DE60210014T2 - Auf Zellen gegründetes Phosphodiesterase-10A-Assay und Sequenzen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Agentien, die PDE10A-Aktivität modulieren, und die Polynucleotid- und Polypeptid-Sequenzen für Ratten-PDE10A bereit.
  • Hintergrund
  • Cyclische Nucleotidphosphodiesterasen (PDEs) katalysieren die Hydrolyse der zweiten Messenger cAMP (cyclisches Adenosin-3'5'-monophosphat) und cGMP (cyclisches Guanin-3'5'-monophosphat) und spielen bei einer weiten Vielzahl von Signaltransduktionswegen eine zentrale regulatorische Rolle (Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–48, 1995). Beispielsweise vermitteln PDEs Prozesse, die beim Sehen (McLaughlin et al., Nat. Genet. 4: 130–34, 1993), Riechen (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9677–81, 1995), bei der Thrombozytenaggregation (Dickinson et al., Biochem. J. 323: 371–77, 1997), der Aldosteronsynthese (MacFarland et al., J. Biol. Chem. 266: 136–42, 1991), der Insulinsekretion (Zhao et al., J. Clin. Invest. 102: 869–73, 1998), der T-Zell-Aktivierung (Li et al., Science 283: 848–51, 1999) und der glatten Muskelrelaxation (Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47–52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164–71, 1998) involviert sind.
  • PDEs bilden eine Superfamilie von Enzymen, die in 11 Hauptfamilien unterteilt ist (Beavo, Physiol. Rev. 75: 725–48, 1995; Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399–05, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991–96, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Common. 246: 570–77, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751–56, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553–58, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559–64, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071–76, 1999; und Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–07, 2000).
  • Jede PDE-Familie ist funktionell durch einzigartige enzymatische Charakteristika und pharmakologische Profile gekennzeichnet. Außerdem weist jede Familie ein unterschiedliches Gewebe-, zelluläres und subzelluläres Expressionsmuster auf (Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46: 399–405, 1994; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8991–96, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 570–77, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250: 751–56, 1998; Soderling et al., J. Biol. Chem. 273: 15553–58, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559–64, 1998; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071–76, 1999; Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–07, 2000; Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47–52, 1996; Ballard et al., J. Urol. 159: 2164–71, 1998; Houslay, Semin. Cell Dev. Biol. 9: 161–67, 1998; und Torphy et al., Pulm. Pharmacol. Ther. 12: 131–35, 1999). Dementsprechend ist es durch Verabreichung einer Verbindung, die die Aktivität einer Familie oder Subfamilie der PDE-Enzyme selektiv reguliert, möglich, cAMP- und/oder cGMP-Signaltransduktionswege in Zell- oder Gewebe-spezifischer Art zu regulieren.
  • PDE10 ist als einzigartiges PDE auf der Basis der Aminosäure-Primärsequenz und der unterschiedlichen enzymatischen Aktivität identifiziert. Ein Homologie-Screening von EST-Datenbanken zeigte PDE10A als erstes Mitglied der PDE10-Familie der Phosphodiesterasen (Fujishige et al., J. Biol. Chem. 274: 18438–18445, 1999; Loughney et al., Gene 234: 109–117, 1999). Die Human-, Ratten- und Maus-Homologen wurden kloniert, und N-terminale Spleißvarianten wurden sowohl für das Ratten- als auch das Human-Gen identifiziert (Kotera et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 261: 551–557, 1999; Fujishige et al., Eur. J. Biochem. 266: 1118–1127, 1999; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071–7076, 1999); es gibt einen hohen Homologiegrad quer durch die Spezies. PDE10A hydrolysiert cAMP und cGMP zu AMP bzw. GMP. Die Affinität von PDE10A für cAMP (Km = 0,05 μM) ist höher als für cGMP (Km = 3 μM). Allerdings hat der etwa 5 mal größere Wert für Vmax für cGMP im Vergleich zu cAMP zu der Annahme geführt, dass PTE10A eine einzigartige cAMP-inhibierte cGMPase ist (Fujishige et al., J. Biol. Chem. 274: 18438–18445, 1999).
  • PDE10A ist im Vergleich zu anderen PDE-Familien allein in Säugern lokalisiert. Messenger-RNA für PDE10A wird nur im Hoden und im Gehirn in hohem Maße exprimiert (Lanfear und Robas, EP 0967284 ; Fujishige et al., Eur. J. Biochem. 266: 1118–1127, 1999; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7071–7076, 1999; Loughney et al., Gene 234: 109–117, 1999). Anfangsstudien zeigten, dass innerhalb des Gehirns die Expression im Striatum (Caudate und Putamen), Nucleus accumbens und im Bulbus olfactorius äußerst hoch ist (Lanfear und Robas, a.a.O.). Dementsprechend könnte eine selektive PDE10A-Modulation eingesetzt werden, um die Level an cyclischen Nucleotiden in diesen Gehirnbereichen zu modulieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Agentien, die die PDE10A-Aktivität selektiv modulieren, und die Polynucleotid- und Polypeptid-Sequenzen für Ratten-PDE10A bereit.
  • Nach einem Aspekt charakterisiert die Erfindung ein Verfahren zum Screening nach einem Agens, das intrazelluläre Phosphodiesterase 10A-Aktivität hemmt, umfassend Verabreichung des Agenses an mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums (striatal medium spiny neurons) und submaximale Aktivierung von Adenylatcyclase; Verabreichung des Agenses an mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums und submaximale Aktivierung von Guanylatcyclase; Messung der cAMP-Bildung bzw. cGMP-Bildung und Berechnung des cAMP-EC200-Wertes bzw. des cGMP-EC200-Wertes, wobei das Agens als ein PDE10A-Inhibitor identifiziert wird, wenn das Verhältnis cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert mit dem Verhältnis vergleichbar ist, das durch Verabreichung von Papaverin unter denselben Assaybedingungen produziert wird.
  • Vorzugsweise werden die mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums als primär kultivierte Neuronen hergestellt, Adenylatcyclase wird durch Forskolin aktiviert, Guanylat cyclase wird durch Natriumnitroprussid aktiviert, und das Verhältnis cAMP-EC200/cGMP-EC200 liegt im Bereich von 1,75–5,25, bevorzugter von 3,0–4,0. Vorzugsweise wird die Konzentration an cAMP und cGMP durch Szintillationsnäherungs-Assay gemessen. Es ist bevorzugt, dass die zur Bestimmung von cAMP und cGMP verwendeten Neuronen in getrennten Proben sind. Außerdem ist es bevorzugt, dass das Agens zuerst in vitro als ein selektiver PDE10A-Inhibitor identifiziert wird. Alternativ wird das Agens außerdem durch in vitro-Assay als selektiver PDE10A-Inhibitor identifiziert.
  • Nach einem anderen Aspekt charakterisiert die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO:2 hat.
  • In einem verwandten Aspekt charakterisiert die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Polynucleotid, das eine Nucleinsäure-Sequenz, welche für das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, und/oder die codierende Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Vektor, der die codierende Sequenz von SEQ ID NO:1 umfasst, und auf eine Wirtszelle, die die codierende Sequenz von SEQ ID NO:1 exprimiert.
  • Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Agenses, das PDE10A-Aktivität moduliert, bereit, umfassend Inkontaktbringen des Agenses mit einem Ratten-PDE10A-Polypeptid, das SEQ ID NO:2 umfasst, und Messen der Aktivität des PDE10A-Polypeptids, wobei eine Differenz zwischen der PDE10A-Polypeptid-Aktivität in Gegenwart des Agenses und in Abwesenheit des Agenses ein Hinweis dafür ist, dass das Agens die PDE10A-Aktivität moduliert.
  • Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Agenses, das PDE10A-Aktivität moduliert, gekennzeichnet, wobei das Verfahren Inkontaktbringen des Agenses mit einer Wirtszelle, die die codierende Sequenz von SEQ ID NO:1 exprimiert, und Messen der Aktivität des PDE10A-Polypeptids, das durch SEQ ID NO:1 exprimiert wird, wobei eine Differenz zwischen der PDE10A-Polypeptid-Aktivität in Gegenwart des Agenses und in Abwesenheit des Agenses ein Hinweis dafür ist, dass das Agens die PDE10A-Aktivität moduliert.
  • Der Fachmann wird die Ausdrücke, die hier in der Beschreibung und in den angefügten Ansprüchen verwendet werden, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben, vollständig verstehen. Dennoch sind die folgenden Ausdrücke, wenn nichts anderes angegeben ist, wie unmittelbar unten beschrieben.
  • Ein "Agens, das PDE10A-Aktivität erhöht" bezieht sich auf ein Molekül, das die biologische Aktivität eines PDE10A-Polypeptids intensiviert oder nachahmt. Solche Agentien (d.h., Agonisten) können Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, kleine Moleküle oder eine beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung umfassen, die die Aktivität von PDE10A erhöhen, entweder indem die Menge an PDE10A, die in einer Zelle vorliegt, erhöht wird, oder indem die katalytische Aktivität eines PDE10A-Polypeptids erhöht wird.
  • Ein "Agens, das PDE10A-Aktivität senkt" bezieht sich auf ein Molekül, das die biologische Aktivität eines PDE10A-Polypeptids inhibiert oder abschwächt. Solche Agentien (d.h., Antagonisten) können Proteine, z.B. Anti-PDE10A-Antikörper, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate, kleine Moleküle oder eine beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung umfassen, die die Aktivität eines PDE10A-Polypeptids entweder durch Reduzierung der Menge an PDE10A-Polypeptid, die in einer Zelle vorliegt, oder durch Senkung der katalytischen Aktivität eines PDE10A-Polypeptids senken.
  • Eine "Allelvariante" ist eine alternative Form des Gens, das für ein PDE10A-Polypeptid codiert. Allelvarianten können aus wenigstens einer Mutation in der Nucleinsäure-Sequenz resultieren und können in veränderten mRNA oder in Polypeptiden resultieren, deren Struktur oder Funktion verändert sein kann oder nicht. Ein Gen kann keine, eine oder viele Allelvarianten seiner natürlich vorkommenden Form haben. Übliche Mutationsänderungen, die Allelvarianten hervorbringen, werden allgemein natürlich auftretenden Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben. Jeder dieser Änderungstypen kann allein oder in Kombination mit den anderen, ein oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz auftreten.
  • Eine "veränderte" Nucleinsäure-Sequenz, die für ein PDE10A-Polypeptid codiert, enthält eine Sequenz mit einer Deletion, Insertion oder Substitution von verschiedenen Nucleotiden, was in einem Polypeptid mit wenigstens einem funktionellen Merkmal eines PDE10A-Polyepeptids resultiert. In dieser Definition sind Polymorphismen enthalten, die unter Verwendung einer bestimmten Oligonucleotid-Sonde des Polynucleotids, das für ein PDE10A-Polypeptid codiert, einfach detektierbar sein können oder nicht. Das codierte Protein kann auch "verändert" sein und kann eine oder mehrere Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten enthalten, die eine stumme Änderung produzieren und zu einem PDE10A-Polypeptid führen, das im Wesentlichen einem bekannten PDE10A-Polypeptid funktionell äquivalent ist. Vorsätzliche Aminosäure-Substitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit bezüglich Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, solange das PDE10A-Polypeptid funktionell im Wesentlichen äquivalent ist, z.B. in seiner katalytischen oder immunologischen Aktivität.
  • "Amplifikation" bezieht sich auf die Produktion von zusätzlichen Kopien einer Nucleinsäure-Sequenz. Sie wird im Allgemeinen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktions (PCR)-Technik, die auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, durchgeführt.
  • Ein cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert ist mit dem "vergleichbar", der durch Papaverin produziert wird, wenn er um weniger als oder gleich 50% des Papaverinwertes variiert.
  • Eine "Zusammensetzung", die ein gegebenes Polynucleotid oder Polypeptid umfasst, kann eine Trockenformulierung oder eine wässrige Lösung umfassen.
  • "Konservative Aminosäure-Substitutionen" sind solche Substitutionen, die, wenn sie durchgeführt werden, sich wenigstens mit den Eigenschaften des ursprünglichen Proteins überlagern, d.h., die Struktur, und speziell die Funktion des Proteins, wird konserviert und durch solche Substitutionen nicht signifikant verändert. Beispiele für konservative Aminosäure-Substitutionen umfassen die Folgenden: Ala wird mit Gly oder Ser ersetzt; Arg wird mit His oder Lys ersetzt; Asn wird mit Asp, Gln oder His ersetzt; Asp wird mit Asn oder Glu ersetzt; Cys wird mit Ala oder Ser ersetzt; Gln wird mit Asn, Glu oder His ersetzt; Glu wird mit Asp, Gln oder His ersetzt; Gly wird mit Ala ersetzt; His wird mit Asn, Arg, Gln oder Glu ersetzt; Ile wird mit Leu oder Val ersetzt; Leu wird mit Ile oder Val ersetzt; Lys wird mit Arg, Gln oder Glu ersetzt; Met wird mit Leu oder Ile ersetzt; Phe wird mit His, Met, Leu, Trp oder Tyr ersetzt; Ser wird mit Cys oder Thr ersetzt; Thr wird mit Ser oder Val ersetzt; Trp wird mit Phe oder Tyr ersetzt; Tyr wird mit His, Phe oder Trp ersetzt; und Val wird mit Ile, Leu oder Thr ersetzt. Konservative Aminosäure-Substitutionen halten im Allgemeinen dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe (a) Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Bereich der Substitution, z.B. als beta-Faltblatt- oder alpha-Helix-Konformation, (b) Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Substitutionsstelle und/oder (c) die Voluminosität der Seitenkette aufrecht.
