ES2256415T3 - Ensayos basados en celulas y secuencias para la fosfodiesterasa 10a. - Google Patents
Ensayos basados en celulas y secuencias para la fosfodiesterasa 10a.Info
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Abstract
Un método para rastrear un agente que inhiba la actividad de fosfodiesterasa 10A intracelular, comprendiendo dicho método: i) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la adenilato ciclasa; ii) administrar el agente a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo a la guanilato 10 ciclasa; iii) medir la generación de cAMP en las células de la etapa (i) y la generación de cGMP en las células de la etapa (ii); 15 iv) calcular la EC200 de cAMP para la etapa (i) y la EC200 de cGMP para la etapa (ii); en el que el agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si la relación de EC200 de cAMP/EC200 de cGMP es comparable a la relación producida por la administración de papaverina en las mismas condiciones de ensayo.
Description
Ensayos basados en células y secuencias para la
fosfodiesterasa 10A.
La presente invención proporciona métodos para
identificar a agentes que modulan la actividad de PDE10A y las
secuencias de polinucleótido y polipéptido para PDE10A de rata.
Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas (PDE)
catalizan la hidrólisis de los segundos mensajeros cAMP
(3'5'-monofosfato cíclico de adenosina) y cGMP
(3'5'-monofosfato cíclico de guanina) y juegan un
papel regulador clave en una amplia variedad de rutas de
transducción de señal (Beavo, Physiol. Rev. 75:
725-48, 1995). Por ejemplo, las PDE median procesos
implicados en la visión (McLaughlin et al., Nat. Genet.
4: 130-34, 1993), el olfato (Yan et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9677-81,
1995), la agregación de plaquetas (Dickinson et al., Biochem.
J. 323: 371-77, 1997), la síntesis de
aldosterona (MacFarland et al., J. Biol. Chem. 266:
13642, 1991), la secreción de insulina (Zhao et al., J. Clin.
Invest. 102: 869-73, 1998), la activación
de células T (Li et al., Science 283:
848-51, 1999), y la relajación del músculo liso
(Boolell et al., Int. J. Impot. Res. 8:
47-52, 1996; Ballard et al., J. Urol.
159: 2164-71, 1998).
Las PDE forman una superfamilia de enzimas que
están subdivididas en 11 familias principales (Beavo,
Physiol. Rev. 75: 725-48, 1995;
Beavo et al., Mol. Pharmacol. 46:
399-05, 1994; Soderling et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95: 8991-96, 1998; Fisher
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246:
570-77, 1998; Hayashi et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 250: 751-56, 1998; Soderling
et al., J. Biol. Chem. 273: 15553-58,
1998; Fisher et al., J. Biol. Chem. 273:
15559-64, 1998; Soderling et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96: 7071-76, 1999; y
Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
3702-07, 2000).
Cada familia de PDE está distinguida
funcionalmente por características enzimáticas únicas y perfiles
farmacológicos. Además, cada familia exhibe modelos de tejidos,
expresión celular y subcelular distintos (Beavo et al., Mol.
Pharmacol. 46: 399-405, 1994; Soderling
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
8991-96, 1998; Fisher et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 246: 570-77, 1998; Hayashi
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 250:
751-56, 1998; Soderling et al., J. Biol.
Chem. 273: 15553-58, 1998; Fisher et
al., J. Biol. Chem. 273: 15559-64, 1998;
Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:
7071-76, 1999; Fawcett et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 97: 3702-07, 2000; Boolell
et al., Int. J. Impot. Res. 8: 47-52,
1996; Ballard et al., J. Urol. 159:
2164-71, 1998; Houslay, Semin. Cell Dev.
Biol. 9: 161-67, 1998; y Torphy et
al., Pulm. Pharmacol. Ther. 12: 131-35,
1999). En consecuencia, administrando un compuesto que regule
selectivamente la actividad de una familia o subfamilia de enzimas
PDE, es posible regular rutas de transducción de la señal de cAMP
y/o cGMP en una manera a células o tejidos específicas.
La PDE10 se identifica como una PDE única basada
en la secuencia de aminoácidos primaria y la diferente actividad
enzimática. El rastro de la homología de bases de datos de EST
reveló a la PDE10A como el primer miembro de la familia PDE10 de
fosfodiesterasas (Fujishige et al., J. Biol. Chem.
274: 18438-18445, 1999; Loughney et al.,
Gene 234:109-117, 1999). Los homólogos
humanos, de rata y murinos han sido clonados y las variantes de
empalme del extremo N han sido identificadas tanto para genes de
rata como para humanos (Kotera et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 261: 551-557, 1999; Fujishige et
al., Eur. J. Biochem. 266: 1118-1127,
1999; Soderling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96: 7071-7076, 1999); hay un alto grado de
homología entre especies. PDE10A hidroliza cAMP y cGMP en AMP y
GMP, respectivamente. La afinidad de PDE10A con cAMP (K_{m} =
0,05 \muM) es más alta que para cGMP (K_{m} = 3 \muM). Sin
embargo, una V_{max} de aproximadamente 5 veces más grande para
cGMP respecto cAMP ha conducido a la sugerencia de que PDE10A sea
una única cGMPasa cAMP-inhibida (Fujishige et
al., J. Biol. Chem. 274:18438-18445,
1999).
La PDE10A únicamente se localiza en mamíferos en
relación con otras familias de PDE. El ARN mensajero para PDE10A
se expresa altamente sólo en los testículos y el cerebro (Lanfear y
Robas, documento EP 0967284; Fujishige et al., Eur. J.
Biochem. 266:1118-1127, 1999; Soderling
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:
7071-7076, 1999; Loughney et al., Gene
234:109-117, 1999). Estudios iniciales
indicaron que, dentro del cerebro, la expresión es más alta en el
cuerpo estriado (caudado y putamen), nucleus accumbens, y
tubérculo olfativo (Lanfear y Robas, supra). En
consecuencia, la modulación selectiva de PDE10A podría ser usada
para modular los niveles de nucleótidos cíclicos en estas áreas
cerebrales.
La presente invención proporciona métodos para
identificar a agentes que modulen selectivamente la actividad de
PDE10A y las secuencias de polinucleótido y polipéptido para PDE10A
de rata.
En un aspecto, la invención se caracteriza por un
método de rastreo para un agente que inhibe la actividad de
fosfodiesterasa intracelular 10A que comprende administrar el agente
a neuronas espinosas medias del estriado y activar de modo
submáximo la adenilato ciclasa, administrar el agente a neuronas
espinosas medias del estriado y activar de modo submáximo la
guanilato ciclasa, medir la generación de cAMP y la generaración
cGMP, respectivamente, y calcular la EC_{200} de cAMP y la
EC_{200} de cGMP, respectivamente, en el que el agente se
identifica como un inhibidor de PDE10A si la relación de EC_{200}
de cAMP/EC_{200} de cGMP es comparable a la relación producida
por la administración de papaverina en las mismas condiciones de
ensayo.
Preferiblemente, las neuronas espinosas medias
del estriado se preparan como neuronas de cultivado primario, la
adenilato ciclasa se activa por la forskolina, la guanilato ciclasa
se activa por nitroprusida de sodio, y la relación de EC_{200}
de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de
1,75-5,25, más preferiblemente, de
3,0-4,0. Preferiblemente, la concentración de cAMP y
cGMP se mide por un ensayo de proximidad por centelleo. Se
prefiere que las neuronas usadas para evaluar cAMP y cGMP estén en
muestras separadas. Además, se prefiere que el agente se
identifique primero in vitro como un inhibidor selectivo de
PDE10A. De forma alternativa, el agente se identifica además como
un inhibidor selectivo de PDE10A por ensayo in vitro.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En un aspecto relacionado, la invención se
refiere a un polinucleótido aislado o purificado que comprende una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el polipéptido de
SEQ ID NO: 2 y/o la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1.
La invención también se refiere a un vector que
comprende la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1, y una
célula huésped que expresa la secuencia de codificación de SEQ ID
NO: 1.
Además, la invención proporciona un método para
identificar a un agente que module la actividad de PDE10A, que
comprende poner en contacto el agente con un polipéptido PDE10A de
rata que comprenda SEQ ID NO: 2 y medir la actividad del
polipéptido PDE10A, en el que una diferencia entre la actividad del
polipéptido PDE10A en presencia del agente y en ausencia del agente
es indicativa de que el agente modula la actividad de PDE10A.
También la invención se refiere a un método para
identificar a un agente que module la actividad de PDE10A, que
comprende poner en contacto el agente con una célula huésped que
exprese la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 y medir la
actividad del polipéptido PDE10A expresado por SEQ ID NO: 1, en el
que una diferencia entre la actividad del polipéptido PDE10A en
presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que
el agente modula la actividad de PDE10A.
Los expertos en la técnica entenderán totalmente
los términos usados en este documento en la descripción y las
reivindicaciones accesorias para describir la presente invención.
Sin embargo, a no ser que se proporcione de otra manera en este
documento, los términos siguientes son tal como se describen
inmediatamente a continuación.
Un "agente que aumenta la actividad de
PDE10A" se refiere a una molécula que intensifica o imita la
actividad biológica del polipéptido PDE10A. Tales agentes (es
decir, agonistas) pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos,
carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier otro compuesto o
composición que aumente la actividad de PDE10A aumentando la
cantidad de PDE10A presente en una célula o aumentando la actividad
catalítica del polipéptido PDE10A.
Un "agente que disminuye la actividad de
PDE10A" se refiere a una molécula que inhibe o atenúa la
actividad biológica del polipéptido PDE10A. Tales agentes (es
decir, antagonistas) pueden incluir proteínas tales como
anticuerpos de antiPDE10A, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas
moléculas, o cualquier otro compuesto o composición que disminuya
la actividad del polipéptido PDE10A reduciendo la cantidad del
polipéptido PDE10A presente en una célula, o disminuyendo la
actividad catalítica del polipéptido PDE10A.
Una "variante alélica" es una forma
alternativa del gen que codifica para el polipéptido PDE10A. Las
variantes alélicas pueden ser el resultado de al menos una mutación
en la secuencia de ácidos nucleicos y pueden causar mRNA cambiados
o polipéptidos cuya estructura o función pueden o no respecto a ser
cambiados. Un gen puede no tener ninguna, una, o muchas variantes
alélicas de su forma natural. Los cambios mutacionales comunes que
dan lugar a variantes alélicas generalmente son atribuidos a
deleciones que ocurren naturalmente, adiciones, o sustituciones de
nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios pueden ocurrir
solos, o en combinación con los otros, una o varias veces en una
secuencia dada.
Una secuencia de ácidos nucleicos
"modificada" que codifica para el polipéptido PDE10A incluye
una secuencia con una deleción, inserción, o sustitución de
nucleótidos diferentes, dando lugar a un polipéptido con al menos
una característica funcional de un polipéptido PDE10A. Incluido
dentro de esta definición están los polimorfismos que pueden o no
ser fácilmente detectables utilizando una sonda de oligonucleotido
particular del polinucleótido que codifica para un polipéptido
PDE10A. La proteína codificada también puede ser "modificada",
y puede contener una o varias deleciones, inserciones, o
sustituciones de los restos de aminoácidos que producen un cambio
silente y originan un polipéptido PDE10A que es sustancialmente
equivalente funcionalmente a un polipéptido PDE10A conocido. Las
sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden ser hechas sobre la
base de la semejanza en la polaridad, carga, solubilidad,
hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de
los restos, siempre que el polipéptido PDE10A sea sustancialmente
funcionalmente equivalente, por ejemplo, en la actividad catalítica
o inmunológica.
La "amplificación" se refiere a la
producción de copias adicionales de una secuencia de ácidos
nucleicos. Generalmente se lleva a cabo usando tecnologías de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocidas en la
técnica.
Un valor de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP
es "comparable" al producido por papaverina si varía en menos
o igual al 50% del valor de papaverina.
Una "composición" que comprende un
polinucleótido dado o polipéptido puede comprender una formulación
seca o una solución acuosa.
"Sustituciones de aminoácidos conservadoras"
son las sustituciones que, cuando se hacen, interfieren lo menos
posible con las propiedades de la proteína original, es decir, la
estructura y especialmente la función de la proteína es conservada
y no es modificada significativamente por tales sustituciones. Los
ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen las
siguientes: Ala sustituido por Gly o Ser; Arg sustituido por His o
Lys; Asn sustituido por Asp, Gln, o His; Asp sustituido por Asn o
Glu; Cys sustituido por Ala o Ser; Gln sustituido por Asn, Glu, o
His; Glu sustituido por Asp, Gln, o His; Gly sustituido por Ala;
His sustituido por Asn, Arg, Gln, o Glu; Ile sustituido por Leu o
Val; Leu sustituido por Ile o Val; Lys sustituido por Arg, Gln, o
Glu; Met sustituido por Leu o Ile; Phe sustituido por His, Met, Leu,
Trp, o Tyr; Ser sustituido por Cys o Thr; Thr sustituido por Ser o
Val; Trp sustituido por Phe o Tyr; Tyr sustituido por His, Phe, o
Trp; y Val sustituido por Ile, Leu, o Thr. Las sustituciones de
aminoácidos conservadoras mantienen generalmente la misma, o
esencialmente igual (a) estructura de la estructura del polipéptido
en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en
hoja \beta o helicoidal \alpha, (b) carga o hidrofobicidad de
la molécula en el sitio de la sustitución, y/o (c) el conjunto de
la cadena lateral.
