30 Psaledakis Nicholas G Proteolytic enzymes in the zymogen form to treat sarcoma cells
US4574729A (en) 1984-08-06 1986-03-11 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Chamber block for a cytocentrifuge having centrifugal force responsive supernatant withdrawal means
US5061049A (en) 1984-08-31 1991-10-29 Texas Instruments Incorporated Spatial light modulator and method
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4883867A (en) 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4968601A (en) 1988-02-09 1990-11-06 The United States Of America As Represented By The Dept. Of Health & Human Services Method for diagnosing latent viral infection
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5002882A (en) 1989-04-27 1991-03-26 New England Biolabs, Inc. Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase
RU2145635C1 (ru) 1989-05-18 2000-02-20 Чирон Корпорейшн Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5559032A (en) 1990-06-29 1996-09-24 Pomeroy; Patrick C. Method and apparatus for post-transfer assaying of material on solid support
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5183053A (en) 1991-04-12 1993-02-02 Acuderm, Inc. Elliptical biopsy punch
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US6759226B1 (en) 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
EP0605655B1 (en) 1991-09-16 1997-05-07 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes
US5321130A (en) 1992-02-10 1994-06-14 Molecular Probes, Inc. Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain
US5308751A (en) 1992-03-23 1994-05-03 General Atomics Method for sequencing double-stranded DNA
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5410030A (en) 1993-04-05 1995-04-25 Molecular Probes, Inc. Dimers of unsymmetrical cyanine dyes containing pyridinium moieties
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
AU7516694A (en) 1993-07-30 1995-02-28 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US5610287A (en) 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
KR100230718B1 (ko) 1994-03-16 1999-11-15 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프 등온 가닥 변위 핵산 증폭법
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
EP0777749B1 (en) 1994-08-19 2002-10-30 PE Corporation (NY) Coupled amplification and ligation method
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
KR960022566A (ko) 1994-12-30 1996-07-18 김충환 신규한 아미노올리고당 유도체 및 그의 제조방법
US5736351A (en) 1995-01-09 1998-04-07 New Horizons Diagnostics Corporation Method for detection of contaminants
US5959098A (en) * 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5928928A (en) 1995-06-07 1999-07-27 Universiteit Van Amsterdam Human chitinase, its recombinant production, its use for decomposing chitin, its use in therapy or prophylaxis against infection diseases
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
EP0861321B1 (en) 1995-10-13 2006-05-31 President And Fellows Of Harvard College Phosphopantetheinyl transferases and uses thereof
US5716825A (en) 1995-11-01 1998-02-10 Hewlett Packard Company Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS
US5763175A (en) * 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6300063B1 (en) 1995-11-29 2001-10-09 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5962271A (en) * 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6913881B1 (en) 1996-01-24 2005-07-05 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting target sequences
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US6875572B2 (en) 1996-01-24 2005-04-05 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection assays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
CA2244891C (en) 1996-02-09 2008-12-30 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
EP2369007B1 (en) 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US20050003431A1 (en) 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US6221654B1 (en) 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
DE19639673A1 (de) 1996-09-27 1998-04-09 Daimler Benz Ag In einem Kraftfahrzeug im Bereich der Frontscheibe angeordnetes Display
US6083761A (en) 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US5837466A (en) 1996-12-16 1998-11-17 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP2319855B1 (en) 1997-01-08 2016-04-06 Sigma-Aldrich Co. LLC Bioconjugation of Macromolecules
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
DE69835143T2 (de) 1997-01-21 2007-06-06 The General Hospital Corp., Boston Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US8207093B2 (en) 1997-01-21 2012-06-26 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US5837860A (en) 1997-03-05 1998-11-17 Molecular Tool, Inc. Covalent attachment of nucleic acid molecules onto solid-phases via disulfide bonds
US6023540A (en) 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
CN1257551A (zh) 1997-03-21 2000-06-21 格雷格·弗思 Vntr等位基因的提取与利用
JP2001517948A (ja) 1997-04-01 2001-10-09 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸配列決定法
EP1591541B1 (en) 1997-04-01 2012-02-15 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US5919626A (en) 1997-06-06 1999-07-06 Orchid Bio Computer, Inc. Attachment of unmodified nucleic acids to silanized solid phase surfaces
US5958775A (en) 1997-07-25 1999-09-28 Thomas Jefferson University Composition and method for targeted integration into cells
EP1012335A4 (en) 1997-08-15 2004-06-09 Hyseq Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OR QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID SPECIES
GB9718455D0 (en) 1997-09-02 1997-11-05 Mcgregor Duncan P Chimeric binding peptide library screening method
EP1028970A1 (en) * 1997-10-10 2000-08-23 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US7456012B2 (en) 1997-11-06 2008-11-25 Cellectricon Ab Method and apparatus for spatially confined electroporation
US6054274A (en) 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
AU2003200718B2 (en) 1997-12-15 2006-10-19 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic biochip
US6844158B1 (en) 1997-12-22 2005-01-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
DE69839572D1 (de) 1997-12-22 2008-07-10 Hitachi Chemical Co Ltd Reinigung von mRNA auf Mikroplatten
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
ES2656439T3 (es) 1998-02-23 2018-02-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Aparato para síntesis de matrices de sondas de ADN
US6699710B1 (en) 1998-02-25 2004-03-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling
ATE347102T1 (de) 1998-02-25 2006-12-15 Us Health Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung
CA2318984C (en) 1998-02-25 2009-04-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling
WO1999053102A1 (en) * 1998-04-16 1999-10-21 Packard Bioscience Company Analysis of polynucleotide sequence
US6906245B1 (en) 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
US6358475B1 (en) 1998-05-27 2002-03-19 Becton, Dickinson And Company Device for preparing thin liquid for microscopic analysis
WO1999063385A1 (en) 1998-06-04 1999-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Digital optical chemistry micromirror imager
JP2000010058A (ja) 1998-06-18 2000-01-14 Hamamatsu Photonics Kk 空間光変調装置
EP2360271A1 (en) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
WO2000000637A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Visible Genetics Inc. Method for sequencing nucleic acids with reduced errors
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20040106110A1 (en) 1998-07-30 2004-06-03 Solexa, Ltd. Preparation of polynucleotide arrays
US6673541B1 (en) 1998-09-18 2004-01-06 Micromet Ag DNA amplification of a single cell
US6159736A (en) 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
US6337472B1 (en) 1998-10-19 2002-01-08 The University Of Texas System Board Of Regents Light imaging microscope having spatially resolved images
JP5213202B2 (ja) 1998-10-28 2013-06-19 バイシス・インコーポレーテツド 細胞アレイならびに遺伝障害マーカーの検出および使用方法
US6391937B1 (en) 1998-11-25 2002-05-21 Motorola, Inc. Polyacrylamide hydrogels and hydrogel arrays made from polyacrylamide reactive prepolymers
WO2000032823A1 (en) 1998-12-02 2000-06-08 Phylos, Inc. Dna-protein fusions and uses thereof
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2000036152A1 (en) 1998-12-14 2000-06-22 Li-Cor, Inc. A system and methods for nucleic acid sequencing of single molecules by polymerase synthesis