  • Der Ausdruck "Derivat" bezieht sich auf die chemische Modifikation einer Polypeptid- oder Polynucleotid-Sequenz. Chemische Modifikationen einer Polynucleotid-Sequenz können z.B. Ersatz von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppe umfassen. Ein Polynucleotid-Derivat codiert für ein Polypeptid, das wenigstens eine biologische oder immunologische Funktion des natürlichen Moleküls beibehält. Ein Polypeptid-Derivat ist eins, das durch Glykosylierung, Pegylierung oder ein beliebiges anderes Verfahren modifiziert ist, welches mindestens eine biologische oder immunologische Funktion des Polypeptids, von dem es abgeleitet wurde, beibehält.
  • Ein "Fragment" ist ein eindeutiger Teil eines PDE10A-Polypeptids oder des Polynucleotids, das für ein PDE10A-Polypeptid codiert, das in der Sequenz identisch zu der Stammsequenz, in der Länge aber kürzer als diese ist. Ein Fragment, das als Sonde, Primer, Antigen, therapeutisches Molekül oder zu anderen Zwecken verwendet wird, kann wenigstens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 oder wenigstens 500 fortlaufende Nucleotide oder Aminosäurereste in der Länge haben. Fragmente können vorzugsweise aus bestimmten Regionen eines Moleküls ausgewählt sein oder ihnen fehlen bestimmte Regionen eines Moleküls.
  • Der Ausdruck "Identität" bezieht sich auf den Komplementaritätsgrad. Es gibt partielle Similarität oder vollständige Identität. Das Wort "Similarität" kann für das Wort "Identität" eingesetzt werden. Eine partiell komplementäre Sequenz, die eine identische Sequenz wenigstens partiell am Hybridisieren an eine Ziel-Nucleinsäure hindert, wird als "im Wesentlichen gleichartig" bezeichnet. Die Inhibierung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Verwendung eines Hybridisierungs-Assays (Southern- oder Northern-Blot, Lösungshybridisierung und dergleichen) unter Bedingungen reduzierter Stringenz untersucht werden. Eine im Wesentlichen gleichartige Sequenz oder Hybridisierungs-Sonde wird um die Bindung einer vollständig gleichartigen (identischen) Sequenz an die Zielsequenz unter Bedingungen reduzierter Stringenz konkurrieren und diese inhibieren. Es kann nicht gesagt werden, dass die Bedingungen reduzierter Stringenz so sind, dass eine nichtspezifische Bindung ermöglicht wird. Stattdessen erfordern Bedingungen reduzierter Stringenz, dass die Bindung von zwei Sequenzen aneinander eine spezifische (d.h., eine selektive) Wechselwirkung ist. Das Fehlen einer nicht-spezifischen Bindung kann durch die Verwendung einer zweiten Zielsequenz getestet werden, der sogar ein partieller Grad an Komplementarität fehlt (d.h., weniger als etwa 30% Similarität oder Identität). In Abwesenheit einer nicht-spezifischen Bindung wird die im Wesentlichen gleichartige Sequenz oder Sonde nicht an die zweite nicht-komplementäre Zielsequenz hybridisieren.
  • Die Ausdrücke "prozentuale Identität" bzw. "Prozentwert der Identität" und "%-Identität", wie sie auf Polynucleotid-Sequenzen angewendet werden, beziehen sich auf den Prozentwert der Restübereinstimmungen zwischen wenigstens zwei Polynucleotid-Sequenzen, die unter Verwendung eines standardisierten Algorithmus angeordnet werden. Ein derartiger Algorithmus kann in standardisierter und reproduzierbarer Weise Lücken in die Sequenzen einsetzen, die verglichen werden, um eine Anordnung zwischen zwei Sequenzen zu optimieren und dadurch einen bedeutungsvolleren Vergleich der zwei Sequenzen zu erreichen. Der Prozentwert der Identität zwischen Polynucleotid-Sequenzen kann bestimmt werden, indem die Default-Parameter des CLUSTAL V-Algorithmus verwendet werden, wie sie in das MegAlign®-Version 3.12e-Sequenzanordnungsprogramm eingearbeitet sind. Dieses Programm ist Teil des LASERGENE-Software-Pakets, einem Satz molekularbiologischer Analyseprogramme (DNASTAR, Madison, WI). CLUSTAL V wird in Higgins und Sharp, CABIOS 5: 151–153, 1989, und in Higgins et al., CABIOS 8: 189–19, 1992, beschrieben. Prozentuale Identität bzw. Prozentwert der Identität wird von CLUSTAL V als der "Prozentwert der Gleichartigkeit" bzw. "Prozentwert der Similarität" zwischen angeordneten Polynucleotid-Sequenz-Paaren angegeben. Alternativ wird eine Reihe von üblicherweise verwendeten und frei zugänglichen Sequenz-Vergleichsalgorithmen vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410, 1990), bereitgestellt. Dieses ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, einschließlich NCBI, Bethesda, MD, und unter http:/Iwww.ncbi.nim.nih.gov/blast/.
  • Die BLAST-Software-Reihe beinhaltet verschiedene Sequenzanalyseprogramme, einschließlich "blastn", die verwendet werden, um eine bekannte Polynucleotid-Sequenz mit anderen Polynucleotid-Sequenzen aus einer Vielzahl von Datenbanken vergleichend anzuordnen. Auch verfügbar ist ein Werkzeug, das "BLAST 2 Sequences" genannt wird, das für einen direkten paarweisen Vergleich von zwei Nucleotid-Sequenzen eingesetzt wird. "BLAST 2 Sequences" ist zugänglich und kann interaktiv verwendet werden unter http:/www.ncbi.nim.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Das "BLAST 2 Sequences"-Werkzeug kann sowohl für blastn als auch blastp (unten diskutiert) eingesetzt werden. BLAST-Programme werden üblicherweise mit Lücke und anderen Parametern verwendet, die zum Default-Einstellen verwendet werden. Um z.B. zwei Nucleotid-Sequenzen zu vergleichen, kann man blastn mit der "BLAST 2 Sequences"-Werkzeug-Version 2.0.9 (07. Mai 1999), entweder unter Verwendung von Blossum 62-Matrix oder PAM250-Matrix, einem Lückegewicht von 40, 50, 60, 70 oder 80 und einem Längegewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwenden. Die prozentuale Identität kann über die Länge einer gesamten definierten Sequenz, z.B. wie sie durch eine bestimmte SEQ ID-Nummer definiert ist, gemessen werden oder kann über eine kürzere Länge, z.B. über die Länge eines Fragments, das aus einer größeren definierten Sequenz entnommen wurde, gemessen werden, z.B. ein Fragment mit wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 40, wenigsten 50, wenigstens 70, wenigstens 100 oder wenigstens 200 fortlaufenden Nucleotiden. Solche Längen sind nur beispielhaft, und es ist einzusehen, dass eine beliebige Fragmentlänge, die durch die hierin gezeigten Sequenzen offenbart wird, verwendet werden kann, um eine Länge zu beschreiben, über welche die prozentuale Identität gemessen werden kann. Nucleinsäure-Sequenzen, die keinen hohen Identitätsgrad zeigen, können dennoch für gleichartige Aminosäure-Sequenzen codieren, und zwar infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes. Es ist einzusehen, dass Änderungen in der Nucleinsäure-Sequenz unter Verwendung dieser Degeneriertheit durchgeführt werden können, um mehrere Nucleinsäure-Sequenzen zu produzieren, welche durch die Erfindung umfasst werden, die alle dasselbe oder im Wesentlichen dasselbe PDE10A-Polypeptid codieren.
  • Die Ausdrücke "Prozentidentität" und "prozentuale Identität" bzw. "%-Identität", wie sie auf Polypeptid-Sequenzen angewendet werden, beziehen sich auf den Prozentwert von Übereinstimmung an Resten zwischen wenigstens zwei Polypeptid-Sequenzen, die unter Verwendung eines standardisierten Algorithmus angeordnet sind. Verfahren zur Polypeptid-Sequenzanordnung sind gut bekannt. Einige Anordnungsmethoden berücksichtigen konservative Aminosäure-Substitutionen. Solche konservativen Substitutionen, die oben detaillierter erläutert sind, konservieren im Allgemeinen die Hydrophobie und Azidität an der Substitutionsstelle und konservieren auf diese Weise die Struktur und die Funktion des Polypeptids. Prozentuale Identität zwischen Polypeptid-Sequenzen kann unter Verwendung der Default-Parameter des CLUSTAL V-Algorithmus, wie er in das MegAlign®-Sequenzanordnungsprogramm eingebaut ist (DNASTAR, Madison, WI), bestimmt werden. Die PAM250-Matrix wird als Default-Restgewichtstabelle ausgewählt. Wie bei den Polynucleotid-Anordnungen, wird die prozentuale Identität durch CLUSTAL V als die "prozentuale Gleichartigkeit bzw. Similarität" bzw. "Prozent Gleichartigkeit" zwischen angeordneten Polypeptid-Sequenz-Paaren angegeben.
  • Alternativ kann die NCBI BLAST-Software-Reihe verwendet werden. Beispielsweise kann man für einen paarweisen Vergleich der zwei Polypeptid-Sequenzen die "BLAST 2 Sequences"-Tool-Version 2.0.9 (7. Mai 1999) mit blastp-Einstellung bei Default-Parametern verwenden. Solche Default-Parameter können z.B. bei Verwendung von Blossum 62-Matrix Score = 50 und Wortlänge = 3 sein. Die prozentuale Identität kann über die Länge einer gesamten definierten Polypeptid-Sequenz, z.B. wie sie durch eine bestimmte SEQ ID-Nummer definiert ist, gemessen werden oder kann über eine kürzere Länge gemessen werden, z.B. über die Länge eines Fragments, das aus einer größeren definierten Polypeptid-Sequenz genommen wurde, z.B. ein Fragment mit mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 70 oder mindestens 100 fortlaufenden Resten. Solche Längen sind nur beispielhaft, und es ist einzusehen, dass eine beliebige Fragmentlänge, die durch die hierin gezeigten Sequenzen, einschließlich in den Figuren und im Sequenzprotokoll, getragen wird, verwendet werden kann, um eine Länge zu beschreiben, über die prozentuale Identität gemessen werden kann.
  • Mit einem "Wirt" ist eine transgene Zelle (z.B. Säuger-, Bakterien-, Insektenzelle) oder ein Tier (z.B. ein nicht-menschliches Säugetier) gemeint, das mit einem heterologen Polynucleotid transfiziert ist und fähig ist, dieses zu exprimieren.
  • Ein "heterologes" Polynucleotid ist eins, das im Genom der Wirtszelle fremd oder nicht natürlich vorkommend oder nicht-natürlich positioniert ist.
  • "Hybridisierung" bezieht sich auf den Prozess, durch den ein Polynucleotidstrang unter definierten Hybridisierungsbedingungen durch Basenpaarung an einen komplementären Strang anlagert. Spezifische Hybridisierung ist ein Hinweis, dass zwei Nucleinsäure-Sequenzen einen hohen Grad an Identität teilen. Spezifische Hybridisierungskomplexe bilden sich unter zulässigen Annealing-Bedingungen und bleiben nach dem "Wasch"-Schritt (nach den "Wasch"-Schritten) hybridisiert. Der Waschschritt (die Waschschritte) ist (sind) bei der Bestimmung der Stringenz des Hybridisierungsprozesses besonders wichtig, wobei stringentere Bedingungen weniger eine nicht-spezifische Bindung zulassen, d.h., eine Bindung zwischen Paaren von Nucleinsäuresträngen, die nicht perfekt zusammenpassen. Permissive Bedingungen für ein Annealing von Nucleinsäure-Sequenzen sind von einem Fachmann routinemäßig bestimmbar und können unter Hybridisierungsexperimenten übereinstimmen, wohingegen Waschbedingungen unter Experimenten variiert werden können, um die gewünschte Stringenz, und daher die gewünschte Hybridisierungsspezifität, zu erreichen. Permissive Annealing-Bedingungen treten z.B. bei 68°C in Gegenwart von etwa 6 × SSC, etwa 1% (G/V) SDS und etwa 100 pg/ml denaturierter Lachssperma-DNA auf.
  • Im Allgemeinen wird Hybridisierungsstringenz zum Teil bezüglich der Temperatur, bei der der Waschschritt durchgeführt wird, ausgedrückt. Im Allgemeinen werden solche Waschtemperaturen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C bis 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegen. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz zu einer perfekt gepaarten Sonde hybridisieren. Eine Gleichung zur Errechnung von Tm und Bedingungen für eine Nucleinsäurehybridisierung sind gut bekannt und können bei Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3, Cold Spring Habor Press, Plainview, NY, gefunden werden; siehe speziell Bd. 2, Kapitel 9.
  • Bedingungen hoher Stringenz zur Hybridisierung zwischen Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung umfassen Waschbedingungen von etwa 55–68°C in Gegenwart von etwa 0,2–1,0 × SSC und etwa 0,1% SDS für etwa 1 Stunde.
