ES2291362T3 - Procedimientos de cribado para identificar proteinas g y otros compuestos que modulan la actividad de la fosfodiesterasa (pde). - Google Patents

Abstract

Procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una fosfodiesterasa (PDE) de Tipo I, procedimiento que comprende: (a) poner en contacto un polipéptido de activación del efector con un polipéptido PDE de Tipo I en condiciones que permitan la unión del polipéptido de activación del efector con el polipéptido PDE, comprendiendo el polipéptido de activación del efector una zona de activación del efector de una proteína G; y (b) detectar la unión del polipéptido de activación del efector con el polipéptido PDE en presencia y en ausencia de un compuesto de ensayo, en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que modula la actividad de una PDE de Tipo I si la unión del polipéptido de activación del efector al polipéptido PDE está modulada en presencia del compuesto de ensayo.

Description

Procedimientos de cribado para identificar proteínas G y otros compuestos que modulan la actividad de la fosfodiesterasa (PDE).

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos procedimientos de transducción de señal en células. En particular, la invención se refiere a la transducción de señal mediante una clase de enzimas conocidas como enzimas fosfodiestearasa o PDE. La invención se refiere asimismo a una clase de moléculas de señalización conocidas como receptores de proteína acoplada a G (GCPR) y proteínas G. La invención proporciona nuevos procedimientos para cribar e identificar proteínas G y otros compuestos que modulan la señalización mediante estas dos clases de proteínas. En particular, se refiere a nuevos análisis que identifican compuestos que modulan (p. ej., aumentan o inhiben) la unión entre un polipéptido PDE y un dominio de activación del efector de una proteína G.

2. Antecedentes de la invención

Los nucleótidos cíclicos son conocidos por mediar una gran variedad de respuestas celulares a estímulos biológicos. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDE) son proteínas que catalizan la hidrólisis de 3',5'-nucleótidos cíclicos, tal como el monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y el monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) a sus correspondientes monofosfatos de 5'-nucleótido. Estas enzimas son por consiguiente importantes en el control de la concentración celular de nucleótidos cíclicos y desempeñan una función central en una variedad de episodios de señalización intracelulares, incluyendo la señalización por dichos mecanismos y hormonas extracelulares, neurotransmisores y similares.

Por lo menos cinco familias distintas de PDE han sido identificadas (para un estudio, véase Beavo, Adv. in Second Mess. And Prot. Phosph Res. 1988, 22:1-38; véase también, Beavo, "Multiple Phosphodiesterase Isozymes: Background, Nomenclature and Implications", págs. 3-15 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action 1990, Beavo & Houslay, eds., John Wiley & Sons, Nueva York; Wang et al., "Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", págs. 19-59 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, supra; y Manganiello et al., "Cyclic GMP-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", págs. 62-85 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, supra). Estas cinco familias incluyen: Tipo Io las PDE estimuladas por calmodulina (CaM); tipo II o las PDE estimuladas por GMPc; tipo III o las PDE inhibidas por GMPc; tipo IV o las PDE específicas para AMPc; y tipo V o las PDE específicas de GMPc. Además, en cada una de las familias identificadas anteriormente existen múltiples formas e isoformas (es decir, variantes de corte y empalme) de las PDE íntimamente relacionadas.

Las PDE estimuladas por CaM están definidas por su sensibilidad a las concentraciones de calcio intracelular que conduce a concentraciones intracelulares reducidas de AMPc y/o GMPc. De hecho, pueden observarse aumento de concentraciones de actividad de PDE en respuestas a CaM y casi cada tipo de tejido de mamífero, así como en Drosophila, Dictyostelium y trypanosomas. La mayoría de las células, por consiguiente, parecen contener por lo menos una pequeña cantidad de actividad de PDE estimulada por CaM. Las mayores concentraciones de actividad de PDE estimulada por CaM han sido observadas en el cerebro y, en particular en las áreas sinápticas (véase Greenberg et al., Neuropharmacol. 1978, 17:737-745; y Kincaid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84:1118-1122). Se han descrito y se conocen en la técnica varios miembros de la familia CaM-PDE. Véase, por ejemplo, la patente US nº 6.015.677, publicada el 18 de enero de 2000 concedida a Beavo et al., véase también LaPorte et al., Biochemistry 1979, 18:2820-2825; Hansen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79: 2788-2792; Sharma et al., J. Biol. Chem. 1986, 261: 14160-14166; Hansen et al., J. Biol. Chem. 1986, 261: 14636-14645; Snyder et al., Cell Signal 1999, 11: 535-544. Véase también Kakkar et al., Cell Mol. Life Sci. 1999; 55: 1164-1186; y Weishaar et al., J. Med. Chem. 1985, 28:537-545 para estudios.

Las proteínas que se unen al nucleótido guanina (proteínas G) son también de particular interés para los antecedentes de la presente invención. Las proteínas G son bien conocidas en la técnica (véase, p. ej., los estudios de Birnbaumer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990, 30:675-705; y Simon et al., Science 1991, 252: 802-808). En resumen, las proteínas G son proteínas heterotriméricas, que cada una tienen una subunidad \alpha, \beta y \gamma, que median también la transducción de señal en una variedad de diferentes sistemas, incluyendo los sistemas olfativo, visual, hormonal y neurotransmisor. Las proteínas G acoplan receptores de la superficie celular a enzimas celulares efectoras, que por consiguiente translucen una señal extracelular en un segundo mensajero intracelular. La subunidad \alpha de una proteína G proporciona la mayor parte de la especificidad de interacción entre su receptor y los efectores en el proceso de transducción de señal, mientras que las subunidades \beta y \gamma parece que están compartidas por diferentes proteínas G. Aunque algunas proteínas G (por ejemplo, G_{s} y G_{i}) se expresan en todas partes, otras (por ejemplo transducina y gustucina) son conocidas por estar implicadas en la transducción sensorial y se han encontrado solamente en células sensoriales especializadas (véase, por ejemplo Lerea et al., Science 1986, 224: 77-80; véase también la patente US nº 6.008.000 publicada el 28 de diciembre de 1999 concedida a Margolskee.

Algunas pruebas han sugerido que por lo menos una determinada proteína G puede efectuar la transducción de señal activando alguna fosfodiesterasa no identificada. En particular, Ruiz-Avila et al. (Nature 1995, 376: 80-85) han demostrado que un péptido derivado de transducina que simula los efectos de una proteína G activada estimula la actividad de GMPc PDE en tejidos linguales gustativos bovinos. Sin embargo, no se ha observado ninguna interacción directa entre la proteína G y ninguna PDE específica.

Dada, sin embargo, la amplia variedad de respuestas de transducción de señal en las que están implicadas tanto las proteínas G como las fosfodiesterasas y los numerosos trastornos asociados con estas diferentes respuestas, existe necesidad de procedimientos para identificar compuestos específicos que modulen la transducción de señal por las PDE, las proteínas G o ambas.

3. Sumario de la invención

Además de los procedimientos y sistemas para identificar los compuestos que modulan la activación de CaM-PDE por las proteínas G, la presente invención proporciona un procedimiento de inhibición de una fosfodiesterasa (PDE) estimulada por calmodulina (CaM). Este procedimiento comprende poner en contacto la PDE con un compuesto que inhibe la activación del PDE por una proteína G.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar una PDE activada por una proteína G. Este procedimiento comprende detectar la activación de una PDE puesta en contacto con un polipéptido. El polipéptido comprende el péptido de activación de la proteína G procedente de un dominio \alpha de una proteína G.

4. Breve descripción de los dibujos

Figs. 1A-1C. Las PDE presentes en el citoplasma de las papilas circundantes bovinas se resolvieron utilizando cromatografía de intercambio aniónico. Se eluyeron las proteínas en una columna DAEA utilizando gradiente de NaCl 0 a 1 M. Los análisis de actividad de PDE en cada fracción se llevaron a cabo como se describe en el apartado 6.1, más adelante utilizando GMPc 1 \muM o AMPc 1\muM (Figs. 1A y 1B, respectivamente) como sustratos en presencia de EDTA 1 mM (rombos), CaCl_{2} 1 mM y 4 \mug/ml de CaM (cuadrados blancos) o péptido G\alpha_{t-rod} 100 \muM (asterisco). La Fig. 1C ilustra la especificidad para la actividad de PDE estimulada por péptidos de las fracciones presentadas en las Figs. 1A y 1B. Específicamente, se sintetizó un péptido "codificado" que tenía la misma composición de restos de aminoácidos que el polipéptido G\alpha_{t-rod} pero una secuencia aleatoria. Se llevaron a cabo análisis de PDE en las fracciones 6 y 11 de las Figs. 1A y 1B, en ausencia de péptido (barras blancas), en presencia de polipéptido G\alpha_{t-rod} 100 \muM (barras sombreadas o en presencia de péptido codificado 100 \muM (barras negras) utilizando GMPc 1 \muM como substrato.

Fig. 2. La fracción 14 de las fracciones de la cromatografía de intercambio aniónico presentada en las Figs. 1A y 1B se utilizó para inmunoprecipitar PDE5 utilizando anticuerpos anti-PDE5. Se preincubaron lentejas de proteína A con ("lentejas Ab") o sin ("lentejas de referencia") anticuerpo antes de la inmunoprecipitación. Se comprobó la actividad de PDE en los sedimentos precipitados tanto con lentejas de Ab (barras sombreadas) como con lentejas de referencia ("sedimento de lentejas de referencia" marcado) en presencia de EGTA 1 mM utilizando GMPc 1 \muM como substrato. Se comprobó también la actividad de PDE en el sobrenadante de los experimentos con las lentejas de Ab (barra negra) y las lentejas de referencia (barra sombreada).

Fig. 3. Se llevó a cabo la cromatografía por afinidad de CaM en la fracción 11 (procedente de las fracciones de intercambio iónico mostrada en las Figs. 1A y 1B) utilizando lentejas de CaM-Sepharose en presencia de CaCl_{2} 2 mM (lentejas de CaM) o en presencia de EGTA 2 mM (lentejas de EGTA). En las lentejas (sedimento) se comprobó la actividad de PDE utilizando GMPc (1 \muM) como substrato en presencia de EGTA 2 mM (barras blancas) CaCl_{2} 1 mM y 4 \mug/ml de CaM (barras sombreadas) o péptido Ga_{t-rod} 100 \muM (barras rellenas). Se suministró CaCl_{2} en exceso durante el ensayo cuando la interacción por afinidad se realizó en presencia de EGTA. El sobrenadante y los lavados presentaban muy poca o ninguna actividad de fosfodiesterasa (datos no mostrados). Todos los valores se expresan como media más o menos la desviación estándar de la media de por lo menos tres experimentos independientes realizados por triplicado.

Fig. 4. La actividad de PDE1A de las fracciones 6 y 11 (de las fracciones de intercambio aniónico mostradas en las Figs. 1A y 1B) se inhibió utilizando SCH 51866 y la calmodulina y la actividad peptídica restante se analizó utilizando GMPc 1 \muM en presencia de EGTA 1 mM (barras blancas) o CaCl_{2} 1 mM y 4 \mug/ml de CaM (barras rellenas) o péptido I G\alpha_{t-rod} 100 \muM (barras grises). SCH 51866 inhibió CaM (barras sombreadas) y el péptido G\alpha_{t-rod} (barras verticales) estimuló la actividad lo que indica que, PDE 1A presente en estas fracciones contribuye en ambos. Todos los valores representan la media más o menos la desviación estándar de la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado.