El término "derivado" se refiere a la
modificación química de una secuencia de polinucleótido o
polipéptido. Las modificaciones químicas de una secuencia de
polinucleótido pueden incluir, por ejemplo, el reemplazo de
hidrógeno por un grupo alquilo, acilo, hidroxilo, o amino. Un
polinucleótido derivado codifica para un polipéptido que conserva
al menos una función biológica o inmunológica de la molécula
natural. Un polipéptido derivado es uno que se modifica por
glicosilación, pegilación, o cualquier otro procedimiento que
conserve al menos una función biológica o inmunológica del
polipéptido del cual fue derivado.
Un "fragmento" es una parte única de un
polipéptido PDE10A o el polinucleótido que codifica para un
polipéptido PDE10A que es idéntico en la secuencia, pero más corto
en la longitud, que la secuencia parental. Un fragmento usado como
una sonda, iniciador, antígeno, molécula terapéutica, o para otros
objetivos, puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60,
75, 100, 150, 250, o al menos 500 nucleótidos contiguos o restos de
aminoácidos en longitud. Los fragmentos pueden seleccionarse
preferencialmente a partir, o carecer, de ciertas regiones de una
molécula.
El término "identidad" se refiere a un grado
de complementariedad. Puede haber semejanza parcial o identidad
completa. La palabra "semejanza" puede sustituir a la palabra
"identidad". Una secuencia parcialmente complementaria que
inhiba al menos parcialmente una secuencia idéntica de la
hibridación a un ácido nucleico objetivo se denomina
"sustancialmente similar". La inhibición de la hibridación de
la secuencia completamente complementaria en la secuencia objetivo
puede ser examinada usando un ensayo de hibridación (inmunoensayo
Southern o Northern, hibridación en solución, y similares) en unas
condiciones de severidad reducida. Una secuencia sustancialmente
similar o sonda de hibridación competirán e inhibirán la unión de
una secuencia completamente similar (idéntica) a la secuencia
objetivo en condiciones de severidad reducida. Esto no debe querer
decir que las condiciones de severidad reducida sean tales que se
permita la unión no específica. Más bien, las condiciones de
severidad reducidas requieren que la unión de dos secuencias entre
sí sea una interacción específica (es decir, una selectiva). La
ausencia de unión no específica puede ser analizada por el uso de
una segunda secuencia objetivo que carezca hasta de un grado
parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de una semejanza o
identidad de aproximadamente 30%). En ausencia de una unión no
específica, la secuencia sustancialmente similar o la sonda no
hibridarán la segunda secuencia objetivo no complementaria.
Las expresiones "porcentaje de identidad" y
"% de identidad", aplicadas a las secuencias del
polinucleótido, se refieren al porcentaje de coincidencias de
restos entre al menos dos secuencias de polinucleótidos alineadas
usando un algoritmo estandarizado. Tal algoritmo puede insertar, de
un modo estandarizado y reproductible, huecos en las secuencias
que se comparan para optimizar el alineamiento entre dos
secuencias, y por lo tanto para alcanzar una comparación más
significativa de las dos secuencias. El porcentaje de identidad
entre secuencias de polinucleótidos puede ser determinada usando
los parámetros estandar del algoritmo CLUSTAL V como se incorpora
en el programa de alineamiento de secuencias MegAlign® versión
3.12e. Este programa es parte del paquete de software LASERGENE,
una serie de programas de análisis biológicos moleculares (DNASTAR,
Madison, Wis.). CLUSTAL V se describe en Higgins y Sharp,
CABIOS 5:151-153, 1989, y en Higgins
et al., CABIOS 8:189-19, 1992.
El porcentaje de identidad se refiere en CLUSTAL V como el
"porcentaje de semejanza" entre pares de secuencia de
polinucleótidos alineados. De forma alternativa, una serie de
algoritmos de comparación de secuencia usados comúnmente y
libremente disponibles se proporciona en el "National Center for
Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)" (Altschul et al., J. Mol. Biol.
215:403-410, 1990), que está disponible en
varias fuentes, incluyendo el NCBI, Bethesda, Md., y en
http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/. La serie del software BLAST
incluye varios programas de análisis de secuencia incluyendo el
"blastn", que se usan para alinear una secuencia de
polinucleótido conocida con otras secuencias de polinucleótido de
una variedad de bases de datos. También está disponible una
herramienta llamada "BLAST 2 Sequences" que se usa para una
comparación de parejas directa de dos secuencias de nucleótidos. Al
"BLAST 2 Sequences" puede accederse y usarse interactivamente
en http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. La herramienta
"BLAST 2 Sequences" puede usarse tanto para blastn como para
blastp (mencionado debajo). Los programas BLAST se usan comúnmente
con hueco y otros parámetros puestos en ajustes estándar. Por
ejemplo, para comparar dos secuencias de nucleótidos, se puede
usar el blastn con la herramienta "BLAST 2 Sequences" Versión
2.0.9 (7 de mayo de 1999) que usa la matriz Blossum 62 o la matriz
PAM250, un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, ó 80, y un peso de
longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. El porcentaje de identidad puede
medirse en la longitud de una secuencia entera definida, por
ejemplo, como se define por un número SEQ ID particular, o puede
medirse en una longitud más corta, por ejemplo, en la longitud de
un fragmento tomado a partir de una secuencia más grande, definida,
por ejemplo, un fragmento de al menos 20, al menos 30, al menos 40,
al menos 50, al menos 70, al menos 100, o al menos 200 nucleótidos
contiguos. Tales longitudes son ejemplares sólo, y se entiende que
cualquier longitud de fragmento descrita por las secuencias
mostradas en este documento puede ser usada para describir una
longitud sobre la cual el porcentaje de identidad pueda ser medido.
Las secuencias de ácidos nucleicos que no muestren un alto grado
de identidad, sin embargo, pueden codificar para secuencias de
aminoácidos similares debido a la degeneración del código genético.
Se entiende que los cambios de una secuencia de ácidos nucleicos
pueden hacerse usando esta degeneración para producir múltiples
secuencias de ácidos nucleicos abarcadas según la invención que
codifiquen todas los mismos o sustancialmente los mismos
polipéptidos de PDE10A.
Las expresiones "porcentaje de identidad" y
"% de identidad" aplicadas a las secuencias del polipéptido,
se refieren al porcentaje de coincidencias del resto entre al menos
dos secuencias del polipéptido alineadas usando un algoritmo
estandarizado. Los métodos de alineamiento de la secuencia del
polipéptido son conocidos. Algunos métodos de alineamiento tienen
en cuenta sustituciones de aminoácidos conservadoras. Tales
sustituciones conservadoras, explicadas más detalladamente
anteriormente, conservan generalmente la hidrofobicidad y la
acidez en el sitio de sustitución, conservando así la estructura y
la función del polipéptido. El porcentaje de identidad entre
secuencias del polipéptido puede ser determinado usando los
parámetros estandar del algoritmo CLUSTAL V como se incorpora en el
programa de alineamiento de secuencias MegAlign® (DNASTAR, Madison,
Wis.). La matriz de PAM250 se selecciona como la tabla de peso del
resto estandar. Como con los alineamientos del polinucleótido, el
porcentaje de identidad se refiere mediante el CLUSTAL V como el
"porcentaje de semejanza" entre pares de secuencia del
polipéptido alineados.
De forma alternativa, puede usarse la serie del
software NCBI BLAST. Por ejemplo, para una comparación por parejas
de dos secuencias del polipéptido, se puede usar la herramienta
"BLAST 2 Sequences" Versión 2.0.9 (7 de mayo de 1999) con el
blastp puesto en los parámetros estandar. En tales parámetros
estandar, por ejemplo, se pueden usar Matriz 62 Blossum, puntuación
= 50, y longitud de palabra = 3. El porcentaje de identidad puede
medirse sobre la longitud de una secuencia de polipéptido entera
definida, por ejemplo, como se define por un número de SEQ ID
particular, o puede medirse sobre una longitud más corta, por
ejemplo, sobre la longitud de un fragmento tomado a partir de una
secuencia del polipéptido más grande definido, por ejemplo, un
fragmento de al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al
menos 50, al menos 70, o al menos 100 restos contiguos. Tales
longitudes son ejemplares sólo, y se entiende que cualquier longitud
de fragmento basado en las secuencias mostradas en este documento,
incluyendo las Figuras y el Listado de Secuencias, puede usarse
para describir una longitud sobre la cual el porcentaje de
identidad pueda medirse.
Por un "huésped" se propone una célula
transgénica (por ejemplo, mamífera, bacteriana, de insecto) o un
animal (por ejemplo, mamífero no humano) que es transfectado, y
capaz de expresarse, con un polinucleótido heterólogo.
Un polinucleótido "heterólogo" es uno que es
extraño, o que se da artificialmente, o que se coloca
artificialmente en el genoma de la célula huésped.
La "hibridación" se refiere al procedimiento
por el cual una cadena de polinucleótido se hibrida con una cadena
complementaria a través de la base que se aparea en condiciones de
hibridación definidas. La hibridación específica es una indicación
de que dos secuencias de ácidos nucleicos comparten un alto grado
de identidad. Los complejos de hibridación específicos se forman en
condiciones de hibridación permisivas y quedan hibridados después
de la(s) etapa(s)
de "lavado". La(s) etapa(s) de lavado es(son) particularmente importante(s) en la determinación de la severidad del procedimiento de hibridación, con condiciones más rigurosas que permitan menos la unión no específica, es decir, la unión entre los pares de las cadenas de ácidos nucleicos que no estén perfectamente emparejadas. Las condiciones permisivas para hibridar las secuencias de ácidos nucleicos son determinables rutinariamente por cualquier experto ordinario en la técnica y pueden ser constantes entre experimentos de hibridación, mientras que las condiciones de lavado pueden variarse entre experimentos para alcanzar la severidad deseada, y por lo tanto la especificidad de la hibridación. Las condiciones de hibridación permisivas ocurren, por ejemplo, a 68ºC en presencia de aproximadamente 6X SSC, aproximadamente 1% (p/v) de SDS, y aproximadamente 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.
de "lavado". La(s) etapa(s) de lavado es(son) particularmente importante(s) en la determinación de la severidad del procedimiento de hibridación, con condiciones más rigurosas que permitan menos la unión no específica, es decir, la unión entre los pares de las cadenas de ácidos nucleicos que no estén perfectamente emparejadas. Las condiciones permisivas para hibridar las secuencias de ácidos nucleicos son determinables rutinariamente por cualquier experto ordinario en la técnica y pueden ser constantes entre experimentos de hibridación, mientras que las condiciones de lavado pueden variarse entre experimentos para alcanzar la severidad deseada, y por lo tanto la especificidad de la hibridación. Las condiciones de hibridación permisivas ocurren, por ejemplo, a 68ºC en presencia de aproximadamente 6X SSC, aproximadamente 1% (p/v) de SDS, y aproximadamente 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.
Generalmente, la severidad de la hibridación se
expresa, en parte, con referencia a la temperatura bajo la cual la
etapa de lavado se lleva a cabo. Generalmente, tales temperaturas de
lavado se seleccionan para que sean de aproximadamente 5ºC a 20ºC
más bajas que el punto de fusión termal (Tm) para la secuencia
específica con una fuerza iónica definida y pH. La Tm es la
temperatura (bajo una fuerza iónica definida y pH) a la que el 50%
de la secuencia objetivo se hibrida en una sonda perfectamente
emparejada. Una ecuación para calcular la Tm y las condiciones para
la hibridación de ácidos nucleicos se conoce y puede ser encontrada
en Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 2ª ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor
Press, Plainview, Nueva York; véase específicamente el vol. 2,
capítulo 9.
Altas condiciones de severidad para la
hibridación entre los polinucleótidos de la presente invención
incluyen condiciones de lavado de aproximadamente
55-68ºC en presencia de aproximadamente
0,2-1,0X SSC y aproximadamente 0,1% de SDS, durante
aproximadamente 1 hora.
En general, las reacciones de hibridación pueden
llevarse a cabo a temperaturas de aproximadamente 65ºC, 60ºC,
55ºC, o 42ºC. La concentración de SSC puede variar de
aproximadamente 0,1 a 2X SSC, estando SDS presente en
aproximadamente 0,1%. Típicamente, los reactivos bloqueantes se usan
para bloquear la hibridación no específica. Tales reactivos de
bloqueo incluyen, por ejemplo, ADN de esperma de salmón
desnaturalizado a aproximadamente 100-200 pg/ml. El
disolvente orgánico, tal como formamida a una concentración en v/v
de aproximadamente 35-50%, también puede usarse en
circunstancias particulares, tales como para hibridaciones RNA:DNA.
