ES2285842T3

ES2285842T3 - Genes de poli(adp-ribosa)polimerasa.

Info

Publication number: ES2285842T3
Application number: ES99929144T
Authority: ES
Inventors: Michael Kock; Thomas Hoger; Burkhard Kroger; Bernd Otterbach; Wilfried Lubisch; Hans-Georg Lemaire
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: JP2002517231A; AU4605999A; ATE358175T1; KR20010052582A; BG105018A; HRP20010013A2; TR200003624T2; WO1999064572A2; HUP0103190A2; EP1082416A2; AR020326A1; CN1304446A; CA2330206C; US9051553B2; CA2330206A1; NO20006153D0; IL139750A0; HK1038591A1; NO20006153L; SK17892000A3

Abstract

Homólogos de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y sus equivalentes funcionales, caracterizados porque presentan una secuencia de aminoácidos, que presenta a) un dominio de enlace funcional NAD+ y b) ausencia de motivo de secuencia de dedo de cinc de la fórmula general CX2CXmHX2C en la que m significa un valor entero de 28 o 30 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera; comprendiendo el dominio de enlace NAD+ funcional el motivo de secuencia PXn(S/T)GX3GKGIYFA, en el que n significa un valor entero desde 1 hasta 5 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera.

Description

Genes de poli(ADP-ribosa)polimerasa.

La presente invención se refiere a nuevos genes de poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y a las proteínas derivadas de los mismos; a anticuerpos con especificidad para las nuevas proteínas; a agentes farmacéuticos y para la terapia génica, que contienen productos según la invención; a procedimientos para la determinación analítica de las proteínas y de los ácidos nucleicos según la invención; a procedimientos para la identificación de efectores o de componentes de enlace de las proteínas según la invención; a procedimientos para la determinación de la actividad de tales efectores, así como a su aplicación para el diagnóstico o la terapia de estados patológicos.

En 1996 Chambon y colaboradores descubrieron un enzima con 116 kD, que se caracterizó con mayor detalle en los años siguientes y en la actualidad porta los nombres PARP (EC 2.4.2.30) (poli(adenosin-5'-difosfo-ribosa)polimerasa), PARS (poli(adenosin-5'-difosfo-ribosa)sintetasa) o ADPRT (adenosin-5'-difosfo-ribosa-transferasa). En el reino vegetal (Arabidopsis thaliana) se encontró en 1995 un PARP de 72 kD (637 aminoácidos) (Lepiniec, L. et al., FEBS Lett. 1995:364(2):103-8). No estaba claro que en el caso de esta forma más corta de la PARP se tratase de una particularidad específica de los vegetales o de un artefacto (variante "Splice" o similar). Hasta la fecha el enzima PARP de 116 kD era único en el reino animal y en los seres humanos con su actividad descrita más adelante. A continuación se denominará como PARP1 para evitar confusiones.

La función fisiológica, primaria, de la PARP1 parece consistir en su participación en un mecanismo complejo de reparación, que han desarrollado las células para la reparación de las roturas del filamento de ADN. La reacción celular primaria sobre una rotura de la hebra de ADN parece que consiste en este caso en la síntesis, catalizada por medio de la PARP1 de la poli(ADP-ribosa) procedente de NAD^{+} (véase la publicación de De Murcia, G. et al., (1994) TIBS, 19, 172).

La PARP1 tiene una estructura molecular constituida de manera modular. Hasta ahora se han identificado tres elementos funcionales principales: un dominio de enlace ADN N-terminal, con un tamaño de 46 kD; un dominio de automodificación central de 22 kD, sobre el que se cuelga la poli(ADP-ribosa), disminuyendo la actividad enzimática de la PARP1 a medida que aumenta la elongación; y un dominio de enlace NAD^{+}, C-terminal, con un tamaño de 54 kD. Únicamente se ha detectado una región de cremallera en la PARP procedente de Drosophila dentro del dominio de automodificación, que apunta a una posible interacción proteína-proteína. Todas las PARPs conocidas hasta el presente son activas posiblemente como homodímeros.