  • Im Allgemeinen können Hybridisierungsreaktionen bei Temperaturen von etwa 65°C, 60°C, 55°C oder 42°C durchgeführt werden. Die SSC-Konzentration kann auch von etwa 0,1 bis 2 × SSC variiert werden, wobei SDS mit etwa 0,1% vorliegt. Typischerweise werden Blockierungsreagentien verwendet, um eine nicht-spezifische Hybridisierung zu blockieren. Solche Blockierungsreagentien umfassen z.B. denaturierte Lachssperma-DNA mit etwa 100–200 pg/ml. Unter bestimmten Umständen, z.B. für RNA:DNA-Hybridisierungen, kann auch ein organisches Lösungsmittel, z.B. Formamid, bei einer Konzentration von etwa 35–50 Vol.-% verwendet werden. Nützliche Variationen bei diesen Waschbedingungen werden dem Fachmann leicht klar sein. Eine Hybridisierung, insbesondere unter Bedingungen hoher Stringenz, deutet auf eine evolutionäre Gleichartigkeit zwischen den Nucleotiden hin, was ein starker Hinweis für eine ähnliche Rolle für die Nucleotide und ihre codierten Polypeptide ist.
  • Der Ausdruck "Hybridisierungskomplex" bezieht sich auf einen Komplex, der zwischen zwei Nucleinsäure-Sequenzen durch Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen gebildet wird. Ein Hybridisierungskomplex kann zwischen Sequenzen, die in Lösung vorliegen, gebildet werden oder kann zwischen einer Nucleinsäure-Sequenz, die in Lösung vorliegt, und einer anderen Nucleinsäure-Sequenz, die auf einem festen Träger (z.B. Papier, Membranen, Filter, Chips, Stifte oder Glasobjektträger) immobilisiert ist, gebildet werden.
  • Mit "isoliert oder gereinigt" ist vom natürlichen Zustand "durch Menschenhand" verändert gemeint. Wenn ein Polynucleotid oder Polypeptid in der Natur vorliegt, dann ist es "isoliert oder gereinigt", wenn es verändert wurde und/oder aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde. Beispielsweise ist ein "isoliertes oder gereinigtes" Polynucleotid von anderen Polynucleotiden, mit denen es in der Natur assoziiert ist, getrennt. Beispielsweise ist eine cDNA-Sequenz, die von einer Intron-Sequenz, die normalerweise mit der codierenden Sequenz assoziiert ist, entfernt ist, "isoliert oder gereinigt". Eine "isolierte oder gereinigte" Polynucleotid-Sequenz kann in Wirtszellen in Kultur oder in ganze Organismen zur transienten oder stabilen Expression eingeführt werden und noch "isoliert und gereinigt" sein, da das Polynucleotid nicht in seiner natürlich vorkommenden Form oder Umgebung sein würde. Allerdings sind Polynucleotid-Sequenzen als Mitglieder von cDNA-Bibliotheken von dem, was mit "isoliert oder gereinigt" bezeichnet wird, ausgeschlossen. Ein "isoliertes oder gereinigtes" Polypeptid ist von wenigstens einer zellulären Komponente, mit der es in der Natur assoziiert ist, getrennt. Vorzugsweise ist das Polypeptid zu wenigstens 60% frei von anderen Komponenten, bevorzugter zu mindestens 75% frei, und am bevorzugtesten zu mindestens 90% frei.
  • Mit "moduliert" ist erhöht oder verringert (einschließlich einer vollständigen Eliminierung) gemeint.
  • "Funktionell verknüpft" bezieht sich auf die Situation, in der eine erste Nucleinsäure-Sequenz in eine funktionelle Beziehung mit einer zweiten Nucleinsäure-Sequenz gestellt ist. Beispielsweise ist ein Promotor funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor unter Regulierung der Transkription der codierenden Sequenz wirkt. Im Allgemeinen können funktionell verknüpfte DNA-Sequenzen in enger Nachbarschaft sein oder fortlaufend sein und, wenn erforderlich, zwei für Protein codierende Regionen im selben Leseraster verbinden.
  • "Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf beliebige RNA (z.B. mRNA)-, RNA-artige, DNA (z.B. cDNA oder genomische)- oder DNA-artige Sequenzen, einschließlich, aber ohne Beschränkung, Einzelstrang-, Doppelstrang- und Dreifachstrang-Sequenzen, Sense- oder Antisense-Stränge, Sequenzen, die unter Verwendung von Nucleotidanaloga gebildet wurden, Hybridmoleküle, die RNA und DNA umfassen, und RNA oder DNA, die modifizierte Basen enthalten. Das Polynucleotid kann natürlich auftretend oder synthetisiert sein.
  • Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf eine Aminosäure-Sequenz, eine Oligopeptid-, Peptid-, Polypeptid- oder Protein-Sequenz oder auf ein Fragment einer beliebigen dieser und auf natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle. Er beinhaltet Aminosäure-Sequenzen, die entweder durch natürliche Prozesse, z.B. posttranslationales Prozessieren, oder durch chemische Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, modifiziert wurden (siehe z.B. Proteins – Structure and Molecular Properties, Hrsg. Creighton, W.H. Freeman und Co., New York, NY, 2. Ausgabe, 1993; Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Hrsg. Johnson, Academic Press, New York, NY, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol., 182: 626–46, 1990; und Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663: 48–62, 1992). Bekannte Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung der Häm-Gruppierung, kovalente Bindung eines Nucleotids oder Nucleotid-Derivats, eines Lipids oder Lipid-Derivats oder von Phosphotidylinositol, Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung, Bildung von Cystin oder Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, protolytische Behandlung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Amionsäuren an Proteine, z.B. Arginylierung und Ubiquitinierung.
  • Mit "PDE10A-Aktivität" ist eine PDE10A-vermittelte Hydrolyse von cAMP und/oder cGMP in vitro, in vivo oder in situ gemeint.
  • Mit einem "selektiven" PDE10A-Inhibitor ist ein Agens gemeint, das PDE10A-Aktivität mit einer IC50, die wenigstens 10 Mal niedriger ist als die, die zur Inhibierung anderer PDEs beobachtet wird, hemmt.
  • Eine "Substitution" bezieht sich auf den Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren oder Nucleotide durch andere Aminosäuren bzw. Nucleotide.
  • Mit "submaximaler" Aktivierung von Adenylatcyclase oder Guanylatcyclase ist Verabreichen einer Verbindung mit einer Konzentration gemeint, die eine Zunahme an cAMP bzw. cGMP erreicht, die etwa 10–50%, vorzugsweise etwa 20–25%, des Werts ist, der durch die maximal wirksame Konzentration der Verbindung erreicht wird.
  • "Transformation" oder "Transfektion" beschreibt einen Prozess der genetischen Modifikation, durch welchen heterologe DNA eintritt und eine Empfängerzelle zur Expression der heterologen DNA fähig macht. Eine Transformation kann in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle nach verschiedenen Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erfolgen. Die Methode wird auf der Basis des Zelltyps, der transformiert wird, ausgewählt und umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, virale Infektion, Elektroporation, Hitzeschock, Lipofektion und Partikelbeschuss. Die Ausdrücke "transformierte Zellen" oder "transfizierte Zellen" umfassen stabil transformierte Zellen, in denen die insertierte DNA entweder als autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms zur Replikation fähig ist, sowie transient transformierte oder transfizierte Zellen, die die insertierte DNA oder RNA für begrenzte Zeiträume exprimieren. Alle derartigen transformierten oder transfizierten Zellen werden als "transgen" bezeichnet.
  • Eine "Variante" einer bestimmten Nucleinsäure-Sequenz ist als eine Nucleinsäure-Sequenz definiert, die wenigstens 40% Sequenzidentität zu der bestimmten Nucleinsäure-Sequenz über eine bestimmte Länge von einer der Nucleinsäure-Sequenzen hat, wobei blastn mit "BLAST 2 Sequences"-Tool-Version 2.0.9, eingestellt auf Default-Parameter, verwendet wird. Solche Sequenzen können über eine bestimmte definierte Länge, z.B. mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 98% oder mehr, Sequenzidentität haben. Eine Variante kann z.B. als eine "Allel"- (wie oben definiert), "Spleiß"-, "Spezies"- oder "polymorphe" Variante beschrieben werden. Eine Spleißvariante kann deutliche Identität zu einem Referenzmolekül haben, wird aber im Allgemeinen durch alternatives Spleißen von Exonen während einer mRNA-Bearbeitung eine größere oder kleinere Anzahl von Polynucleotiden haben. Das entsprechende Polypeptid kann zusätzliche funktionelle Domänen besitzen oder ihm können Domänen fehlen, die im Referenzmolekül vorhanden sind. Speziesvarianten sind Polynucleotid-Sequenzen, die von einer Spezies zu einer anderen variieren. Die resultierenden Polypeptide werden im Allgemeinen im Vergleich zu einem anderen signifikante Aminosäureidentität haben. Eine polymorphe Variante ist eine Variation in der Polynucleotid-Sequenz eines besonderen Gens zwischen Individuen einer gegebenen Spezies. Polymorphe Varianten können auch "Einzel-Nucleotid-Polymorphismen" (SNPs) umfassen, in denen die Polynucleotid-Sequenz um eine Nucleotidbase variiert. Das Vorliegen von SNPs kann z.B. für eine bestimmte Population, einen Krankheitszustand oder eine Neigung für einen Krankheitszustand indikativ sein.
  • Weitere Merkmale und Vorzüge der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich. Obgleich die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführugsformen beschrieben wird, wird es einzusehen sein, dass andere Änderungen und Modifikationen, die durchgeführt werden können, auch Teil dieser Erfindung sind und auch im Rahmen der beigefügten Ansprüche liegen. Diese Beschreibung soll Äquivalente, Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, einschließlich Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die innerhalb der bekannten oder gängigen Praxis auf dem Fachgebiet liegen und die ohne übermäßiges Experimentieren ermittelt werden können, abdecken. Eine zusätzliche Anleitung bezüglich der Herstellung und Verwendung von Nucleinsäuren und Polypeptiden wird in Standardwerken der Molekularbiologie, der Proteinwissenschaft und Immunologie gefunden (siehe z.B. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, NY, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Molecular Cloning, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Herausg. Ausubel et al., John Wiley and Sons; Current Protocols in Human Genetics, Herausg. Dracopoli et al., John Wiley and Sons; Current Protocols in Protein Science, Herausg. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons; und Current Protocols in Immunology, Herausg. John E. Coligan et al., John Wiley and Sons). Alle hierin genannten Publikationen gelten durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit als hier aufgenommen.
  • Beschreibung der Figur
  • 1A zeigt die Polynucleotid-Sequenz, die für Ratten-PDE10A (SEQ ID NO:1) codiert. 1B zeigt die Aminosäure-Sequenz für das Ratten-PDE10A-Polypeptid (SEQ ID NO:2).
  • Detaillierte Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Screening-Assay auf Zellbasis bereit, der mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums verwendet, um Agentien zu identifizieren, die PDE10A-Aktivität auf dem zellulären Level inhibieren. Unter der Annahme des bestätigten hohen Levels an PDE10A in mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums (wie in Beispiel 1 unten näher beschrieben) sind diese Zellen ausgezeichnete Kandidaten für eine Verwendung in einem Assay auf Zellbasis zur Identifizierung von Inhibitoren der PDE10A-Aktivität. Solche Inhibitoren sind z.B. einsetzbar, um Bewegungsstörungen oder Gemütsstörungen, Angst, Psychosen, Drogen- bzw. Arzneimittelabhängigkeit und Störungen in Form von Symptomen von Wahrnehmungsdefiziten, einsetzbar, wie es außerdem in der vorläufigen US-Anmeldung 60/285 148 beschrieben wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Ratten-PDE10A-Polynucleotid- und -Polypeptid-Sequenzen.
  • Assay auf Zellbasis zur Identifizierung von PDE10A-Inhibitoren
  • Der Assay der Erfindung auf Zellbasis resultiert aus zwei Entdeckungen, die in den Beispielen unten näher beschrieben werden. Erstens, Papaverin ist ein selektiver PDE10A-Inhibitor. Und zweitens, die Verabreichung von Papaverin an mittelgroße Projektionsneuronen produziert ein eindeutiges Änderungsprofil für die Level von cAMP und cGMP. Dieses eindeu tige Profil zeigt, dass andere Agentien, die dieselbe Kombination von Änderungen zu cyclischen Nucleotiden in mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums produzieren, auch als PDE10A-Inhibitoren identifiziert werden. Zur Durchführung des Assays werden mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums verwendet. Die Zellen können als Primärkultur hergestellt werden (siehe z.B. Ventimiglia et al., Eur. J. Neurosci. 7: 213–22, 1995). Alternativ kann eine immortalisierte Zelllinie von mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums verwendet werden (Ehlich et al., Exp. Neurol. 167: 215–26, 2001; Cattaneo und Conti, J. Neuroscience Res. 53: 223–34, 1998; Wainwright et al., J. Neuroscience 15: 676–88, 1995).
  • Für eine primäre Zellkultur werden die Neuronen präpariert, durch Präparieren des Gehirns aus einem Säugerembryo (z.B. ein E17-Ratten- oder Maus-Embryo), Dissoziieren des Gewebes in Einzelzellsuspension und Plattieren von Zellen in geeigneten Gefäßen, z.B. Platten mit mehreren Vertiefungen. Wenn es gewünscht wird, kann das Vorliegen von mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums in der Präparation bestimmt werden, indem die GABA-Immunreaktivität (Ventimiglia et al., supra) getestet wird; die Expression von PDE10A kann z.B. durch Western-Blot- oder RNase-Schutzassay (siehe Beispiel 3 unten) bestätigt werden.