US6830884B1 (en) 1998-12-15 2004-12-14 Molecular Staging Inc. Method of amplification
DE60042775D1 (de) 1999-01-06 2009-10-01 Callida Genomics Inc Verbesserte sequenzierung mittels hybridisierung durch verwendung von sondengemischen
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
EP1024201B1 (en) 1999-01-27 2003-11-26 Commissariat A L'energie Atomique Microassay for serial analysis of gene expression and applications thereof
US6157432A (en) 1999-01-29 2000-12-05 Hewlett-Packard Company Heated ferroelectric liquid crystal spatial light modulator with improved contrast, improved grayscale resolution, and decreased pixel sticking when operated in a non-DC balanced mode
US20020150909A1 (en) 1999-02-09 2002-10-17 Stuelpnagel John R. Automated information processing in randomly ordered arrays
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6153389A (en) 1999-02-22 2000-11-28 Haarer; Brian K. DNA additives as a mechanism for unambiguously marking biological samples
US6673620B1 (en) 1999-04-20 2004-01-06 Cytologix Corporation Fluid exchange in a chamber on a microscope slide
WO2000063437A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20050191698A1 (en) 1999-04-20 2005-09-01 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6534266B1 (en) 1999-04-22 2003-03-18 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Assay of transcription sites by multi-fluor fish
US7276336B1 (en) 1999-07-22 2007-10-02 Agilent Technologies, Inc. Methods of fabricating an addressable array of biopolymer probes
US20010055764A1 (en) 1999-05-07 2001-12-27 Empedocles Stephen A. Microarray methods utilizing semiconductor nanocrystals
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
CA2374390A1 (en) 1999-05-20 2000-12-14 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6136592A (en) 1999-06-25 2000-10-24 Leighton; Stephen B. Multiple micro-arrays
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
ATE409236T1 (de) 1999-07-14 2008-10-15 Packard Bioscience Company Derivatisierte nukleinsäuren und deren verwendung
CA2375034C (en) * 1999-07-26 2012-01-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, The National Institutes Of Health Method and device for analysis of biological specimens
EP1198583A1 (en) 1999-08-02 2002-04-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutant tn5 transposase enzymes and method for their use
EP1206577B1 (en) 1999-08-13 2006-03-01 Yale University Binary encoded sequence tags
EP1218545B1 (en) * 1999-08-18 2012-01-25 Illumina, Inc. Methods for preparing oligonucleotide solutions
US6942968B1 (en) 1999-08-30 2005-09-13 Illumina, Inc. Array compositions for improved signal detection
EP1218542B1 (en) 1999-09-13 2004-03-24 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
JP2003509060A (ja) 1999-09-17 2003-03-11 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 逆トランスフェクション方法
EP1218543A2 (en) 1999-09-29 2002-07-03 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
US6291180B1 (en) 1999-09-29 2001-09-18 American Registry Of Pathology Ultrasound-mediated high-speed biological reaction and tissue processing
CA2386540A1 (en) 1999-10-04 2001-04-12 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel carbamates and ureas
EP1235932A2 (en) 1999-10-08 2002-09-04 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
CA2386193A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Signature Bioscience, Inc. System and method for detecting and identifying molecular events in a test sample
US7585632B2 (en) 1999-10-29 2009-09-08 Hologic, Inc. Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6569674B1 (en) 1999-12-15 2003-05-27 Amersham Biosciences Ab Method and apparatus for performing biological reactions on a substrate surface
AU782452B2 (en) 1999-12-13 2005-07-28 Government of The United States of America, as represented by The Secretary Department of Health & Human Services, The National Institutes of Health, The High-throughput tissue microarray technology and applications
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US6485926B2 (en) 1999-12-22 2002-11-26 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for measuring protease activity
US6713298B2 (en) 2000-01-31 2004-03-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
EP1259643B1 (en) 2000-02-07 2008-10-15 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
CA2401962A1 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US20010026919A1 (en) 2000-02-08 2001-10-04 Alex Chenchik Nucleic acid assays employing universal arrays
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP1198596A1 (en) 2000-02-15 2002-04-24 Lynx Therapeutics, Inc. Data analysis and display system for ligation-based dna sequencing
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
JP2001284267A (ja) 2000-04-03 2001-10-12 Canon Inc 排気処理方法、プラズマ処理方法及びプラズマ処理装置
US20020045194A1 (en) 2000-04-10 2002-04-18 Cravatt Benjamin F. Proteomic analysis
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6291187B1 (en) 2000-05-12 2001-09-18 Molecular Staging, Inc. Poly-primed amplification of nucleic acid sequences
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
WO2001098765A1 (en) 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
US8278034B2 (en) 2000-06-22 2012-10-02 Nuclea Biotechnologies, Inc. Methods of making frozen tissue microarrays
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences
CN101525660A (zh) 2000-07-07 2009-09-09 维西根生物技术公司 实时序列测定
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
AU2001280796A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Electrowetting-driven micropumping
US7613571B2 (en) 2000-07-28 2009-11-03 Doyle Michael D Method and system for the multidimensional morphological reconstruction of genome expression activity
DE60120713T2 (de) 2000-08-15 2007-06-06 Discerna Ltd. Funktionelles protein array
HU229489B1 (hu) 2000-08-21 2014-01-28 Apitope Technology Bristol Ltd Tolerogén peptidek
US6713257B2 (en) 2000-08-25 2004-03-30 Rosetta Inpharmatics Llc Gene discovery using microarrays
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US6942970B2 (en) 2000-09-14 2005-09-13 Zymed Laboratories, Inc. Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment
US20020168639A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-14 Muraca Patrick J. Profile array substrates
WO2002027029A2 (en) 2000-09-27 2002-04-04 Lynx Therapeutics, Inc. Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences
AT411066B (de) 2000-10-24 2003-09-25 Steiner Georg E Verfahren und anordnung zur untersuchung von zellen
US20020164611A1 (en) 2000-11-15 2002-11-07 Bamdad R. Shoshana Oligonucleotide identifiers
EP1343973B2 (en) 2000-11-16 2020-09-16 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US20030215936A1 (en) 2000-12-13 2003-11-20 Olli Kallioniemi High-throughput tissue microarray technology and applications
US20030017451A1 (en) 2000-12-21 2003-01-23 Hui Wang Methods for detecting transcripts
JP4061043B2 (ja) 2000-12-28 2008-03-12 株式会社ポストゲノム研究所 ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法
US7135296B2 (en) 2000-12-28 2006-11-14 Mds Inc. Elemental analysis of tagged biologically active materials
WO2002059601A1 (en) 2001-01-23 2002-08-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
EP1356117A2 (en) 2001-01-25 2003-10-29 TM Bioscience Corporation Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
US20030087232A1 (en) 2001-01-25 2003-05-08 Fred Christians Methods for screening polypeptides
KR20020063359A (ko) * 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치
WO2002094867A2 (fr) 2001-02-07 2002-11-28 Institut Pasteur Sequence du genome de photorhabdus luminescens souche tto1 et utilisations
US6573051B2 (en) 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
EP1368497A4 (en) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHOD AND DEVICE FOR ANALYZING POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION
AU785425B2 (en) 2001-03-30 2007-05-17 Genetic Technologies Limited Methods of genomic analysis
EP1385999B1 (en) 2001-04-30 2012-12-12 Ventana Medical Systems, Inc. Reagents and methods for automated in situ or microarray hybridization
WO2003106973A2 (en) 2002-06-18 2003-12-24 Invitrogen Corporation Methods and apparatus for low resistance electrophoresis of prior-cast, hydratable separation media