El elevado grado de organización de la molécula se refleja en la fuerte conservación de la secuencia de aminoácidos. De este modo se ha observado para la PARP1 de los seres humanos, del ratón, de vaca y de perro una conservación de 62% de la secuencia de aminoácidos. Existen mayores diferencias estructurales con respecto a la PARP de la Drosophila. Los dominios individuales propiamente dichos presentan a su vez conglomerados con conservación acrecentada. De este modo la región de enlace ADN contiene dos denominados dedos de cinc como subdominios (que comprenden motivos del tipo CX_{2}CX_{28/30}HX_{2}C), que participan en el reconocimiento, dependiente del Zn^{2+}, de las roturas de las hebras monocatenarias de ADN o de los colgajos de ADN monocatanario (por ejemplo en los extremos de los cromosomas, los telómeros). El dominio catalítico C-terminal comprende un bloque de aproximadamente 50 aminoácidos (resto 859-908), que se conserva aproximadamente en el 100% entre los vertebrados ("firma" de la PARP). Este bloque enlaza el substrato natural NAD^{+} y condiciona, por lo tanto, la síntesis de la poli(ADP-ribosa) (véase la publicación de de Murcia, anteriormente citada). Especialmente el motivo GX_{3}GKG es característico de las PARPs en este
bloque.

Frente a la función positiva, anteriormente descrita, se encuentra una función patológica en un gran número de enfermedades (apoplejía, infarto cardíaco, sepsis, etc.). La PARP interviene en la muerte celular como consecuencia de isquemias cerebrales (Choi, D.W., (1997) Nature Medicine, 3, 10, 1073), del miocardio (Zingarelli, B., et al., (1997), Cardiovascular Research, 36, 205) así como también ocular (Lam, T.T. (1997), Res. Comm. in Molecular Pathology and Pharmacology, 95, 3, 241). Del mismo modo en el caso del choque séptico se observó una activación de la PARP provocada por mediadores de la inflamación (Szabo, C., et al. (1997), Journal of Clinical Investigation, 100, 3, 723). En este caso, una activación de la PARP va acompañada por un fuerte consumo de NAD^{+}. Puesto que se consumen cuatro moles de ATP para la biosíntesis de un mol de NAD^{+}, el aporte energético celular disminuye drásticamente. La consecuencia es la muerte celular.

En la literatura del ramo, anteriormente citada, se describen la nicotinamida y la 3-aminobenzamida como inhibidores de la PARP1. Se conoce la 3,4-dihidro-5-[4-(1-piperidinil)butoxi]-1(2H)-isoquinolona por la publicación de Takahashi, K., et al (1997), Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 17, 1137. Otros inhibidores han sido descritos, por ejemplo, en las publicaciones de Banasik, M., et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 3, 1569 y Griffin, R.J., et al. (1995), Anti-Cancer Drug Design, 10, 507.

Se ha descrito como componente de enlace de elevado peso molecular para la PARP1 humana, entre otras, la proteína Base Excision Repair (BER) XRCC1 (X-ray repair cross-complementing 1), que se enlaza a través de un motivo de dedo de cinc y de un módulo de BRCT (BRCA1 extremo C) (aminoácidos 372-524) (Masson, M., et al., (1998) Molecular and Cellular Biology, 18,6, 3563).

Los autores Lepiniec, L. et al. describen en la publicación FEBS Letters 364 (1995) 103-108 un homólogo de la PARP procedente de Arabidopsis thaliana, cuyo dominio catalítico presenta una gran similitud con la PARP de los vertebrados.

Debido a las múltiples funciones fisiológicas y patológicas de la PARP se plantea la tarea de poner a disposición nuevos homólogos de la PARP. La puesta a disposición de homólogos de las PARPs sería de un significado especial concretamente para el desarrollo de nuevas dianas para los productos activos o bien de nuevos productos activos, para mejorar el diagnóstico y/o la terapia de los estados patológicos, en los cuales están envueltos la PARP, los homólogos de la PARP o las substancias derivadas de los mismos.

Esta tarea se resolvió, sorprendentemente, mediante la puesta a disposición de homólogos de la PARP preferentemente a partir de mamíferos humanos o no humanos, y equivalentes funcionales de los mismos, caracterizados por una secuencia de aminoácidos, que presenta

a): un dominio de enlace NAD^{+} funcional, es decir una secuencia de "firma" de la PARP con el motivo caracterizante GX_{3}GKG; y

b): especialmente en la zona de la secuencia N-terminal, es decir en la zona de los primeros 200, así como por ejemplo en la zona de los primeros 100 aminoácidos N-terminales, no presenten motivos de secuencia de la PARP-dedo de cinc de la fórmula general

CX_{2}CX_{m}HX_{2}C

: en la que

: m significa un valor entero desde 28 hasta 30 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera; y presentando el dominio de enlace NAD^{+} funcional, el motivo de secuencia definido en la reivindicación 1.