Fig. 5. PDE1A1, PDE1A2 y PDE1C3 se sobreexpresaron en las células HEK-293 y se realizaron los análisis de PDE utilizando GMPc como substrato en presencia de EGTA 1 mM (barras blancas), CaCl_{2} 1 mM y 4 \mug/ml de CaM (barras con trama), polipéptido G\alpha_{t-rod} 100 \muM (barras negras) o polipéptido codificado (barras grises). Se determinó también la actividad basal de las células HEK-293 no transfectadas en presencia de cada uno de los compuestos listados anteriormente. Todos los valores descritos representan la media más o menos la desviación estándar de la media de tres experimentos independientes realizados por duplicado.

La Fig. 6 presenta la secuencia de aminoácidos de una proteína transducina G\alpha a título de ejemplo (SEC. ID. nº: 1). Véase, también las Figuras 1A-1B de la patente US nº 6.008.000 publicada el 28 de diciembre de 1999 así como la SEC. ID. nº: 23 de esta patente.

5. Descripción detallada de la invención 5.1. Definiciones

La terminología utilizada en esta memoria generalmente tiene sus significados ordinarios en la materia, dentro del contexto de la presente invención y en el contexto específico donde se utiliza cada término. Determinados términos se exponen a continuación, o en cualquier lugar de la memoria, para proporcionar directrices adicionales al especialista en la descripción de los dispositivos y procedimientos de la invención y cómo utilizarlos.

Definiciones generales. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aislado" significa que el material de referencia se elimina del medio en el que se encuentra normalmente. Así, un material biológico aislado puede estar exento de componentes celulares, es decir, de componentes de las células en las que se encuentra o se produce el material. En el caso de las moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto de PCR, un ARNm aislado, un ADNc, o un fragmento de restricción. En otra forma de realización, un ácido nucleico aislado se escinde preferentemente del cromosoma en el que puede encontrarse, y más preferentemente no se une más a las zonas no reguladoras y no codificantes, o a otros genes, situados corriente arriba o corriente abajo del gen contenido por la molécula de ácido nucleico aislada cuando se encuentra en el cromosoma. Incluso en otra forma de realización, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas aisladas de ácido nucleico incluyen secuencias insertadas en los plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. Por lo tanto, en una forma de realización específica, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede estar asociada con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambos, con los que se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada a la membrana. Un orgánulo aislado, célula o tejido se elimina de la zona anatómica en la que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede estar, pero no necesita estar, purificado.

El término "purificado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material que ha sido aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluyendo materiales naturales de los que se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada está con preferencia sustancialmente exenta de otras proteínas o ácidos nucleicos con los que está asociada en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada está con preferencia sustancialmente exenta de proteínas o de otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las que puede encontrarse dentro de una célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente exento" se utiliza operativamente, en el contexto de la experimentación analítica del material. Preferentemente, el material purificado sustancialmente exento de contaminantes es por lo menos 50% puro; más preferentemente, por lo menos 90% puro y aún más preferentemente por lo menos 99% puro. La pureza puede evaluarse por cromatografía, electroforesis en gel, inmunoanálisis, análisis de la composición, análisis biológico y otros procedimientos conocidos en la técnica.

Los procedimientos para la purificación son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden purificarse por precipitación, cromatografía (incluyendo la cromatografía en fase sólida de preparación, hibridación de oligonucleótidos y cromatografía de triple hélice), ultracentrifugación y otros métodos. Los polipéptidos y proteínas pueden purificarse por varios procedimientos incluyendo, sin limitación, electroforesis en gel con disco de preparación, enfoque isoeléctrico, HPLC, HPLC en fase inversa, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y de reparto, precipitación y cromatografía de salado, extracción y distribución en contracorriente. Por algunas razones es preferible producir el polipéptido en un sistema recombinante en el que la proteína contiene una etiqueta de la secuencia adicional que facilita la purificación, tal como, pero sin limitarse a, una secuencia de polihistidina, o una secuencia que se une específicamente a un anticuerpo, tal como FLAG y GST. El polipéptido puede purificarse a continuación de un lisado en bruto de la célula hospedadora por cromatografía en una matriz en fase sólida apropiada. Alternativamente, los anticuerpos producidos contra la proteína o contra los péptidos procedentes de ésta pueden utilizarse como reactivos de purificación. Las células pueden purificarse por varias técnicas, incluyendo centrifugación, separación de la matriz (p. ej., separación en lana de nilón), movimiento horizontal y otras técnicas de inmunoselección, eliminación (p. ej. eliminación del complemento de las células contaminantes) y clasificación celular (p. ej. clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]). Otros procedimientos de purificación son posibles. Un material purificado puede contener menos de aproximadamente el 50%, preferentemente menos de aproximadamente el 75% y lo más preferentemente menos de aproximadamente 90%, de los componentes celulares con los que está asociado generalmente. "Sustancialmente puro" indica el grado mayor de pureza que puede conseguirse utilizando técnicas de purificación convencionales conocidas en la materia.

Una "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material biológico en el que puede analizarse la presencia de polipéptidos OSCAR o ácidos nucleicos OSCAR, p. ej., para evaluar una terapia o expresión génica en un animal transgénico o para identificar células tales como osteoclastos, que expresan específicamente el gen OSCAR y su producto génico. Dichas muestras pueden obtenerse de cualquier procedencia, incluyendo tejido, sangre y células sanguíneas, incluyendo las células madre hematopoyéticas circulantes (para la posible detección de proteínas o ácidos nucleicos), derrames pleurales, fluido cerebroespinal (CSF), fluido ascítico y cultivo celular. En las muestras de las formas de realización preferidas se obtienen de la médula ósea.

Los animales no humanos incluyen, sin limitación, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayas, monos, etc.; animales domésticos tales como perros y gatos; y, animales de granja tales como ovejas, cabras, cerdos, caballos y vacas.

En las formas de realización preferidas, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significarán generalmente un grado aceptable de error de la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error típicos, a título de ejemplo, están comprendidos dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10% y más preferentemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado de valores. Alternativamente, y específicamente en los sistemas biológicos, los términos "alrededor de" y "aproximadamente", pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces o más preferentemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas dadas en la presente memoria son aproximadas, a menos que se indique de otro modo, lo que significa que el término "alrededor de" o "aproximadamente" puede deducirse cuando no se indica expresamente.

El término "molécula" significa cualquier unidad estructural distinta o distinguible de materia que comprende uno o más átomos, e incluye, por ejemplo, polipéptidos y polinucleótidos.

Definiciones de biología molecular. De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante dentro de la experiencia en la materia. Dichas técnicas están explicadas completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fitsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (citado en la presente memoria como "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Harnes & S.J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

El término "polímero" significa cualquier sustancia o compuesto que esté compuesto de dos o más bloques de construcción ("-meros") que se unen repetitivamente. Por ejemplo, un "dímero" es un compuesto en el que se han unido dos bloques de construcción; un "trímero" es un compuesto en el que se han unido tres bloques de construcción; etc.

El término "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula polimérica que tiene un eje central que soporta bases capaces de unir el hidrógeno a polinucleótidos típicos, en la que el eje central de polímero presenta las bases de manera que permite dicho enlace de hidrógeno de un modo específico entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (p. ej., ADN monocatenario). Dichas bases son típicamente inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas incluyen el ADN y ARN "de doble cadena" y "de una sola cadena", así como modificaciones en el eje central de los mismos (p. ej., enlaces de fosfonato de metilo).

Por lo tanto, una secuencia "polinucleotídica" o de "ácido nucleico" es una serie de bases nucleotídicas (denominadas también "nucleótido") generalmente en ADN y ARN, y significa cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Una secuencia nucleotídica lleva frecuentemente información genética, incluyendo la información utilizada para que el sistema celular construya proteínas y enzimas. Los términos incluyen ADN genómico, ADNc, ARN, cualquier polinucleótido sintético y manipulado genéticamente y los polinucleótidos tanto transcrito como complementario. Esto indica moléculas mono y bicatenarias; es decir, híbridos de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN así como "ácidos nucleicos de proteína" (APN) formados conjugando bases a un eje central de aminoácidos. Esto incluye también ácidos nucleicos que contienen bases modificadas, por ejemplo, tiouracilo, tioguanina y fluorouracilo.

Los polinucleótidos en la presente memoria pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras naturales, o pueden estar asociados a secuencias heterólogas, incluyendo activadores, potenciadores, elementos de respuesta, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, intrones, zonas no codificantes 5' y 3' y similares. Los ácidos nucleicos pueden modificarse también por muchos métodos conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de dichas modificaciones incluyen la metilación, "cápsulas", sustitución de uno o más de estos nucleótidos naturales por un análogo, y modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, los enlaces no intercambiados (p. ej., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener uno o más restos unidos por enlace covalente, tales como proteínas p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos con señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), quelantes (p. ej., metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidantes, etc.) y alquilantes por nombrar unos pocos. Los polinucleótidos pueden modificarse por formación de un fosfotriéster de metilo o etilo o un enlace de alquil fosforamidita. Además, los polinucleótidos en la presente memoria pueden también modificarse con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Marcadores a título de ejemplo incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares. Otros ejemplos no limitativos de modificación que pueden prepararse se proporcionan, más adelante, en la descripción de la presente invención.

Un "polipéptido" es una cadena de bloques químicos de construcción denominados aminoácidos que están unidos por enlaces químicos denominados "enlaces peptídicos". El término "proteína" se refiere a los polipéptidos que contienen los restos de aminoácido codificados por un gen o por una molécula de ácido nucleico (p. ej., un ARNm o un ADNc) transcritos a partir de este gen ya sea directa o indirectamente. Opcionalmente, una proteína puede carecer de determinados restos de aminoácidos que están codificados por un gen o por un ARNm. Por ejemplo, un gen o una molécula de ARNm puede codificar una secuencia de restos de aminoácido en el terminal N de una proteína (es decir, una secuencia señal) que está separada de la proteína final y por consiguiente puede que no forme parte de la misma la proteína final. Una proteína o polipéptido, incluyendo una enzima, puede ser "natural" o "de tipo natural", lo que significa que se produce en la naturaleza; o puede ser una "mutante", "variante" o "modificada" lo que significa que ha sido construida, alterada, modificada o es en alguna manera diferente o está cambiada en una proteína natural o en otro mutante.

"Ampliación" de un polinucleótido, tal como se utiliza en la presente memoria, indica la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar la concentración de una secuencia de ADN específica en una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de PCR véase Saiki et al., Science 1988, 239:487.

"Secuenciado químico" de ADN indica los procedimientos tales como los de Maxam y Gilbert, (secuenciado de Maxam-Gilbert; véase Maxam & Gilbert Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74:560), en los que el ADN se escinde utilizando reacciones específicas para bases individuales.