WO2003002979A2 (en) * 2001-06-28 2003-01-09 Illumina, Inc. Multiplex decoding of array sensors with microspheres
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
WO2003008968A2 (en) 2001-07-19 2003-01-30 Signet Laboratories, Inc. Human tissue specific drug screening procedure
US20040091857A1 (en) 2001-07-20 2004-05-13 Nallur Girish N. Gene expression profiling
GB0118031D0 (en) 2001-07-24 2001-09-19 Oxford Glycosciences Uk Ltd Self assembled protein nucleic acid complexes and self assembled protein arrays
US7297778B2 (en) 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
DE60210014T2 (de) 2001-07-31 2006-09-21 Pfizer Products Inc., Groton Auf Zellen gegründetes Phosphodiesterase-10A-Assay und Sequenzen
US6696271B2 (en) * 2001-08-23 2004-02-24 The Regents Of The University Of California Frozen tissue microarray technology for analysis of RNA, DNA, and proteins
US7063946B2 (en) 2001-09-10 2006-06-20 Meso Scale Technologies, Llc. Methods, reagents, kits and apparatus for protein function analysis
US20060188875A1 (en) 2001-09-18 2006-08-24 Perlegen Sciences, Inc. Human genomic polymorphisms
US20040019005A1 (en) 2001-10-01 2004-01-29 Jeffrey Van Ness Methods for parallel measurement of genetic variations
US7195913B2 (en) 2001-10-05 2007-03-27 Surmodics, Inc. Randomly ordered arrays and methods of making and using
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US6942972B2 (en) 2001-10-24 2005-09-13 Beckman Coulter, Inc. Efficient synthesis of protein-oligonucleotide conjugates
US20030175947A1 (en) 2001-11-05 2003-09-18 Liu Robin Hui Enhanced mixing in microfluidic devices
JP2005514603A (ja) 2001-11-06 2005-05-19 アジリックス・コーポレイション 高感度コード化検出システム
JP2005535283A (ja) 2001-11-13 2005-11-24 ルビコン ゲノミクス インコーポレイテッド ランダムフラグメント化により生成されたｄｎａ分子を用いたｄｎａ増幅および配列決定
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
JP2005510347A (ja) 2001-11-26 2005-04-21 ケック グラデュエイト インスティテュート 化学、生化学、および生物学的アッセイ等のためにエレクトロウェッティングを介してマイクロ流体制御する方法、装置、および物
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7098041B2 (en) 2001-12-11 2006-08-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Methods to view and analyze the results from diffraction-based diagnostics
US20030153850A1 (en) 2002-01-16 2003-08-14 Davis Brian J. Method and apparatus for image-guided therapy
US7731909B1 (en) 2002-01-22 2010-06-08 Grace Bio-Labs, Inc. Reaction surface array diagnostic apparatus
AU2003215240A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
US20040002090A1 (en) 2002-03-05 2004-01-01 Pascal Mayer Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype
US20030170637A1 (en) 2002-03-06 2003-09-11 Pirrung Michael C. Method of analyzing mRNA splice variants
US7166441B2 (en) 2002-03-12 2007-01-23 Perseptive Biosystems Inc. Method and apparatus for the identification and quantification of biomolecules
US7223371B2 (en) 2002-03-14 2007-05-29 Micronics, Inc. Microfluidic channel network device
JP2005538695A (ja) 2002-04-15 2005-12-22 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 概日リズム障害を治療するためのスクリーニング法および治療法
WO2003089454A2 (en) 2002-04-19 2003-10-30 California Institute Of Technology Unnatural amino acid containing display libraries
SI2151250T1 (sl) 2002-05-06 2014-02-28 Endocyte, Inc. Z vitamini ciljana sredstva za slikanje
AU2003302463A1 (en) 2002-05-09 2004-06-18 U.S. Genomics, Inc. Methods for analyzing a nucleic acid
WO2003101972A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
WO2003102233A1 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Pamgene B.V. Novel high density arrays and methods for analyte analysis
US7108976B2 (en) 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
FR2841063B1 (fr) 2002-06-18 2004-09-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif de deplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces electrostatiques
US7223592B2 (en) 2002-06-21 2007-05-29 Agilent Technologies, Inc. Devices and methods for performing array based assays
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US7205128B2 (en) 2002-08-16 2007-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method for synthesis of the second strand of cDNA
US20050118616A1 (en) 2002-08-16 2005-06-02 Kawashima Tadashi R. Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction
EP3363809B1 (en) 2002-08-23 2020-04-08 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US20040038385A1 (en) 2002-08-26 2004-02-26 Langlois Richard G. System for autonomous monitoring of bioagents
US20070166725A1 (en) 2006-01-18 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Multiplexed diagnostic platform for point-of care pathogen detection
ES2402092T3 (es) 2002-09-11 2013-04-26 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Sistema automatizado para separaciones electroforéticas de alta capacidad de producción
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US7662594B2 (en) 2002-09-20 2010-02-16 New England Biolabs, Inc. Helicase-dependent amplification of RNA
CA2498764C (en) 2002-09-20 2015-11-10 New England Biolabs, Inc. Helicase dependent amplification of nucleic acids
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
CA2500283A1 (en) 2002-09-25 2004-04-08 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
US20040259105A1 (en) 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
CA2500715A1 (en) 2002-10-03 2004-04-15 Epimmune, Inc. Hla binding peptides and their uses
US20040067492A1 (en) 2002-10-04 2004-04-08 Allan Peng Reverse transcription on microarrays
AU2003291659A1 (en) 2002-10-31 2004-06-07 University Of Massachusetts Rapid cell block embedding method and apparatus
US7122384B2 (en) 2002-11-06 2006-10-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Resonant light scattering microparticle methods
MXPA05006158A (es) 2002-12-12 2005-08-26 Chiron Corp Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuantificacion del virus del nilo occidental.
US20040175822A1 (en) 2002-12-18 2004-09-09 West Virginia University Research Corporation Apparatus and method for edman degradation using a microfluidic system
KR20040062847A (ko) 2003-01-03 2004-07-09 삼성전자주식회사 핵산 어레이의 복제방법
US7547380B2 (en) 2003-01-13 2009-06-16 North Carolina State University Droplet transportation devices and methods having a fluid surface
WO2004070007A2 (en) 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Method for preparing single-stranded dna libraries
GB0302058D0 (en) 2003-01-29 2003-02-26 Univ Cranfield Replication of nucleic acid arrays
JP4691014B2 (ja) 2003-02-26 2011-06-01 カリダ ゲノミクス，インコーポレーテッド ハイブリダイゼーションによるランダムアレイｄｎａ分析
EP1604040B1 (en) 2003-03-07 2010-10-13 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
PT1601450E (pt) 2003-03-10 2013-09-06 Expression Pathology Inc Preparação líquida de tecido a partir de amostras biológicas, de tecidos e de células tratados histopatologicamente
FR2852317B1 (fr) 2003-03-13 2006-08-04 Biopuces a sondes et leurs methodes d'utilisation
WO2004093645A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Tn5 transposase mutants and the use thereof
CN1300333C (zh) 2003-04-17 2007-02-14 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用
US7267994B2 (en) 2003-04-28 2007-09-11 Regents Of The University Of California Element-coded affinity tags
US20040219588A1 (en) 2003-04-30 2004-11-04 Masaru Furuta Method for dispensing reagents onto biological samples and method for analyzing biological samples
WO2004104588A1 (en) 2003-05-23 2004-12-02 Epfl - Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Methods for protein labeling based on acyl carrier protein
EP1628753A1 (en) 2003-05-30 2006-03-01 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and spr detection
US20050026188A1 (en) 2003-05-30 2005-02-03 Van Kessel Andrew G. Methods of identifying, characterizing and comparing organism communities
US7255994B2 (en) 2003-06-10 2007-08-14 Applera Corporation Ligation assay
US20060216775A1 (en) 2003-06-17 2006-09-28 The Regents Of The University Of Califoenia Compositions and methods for analysis and manipulation of enzymes in biosynthetic proteomes
CA2528577C (en) 2003-06-20 2012-08-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20070128656A1 (en) 2003-06-26 2007-06-07 University Of South Florida Direct Fluorescent Label Incorporation Via 1st Strand cDNA Synthesis
MXPA05014215A (es) 2003-07-03 2006-03-13 Univ California Mapeo de genoma de elementos funcionales de adn y proteinas celulares.