\vskip1.000000\baselineskip

Puesto que las moléculas de la PARP, según la invención, representan especialmente homólogos funcionales, tienen naturalmente, además, una actividad sintetizante de poli-(ADP-ribosa). El dominio de enlace NAD corresponde esencialmente a esta actividad y está localizado como C-terminal.

La característica esencial de las PARPs, según la invención, consiste, por lo tanto, en la presencia de un dominio de enlace NAD^{+} funcional (firma de la PARP), que se encuentra en la zona C-terminal de la secuencia de aminoácidos (es decir aproximadamente en la zona de los últimos 400, tal como por ejemplo de los últimos 350 o 300 aminoácidos C-terminales), en combinación con una secuencia N-terminal, que no presenta motivos de dedo de cinc. Puesto que los motivos de dedo de cinc contribuyen en las PARPs conocidas, probablemente, al reconocimiento de los puntos de rotura del ADN, debe suponerse que las proteínas según la invención no interaccionan o interaccionan de otra manera con el ADN. Con ensayos bioquímicos correspondientes pudo demostrarse que la PARP2, según la invención puede activarse mediante "ADN activado" (es decir ADN digerido limitadamente con DNasaI). De aquí puede deducirse, además, que la PARP2, según la invención, tiene propiedades enlazantes del ADN. El mecanismo para el enlace del ADN y la activación enzimática en el caso de las PARPs según la invención es, sin embargo, diferente del de la PARP1. Su enlace ADN y su activación enzimática se determinan, como se ha citado, por medio de un motivo característico de dedo de cinc. Tales motivos no están presentes en las PARPs según la invención. Probablemente los aminoácidos, cargados positivamente, inducen estas propiedades en la zona N-terminal de las PARPs según la invención. Puesto que el "ADN activado" (es decir por ejemplo ADN que ha sido tratado limitadamente con DNasaI) presenta una pluralidad de defectos (roturas de las hebras monocatenarias, huecos de las hebras monocatenarias, colgajos en las hebras monocatenarias, roturas en la hebra doble, etc.) es posible que la PARP1 y que las PARPs, según la invención, sean activadas, ciertamente por medio de este "ADN activado", sin embargo debido a otra subpoblación de defectos (por ejemplo huecos en las hebras monocatenarias en lugar de roturas en las hebras
monocatenarias).

Los dominios de enlace NAD^{+} funcionales (es decir los dominios catalíticos) enlazan el substrato para la síntesis de la poli-(ADP-ribosa). En coincidencia con las PARPs conocidas debe encontrarse, especialmente, el motivo de secuencia GX^{1}X^{2}X^{3}GRG, en el que G significa glicina, K significa lisina y X^{1}, X^{2} y X^{3} significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera. Sin embargo tal como se ha observado sorprendentemente por comparación de las secuencias de aminoácidos de los dominios enlazantes NAD^{+} de las moléculas de la PARP, según la invención, con la PARP1 humana, conocida hasta ahora, las secuencias según la invención se diferencian claramente de la secuencia conocida para el dominio de enlace NAD^{+}.

\newpage

\global\parskip0.930000\baselineskip

Un grupo preferente, según la invención, de moléculas de la PARP tienen en común preferentemente el siguiente motivo de secuencia general en el dominio catalítico:

PX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFA	(SEQ ID NO:11)	especialmente

(S/T)XGLR(I/V)XPX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFA	(SEQ ID NO:12),	preferentemente

LLWHG(S/T)X_{7}IL(S/T)XGLR(I/V)XPX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFAX_{3}SKSAXY (SEQ ID NO:13)

donde (S/T) describe la ocupación alternativa de esta posición secuencial con S o T, (I/V) describe la ocupación alternativa de esta posición secuencial con I o V y n significa un valor entero desde 1 hasta 5 y los restos X, independientemente entre sí, significan un aminoácido cualquiera. El último motivo se denomina también como motivo "firma PARP".

El dominio de automodificación está formado también, preferentemente, en las PARPs según la invención. Éste puede encontrarse en la zona de aproximadamente 100 hasta 200 aminoácidos por delante del extremo N-terminal del dominio de enlace NAD^{+}.