Variaciones útiles sobre estas condiciones de lavado serán
fácilmente evidentes para los expertos ordinarios en la técnica. La
hibridación, particularmente a altas condiciones de severidad, es
sugestiva de una semejanza evolutiva entre los nucleótidos, que es
fuertemente indicativa de un papel similar para los nucleótidos y
sus polipéptidos codificados.
La expresión "complejo de hibridación" se
refiere a un complejo formado entre dos secuencias de ácidos
nucleicos en virtud de la formación de enlaces de hidrógeno entre
bases complementarias. Un complejo de hibridación puede formarse
entre las secuencias presentes en la solución o formarse entre una
secuencia de ácidos nucleicos presente en solución y otra secuencia
de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido (por
ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, varillas o
portaobjetos).
Por "aislado o purificado" se entiende
cambiado desde el estado natural "por la mano del hombre". Si
un polinucleótido o polipéptido existe en la naturaleza, entonces
es "aislado o purificado" si es cambiado y/o eliminado de su
ambiente original. Por ejemplo, un polinucleótido "aislado o
purificado" se separa de otros polinucleótidos con los cuales
está asociado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de cDNA
que es eliminada de la secuencia intrónica normalmente asociada con
la secuencia de codificación es "aislada o purificada". Una
secuencia del polinucleótido "aislada o purificada" puede ser
introducida en células huésped en un cultivo o en organismos
enteros para su expresión transitoria o estable y ser todavía
"aislado y purificado", porque el polinucleótido no estaría
en su forma que ocurre naturalmente o ambiental. Sin embargo, las
secuencias del polinucleótido como miembros de genotecas de cDNA
están excluidas de lo que se propone por "aislado o
purificado". Un polipéptido "aislado o purificado" se
separa de al menos un componente celular con el cual está asociado
en la naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido está al menos 60%
libre, más preferiblemente, al menos 75% libre, y, lo más
preferiblemente, al menos 90% libre de otros componentes.
Por "modula" se propone aumentos o
disminuciones (incluyendo una eliminación completa).
"Operativamente unido" se refiere a la
situación en la cual una primera secuencia de ácidos nucleicos es
colocada en una relación funcional con una segunda secuencia de
ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está operativamente
unido para una secuencia de codificación si el promotor funciona
para regular la transcripción de la secuencia de codificación.
Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente pueden
estar en una proximidad cercana o contigua y, cuando sea necesario,
unirse a regiones que codifiquen para dos proteínas, en el mismo
marco de
lectura.
lectura.
"Polinucleótido" generalmente se refiere a
cualquier ARN (por ejemplo, mRNA), tipo ARN, ADN (por ejemplo,
cDNA o genómico), o secuencias del tipo ADN, incluyendo, sin límite,
secuencias monocatenarias, bicatenarias, y tricatenarias, cadenas
sentido o antisentido, secuencias generadas usando análogos de
nucleótidos, moléculas híbridas que comprenden ARN y ADN, y ARN o
ADN que contienen bases modificadas. El polinucleótido puede darse
naturalmente o ser sintetizado.
El término "polipéptido" se refiere a una
secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido, polipéptido, o
secuencia de proteína, o un fragmento de cualquiera de estos, y
darse naturalmente o ser moléculas sintéticas. Esto incluye
secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, tales
como tratamiento de post-translación, o por
modificaciones químicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo,
"Proteins-Structure and Molecular
Properties", editor Creighton, W.H. Freeman y Col., Nueva York,
2ª Ed., 1993; "Posttranslational Covalent Modification of
Proteins", editor Johnson, Academic Press, Nueva York, 1983;
Seifter et al., Meth. Enzymol., 182:
626-46, 1990; y Rattan et al., Ann. NY Acad.
Sci. 663: 48-62, 1992). Las
modificaciones conocidas incluyen, pero no están limitadas,
acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación,
enlace covalente de flavina, enlace covalente del resto hemo,
enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, lípido
o derivado de lípido, o fosfotidilinositol, entrecruzamiento,
ciclación, formación de puente de disulfuro, desmetilación,
formación de cistina o piroglutamato, formilación,
g-carboxilación, glicosilación, formación de ancla
de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación,
oxidación, tratamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de
transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y
ubiquitinación.
Por "actividad de PDE10A" se entiende la
hidrólisis mediada por PDE10A de cAMP y/o cGMP in vitro,
in vivo, o in situ.
Por un inhibidor de PDE10A "selectivo" se
propone un agente que inhiba la actividad de PDE10A con una
IC_{50} de al menos 10 veces menos que la observada para la
inhibición de otras PDE.
Una "sustitución" se refiere al reemplazo de
uno o varios aminoácidos o nucleótidos por aminoácidos diferentes
o nucleótidos, respectivamente.
Por adenilato ciclasa o guanilato ciclasa
activando "de modo submáximo" se entiende administrar un
compuesto a una concentración que alcance un aumento de cAMP o
cGMP, respectivamente, que sea de aproximadamente
10-50%, preferiblemente, aproximadamente
20-25%, del valor producido por la concentración
máxima eficaz del compuesto.
"Transformación" o "transfección"
describen un procedimiento de modificación genética por el que el
ADN heterólogo entra y da una célula receptora capaz de expresar el
ADN heterólogo. La transformación puede ocurrir en una célula
huésped procariota o eucariota de acuerdo con varios métodos
conocidos en la técnica. El método se selecciona basado en el tipo
de célula huésped que se transforma e incluye, pero no está
limitado, a la infección viral, electroporación, choque térmico,
lipofección, y bombardeo de partículas. Las expresiones "células
transformadas" o "células transfectadas" incluyen células
establemente transformadas en las que el ADN insertado es capaz de
replicación tanto como un plásmido que se replica autónomamente o
como parte del cromosoma del huésped, así como células
transitoriamente transformadas o transfectadas que expresan el ADN
insertado o el ARN durante períodos limitados de tiempo. Todas
tales células transformadas o transfectadas se denominan
"transgénicas".
Una "variante" de una secuencia de ácidos
nucleicos particular se define como una secuencia de ácidos
nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos 40%
frente a la secuencia de ácidos nucleicos particular sobre una
cierta longitud de una de las secuencias de ácidos nucleicos usando
la herramienta blastn "BLAST 2 Sequences" Versión 2.0.9,
puesta en los parámetros estandar. Tales secuencias pueden mostrar,
por ejemplo, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos
80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o
mayor, identidad de secuencia respecto a una cierta longitud
definida. Una variante puede ser descrita como, por ejemplo, una
de variante "alelo" (como se define anteriormente),
"empalme", "especie", o "polimorfa". Una variante de
empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de
referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de
polinucleótidos debido al empalme alterno de exones durante el
procesamiento del mRNA. El polipéptido correspondiente puede poseer
dominios funcionales adicionales o carecer de dominios que estén
presentes en la molécula de referencia. Las variantes de especie son
las secuencias de polinucleótido que varían de una especie a otra.
Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán una identidad de
aminoácidos significativa entre sí. Una variante polimorfa es una
variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular
entre los individuos de una especie dada. Las variantes polimorfas
también pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleótido"
(SNP) en los que la secuencia de polinucleótidos varía por una base
de nucleótido. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por
ejemplo, una cierta población, un estado de enfermedad, o una
propensión para un estado de enfermedad.
Otras propiedades y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y
de las reivindicaciones. Aunque la invención está descrita en
conexión con realizaciones específicas, será entendido que otros
cambios y modificaciones que puedan ser practicados son también
parte de esta invención y están también en la amplitud de las
reivindicaciones añadidas. Con esta memoria descriptiva se pretende
cubrir cualquier equivalente, variaciones, usos, o adaptaciones de
la invención que siguen, en general, los principios de la
invención, incluyendo las salidas de la presente descripción que
vienen dentro de la práctica conocida o usada comúnmente dentro de
la técnica, y que pueden averiguarse sin una experimentación
excesiva. La dirección adicional en lo que concierne a la
fabricación y utilización de ácidos nucleicos y polipéptidos es
encontrada en los manuales estándar de biología molecular, ciencia
de las proteínas, e inmunología (véase, por ejemplo, Davis et
al., "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevir
Sciences Publishing, Inc., New York, 1986; Hames et al.,
"Nucleic Acid Hybridization", IL Press, 1985; "Molecular
Cloning", Sambrook et al., "Current Protocols in
Molecular Biology", Eds. Ausubel et al., John Wiley and
Sons; "Current Protocols in Human Genetics", Eds. Dracopoli
et al., John Wiley and Sons; "Current Protocols in Protein
Science", Eds. John E. Coligan et al., John Wiley and
Sons; y "Current Protocols in Immunology", Eds. John E.
Coligan et al., John Wiley and Sons). Todas las
publicaciones mencionadas en este documento son incorporadas como
referencia en su totalidad.
La figura 1A muestra la secuencia del
polinucleótido que codifica para PDE10A de rata (SEQ ID NO: 1). La
figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos para el polipéptido
PDE10A de rata (SEQ ID NO: 2).
La presente invención proporciona un ensayo de
rastreo de células que usa neuronas espinosas medias del estriado
para identificar a agentes que inhiban la actividad de PDE10A a
nivel celular. Considerando el alto nivel confirmado de PDE10A en
neuronas espinosas medias del estriado (como además se describe en
el Ejemplo 1 debajo), estas células son candidatos excelentes para
el uso en un ensayo de células para identificar a los inhibidores
de la actividad de PDE10A. Tales inhibidores son útiles, por
ejemplo, para tratar trastornos de movilidad o de ánimo, ansiedad,
psicosis, drogadicción, y trastornos con síntomas de cognición
deficiente, como se describe además en la solicitud provisional de
EE.UU. 60/285.148. La presente invención también se refiere a las
secuencias del polinucleótido de PDE10A de rata y del
polipéptido.
El ensayo de células de la invención se deriva de
dos descubrimientos descritos además en los Ejemplos siguientes.
Primero, la papaverina es un inhibidor selectivo de PDE10A. Y
segundo, la administración de papaverina a neuronas espinosas
medias del estriado produce un perfil único de cambios a niveles de
cAMP y cGMP. Este perfil único indica que otros agentes que
producen la misma combinación de cambios en nucleótidos cíclicos en
neuronas espinosas medias del estriado también se identifican como
inhibidores de PDE10A.
Para llevar a cabo el ensayo, se usan neuronas
espinosas medias del estriado de mamífero. Las células pueden
prepararse como un cultivo primario (véase, por ejemplo, Ventimiglia
et al., Eur. J. Neurosci. 7: 213-22,
1995). De forma alternativa, puede usarse una línea celular de
neuronas espinosas medias del estriado inmortalizadas (Ehlich
et al., Exp. Neurol. 167: 215-26,
2001; Cattaneo y Conti, J. Neuroscience Res. 53:
223-34, 1998; Wainwright et al., J.
Neuroscience 15: 676-88, 1995).
Para el cultivo celular primario, las neuronas se
preparan disecando cerebros de un embrión de mamífero (por
ejemplo, un embrión de rata E17 o ratón), disociando el tejido en
una suspensión de células individuales, y cultivando las células
en los recipientes apropiados, tales como placas de multipocillos.
De ser deseado, puede ser determinada la presencia de neuronas
espinosas medias del estriado en la preparación analizando la
inmunorreactividad de GABA (Ventimiglia et al., supra) y
puede confirmarse la expresión de PDE10A, por ejemplo, por
inmunotransferencia o ensayo de protección de RNasa (véase el
Ejemplo 3 debajo).
Un ejemplo del protocolo de ensayo es como sigue.
Un cultivo de células primario de neuronas espinosas medias del
estriado (por ejemplo, rata) de 4-5 días se lava
in vitro en una solución salina tamponada de fosfato libre
de Ca^{2+}/Mg^{2+} y se preincuba durante aproximadamente 1
hora en una solución salina tamponada de fosfato que contiene
HEPES 30 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM, dextrosa 1 mg/ml, y
MgCl_{2} 5 mM. Los agentes de ensayo entonces se incuban con las
células en el mismo tampón a 37ºC durante aproximadamente 20
minutos.
Para analizar los cambios de cAMP, el cultivo de
neuronas también se incuba con una concentración submáxima de un
compuesto que estimula la adenilato ciclasa (por ejemplo, forskolina
1 \muM). Para analizar los cambios de cGMP, el cultivo de
neuronas se incuba con una concentración submáxima de un compuesto
que estimula a la guanilato ciclasa (por ejemplo, nitroprusida de
sodio 100 \muM (SNP)). Una concentración submáxima para un
compuesto que estimula la generación de nucleótidos cíclicos es una
concentración que genera 10-50%, preferiblemente
20-25%, de la concentración eficaz máxima. El
compuesto puede ser administrado durante la incubación del agente
de ensayo o durante un período subsecuente a la incubación del
agente de ensayo (por ejemplo, 1-5 minutos).