US7627171B2 (en) 2003-07-03 2009-12-01 Videoiq, Inc. Methods and systems for detecting objects of interest in spatio-temporal signals
US8048627B2 (en) 2003-07-05 2011-11-01 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
EP1660858A4 (en) 2003-07-21 2007-10-24 Amplified Proteomics Inc MULTIPLEX analyte
US20050031176A1 (en) 2003-08-08 2005-02-10 Hertel Sarah R. Method and apparatus of multi-modality image fusion
AU2004265635A1 (en) 2003-08-08 2005-02-24 Thomas Jefferson University Method for rapid identification of alternative splicing
US20050037362A1 (en) 2003-08-11 2005-02-17 Eppendorf Array Technologies, S.A. Detection and quantification of siRNA on microarrays
US8808991B2 (en) 2003-09-02 2014-08-19 Keygene N.V. Ola-based methods for the detection of target nucleic avid sequences
US20050095627A1 (en) 2003-09-03 2005-05-05 The Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
EP1660674B1 (en) 2003-09-10 2010-03-17 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
WO2005026329A2 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for identifying target nucleic acid molecules
DE602004023960D1 (de) 2003-09-18 2009-12-17 Nuevolution As Methode zur Gewinnung struktureller Informationen kodierter Moleküle und zur Selektion von Verbindungen
US20050226780A1 (en) 2003-09-19 2005-10-13 Donald Sandell Manual seal applicator
US7541166B2 (en) 2003-09-19 2009-06-02 Microfluidic Systems, Inc. Sonication to selectively lyse different cell types
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
JP2007508552A (ja) 2003-10-10 2007-04-05 プロテイン・デイスカバリー・インコーポレーテツド マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ｍａｌｄｉ）質量分析法（ｍｓ）を包含する化学分析のための被検体の濃縮および精製のための方法および装置
WO2005047696A1 (en) 2003-11-17 2005-05-26 Koninklijke Philips Electronics N.V. System for manipulation of a body of fluid
WO2005051984A2 (en) 2003-11-21 2005-06-09 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing olfactory gpcrs
CN101208437B (zh) 2003-12-12 2012-07-04 圣路易斯大学 检测大分子和其它分析物的生物传感器
US7259258B2 (en) 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
US20050136414A1 (en) 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
US20050147976A1 (en) 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
US20070014810A1 (en) 2003-12-31 2007-01-18 Denise Baker Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
US7569392B2 (en) 2004-01-08 2009-08-04 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
WO2005067648A2 (en) 2004-01-08 2005-07-28 Vanderbilt University Multiplex spatial profiling of gene expression
US20080261204A1 (en) 2004-01-23 2008-10-23 Lingvitae As Polynucleotide Ligation Reactions
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
WO2005089508A2 (en) 2004-03-18 2005-09-29 Atom Sciences, Inc. Dna sequence detection by limited primer extension
FR2868638B1 (fr) 2004-03-30 2006-05-19 Sagem Procede d'echange d'informations entre deux reseaux fonctionnant sous des protocoles de routages differents
KR100624420B1 (ko) 2004-04-10 2006-09-19 삼성전자주식회사 마이크로어레이에 대한 정보가 스팟의 형태로 저장되어있는 마이크로어레이, 그를 제조하는 방법 및 그를이용하는 방법
US20050260653A1 (en) 2004-04-14 2005-11-24 Joshua Labaer Nucleic-acid programmable protein arrays
JP4592060B2 (ja) 2004-04-26 2010-12-01 キヤノン株式会社 Ｐｃｒ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するｐｃｒ増幅反応方法
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
US7618780B2 (en) 2004-05-20 2009-11-17 Trillion Genomics Limited Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry
JP4751650B2 (ja) 2004-06-11 2011-08-17 株式会社リコー 微小光学素子、この微小光学素子を用いた空間光変調装置及びプロジェクタ装置
US7906276B2 (en) 2004-06-30 2011-03-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Enzymatic detection techniques
FR2872715B1 (fr) 2004-07-08 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Microreacteur goutte
FR2872809B1 (fr) 2004-07-09 2006-09-15 Commissariat Energie Atomique Methode d'adressage d'electrodes
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
JP2006058031A (ja) 2004-08-17 2006-03-02 Hitachi High-Technologies Corp 化学分析装置
US7776547B2 (en) 2004-08-26 2010-08-17 Intel Corporation Cellular analysis using Raman surface scanning
US20060228758A1 (en) 2004-09-13 2006-10-12 Xencor, Inc. Analysis of MHC-peptide binding interactions
AU2005296200B2 (en) 2004-09-17 2011-07-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
EP1647600A3 (en) * 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
CN100396790C (zh) 2004-09-17 2008-06-25 北京大学 溶液识别、表面寻址蛋白质芯片及其制备和检测方法
US7524672B2 (en) 2004-09-22 2009-04-28 Sandia Corporation Microfluidic microarray systems and methods thereof
US8445413B2 (en) 2004-10-15 2013-05-21 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Linker for constructing mRNA-puromycin-protein conjugate
US7527970B2 (en) 2004-10-15 2009-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of identifying active chromatin domains
CA2850323A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
US7183119B2 (en) 2004-11-15 2007-02-27 Eastman Kodak Company Method for sensitive detection of multiple biological analytes
US7745143B2 (en) 2004-11-19 2010-06-29 Plexera, Llc Plasmon resonance biosensor and method
WO2006053571A2 (en) 2004-11-22 2006-05-26 Peter Birk Rasmussen Template directed split and mix systhesis of small molecule libraries
ITPD20040301A1 (it) 2004-11-26 2005-02-26 Dimensional Srl P Metodo ed apparato per la separazione simultanea di molecole biologiche mediante elettroforesi bidimensionale
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
US20060292586A1 (en) 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
JP2008526877A (ja) 2005-01-05 2008-07-24 エージェンコート パーソナル ジェノミクス 可逆的ヌクレオチドターミネーターおよびその使用
KR100682920B1 (ko) 2005-01-20 2007-02-15 삼성전자주식회사 다중 바이오어세이용 미세유체 칩 및 그 제조방법
WO2006081222A2 (en) 2005-01-25 2006-08-03 Compass Genetics, Llc. Isothermal dna amplification
US7458661B2 (en) 2005-01-25 2008-12-02 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for promoting the complete transfer of liquid drops from a nozzle
ATE527619T1 (de) 2005-01-27 2011-10-15 Cambridge Res & Instrumentation Inc Klassifizierung der bildeigenschaften
KR101198038B1 (ko) 2005-01-28 2012-11-06 듀크 유니버서티 인쇄 회로 기판 위의 액적 조작을 위한 기구 및 방법
KR20070112785A (ko) 2005-02-01 2007-11-27 에이젠코트 바이오사이언스 코오포레이션 비드-기초 서열화를 위한 시약, 방법, 및 라이브러리
CA2596117A1 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Perkinelmer Las, Inc. Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060199207A1 (en) 2005-02-24 2006-09-07 Matysiak Stefan M Self-assembly of molecules using combinatorial hybridization
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
GB0504774D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Lingvitae As Method
US7776567B2 (en) 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
US7303880B2 (en) * 2005-03-18 2007-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Microdissection-based methods for determining genomic features of single chromosomes
US7229769B2 (en) 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
ATE406463T1 (de) 2005-04-06 2008-09-15 Maurice Stroun Methode zur krebsdiagnose mittels nachweis von dna und rna im kreislauf
GB0508983D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Oxford Gene Tech Ip Ltd Cell analyser
US8623628B2 (en) 2005-05-10 2014-01-07 Illumina, Inc. Polymerases
EP1880025B1 (en) 2005-05-12 2011-03-16 Affymetrix, Inc. Multiplex branched-chain dna assays
US20070003954A1 (en) 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
GB0509833D0 (en) 2005-05-16 2005-06-22 Isis Innovation Cell analysis
AU2006247067B2 (en) 2005-05-18 2012-06-07 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by CD40 signaling
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
CN100526453C (zh) 2005-05-20 2009-08-12 麦克奥迪实业集团有限公司 激光显微切割后细胞收集方法
EP1885890A4 (en) 2005-05-26 2010-01-20 Univ Boston QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS VIA OLIGONUCLEOTIDE MASS LABELS
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US7601499B2 (en) 2005-06-06 2009-10-13 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
WO2007007192A1 (en) 2005-06-07 2007-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Use of ionic matrices for maldi mass spectrometry analysis of tissue sections
GB0511717D0 (en) 2005-06-09 2005-07-13 Babraham Inst Repeatable protein arrays
WO2006138257A2 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
EP2500439B2 (en) 2005-06-20 2017-08-16 Advanced Cell Diagnostics, Inc. kits and products for detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations.