  • Ein Beispiel des Assayprotokolls ist wie folgt. Eine primäre Zellkultur von mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums (z.B. Ratte) am Tag 4–5 in vitro wird mit Ca2+/Mg2+-freier, Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und für etwa 1 Stunde in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 30 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml Dextrose und 5 mM MgCl2 enthält, vorinkubiert. Testagentien werden dann mit den Zellen in demselben Puffer bei 37°C für etwa 20 min inkubiert.
  • Um auf Änderungen beim cAMP zu untersuchen, wird die Neuronenkultur auch mit einer submaximalen Konzentration einer Verbindung, die Adenylatcyclase stimuliert (z.B. 1 μM Forskolin), inkubiert. Um auf Änderungen bei cGMP zu untersuchen, wird die Neuronenkultur mit einer submaximalen Konzentration einer Verbindung, die Guanylatcyclase stimuliert (z.B. 100 μM Natriumnitroprussid (SNP)), inkubiert. Eine submaximale Konzentration einer Verbindung, die die Erzeugung von cyclischen Nucleotiden stimuliert, ist eine Konzentration, die 10–50%, vorzugsweise 20–25%, der maximal effektiven Konzentration erzeugt. Die Verbindung kann während der Testagens-Inkubation oder über einen Zeitraum, der auf die Testagens-Inkubation folgt (z.B. 1–5 min), verabreicht werden.
  • Zellen werden lysiert, und die geeigneten cAMP- und cGMP-Level werden unter Verwendung von Standardverfahren im Zelllysat gemessen. Beispielsweise können die cAMP- und cGMP-Level unter Verwendung von Szintillationsnäherungs-Assay (SPA)-Kits (Kat. Nr. RPA 540 bzw. RPA 559, Amersham, Piscataway, NJ) gemessen werden. Testagentien werden bei verschiedenen Konzentrationen untersucht, so dass der EC200-Wert bestimmt werden kann. Der EC200-Wert ist als die Konzentration an Testagens definiert, die die cAMP- oder cGMP-Level im Vergleich zu dem Level an cAMP oder cGMP, der in Lysaten aus Zellen, die nicht mit dem Testagens behandelt wurden, gemessen wurde, um 200% erhöht. Idealerweise werden getrennte Proben von Zellen verwendet, um die Cyclasen zu stimulieren und cyclische Nucleotidkonzentrationen zu analysieren. Allerdings kann eine Stimulation von Adenylatcyclase und Guanylatcyclase in einer einzelnen Probe von Zellen durchgeführt werden, das Zelllysat kann in zwei Proben aufgeteilt werden, und dann können cAMP und cGMP getrennt in diesen zwei Lysaten gemessen werden.
  • Wenn eine primäre Kultur aus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums verwendet wird und die beispielhaften, oben beschriebenen Assaybedingungen verwendet werden, wird ein Testagens als ein PDE10A-Inhibitor identifiziert, wenn er eine Zunahme an cAMP und cGMP verursacht, wobei das Verhältnis von cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert im Bereich von 1,75–5,25, vorzugsweise 2,5–4,5, bevorzugter 3,0–4,0, liegt. Wenn die bestimmten Zellen oder die Assaybedingungen von den oben genannten abweichen, dann kann der Bereich von cAMP-EC200/cGMP-EC200, der anzeigt, dass das Agens ein PDE10A-Inhibitor ist, bestimmt werden, indem Papaverin als positive Kontrolle unter den geeigneten Bedingungen getestet wird. Ein Agens wird als PDE10A-Inhibitor identifiziert, wenn es ein Verhältnis cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert produziert, das mit dem Wert für Papaverin vergleichbar ist (d.h., um nicht mehr als 50% variiert).
  • Das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung kann alternative Standard-Zellherstellungsprotokolle (Misgeld und Dietzel, Brain Res. 492: 149–57, 1989; Shi und Raypon, J. Neurosci. 14: 4548–60, 1994; Mao und Wang, Mol. Brain. Res. 86: 125–37, 2001; Snyder et al., J. Neuroscience 20: 4480–88, 2000), alternative Standardmethoden zur Stimulierung cyclischer Nucleotidbildung (Svenningsson et al., Neuroscience 84: 223–28, 1998; Glass und Felder, J. Neurosci. 17: 5327–33, 1997) und/oder alternative Standardmethoden zur cyclischen Nucleotid-Detektion (Villegas und Brunton, Analytical Biochem. 235: 102–3, 1996; Corbin et al., Methods Enzymol. 159: 74–82, 1988) verwenden.
  • Obgleich der Assay der vorliegenden Erfindung auf Zellbasis an Testagentien durchgeführt werden kann, für die keine Vorinformationen bezüglich einer PDE10A-Inhibierung bekannt sind, ist es bevorzugt, dass der Assay auf Zellbasis als Sekundärassay verwendet wird, um zu bestätigen, dass Agentien, die durch in vitro-Tests als PDE10A-Inhibitoren identifiziert wurden, auch auf zellulärem Level PDE10A inhibieren. Vorzugsweise sind die Agentien als selektive PDE10A-Inhibitoren identifiziert. Als eine Alternative zum in vitro-Vorscreening können Agentien auch durch in vitro-Untersuchung nach Identifizierung im Assay auf Zellbasis als PDE10A-Inhibitoren bestätigt werden.
  • Für in vitro-Tests würden Agentien als selektive PDE10A-Inhibitoren identifiziert werden, wenn die IC50-Werte zur Inhibierung von anderen PDEs als PDE10A wenigstens 10fach höher waren als der IC50-Wert für die PDE10A-Inhibierung. Um vergleichbare IC50-Werte zu erreichen, werden alle PDE-Assays bei cyclischen Nucleotidsubstratkonzentrationen durchgeführt, die äquivalent proportional zu der Km des cyclischen Nucleotids für jedes Enzym sind. Ein Screening-Typ zur Identifizierung von selektiven PDE10A-Modulatoren verwendet native Enzyme, die aus Gewebe isoliert wurden, oder rekombinante Enzyme, die aus transfizierten Wirtszellen, z.B. Sf9-Insektenzellen (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–07, 2000), Hefezellen (Loughney et al., US-Pat. Nr. 5 932 465) oder COS-7-Zellen (Yuasa, J. Biol. Chem. 275: 31469–79, 2000) isoliert wurden. Vorzugsweise ist das PDE10A-Enzym humanes (z.B. Loughney et al., US-Pat. Nr. 5 932 465, Lanfear et al., EP 967284 ), von der Maus (z.B. Lanfear et al., EP 967294 ) oder der Ratte (z.B. SEQ ID NO:2).
  • PDE10A-Aktivität wird z.B. als Hydrolyserate eines geeigneten Substrats, [3H]cAMP oder [3H]cGMP, gemessen. Diese Aktivität wird z.B. durch Methoden auf SPA-Basis (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–47, 2000; Phillips et al., WO 00/40733, und Thompson et al., Biochem. 18: 5228, 1979 (wie modifiziert unter Verwendung des Produkts, Code TRKQ7090/7100, Amersham Int'l Ltd., Buckhamshire, England)) gemessen. Kurz, Proben, die das PDE10A-Enzym enthalten, werden mit einem cAMP- oder cGMP-Substrat (Sigma Chemical), von dem ein Teil (z.B. 1/4 bis 1/2) mit 3H markiert ist (Amersham), in Kontakt gebracht. Reaktionen werden z.B. in Mikrotiterplatten (z.B. Microfluor®-Platten, Dynex Technologies, Chantilly, VA) durchgeführt und durch Zusatz von Yttriumsilikat SPA-Perlen (Amersham), die einen Überschuss an nicht-markiertem cyclischen Nucleotid enthalten, beendet. Nachdem sich die Perlen im Dunklen absetzen gelassen wurden, werden die Platten mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (z.B. TopCount®, Packard, Meriden, CT) gelesen.
  • PDE10A-Aktivität kann auch durch Detektion von 32P-Phosphat, das aus 32P-cAMP oder 32P-cGMP freigesetzt wird (wie es z.B. in Loughney et al., J. Biol. Chem. 271: 796–806, 1996, und Loughney, US-Pat. Nr. 5 932 465, beschrieben ist) oder unter Verwendung von Antikörpern zur Unterscheidung zwischen den PDE-Substraten cGMP oder cMP und ihren hydrolysierten Produkten (unter Verwendung von z.B. FlashPlateTM-Technik, NEN® Life Sciences Products, Boston, MA) analysiert werden.
  • Als Alternative zum Analysieren der katalytischen PDE10A-Aktivität können Agentien als PDE10A-positive Modulatoren oder negative Modulatoren (Antagonisten) identifiziert werden, wenn sie die katalytische PDE10A-Aktivität indirekt modulieren, z.B. via posttranslationaler Modifikation (z.B. Phosphorylierung), Modulation von allosterischer Ligandenbindung (z.B. über die GAF-Domäne (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–07, 2000)) oder durch Bindung an PDE10A selbst, entweder an einer katalytischen oder allosterischen regulatorischen Stelle. Verfahren zur Bestimmung der PDE10A-Phosphorylierung und der allosterischen Ligandenbindung sind in der Literatur beschrieben (siehe z.B. McAllister-Lucas et al., J. Biol. Chem. 270: 30671–79, 1995, und Corbin et al., Eur. J. Biochem. 267: 2760–67, 2000).
  • Die Testagentien, die zum in vitro-Screening und im Assay der vorliegenden Erfindung auf Zellbasis eingesetzt werden, können individuell ausgewählt werden oder aus einer Verbindungsbibliothek erhalten werden. Solche Agentien umfassen Peptide, aus der kombinatorischen Chemie stammende Molekül-Bibliotheken, die aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration hergestellt sind, Phosphopeptide, Antikörper und kleine organische und anorganische Verbindungen. Bibliotheken umfassen biologische Bibliotheken, Bibliotheken natürlicher Verbindungen, Peptoid-Bibliotheken (Bibliotheken von Molekülen, die Funktionen von Peptiden haben, aber mit neuen, Nicht-Peptid-Hauptketten, die gegenüber einem enzymatischen Abbau resistent sind, aber bioaktiv bleiben) (siehe z.B. Zuckermann, J. Med. Chem. 37: 2678–85, 1994), räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken, synthetische Bibliotheksverfahren, die eine Entfaltung erfordern, das "eine Perle-eine Verbindung"-Bibliotheksverfahren und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung einer Affinitätschromatographie-Selektion.
  • Beispiele für Verfahren zur Synthese von Molekül-Bibliotheken können auf dem Fachgebiet gefunden werden, z.B. in DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6909, 1993; Erd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al., Science, 261: 1303, 1995; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994; und Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233, 1994.
  • Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (z.B. Houghten, Biotechniques, 13: 412–421, 1992) oder an Perlen (Lam, Nature 354: 82–841, 1991), auf Chips (Fodor, Nature 364: 555–556, 1993), Bakterien oder Sporen (Ladner, US-Patent Nr. 5 223 409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865–1869, 1992) oder auf Phagen (Scott et al., Science 249: 386–390, 1990; Devlin, Science 249: 404–406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 6378–6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222: 301–310, 1991; Ladner, supra) präsentiert werden.
  • Die codierende Nucleotid-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz für Ratten-PDE10A
  • Die Erfindung umfasst isolierte oder gereinigte Ratten-PDE10A-Sequenz, z.B. wie sie in 1B (SEQ ID NO:2) gezeigt ist.
  • Die Erfindung umfasst auch codierende Nucleotid-Sequenzen, die eine Ratten-PDE10A codieren, wie sie z.B. in 1A gezeigt sind.
  • Die Nucleinsäure-Sequenzen, die für die Ratten-PDE10A codieren, können unter Verwendung einer partiellen Nucleotid-Sequenz und unter Anwendung verschiedener Verfahren auf PCR-Basis, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ausgedehnt werden, um stromaufwärts gelegene Sequenzen, z.B. Promotoren und regulatorische Elemente, zu detektieren. Beispielsweise verwendet ein Verfahren, das angewendet werden kann, Restriktionsstellen-PCR, universelle und verschachtelte Primer, um eine unbekannte Sequenz aus genomischer DNA innerhalb eines Klonierungsvektors zu amplifizieren (siehe z.B. Sarkar, PCR Methods Applic. 2: 318–322, 1993). Ein anderes Verfahren, inverse PCR, verwendet Primer, die in divergente Richtungen verlängern, um eine unbekannte Sequenz aus einer zirkularisierten Matrize zu verlängern. Die Matrize stammt aus Restriktionsfragmenten, die einen bekannten genomischen Locus und umgebende Sequenzen umfassen (siehe z.B. Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16: 8186, 1988). Ein drittes Verfahren, Capture-PCR, involviert die PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten, die zu bekannten Sequenzen in künstlicher Chromosomen-DNA bei Menschen und Hefe be nachbart sind (siehe z.B. Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111–119, 1991). Bei diesem Verfahren können mehrere Restriktionsenzym-Verdaue und Ligationen verwendet werden, um eine "engineered" doppelsträngige Sequenz in eine Region unbekannter Sequenz vor Durchführung der PCR zu insertieren.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Polynucleotid der Erfindung in rekombinante DNA-Moleküle kloniert werden, welche eine Expression des Ratten-PDE10A in geeigneten Wirtszellen steuern. Die Nucleotid-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, genetisch verändert werden, um die für PDE10A codierenden Sequenzen für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Modifikation der Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts, zu verändern.