"Secuenciado enzimático" de ADN indica procedimientos tales como los de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74:5463) y variaciones de los mismos tales bien conocidas en la técnica, en un ADN monocatenario se copian y se terminan al azar utilizando ADN polimerasa.

Un "gen" es una secuencia de nucleótidos que codifica un "producto génico" funcional. Generalmente, un producto génico es una proteína funcional. Sin embargo, un producto génico puede ser otro tipo de molécula en una célula, tal como un ARN (p. ej., un ARNt o un ARNr). Para los fines de la presente invención, un producto génico se refiere también a una secuencia de ARNm que puede encontrarse en una célula. Por ejemplo, la medición de las concentraciones de la expresión génica según la invención puede corresponder a medir las concentraciones de ARNm. Un gen puede comprender también secuencias reguladoras (es decir, no codificantes) así como secuencias de codificación. Las secuencias reguladoras a título de ejemplo incluyen secuencias activadoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. La zona transcrita del gen puede incluir también zonas no traducidas incluyendo intrones, una zona 5' no traducida (5'-UTR) y una zona 3' no traducida (3'-UTR).

Una "secuencia codificadora" o una secuencia "que codifica" y el producto de expresión tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, da como resultado la producción de este ARN, polipéptido, proteína o enzima; es decir, la secuencia nucleotídica "codifica", este ARN o codifica la secuencia de aminoácidos para este polipéptido, proteína o enzima.

Una "secuencia activadora" es una zona reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula y de la iniciación de la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3'). Con objeto de definir la presente invención, la secuencia activadora está unida a su terminal 3' por la zona de iniciación de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Cuando la secuencia activadora se encuentra en un punto de iniciación de la transcripción (convenientemente descubierta, por ejemplo, cartografiando con nucleasa S1), así como los dominios de unión proteica (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Una secuencia de codificación está "bajo el control de" o está "operativamente asociada a" las secuencias de control de la transcripción y de la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia de codificación en el ARN, que se corta y empalma a continuación el trans-ARN (si contiene intrones) y, si la secuencia codifica una proteína, se traduce en esta proteína.

El término "expresa" y "expresión" significa permitir o dar lugar a la información en un gen o secuencia de ADN que se pone de manifiesto, por ejemplo, produciendo ARN (tal como ARNr o ARNm) o una proteína activando las funciones celulares que implican la transcripción y traducción de un gen o secuencia génica correspondientes. Una secuencia de ADN es expresada por una célula para formar un "producto de expresión" tal como un ARN (p. ej., un ARNm o un ARNr) o una proteína. El propio producto de la expresión, p. ej., el ARN o proteína resultante, puede también decirse que es "expresado" por la célula.

El término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "extraños" (es decir, extrínsecos o extracelulares), en una célula hospedadora de modo que la célula hospedadora exprese el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, en la invención típicamente un ARN codificado por el gen o secuencia introducido, pero también una proteína o una enzima codificada por el gen o secuencia introducido. El gen o secuencia introducido puede denominarse también gen o secuencia "clonado" o "extraño", puede incluir secuencias reguladoras o de control (p. ej., iniciación, interrupción, activador, señal, secreción u otras secuencias utilizadas por un sistema genético de células). El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin función conocida. Una célula hospedadora que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una célula hospedadora puede proceder de cualquier fuente, incluyendo las células del mismo género o especie que la célula hospedadora o células de diferente género o especie.

Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" significa el vehículo mediante el cual una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen extraño) puede introducirse en una célula hospedadora a fin de transformar el hospedador y favorecer la expresión (p. ej., transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores pueden incluir plásmidos, fagos, virus, etc. y se exponen con más detalle a continuación.

Una "casete" se refiere a una secuencia de codificación de ADN o a un segmento del ADN que codifica un producto de expresión que puede estar insertado en un vector en secuencias de restricción definidas. Las secuencias de restricción de la casete se diseñan para asegurar la inserción de la casete en el marco de lectura apropiado. Generalmente, el ADN extraño se inserta en una o más secuencias de restricción del ADN vector, y a continuación es transportado por el vector en una célula hospedadora junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene insertado o añadido ADN, tal como un vector de expresión, puede denominarse también un "montaje de ADN". Un tipo frecuente de vector es un "plásmido", que generalmente es una molécula autocontenida de ADN de doble cadena, normalmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente ADN adicional (extraño) y que puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Un gran número de vectores, incluyendo vectores de plásmido y micóticos, se han descrito para la replicación y/o expresión en una variedad de hospedadores eucarióticos y procarióticos. La expresión "célula hospedadora" significa cualquier célula de cualquier organismo que se seleccione, modifique, transforme, crezca o se utilice o manipule de cualquier manera para la producción de una sustancia por la célula. Por ejemplo, una célula hospedadora puede ser una que se manipule para expresar un gen específico, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o una enzima. Las células hospedadoras pueden utilizarse además para la identificación u otros ensayos que se describen a continuación. Las células hospedadoras pueden cultivarse in vitro o una o más células en un animal no humano (p. ej., un animal transgénico o un animal transfectado temporalmente).

La expresión "sistema de expresión" significa una célula hospedadora y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por un ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula hospedadora. Los sistemas de expresión corrientes incluyen células hospedadoras E. coli y vectores de plásmido, células hospedadoras de insecto tales como células Sf9, Hi5 o S2 y vectores de baculovirus, células de Drosophila (células de Schneider) y sistemas de expresión y células hospedadoras de mamíferos y vectores.

El término "heteróloga" se refiere a una combinación de elementos que no se producen en la naturaleza. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas híbridas de ARN que comprenden una secuencia de ARNr y una secuencia de ARN heterólogo que no forma parte de la secuencia de ARNr. En este contexto, la secuencia de ARN heterólogo se refiere a una secuencia de ARN que no está colocada de forma natural dentro de la secuencia de ARN ribosómico. Alternativamente, la secuencia de ARN heterólogo puede situarse de forma natural dentro de la secuencia de ARN ribosómico, pero se encuentra en una posición en la secuencia de ARNr donde no se produce de forma natural. Como otro ejemplo, el ADN heterólogo se refiere al ADN que no está situado de forma natural en la célula, o en la secuencia cromosómica de la célula. Preferentemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño a la célula. El elemento regulador de la expresión heteróloga es un elemento regulador operativamente asociado a un gen diferente del que está operativamente asociado en la naturaleza.

Los términos "mutante" y "mutación" significan cualquier cambio detectable en el material genético, p. ej., ADN, o cualquier proceso, mecanismo o resultado de dicho cambio. Esto incluye las mutaciones génicas, en las que la estructura (p. ej., la secuencia de ADN) de un gen está alterada, cualquier gen de ADN que aparece en cualquier proceso de mutación, y cualquier producto de expresión (p. ej., ARN, proteína o enzima) expresado por un gen o secuencia de ADN modificados. El término "variante" puede utilizarse también para indicar un gen modificado o alterado, secuencia de ADN, ARN, enzima, célula, etc., es decir, cualquier clase de mutante.

"Variantes conservadoras de la secuencia" de una secuencia nucleotídica son aquellas en las que un cambio de uno o más nucleótidos en una posición dada del codón no produce ninguna alteración en el aminoácido codificado en esta posición.

"Variantes conservadoras de la función" de un polipéptido o polinucleótido son aquellas en las que un resto de aminoácido dado en el polipéptido, o el resto de aminoácido codificado por un codón del polinucleótido, ha sido cambiado o alterado sin alterar la configuración y función general del polipéptido. Por ejemplo, las variantes conservadoras de la función pueden incluir, pero no se limitan a, la sustitución de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares (p. ej., polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, propiedades ácidas, básicas, hidrófobas, aromáticas y similares). Los restos de aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los restos de los aminoácidos arginina, histidina y lisina son los restos de aminoácidos básicos e hidrófilos y pueden por consiguiente ser intercambiables. Asimismo, el resto de aminoácido isoleucina, que es un resto de aminoácido hidrófobo, puede estar sustituido por leucina, metionina o valina. Dichos cambios es de esperar que presenten poco o ningún efecto en el peso molecular aparente o en el punto isoeléctrico del polipéptido. Los restos de aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden también diferenciarse en una proteína o enzima de modo que el porcentaje de similitud de la secuencia de proteína o aminoácido entre cualesquiera dos proteínas de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, desde el 70% al 99% determinado según un esquema de alineación tal como el Método de Cluster, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Las "variantes conservadoras de la función" de un polipéptido dado incluyen también polipéptidos que presentan por lo menos el 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el polipéptido dado determinada, por ejemplo, por los algoritmos BLAST o FASTA. Preferentemente, las variantes conservadoras de la función de un polipéptido dado presentan por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos el 85% y aún más preferentemente por lo menos el 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el polipéptido dado y, preferentemente, también presentan las mismas o sustancialmente similares propiedades (p. ej., de peso molecular y/o punto isoeléctrico) o funciones (p. ej., funciones o actividades biológicas) que el polipéptido natural o precursor al que se compara. Como ejemplo específico, la Tabla 2 en los Ejemplos, más adelante, lista varios genes que se expresan de manera diferenciada en las zonas del escotoma o periescotoma de la corteza cerebral y pueden utilizarse en las micromatrices de la presente invención. Muchos de estos genes codifican productos génicos (específicamente, polipéptidos) que presentan niveles de identidad de la secuencia de aminoácidos con uno o más polipéptidos ya conocidos en la materia, indicados en la columna 3 de la Tabla 2. Estos genes del escotoma y del periescotoma se consideran por consiguiente que son variantes conservadoras funcionales de los genes que codifican estos polipéptidos conocidos.

El término "homólogo", en todas sus formas gramaticales y en las variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen de evolución común", incluyendo las proteínas de las superfamilias (p. ej., la superfamilia de la inmunoglobulina) en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismo (por ejemplo, el polipéptido de la cadena ligera de la miosina, etc.; véase, Reeck et al., Cell 1987, 50: 667). Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificadores) presentan homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea desde el punto de vista de la identidad de porcentaje o por la presencia de restos o motivos específicos y de posiciones conservadas. Por ejemplo, la columna 3 en la Tabla 2 presentada en los Ejemplos, a continuación, indica homólogos de genes que están expresados de manera diferenciada en las áreas del escotoma o del periescotoma de la corteza cerebral, o en ambas áreas del escotoma y del periescotoma de la corteza cerebral. Dichos homólogos por consiguiente pueden utilizarse en los procedimientos y composiciones de la presente invención.

La expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o de correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácido que pueden o no compartir un origen de la evolución común (véase, Reeck et al., anteriormente). Sin embargo, en la utilización corriente y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "muy" puede referirse a la similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen de la evolución común.

En las formas de realización específicas, dos secuencias de ácido nucleico son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando por lo menos aproximadamente el 80%, y más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90% o por lo menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos igualan más de una longitud definida de las secuencias de ácido nucleico, determinadas por un algoritmo de comparación de secuencias conocido tal como BLAST, FASTA, ADN Strider, etc. Un ejemplo de dicha secuencia es una variante alélica o de la especie de los genes específicos de la presente invención (p. ej., los genes que comprenden las secuencias nucleotídicas citadas en la Tabla 1 de los Ejemplos, más adelante). Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse también por hibridación, p. ej., en un experimento de hibridación de Southern en, p. ej., condiciones severas tales como las definidas para este sistema específico.