Las células son lisadas y los niveles de cAMP y
cGMP apropiados son medidos en el lisado de células utilizando
métodos estándar. Por ejemplo, los niveles de cAMP y cGMP pueden ser
medidos usando kits del ensayo de proximidad por centelleo (SPA)
(Nº. de cat. RPA 540 y RPA 559, respectivamente, Amersham,
Piscataway, N.J.). Los agentes de ensayo se estudian a
concentraciones que varían tal que el valor de EC_{200} pueda ser
determinado. La EC_{200} se define como la concentración de
agente de ensayo que aumenta los niveles de cAMP o cGMP en un 200%
comparado con el nivel de cAMP o cGMP medido en lisados de células
no tratadas por el agente de ensayo. Idealmente, las muestras
separadas de células son usadas para estimular las ciclasas y
evaluar los niveles de nucleótido cíclico. Sin embargo, la
estimulación de adenilato ciclasa y guanilato ciclasa puede ser
llevada a cabo en una sola muestra de células, el lisado de células
puede ser dividido en dos muestras, y luego pueden medirse cAMP y
cGMP separadamente en estos dos lisados.
Usando un cultivo primario de neuronas espinosas
medias del estriado y las condiciones de ensayo ejemplares
descritas anteriormente, un agente de ensayo se identifica como un
inhibidor de PDE10A si causa un aumento de cAMP y cGMP, en el que
la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el
intervalo de 1,75-5,25, preferiblemente,
2,5-4,5, más preferiblemente,
3,0-4,0. Si las células particulares o las
condiciones de ensayo son variadas de las de arriba, entonces el
intervalo de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP que indique que
el agente es un inhibidor de PDE10A puede ser determinado analizando
la papaverina como un control positivo en las condiciones
apropiadas. Un agente se identifica como un inhibidor de PDE10A si
produce una relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP que
es comparable (es decir, varía en no más del 50%) del valor para
papaverina.
Con el método de ensayo de la presente invención
se pueden usar protocolos de preparación de células estándar
alternativos (Misgeld y Dietzel, Brain Res. 492:
149-57, 1989; Shi y Rayport, J. Neurosci.
14: 4548-60, 1994; Mao y Wang, Mol. Brain
Res. 86: 125-37, 2001; Snyder et al.,
J. Neuroscience 20: 4480-88, 2000),
métodos alternativos estándar de estimular la formación de
nucleótido cíclico (Svenningsson et al., Neuroscience
84: 223-28, 1998; Glass y Felder, J.
Neurosci. 17: 5327-33, 1997), y/o métodos
alternativos estándar para la detección de nucleótido cíclico
(Villegas y Brunton, Analytical Biochem. 235:
102-3, 1996; Corbin et al., Methods Enzymol.
159: 74-82, 1988).
Aunque el ensayo de células de la presente
invención pueda ser llevado a cabo con agentes de ensayo para los
cuales no se conoce ninguna información anterior en cuanto a la
inhibición de PDE10A, se prefiere que el ensayo de células sea
usado como un ensayo secundario para confirmar que los agentes que
son identificados como inhibidores de PDE10A por análisis in
vitro también inhiban PDE10A a un nivel celular.
Preferiblemente, los agentes se identifican como inhibidores
selectivos de PDE10A. Como una alternativa al prerrastreo in
vitro también se pueden confirmar a agentes como inhibidores de
PDE10A analizando in vitro después de la identificación en
el ensayo de células.
Para los análisis in vitro, los agentes
serían identificados como inhibidores selectivos de PDE10A si la
IC_{50} para la inhibición de otras PDE diferentes a PDE10A fuera
al menos 10 veces mayor que la IC_{50} para la inhibición de
PDE10A. Para alcanzar valores de IC_{50} comparables, todos los
ensayos de PDE son llevados a cabo a las concentraciones de
sustrato de nucleótido cíclico que sean equivalentemente
proporcionales a la Km del nucleótido cíclico para cada enzima. Un
tipo de rastreo para identificar moduladores selectivos de PDE10A
usa enzimas naturales aisladas a partir de tejido o de enzimas
recombinantes aisladas a partir de células huésped transfectadas,
por ejemplo, células de insecto Sf9 (Fawcett, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 97: 3702-07, 2000), células de
levadura (Loughney et al., patente de EE.UU. Nº. 5.932.465),
o células COS-7 (Yuasa, J. Biol. Chem.
275: 31469-79, 2000). Preferiblemente, la
enzima de PDE10A es humana (por ejemplo, Loughney et al.,
patente de EE.UU. Nº. 5.932.465, Lanfear et al., documento EP
967284), ratón (por ejemplo, Lanfear et al., documento EP
967294), o rata (por ejemplo, SEQ ID NO: 2).
La actividad de PDE10A se mide, por ejemplo, como
la velocidad de hidrólisis de un sustrato apropiado,
[^{3}H]cAMP o [^{3}H]cGMP. Esta actividad se
mide, por ejemplo, por métodos basados en SPA (Fawcett, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97: 3702-07, 2000;
Phillips et al., documento WO 00/40733, y Thompson et
al., Biochem. 18: 5228, 1979 (como se modifica
utilizando el código del producto TRKQ7090/7100, Amersham Int'l
Ltd., Buckhamshire, Inglaterra)). Brevemente, se ponen en contacto
muestras que contienen la enzima de PDE10A con un sustrato de cAMP
o cGMP (Sigma Chemical), una parte (por ejemplo, de ^{1}/_{4} a
^{1}/_{2}) de la cual se marca con ^{3}H (Amersham). Las
reacciones se llevan a cabo, por ejemplo, en placas de microtítulo
(por ejemplo, placas Microfluor®, Dynex Technologies, Chantilly,
Va.), y son terminadas por la adición de perlas de SPA de silicato
de itrio (Amersham) que contienen un exceso del nucleótido cíclico
no marcado. Después se permite que las perlas sedimenten en la
oscuridad, las placas se leen mediante una placa lectora de
microtítulo (por ejemplo, TopCount®, Packard, Meriden, Conn.).
La actividad de PDE10A también puede ser
analizada por la detección de ^{32}P- fosfato liberado a partir
de ^{32}P-cAMP o ^{32}P-cGMP
(como se describe, por ejemplo, en Loughney et al., J. Biol.
Chem. 271: 796-806, 1996, y Loughney,
patente de EE.UU. Nº. 5.932.465), o usando anticuerpos para
distinguir entre los sustratos de PDE, cGMP o cAMP, y sus productos
hidrolizados (utilizando, por ejemplo la tecnología FlashPlate®,
NEN® Life Sciences Products, Boston, MA).
Como una alternativa al ensayo de la actividad
catalítica de PDE10A, pueden identificarse agentes como los
moduladores positivos de PDE10A o moduladores negativos
(antagonistas) si modulan indirectamente la actividad catalítica
de PDE10A, por ejemplo, vía la modificación de
post-translación (por ejemplo, fosforilación), la
modulación de unión de ligando alostérico (por ejemplo, vía el
dominio GAF (Fawcett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
3702-7, 2000)), o uniendo a las PDE10A mismas en un
sitio catalítico o regulador alostérico. Los métodos para
determinar la fosforilación de PDE10A y la unión de ligando
alostérico se describen en la bibliografia (véase, por ejemplo,
McAllister-Lucas et al., J. Biol. Chem.
270: 30671-79, 1995, y Corbin et al., Eur.
J. Biochem. 267: 2760-67,
2000).
2000).
Los agentes de ensayo usados para rastrear in
vitro y en los ensayo de células de la presente invención
pueden seleccionarse individualmente o ser obtenidos a partir de
una genoteca de compuestos. Tales agentes incluyen péptidos,
genotecas moleculares derivadas por química combinatoria hechas de
aminoácidos con configuración D y/o L, fosfopéptidos, anticuerpos,
y pequeños compuestos orgánicos e inorgánicos. Las genotecas
incluyen genotecas biológicas, genotecas de compuestos naturales,
genotecas peptoides (genotecas de moléculas que tienen las
funciones de péptidos, pero con estructuras no peptídicas nuevas que
son resistentes a la degradación enzimática aunque permanezcan
bioactivas) (véase, por ejemplo, Zuckermann, J. Med. Chem.
37: 2678-85, 1994), genotecas de fase sólida
paralela espacialmente direccionable o fase en solución, métodos de
genoteca sintética que requieren desconvolución, el método de
genoteca de "una-perla
un-compuesto", y métodos de genoteca sintéticos
usando la selección por cromatografía de afinidad.
Los ejemplos de métodos para la síntesis de
genotecas moleculares pueden ser encontrados en la técnica, por
ejemplo, en DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:
6909, 1993; Erd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:
11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:
2678, 1994; Cho et al., Science, 261: 1303, 1995;
Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061,
1994; y Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233,
1994.
Las genotecas de compuestos pueden ser
presentadas en solución (por ejemplo, Houghten,
Biotechniques, 13: 412-421, 1992), o
sobre perlas (Lam, Nature 354: 82-841,
1991), sobre chips (Fodor, Nature 364:
555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner,
patente de EE.UU. Nº. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 89: 1865-1869,
1992) o sobre bacteriófagos (Scott et al., Science
249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249:
404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (EE. UU) 87: 6378-6382, 1990;
Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310,
1991; Ladner, supra).
La invención abarca la secuencia de PDE10A
aislada o purificada de rata, por ejemplo, como se muestra en la
figura 1B (SEQ ID NO: 2).
La invención también comprende las secuencias que
codifican para el nucleótido que codifican para PDE10A de rata,
por ejemplo, como se muestra en la figura 1A.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
para PDE10A de rata pueden ser ampliadas utilizando una secuencia
de nucleótidos parcial y empleando varios métodos basados en PCR
conocidos en la técnica para detectar las secuencias corriente
arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo,
un método que puede ser empleado, PCR de sitio de restricción, usa
iniciadores universales y anidados para amplificar la secuencia
desconocida del ADN genómico dentro de un vector de clonación
(véase, por ejemplo, Sarkar, PCR Methods Applic. 2:
318-322, 1993). Otro método, PCR inversa, usa
iniciadores que amplian en direcciones divergentes para amplificar
la secuencia desconocida de una plantilla circularizada. La
plantilla se deriva de fragmentos de restricción que comprenden un
lugar genómico conocido y secuencias circundantes (véase, por
ejemplo, Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16:
8186, 1988). Un tercer método, PCR de captura, implica la
amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a secuencias
conocidas en humanos y ADN de cromosoma artificial de levadura
(véase, por ejemplo., Lagerstrom et al., PCR Methods Applic.
1: 111-119, 1991). En este método, pueden
usarse múltiples digestiones de enzima de restricción y ligamientos
para insertar una secuencia bicatenaria genéticamente modificada
en una región de secuencia desconocida antes de la realización de la
PCR.
En otra realización de la invención, puede
clonarse un polinucleótido de la invención en moléculas de ADN
recombinantes que dirigen la expresión de PDE10A de rata en células
huésped apropiadas. Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden ser modificadas genéticamente usando métodos
generalmente sabidos en la técnica para modificar secuencias que
codifican para PDE10A con una variedad de objetivos incluyendo,
pero no limitados, a la modificación de la clonación, el
procesamiento, y/o la expresión del producto génico.
Puede usarse la técnica de barajar el ADN por
fragmentación aleatoria y reensamblaje por PCR de fragmentos
génicos y oligonucleotidos sintéticos para modificar genéticamente
las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede usarse
mutagénesis dirigida mediada por oligonucleotido para introducir
las mutaciones que crean nuevos sitios de restricción, modificar el
modelo de glicosilación, modificar la preferencia del codon,
producir variantes de empalme, etcétera, etcétera. En otra
realización, pueden ser sintetizadas secuencias que codifican para
PDE10A de rata, en todo o en parte, usando métodos químicos
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Caruthers et al.,
Nucleic Acids Symp. Ser. 7: 215-223,
1980; y Horn et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 7:
225-232, 1980). De forma alternativa, la PDE10A de
rata en sí misma o uno de sus fragmentos pueden ser sintetizados
usando métodos químicos. Por ejemplo, puede ser realizada la
síntesis del péptido usando varias técnicas en fase sólida (véase,
por ejemplo, Roberge et al., Science 269:
202-204, 1995). La síntesis automatizada puede ser
lograda usando el sintetizador de péptidos ABI 431A
(Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.). Además, la
secuencia de aminoácidos de PDE10A de rata, o cualquiera de sus
partes, puede ser modificada durante la síntesis directa y/o
combinada con secuencias de otras proteínas, o cualquiera de sus
partes, para producir el polipéptido variante. El péptido puede
ser purificado sustancialmente por cromatografía líquida de alta
resolución preparatoria (véase, por ejemplo, Chiez y Regnier,
Methods Enzymol. 182: 392-421, 1990).