Los homólogos de la PARP, según la invención, pueden comprender además en posición N-terminal con respecto al dominio de enlace NAD^{+} (es decir con una proximidad de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 80 aminoácidos con respecto al N-término) un motivo de secuencia de tipo cremallera de leucina de la fórmula general

(L/V)X_{6}LX_{6}LX_{6}L: (SEQ ID NO:14)

donde (L/V) significa la ocupación alternativa de esta posición secuencial con L o V y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera. Los motivos de cremallera de leucina, observados según la invención, se diferencian claramente en cuanto a su longitud de los que han sido descritos para la PARP de Drosophila. Las cremalleras de leucina pueden conducir a homodímeros (dos moléculas de la PARP) o a heterodímeros (una molécula de la PARP con un componente de enlace diferente a la misma).

Los homólogos de la PARP, según la invención, comprenden preferentemente, además, en posición N-terminal con respecto al motivo de secuencia de tipo cremallera de leucina, anteriormente citado, es decir a una proximidad de aproximadamente 10 hasta 250 aminoácidos del N-término, al menos otro motivo con la secuencia parcial siguiente:

LX_{9}NX_{2}YX_{2}QLLX(D/E)X_{b}WGRVG,: (motivo 1; SEQ ID NO:15)

AX_{3}FXKX_{4}KTXNXWX_{s}FX_{3}PXK,: (motivo 2; SEQ ID NO:16)

QXL(I/L)X_{2}IX_{9}MX_{10}PLGKLX_{3}QIX_{6}L,: (motivo 3; SEQ ID NO:17)

FYTXIPHXFGX_{3}PP,: (motivo 4; SEQ ID NO:18) y

KX_{3}LX_{2}LXDIEXAX_{2}L: (motivo 5; SEQ ID NO:19),

donde (D/E) describe la ocupación alternativa de esta posición secuencia con D o E, (I/L) describe la ocupación alternativa de esta posición secuencial con I o L, b significa un valor entero de 10 u 11 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera. En el caso más preferente están presentes simultáneamente estos motivos 1 a 5 en el orden indicado, encontrándose el motivo 1 más próximo del N-término.

En las proteínas, según la invención, el motivo de la firma PARP, anteriormente citado, vas seguido por al menos otro de los motivos siguientes:

GX_{3}LXEVALG: (motivo 6; SEQ ID NO:20)

GX_{2}SX_{4}GX_{3}PX_{a}LXGX_{2}V: (motivo 7; SEQ ID NO:21) y

E(Y/F)X_{2}YX_{3}QX_{4}YLL: (motivo 8; SEQ ID NO:22)

donde (Y/F) describe la ocupación alternativa de la posición secuencial con Y o F, a es igual a 7 hasta 9 y X significa, respectivamente, un aminoácido cualquiera. En el caso más preferente están formados los tres motivos C-terminales simultáneamente y en el orden indicado, encontrándose el motivo 8 más próximo del C-término.

Una construcción preferente de una estructura de la PARP, según la invención, puede describirse esquemáticamente de la manera siguiente:

motivos 1 a 5/firma PARP/motivos 6 a 8 o motivos 1 a 15/cremallera de leucina/firma PARP/motivos 6 a 8

\global\parskip1.000000\baselineskip

pudiendo estas dispuestos entre los motivos individuales otros restos de aminoácidos, tal como por ejemplo hasta 40, y en el N-término y/o en el C-término otros aminoácidos, tal como por ejemplo hasta 80.

Los homólogos PARP especialmente preferentes, según la invención, son las proteínas humanPARP2, humanPARP3, mausPARP3 y los equivalentes funcionales de las mismas. La proteína denominada como humanPARP2 comprende 570 aminoácidos (véase SEQ ID NO:2). La proteína denominada como humanPARP3 existe posiblemente en dos formas. El tipo 1 comprende en este caso 553 aminoácidos (SEQ ID NO:4) y el tipo 2 comprende 540 aminoácidos (SEQ ID NO:6). Las formas pueden producirse debido a la iniciación diferente de la traducción. La proteína denominada como mausPARP3 existe en dos formas, que se diferencian entre sí por una eliminación de 5 aminoácidos (15 bp). El tipo 1 comprende en este caso 533 aminoácidos (SEQ ID NO:8), el tipo 2 comprende 528 aminoácidos (SEQ ID NO:10). Los homólogos de la PARP, según la invención, se diferencian claramente en su secuencia con respecto a la de la proteína PARP conocida procedente de Arabidopsis thaliana (véase más arriba). De este modo la PARP2 y la PARP3 no presentan, por ejemplo, la secuencia péptida AAVLDQWIPD, característica de la PARP vegetal, que corresponde a los restos de aminoácido 143 hasta 152 de la proteína
Arabidopsis.