Asimismo, en las formas de realización específicas de la invención, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más del 80% de los restos de aminoácidos son idénticos, o cuando más del 90% de los restos de aminoácido son similares (es decir, son operativamente idénticos). Preferentemente las secuencias de polipéptido similares u homólogas están identificadas por la alineación utilizando, por ejemplo, el programa de compilación GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, versión 7, Madison Wisconsin), o utilizando cualquiera de los programas y algoritmos descritos anteriormente (p. ej., BLAST, FASTA, etc.).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de por lo menos 10, preferentemente por lo menos 15 y más preferentemente por lo menos 20 nucleótidos, preferentemente no más de 100 nucleótidos, que puede hibridarse con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc o una molécula de ARNm que codifica un gen, ARNm, ADNc u otro ácido nucleico de interés. Los oligonucleótidos pueden marcarse, p. ej., con nucleótidos-^{32}P o nucleótidos con los que se ha conjugado con enlace covalente un marcador, tal como biotina o un colorante fluorescente (por ejemplo, Cy3 o Cy5).

En una forma de realización, puede utilizarse como sonda un oligonucleótido marcado para detectar la presencia de un ácido nucleico. Por ejemplo, en las formas de realización preferidas los ácidos nucleicos de la presente invención se utilizan como sondas, p. ej., en micromatrices de la invención, para detectar la expresión de determinados genes en las células (p. ej., en las células de una corteza cerebral o de otro tejido cerebral). En otra forma de realización, pueden utilizarse oligonucleótidos (de los cuales uno o ambos puede estar marcado) como cebadores de PCR, ya sea para clonar toda la longitud o un fragmento de un ácido nucleico, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos en las células. Por ejemplo, los Ejemplos, más adelante, describen el diseño y la utilización de cebadores de PCR para ampliar las secuencias de ADNc en un banco de ADNc, para su utilización en una micromatriz de la presente invención.

En una forma de realización adicional, un oligonucleótido de la invención puede formar una triple hélice con una molécula de ADN OSCAR. La presente invención proporciona también ácidos nucleicos complementarios (que incluyen ribozimas), que pueden utilizarse para inhibir la expresión de un gen o subproducto génico. Un "ácido nucleico complementario" es una molécula de ácido nucleico monocatenaria que, en la hibridación en condiciones citoplásmicas con bases complementarias en una molécula de ARN o ADN, inhibe la función de esta última. Si el ARN es un transcrito del ARN mensajero, el ácido nucleico complementario es un contratranscrito o un ácido nucleico complementario que interfiere con el ARNm. Tal como se utiliza actualmente, "complementario" incluye en sentido amplio las interacciones ARN-ARN, las interacciones ARN-ADN, las interacciones de triple hélice, ribozimas y la interrupción mediada por la ARNasa-H. Las moléculas de ácido nucleico complementarias pueden ser codificadas por un gen recombinante para la expresión en una célula (p. ej., patente US nº 5.814.500; patente US nº 5.811.234) o alternativamente pueden prepararse por síntesis (p. ej., patente US nº 5.780.607). Más adelante se proporcionan otros ejemplos específicos de moléculas de ácido nucleico complementarias de la invención.

Generalmente, los oligonucleótidos se preparan por síntesis, preferentemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. Por consiguiente, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces de análogo de fosfoéster no naturales, tales como los enlaces tioéster, etc. Los ejemplos no limitativos específicos de los oligonucleótidos sintéticos previstos por la presente invención incluyen, además de los restos de ácido nucleico descritos anteriormente, oligonucleótidos que contienen fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, alquilo de cadena corta o enlaces interazúcar de cicloalquilo o enlaces interazúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los más preferidos son aquellos con ejes centrales de CH_{2}-NH-O-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2}, CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2} y O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2} (en los que el fosfodiéster es O-PO_{2}-O-CH_{2}). La patente US nº 5.677.437 describe enlaces de oligonucleósido heteroatómico. Pueden utilizarse también enlazadores de nitrógeno o grupos que contienen nitrógeno para preparar simulaciones de oligonucleótido (patentes US nº 5.792.884 y nº 5.783.682). La patente US nº 5.637.684 describe compuestos oligoméricos de fosforoamidato y fosforotioamidato. También están previstos los oligonucleótidos que tienen estructuras con eje central de morfolino (patente US nº 5.034.506). En otras formas de realización, tal como el eje central de ácido peptidonucleico (PNA), el eje central de fosfodiéster del oligonucleótido puede sustituirse por un eje central de poliamida, estando las bases unidas directa o indirectamente a los átomos nitrógeno de aza del eje central de poliamida (Nielsen et al., Science 254: 1497, 1991). Otros oligonucleótidos sintéticos pueden contener restos de azúcar sustituidos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH_{3}, F, OCN, O(CH_{2})_{n}NH_{2} o O(CH)_{n}CH_{3} en las que n está comprendida entre 1 y aproximadamente 10; alquilo inferior C_{1} a C_{10}, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF_{3}; OCF_{3}; O-; S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; SOCH_{3}; SO_{2}CH_{3}; ONO_{2}; NO_{2}; N_{3}; NH_{2}; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un resto de fluoresceína; un grupo que se separa del ARN; un grupo indicador; un grupo intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes con propiedades similares. Los oligonucleótidos pueden tener también simuladores de azúcar tales como los ciclobutilos u otros carbocíclicos en lugar del grupo pentofuranosilo. Las unidades de nucleótido con otros nucleósidos aparte de adenosina, citidina, guanosina, timidina y uridina, tal como inosina, pueden utilizarse en una molécula de oligonucleótido.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridarse con otra molécula de ácido nucleico en condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook et al., anteriormente). Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Para la identificación preliminar de ácidos nucleicos homólogos, la baja severidad de las condiciones de hibridación, correspondientes a una T_{m} (temperatura de fusión) de 55ºC, pueden utilizarse, p. ej., 5\times SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leche y sin formamida, o 30% de formamida, 5\times SSC, 0,5% de SDS). Las condiciones de hibridación con severidad moderada corresponden a una T_{m} superior, p. ej., 40% de formamida, con 5\times o 6\times SCC. Las condiciones de hibridación con alta severidad corresponden a la T_{m} más elevada, p. ej., 50% de formamida, 5\times o 6\times SCC. SCC es un NaCl 0,15 M, citrato 0,015 Na. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles incompatibilidades entre las bases. La severidad apropiada para hibridar los ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la materia. Cuanto mayor es el grado de similitud o de homología entre dos secuencias de nucleótido, mayor es el valor de T_{m} para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la T_{m} mayor) de las hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para los híbridos de longitud mayor de 100 nucleótidos, se han deducido ecuaciones para calcular T_{m} (véase Sambrook et al., anteriormente, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los emparejamientos incorrectos se hace más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., anteriormente, 11.7-11.8). Una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es por lo menos aproximadamente de 10 nucleótidos; preferentemente por lo menos aproximadamente de 15 nucleótidos; y más preferentemente la longitud es por lo menos aproximadamente de 20 nucleótidos.

En una forma de realización específica, la expresión "condiciones de hibridación normales" se refiere a una T_{m} de 55ºC, y utiliza las condiciones indicadas anteriormente. En una forma de realización preferida, la T_{m} es de 60ºC; en una forma de realización más preferida, la T_{m} es de 65ºC. En una forma de realización específica, "severidad elevada" se refiere a las condiciones de hibridación y/o de lavado a 68ºC en 0,2\times SSC, a 42ºC en 50% de formamida, 4\times SSC o en condiciones que proporcionen niveles de hibridación equivalentes a los observados en una de estas dos condiciones.

Las condiciones de hibridación adecuadas para oligonucleótidos (p. ej., para sondas o cebadores de oligonucleótido) son típicamente algo diferentes de las de los ácidos nucleicos completos (p. ej., ADNc completo), debido a la temperatura de fusión más baja de los oligonucleótidos. Debido a que la temperatura de fusión de los oligonucleótidos dependerá de la longitud de las secuencias de oligonucleótido implicadas, las temperaturas de hibridación adecuadas variarán dependiendo de las moléculas de oligonucleótido utilizadas. Las temperaturas a título de ejemplo pueden ser 37ºC (para oligonucleótidos de 14 bases), 48ºC (para oligonucleótidos de 17 bases), 55ºC (para oligonucleótidos de 20 bases) y 60ºC (para oligonucleótidos de 23 bases). Las condiciones de hibridación adecuadas a título de ejemplo para oligonucleótidos incluyen el lavado en 6\times SSC/0,05% de pirofosfato sódico, u otras condiciones que proporcionen niveles de hibridación equivalentes.

5.2. Sistemas de expresión recombinante

Una amplia variedad de combinaciones hospedador/vector de expresión (es decir, sistemas de expresión) puede emplearse para expresar las secuencias de ADN de la presente invención, particularmente en las células de tejido o del sistema nervioso central tales como la corteza cerebral. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden estar constituidos por segmentos de secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y de plásmidos bacterianos conocidos, p. ej., plásmidos de E. coli col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., Gene 67:31-40, 1988), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; los ADN del fago, p. ej., los numerosos derivados del fago 1, p. ej., NM989 y otros ADN de fago, p. ej., M13 y ADN de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2m o sus derivados; vectores útiles en células eucarióticas tales como los vectores útiles en células de insecto o mamífero; vectores derivados de las combinaciones de plásmidos y de los ADN de fago como los plásmidos que han sido modificados para emplear el ADN del fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares. Además varias estirpes celulares tumorales pueden utilizarse en los sistemas de expresión de la invención.

Pueden utilizarse también sistemas de expresión de levadura según la invención para expresar cualquier proteína de interés. Por ejemplo, el vector pYES2 no de fusión (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1 y la secuencia de clonación de HindIII; Invitrogen) o pYESHisA, B, C de fusión (XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, KpnI y la secuencia de clonación HindIII, el péptido N-terminal purificado con la resina ProBond y separada con enterocinasa; Invitrogen), por mencionar sólo dos, pueden emplearse según la invención.

La expresión de la proteína o polipéptido puede controlarse mediante cualquier elemento activador/potenciador conocido en la materia, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los activadores que pueden utilizarse para controlar la expresión génica incluyen, pero no se limitan a, activador de citomegalovirus (CMV) (patentes US nº 5.385.839 y nº 5.168.062), la zona del activador precoz SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el activador contenido en la repetición larga del terminal 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 22:787-797, 1980), el activador de la timidina cinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1441-1445, 1981), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42, 1982); los vectores de expresión procariótica tal como el activador de \beta-lactamasa (Villa-Komaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3727-3731, 1978), o el activador tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25, 1983); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 242:74-94, 1980; y los elementos activadores de levadura y de otros hongos tales como el activador Gal 4, el activador ADC (alcohol deshidrogenasa), el activador de PGK (fosfoglicerol cinasa) y el activador de fosfatasa alcalina.