Se puede confirmar la composición de los péptidos sintéticos
mediante el análisis de aminoácidos o por secuenciación (véase, por
ejemplo, Creighton, "Proteins, Structures and Molecular
Propierties", WH Freeman, Nueva York,
1984).
1984).
Para expresar una PDE10A de rata biológicamente
activa, la secuencia de nucleótidos que codifica para PDE10A de
rata puede ser insertada en un vector de expresión apropiado, es
decir, un vector que contenga los elementos necesarios para el
control transcripcional y de translación de la secuencia de
codificación insertada en un huésped adecuado. Estos elementos
incluyen secuencias reguladoras, tales como potenciadores,
promotores constitutivos e inducibles, y regiones 5' y 3' no
traducidas derivadas del vector y/o de las secuencias del
polinucleótido que codifican para PDE10A de rata. Tales elementos
pueden variar en su fuerza y especificidad. También pueden usarse
señales de iniciación específicas para alcanzar una traducción más
eficiente de secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A.
Tales señales incluyen el codon de iniciación ATG y las secuencias
adyacentes, por ejemplo la secuencia Kozak. En los casos en los que
las secuencias que codifican para PDE10A de rata y su codon de
iniciación y las secuencias corriente arriba reguladoras son
insertadas en el vector de expresión apropiado, pueden no ser
necesarias ningunas señales de control adicionales
transcripcionales o de translación. Sin embargo, en los casos en
los que se inserta sólo la secuencia de codificación, o uno de sus
fragmentos, las señales control de translación exógena incluyendo
un codon de iniciación de ATG en marco debería ser proporcionado
por el vector. Los elementos de translación exógenos y los codones
de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como
sintéticos. La eficacia de expresión puede ser realzada por la
inclusión de potenciadores apropiados por el sistema de célula
huésped particular usado (véase, por ejemplo, Scharf et al.,
Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162,
1994). Pueden usarse métodos que son conocidos para los expertos en
la técnica, a la luz de esta descripción, para construir vectores
de expresión que contienen las secuencias que codifican para el
polipéptido PDE10A y elementos de control transcripcionales y de
translación apropiados. Estos métodos incluyen la técnicas de ADN
recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación
genética in vivo (véase, por ejemplo, Sambrook et
al., "Molecular Cloning, Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor, Plainview, Nueva York, capítulos 4, 8, y
16-17, 1989; Ausubel et al., "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley e Hijos, Nueva York,
capítulos 9, 13, y 16, 1995). Una variedad de sistemas de expresión
de vector/huésped puede ser utilizada para contener y expresar las
secuencias que codifican para PDE10A de rata. Estos incluyen, pero
no están limitados, a microorganismos tales como bacterias
transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos, o
vectores de expresión de ADN cósmido; levaduras transformadas con
vectores de expresión de levadura (por ejemplo, episomas, elementos
cromosómicos); sistemas de células de insecto infectados con
vectores de expresión viral (por ejemplo, baculovirus, paponavirus,
Vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, virus de la
rabia, y retrovirus); sistemas de células de plantas transformados
con vectores de expresión viral (por ejemplo, virus del mosaico de
la coliflor, CaMV, o virus del mosaico del tabaco, TMV), con
vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o
pBR322), o sistemas de células de animales. La invención no está
limitada por la célula huésped empleada.
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse
varios vectores de clonación y expresión dependiendo del uso
pretendido para las secuencias del polinucleótido que codifican para
PDE10A de rata. Por ejemplo, una clonación de rutina,
subclonación, y propagación de las secuencias del polinucleótido
que codifican para el polipéptido PDE10A de rata pueden ser
logradas usando un vector de E. coli multifuncional tal como
pBlueScript (Stratagene, La Jolla, California) o el plásmido
pSport1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). El ligamiento de
las secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A de rata en
los múltiples sitios de clonación del vector interrumpe el gen
lacZ, permitiendo un procedimiento de rastreo colorimétrico para la
identificación de bacterias transformadas que contienen moléculas
recombinantes. Además, estos vectores pueden ser útiles para la
transcripción in vitro, secuenciación didesoxi, rescate
monocatenario con bacteriófago auxiliar, y la creación de
deleciones anidadas en la secuencia clonada (véase, por ejemplo,
Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:
5503-5509, 1989). Cuando son necesarias grandes
cantidades del polipéptido PDE10A, por ejemplo, para la producción
de anticuerpos, pueden usarse vectores que dirigen un nivel alto de
expresión del polipéptido PDE10A. Por ejemplo, pueden usarse los
vectores que contienen el promotor de bacteriófago T5 o T7 fuerte e
inducible.
La expresión de proteínas recombinantes puede ser
maximizada en la bacteria huésped proporcionando una base genética
en la que la célula huésped tiene una capacidad impedida de escindir
proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman et al.,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:
119-28, 1990). De forma alternativa, la secuencia
del polinucleótido puede ser modificada para proporcionar un uso
del codon preferencial para una célula huésped específica, por
ejemplo, E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res.
20: 2111-18, 1992).
En los sistemas de expresión de levadura, pueden
usarse varios vectores que contienen a promotores constitutivos o
inducibles, tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, o
promotores de PGH, por ejemplo, en la levadura Saccharomyces
cerevisiae o Pichia pastoris. Además, tales vectores
dirigen la secreción o la retención intracelular de proteínas
expresadas y permiten la integración de secuencias extrañas en el
genoma del huésped para una propagación estable (véase, por
ejemplo, Ausubel, 1995; Bitter et al., Methods Enzymol.
153: 516-544, 1987; y Scorer et al.,
BioTechnology 12: 181-184, 1994). Los
sistemas de plantas también pueden usarse para la expresión de
PDE10A de rata. Puede llevarse a cabo la transcripción de
secuencias que codifican para el polipéptido PDE10A mediante
promotores virales, por ejemplo, los promotores 35S y 19S de CaMV
usados solos o en combinación con la secuencia de líder Omega a
partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:
307-311, 1987). De forma alternativa, pueden usarse
promotores de planta tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o
promotores de choque térmico (véase, por ejemplo, Coruzzi et
al., EMBO J. 3: 1671-1680, 1984;
Broglie et al., Science 224: 838-843,
1984; y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:
85-105, 1991). Estos constructos pueden ser
introducidos en células de plantas por la transformación de ADN
directa o la transfección mediada por patógenos (véase, por
ejemplo, "The McGraw Hill Yerabook of Science and Technology",
McGraw Hill, Nueva York, págs. 191-196, 1992).
En las células de mamíferos, pueden ser
utilizados varios sistemas de expresión viral. En los casos en los
que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias
que codifican para el polipéptido PDE10A pueden ser ligadas en un
complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en
un promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en
una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para
obtener el virus infectivo que exprese PDE10A de rata en células
huésped infectadas (véase, por ejemplo, Logan y Shenk, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659,
1984). Además, pueden usarse potenciadores de transcripción, tales
como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para
aumentar la expresión en células huésped de mamíferos. Los
vectores basados en SV40 o EBV también pueden usarse para expresar
la proteína en un alto nivel.
También pueden emplearse HAC, BAC o YAC para
suministrar los fragmentos más grandes de ADN que puedan estar
contenidos y expresarlos a partir de un plásmido. Por ejemplo, HAC
de aproximadamente 6 kb a 10 Mb son construidos y suministrados
vía métodos de suministro convencionales (liposomas, polímeros de
amino policatiónicos, o vesículas) con objetivos terapéuticos
(véase, por ejemplo, Harrington et al., Nat. Genet.
15: 345-355, 1997). Para la producción a
largo plazo de proteínas recombinantes en sistemas de mamíferos, se
prefiere la expresión estable de PDE10A de rata en líneas
celulares. Por ejemplo, las secuencias que codifican para PDE10A de
rata pueden ser transformadas en líneas celulares usando vectores
de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación
y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador
seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de
la introducción del vector, se deja a las células crecer durante
aproximadamente 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiar
al medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es
conferir resistencia a un agente selectivo, y su presencia permite
el crecimiento y la recuperación de células que expresen
satisfactoriamente las secuencias introducidas. Los clones
resistentes de células establemente transformadas pueden ser
propagados usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas a cada
tipo de célula.
La invención también abarca vectores en los
cuales las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este
documento son clonadas en el vector en orientación inversa, pero
que se unen operativamente a una secuencia reguladora que permita
la transcripción de ARN antisentido. Así, puede ser producida una
transcripción antisentido en todo, o una parte, de las secuencias
de la molécula del ácido nucleico descritas en este documento,
incluyendo tanto regiones codificantes como no codificantes. La
expresión de este ARN antisentido está sujeta a cada uno de los
parámetros descritos anteriormente en relación con la expresión del
ARN sentido.
Cualquier número de sistemas de selección puede
usarse para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos
incluyen, pero no están limitados, a genes de quinasa de timidina
del virus del herpes simple y adenina fosforibosiltransferasa,
para el uso en células TK^{-}, y APR^{-}, respectivamente
(véase, por ejemplo, Wigler et al., Cell 11:
223-232, 1997; Lowy et al., Cell
22: 817-823, 1980). También, puede usarse la
resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base
para la selección. Por ejemplo, Dhfr confiere resistencia a
metotrexato; Neo confiere resistencia a la neomicina de
aminoglucósidos y G-418; y Als y Pat confieren
resistencia a clorosulfuron y fosfinotricina acetiltransferasa,
respectivamente (véase, por ejemplo, Wigler et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 3567-3570, 1980;
Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol.
150: 1-14, 1981). Otros genes seleccionables
han sido descritos, por ejemplo, TrpB y HisD, que cambian los
requerimientos celulares para metabolitos (véase, por ejemplo,
Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
8047-8051, 1988). Pueden usarse marcadores visibles,
por ejemplo, antocianinas, proteínas fluorescentes verdes (GFP;
Clontech, Palo Alto, California),
\beta-glucuronidasa y su sustrato
\beta-glucurónido, o luciferasa y su sustrato
luciferina. Estos marcadores pueden usarse no sólo para identificar
transformantes, sino que también para cuantificar la cantidad de
expresión de la proteína transitoria o estable atribuible a un
sistema de un vector específico (véase, por ejemplo, Rhodes,
Methods Mol. Biol. 55: 121-131,
1995). Aunque la presencia/ausencia de las expresión del gen
marcador sugiera que el gen de interés está también presente, la
presencia y la expresión del gen pueden tener que ser confirmadas.
Por ejemplo, si la secuencia que codifica para PDE10A de rata es
insertada dentro de una secuencia de un marcador génico, las células
transformadas que contienen las secuencias que codifican para el
polipéptido PDE10A pueden ser identificadas por ausencia de la
función del marcador génico. De forma alternativa, un gen marcador
puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifique para
el polipéptido PDE10A bajo el control de un promotor individual. La
expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o la
selección indica por lo general la expresión de la secuencia de
PDE10A tándem también.
En general, las células huésped que contienen la
secuencia de ácidos nucleicos que codifican para PDE10A de rata y
las que expresan PDE10A de rata pueden ser identificadas por una
variedad de procedimientos conocidos para los expertos en la
técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados, a
hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN,
amplificación por PCR, y bioensayo de proteínas o técnicas de
inmunoensayo que incluyen las tecnologías basadas en la membrana,
disolución, o chips para la detección y/o la cuantificación de
secuencias de ácidos nucleicos o proteínas.
Se conocen métodos inmunológicos para detectar y
medir la expresión de PDE10A usando anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos en la técnica. Los ejemplos de tales
técnicas incluyen ensayo inmunosorbente ligada a enzimas (ELISA),
radioinmunoensayos (RIA), inmunotransferencias,
inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, y separación de células
activadas por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos son
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hampton,
"Serological Methods, A laboratory Manual", APS Press, San
Pablo, MN, Sección IV, 1990; Coligan et al., "Current
Protocols in Immunology", Greene Pub. Associates y
Wiley-Interscience, Nueva York, 1997; y Pound,
"Immunochemical Protocols", Humana Press, Totowa, N.J., 1998).
Se conoce una amplia variedad de técnicas de marcaje y conjugación
por los expertos en la técnica y pueden usarse en los diversos
ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos.
El medio para producir la hibridación marcada o
sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a los
polinucleótidos que codifican para PDE10A de rata incluye
oligomarcaje, traslación por cortez, marcaje del extremo, o
amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.
De forma alternativa, las secuencias que
codifican para PDE10A de rata, o cualquiera de sus fragmentos,
pueden ser clonadas en un vector para la producción de una sonda de
mRNA. Se conocen tales vectores en la técnica, están disponibles
en el comercio, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in
vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como
T7, T3, o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden
ser llevados a cabo usando una variedad de kits disponibles en el
comercio (por ejemplo, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,
N.J.; Promega, Madison, Wis.; y US Biochemical, Cleveland, Ohio).