US20070087360A1 (en) 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
US7873193B2 (en) 2005-06-21 2011-01-18 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Serial section analysis for computer-controlled microscopic imaging
ATE491045T1 (de) 2005-06-23 2010-12-15 Keygene Nv Strategien mit hohem durchsatz zur identifizierung und zum nachweis von polymorphismen
WO2007005649A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Applera Corporation Proximity probing of target proteins comprising restriction and/or extension field
US7883848B2 (en) 2005-07-08 2011-02-08 Olink Ab Regulation analysis by cis reactivity, RACR
JP4822753B2 (ja) 2005-07-11 2011-11-24 一般社団法人オンチップ・セロミクス・コンソーシアム 細胞構成物質分取チップならびに細胞構成物質解析システム及びこれらを用いる細胞構成物質解析法
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US20070023292A1 (en) 2005-07-26 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Small object moving on printed circuit board
US7805081B2 (en) 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
JP2009506772A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 プロメガ コーポレイション 細胞ベースの発光及び非発光プロテアソームアッセイ
WO2007030373A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 St. Jude Children's Research Hospital Method for in situ hybridization analysis
JP2007074967A (ja) 2005-09-13 2007-03-29 Canon Inc 識別子プローブ及びそれを用いた核酸増幅方法
US7741106B2 (en) 2005-09-21 2010-06-22 Moyle William R Sensors for biomolecular detection and cell classification
ES2338459T5 (es) 2005-09-29 2014-02-24 Keygene N.V. Exploración de alto rendimiento de poblaciones mutagenizadas
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
WO2007041689A2 (en) 2005-10-04 2007-04-12 President And Fellows Of Harvard College Methods of site-specific labeling of molecules and molecules produced thereby
AU2007249635B2 (en) 2005-10-07 2012-05-31 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
US20070116612A1 (en) 2005-11-02 2007-05-24 Biopath Automation, L.L.C. Prefix tissue cassette
CA2627967A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
WO2007061284A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 Plant Research International B.V. Multiplex nucleic acid detection
WO2007060599A1 (en) 2005-11-25 2007-05-31 Koninklijke Philips Electronics N.V. Magnetic biosensor for determination of enzymic activity
WO2007100392A2 (en) 2005-11-30 2007-09-07 Biotium, Inc. Enzyme substrate comprising a functional dye and associated technology and methods
US20070161029A1 (en) 2005-12-05 2007-07-12 Panomics, Inc. High throughput profiling of methylation status of promoter regions of genes
US7803751B2 (en) 2005-12-09 2010-09-28 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting phosphomonoester
DE102005060738A1 (de) 2005-12-16 2007-06-21 Qiagen Gmbh Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben
US20070178503A1 (en) 2005-12-19 2007-08-02 Feng Jiang In-situ genomic DNA chip for detection of cancer
US20070141718A1 (en) 2005-12-19 2007-06-21 Bui Huy A Reduction of scan time in imaging mass spectrometry
WO2007076023A2 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Meso Scale Technologies, Llc Assay modules having assay reagents and methods of making and using same
EP2363504A1 (en) 2005-12-22 2011-09-07 Keygene N.V. Method for high-throughtput AFLP-based polymorphism detection
ES2394633T3 (es) 2005-12-22 2013-02-04 Keygene N.V. Estrategias mejoradas para elaboración de perfiles de transcritos usando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento
JP4847541B2 (ja) 2005-12-23 2011-12-28 テレフオンアクチーボラゲット エル エム エリクソン（パブル） データパケットトラフィック輻輳を解決する方法及び装置
US8986926B2 (en) 2005-12-23 2015-03-24 Nanostring Technologies, Inc. Compositions comprising oriented, immobilized macromolecules and methods for their preparation
CA2640385C (en) 2005-12-23 2014-07-15 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
EP1969146B1 (en) 2006-01-04 2010-10-06 Si Lok Methods for nucleic acid mapping and identification of fine-structural-variations in nucleic acids and utilities
US7544473B2 (en) 2006-01-23 2009-06-09 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
WO2007087339A2 (en) 2006-01-24 2007-08-02 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexed analyte quantitation by two-dimensional planar electrochromatography
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
SG170028A1 (en) 2006-02-24 2011-04-29 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
JP5237126B2 (ja) 2006-03-01 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ ライゲーションアッセイを用いてハイスループットシークエンスに基づき遺伝子関連配列を検出する方法
US20080009420A1 (en) 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
JP2007248396A (ja) 2006-03-17 2007-09-27 Toshiba Corp 核酸検出用デバイスおよび核酸検出装置
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
SG170802A1 (en) 2006-03-31 2011-05-30 Solexa Inc Systems and devices for sequence by synthesis analysis
ES2545264T3 (es) 2006-04-04 2015-09-09 Keygene N.V. Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción
CA2680532C (en) 2006-04-18 2017-03-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
WO2007127458A2 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Nsabp Foundation, Inc. Methods of whole genome or microarray expression profiling using nucleic acids
CA2651815A1 (en) 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
JP2007304043A (ja) 2006-05-15 2007-11-22 Canon Inc プローブ固定担体の製造方法
AU2007268027B2 (en) 2006-05-22 2012-08-09 Nanostring Technologies, Inc. Systems and methods for analyzing nanoreporters
US20080132429A1 (en) 2006-05-23 2008-06-05 Uchicago Argonne Biological microarrays with enhanced signal yield
EP3260863B1 (en) 2006-05-27 2021-03-10 Fluidigm Canada Inc. Method for performing multiplex analysis of two or more analytes
US9149564B2 (en) 2006-06-23 2015-10-06 The Regents Of The University Of California Articles comprising large-surface-area bio-compatible materials and methods for making and using them
WO2008002502A2 (en) 2006-06-23 2008-01-03 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of dna cluster arrays
JP2009542222A (ja) 2006-06-29 2009-12-03 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ チャンバー装置
US8178316B2 (en) 2006-06-29 2012-05-15 President And Fellows Of Harvard College Evaluating proteins
US7312029B1 (en) 2006-06-30 2007-12-25 Searete Llc Method of combing an elongated molecule
US8362242B2 (en) 2006-06-30 2013-01-29 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Analyte determination utilizing mass tagging reagents comprising a non-encoded detectable label
AT503862B1 (de) 2006-07-05 2010-11-15 Arc Austrian Res Centers Gmbh Pathogen-identifizierung anhand eines 16s oder 18s-rrna mikroarray
WO2008007511A1 (fr) 2006-07-10 2008-01-17 Hitachi High-Technologies Corporation Dispositif de transfert de liquide
WO2008097257A2 (en) 2006-07-10 2008-08-14 California Institute Of Technology Method for selectively anchoring large numbers of nanoscale structures
EP1878502A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 Roche Diagnostics GmbH Instrument for heating and cooling
CN101522915A (zh) 2006-08-02 2009-09-02 加州理工学院 用于检测和/或分选靶标的方法和系统
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008022332A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Board Of Regents, The University Of Texas System System, method and kit for replicating a dna array
US20080047835A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Macconnell William P Genomic DNA Purifier
EP3936857B1 (en) 2006-09-01 2023-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
EP2076609A1 (en) 2006-10-10 2009-07-08 Illumina Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
US8343746B2 (en) 2006-10-23 2013-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US20080108804A1 (en) 2006-11-02 2008-05-08 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS
WO2008055256A2 (en) 2006-11-02 2008-05-08 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for real-time feedback control of electrical manipulation of droplets on chip
WO2008069906A2 (en) 2006-11-14 2008-06-12 The Regents Of The University Of California Digital expression of gene analysis
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US7655898B2 (en) 2006-11-30 2010-02-02 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Optical filter assembly with selectable bandwidth and rejection
BRPI0721095B1 (pt) 2006-12-13 2015-09-29 Luminex Corp Sistemas e métodos para a análise multíplex de pcr em tempo real