Los vectores preferidos, en particular para los análisis celulares in vitro e in vivo son vectores víricos, tales como los lentivirus, retrovirus, herpes virus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de la vacuna, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. De este modo, un gen que codifica una proteína funcional o mutante o un fragmento del dominio polipeptídico de ésta pueden introducirse in vivo, ex vivo o in vitro utilizando un vector vírico o mediante la introducción directa de ADN. La expresión en tejidos dirigidos puede estar afectada por el direccionamiento del vector transgénico a células específicas, tales como con un vector vírico o un ligando receptor, o utilizando un activador específico para el tejido o ambos. La administración génica dirigida se describe en la publicación de la patente internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995.

Los vectores víricos frecuentemente utilizados para el direccionamiento in vivo o ex vivo y los procedimientos terapéuticos son vectores a base de ADN y vectores retrovíricos. Los métodos para construir y utilizar vectores víricos son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Millar y Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992). Preferentemente, los vectores víricos tienen defectos de replicación, es decir, son incapaces de replicarse de forma autónoma en la célula diana. Preferentemente, el virus defectuoso para la replicación es un virus mínimo, es decir, retiene solamente las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular el genoma destinadas a producir partículas víricas.

Los vectores víricos de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como pero sin limitarse al virus del herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y similares. Los virus defectuosos, que carecen por completo o casi por completo de genes víricos, son los preferidos. El virus defectuoso no es infeccioso tras la introducción en una célula. La utilización de vectores víricos defectuosos permite la administración a las células en un área específica y localizada, sin tener que ver con el vector que puede infectar otras células. De este modo, un tejido específico puede ser dirigido específicamente. Ejemplos de vectores específicos incluyen, pero no se limitan a, un vector del herpes virus 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330, 1991), un vector del herpes virus defectuoso que carece de un gen con gluco-proteína L (publicación de patente RD 371005 A) u otros vectores de herpes virus defectuosos (publicación de Patente Internacional nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994); un vector de adenovirus atenuado (tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90:626-630; 1992; véase también La Salle et al., Science 259:988-990, 1993); y un vector del virus adenoasociado defectuoso (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988).

Varias compañías producen vectores víricos comercialmente, incluyendo pero sin que signifique limitados a Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores AAV), Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovíricos, adenovíricos, AAV y vectores lentivíricos), Clontech (vectores retrovíricos y baculovíricos), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovíricos y AAV), Genvec (vectores adenovíricos), IntroGene (Leiden, Holanda; vectores adenovíricos), Molecular Medicine (vectores retrovíricos, adenovíricos, AAV y herpes víricos), Normen (vectores adenovíricos), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivíricos) y Transgene (Estrasburgo, Francia; vectores adenovíricos, de vacuna, retrovíricos y lentivíricos).

5.3. Análisis de identificación

Utilizando análisis de identificación tales como los descritos a continuación en la presente memoria, es posible para un experto en la materia identificar compuestos que modulan (p. ej., inhiben o aumentan) la actividad de una fosfodiesterasa. En particular, el Ejemplo más adelante demuestra que una proteína G puede interactuar con un polipéptido de fosfodiesterasa (PDE), tal como un PDE estimulado por CaM, y activarla de este modo.

Los PDE son bien conocidos en la técnica, y se ha secuenciado un amplio número de polipéptidos PDE y están públicamente disponibles. Para estudios, véase Beavo, Adv. in Second Mess. and Prot. Phosph. Res. 1988, 22:1-38; véase también, Beavo, "Multiple Phosphodiesterase Isozymes: Background, Nomenclature and Implications", págs. 3-15 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action 1990, Beavo & Houslay, eds., John Wiley & Sons, Nueva York; Wang et al., "Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", págs. 19-59 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, anteriormente; y Manganiello et al., "Cyclic GMP-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", págs. 62-85 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, anteriormente. Véase también, las patentes US nº 6.037.119 y nº 6.015.677, publicadas el 14 de marzo de 2000 y el 18 de enero de 2000, respectivamente, concedida a Beavo et al. Por lo menos cinco tipos distintos de familia de PDE son conocidos en la materia, incluyendo: el tipo I o las PDE estimuladas por calmodulina (CaM); el tipo II o las PDE estimuladas por GMPc; el tipo III o las PDE inhibidas por GMPc; el tipo IV o las PDE específicas para AMPc; y el tipo V o las PDE específicas para GMPc. Las PDE de cada una de estas cinco familias se denominan en la presente memoria PDE1, PDE2, PDE3, PDE4 y PDE5, respectivamente.

La invención se pone en práctica utilizando una PDE estimulada por CaM (es decir, un polipéptido de PDE1). Las PDE estimuladas por CaM a título de ejemplo que pueden utilizarse, y son preferidas, incluyen la PDE1A (incluyendo las isoformas de la misma, tales como PDE1A1 y PDE1A7) y PDE1C (así como las isoformas de la misma). Véase, por ejemplo, las secuencias de polipéptidos depositadas en el GenBank con los números de registro NP_005010.1 (GI número 4826892), P54750 (GI número 1705942), AAC50436 (GI número 1151109), P14100 (GI número 544050), NP_005011 (GI número 4826894), Q14123 (GI número 2499445), AAC50437 (GI número 1151111) y AAA96961.1 (GI número 1151113), cada una de las cuales se le dio registro el 13 de septiembre de 2000.

Las proteínas G son también bien conocidas en la técnica (para estudios, véase Birnbaumer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990, 30:675-705; y Simon et al., Science 1991, 252:802-808). Cualquier subunidad (p. ej., una subunidad \alpha, \beta o \gamma) de cualquier proteína G procedente de algunas especies de organismo pueden utilizarse para poner en práctica los procedimientos de la presente invención, así como cualquier heterodímero de cualquier subunidad o subunidades de las proteínas G. La invención contempla además la utilización de fragmentos de subunidades (es decir, una subunidad \alpha, \beta o \gamma) de proteína G, particularmente "fragmentos de efector" que se describen en la presente memoria a continuación. Sin embargo, debido a que la subunidad \alpha proporciona generalmente la mayoría de la especificidad de interacción entre una proteína G y su efector, en las formas de realización preferidas los procedimientos y composiciones de las presentes invenciones se ponen en práctica utilizando la subunidad \alpha de una proteína G (es decir, un G\alpha polipéptido) o un fragmento de la misma. Las proteínas G a título de ejemplo que pueden utilizarse en los procedimientos y composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas G que se expresan en las células gustativas, y en otras células transductoras de señal (por ejemplo las células fotorreceptoras de bastones y/o conos). Como ejemplo, y no a título de limitación, en una forma de realización preferida se utiliza la subunidad \alpha de la proteína G gustducina en los procedimientos y composiciones de la presente invención. En otra forma de realización a título de ejemplo la subunidad \alpha de la proteína G transducina (p. ej., de las células fotorreceptoras de conos o bastones) se utiliza en los procedimientos y composiciones de la invención (véase, por ejemplo, la patente US nº 6.008.000 publicada el 28 de diciembre de 1999 concedida a Margolskee y, en particular las SEC. ID. nº: 21 a 24 presentadas en las Figs. 1A-1B de esta patente).

Sin estar limitado por ningún mecanismo concreto, se cree que las proteínas G interactúan con los polipéptidos PDE mediante la interacción de una "zona de activación del efector" de la proteína G con el PDE. Una "zona de activación" o "zona efectora", tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, se refiere a una zona o dominio de una proteína (p. ej., de una proteína G o de una subunidad de la misma) que se une específicamente a un polipéptido PDE y es activada por éste. De este modo, en las formas de realización particularmente preferidas de la invención, se utiliza un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de una zona de activación del efector de una proteína G o de una subunidad proteína G (p. ej., una subunidad \alpha, \beta o \gamma). Por ejemplo, en el Ejemplo más adelante se describe la utilización de un polipéptido con la secuencia de aminoácido de los restos 293 a 314 de un polipéptido de transducina G\alpha (p. ej., la SEC. ID. nº: 23 en las Figs. 1A-1B de la patente US nº 6.008.000 publicada el 28 de diciembre de 1999 concedida a Margolskee). Preferentemente, el polipéptido con una secuencia de aminoácidos de una zona de activación del efector para una proteína G o una subunidad de la proteína G comprende una secuencia entre 10 y aproximadamente 50 aminoácidos para la secuencia de polipéptidos de la proteína G o la subunidad de la proteína G. En formas de realización particularmente preferidas, el polipéptido comprende una secuencia de 20 restos de aminoácidos procedentes de la secuencia de la proteína G o de la subunidad de la proteína G.

Las clases de compuestos que pueden ser identificados por dichos análisis de identificación incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas así como a pequeñas moléculas (p. ej., moléculas orgánicas o inorgánicas que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 2 kd, son más preferentemente inferiores a aproximadamente 1 kd de peso molecular, y/o son capaces de cruzar la barrera sangre-cerebro o introducirse en una célula apropiada y afectar una interacción entre una proteína G y un polipéptido PDE). Los compuestos identificados por estos análisis de identificación pueden incluir también péptidos y polipéptidos. Por ejemplo, los análisis de identificación pueden identificar péptidos solubles, péptido de fusión, miembros de bancos combinatorios (tales como los descritos por Lam et al., Nature 1991, 354:82-84; y por Houghten et al., Nature 1991, 354:84-86), miembros de los bancos derivados por química combinatoria (por ejemplo, bancos moleculares de aminoácidos con configuración D y/o L), y fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bancos de fosfopéptido directos aleatorios o parcialmente degenerados tales como los descritos en Songyang et al., Cell 1993, 72:767-778). Los procedimientos de identificación de la invención pueden también identificar anticuerpos que afectan una interacción entre una proteína G y un polipéptido PDE, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, antiidiotípicos, híbridos o de una sola cadena, así como fragmentos de anticuerpo tales como FAb, F(Ab')_{2}, fragmentos del banco de expresión FAb y fragmentos de fijación al epítopo de los mismos.

En general, los análisis para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre un PDE estimulado por CaM y un polipéptido de activación del efector conllevan preparar una mezcla de reacción de prueba que contiene el polipéptido PDE y un polipéptido de activación del efector en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el polipéptido PDE y el polipéptido de activación del efector se unan y formen un complejo. Con objeto de analizar en un compuesto la actividad inhibidora (es decir, para que la capacidad de inhibir la formación del complejo, o para destruir los complejos de fijación una vez formados), el compuesto de prueba, preferentemente está también presente en la mezcla de reacción. En una forma de realización a título de ejemplo, el compuesto de prueba puede estar incluido inicialmente en la mezcla de reacción de prueba con el PDE y polipéptidos de activación del efector. Alternativamente, sin embargo, el compuesto de prueba puede añadirse a la mezcla de reacción de prueba en un momento posterior, siguiente a la adición del PDE y de los polipéptidos efectores. En formas de realización preferidas, pueden prepararse también una o más mezclas de reacción de referencia, que no contienen el compuesto de prueba. Típicamente, una mezcla de reacción de referencia contendrá el mismo PDE y los polipéptidos de activación del efector que están en la mezcla de reacción de prueba, pero que no contienen un compuesto de prueba. Una mezcla de reacción de referencia puede también contener un placebo, no presente en la mezcla de reacción de prueba en lugar del compuesto de
prueba.