Moléculas indicadoras adecuadas o marcadores que pueden usarse para
facilitar la detección incluyen radioisótopos, enzimas, agentes
fluorescentes, quimiluminiscentes, o cromogénicos, así como
sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y otros
por el estilo.
Las células huésped transformadas con secuencias
de nucleótidos que codifican el polipéptido PDE10A pueden ser
cultivadas en condiciones adecuadas para la expresión y la
recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. La
proteína producida por una célula transformada puede ser secretada o
conservada intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el
vector usado. Como será entendido por los expertos en la técnica,
los vectores de expresión que contienen los polinucleótidos que
codifican para PDE10A de rata pueden ser diseñados para que
contengan las secuencias de señal que dirigen la secreción de PDE10A
de rata por una membrana de célula procariota o eucariota. Además,
una cepa de célula huésped puede ser escogida por su capacidad de
modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar
la proteína expresada de la manera deseada. Tales modificaciones
del polipéptido incluyen, pero no están limitadas, a acetilación,
carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y
acilación. El procesamiento de post-translación que
rompe una forma "prepro" o "pro" de la proteína también
puede usarse para especificar el reconocimiento de la proteína, la
desnaturalización, y/o la actividad.
Diferentes células huésped que tienen la
maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para
las actividades de post-translación (por ejemplo,
CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y W138) están disponibles de la colección
americana de cultivos tipo (ATCC, Manassas, VA) y pueden ser
escogidas para asegurar la modificación correcta y el
procesamiento de la proteína extraña. En otra realización de la
invención, las secuencias de ácidos nucleicos naturales,
modificadas, o recombinantes que codifican para el polipéptido
PDE10A pueden ser ligadas a una secuencia heteróloga que causa la
traducción de una proteína de fusión en cualquiera de los sistemas
de huésped anteriormente mencionados. Por ejemplo, una proteína de
PDE10A quimérica que contenga un resto heterólogo que pueda ser
reconocido por un anticuerpo disponible en el comercio puede
facilitar el rastreo de genotecas de péptidos para moduladores de
actividad del polipéptido PDE10A. La proteína heteróloga y los
restos del péptido también pueden facilitar la purificación de
proteínas de fusión usando matrices de afinidad disponibles en el
comercio. Tales restos incluyen, pero no están limitados, a
glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión
de maltosa (MBP), tioredoxin (Trx), péptido de unión a calmodulina
(CBP), 6-His, FLAG, c-myc, y
hemaglutinina (HA). GST, MBP, Trx, CBP, y 6-His
permiten la purificación de sus proteínas de fusión cognadas sobre
glutationa inmovilizada, maltosa, óxido de fenilarsina,
calmodulina, y resinas de quelato metálico, respectivamente. FLAG,
c-myc, y hemaglutinina (HA) permiten la
purificación por inmunoafinidad de proteínas de fusión usando
anticuerpos monoclonales y policlonales disponibles en el comercio
que reconocen específicamente estos marcadores de epítopo. Una
proteína de fusión también puede ser genéticamente modificada para
que contenga un sitio de división proteolítica localizado entre el
polipéptido PDE10A que codifica la secuencia y la secuencia de la
proteína heteróloga, de modo que el polipéptido PDE10A pueda ser
dividido lejos del resto heterólogo después de la purificación. Los
métodos para la expresión de proteínas de fusión y la purificación
son discutidos en Ausubel (1995, supra, capítulo 10). Una
variedad de kits disponibles en el comercio también puede usarse
para facilitar la expresión y la purificación de proteínas de
fusión.
En una realización más de la invención, la
síntesis de PDE10A de rata radiomarcada puede ser lograda in
vitro usando el sistema de lisado de reticulocito TNT de conejo
o extracto de germen de trigo (Promega). Estos sistemas acoplan la
transcripción y la traducción de secuencias que codifican para la
proteína operativamente asociados con los promotores T7, T3, o SP6.
La traducción ocurre en presencia de un aminoácido radiomarcado,
por ejemplo, ^{35}S-metionina.
Los fragmentos de PDE10A de rata pueden ser
producidos no sólo por medios recombinantes, sino que también por
la síntesis directa del péptido usando técnicas en fase sólida
(véase, por ejemplo, Creighton, supra, págs.
55-60). La síntesis de proteínas puede ser realizada
por técnicas manuales o por la automatización. La síntesis
automatizada puede ser lograda, por ejemplo, usando el sintetizador
de péptidos ABI® 431A (Perkin-Elmer). Varios
fragmentos de la PDE10A de rata pueden ser sintetizados
separadamente y luego ser combinados para producir la molécula de
longitud entera.
La presente invención proporciona además kits de
detección de ácidos nucleicos, tales como sistemas o microsistemas
de moléculas de ácidos nucleicos que están basados en la información
de la secuencia proporcionada en la figura 1A.
Como se usa en este documento los sistemas o
microsistemas se refieren a una serie de polinucleótidos distintos
u oligonucleotidos sintetizados sobre un sustrato, tal como papel,
nilón, u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos, o
cualquier otro soporte sólido adecuado. En una realización, el
microsistema se prepara y se usa de acuerdo con métodos descritos
en Chee et al., patente de EE.UU. Nº. 5.837.832, Chee et
al., documento WO 95/11995, Lockhart et al., Nat.
Biotech. 14: 1675-80, 1996, Schena
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
10614-19, 1996. Otros sistemas son producidos por
los métodos descritos en Brown et al., patente de EE.UU.
Nº. 5.807.522, y en Baldeschwieler et al., documento WO
95/25116.
Ha sido publicado previamente el mRNA de PDE10A
dentro del cerebro en el cuerpo estriado, nucleus accumbens,
y turbérculo olfativo (Lanfear y Robas, documento EP 0967284). Los
experimentos siguientes confirmaron estas conclusiones y además
caracterizaron la expresión de PDE10A en ratones y ratas.
Fueron recogidos cerebros de ratón y rata después
de una decapitación rápida, fueron congelados en isopentano en
hielo carbónico, y cortados en secciones de 20 \muM en un
criostato de Hacker-Brigth (Hacker Instruments,
Fairfield, N.J.). Las secciones de todos los niveles del cerebro de
ratón y de rata fueron montadas por deshielo en portaobjetos antes
de ser cubiertas con el reactivo Vectabond® (Vector Laboratories,
Burlingame, California), fueron fijadas en una solución de
paraformaldehído del 4%, deshidratadas en etanol, y almacenadas con
desecante en recipientes herméticos a 4ºC hasta su uso.
Fue insertado el ADN del plásmido que contenía un
fragmento de 914 pares de bases aislado a partir de cDNA de
PDE10A de ratón (correspondiente a los pares de bases
380-1294) en E. coli (DH5\alpha),
que fue cultivada en un cultivo de suspensión. El ADN del plásmido
fue extraído con un kit Maxi-prep Qiagen® (Qiagen,
Valencia, California) y fue almacenado hasta su uso. Para la sonda
antisentido, el plásmido fue linealizado con la endonucleasa de
restricción XbaI. Para la sonda sentido, el plásmido fue linealizado
con la enzima de restricción EcoR1. El ADN de plantilla entonces
fue purificado usando un kit de PCR Qiaquick® (Qiagen) y fue
transcrito y marcado con ^{33}P-UTP utilizando un
kit de Maxiscript® (Ambion, Austin, Texas). La sonda antisentido
fue generada con la polimerasa T7, y la sonda sentido con la
polimerasa SP6. Las ribosondas marcadas finales se prepararon
usando una columna G50 QuickSpin® (Novagen, Madison, Wis.), y fueron
diluidas en tampón de hibridación comercial (Novagen).
Las secciones cerebrales montadas en los
portaobjetos fueron incubadas en proteinasa K (1 \mug/ml) durante
5 minutos, fueron aclaradas en agua sin RNasa, fueron suspendidas
en trietilamina 0,1 M (TEA) a pH 8,0, y fueron acetiladas por la
adición de anhídrido acético del 0,25% durante 5 minutos. Las
sondas fueron aplicadas a las secciones montadas en los
portaobjetos en un volumen de 10-25 \mul/sección
que contenía ^{33}P (0,5-1 x 10^{6} cpm por
sección). Como un control, un pequeño número de secciones de
cerebro de ratón fueron pretratadas con RNasa (20 \mug/ml) antes
de la hibridación. Las secciones fueron incubadas de la noche a la
mañana en un ambiente húmedo a 50ºC, y luego fueron aclaradas en 2X
SSC, fueron tratadas con RNasa A para destruir el ARN
monocatenario, fueron lavadas en una serie de lavado estándar, y
deshidratadas en una serie graduada de soluciones de etanol. Los
cortes resultantes fueron colocados en una película
\beta-max (Amersham, Piscataway, N.J.) en casetes
de rayos X estándar, y fue expuesta durante 5-10
días.
Después de la exposición de la película, los
cortes se sumergieron en una emulsión NTB-2 de
Kodak® (Compañía Eastman Kodak, Rochester, Nueva York) diluida 1:1
con agua a 43ºC en condiciones protecctoras de la luz. Los cortes
fueron secados al aire y fueron expuestos durante dos semanas a una
oscuridad total durante el almacenaje a -20ºC. Los cortes fueron
desarrollados en revelador D-19 de Kodak® y fijador
de Kodak® a 19ºC. Los portaobjetos fueron contrateñidos con azul
de toluidina del 1%, fueron deshidratados en alcohol, y
cubridos.
Un anticuerpo dirigido contra el polipéptido
PDE10A de rata fue generado para estudios de inmunocitoquímica. La
secuencia de PDE10A de rata de cadena entera (figura 1B, SEQ ID NO:
2) con un marcaje del extremo His fue expresada en células de
insecto Sf9 de acuerdo con los métodos anteriormente mencionados
(Fawcett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
3702-07, 2000). Una purificación en tres etapas
usando cromatografía Ni-NTA, intercambio de tampón,
y cromatografía de intercambio aniónico proporcionó un producto
final que era 95% puro, tenía la masa apropiada predicha de 97 Kd
como se determina por espectrometría de masas, y tenía actividad
de hidrólisis con cGMP. La PDE10A purificada fue usada para
inmunizar ratones y se prepararon hibridomas clonales usando
protocolos estándar. Un anticuerpo denominado 24F3. F11 fue escogido
para el uso.
La afinidad del anticuerpo monoclonal 24F3. F11
para PDE10A de humano y rata fue analizado usando lisados de
células de una línea celular de Sf9 que expresó PDE10A humano y una
línea celular Sf9 que expresó PDE10A de rata. El anticuerpo
monoclonal 24F3. F11 reconoce a PDE10A recombinante de rata y
humano. Los lisados de las células recombinantes, así como el
control de las células Sf9, fueron sometidos a electrofóresis de
gel. Las manchas del gel fueron incubadas después con el anticuerpo
24F3. F11, y fue determinada la unión del anticuerpo 24F3. F11 a
las manchas. No fue observada inmunorreactividad de PDE10A en la
columna que contenía los lisados de células Sf9 que no expresan la
proteína recombinante.
La especificidad del anticuerpo 24F3. F11 para
PDE10A fue comparada con las de las PDE de las otras diez familias
del gen de PDE. El anticuerpo 24F3. F11 no tuvo reacciones cruzadas
con ninguna otra PDE.
La expresión de PDE10A en diferentes regiones de
cerebro de rata fue determinada por inmunotransferencia "Western
Blot" con el anticuerpo 24F3. F11 y por inmunocitoquímica. Para
los análisis de inmunotransferencia "Western Blot", las ratas
fueron sacrificadas por decapitación y los cerebros fueron
retirados rápidamente y enfriados en hielo. Las diferentes regiones
cerebrales fueron identificadas y microdisecadas usando técnicas
estándar. Las secciones cerebrales fueron homogeneizadas en 10
volúmenes de tampón (NaCl 250 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 5
mM, NP-40 del 0,1%) en un homogeneizador de
vidrio/vidrio. Los lisados fueron centrifugados a 4000
revoluciones por minuto (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, modelo
5417R) y los sobrenadantes fueron sometidos a análisis por
inmunotransferencia "Western Blot" usando protocolos
estándar.
Para la inmunocitoquímica, los cerebros de rata
fueron fijados por inmersión en formalina tamponada del 10% (pH
7,0) durante 24 horas y luego fueron embebidos en parafina.
Secciones (6 \muM) fueron desparafinadas e hidratadas en agua
destilada. Los epítopos enmascarados fueron recuperados usando
tampón de citrato (pH 6) calentado a 96ºC durante 20 minutos. Las
secciones fueron incubadas a temperatura ambiente con el anticuerpo
24F3. F11 (1,2 \mug/ml) durante 60 minutos. Como controles,
fueron incubados en paralelo sobre secciones de replicado un
anticuerpo control del isotipo de IgG1 y el anticuerpo 24F3. F11
preabsorbido con una concentración saturante (como se determina
por inmunotransferencia) de PDE10A. La tinción positiva fue
detectada usando el complejo
avidin-biotin-HRP y fue visualizada
con diaminobenzidina (DAB). Ningún producto de reacción fue
observado en los controles de IgG1 y F11 preabsorbido.