Otro objeto de la invención se refiere a componentes de enlace para los homólogos de la PARP según la invención. Estos componentes de enlace se eligen, preferentemente, entre

a): anticuerpos y fragmentos, tales como por ejemplo Fv, Fab, F(ab)'_{2}, entre los cuales

b): compuestos de tipo proteico, que interaccionan con la PARP por ejemplo a través de la región de cremallera de leucina anterior o a través de otro segmento de la secuencia, y

c): efectores de bajo peso molecular, que modulen una función PARP biológica, tal como por ejemplo la actividad PARP catalítica, es decir la ribosilación ADP consumidora de NAD^{+}, o el enlace con una proteína activadora o con el ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Otro objeto de la invención se refiere a ácidos nucleicos, que comprenden

a): una secuencia de nucleótido, que codifique al menos un homólogo de la PARP según la invención o la secuencia de nucleótido complementaria del mismo;

b): una secuencia de nucleótido que se hibridice, preferentemente bajo condiciones rigurosas, con una secuencia según a); o

c): secuencias de nucleótidos, que se deriven, por desnaturalización (degeneración) del código genético de las secuencias de nucleótidos definidas en a) y b).

En particular, los ácidos nucleicos adecuados según la invención comprenden al menos una de las secuencias parciales que codifican los motivos de secuencias de aminoácidos anteriormente citadas.

Los ácidos nucleicos, preferentes según la invención, comprenden las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NO: 1 y 3, y, especialmente, secuencias parciales de las mismas características para los homólogos de la PARP según la invención, tales como por ejemplo las secuencias de nucleótidos, que comprenden

a): los nucleótidos +3 hasta + 1715 según SEQ ID NO:1;

b): los nucleótidos +242 hasta + 1843 según SEQ ID NO:3;

c): los nucleótidos +221 hasta + 1843 según SEQ ID NO:5;

d): los nucleótidos +112 hasta +1710 según SEQ ID NO:7; o

e): los nucleótidos + 1 hasta + 1584 según SEQ ID NO:9

o secuencias parciales de a), de b), de c), de d) y de e), que codifican los motivos de secuencias de aminoácidos característicos, anteriormente citados, de los homólogos de la PARP según la invención.

Otro objeto de la invención comprende cajas de expresión, que contienen, bajo el control genético, secuencias de nucleótidos regulables de al menos una de las secuencias de nucleótidos según la invención, anteriormente descritas. Éstas pueden emplearse para la obtención de vectores recombinantes según la invención, tal como por ejemplo de vectores o plásmidos víricos; que contengan al menos una caja de expresión según la invención.

Los microorganismos recombinantes, según la invención, están transformados con, al menos, uno de los vectores anteriormente citados.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de detección in vitro para los inhibidores de la PARP, que puede llevarse a cabo de manera homogénea o heterogénea, caracterizado porque

a): se incuba una diana poli-ADP-ribosilable, no soportada o soportada, con una mezcla de reacción, que comprende

a1): un homólogo de la PARP según la invención;

a2): un activador de la PARP; y

a3): un inhibidor de la PARP o un analito, en el cual se suponga la presencia de, al menos, un inhibidor de la PARP;

b): se lleva a cabo la reacción de poli-ADP-ribosilación; y

c): se determina cualitativa o cuantitativamente la poli-ADP-ribosilación de la diana.

Preferentemente, se llevará a cabo el procedimiento de detección de tal manera que se lleva a cabo una incubación previa del homólogo de la PARP con el activador de la PARP y con el inhibidor de la PARP o con un analito, en le que se suponga la presencia de, al menos, un inhibidor de la PARP, por ejemplo durante aproximadamente 1 hasta 30 minutos, como paso previo a la realización de la reacción de la poli-ADP-ribosilación.

Tras la activación mediante DNS con roturas de las hebras monocatenarias (denominado según la invención como "DNS activado"), la PARP verifica la poli-ADP-ribosilación de una pluralidad de proteínas nucleares en presencia de NAD. A estas proteínas pertenecen, por un lado, la propia PARP, así como también histonas, etc.

La diana poli-ADP-ribosilable, empleada preferentemente en los procedimientos de detección, es una histona-proteína en su forma nativa o un equivalente poli-ADP-ribosilable, derivado de la misma. A modo de ejemplo se empleó una preparación de histona de la firma Sigma (SIGMA, catálogo Nr. H-7755; histona tipo II-AS procedente de Kalbsthymus, Luck, J. M., et al., J. Biol. Chem., 233, 1407 (1958), Satake K., et al., J. Biol. Chem, 235, 2801 (1960)). En principio pueden emplearse todos los tipos de proteínas o partes de las mismas, que puedan acceder a una poli-ADP-ribosilación por medio de la PARP. Éstas son preferentemente proteínas nucleares, por ejemplo histona, de DNA-polimerasa, telomerasa o PARP propiamente dicha. También pueden actuar como dianas los péptidos sintéticos, que se deriven de las proteínas correspondientes.