La formación de un complejo entre el PDE y los polipéptidos efectores puede detectarse a continuación en la mezcla de reacción. La formación de dicho complejo en ausencia de un compuesto de prueba (p. ej., en una mezcla de reacción de referencia) pero no en presencia de un compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba es el que interfiere con la interacción de un polipéptido de PDE y un polipéptido efector o modula la misma.

Los análisis de los compuestos que modulan la interacción de un polipéptido PDE y de un polipéptido efector pueden realizarse en un formato heterogéneo o, alternativamente, en un formato homogéneo. Los análisis heterogéneos implican típicamente el anclaje ya sea a un polipéptido PDE o a un polipéptido efector en una fase sólida y la detección de los compuestos anclados en la fase sólida al final de la reacción y después la eliminación (p. ej., por lavado) de los compuestos no unidos.

Por ejemplo, en una forma de realización preferida de dicho procedimiento, un polipéptido PDE puede estar anclado en una superficie sólida y un polipéptido efector marcado se pone en contacto con la superficie. Con objeto de analizar la actividad inhibidora de un compuesto, el compuesto de prueba preferentemente también se pone en contacto con la superficie. Por ejemplo, el compuesto de prueba puede ponerse en contacto con la superficie con el polipéptido efector marcado. Alternativamente, el compuesto de prueba puede ponerse en contacto con la superficie en un momento posterior, después de la introducción del polipéptido efector.

Después de poner en contacto el polipéptido efector con la superficie, los polipéptidos PDE y efector se incuban durante un tiempo suficiente y en condiciones suficientes para que pueda formarse un complejo entre la PDE los polipéptidos efectores. En las formas de realización en las que un compuesto de prueba se pone en contacto en la superficie con el polipéptido efector, la PDE y los polipéptidos efectores se incuban con el compuesto de prueba. Alternativamente, en las formas de realización en las que un compuesto de ensayo se pone en contacto en la superficie en un momento después de la introducción del polipéptido efector, el PDE y los polipéptidos efectores pueden incubarse antes de la adición del compuesto de ensayo, durante un tiempo suficiente y en condiciones suficientes para que pueda formarse un complejo entre la PDE y los polipéptidos efectores. En dicha forma de realización alternativamente, la PDE y los compuestos efectores se incuban preferentemente otra vez con el compuesto de ensayo (preferentemente en las mismas condiciones), p. ej., de modo que el compuesto de ensayo pueda destruir los complejos entre la PDE y los polipéptidos efectores que se han formado, p. ej., durante la primera incubación. Después de incubar los polipéptidos y el compuesto de ensayo, las moléculas no unidas de los polipéptidos efectores y del compuesto de ensayo se separan de la superficie (p. ej., mediante lavado) y se detectan las moléculas marcadas que quedan.

Como se indicó anteriormente, en las formas de realización preferidas pueden prepararse también una o más reacciones de referencia que no contienen un compuesto de ensayo. Por ejemplo, el polipéptido PDE puede unirse a un soporte sólido o a una superficie y un polipéptido efector marcado ponerse en contacto con ésta, sin que se ponga en contacto el compuesto de ensayo con la superficie. Alternativamente, puede ponerse en contacto un placebo con la superficie en lugar de un compuesto de ensayo. El análisis heterogéneo descrito anteriormente puede también realizarse uniendo un polipéptido efector a un soporte o superficie sólida, y poniendo en contacto un polipéptido PDE marcado con ésta.

Los polipéptidos pueden marcarse según cualquier método conocido en la materia incluyendo, pero sin limitarse a, radiomarcado con yodo o fósforo (véase, por ejemplo, la patente europea nº EP 372707 B), colorantes fluorescentes (p. ej., Cy3 o Cy5), un grupo quelante acomplejado con un ión metálico, un cromóforo, un fluoróforo, biotina, un coloide de oro, etc.

Alternativamente, debido a que la interacción entre los polipéptidos PDE de la invención y un polipéptido efector (p. ej., una proteína G) activan a PDE, los análisis de identificación de la presente invención pueden también identificar compuestos que modulan una interacción entre un polipéptido PDE y un polipéptido efector detectando cambios en la actividad de PDE. En una forma de realización preferida, los cambios en la actividad de PDE se detectan por detección de la hidrólisis de un monofosfato de nucleótido cíclico (NMPc) tal como AMPc o GMPc. Los análisis de rutina para detectar la actividad de PDE (p. ej., detectando la hidrólisis de NMPc) son bien conocidos en la materia y han sido descritos, p. ej., por Sonnenburg et al. (Methods 1998, 14:3-19). La utilización a título de ejemplo de dichos análisis se describe también en el Ejemplo, más adelante. Dichos análisis se utilizan preferentemente para detectar la actividad de PDE en un sistema de análisis homogéneo. Sin embargo, los expertos en la materia pueden apreciar fácilmente que dichos análisis pueden adaptarse también para su utilización en un sistema de análisis heterogéneo, tal como los descritos anteriormente, sin experimentación excesiva.

Los procedimientos de identificación de la presente invención incluyen también procedimientos para identificar las PDE de tipo I que son activadas por una proteína G. Dichos procedimientos comprenden detectar la activación de un polipéptido PDE puesto en contacto con un polipéptido. El polipéptido comprende un péptido de activación de la proteína G procedente de un \alpha-dominio de una proteína G. En una forma de realización, el polipéptido es una proteína G. La proteína G/PDE puede expresarse en una célula heteróloga, en la que la actividad de PDE puede ser detectada por algunas de las mediciones habituales. Alternativamente, el polipéptido o péptido de la proteína G purificada y PDE pueden combinarse in vitro, y determinarse la actividad de PDE utilizando procedimientos de rutina. Incluso en otra forma de realización, el péptido de la proteína G puede añadirse a una célula que contiene un PDE para experimentación para determinar si activa el PDE. Dichos péptidos pueden ser restos de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos, p. ej., tales como el péptido que comprende los restos de los aminoácidos 293 a 314 de la subunidad \alpha de transducina, más específicamente un péptido con una secuencia como la indicada en la Fig. 6 (SEC. ID. nº: 1).

Aunque puede utilizarse cualquier proteína G, en los ejemplos específicos la proteína G se selecciona del grupo constituido por transducina y gustucina.

Una vez se han identificado dichas interacciones la presente invención permite la generación de sistemas de análisis y procedimientos que aparejan la combinación específica proteína G/PDE para descubrir compuestos que inhiben la actividad de PDE mediada por la proteína G. Como se expuso anteriormente, dichos compuestos presentan claramente potencial para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados a insuficiencia de la actividad de PDE.

6. Ejemplo

La invención se describe también mediante el siguiente ejemplo específico. En particular, los experimentos descritos en este ejemplo identifican y confirman la existencia de una interacción directa entre determinadas fosfodiesterasas (PDA) y proteínas G. En particular, estos experimentos demuestran que un polipéptido efector que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína G puede interactuar con la actividad de las PDE estimuladas por CaM, y ser modulada por éstas, tales como PDE1A (incluyendo las isoformas de las mismas, tales como PDE1A1 y PDE1A7) y PDE1C.

6.1. Materiales y procedimientos

Reactivos. La leupeptina y la aprotinina se adquirieron en Boehringer-Mannheim Biochemicals (Indianápolis, IN). La columna de intercambio aniónico DEAE era de Bio-Rad laboratories (Hércules, CA). La IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirió en Amersham. [8,5^{3}H] GMPc y [^{3}H] AMPc se adquirieron en NEN-Research Products (Boston, MA). Los kits de secuenciado de ADN de la reacción preparados para el secuenciado del ciclo terminador del colorante Taq ADN polimerasa eran de Perkin-Elmer Corp. (Foster City, CA). Los escalones de 100 bp y los marcadores de proteínas teñidos previamente eran de GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD). Las lentejas con afinidad a calmodulina se adquirieron en Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). La calmodulina del cerebro bovino se adquirió en Calbiochem. Corp. (La Jolla, CA). Todos los péptidos del estudio se sintetizaron en las instalaciones HHMI Protein Core de la Universidad de Columbia o en la Universidad de Washington. Todos los demás reactivos se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Preparación del extracto de sabor. Se disecaron 1 a 2 g de papilas gustativas circundantes o de papilas fungiformes procedentes de lenguas de bovino frescas y se homogeneizaron en un tampón que contenía Tris-Cl 20 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, glicerol al 10%, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, AEBSF 100 \muM y 10 \mug/ml de pepstatina. La homogeneización se realizó utilizando un homogeneizador Polytron. El homogeneizado se centrifugó en primer lugar a 2.500 \times g durante 30 minutos a 4ºC y el sobrenadante resultante se centrifugó a 100.000 \times g durante 30 minutos a 4ºC. En el sobrenadante de la segunda centrifugación se comprobó la actividad de PDE y se fraccionó por cromatografía de intercambio aniónico.

Cromatografía de intercambio aniónico. El sobrenadante preparado a partir de las papilas gustativas se cargó en una columna de intercambio aniónico DEAE-10 a razón de 1 ml/min que había sido equilibrada con tampón A (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, \beta-mercaptoetanol 20 mM). La columna se lavó en tampón A durante 15 minutos o hasta que la proteína no se detectó más en el tampón. La actividad de la proteína unida se eluyó a un caudal de 2 ml/min con un gradiente lineal (0-100%) de tampón B (tampón A + NaCl 1 M) durante 45 minutos. Se recogieron las fracciones a 4ºC y se analizó la actividad de PDE. Se hirvieron las alícuotas de cada fracción en el tampón de la muestra para el análisis por transferencia Western.

Análisis de PDE y afinidad de CaM en lentejas. Los análisis de PDE siguientes crearon los procedimientos (Sonnenburg et al., Methods 1998, 14:3-19). Todos los análisis se realizaron a 30ºC utilizando AMPc 1 \muM o GMPc entre 0,2 y 1 \muM en presencia de EGTA 1 mM (basal), CaCl_{2} 1 mM más 4 \mug/ml de CaM (Ca^{2+}/CaM) o péptido de activación del efector 100 \muM péptido (G\alpha_{t-rod}).

Las fracciones que contienen actividad estimulable por Ca^{2+}/CaM se purificaron más por afinidad utilizando lentejas de calmodulina-sepharose 4B en un tampón que contiene Tris-HCl 40 mM pH 7,5, CaCl_{2} 0,1 mM, acetato de Mg 3 mM, NaCl 100 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM en presencia de 10 \mug/ml de leupeptina y de 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina de soja (SBTI). La especificidad de las lentejas con afinidad a calmodulina se comprobó realizando una purificación por cromatografía de afinidad en presencia de EGTA 2 mM en lugar de CaCl_{2}. Se incubaron las lentejas con las fracciones apropiadas a 4ºC durante 1 hora, a continuación se centrifugó durante 2 minutos y se mantuvieron por separado el sobrenadante y el sedimento. Las lentejas se lavaron a continuación en el mismo tampón y se volvieron a poner en suspensión en presencia de inhibidores de proteasa. Se comprobó la actividad de PDE en las lentejas y en el sobrenadante. CaCl_{2} se compensó en los análisis de PDE cuando se realizó la afinidad a CaM en presencia de EGTA en exceso.