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2639579B1 (en) 2006-12-14 2016-11-16 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
CN101221182A (zh) * 2007-01-08 2008-07-16 山东司马特生物芯片有限公司 一种荧光蛋白质芯片血清肿瘤系列诊断新方法
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080220434A1 (en) 2007-02-07 2008-09-11 Perscitus Biosciences, Llc Detection Of Molecule Proximity
EP2118344B1 (en) 2007-02-12 2014-07-23 Proteonova, Inc. GENERATION OF LIBRARY OF SOLUBLE RANDOM POLYPEPTIDES LINKED TO mRNA
KR100819006B1 (ko) 2007-02-13 2008-04-03 삼성전자주식회사 마이크로 어레이용 마스크 세트, 이의 제조 방법, 및마스크 세트를 이용한 마이크로 어레이의 제조 방법
US8153782B2 (en) 2007-02-14 2012-04-10 Eastman Chemical Company Reformation of ionic liquids
KR101017808B1 (ko) 2007-04-04 2011-02-28 엔에이치엔(주) 편집 파일 자동 생성 방법 및 그 장치
EP2155899A2 (en) 2007-04-10 2010-02-24 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
EP2145180B1 (en) 2007-04-13 2013-12-04 Sequenom, Inc. Comparative sequence analysis processes and systems
AU2008256851A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 Oregon Health & Science University Microarray systems and methods for identifying DNA-binding proteins
EP2164985A4 (en) 2007-06-01 2014-05-14 454 Life Sciences Corp SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE
WO2008151127A1 (en) 2007-06-04 2008-12-11 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for chemical ligation
CA2691197C (en) 2007-06-21 2013-03-12 Gen-Probe Incorporated Instrument and receptacles for use in performing processes
CN101679932A (zh) 2007-06-27 2010-03-24 数字化生物系统 用于热交换化学过程的基于数字微流体的装置
EP2395113A1 (en) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US7534991B2 (en) 2007-07-10 2009-05-19 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Athermalized birefringent filter apparatus and method
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
CA2730565A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Ensemble Discovery Corporation Detection assays and use thereof
JP2009036694A (ja) 2007-08-03 2009-02-19 Tokyo Medical & Dental Univ 空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法
US20090093378A1 (en) 2007-08-29 2009-04-09 Helen Bignell Method for sequencing a polynucleotide template
US9388457B2 (en) * 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
ITBO20070627A1 (it) 2007-09-14 2009-03-15 Twof Inc Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare
CA2697640C (en) 2007-09-21 2016-06-21 Katholieke Universiteit Leuven Tools and methods for genetic tests using next generation sequencing
EP2051051B1 (en) 2007-10-16 2020-06-03 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral imaging system with dynamic optical correction
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US20090181375A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Peter Brian J Method for detection of nucleic acid barcodes
EP2620511B1 (en) 2008-01-17 2018-02-28 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes
KR20090081260A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
US8247217B2 (en) 2008-02-15 2012-08-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Thermal cycler with self-adjusting lid
DE102008014687A1 (de) 2008-03-18 2009-09-24 Smartrac Ip B.V. Lagenverbund für einen Kartenkörper und Verfahren zur Herstellung des Lagenverbunds
WO2009117698A2 (en) * 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
US20090253163A1 (en) 2008-04-02 2009-10-08 General Electric Company Iterative staining of biological samples
DE102008023438B4 (de) 2008-05-14 2011-06-30 Bruker Daltonik GmbH, 28359 Verfahren zur Analyse von Gewebeschnitten
US8093064B2 (en) 2008-05-15 2012-01-10 The Regents Of The University Of California Method for using magnetic particles in droplet microfluidics
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
US20100120097A1 (en) 2008-05-30 2010-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US8199999B2 (en) 2008-06-17 2012-06-12 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Image classifier training
GB0811574D0 (en) 2008-06-24 2008-07-30 Trillion Genomics Ltd Characterising planar samples by mass spectrometry
EP2291533B2 (en) 2008-07-02 2020-09-30 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
JP5836803B2 (ja) 2008-08-14 2015-12-24 ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド 安定したナノレポーター
WO2010027870A2 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Fluidigm Corporation Assay methods for increased throughput of samples and/or targets
EP2163900A1 (en) 2008-09-04 2010-03-17 Commissariat A L'energie Atomique New method of imaging by mass spectrometry and new mass tag associated trityl derivatives
US20100055733A1 (en) 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
US8586310B2 (en) 2008-09-05 2013-11-19 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
JP5184642B2 (ja) 2008-09-08 2013-04-17 株式会社日立製作所 Ｄｎａ検出装置、及びｄｎａ検出デバイス、並びにｄｎａ検出方法
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
JP2012502660A (ja) 2008-09-22 2012-02-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー マイクロアレイ基板上の生体物質の選択的プロセシング
AU2009298501A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Abbvie Inc. Improved antibody libraries
JP5562342B2 (ja) 2008-10-08 2014-07-30 セージ サイエンス， インコーポレイテッド 多重チャネルの分取用電気泳動システム
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
WO2010062310A1 (en) 2008-10-28 2010-06-03 Millipore Corporation Biological culture assembly
WO2010056513A2 (en) 2008-10-30 2010-05-20 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
JP5690272B2 (ja) 2008-11-03 2015-03-25 ステフティン サンクイン ブルードフォルツィーニング サンプル中の抗原応答性細胞の検出
EP4335932A2 (en) 2008-11-07 2024-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8288122B2 (en) 2008-12-03 2012-10-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Pressure-assisted molecular recovery (PAMR) of biomolecules, pressure-assisted antigen retrieval (PAAR), and pressure-assisted tissue histology (PATH)
US20110275077A1 (en) 2009-01-12 2011-11-10 William James Oligonucleotide-Coated Affinity Membranes and Uses Thereof
US8790873B2 (en) 2009-01-16 2014-07-29 Affymetrix, Inc. DNA ligation on RNA template
KR101059565B1 (ko) 2009-02-11 2011-08-26 어플라이드 프레시젼, 인코포레이티드 밝은 기준점 표지를 갖는 마이크로어레이 및 그로부터 광 데이터를 수집하는 방법
US8481698B2 (en) 2009-03-19 2013-07-09 The President And Fellows Of Harvard College Parallel proximity ligation event analysis
EP3998346A1 (en) * 2009-03-30 2022-05-18 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
EA023190B9 (ru) 2009-04-02 2018-03-30 Флуидигм Корпорейшн Способ мультипраймерной амплификации для штрихового кодирования целевых нуклеиновых кислот
CN102625850B (zh) 2009-04-03 2014-11-26 蒂莫西·Z·刘 多重核酸检测方法和系统
CA2760439A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
WO2011008502A2 (en) 2009-06-29 2011-01-20 California Institute Of Technology Isolation of unknown rearranged t-cell receptors from single cells
RU2410439C1 (ru) 2009-07-06 2011-01-27 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации Способ абляции целевой днк с поверхности днк-биочипов
US20120196297A1 (en) 2009-07-14 2012-08-02 Yost Richard A Mass tags for mass spectrometric analysis of immunoglobulins
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
JP2013500725A (ja) 2009-07-31 2013-01-10 プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド アッセイツールおよびその使用方法
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
CN102482668A (zh) 2009-08-20 2012-05-30 群体遗传学科技有限公司 分子内核酸重排的组合物和方法
EP2473842A4 (en) 2009-09-01 2014-03-19 Univ Oregon Health & Science ELECTROPHORESIS DEVICE WITH REVERSIBLE STROM GEL FOR THE SEPARATION OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES
SG169918A1 (en) 2009-10-02 2011-04-29 Fluidigm Corp Microfluidic devices with removable cover and methods of fabrication and application
ES2461992T3 (es) 2009-10-09 2014-05-22 Invisible Sentinel, Inc. Dispositivo para la detección de antígenos y usos de los mismos
AU2010306862B2 (en) 2009-10-13 2015-08-27 Nanostring Technologies, Inc. Protein detection via nanoreporters
US9005891B2 (en) 2009-11-10 2015-04-14 Genomic Health, Inc. Methods for depleting RNA from nucleic acid samples
KR101358549B1 (ko) 2009-11-13 2014-02-05 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 조절 가능한 체적 수용을 위한 박막 프로세싱 장치
CN102549170B (zh) 2009-11-18 2013-07-17 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种芯片法邻位连接技术
CN106701739A (zh) 2009-12-04 2017-05-24 株式会社日立制作所 基因表达解析用解析装置及设备
US20120270748A1 (en) 2009-12-07 2012-10-25 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide display arrays