  • DNA-Shuffling durch statistische Fragmentierung und PCR-Neuanordnung von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden kann verwendet werden, um die Nucleotid-Sequenzen technisch zu verändern. Beispielsweise kann eine Oligonucleotid-vermittelte, ortsspezifische Mutagenese eingesetzt werden, um Mutationen einzuführen, die neue Restriktionsstellen schaffen, Glykosylierungsmuster verändern, Kodonpräferenz verändern, Spleißvarianten produzieren, usw. In einer anderen Ausführungsform können Sequenzen, die für eine Ratten-PDE10A codieren, ganz oder teilweise unter Verwendung von chemischen Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden (siehe z.B. Caruthers et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 215–223, 1980; und Horn et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 225–232, 1980). Alternativ kann die Ratten-PDE10A selbst oder ein Fragment davon unter Anwendung chemischer Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann eine Peptidsynthese unter Verwendung verschiedener Festphasentechniken durchgeführt werden (siehe z.B. Roberge et al., Science 269: 202–204, 1995). Eine automatisierte Synthese kann unter Verwendung des ABI 431A-Peptid-Synthesizers (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) erreicht werden. Zusätzlich kann die Aminosäure-Sequenz von Ratten-PDE10A oder ein beliebiger Teil davon während einer direkten Synthese verändert werden und/oder mit Sequenzen aus anderen Proteinen oder einem Teil davon kombiniert werden, um ein Varianten-Polypeptid zu produzieren. Das Peptid kann im Wesentlichen durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden (siehe z.B. Chiez und Regnier, Methods Enzymol. 182: 392–421, 1990). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder durch Sequenzierung bestätigt werden (siehe z.B. Creighton, Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York, NY, 1984).
  • Expressionsvektoren und Wirtszellen
  • Um eine biologisch aktive Ratten-PDE10A zu exprimieren, kann die Nucleotid-Sequenz, die für die Ratten-PDE10A codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt werden, d.h., in einen Vektor, der die notwendigen Elemente für eine transkriptionale und translationale Kontrolle der insertierten codierenden Sequenz in einem geeigneten Wirt enthält. Die se Elemente enthalten regulatorische Sequenzen, z.B. Enhancer, konstitutive und induzierbare Promotoren und 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, die aus dem Vektor stammen und/oder den Polynucleotid-Sequenzen, die für eine Ratten-PDE10A codieren. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Spezifische Initiationssignale können auch verwendet werden, um eine effizientere Translation von Sequenzen zu erreichen, die für das PDE10A-Polypeptid codieren. Solche Signale umfassen das ATG-Initiationskodon bzw. ATG-Startkodon und angrenzende Sequenzen, z.B. die Kozak-Sequenz. In Fällen, in denen Sequenzen, die für eine Ratten-PDE10A codieren, und ihr Startkodon und stromaufwärts gelegene regulatorische Sequenzen in den geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, können keine zusätzlichen transkriptionalen oder translationalen Kontrollsignale benötigt werden. Wenn allerdings nur codierende Sequenz oder ein Fragment davon insertiert wird, sollten exogene translationale Kontrollsignale, die ein "Im-Raster-ATG-Startkodon" umfassen, durch den Vektor bereitgestellt werden. Exogene translationale Elemente und Startkodons können unterschiedlichen Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs. Die Expressionseffizienz kann durch den Einschluss von Enhancern, die für das bestimmte Wirtszellsystem, das verwendet wird, geeignet sind, verstärkt werden (siehe z.B. Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125–162, 1994). Im Licht dieser Offenbarung können Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die für ein PDE10A-Polypeptid codieren, und geeignete transkriptionale und translationale Kontrollelemente enthalten. Diese Verfahren umfassen in vitro-DNA-Rekombinationstechniken, Synthesetechniken und in vivo-Genrekombination (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, Kap. 4, 8 und 16–17, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, Kap. 9, 13 und 16, 1995). Es kann eine Vielzahl von Expressions-Vektor/Wirts-Systemen verwendet werden, die Sequenzen, die für eine Ratten-PDE10A codieren, enthalten und exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroorganismen, z.B. Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind; Hefe, die mit Hefe-Expressionsvektoren (z.B. Episome, chromosomale Elemente) transformiert ist; Insektenzellsysteme, die mit viralen Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus, Paponavirus, Yaccinia, Adenovirus, Pockenvirus, Tollwutvirus und Retrovirus) infiziert sind; Planzenzellsysteme, die mit viralen Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV oder Tabakmosaikvirus, TMV), mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. Ti oder pBR322-Plasmide) transformiert sind oder Tierzellsystemen. Die Erfindung ist durch die verwendeten Wirtszellen nicht beschränkt.
  • In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Klonierungs- und Expressionsvektoren (in Abhängigkeit von der für Polynucleotid-Sequenzen, die für die Ratten-PDE10A codieren, vorgesehenen Verwendung ausgewählt werden. Beispielsweise kann eine Routineklonierung, Subklonierung und Ausbreitung von Polynucleotid-Sequenzen, die für das Ratten-PDE10A- Polypeptid codieren, erreicht werden, indem ein multifunktioneller E. coli-Vektor, wie z.B. pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA) oder pSport1-Plasmid (Life Technologies, Gaithersburg, MD) verwendet wird. Eine Ligation von Sequenzen, die für das Ratte-PDE10A-Polypeptid codieren, in die Mehrfachklonierungsstellen unterbricht das lacZ-Gen, was ein colorimetrisches Screeningverfahren zur Identifizierung von transformierten Bakterien, die rekombinante Moleküle enthalten, ermöglicht. Außerdem können diese Vektoren für eine in vitro-Transkription, Didesoxysequenzierung, Einzelstrang-Wiedergewinnung mit Helferphage und Schaffung von verschachtelten Deletionen in der klonierten Sequenz einsetzbar sein (siehe z.B. Van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509, 1989). Wenn große Mengen an PDE10A-Polypeptid benötigt werden, z.B. zur Produktion von Antikörpern, können Vektoren, die eine Expression von PDE10A-Polypeptid auf hohem Level steuern, eingesetzt werde. Z.B. können Vektoren, die den starken, induzierbaren T5- oder T7-Bakteriophagen-Promotor enthalten, verwendet werden.
  • Rekombinante Protein-Expression kann in Wirtsbakterien maximiert werden, indem ein genetischer Hintergrund bereitgestellt wird, bei dem die Wirtszelle ein verschlechtertes Vermögen hat, das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten (Gottesman et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 119–28, 1990). Alternativ kann die Polynucleotid-Sequenz so verändert werden, dass eine bevorzugte Kodonverwendung für eine spezifische Wirtszelle, z.B. E. coli, bereitgestellt wird (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111–18, 1992).
  • In Hefe-Expressionssystemen kann eine Reihe von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, z.B. alpha-Faktor-, Alkoholoxidase- oder PGH-Promotoren, verwendet werden, z.B. in der Hefe Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Außerdem steuern solche Vektoren entweder die Sekretion oder die intrazelluläre Retention von exprimierten Proteinen und ermöglichen den Einbau von Fremdsequenzen in das Wirtsgenom zur stabilen Vermehrung (siehe z.B. Ausubel, 1995; Bitter et al., Methods Enzymol. 153: 516–544, 1987; und Scorer et al., BioTechnology 12: 181–184, 1994). Zur Expression der Ratten-PDE10A können auch Pflanzensysteme verwendet werden. Die Transkription von Sequenzen, die für PDE10A-Polypeptid codieren, kann durch virale Promotoren gesteuert werden, z.B. die 35S- und 19S-Promotoren von CaMV, die allein oder in Kombination mit der omega-Leadersequenz aus TMV verwendet werden (Takamatsu, EMBO J. 6: 307–311, 1987). Alternativ können Pflanzen-Promotoren, z.B. die kleine Untereinheit von RUBISCO oder Hitzeschock-Promotoren, verwendet werden (siehe z.B. Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671–1680, 1984; Broglie et al., Science 224: 838–843, 1984; und Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17: 85–105, 1991). Diese Konstrukte können durch direkte DNA-Transformation oder durch Pathogenvermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden (siehe z.B. The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, NY, S. 191–196, 1992).
  • In Säugerzellen kann eine Reihe von Expressionssystemen auf viraler Basis eingesetzt werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, können Se quenzen, die für PDE10A-Polypeptid codieren, in einen Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Komplex ligiert werden, der aus dem späten Promotor und der dreiteiligen Leadersequenz besteht. Eine Insertion in eine nicht-essentielle E1- oder E3-Region des viralen Genoms kann verwendet werden, um ein infektiöses Virus zu erhalten, das Ratten-PDE10A in infizierten Wirtszellen exprimiert (siehe z.B. Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659, 1984). Zusätzlich können Transkriptionsenhancer, z.B. der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-Enhancer, verwendet werden, um eine Expression in Säugerwirtszellen zu erhöhen. Vektoren auf SV40-Basis oder EBV-Basis können auch für eine Proteinexpression auf hohem Level verwendet werden.
  • HACs, BACs oder YACs können auch verwendet werden, um größere DNA-Fragmente abzugeben, die in einem Plasmid enthalten sein können und aus einem Plasmid exprimiert werden können. Beispielsweise werden HACs mit etwa 6 kb bis 10 Mb konstruiert und über herkömmliche Abgabeverfahren (Liposome, polykationische Aminopolymere oder Vesikel) für therapeutische Zwecke abgegeben (siehe z.B. Harrington et al., Nat. Genet. 15: 345–355, 1997). Zur Langzeitproduktion von rekombinanten Proteinen in Säugersystemen ist eine stabile Expression der Ratten-PDE10A in Zelllinien bevorzugt. Beispielsweise können Sequenzen, die für Ratten-PDE10A codieren, in Zelllinien transformiert werden, indem Expressionsvektoren verwendet werden, welche virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen auf demselben oder einem getrennten Vektor enthalten können. Nach Einführung des Vektors können die Zellen für etwa 1 bis 2 Tage in angereicherten Medien wachsen gelassen werden, bevor auf selektive Medien umgestellt wird. Der Zweck des selektierbaren Markers besteht darin, Resistenz gegenüber einem selektiven Mittel zu verleihen, und sein Vorliegen erlaubt Wachstum und Gewinnung von Zellen, welche die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturtechniken, die für den Zelltyp geeignet sind, vermehrt werden.
  • Die Erfindung umfasst auch Vektoren, in denen die hierin beschriebenen Nucleinsäure-Sequenzen in umgekehrter Orientierung in den Vektor kloniert sind, aber funktionell an eine regulatorische Sequenz gebunden sind, die eine Transkription von Antisense-RNA erlaubt. So kann ein Antisense-Transkript für die gesamten Nucleinsäuremolekül-Sequenzen oder einen Teil der Nucleinsäuremolekül-Sequenzen, die hierin beschrieben sind, einschließlich codierender und nicht-codierender Regionen, produziert werden. Eine Expression dieser Antisense-RNA unterliegt jedem der Parameter, die oben in Verbindung mit Expression der Sense-RNA beschrieben wurden.
  • Es kann eine beliebige Reihe von Selektionssystemen eingesetzt werden, um transformierte Zelllinien zu isolieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase- und Adeninphosphoribosyltransferase-Gene zur Verwendung in TK–- bzw. APR–-Zellen (siehe z.B. Wigler et al., Cell 11: 223–232, 1997; Lowy et al., Cell 22: 817–823, 1980). Es kann auch Antimetabolit-, Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz als Basis für eine Selektion verwendet werden. Beispielsweise verleiht Dhfr Resistenz gegen Methotrexat; Neo verleiht Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin und G-418; und Als und Pat verleihen Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase (siehe z.B. Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567–3570, 1980; Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1–14, 1981). Es wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, z.B. TrpB und HisD, die den zellulären Bedarf an Metboliten ändern (siehe z.B. Hartman und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047–8051, 1988). Sichtbare Marker, z.B. Anthocyanine, grün fluoreszierende Proteine (GFP; Clontech, Palo Alto, CA), β-Glucuronidase und ihr Substrat β-Glucuronid oder Luciferase und ihr Substrat Luciferin können verwendet werden. Diese Marker können nicht nur verwendet werden, um Transformanten zu identifizieren, sondern auch, um die Menge an transienter oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zuzuschreiben ist, quantitativ zu bestimmten (siehe z.B. Rhodes, Methods Mol. Biol. 55: 121–131, 1995). Obgleich das Vorliegen/Fehlen von Marker-Gen-Expression nahe legt, dass das Gen von Interesse auch vorliegt, kann es notwendig sein, das Vorliegen und die Expression des Gens zu bestätigen. Wenn beispielsweise die Sequenz, die für Ratten-PDE10A codiert, in eine Marker-Gen-Sequenz insertiert wird, können transformierte Zellen, die Sequenzen enthalten, die für PDE10A-Polypeptid codieren, durch Fehlen der Marker-Gen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Marker-Gen in Tandemanordnung mit einer Sequenz, die PDE10A-Polypeptid codiert, unter die Kontrolle eines einzelnen Promotors gestellt werden. Eine Expression des Marker-Gens als Reaktion auf Einführung oder Selektion zeigt üblicherweise auch die Expression der Tandem-PDE10A-Sequenz an.
  • Im Allgemeinen können Wirtszellen, die die Nucleinsäure-Sequenz enthalten, die für die Ratten-PDE10A codiert, und die die Ratten-PDE10A exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen, PCR-Amplifikation und Protein-Bioassay- oder Immunoassay-Techniken, welche Technologien auf Membran-, Lösungs- oder Chip-Basis zur Detektion und/oder Quantifizierung von Nucleinsäure- oder Protein-Sequenzen umfassen.