Sobreexpresión y análisis de las PDE recombinantes. Se cultivaron células HEK 293 en MEM de Eagle con glutamato 2 mM, solución salina equilibrada de Earle, 1,5 g/l de bicarbonato sódico, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM y 10% de suero de ternero fetal activado térmicamente. Se sembraron células HEK 293 a razón de 0,5 \times 10^{6} por pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 24 horas, se transfectaron las células con montajes de ADN utilizando Gene Porter (Gene Therapy Systems), un reactivo de transfección a base de lípido. Se transfectaron las células con 6 \mug de ADN (PDE1A1, PDE1A2 o PDE1C3) y 30 \mul de reactivo de transfección en medio exento de suero en un volumen de 1 ml. Después de 5 horas, se enriquecieron las células con 1 ml de medio que contiene suero doble. 24 horas después, se recogieron las células enjuagando dos veces con PBS (arañando las células en 200 \mul de tampón que contenía Tris-Cl 20 mM pH 7,5, inhibidores de proteasa (Sigma P-8340), fluoruro de 4-(2-aminoetilo) bencenosulfonilo (AEBSF) 1mM, pepstatina A 15 \muM, trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E-64) 14 \muM, bestatina 40 \muM, leupeptina 22 \muM y aprotinina 0,8 \muM. Se trataron con ultrasonidos las células en 3 ráfagas de 5 segundos a aproximadamente 10 vatios, y se utilizaron los lisados como fuente de enzima en el análisis de PDE.

Análisis por transferencia Western. Se hirvieron las muestras en tampón de muestra durante 5 minutos, se cargaron en un gel SDS-poliacrilamida (10% de acrilamida/0,2% de bisacrilamida) y se realizó la electroforesis. Las proteínas por separado se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se inmunotiñeron con anticuerpos anti-PDE1 o PDE5 específicos para la isoenzima (Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994). Se detectó inmunorreactividad por aumento de quimioluminiscencia utilizando las IgG anti-conejo de cabra conjugadas con HRP y mezcla de HRP-substrato luminiscente.

Ampliación de las PDE por reacción en cadena de polimerasa. Se montaron las PCR utilizando cebadores específicos para varias isoformas de PDE y un banco de ADNc de papilas bovinas circundantes como plantilla. Se separaron los productos de la reacción en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% que contenía bromuro de etidio. Las bandas de ADN de los tamaños previstos, basadas en la secuencia publicada y en la posición de los cebadores de ampliación se eluyeron en gel y se secuenciaron utilizando el secuenciado del ciclo terminador de colorante.

Síntesis de péptidos. El péptido G\alpha_{t-rod} correspondiente a la zona de interacción del efector de PDE de la transducina de los bastones, se sintetizó por el procedimiento Fmoc/t-Bu Chemistry en fase sólida utilizando el sintetizador 431A de Applied Biosystems. Se sintetizó también un péptido codificado de la misma composición de aminoácidos, pero de secuencia aleatoria. Se sintetizaron ambos péptidos con un terminal amino libre y con una amida en el terminal C. Se purificaron péptidos en bruto por HPLC en fase inversa en una columna 2,3 \times 30 cm C-18 de Bondapack. Se eluyeron los péptidos a un caudal de 8 ml/min. con un gradiente lineal (acetonitrilo del 5 al 65% que contenía ácido trifluoroacético al 0,1%) durante tres horas, con detección a 215 nm. Se disolvieron los péptidos purificados en agua destilada como soluciones 5 mM y a continuación se almacenaron a -20ºC antes de su utilización.

Localización inmunocitoquímica de las PDE. Se bloquearon secciones congeladas (8 \muM) de tejido lingual murino previamente fijadas en paraformaldehído al 4% y crioprotegidas en sacarosa al 20% en BSA al 3%, Triton X-100 al 0,3%, suero de cabra al 2% y azida sódica al 0,1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. El doble marcado de las secciones se realizó utilizando anticuerpos policlonales contra PDE1A (Sonnenburg et al., Methods 1998, 14:3-19) y G\alpha_{gus} (Ruiz-Avila et al., Nature 1995, 14:3-19) según un procedimiento suministrado por Jackson Immunoresearch. Los anticuerpos secundarios eran Fab anti-conejo de cabra (GAR) conjugado con Cy3 para PDE1A y Fab anti-conejo de cabra (GAR) conjugado con fluoresceína para G\alpha_{gus}. Después del bloqueo, se incubaron las secciones sucesivamente con los siguientes reactivos (1) antisueros de PDE1A (1:200); (2) fragmentos de Fab marcados con GAR-Cy3; (3) antisueros anti-conejo no marcados (para asegurar que todos los puntos del conejo estaban ocupados); (4) antisueros de G\alpha_{gus} (1:1.000); y (5) fragmentos de Fab marcados con GAR-FITC. Se lavaron tres veces las secciones con PBS que contenía Triton X-100 al 0,3% entre cada incubación. Dado que ambos anticuerpos primarios aumentaron en el conejo, se realizó un control en el que el segundo antisuero primario (es decir, anti-G\alpha_{gus}) se omitió para verificar que el segundo antisuero secundario marcado (GAR-FITC Fab) no se estaba uniendo al primer antisuero primario (es decir, anti-PDE1A). En los controles adicionales, se bloqueó la inmunorreactividad de los anticuerpos de PDE1A mediante incubación previa con el antígeno (proteína de fusión de la zona C-terminal de GST-PDE1A).

6.2. Resultados

Fraccionamiento e identificación de PDE gustativas. Para identificar que, si existen, las PDE en el tejido gustativo están reguladas por las proteínas G tales como la transducina y la gustducina (véase la patente US nº 6.008.000 publicada el 28 de diciembre de 1999 concedida a Margolskee), se resolvieron las isoformas de PDE expresadas en el tejido gustativo bovino por cromatografía de intercambio aniónico. En cada fracción se analizó la actividad de PDE en presencia de Ca^{2+}/CaM (actividad estimulable por calmodulina), EGTA (actividad basal) o péptido G\alpha_{t-rod} (actividad estimulada por transducina/gustducina) utilizando GMPc o AMPc como sustratos. Se llevó a cabo también el análisis por transferencia Western de las fracciones con anticuerpos específicos para PDE.

Un perfil de fraccionamiento típico de la actividad de hidrólisis de GMPc, que pone de manifiesto múltiples picos, se presenta en la Fig. 1A. Si bien predomina la actividad de PDE estimulada por Ca^{2+}/CaM, existe una actividad basal de PDE significativa en presencia de EGTA, lo que indica la presencia de las PDE que no se estimulan por Ca^{2+}/CaM. En general, los picos de actividad de PDE estimulados por Ca^{2+}/CaM se solapan completamente bien con los de la actividad de PDE estimulada por el péptido G\alpha_{t-rod}. Los cuatro picos mayores de la actividad de GMPc PDE pueden observarse (Fig. 1A). El primer pico pequeño de la actividad hidrolítica de GMPc (fracciones 6-7) es probable que contenga una PDE estimulada por Ca^{2+}/CaM exclusivamente como es evidente de la actividad de fosfodiesterasa despreciable en presencia de EGTA. Este pico fue activado también por el péptido G\alpha_{t-rod}. El segundo y el pico mayor de la actividad hidrolítica de GMPc (fracciones 10 y 12) está también activado tanto por Ca^{2+}/CaM como por el péptido G\alpha_{t-rod}, pero contiene también actividad hidrolítica basal mínima de GMPc en presencia de EGTA. El tercer pico (fracciones 13-15) presenta la mayor actividad cuando es estimulado por uno de los dos Ca^{2+}/CaM o el péptido G\alpha_{t-rod}. Sin embargo este tercer pico contiene también actividad hidrolítica significativa de GMPc en presencia de EGTA, lo que indica la presencia de otras PDE que no están estimuladas por Ca^{2+}/CaM. El cuarto pico (fracciones 21 a 23) no fue estimulado por encima del nivel de referencia por Ca^{2+}/CaM o el péptido G\alpha_{t-rod}.

Un perfil típico de la hidrólisis de AMPc por las mismas fracciones se presenta en la Fig. 1B. Una vez más, pueden apreciarse cuatro picos de actividad de PDE. Los tres primeros picos (fracciones 6-7; fracciones 10-12; fracciones 13-15) que corresponden bien con los observados en la Fig. 1A (es decir, con GMPc como sustratos) presentan estimulación con Ca^{2+}/CaM o el péptido G\alpha_{t-rod}, pero presentan actividad basal mínima en presencia de EGTA. El cuatro pico (fracciones 19-23), sin embargo presenta actividad hidrolizante de AMPc sustancial (junto con actividad hidrolizante mínima de GMPc (véase Fig. 1A) en presencia de EGTA. La actividad hidrolizante de AMPc de este cuarto pico no es dependiente de Ca^{2+}/CaM ni del péptido G\alpha_{t-rod}. Basándose en sus propiedades farmacológicas con los inhibidores específicos de PDE4 rolipran y Ro-20-174, la PDE contenida en estas fracciones (es decir, fracciones 19-23) fue identificada como PDE4. Este resultado es coherente con la clonación precoz de dos PDE4 del tejido gustativo de rata (Spickofsky et al., Nat. Struc. Biol. 1994, 1:771-781).

Para comprender la especificidad de la estimulación mediada por el péptido G\alpha_{t-rod} de la actividad de PDE, se sintetizó un péptido codificado que presentaba la misma composición de aminoácidos que el péptido G\alpha_{t-rod}. La capacidad de este péptido codificado para activar las PDE en las fracciones 6 y 11 (que presentan la mayor actividad de PDE estimulada para el péptido G\alpha_{t-rod}) se probó a continuación. Los resultados de estas pruebas se presentan en la Fig. 1C. Las actividades de PDE de ambas fracciones 6 y 11 están estimuladas por la presencia del péptido G\alpha_{t-rod} (barras con trama), pero no por el péptido secuenciado (barras grises). Por lo tanto, la interacción del péptido transducina con estas PDE no es fenómeno no específico basado en la carga neta. Más bien, estos datos sugieren que el péptido G\alpha_{t-rod} se une específicamente con las PDE en función de la secuencia.

Como es evidente a partir de las Figs. 1A y 1B, muchas PDE están presentes en el tejido gustativo, incluyendo las formas dependientes e independientes de Ca^{2+}/CaM. Para identificar las PDE dependientes de Ca^{2+}/CaM (es decir, estimuladas por CaM), se llevaron a cabo análisis por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos para la isoforma PDE1 (Rybalkin et al., J. Clin. Invest. 1997, 100:2611-2621). Los tres primeros picos de Ca^{2+}/CaM estimularon la actividad hidrolítica de GMPc (correspondientes a las fracciones 6-7; 10-12 y 13-15 mostradas en la Fig. 1A), inmunorreaccionan con los anticuerpos PDE1A. Basándose en la movilidad en SDS-PAGE el primer pico (fracción 6 y 7), con una banda de \sim50 kDa, contiene una isoforma identificada recientemente denominada PDEIA7 (número de registro AF 59298). Las fracciones 11-14 contienen una variante de corte y empalme de peso molecular de aproximadamente 59 kDa, correspondiente en tamaño a PDE1A1. Una inmunotransferencia de las fracciones 14-16 puso de manifiesto bandas detectables de las variantes de corte y empalme de PDE1C en estas fracciones. En ausencia del péptido estimulante o de Ca^{2+}/CaM, las fracciones 13 a 15 hidrolizan a GMPc con un alto grado de selectividad sobre AMPc, lo que indica la presencia en estas fracciones de una PDE específica para GMPc tal como PDE5. Las inmunotransferencias de estas fracciones confirmaron que el hecho, realmente, contiene una PDE específica para GMPc. Scpm, las fracciones inmunorreaccionan con anticuerpos específicos para PDE5A (Bakre et al., J. Cellular. Biochem. 2000, 77:159-167).