Las autoradiografías de las secciones de cerebro
de ratón marcadas antisentido de PDE10A mostraron una señal de
hibridación altamente específica. El marcaje denso fue encontrado en
sólo tres áreas; cuerpo estriado dorsal (caudado y hueso), cuerpo
estriado ventral (nucleus accumbens), y tubérculo olfativo.
Dentro del cuerpo estriado y nucleus accumbens, el mRNA de
PDE10A fue expresado altamente en neuronas espinosas medias del
estriado, que representan aproximadamente el 95% de todas las
neuronas encontradas en estas estructuras. Una densidad inferior
de marcaje fue notada en las capas del cuerpo detentado y capas CA
del hipocampo y en la capa de células granulares del cerebelo.
Ninguna diferencia significativa fue observada en el modelo de
marcaje en el cerebro de rata en relación con el de ratón.
El marcaje de PDE10A in situ fue
específico. Las secciones del cerebro de ratón pretratadas con
RNAsa A antes de la hibridación no tenían ninguna incorporación
visible de marcaje.
Había una correspondencia muy buena entre las
áreas de localización del mRNA de PDE10A y aquellas áreas
clásicamente asociadas con la alta expresión del receptor de
dopamina. Esta semejanza además fue apoyada por autoradiografías
de emulsión, que permiten la localización subcelular y una mayor
resolución en relación con la autoradiografía de películas. La
incorporación densa de granos de plata fue notada en todas las
partes del cuerpo estriado, nucleus accumbens, y tubérculo
olfativo, y fue notado que cubría la basta mayoría de los enormes
cuerpos de células neuronales en estas tres áreas. Además, las
áreas que expresan bajos niveles pero mensurables de receptores de
dopamina también mostraron una deposición de grano, en basta
correspondencia con su densidad de receptor de DA relativa. Estos
incluyeron notablemente las cortezas media y sulcal prefrontal, así
como el cuerpo detentado y las capas de CA del hipocampo. Sin
embargo, ninguna acumulación de grano fue vista en la pars
reticulata de la sustancia negra, una zona de expresión del
receptor de dopamina D1 densa.
Compatible con los niveles de mRNA, un nivel alto
de la proteína PDE10A fue demostrado en el cuerpo estriado
(caudado y putamen), nucleus accumbens, y tubérculo olfativo.
La proteína PDE10A fue observada en los cuerpos de células
neuronales y en todas las partes del neurópilo. Además, un nivel
alto de proteína PDE10A, pero no mRNA de PDE10A, fue observado en
las regiones cerebrales que proyentan a las neuronas espinosas
medias del estriado, incluyendo la cápsula interna, globus
pallidus, núcleo entopeduncular, y sustancia negra.
Considerando la ausencia de mRNA de PDE10A en estas regiones, el
nivel alto de proteína de PDE10A debe provenir de los axones y los
terminales de las neuronas espinosas medias del estriado.
Fue identificada papaverina analizandola in
vitro como un inhibidor selectivo de PDE10A. La papaverina fue
analizada por su capacidad de inhibir a PDE10A comparado con las PDE
de otras familias génicas. Las PDE 2, 3, y 5 humanas fueron
aisladas del cuerpo cavernoso, fue aislada PDE1 humana a partir del
ventrículo cardíaco, y la PDE4 humana fue aislada a partir del
músculo esquelético (Boolell et al., Int. J. Impotence
Research 8: 7-52, 1996). Fueron
generadas fosfodiesterasas 7-11 de clones
recombinantes de longitud completa transfectados en células SF9
como se describe antes (Fisher et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 246: 570-577, 1998; Fisher et
al., J. Biol. Chem. 273: 15559-15564,
1998b; Soderling et al., PNAS 96:
7071-7076, 1999; Fawcett et al., PNAS
97: 3702-3707, 2000). Las enzimas fueron
purificadas por FPLC a partir de la fracción soluble de los
lisados de células como se describe en Boolell et al.,
supra.
La actividad de PDE fue medida usando un método
basado en SPA como se describe antes (Fawcett et al., 2000).
Los ensayos fueron llevados a cabo usando una cantidad fija de
enzima de PDE10A en presencia de concentraciones de inhibidor
variables. Los sustratos de nucleótido cíclico (cGMP o cAMP en una
relación 3:1 de no marcados frente a
^{3}H-marcados) usados en los ensayos fueron 1/3
de la concentración de Km, permitiendo las comparaciones en los
valores de IC_{50} del inhibidor para las diferentes PDE. El
volumen del ensayo final fue ajustado a 100 \mul con tampón de
ensayo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 5 mM,
albúmina de suero bovino 1 mg/ml).
Las reacciones fueron iniciadas con la adición de
enzima. Las muestras fueron incubadas durante 30-60
minutos a 30ºC para dar < 30% de recambio de sustrato y fueron
terminadas con perlas de SPA de silicato de itrio de 50 \mul
(Amersham) que contenían 3 mM del nucleótido cíclico apropiado no
marcado. Las placas fueron reselladas y agitadas durante 20
minutos; después se permitió a las perlas sedimentarse durante 30
minutos en la oscuridad y luego fueron contadas en un lector de
placas TopCount (Packard, Meriden, Conn.). Las unidades de
radiactividad fueron convertidas a porcentaje de actividad
comparando con un control sin inhibición (100%). Los valores de
IC_{50} fueron obtenidos usando la aplicación de Microsoft Excel
de ajuste de curva.
La papaverina fue identificada como un inhibidor
competitivo de PDE10A, con un valor de IC_{50} de 17 nM. La
papaverina era bastante menos potente contra todas las otras PDE
analizadas (Tabla 1), demostrando la selectividad con PDE10A.
Isozima | IC_{50} (\muM) | Selectividad |
PDE10A | 0,018 | 1,0 |
PDE1 | 37 | 2.055 |
PDE2 | 9 | 500 |
PDE3A | 1,3 | 72 |
PDE4A | 1,9 | 105 |
PDE4B | 1,4 | 78 |
PDE4C | 0,8 | 44 |
PDE4D | 0,32 | 18 |
PDE5 | 8 | 444 |
PDE7 | 27 | 1.500 |
PDE8A | 10 | 555 |
PDE9 | 400 | 20.000 |
PDE11 | 11 | 611 |
\vskip1.000000\baselineskip
Considerando la especificidad de la papaverina
para inhibir PDE10A, fue administrada papaverina a neuronas
espinosas medias del estriado primarias cultivadas para determinar
si la inhibición de PDE10A selectiva tenía un efecto único sobre
el metabolismo del nucleótido cíclico en estas células. Los efectos
de la papaverina fueron comparados con los efectos que son el
resultado de la administración de otros inhibidores de PDE,
3-isobutil-1-metilxantina
(IBMX), rolipram, y zaprinast (todos inhibidores de PDE disponibles
en Sigma, San Louis, Mo.).
Los cultivos del cuerpo estriado se prepararon
como se describe antes (Ventimiglia et al., Eur. J.
Neurosci. 7: 213-222, 1995). Brevemente,
fueron disecados los cuerpo estriados (núcleo caudado y putamen) de
ratas E17, fueron disociados para producir una suspensión de
células solas, y colados en placas a una densidad de 5 x 10^{4}
neuronas/pocillo en placas de 96 pocillos revestidas de
poli-L-ornitina/laminina (Nº. de
cat. 354657, BD Biosciences, Bedford, MA). Las células fueron
colocadas en placas en medio Neurobasal (Nº. de cat.
21103-049, Gibco BRL, Grand Island, Nueva York) con
suplementos B27 (Nº. de cat. 17504-010, Gibco BRL)
y factor neurotrófico derivado de cerebro recombinante humano por
(BDNF) (100 ng/ml) (Nº. de cat. 248-BD, R & D
Systems, Minneapolis, Minn.). Las neuronas espinosas medias del
cuerpo estriado comprendian el 50-60% de células en
estos cultivos, como se confirma por un protocolo de
inmunorreactividad de GABA como se ha descrito antes (Ventimiglia
et al., 1995, supra). El ensayo de protección de la RNasa
confirmó la expresión de mRNA de PDE10A en estos cultivos, como se
describe además debajo.
Después de aproximadamente cuatro días in
vitro, las células del cuerpo estriado fueron lavadas con una
solución salina tamponada de fosfato sin Ca^{2+}/Mg^{2+} (pH
7,4) y fueron preincubadas durante una hora en un tampón que
contenía una solución salina tamponada de fosfato sin
Ca^{2+}/Mg^{2+}, HEPES 30 mM (pH 7,4), CaCl_{2} 1 mM,
dextrosa 1 mg/ml, y MgCl_{2} 5 mM. Las células del cuerpo
estriado fueron expuestas después a uno de los inhibidores de PDE y
fueron incubadas durante 20 minutos a 37ºC. Cuando se medía cGMP,
las neuronas fueron estimuladas con nitroprusida de sodio (SNP)
(100 \muM) durante dos minutos después de 20 minutos de
incubación con el inhibidor de PDE. Cuando se medía cAMP, las
neuronas fueron estimuladas con forskolina (1 \muM) para una
duración de incubación de inhibidor de 20 minutos. Estas
concentraciones de SNP y forskolina fueron escogidas como las
concentraciones submáximas que produjeron aproximadamente el
20-25% de la respuesta máxima (SNP 1000 \muM y
forskolina 10 \muM produjeron aumentos máximos de cGMP y cAMP,
respectivamente).
Los sistemas SPA de cGMP y cAMP (código Amersham
RPA 540 y RPA 559, respectivamente) fueron usados para detectar
las concentraciones de cGMP y cAMP respectivas en el lisado de
células. Las células fueron lisadas utilizando una combinación de
tampón de ensayo de rastreo directo de SPA 9:1 (acetato 0,05 M con
azida de sodio del 0,01%) y tampón A (bromuro de
dodeciltrimetilamonio 133 mg/ml), y los lisados fueron congelados
en hielo carbónico.
En las células no estimuladas por SNP o
forskolina, la papaverina no afectó a los niveles de cAMP o cGMP en
los cultivos del cuerpo estriado. En ausencia de un inhibidor de
PDE, las concentraciones submáximas de forskolina (1 \muM) y SNP
(100 \muM) causaron un aumento de 2-3 veces sobre
los cAMP y cGMP de base. La papaverina causó un aumento
dependiente en la concentración de la acumulación de cGMP inducida
por SNP con un valor de EC_{200} (concentración del inhibidor que
proporciona un aumento de 2 veces) de 11,7 \muM (Tabla 2). Un
efecto máximo fue observado con papaverina 100 \muM; los niveles
de cGMP fueron elevados 5 veces en los cultivos estimulados con
SNP solo. La papaverina también causó un aumento de la acumulación
de cAMP en los cultivos estimulados por forskolina con una
EC_{200} de 38,3 (Tabla 2). Así, la papaverina era 3,3 veces
menos potente en la promoción de un aumento de cAMP que cGMP, como
se determina por la relación de EC_{200} de cGMP/EC_{200} de
cAMP (Tabla 2).
En contraste, IBMX, un inhibidor de PDE no
selectivo, causó (en el intervalo de 3-100 \muM)
un aumento dependiente de la concentración tanto para la
acumulación de cGMP como de cAMP en cultivos estimulados por SNP
como de forskolina con valores de EC_{200} de 19 y 30 \muM,
respectivamente. El inhibidor selectivo de PDE4 rolipram aumentó
la acumulación de cAMP estimulada por forskolina con un valor de
EC_{200} de 2,5 \muM y requirió concentraciones 10 veces más
altas para doblar la velocidad de acumulación de cGMP. Zaprinast,
un inhibidor de las PDE que prefieren cGMP, dobló los niveles de
cAMP en estas neuronas a una concentración de 98 \muM. Sin
embargo, 100 \muM de este compuesto no dobló realmente
exactamente el nivel de cGMP. Se muestran las comparaciones de las
relaciones de EC_{200} de cGMP/EC_{200} de cAMP para cada
inhibidor de PDE en la Tabla 2 y se demuestra que los inhibidores
selectivos de PDE10A (como se representa por papaverina) tienen un
efecto único sobre la regulación de nucleótido cíclico en neuronas
espinosas medias del estriado.
inhibidor de PDE | EC_{200} de cGMP | EC_{200} de cAMP | EC_{200} de cGMP/EC_{200} de cAMP |
\muM \pm SEM (n) | \muM \pm SEM (n) | ||
Papaverina | 11,7 \pm 8,2 (4) | 38,3 \pm 11,4 (4) | 3,3 |
Rolipram | 29,2 \pm 10,3 (3) | 2,5 \pm 2,0 (3) | 0,09 |
Zaprinast | 98,3 \pm 10,3 (3) | 100 (3) | 1 |
IBMX | 19,5 (1) | 30,2 (2) | 1,5 |
El ARN fue preparado a partir de un cultivo
primario de neuronas espinosas medias del estriado de rata por
centrifugación a 150.000 x g a 20ºC durante 21 horas por un
gradiente de cloruro de cesio 5,7 M como se describe antes
(Iredale Pa., et al., Mol. Pharmacol. 50:
1103-1110, 1996). El pelet de ARN fue resuspendido
en acetato de sodio 0,3 M, pH 5,2, y fue precipitado en etanol. La
concentración de ARN fue determinada por espectrofotometría. Una
ribosonda de PDE10A fue preparada por amplificación por PCR de un
fragmento de 914 bp aislado de cDNA de ratón (correspondiente a
las pares de bases 380-1294 de la Genoteca
AF110507). Este fragmento entonces fue clonado después en pGEM3Zf.