US20120202704A1 (en) 2009-12-07 2012-08-09 Illumina, Inc. Multi-sample indexing for multiplex genotyping
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
SG181543A1 (en) 2009-12-15 2012-07-30 Agency Science Tech & Res Processing of amplified dna fragments for sequencing
US8889416B2 (en) 2010-01-21 2014-11-18 California Institute Of Technology Methods and devices for micro-isolation, extraction, and/or analysis of microscale components
US20130171621A1 (en) 2010-01-29 2013-07-04 Advanced Cell Diagnostics Inc. Methods of in situ detection of nucleic acids
EP2354242A1 (en) 2010-02-03 2011-08-10 Epiontis GmbH Assay for determining the type and/or status of a cell based on the epigenetic pattern and the chromatin structure
WO2011100541A2 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Nanostring Technologies, Inc. Compositions and methods for the detection of small rnas
WO2011102903A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Bima Limited Immobilised-bead immunomultiplex assay
WO2011112634A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 California Institute Of Technology Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells
US10266876B2 (en) 2010-03-08 2019-04-23 California Institute Of Technology Multiplex detection of molecular species in cells by super-resolution imaging and combinatorial labeling
JP5665021B2 (ja) 2010-03-08 2015-02-04 国立大学法人東京農工大学 融合ｍｈｃ分子連結磁気微粒子、抗原ペプチドのスクリーニング方法、組換えベクター、及び磁性細菌の形質転換体
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
KR101866401B1 (ko) 2010-04-05 2018-06-11 프로그노시스 바이오사이언스, 인코포레이티드 공간적으로 엔코딩된 생물학적 검정
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20110245101A1 (en) 2010-04-05 2011-10-06 Prognosys Biosciences, Inc. Co-localization affinity assays
US8462981B2 (en) 2010-04-07 2013-06-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Spectral unmixing for visualization of samples
WO2011143556A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Gen9, Inc. Methods for nucleotide sequencing and high fidelity polynucleotide synthesis
WO2011143583A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Illumina, Inc. Binding assays for markers
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
JP6110297B2 (ja) 2010-06-09 2017-04-05 キージーン・エン・フェー 高処理スクリーニング用の組合せ配列バーコード
WO2012003478A2 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Ventana Medical Systems, Inc. Detecting targets using mass tags and mass spectrometry
US20130211249A1 (en) 2010-07-22 2013-08-15 The Johns Hopkins University Drug eluting hydrogels for catheter delivery
CA2806621C (en) 2010-08-05 2018-09-11 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Enhancing visual assessment of samples
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
GB201013767D0 (en) 2010-08-17 2010-09-29 Isis Innovation Identification of ligands and their use
ES2523140T3 (es) 2010-09-21 2014-11-21 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US9110079B2 (en) 2010-09-29 2015-08-18 Biomerieux Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS
EP3561159B1 (en) 2010-10-08 2023-09-20 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
WO2012049316A1 (en) 2010-10-15 2012-04-19 Olink Ab Dynamic range methods
CN104849472A (zh) 2010-10-21 2015-08-19 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
EP4328321A2 (en) 2010-10-22 2024-02-28 Cold Spring Harbor Laboratory Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information
EP3928867A1 (en) 2010-10-27 2021-12-29 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
WO2012058638A2 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid nanostructure barcode probes
AU2011323107B2 (en) 2010-11-05 2015-09-10 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US20120258870A1 (en) 2010-11-22 2012-10-11 The University Of Chicago Methods, Systems, and/or Use of Oligonucleotide Conjugates to Develop Panels for Use in Assays and Detections
US20140121118A1 (en) 2010-11-23 2014-05-01 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems and compositions regarding multiplex construction protein amino-acid substitutions and identification of sequence-activity relationships, to provide gene replacement such as with tagged mutant genes, such as via efficient homologous recombination
EP2652155B1 (en) 2010-12-16 2016-11-16 Gigagen, Inc. Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
EP3564395A1 (en) 2010-12-30 2019-11-06 Foundation Medicine, Inc. Optimization of multigene analysis of tumor samples
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
MX2013008367A (es) 2011-01-25 2013-08-12 Almac Diagnostics Ltd Firmas de esxpresion genetica de cancer de colon y metodos de uso.
JP5881746B2 (ja) 2011-02-15 2016-03-09 ライカ バイオシステムズ ニューキャッスル リミテッド ｍＲＮＡの局在インサイチュー検出のための方法
WO2012129242A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates
US9260753B2 (en) 2011-03-24 2016-02-16 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
EP2694709B1 (en) 2011-04-08 2016-09-14 Prognosys Biosciences, Inc. Peptide constructs and assay systems
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP3907299A1 (en) 2011-04-15 2021-11-10 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US8946389B2 (en) 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
WO2012151111A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
SG194722A1 (en) 2011-05-09 2013-12-30 Fluidigm Corp Probe based nucleic acid detection
AU2012255121B2 (en) 2011-05-17 2017-03-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
CN103717751A (zh) 2011-05-19 2014-04-09 塞昆纳姆股份有限公司 用于多重核酸鉴定的产品和方法
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
GB201108678D0 (en) 2011-05-24 2011-07-06 Olink Ab Multiplexed proximity ligation assay
KR20140023326A (ko) 2011-06-06 2014-02-26 비오까르띠 에스아 이온성 계면활성제에 의한 세포의 선택적 용해
CA2839542A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Constitution Medical, Inc. Fixative and staining solutions
CN103732761A (zh) 2011-08-03 2014-04-16 伯乐实验室公司 使用透化处理的细胞过滤小核酸
WO2013033271A2 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Derren Barken Method to augment immune system in response to disease or injury
DE112011100879A5 (de) 2011-08-30 2013-11-14 Jacobs University Bremen Ggmbh Gen codiert für ein MHC-Klasse-I-Molekül, Plasmid, Expressionssystem, Protein, Multimer, Reagenz und Kit zum Analysieren einer T-Zellen-Frequenz
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
ES2752653T3 (es) 2011-09-23 2020-04-06 Illumina Inc Métodos y composiciones para la secuenciación de ácidos nucleicos
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
US8987174B2 (en) 2011-10-28 2015-03-24 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for manufacturing molecular arrays
AU2012328662B2 (en) 2011-10-28 2015-12-17 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
CA2854023A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
US9200274B2 (en) 2011-12-09 2015-12-01 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
US20150031553A1 (en) 2011-12-13 2015-01-29 Sequenta, Inc. Method of measuring immune activation
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US9803188B2 (en) 2011-12-22 2017-10-31 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
US10227639B2 (en) 2011-12-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
AU2013221480B2 (en) 2012-02-14 2018-08-23 Cornell University Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
EP2814959B1 (en) 2012-02-17 2018-01-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
NO2694769T3 (ko) 2012-03-06 2018-03-03
EP2825672B1 (en) 2012-03-13 2019-02-13 Swift Biosciences, Inc. Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase
US9862995B2 (en) 2012-03-13 2018-01-09 Abhijit Ajit Patel Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing
EP4234713A3 (en) 2012-03-20 2024-02-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
AU2013240088B2 (en) 2012-03-26 2017-02-02 The Johns Hopkins University Rapid aneuploidy detection
WO2013151622A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
CN104395481A (zh) 2012-04-13 2015-03-04 赛昆塔公司 免疫组库分析中样品污染的检测和定量
WO2013158936A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Sequenta, Inc Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in b-cell acute lymphoblastic leukemia
EP2659977B1 (en) 2012-05-02 2019-04-24 IMEC vzw Microfluidics system for sequencing
MX369628B (es) 2012-05-22 2019-11-14 Nanostring Technologies Inc Genes nano46 y metodos para predecir el resultado del cancer de mama.