  • Immunologische Verfahren zum Detektieren und Messen der Expression von PDE10A unter Verwendung spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für solche Techniken umfassen Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsbestimmungen (ELISA), Radioimmunoassays (RIAs), Western-Blots, Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Diese und andere Assays sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe z.B. Hampton, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN, Sekt. IV, 1990; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, 1997; und Pound, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 1998). Dem Fach mann ist eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt, und diese können in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäure-Assays eingesetzt werden.
  • Mittel zur Herstellung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Detektieren von Sequenzen, die mit Polynucleotiden in Verbindung stehen, welche für Ratten-PDE10A codieren, umfassen Oligomarkierung, Nicktranslation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids.
  • Alternativ können die Sequenzen, die die Ratten-PDE10A oder beliebige Fragmente davon codieren, in einen Vektor für die Produktion einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, sind im Handel erhältlich und können zur in vitro-Synthese von RNA-Sonden durch Zusatz einer geeigneten RNA-Polymerase, z.B. T7, T3 oder SP6, und markierter Nucleotide verwendet werden. Diese Verfahren können unter Verwendung einer Vielzahl im Handel erhältlicher Kits (z.B. Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Promega, Madison, WI; und US Biochemical, Cleveland, OH) durchgeführt werden. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen, die zur Vereinfachung der Detektion verwendet werden können, umfassen Radionuclide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Mittel, wie auch Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel, und dergleichen.
  • Wirtszellen, die mit Nucleotid-Sequenzen, die PDE10A-Polypeptid codieren, transformiert sind, können unter Bedingungen, die für die Expression und Gewinnung des Proteins aus Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das durch eine transformierte Zelle produzierte Protein kann in Abhängigkeit von der Sequenz und/oder dem Vektor, der verwendet wird, sezerniert oder intrazellulär zurückgehalten werden. Wie der Fachmann auf dem Gebiet erkennen wird, können Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, welche für die Ratten-PDE10A codieren, so konzipiert sein, dass sie Signal-Sequenzen enthalten, welche eine Sekretion der Ratten-PDE10A durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran steuern. Außerdem kann ein Wirtszellstamm auf seine Fähigkeit, Expression der insertierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein in gewünschter Weise zu prozessieren, gewählt werden. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Eine posttranslationale Prozessierung, die eine "Prepro"- oder "Pro"-Form des Proteins spaltet, kann ebenfalls verwendet werden, um Protein-Targeting, -Faltung und/oder -Aktivität zu spezifizieren.
  • Verschiedene Wirtszellen, die eine spezifische zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für posttranslationale Aktivitäten haben (z.B. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und W138), sind von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) erhältlich und können so gewählt werden, dass sie die korrekte Modifikation und Prozessierung des Fremdproteins gewährleisten. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können natürliche, modifizierte oder rekombinante Nucleinsäure-Sequenzen, die für das PDE10A- Polypeptid codieren, an eine heterologe Sequenz ligiert sein, was in einer Translation eines Fusionsproteins in einem der vorstehend genannten Wirtssysteme resultiert. Beispielsweise kann ein chimäres PDE10A-Protein, das eine heterologe Gruppierung enthält, die durch einen im Handel verfügbaren Antikörper erkannt werden kann, das Screening von Peptid-Bibliotheken auf Modulatoren der PDE10A-Polypeptid-Aktivität erleichtern. Heterologe Protein- und Peptidgruppierungen können auch eine Reinigung von Fusionsproteinen unter Verwendung im Handel verfügbarer Affinitätsmatrizes erleichtern. Solche Gruppierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Glutathion S-Transferase (GST), Maltose-bindendes Protein (MBP), Thioredoxin (Trx), Calmodulin-bindendes Peptid (CBP), 6-His, FLAG, c-myc und Hämagglutinin (HA). GST, MBP, Trx, CBP und 6-His ermöglichen eine Reinigung ihrer verwandten Fusionsproteine an immobilisiertem Glutathion, Maltose, Phenylarsinoxid, Calmodulin und Metallchelat-Harzen. FLAG, c-myc und Hämagglutinin (HA) ermöglichen eine Immunaffinitätsreinigung von Fusionsproteinen unter Verwendung von im Handel verfügbaren monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, welche diese Epitop-Tags spezifisch erkennen. Ein Fusionsprotein kann auch so manipuliert sein, dass es eine proteolytische Spaltungsstelle enthält, die zwischen der für PDE10A-Polypeptid codierenden Sequenz und der heterologen Protein-Sequenz lokalisiert ist, so dass PDE10A-Polypeptid nach Reinigung von der heterologen Gruppierung abgespalten werden kann. Verfahren zur Fusionsprotein-Expression und -Reinigung werden in Ausubel (1995, supra, Kap. 10) diskutiert. Es können auch eine Reihe von im Handel verfügbaren Kits eingesetzt werden, um Expression und Reinigung von Fusionsproteinen zu erleichtern.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Synthese einer radioaktiv markierten Ratten-PDE10A in vitro erreicht werden, indem das TNT-Kaninchen-Retikulozytenlysat oder das Weizenkeimextrakt-System (Promega) verwendet wird. Diese Systeme verbinden Transkription und Translation von Protein-codierenden Sequenzen, die funktionell mit dem T7-, T3- oder SP6-Promotor verbunden sind. Eine Translation erfolgt in Gegenwart einer radioaktiv markierten Aminosäure, z.B. 35S-Methionin.
  • Fragmente der Ratten-PDE10A können nicht nur durch Rekombinationsmittel, sondern auch durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasentechniken produziert werden (siehe z.B. Creighton, supra, S. 55–60). Eine Proteinsynthese kann durch manuelle Techniken oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Eine automatisierte Synthese kann z.B. unter Verwendung des ABI® 431A-Peptidsynthesizers (Perkin-Elmer) erreicht werden. Verschiedene Fragmente der Ratten-PDE10A können getrennt synthetisiert werden und dann unter Produktion des Volllängenmoleküls kombiniert werden.
  • Nucleinsäure-Arrays
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Nucleinsäure-Detektionskits, z.B. Arrays oder Mikroarrays von Nucleinsäure-Molekülen, bereit, die auf der in 1A bereitgestellten Sequenzinformation basieren.
  • Die Ausdrücke Arrays oder Mikroarrays, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf einen Array verschiedener Polynucleotide oder Oligonucleotide, die auf einem Substrat, z.B. Papier, Nylon oder einem anderen Membrantyp, Filter, Chip, Glasobjektträger oder einem anderen geeigneten festen Träger synthetisiert werden. In einer Ausführungsform wird der Mikroarray nach den Verfahren hergestellt und verwendet, die in Chee et al., US-Pat. Nr. 5 837 832, Chee et al., WO 95/11995, Lockhart et al., Nat. Biotech. 14: 1675–80, 1996, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614–19, 1996 beschrieben sind. Andere Arrays werden durch die Verfahren produziert, die in Brown et al., US-Pat. Nr. 5 807 522 und in Baldeschwieler et al., WO 95/25116 beschrieben sind.
  • Beispiel 1: PDE10A-Expressionsmuster
  • Es wurde früher berichtet, dass PDE10A-mRNA im Gehirn im Striatum, Nucleus accumbens und im Tuberculum olfactoriurm vorkommt (Lanfear und Robas, EP 0967284 ). Die folgenden Experimente bestätigten diese Feststellungen und charakterisierten eine PDE10A-Expression in Mäusen und Ratten weiter.
  • Gehirn-Sektion.
  • Maus- und Ratten-Gehirne wurden nach schneller Enthauptung gesammelt, in Isopentan auf Trockeneis gefroren und in 20 μm-Schnitte mit einem Hacker-Bright-Kryostat (Hacker Instruments, Fairfield, NJ) geschnitten. Schnitte von allen Ebenen des Maus- und Rattengehirns wurden auf vorher mit VectabondTM-Reagens (Vector Laboratories, Bulingame, CA) beschichtete Objektträger in getautem Zustand aufgebracht, in 4%iger Paraformaldehydlösung fixiert, in Ethanol dehydratisiert und mit einem Trocknungsmittel in luftdichten Behältern bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
  • Bildung einer Messenger-RNA-Sonde.
  • Plasmid-DNA, enthaltend ein 914 Basenpaar-Fragment, das aus Maus-PDE10A-cDNA isoliert worden war (entsprechend den Basenpaaren 380-1294), wurde in E. coli (DHSα), die in Suspensionskultur wachsen gelassen worden waren, insertiert. Die Plasmid-DNA wurde mit einem Qiagen® Maxi-Prep-Kit (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert und bis zur Verwendung gelagert. Für die Antisense-Sonde wurde das Plasmid mit XbaI-Restriktionsendonuclease linearisiert. Für die Sense-Sonde wurde Plasmid mit EcoRI-Restriktionsenzym linearisiert. Die Matrizen-DNA wurde dann unter Verwendung eines Qiaquick®-PCR-Kits (Qiagen) gereinigt und transkribiert und mit 33P-UTP unter Verwendung eines MaxiscriptTM-Kits (Ambion, Austin, TX) markiert. Eine Antisense-Sonde wurde mit T7-Polymerase erzeugt, und eine Sense-Sonde wurde mit SP6-Polymerase erzeugt. Finale markierte Ribo-Sonden wurden unter Verwendung einer G50 QuickSpinTM-Säule (Novagen, Madison, WI) hergestellt und in kommerziellem Hybridisierungspuffer (Novagen) verdünnt.
  • In situ-Hybridisierung.
  • Auf Objektträgern montierte Gehirnschnitte wurden in Proteinase K (1 μg/ml) für 5 min inkubiert, in RNase-freiem Wasser gespült, in 0,1 M Triethylamin (TEA) bei pH 8,0 suspen diert und durch Zusatz von 0,25% Essigsäureanhydrid für 5 min acetyliert. Die Sonden wurden auf die auf Objektträger montierten Schnitte in einem Volumen von 10–25 μl/Schnitt, enthaltend 33P (0,5–1 × 106 cpm pro Schnitt) aufgetragen. Als Kontrolle wurde eine kleine Anzahl von Mausgehirnschnitten mit RNase (A) (20 μg/ml) vor Hybridisierung vorbehandelt. Die Schnitte wurden über Nacht in feuchter Umgebung bei 50°C inkubiert und dann in 2 × SSC gespült, mit RNase A behandelt, um einzelsträngige RNA zu zerstören, in einer Standardreihe von Waschgängen gewaschen und in abgestuften Reihen von Ethanollösungen dehydratisiert. Die resultierenden Objektträger wurden in Standard-Röntgenstrahlkassetten einem β-Max-Film (Amersham, Piscataway, NJ) gegenübergestellt und für 5–10 Tage belichtet.
  • Nach Filmbelichtung wurden die Objektträger in Kodak® NTB-2-Emulsion (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, 1:1 mit Wasser verdünnt, bei 43°C unter Sicherheitslichtbedingungen eingetaucht. Die Objektträger wurden an der Luft getrocknet und für 2 Wochen während einer Lagerung bei –20°C in totaler Dunkelheit belichtet. Die Objektträger wurden in Kodak® D-19-Entwickler und Kodak®-Fixierungsmittel bei 19°C entwickelt. Die Objektträger wurden mit 1% Toluidin Blau gegengefärbt, in Alkohol dehydratisiert und mit einem Deckglas bedeckt.
  • PDE10A-spezifische Antikörper.
  • Ein Antikörper, der gegen das Ratten-PDE10A-Polypeptid gerichtet ist, wurde für Immuncytochemie-Studien erzeugt. Die Volllängen-Ratten-PDE10A-Sequenz (1B, SEQ ID NO:2) mit einem C-terminalen His-Tag wurde in Sf9-Insektenzellen nach früher beschriebenen Verfahren exprimiert (Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702–07, 2000). Eine Drei-Stufen-Reinigung unter Verwendung von Ni-NTA-Chromatographie, Pufferaustausch und Anionenaustauschchromatographie führte zu einem Endprodukt, das 95% rein war, die geeignete vorausgesagte Masse von 97 kD, bestimmt durch Massenspektrometrie, hatte, und das cGMP-Hydrolyse-Aktivität hatte. Gereinigte PDE10A wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren, und unter Verwendung von Standardprotokollen wurden klonale Hybridome hergestellt. Zur Verwendung wurde ein Antikörper, als 24F3.F11 bezeichnet, gewählt.
  • Die Affinität des monoklonalen 24F3.F11-Antikörpers für humane und Ratten-PDE10A wurde unter Verwendung von Zelllysaten aus einer Sf9-Zelllinie, die humane PDE10A exprimierte, und einer Sf9-Zelllinie, die Ratten-PDE10A exprimierte, getestet. Der monoklonale 24F3.F11-Antikörper erkennt rekombinante Ratten- und humane PDE10A. Lysate aus den rekombinanten Zellen, wie auch aus Kontroll-Sf9-Zellen, wurden einer Gelelektrophorese unterworfen. Blots des Gels wurden dann mit dem 24F3.F11-Antikörper inkubiert, und eine Bindung des 24F3.F11-Antikörpers an die Blots wurde bestimmt. In der Bahn, die Lysate aus Sf9-Zellen, die kein rekombinantes Protein exprimierten, enthielt, wurde keine PDE10A-Immunreaktivität beobachtet.
  • Die Spezifität des 24F3.F11-Antikörpers für PDE10A wurde mit PDEs aus den anderen zehn PDE-Gen-Familien verglichen. Der 24F3.F11-Antikörper reagierte mit keiner anderen PDE kreuz.
  • Inmuncytochemie und Western-Blot.