El vector fue linealizado y fue usada la ARN polimerasa T7 para
sintetizar la ribosonda antisentido
^{32}P-marcada.
El ensayo de protección de RNase fue realizado
usando el kit de RPAII (Ambion). Brevemente, 5 \mug del total
del ARN celular fue hibridado con una ribosonda de PDE10A
^{32}P-marcada (aproximadamente 105 cpm/muestra)
de la noche a la mañana a 42ºC. Al día siguiente las muestras fueron
incubadas con RNasa A y T1 durante 30 minutos a 37ºC y los
fragmentos de ARN bicatenarios protegidos fueron precipitados
después y corridos en un gel de poliacrilamida del 6% que contenía
urea. Los resultados de este ensayo confirmaron que el mRNA de
PDE10A estaba presente en un nivel alto en el cultivo primario de
neuronas espinosas medias del estriado.
La secuencia que codifica para la proteína de
PDE10A humano (Genoteca AB020593) fue usada para buscar un
subconjunto seleccionado de la base de datos "National Center for
Biotechnology Information" (NCBI) "Expressed Sequence Tag"
(EST) que contenía los EST no humanos utilizando la herramienta
"Basic Local Alignment Search Tool" (BLAST) (Altshul et
al., J. Mol. Bio. 215, 403-410,
1990). La secuencia de aminoácidos predicha por un EST de rata
(H32734) era homóloga a una parte interna de la proteína humana.
Además, la secuencia de ácidos nucleicos de este EST era altamente
homóloga a la de PDE10A de ratón (Genoteca AF110507). Los
inventores usamos esta información de EST más las técnicas de
"Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE) para identificar la
secuencia de 5' y 3' auténtica a partir del ARN de cerebro de rata,
que fue usado después para aislar un cDNA de PDE10A de rata
completo.
El 5' RACE fue realizado usando los kit de 5'
RACE (Gibco/BRL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
La primera hebra de cDNA fue generada usando el iniciador 1358 3'
específico del gen (Tabla 3), 1 \mug del ARN total de cerebro de
rata Sprague-Dawley, y la transcriptasa inversa
Superscript® II (Gibco/BRL). El primero ciclo de la PCR fue
llevado a cabo usando el iniciador 1357 específico del gen 3'
anidado (Tabla 3) y el iniciador adaptador de 5' (el iniciador
"Abridged Anchor Primer" (AAP)) del kit. Las condiciones de
ciclación incluyeron una desnaturación inicial de 2 minutos a 94ºC
seguido de una desnaturación de 35 ciclos a 94ºC durante 45 s, un
templado a 54ºC durante 30 s, una extensión de 72ºC durante 3
minutos, más una extensión final de 10 minutos a 72ºC (Robocycler
(R), Stratagene, La Jolla, California).
El producto de la PCR del primer ciclo (1 \mul)
fue usado como plantilla en un segundo ciclo de la PCR utilizando
las condiciones de ciclación anteriores, con el iniciador 1356
específico del gen anidado (Tabla 3) y el iniciador adaptador 5'
(iniciador "Abridged Universal Amplification Primer" (AUAP))
del kit. Seis productos de la PCR separados fueron identificados
por electrofóresis en geles de agarosa del 1,2%. Estas bandas
fueron aisladas individualmente usando un kit de extracción de gel
(Qiagen, Valencia, California), fueron clonadas en TOPO de pCR4
(Invitrogen, Carlsbad, California) y fueron transfectadas en células
TOP10 (Invitrogen). Las colonias fueron seleccionadas por PCR con
los iniciadores específicos del vector 1369 y 1370 (Tabla 3) como
los descritos anteriormente y fueron secuenciados clones positivos
múltiples de cada banda.
Todas las secuencias fueron alineadas para
producir una secuencia acorde al extremo 5' de PDE10A de rata. La
3' RACE fue realizada usando un kit de 3' RACE (Gibco/BRL) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. La primera hebra de
cDNA fue generada a partir de 2 \mug del ARN total de cerebro de
rata usando el iniciador adaptador de 3' (AP) y la transcriptasa
inversa Superscript® II. El primer ciclo de la PCR fue llevado a
cabo usando el iniciador 1375 5' específico del gen (Tabla 3) y el
3' AP del kit. Las condiciones de ciclación fueron como las
descritas anteriormente. El producto de la PCR del primer ciclo (1
\mul) fue usado como plantilla en un segundo ciclo de PCR, usando
las mismas condiciones de ciclación, con el iniciador 1376 anidado
(Tabla 3) y 3' AUAP. Cuatro productos de la PCR discretos del
tamaño esperado aproximado fueron identificados por electrofóresis
en geles de agarosa del 1,2%. Estas bandas fueron aisladas y
subclonadas y las colonias fueron rastreadas como anteriormente.
Los clones positivos fueron identificados a partir de un producto
de la PCR. Las secuencias de seis de estos clones fueron alineadas
para producir una secuencia acorde con el extremo 3' de PDE10A de
rata.
Para aislar el cDNA de PDE10A de rata de longitud
completa, la primera cadena de cDNA fue generada por triplicado a
partir del ARN de cerebro de rata total usando el Sistema
Superscript® (Gibco/BRL). El iniciador 1380 5' y el iniciador 1407
3' (Tabla 3) fueron diseñados a partir de la información de la
secuencia 5' y 3' de rata generada anteriormente y modificada
genéticamente para incluir los sitios de restricción SalI
flanqueantes para facilitar la clonación. La PCR fue realizada
usando una Sistema de Alta Fidelidad PCR (Boehringer Mannheim
(Roche), Basilea, Suiza). Las condiciones de ciclación eran una
desnaturación inicial de 2 minutos a 94ºC, seguido de 4 ciclos de
desnaturación de 94ºC durante 45 s, un templado de 48ºC durante 30
s, una extensión de 72ºC durante 3,5 minutos, después 30 ciclos de
desnaturación de 94ºC durante 45 s, un templado de 55ºC durante 30
s, una extensión de 72ºC durante 3,5 minutos, más una extensión
final de 10 minutos a 72ºC (Robocycler (R), Stratagene). Las
reacciones de la PCR separadas fueron llevadas a cabo para cada una
de las tres plantillas de cDNA de la primera cadena.
Una banda de aproximadamente 2,3 kb de cada
reacción PCR fue aislada por gel usando un kit de extracción de
gel (Qiagen, Valencia, California) y fue ligada en Blunt PCR
(Invitrogen) y fue transformada como anteriormente. Los clones
correctos fueron identificados por PCR colonia utilizando los
iniciadores específicos 1385 y 1386 de PDE10 de rata (Tabla 3) y la
digestión de restricción SalI. Múltiples clones de cada reacción
PCR por transcripción inversa separada fueron secuenciados, y todas
las secuencias fueron alineadas para determinar un consenso.
Fueron identificados y secuenciados dos clones libres erroneos
(pNB1426 y pNB1427). Se muestran la secuencia del polinucleótido
(SEQ ID NO: 1) y la secuencia del aminoácido predicha (SEQ ID NO:
2) para PDE10A de rata en la figura 1A y la figura 1B,
respectivamente.
INICIADOR | SECUENCIA (5'-3') |
1317 | CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG (SEQ ID NO: 3) |
1318 | AGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEQ ID NO: 4) |
1356 | GTACAGCTCCTTGTTCTTGTGG (SEQ ID NO: 5) |
1357 | CCAGCAATCCCTTTCTCAATGG (SEQ ID NO: 6) |
1358 | GTAGGCATCAGGAATGTTCAGG (SEQ ID NO: 7) |
1369 | TATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID NO: 8) |
1370 | GTTGTAAAACGACGGCCAGTG (SEQ ID NO: 9) |
1375 | TAGCAATACACCAGGTGCAGG (SEQ ID NO: 10) |
1376 | CAGACCGAACTGAATGACTTCC (SEQ ID NO: 11) |
1380 | TGTCGACTATAAATATGTCTGGTTTGACGGATG (SEQ ID NO: 12) |
1385 | GGAATGAAGGAAGGTCAACC (SEQ ID NO: 13) |
1386 | GCTGTCAATTTTGTAACTGG (SEQ ID NO: 14) |
1407 | AGTCGACGTCATCGACCTTCCTGGTC (SEQ ID NO: 15) |
<110> Pfizer Products Inc.
\hskip1cmJames, Larry C.
\hskip1cmLebel, Lorraine A.
\hskip1cmMenniti, Frank S.
\hskip1cmStrick, Christine A.
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<120> Ensayo celular de PDE10 y
secuencias
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<130> PC23111ANIS
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<150> US 60/308,978
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<151>
2001-07-31
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<160> 15
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 3219
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 773
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipcccagtcacg acgttgtaaa acg
\hfill23
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<210> 4
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipagcggataac aatttcacac agg
\hfill23
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<210> 5
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgtacagctcc ttgttcttgt gg
\hfill22
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<210> 6
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<211> 22
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipccagcaatcc ctttctcaat gg
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaggcatca ggaatgttca gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgaccatg attacgccaa gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgtaaaac gacggccagt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcataca ccaggtgcag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipcagaccgaac tgaatgactt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgactaatt aaatatgtct ggtttgacgg atg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipggaatgaagg aaggtcaacc
\hfill20
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<210> 14
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgtcaatt ttgtaactgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcgacgtc atcgaccttc ctggtc
\hfill26
Claims (14)
1. Un método para rastrear un agente que inhiba
la actividad de fosfodiesterasa 10A intracelular, comprendiendo
dicho método:
i) administrar el agente a neuronas espinosas
medias del estriado y activar de modo submáximo a la adenilato
ciclasa;
ii) administrar el agente a neuronas espinosas
medias del estriado y activar de modo submáximo a la guanilato
ciclasa;
iii) medir la generación de cAMP en las células
de la etapa (i) y la generación de cGMP en las células de la etapa
(ii);
iv) calcular la EC_{200} de cAMP para la etapa
(i) y la EC_{200} de cGMP para la etapa (ii);
en el que el agente se identifica como un
inhibidor de PDE10A si la relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200}
de cGMP es comparable a la relación producida por la administración
de papaverina en las mismas condiciones de ensayo.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dichas neuronas espinosas medias del estriado se preparan como
neuronas de un cultivo primario.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la
adenilato ciclasa se activa por forskolina, la guanilato ciclasa
se activa por nitroprusida de sodio, y la relación de EC_{200} de
cAMP/EC_{200} de cGMP está en el intervalo de
1,75-5,25.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
dicha relación de EC_{200} de cAMP/EC_{200} de cGMP está en el
intervalo de de 3,0-4,0.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la
concentración de cAMP y cGMP se mide por un ensayo de proximidad
por centelleo.
6. El método de la reivindicación 1, en el que,
antes de las etapas (i) y (ii), dicho agente se identifica in
vitro como un inhibidor selectivo de PDE10A.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho agente se identifica además como un inhibidor selectivo de
PDE10A por un ensayo in vitro.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
las neuronas de las etapas (i) y (ii) están en muestras
separadas.
9. Un polipéptido aislado o purificado que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
10. Un polinucleótido aislado o purificado que
comprende:
i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
para el polipéptido de la SEQ ID NO: 2;
ii) la secuencia de codificación de SEQ ID NO:
1.
11. Un vector que comprende un polinucleótido de
la reivindicación 10.
12. Una célula huésped transformada con un vector
de la reivindicación 11 y que expresa un polinucleótido de la
reivindicación 10.
13. Un método para identificar a un agente que
modula la actividad de PDE10A, comprendiendo dicho método poner en
contacto dicho agente con un polipéptido PDE10A que comprende SEQ ID
NO: 2 y medir la actividad de dicho polipéptido PDE10A, en el que
una diferencia entre dicha actividad del polipéptido PDE10A en
presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que
el agente modula dicha actividad.
14. Un método para identificar a un agente que
modula la actividad de PDE10A, comprendiendo dicho método poner en
contacto dicho agente con una célula huésped de la reivindicación 12
y medir la actividad de dicho polipéptido PDE10A, en el que una
diferencia entre dicha actividad del polipéptido PDE10A en
presencia del agente y en ausencia del agente es indicativa de que
el agente modula dicha actividad.
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