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP2875350A4 (en) 2012-07-18 2016-05-11 Biolog Dynamics Inc MANIPULATION OF MICROPARTICLES IN DIELECTROPHORETIC REGIONS OF LOW FIELD THICKNESS
JP5997278B2 (ja) 2012-07-30 2016-09-28 株式会社日立製作所 タグ配列付き２次元ｃＤＮＡライブラリーデバイス、並びにこれを用いた遺伝子発現解析方法及び遺伝子発現解析装置
EP4163617A1 (en) 2012-08-09 2023-04-12 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
CN111748607B (zh) 2012-08-14 2024-04-30 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10032064B2 (en) 2012-08-21 2018-07-24 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Visualization and measurement of cell compartments
US20150275267A1 (en) 2012-09-18 2015-10-01 Qiagen Gmbh Method and kit for preparing a target rna depleted sample
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
CA2886647A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
US9518980B2 (en) 2012-10-10 2016-12-13 Howard Hughes Medical Institute Genetically encoded calcium indicators
WO2014060483A1 (en) 2012-10-17 2014-04-24 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP2722105A1 (en) 2012-10-22 2014-04-23 Universität Wien Method of in situ synthesizing microarrays
CN104919057B (zh) 2012-11-14 2018-09-25 欧凌科公司 基于rca的局部扩增方法
US10035920B2 (en) 2012-11-27 2018-07-31 Tufts University Biopolymer-based inks and use thereof
SG10202009015SA (en) 2012-12-10 2020-10-29 Resolution Bioscience Inc Methods for targeted genomic analysis
EP2943932B1 (en) 2013-01-10 2019-09-11 Akoya Biosciences, Inc. Whole slide multispectral imaging systems and methods
EP2943761B1 (en) 2013-01-10 2023-11-29 Akoya Biosciences, Inc. Multispectral imaging system and methods
US9758828B2 (en) 2013-01-31 2017-09-12 Cornell University Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts
CN108753766A (zh) 2013-02-08 2018-11-06 10X基因组学有限公司 多核苷酸条形码生成
WO2014130576A1 (en) 2013-02-19 2014-08-28 Biodot, Inc. Automated fish analysis of tissue and cell samples using an isolating barrier for precise dispensing of probe and other reagents on regions of interest
ES2741956T3 (es) 2013-02-25 2020-02-12 Biocartis Nv Aislamiento de ácidos nucleicos
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
DK2969479T3 (da) 2013-03-13 2021-08-02 Illumina Inc Væskeanordninger i flere lag og fremgangsmåder til deres fremstilling
WO2014152397A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Selective purification of rna and rna-bound molecular complexes
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
DK3611262T3 (da) 2013-03-15 2021-01-25 Lineage Biosciences Inc Fremgangsmåder til sekvensering af immunrepertoire
WO2014152281A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Ribosomal ribonucleic acid hybridization for organism identification
CN113337604A (zh) 2013-03-15 2021-09-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
EP2971284A4 (en) 2013-03-15 2017-01-18 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Subtyping lung cancers
US10656149B2 (en) 2013-03-15 2020-05-19 The Trustees Of Princeton University Analyte detection enhancement by targeted immobilization, surface amplification, and pixelated reading and analysis
US9868979B2 (en) 2013-06-25 2018-01-16 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
CN110592182B (zh) 2013-06-27 2023-11-28 10X基因组学有限公司 用于样品处理的组合物和方法
AU2014284584B2 (en) 2013-07-01 2019-08-01 Illumina, Inc. Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
US9834814B2 (en) 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
KR102596508B1 (ko) 2014-04-10 2023-10-30 10엑스 제노믹스, 인크. 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용
WO2015184386A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Regents Of The University Of California Subcellular western blotting of single cells
EP3628684A1 (en) 2014-06-06 2020-04-01 Herlev Hospital Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers
EP3155426B1 (en) 2014-06-13 2023-07-19 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
US10179932B2 (en) 2014-07-11 2019-01-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
ES2955916T3 (es) 2015-04-10 2023-12-11 Spatial Transcriptomics Ab Análisis múltiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
US10059990B2 (en) 2015-04-14 2018-08-28 Massachusetts Institute Of Technology In situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples
WO2017013170A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of antigen epitopes and immune sequences recognizing the antigens
US10768141B2 (en) 2015-09-11 2020-09-08 The Regents Of The University Of California Isoelectric focusing arrays and methods of use thereof
EP3507364A4 (en) 2016-08-31 2020-05-20 President and Fellows of Harvard College METHODS OF GENERATING NUCLEIC ACID SEQUENCE LIBRARIES FOR IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING DETECTION
EP3507385A4 (en) 2016-08-31 2020-04-29 President and Fellows of Harvard College METHODS OF COMBINING THE DETECTION OF BIOMOLECULES IN A SINGLE ASSAY USING IN SITU FLUORESCENT SEQUENCING
DK3529357T3 (da) 2016-10-19 2022-04-25 10X Genomics Inc Fremgangsmåder til stregkodning af nukleinsyremolekyler fra individuelle celler
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US20190064173A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 10X Genomics, Inc. Methods of producing droplets including a particle and an analyte
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
EP3844307A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US20210324457A1 (en) 2018-08-28 2021-10-21 Eswar Prasad Ramachandran Iyer Methods for Generating Spatially Barcoded Arrays
EP3844308A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
EP4345453A2 (en) 2018-09-28 2024-04-03 10X Genomics, Inc. High throughput epitope identification and t cell receptor specificity determination using loadable detection molecules
WO2020076979A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Surface capture of targets
US20220049293A1 (en) 2018-12-10 2022-02-17 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
WO2020123301A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
US20230242976A1 (en) 2018-12-10 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US20210189475A1 (en) 2018-12-10 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
DE102018132378A1 (de) 2018-12-17 2020-06-18 Hamm Ag Bodenbearbeitungsmaschine
US20220267844A1 (en) 2019-11-27 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
US20230159995A1 (en) 2019-02-28 2023-05-25 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
WO2020176882A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and methods for increasing droplet formation efficiency
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
US20220145361A1 (en) 2019-03-15 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
EP3887542A1 (en) 2019-03-22 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20220017951A1 (en) 2019-03-22 2022-01-20 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2020219901A1 (en) 2019-04-26 2020-10-29 10X Genomics, Inc. Imaging support devices
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20210140982A1 (en) 2019-10-18 2021-05-13 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of brain disorders and methods of using the same
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US20210199660A1 (en) 2019-11-22 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Biomarkers of breast cancer
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
EP4081777A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 10X Genomics, Inc. Reversible fixing reagents and methods of use thereof
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US20210198741A1 (en) 2019-12-30 2021-07-01 10X Genomics, Inc. Identification of spatial biomarkers of heart disorders and methods of using the same
US20220348992A1 (en) 2020-01-10 2022-11-03 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a target nucleic acid in a biological sample
CN115715329A (zh) 2020-01-10 2023-02-24 10X基因组学有限公司 确定生物样品中靶核酸位置的方法
US20210214785A1 (en) 2020-01-13 2021-07-15 Spatial Transcriptomics Ab Methods of decreasing background on a spatial array
US20210223227A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Spatial Transcriptomics Ab Electrophoretic system and method for analyte capture
US20210222253A1 (en) 2020-01-21 2021-07-22 10X Genomics, Inc. Identification of biomarkers of glioblastoma and methods of using the same
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
US20210237022A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US20210238664A1 (en) 2020-02-03 2021-08-05 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
WO2021168278A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 10X Genomics, Inc. METHODS TO COMBINE FIRST AND SECOND STRAND cDNA SYNTHESIS FOR SPATIAL ANALYSIS
EP4107282A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Capturing genetic targets using a hybridization approach
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
CN115803454A (zh) 2020-05-04 2023-03-14 10X基因组学有限公司 空间转录组学转移模式
EP4153984A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237056A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Rna integrity analysis in a biological sample
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
US20230279474A1 (en) 2020-06-10 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using blocker oligonucleotides
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US20230287475A1 (en) 2020-07-31 2023-09-14 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
WO2022060798A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 10X Genomics, Inc. Methods of releasing an extended capture probe from a substrate and uses of the same
EP4214333A1 (en) 2020-09-16 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Methods of determining the location of an analyte in a biological sample using a plurality of wells
US20240018572A1 (en) 2020-10-22 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification
CN116829733A (zh) 2020-11-06 2023-09-29 10X基因组学有限公司 用于将分析物结合至捕获探针的组合物和方法
WO2022098810A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 10X Genomics, Inc. Assay support devices
WO2022103712A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
EP4247978A1 (en) 2020-11-18 2023-09-27 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing immune infiltration in cancer stroma to predict clinical outcome
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2022147005A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 10X Genomics, Inc. Methods for analyte capture determination
US20240076723A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
AU2022212231A1 (en) 2021-01-29 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
WO2022178267A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 10X Genomics, Inc. Modular assay support devices
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4305196A1 (en) 2021-04-14 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022226057A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 10X Genomics, Inc. Methods for assessing sample quality prior to spatial analysis using templated ligation
US20220333192A1 (en) 2021-04-20 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Methods and devices for spatial assessment of rna quality
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2022271820A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 10X Genomics, Inc. Spatial detection of sars-cov-2 using templated ligation
US20230014008A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for improving spatial performance
EP4352252A1 (en) 2021-07-13 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
US20230034216A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Multiplexed spatial capture of analytes
US20230034039A1 (en) 2021-08-02 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Methods of preserving a biological sample
US20230042817A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 10X Genomics, Inc. Analyte capture from an embedded biological sample
WO2023018799A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 10X Genomics, Inc. Methods, compositions and systems for identifying antigen-binding molecules
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023076345A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna capture
US20230135010A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 10X Genomics, Inc. Sequential analyte capture
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230175045A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090415A2 (en) 2000-05-20 2001-11-29 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a dna library using positional amplification

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clin. Microbiol. Rev., 22(4): 611-633 (2009.10.)*
Monnie McGee, ‘Structure and Analysis of Affymetrix Arrays’, UTSW Microarray Analysis Course (2005.10.28.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20220090058A1 (en) 2022-03-24
CN103781918B (zh) 2018-06-01
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