Estos resultados demuestran por consiguiente que el tejido gustativo contiene múltiples actividades de PDE, incluyendo la actividad de PDE estimulada por CaM, p. ej. procedente de PDE1A1, PDE1A7 y PDE1C. Además, las fracciones por cromatografía de intercambio aniónico que presentan actividad de PDE estimulada por CaM también presentan actividad de PDE estimulada por el G\alpha_{t-rod}. El tejido gustativo contiene también la actividad de PDE procedente de otras clases de PDE, incluyendo PDE4 y PDE5. La presencia de ARNm que codifica cada una de estas clases de PDE fue confirmada por RT-PCR utilizando cebadores específicos correspondientes a zonas exclusivas de cada isoforma PDE1A, PDE1C, PDE4A y PDE5A seguido de secuenciado del ADN. No se observó ningún producto para PDE1B.

Una mayor parte de la actividad hidrolítica de GMPc presente en los extractos de tejido gustativo no era dependiente de Ca^{2+}/CaM (Fig. 1A). Además, el análisis por transferencia Western de las fracciones 13 a 16 presentó inmunotinción con un anticuerpo PDE5 de una banda del peso molecular apropiado para PDE5. Para confirmar este resultado, se utilizó un anticuerpo específico para PDE5 para inmunoprecipitar la actividad hidrolítica de GMPc de la fracción 14, la fracción con actividad hidrolítica de GMPc máxima en presencia de EGTA. Se preincubaron lentejas de proteína A con (lentejas Ab) o sin anticuerpo anti-PDE5 primario (lentejas de referencia). La actividad de PDE presente en las lentejas se determinó a continuación utilizando GMPc como sustrato en presencia de EGTA (Fig. 2). Las lentejas eliminaron el 60% de la actividad cuando se llevó a cabo la inmunoprecipitación en presencia de anticuerpo primario (barras con trama) y el sobrenadante presentó poca actividad dejada (barras negras). Cuando se llevó a cabo la inmunoprecipitación en ausencia de anticuerpo primario (lentejas de referencia), la mayor parte de la actividad de fosfodiesterasa permaneció en el sobrenadante (barras grises) y las lentejas/sedimento contenían actividad despreciable. De este modo, además de la actividad hidrolítica de PDE1, PDE5 contribuye a parte de la actividad hidrolítica de GMPc medida en el tejido gustativo.

Las isoformas PDE1A están presentes en el tejido gustativo. Para confirmar la presencia de PDE1A en las fracciones descritas anteriormente de tejido gustativo, se llevó a cabo un ensayo de afinidad a CaM "en sentido descendente" en estas fracciones en cada pico, que presentaba la mayor estimulación de Ca^{2+}/CaM sobre EGTA. La fracción 11 se incubó con lentejas de CaM-Sepharose 4B en presencia de CaCl_{2} (lentejas de CaM) o EGTA (lentejas de EGTA) (Fig. 3). En los sobrenadantes y la PDE unida a las lentejas (sedimentos) se comprobó la actividad de GMPc PDE en presencia de EGTA (barras blancas), Ca^{2+}/CaM (barras con trama) o del péptido G\alpha_{t-rod} (barras llenas). Con las lentejas de CaM, el 70 al 80% de la calmodulina o de la actividad de PDE estimulable por el péptido G\alpha_{t-rod} originalmente observada en la fracción 11 estaba presente en el sedimento, mientras que el sobrenadante estaba casi desprovisto de actividad de PDE alguna. El tampón en el que se lavaron las lentejas de CaM presentaba actividad despreciable de PDE. En el caso de las lentejas de EGTA, menos del 10% de la actividad estaba presente en el sedimento y la mayor parte de la actividad de PDE en su lugar se encontraba en el sobrenadante, lo que demuestra la especificidad y afinidad para CaM de la interacción de la PDE en la fracción 11. Se obtuvieron resultados similares cuando el experimento anterior se realizó con la fracción 6. La identificación de la fracción 11 como PDE1A se confirmó por transferencia Western del sedimento de las lentejas de CaM.

SCH 51866 es, con mucho, uno de los inhibidores más específicos de PDE1 e inhibe a PDE1 y a PDE5 con una IC_{50} de 0,1 \muM (Yan et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:25699-2706). La inhibición de Ca^{2+}/CaM o el péptido G\alpha_{t-rod} estimuló a PDE1A presente en las fracciones 6 y 11 se ensayó por consiguiente con SCH 51866. Como se muestra en la Fig. 4, las fracciones 6 y 11 presentaban baja actividad basal en presencia de EGTA (barras blancas) en comparación con la calmodulina estimulada (barras llenas) y el péptido estimulado (barras grises). Como era de esperar SCH 51866 inhibió la actividad estimulada por calmodulina en el 90% (barras con trama). Es interesante que SCH 51866 también inhibió la actividad estimulada por el péptido (barras verticales) presente en la fracción. SCH 51866 inhibió también la actividad de PDE1A estimulada por el péptido unida a lentejas de calmodulina. Por lo tanto, la actividad de PDE estimulada por calmodulina y el péptido G\alpha_{t-rod} está contribuida por la misma PDE, que está inhibida por SCH 51866. Estos resultados confirman que PDE1A, que está presente en el tejido gustativo, es de hecho responsable de la actividad estimulada por el péptido G\alpha_{t-rod}.

Activación de las isoformas de PDE1 por el péptido G\alpha_{t-rod}. El solapamiento extenso en las actividades de PDE estimuladas por Ca^{2+}/CaM y por el péptido G\alpha_{t-rod} en el cromatograma (Fig. 1) y en el sedimento de lentejas de CaM (Fig. 3), expuesto anteriormente, sugiere que PDE1A expresado en el tejido gustativo puede activarse por Ca^{2+}/CaM o por el péptido G\alpha_{t-rod}. Para esta hipótesis, se sobreexpresaron isoformas de PDE1 recombinante en células HEK-293 y la actividad de PDE de los homogeneizados de células se midió en presencia del péptido G\alpha_{t-rod} o Ca^{2+}/CaM (Fig. 5). Las tres PDE recombinantes, fueron estimuladas por Ca^{2+}/CaM (barras con tramas) y el péptido G\alpha_{t-rod} (barras negras), coherente con la hipótesis de que las PDE de tipo I están realmente estimuladas por el péptido G\alpha_{t-rod}. El péptido aleatorio (codificado) (barras grises) no estimuló las PDE recombinantes excepto para PDE1A1, en las que solamente se observó una modesta activación, muy por debajo de la conseguida con Ca^{2+}/CaM o el péptido
G\alpha_{t-rod}.

Expresión de PDE1A en las células receptoras de sabor. A fin de que la importancia biológica de los descubrimientos descritos anteriormente pueda determinarse mejor, se llevó a cabo la inmunocitoquímica en secciones de brotes gustativos de papilas de ratón rodeados de antisueros contra G\alpha_{gus} y PDE1A. En particular, estos experimentos determinaron si las isoformas de PDE1A se expresan en las células receptoras de sabor y, si de este modo, estas células son también positivas a G\alpha_{gus}.

Como era de esperar, la tinción de G\alpha_{gus} se observó en aproximadamente un tercio de las células en un brote de sabor. Se observó tinción de PDE1A en los brotes de sabor de aproximadamente la mitad de las células gustativas, lo que confirma la presencia de PDE1A en las células gustativas. Cuando las dos imágenes se combinan, pueden identificarse tres poblaciones de células: (1) células doblemente positivas G\alpha_{gus}/PDE1A; (2) células positivas simples G\alpha_{gus}; y (3) células positivas simples PDE1A. La mayoría de las células G\alpha_{gus} fueron positivas para PDE1A, lo que es coherente con la idea de que G\alpha_{gus} activó PDE1A durante la transducción del sabor. La inmunofluorescencia de PDE1A se observó en la zona perinuclear así como en los procesos apicales en los poros gustativos. La distribución apical es coherente con una función en la transducción del sabor. El modelo perinuclear se ha observado anteriormente en células cardiacas que expresan a PDE1A (Rybalkin et al. J. Clin. Invest. 1997, 100:2611-2621).

Claims (12)

1. Procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una fosfodiesterasa (PDE) de Tipo I, procedimiento que comprende:

(a)

poner en contacto un polipéptido de activación del efector con un polipéptido PDE de Tipo I en condiciones que permitan la unión del polipéptido de activación del efector con el polipéptido PDE, comprendiendo el polipéptido de activación del efector una zona de activación del efector de una proteína G; y

(b)

detectar la unión del polipéptido de activación del efector con el polipéptido PDE en presencia y en ausencia de un compuesto de ensayo,

en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que modula la actividad de una PDE de Tipo I si la unión del polipéptido de activación del efector al polipéptido PDE está modulada en presencia del compuesto de ensayo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que inhibe la actividad de una PDE de Tipo I si la unión del polipéptido de activación del efector al polipéptido PDE disminuye en presencia del compuesto de ensayo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que aumenta la actividad de una PDE de tipo I si la unión del polipéptido de activación del efector al polipéptido PDE aumenta en presencia del compuesto de ensayo.

4. Procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de una fosfodiesterasa (PDE) de Tipo I, procedimiento que comprende:

(a)

poner en contacto un polipéptido de activación del efector con un polipéptido PDE de Tipo I, comprendiendo el polipéptido de activación del efector una zona de activación del efector de una proteína G; y

(b)

detectar la actividad de PDE en presencia y en ausencia de un compuesto de ensayo,

en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que modula la actividad de una PDE de Tipo I si la actividad de PDE está modulada en presencia del compuesto de ensayo.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que inhibe la actividad de una PDE de tipo I si la actividad de PDE diminuye en presencia del compuesto de ensayo.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que aumenta la actividad de una PDE de tipo I si la actividad de PDE aumenta en presencia del compuesto de ensayo.

7. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la actividad de PDE se detecta según un procedimiento que comprende detectar la hidrólisis de un monofosfato de nucleósido cíclico (NMPc).

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el NMPc se selecciona de entre un grupo constituido por AMPc y GMPc.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 4, en el que la proteína G es una proteína G expresada en una célula gustativa receptora.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína G es la transducina.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el polipéptido de activación del efector comprende la secuencia de los restos de los aminoácidos 293 a 314 de la subunidad alfa de transducina indicada en la Fig. 6 (SEC. ID. nº: 1).

12. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 4, en el que el polipéptido PDE se selecciona de entre el grupo constituido por PDE1A7, PDE1A1 y PDE1C.