  • Die Expression von PDE10A in verschiedenen Regionen von Rattengehirn wurde durch Western-Blotting mit dem 24F3.F11-Antikörper und durch Immuncytochemie bestimmt. Für Western-Blot-Analysen wurden Ratten durch Enthauptung getötet, und die Gehirne wurden schnell entfernt und auf Eis gekühlt. Verschiedene Gehirnregionen wurden identifiziert und unter Anwendung von Standardtechniken einer Mikrodissektion unterzogen. Gehirnsektionen wurden in 10 Volumina Puffer (250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40) in einem Glas/Glas-Homogenisator homogenisiert. Lysate wurden mit 4000 UpM zentrifugiert (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, Modell 5417R), und Überstände wurden Western-Blot-Analysen unter Anwendung von Standardprotokollen unterworfen.
  • Zur Immuncytochemie wurden Rattengehirne in 10% gepuffertem Formalin (pH 7,0) für 24 Stunden tauchfixiert und dann in Paraffin eingebettet. Schnitte (6 μm) wurden von Paraffin befreit und in destilliertem Wasser hydratisiert. Maskierte Epitope wurden unter Verwendung eines Citratpuffers (pH 6) wiedergewonnen, für 20 min auf 96°C erwärmt. Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur mit dem 24F3.F11-Antikörper (1,2 μg/ml) für 60 min inkubiert. Als Kontrolle wurden ein IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper und der 24F3.F11-Antikörper, die mit einer sättigenden Konzentration (bestimmt durch Western-Blot) an PDE10A vorabsorbiert worden waren, parallel an doppelten Schnitten inkubiert. Eine positive Färbung wurde unter Verwendung des Avidin-Biotin-HRP-Komplexes detektiert und mit Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht. Bei IgG1- und vorabsorbierten F11-Kontrollen wurde kein Reaktionsprodukt beobachtet.
  • PDE 10A-mRNA-Lokalisierung.
  • Autoradiogramme der PDE10A-Antisense-markierten Mausgehirnschnitte zeigten ein hochspezifisches Hybridisierungssignal. Eine dichte Markierung wurde nur in drei Bereichen gefunden: dorsales Striatum (Caudate und Putamen), Ventralstriatum (Nucleus accumbens) und Tuberculum olfactorium. Im Striatum und Nucleus accumbens wurde PDE10A-mRNA in den mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums (striatal medium spiny neurons) in hohem Maße exprimiert, welche etwa 95% aller in diesen Strukturen gefundenen Neuronen darstellen. Eine geringere Markierungsdichte wurde im Gyrus dentatus und in CA-Schichten des Hippokampus und in der Körnerzellschicht des Cerebellums festgestellt. Es wurde kein deutlicher Unterschied im Markierungsmuster im Rattengehirn im Vergleich zur Maus gesehen.
  • Eine in situ-Markierung von PDE10A war spezifisch. Mausgehirnschnitte, die mit RNase A vor Hybridisierung vorbehandelt worden waren, wiesen keinen sichtbaren Markierungseinbau auf.
  • Es gab eine sehr gute Übereinstimmung zwischen PDE10A-mRNA-Lokalisierungsbereichen und solchen Bereichen, die klassischerweise mit einer hohen Dopamin-Rezeptorexpression assoziiert sind. Diese Ähnlichkeit wurde außerdem durch Emulsionsautoradiogramme gestützt, die im Vergleich zu Filmautoradiographie eine subzelluläre Lokalisierung und erhöhte Auflösung liefern. Ein dichter Einbau von Silberkörnern wurde im gesamten Striatum, Nucleus accumbens und Tuberculum olfactorium bemerkt, und es wurde bemerkt, dass sie die überwiegende Mehrheit der neuronalen Zellkörper in diesen drei Bereichen überlagern. Außerdem zeigten auch Bereiche, die geringe, aber messbare Level an Dopamin-Rezeptoren exprimieren, eine Kornabscheidung in grober Übereinstimmung mit ihrer relativen DA-Rezeptordichte. Diese umfassten besonders den medialen und sulcalen präfrontalen Cortex, wie auch Gyrus dentate und die CA-Schichten des Hippokampus. Allerdings wurde keine Kornackumulierung in der Substantia nigra pars reticulata, ein Bereich dichter Dopamin-D1-Rezeptorexpression, erkannt.
  • PDE10A-Protein-Lokalisierung.
  • In Übereinstimmung mit den mRNA-Leveln wurde ein hoher Level an PDE10A-Protein im Striatum (Caudate und Putamen), im Nucleus accumbens und im Tuberculum olfactorium gezeigt. PDE10A-Protein wurde in den neuronalen Zellkörpern und überall im Neuropil beobachtet. Darüber hinaus wurde ein hoher Level an PDE10A-Protein, nicht aber an PDE10A-mRNA in den Gehirnregionen beobachtet, in die die mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums vorstehen, einschließlich innere Kapsel, Globus pallidus, entopedunkulärer Nucleus und Substantia nigra. Wenn das Fehlen von PDE10A-mRNA in diesen Regionen angenommen wird, müssen hohe Level an PDE10A-Protein aus den Axonen und Termini der mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums kommen.
  • Beispiel 2: In vitro-Screening auf PDE10A-selektive Modulatoren
  • Papaverin wurde durch in vitro-Untersuchung als ein PDE10A-selektiver Inhibitor identifiziert. Papaverin wurde auf seine Fähigkeit, PDE10A zu inhibieren, im Vergleich zu PDEs der anderen Gen-Familien getestet. Humane PDE2, 3 und 5 wurden aus Corpus cavernosum isoliert, humane PDE1 wurde aus Herzventrikel isoliert, und humane PDE4 wurde aus Skelettmuskel isoliert (Boolell et al., Int. J. Impotence Research 8: 7–52, 1996). Phosphodiesterasen 7–11 wurden aus rekombinanten Volllängen-Klonen, die in SF9-Zellen, wie vorher beschrieben, transfiziert worden waren, erzeugt (Fisher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 246: 570–577, 1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273: 15559–15564, 1998b; Soderling et al., PNAS 96: 7071–7076, 1999; Fawcett et al., PNAS 97: 3702–3707, 2000). Die Enzyme wurden durch FPLC aus der löslichen Fraktion von Zelllysaten gereinigt, wie es bei Boolell et al., supra, beschrieben ist.
  • PDE-Aktivität wurde unter Verwendung eines Verfahrens auf SPA-Basis, wie es früher beschrieben wurde (Fawcett et al., 2000), gemessen. Assays wurden unter Verwendung einer festgelegten Menge an PDE10A-Enzym in Gegenwart von variierenden Inhibitorkonzentrationen durchgeführt. Die cyclischen Nucleotidsubstrate (cGMP oder cAMP in einem Verhältnis von unmarkiert zu [3H]-markiert von 3:1), die in den Assays verwendet wurden, waren 1/3 der Km-Konzentration, was Vergleiche bei den Inhibitor-IC50-Werten für die verschiedenen PDEs erlaubt. Das endgültige Assayvolumen wurde mit Assaypuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) auf 100 μl eingestellt.
  • Reaktionen wurden durch Enzymzugabe initiiert. Proben wurden für 30–60 min bei 30°C inkubiert, um < 30% Substratumsatz zu erhalten, und mit 50 μl Yitriumsilicat-SPA-Perlen (Amersham), die 3 mM des geeigneten unmarkierten cyclischen Nucleotids enthalten, terminiert. Die Platten wurden wieder versiegelt und für 20 min geschüttelt; die Perlen wurden dann für 30 min im Dunklen absetzen gelassen und dann an einem Topcount-Plattenlesegerät (Packard, Meriden, CT) gezählt. Die Radioaktivitätseinheiten wurden in Prozent Aktivität, verglichen mit einer nicht-inhibierten Kontrolle (100%), umgewandelt. IC50-Werte wurden unter Verwendung der "Fit Curve" Microsoft Excel-Erweiterung erhalten.
  • Papaverin wurde als kompetitiver Inhibitor von PDE10A mit einem IC50-Wert von 17 nM identifiziert. Papaverin war gegenüber allen anderen getesteten PDEs beträchtlich weniger wirksam (Tabelle 1), was Selektivität für PDE10A beweist.
  • TABELLE 1. Papaverin-Inhibierung von verschiedenen PDE-Gen-Familien
    Figure 00280001
  • Beispiel 3: Primäre, mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums – Effekt von Papaverin
  • Unter der Annahme der Spezifität von Papaverin zur Inhibierung von PDE10A wurde Papaverin-kultivierten, primären, mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums verabreicht, um zu bestimmen, ob eine selektive PDE10A-Inhibierung einen eindeutigen Effekt auf den cyclischen Nucleotid-Metabolismus in diesen Zellen hat. Die Effekte von Papaverin wurden mit den Effekten verglichen, die aus der Verabreichung von anderen PDE-Inhibitoren, 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX, Rolipram und Zaprinast (alle PDE-Inhibitoren von Sigma, St. Louis, MO, verfügbar) verglichen.
  • Striatalkulturen wurden hergestellt, wie es früher beschrieben wurde (Ventimiglia et al., Eur. J. Neurosci. 7: 213–222, 1995). Kurz ausgedrückt, Striata (Nucleus caudatus und Putamen) wurden aus E17-Ratten seziert, dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu produzieren, und in einer Dichte von 5 × 104 Neuronen/Vertiefung in eine Platte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit Poly-L-Ornithin/Laminin (Kat. Nr. 354657, BD Biosciences, Bedford, MA) plattiert. Die Zellen wurden in Neurobasalmedium (Kat. Nr. 21103-049, Gibco BRL, Grand Island, NY) mit B27-Ergänzungen (Kat. Nr. 17504-010, Gibco BRL) und humanem rekombinanten aus dem Hirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) (100 ng/ml) (Kat. Nr. 248-BD, R & D Systems, Minneapolis, MN) plattiert. Mittelgroße Projektionsneuronen des Striatums umfassten 50–60% der Zellen in diesen Kulturen, was durch ein GABA-Immunreaktivitätsprotokoll, das früher beschrieben worden war (Ventimiglia et al., 1995, supra), bestätigt wurde. Eine Expression von PDE10A-mRNA in diesen Kulturen wurde durch RNase-Schutz-Assay bestätigt, wie es weiter unten noch beschrieben wird.
  • Nach etwa vier Tagen in vitro wurden die Striatumzellen mit Ca2+/Mg2+-freier, Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) gewaschen und für eine Stunde in einem Puffer vorinkubiert, der Ca2+/Mg2+-freie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 30 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM CaCl2, 1 mg/ml Dextrose und 5 mM MgCl2 enthielt. Die Striatumzellen wurden dann einem der PDE-Inhibitoren ausgesetzt und für 20 min bei 37°C inkubiert. Wenn cGMP gemessen wurde, wurden die Neuronen mit Natriumnitroprussid (SNP) (100 μM) nach 20 min Inkubation mit dem PDE-Inhibitor für 2 min stimuliert. Wenn cAMP gemessen wurde, wurden die Neuronen mit Forskolin (1 μM) für die Dauer der 20-minütigen Inhibitorinkubation stimuliert. Diese Konzentrationen an SNP und Forskolin wurden als submaximale Konzentrationen gewählt, die etwa 20–25% der Maximalantwort produzierten (1000 μM SNP und 10 μM Forskolin produzierten maximale Erhöhungen bei cGMP bzw. cAMP).
  • cGMP- und cAMP-SPA-Systeme (Amersham Code RPA 540 bzw. RPA 559) wurden verwendet, um die entsprechenden cGMP- und cAMP-Konzentrationen im Zelllysat zu detektieren. Die Zellen wurden lysiert, indem eine 9:1-Kombination von SPA direct screening Assay Buffer (0,05 M Acetat mit 0,01% Natriumazid) und Puffer A (133 mg/ml Dodecyltrimethylammoniumbromid) verwendet wurde; und die Lysate wurden auf Trockeneis gefroren.
  • In Zellen, die nicht durch SNP oder Forskolin stimuliert worden waren, beeinflusste Papaverin weder die cAMP- noch die cGMP-Level in den Striatumkulturen. In Abwesenheit eines PDE-Inhibitors bewirkten die submaximalen Konzentrationen an Forskolin (1 μM) und SNP (100 μM) eine 2–3fache Zunahme gegenüber Basal-cAMP und -cGMP. Papaverin verursachte eine Konzentrations-abhängige Zunahme bei der SNP-induzierten cGMP-Akkumulierung mit einem EC200 (Konzentration des Inhibitors, die eine 2fache Erhöhung gibt)-Werts von 11,7 μM (Tabelle 2). Ein maximaler Effekt wurde mit 100 μM Papaverin beobachtet; cGMP-Level wurden gegenüber Kulturen, die nur mit SNP stimuliert waren, 5fach erhöht. Papaverin verursachte auch eine Zunahme bei der cAMP-Akkumulierung in Forskolin stimulierten Kulturen mit einem EC200-Wert von 38,3 (Tabelle 2). Demnach war Papaverin bei der Förderung einer Erhöhung bei cAMP 3,3-mal weniger wirksam als cGMP, was durch das Verhältnis cGMP-EC200/cAMP-EC200 (Tabelle 2) bestimmt wurde.
  • Im Gegensatz dazu verursachte IBMX, ein nicht-selektiver PDE-Inhibitor, eine Konzentrations-abhängige (über einen Bereich von 3–100 μM) Zunahme, sowohl bei der cGMP- als auch der cMP-Akkumulierung in SNP- oder Forskolin-stimulierten Kulturen mit EC200-Werten von 19 bzw. 30 μM. Der selektive PDE4-Inhibitor Rolipram erhöhte die Forskolinstimulierte cAMP-Akkumulierung mit einem EC200-Wert von 2,5 μM und erforderte 10 mal höhere Konzentrationen, um die Rate der cGMP-Akkumulierung zu verdoppeln. Zaprinast, ein Inhibitor von cGMP-bevorzugenden PDEs, verdoppelte die cAMP-Level in diesen Neuronen bei einer Konzentration von 98 μM. Allerdings verdoppelten 100 μM dieser Verbindung den Level von cGMP nicht völlig. Vergleiche der Verhältnisse cGMP-EC200/cAMP-EC200 für jeden PDE-Inhibitor sind in Tabelle 2 gezeigt und beweisen, dass PDE10A-selektive Inhibitoren, wie sie durch Papaverin dargestellt werden, einen eindeutigen Effekt auf cyclische Nucleotidregulierung in mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums haben.
  • TABELLE 2. Vergleich von PDE-Inhibitoren
    Figure 00300001
  • RNase-Schutz-Assay.
  • RNA wurde aus einer Primärkultur von mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums von Ratten durch Zentrifugation mit 150.000 × g bei 20°C für 21 Stunden durch einen 5,7 M Cäsiumchlorid-Gradienten, wie es früher beschrieben wurde (Iredale PA, et al., Mol. Pharmacol. 50: 1103–1110, 1996) hergestellt. Das RNA-Pellet wurde in 0,3 M Natriumacetat, pH 5,2, resuspendiert und in Ethanol präzipitiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Spektralphotometrie bestimmt. Eine PDE10A-Ribosonde wurde durch PCR-Amplifikation eines 914 bp-Fragments, das aus Maus-cDNA isoliert worden war (entspricht den Basenpaaren 380-1294 von Genbank AF110507), hergestellt. Dieses Fragment wurde dann in pGEM3Zf kloniert. Der Vektor wurde linearisiert, und T7-RNA-Polymerase wurde verwendet, um eine [32P]-markierte Antisense-Ribosonde zu synthetisieren.
  • Der RNase-Schutz-Assay wurde durchgeführt, wobei der RPAII-Kit (Ambion) verwendet wurde. Kurz beschrieben, 5 μg der Gesamtzell-RNA wurde mit [32P]-markierter PDE10A-Ribosonde (etwa 105 cpm/Probe) über Nacht bei 42°C hybridisiert. Am folgenden Tag wurden die Proben mit RNase A und T1 für 30 min bei 37°C inkubiert, und die geschützten doppelsträngigen RNA-Fragmente wurden dann präzipitiert und auf einem 6% Polyacrylamidgel, das Harnstoff enthielt, laufen gelassen. Die Resultate dieses Assays bestätigten, dass PDE10A-mRNA in einer hohen Konzentration in der Primärkultur von mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums vorhanden war.
  • Beispiel 4: Klonierung und Sequenzierungvon Ratten-PDE10A
  • Die Protein-codierende Sequenz von humanem PDE10A (GenBank AB020593) wurde verwendet, um eine ausgewählte Untergruppe der National Center for Biotechnology Information (NCBI) Expressed Sequence Tag (EST) Database, die nicht-humane ESTs enthielt, unter Verwendung des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) durchzusuchen (Altshul et al., J. Mol. Bio. 215, 403–410, 1990). Die durch ein Ratten-EST (H32734) vorausgesagte Aminosäure-Sequenz war zu einem internen Teil des humanen Proteins homolog. Außerdem war die Nucleinsäure-Sequenz dieses EST zu der von Maus-PDE10A (GenBank AF110507) in hohem Maße homolog. Wir verwendeten diese EST-Information plus 5' and 3' Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)-Techniken, um authentische 5'- und 3'-Sequenzen aus Rattengehirn-RNA zu identifizieren, die dann verwendet wurden, um eine vollständige Ratten-PDE10A-cDNA zu isolieren.
  • 5'-RACE wurde durchgeführt, wobei ein 5'-RACE-Kit (Gibco/BRL) nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet wurde. Erster Strang-cDNA wurde unter Verwendung von Gen-spezifischen 3'-Primer 1358 (Tabelle 3), 1 μg Gesamt-RNA aus Sprague-Dawley-Rattengehirn und SuperscriptTM II-reverser Transkriptase (Gibco/BRL) erzeugt. Die erste PCR-Runde wurde durchgeführt, indem verschachtelte 3'-Gen-spezifischer Primer 1357 (Tabelle 3) und 5'-Adapter-Primer (Abridged Anchor Primer (AAP)) aus dem Kit verwendet wurden. Zyklusbedingungen umfassten eine Anfangsdenaturierung über 2 min bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen aus 94°C-Denaturierung für 45 s, 54°C-Annealing für 30 s, 72°C-Verlängerung für 3 min, plus finaler 10 min-Verlängerung bei 72°C (Robocycler®, Stratagene, La Jolla, CA).
  • Das Produkt der ersten PCR-Runde (1 μl) wurde als Matrize in einer zweiten PCR-Runde eingesetzt, wobei die obigen Zyklusbedingungen mit einem verschachtelten Genspezifischen Primer 1356 (Tabelle 3) und dem 5'-Adapter-Primer (Abridged Universal Amplification Primer (AUAP)) aus dem Kit angewendet wurden. Sechs getrennte PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an 1,2% Agarosegelen identifiziert. Diese Banden wurden einzeln unter Verwendung eines Gelextraktions-Kits (Qiagen, Valencia, CA) isoliert, in pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und in TOP10-Zellen (Invitrogen) transfiziert. Die Kolonien wurden durch PCR mit Vektor-spezifischen Primern 1369 und 1370 (Tabelle 3) durchgemustert, wie es oben beschrieben ist, und aus jeder Bande wurden mehrere positive Klone sequenziert.
  • Alle Sequenzen wurden angeordnet, um eine Konsensus-Sequenz für das 5'-Ende von Ratten-PDE10A zu produzieren. 3'-RACE wurde unter Verwendung eines 3'-RACE-Kits (Gib co/BRL) nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. cDNA eines ersten Strangs wurde aus 2 μg Rattengehirn-Gesamt-RNA unter Verwendung des 3'-Adapter-Primers (AP) und Supercript® II-reverser Transkriptase erzeugt. Die erste PCR-Runde wurde unter Verwendung des Gen-spezifischen 5'-Primers 1375 (Tabelle 3) und des 3'-AP aus dem Kit durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren wie oben beschrieben. Das Produkt der ersten PCR-Runde (1 μl) wurde als Matrize in einer zweiten PCR-Runde unter Anwendung derselben Zyklusbedingungen mit den verschachtelten Primern 1376 (Tabelle 3) und 3'-AUAP verwendet. Vier getrennte PCR-Produkte der ungefähren erwarteten Größe wurden durch Elektrophorese an 1,2% Agarosegelen identifiziert. Diese Banden wurden isoliert und subkloniert, und Kolonien wurden wie oben durchgemustert. Positive Klone wurden aus einem PCR-Produkt identifiziert. Die Sequenzen aus sechs dieser Klone wurden angeordnet, um eine Konsensus-Sequenz für das 3'-Ende von Ratten-PDE10A zu produzieren.
  • Um Volllängen-Ratten-PDE10A-cDNA zu isolieren, wurde ein erster Strang cDNA in dreifacher Form aus Gesamt-Rattengehirn-RNA unter Verwendurg des Supercript® System (Gibco/BRL) erzeugt. 5'-Primer 1380 und 3'-Primer 1407 (Tabelle 3) wurden aus den Ratten-5'- und 3'-Sequenzinformationen, die oben erzeugt worden waren, entwickelt und manipuliert, um flankierende SalI-Restriktionsstellen zu erhalten, die eine Klonierung erleichtern. PCR wurde unter Verwendung eines High Fidelity PCR-Systems (Boehringer Mannheim (Roche), Basel, Schweiz) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren: zu Beginn 2 min Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 4 Zyklen aus 94°C-Denaturierung für 45 s, 48°C-Annealing für 30 s, 72°C-Verlängerung für 3,5 min, danach 30 Zyklen aus 94°C-Denaturierung für 45 s, 55°C-Annealing für 30 s, 72°C-Verlängerung für 3,5 min plus abschließende 10 min-Verlängerung bei 72°C (Robocycler®, Stratagene). Für jeden der drei ersten Stränge an cDNA-Matrizen wurden getrennte PCR-Reaktionen durchgeführt.
  • Eine Bande von etwa 2,3 kb aus jeder PCR-Reaktion wurde Gel-isoliert, wobei ein Gelextraktions-Kit (Qiagen, Valencia, CA) verwendet wurde, und in PCR Blunt (Invitrogen) ligiert und wie oben transformiert. Korrekte Klone wurden durch Kolonien-PCR unter Verwendung von Ratten-PDE10-spezifischen Primern 1385 und 1386 (Tabelle 3) und SalI-Restriktionsverdau identifiziert. Mehrfach-Klone aus jeder getrennten reversen Transkriptions-PCR-Reaktion wurden sequenziert und alle Sequenzen angeordnet, um einen Konsensus zu bestimmen. Zwei fehlerfreie Klone (pNB1426 und pNB1427) wurden identifiziert und sequenziert. Die Polynucleotid-Sequenz (SEQ ID NO:1) und die vorausgesagte Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO:2) für Ratten-PDE10A sind in 1A bzw. 1B gezeigt.
  • TABELLE 3. Primer-Sequenzen zur Klonierung von Ratten-PDE10A
    Figure 00330001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001

Claims (14)

  1. Verfahren zum Screening nach einem Agens, das intrazelluläre Phosphodiesterase-10A-Aktivität hemmt, wobei das Verfahren umfasst: i) Verabreichung des Agenses an mittelgroße Projektionsneuronen des Striatum und submaximale Aktivierung von Adenylatcyclase; ii) Verabreichung des Agenses an mittelgroße Projektionsneuronen des Striatum und submaximale Aktivierung von Guanylatcyclase; iii) Messung der cMP-Bildung in den Zellen von Schritt (i) und der cGMP-Bildung in den Zellen von Schritt (ii); iv) Berechnung des cAMP-EC200-Wertes für Schritt (i) und des cGMP-EC200-Wertes für Schritt (ii); wobei das Mittel als ein PDE10A-Inhibitor identifiziert wird, wenn das Verhältnis cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert mit dem Verhältnis vergleichbar ist, das durch Verabreichung von Papaverin unter denselben Assay-Bedingungen produziert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatum als primär kultivierte Neuronen hergestellt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Adenylatcyclase durch Forskolin aktiviert wird, Guanylatcyclase durch Natriumnitroprussid aktiviert wird und das Verhältnis cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert im Bereich von 1,75–5,25 liegt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verhältnis cAMP-EC200-Wert/cGMP-EC200-Wert im Bereich von 3,0–4,0 liegt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration an cAMP und cGMP durch einen Szintillationsnäherungs-Assay gemessen wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Agens vor den Schritten (i) und (ii) in vitro als selektiver PDE10A-Inhibitor identifiziert wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Agens außerdem in einem in-vitro-Assay als selektiver PDE10A-Inhibitor identifiziert wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Neuronen von Schritt (i) und (ii) in getrennten Proben vorliegen.
  9. Isoliertes oder gereinigtes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
  10. Isoliertes oder gereinigtes Polypeptid, umfassend: i) eine Nucleinsäuresequenz, die für das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert; ii) die codierende Sequenz von SEQ ID NO:1.
  11. Vektor, der ein Polynucleotid nach Anspruch 10 umfasst.
  12. Eine Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 11 transformiert ist und die ein Polynucleotid nach Anspruch 10 exprimiert.
  13. Verfahren zur Identifizierung eines Agenses, das PDE10A-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren Inkontaktbringen des Agenses mit einem PDE10A-Polypeptid, das SEQ ID NO:2 umfasst, und Messen der Aktivität des PDE10A- Polypeptids umfasst, wobei eine Differenz zwischen der PDE10A-Polypeptid-Aktivität in Gegenwart des Agenses und in Abwesenheit des Agenses ein Hinweis dafür ist, dass das Agens die Aktivität moduliert.
  14. Verfahren zur Identifizierung eines Agenses, das PDE10A-Aktivität moduliert, wobei das Verfahren Inkontaktbringen des Agenses mit einer Wirtszelle nach Anspruch 12 und Messen der Aktivität des PDE10A-Polypeptids umfasst, wobei eine Differenz zwischen der PDE10A-Polypeptid-Aktivität in Gegenwart des Agenses und in Abwesenheit des Agenses ein Hinweis dafür ist, dass das Agens die Aktivität moduliert.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032579A1 (en) * 2001-04-20 2003-02-13 Pfizer Inc. Therapeutic use of selective PDE10 inhibitors
US8338420B1 (en) 2002-12-04 2012-12-25 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Treatment of Parkinson's disease and enhancement of dopamine signal using PDE 10 inhibitor
EP1608743A2 (de) * 2003-04-03 2005-12-28 Memory Pharmaceutical Corporation Phosphodiesterase-10a7-isoformen und verwendungsverfahren
JP2007508241A (ja) * 2003-07-31 2007-04-05 バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン Ｐｄｅ１０ａ阻害剤を用いる糖尿病および関連障害の処置方法
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
EP3150750B1 (de) 2011-04-08 2018-12-26 Prognosys Biosciences, Inc. Peptidkonstrukte und testsysteme dafür
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CA2907050C (en) 2013-03-15 2023-09-26 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
US10288608B2 (en) 2013-11-08 2019-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0967284A1 (de) * 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterasen

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