En el ELISA, según la invención, pueden emplearse cantidades de histona en el intervalo desde aproximadamente 0,1 \mug/pocillo hasta aproximadamente 100 \mug/pocillo, preferentemente desde aproximadamente 1 \mug/pocillo hasta aproximadamente 10 \mug/pocillo. Las cantidades de la PARP-enzima se encuentran en un intervalo desde aproximadamente 0,2 pmol/pocillo hasta aproximadamente 2 nmol/pocillo, preferentemente desde aproximadamente 2 pmol/pocillo hasta aproximadamente 200 pmol/pocillo, constituyendo la carga de la reacción respectivamente 100 \mul/pocillo. Son posibles reducciones a pocillos menores y a volúmenes de reacción correspondientemente más
pequeños.

En el ensayo HTRF, según la invención, se emplearán cantidades idénticas de la PARP, encontrándose la cantidad de histona o de histona modificada en el intervalo desde aproximadamente 2 ng/pocillo hasta aproximadamente 25 \mug/pocillo, preferentemente desde aproximadamente 25 ng/pocillo hasta aproximadamente 2,5 \mug/pocillo, constituyente la carga de la reacción respectivamente 50 \mul/pocillo. Son posibles reducciones a pocillos más pequeños y a volúmenes de reacción correspondientemente más pequeños.

El activador de la PARP, empleado según la invención es, preferentemente, el ADN activado.

Como activadores pueden actuar diversos tipos de ADN dañado. Los daños del ADN pueden conseguirse mediante digestión con DNasas o con otros enzimas DNA modificantes (por ejemplo endonucleasas de restricción), mediante irradiación u otros métodos físicos o tratamiento químico del ADN. Además es posible simular específicamente la situación de un deterioro del ADN mediante oligonucleótidos sintéticos. En los ensayos indicados a modo de ejemplo se utilizó ADN activado procedente del timo de ternera (SIGMA, producto Nr. D4522, CAS: 91080-16-9, fabricado según el método de Aposhian y Kornberg con empleo de ADN del timo de ternera (SIGMA D-1501) y desoxiribonucleasa tipo I (D-4263). Aposhian H. V. y Kornberg A., J. Biol. Chem., 237, 519 (1962)). Se empleó el ADN activado en un intervalo de concentraciones desde 0,1 hasta 1.000 \mug/ml, preferentemente desde 1 hasta 100 \mug/ml en la etapa de reacción.

La reacción de poli-ADP-ribosilación se inicia en un procedimiento según la invención mediante la adición de NAD^{+}. Las concentraciones de NAD se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 0,1 \muM hasta aproximadamente 10 mM, preferentemente en un intervalo desde aproximadamente 10 \muM hasta aproximadamente 1 mM.

Se determinará la poli-ADP-ribosilación de la diana soportada, según la variante realizable de manera heterogénea del procedimiento anterior, con anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa). Para ello se separa la mezcla de la reacción de la diana soportada, se lava y se incuba con el anticuerpo. Este anticuerpo puede estar marcado a su vez. Alternativamente se emplea un anticuerpo secundario marcado, o un fragmento de anticuerpo correspondientemente marcado para la detección del anticuerpo enlazado anti-poli-(ADP-ribosa). Las marcas adecuadas son, por ejemplo, marcas radiológicas, marcas cromóferas o marcas fluoróforas, biotinilización, marcas por quimiluminiscencia, marcas con metal paramagnético o, especialmente, marcas enzimáticas, como por ejemplo con peroxidasa de rábano picante. Las tecnologías de detección correspondientes son conocidas en general por el técnico en la materia.

Según la variante, que puede realizarse de manera homogénea, del procedimiento anterior, la diana no soportada está marcada con un aceptor-fluoróforo. En este caso se emplea como diana, preferentemente, la histona biotinilazada, acoplándose el aceptor-fluoróforo con el grupo de biotina de la histona a través la avidina o de la estreptavidina. Las ficobiliproteínas son especialmente adecuadas como aceptor-fluoróforo (por ejemplo ficocianina, ficoeritrina), por ejemplo R-ficocianina (R-PC), aloficocianina (APC), R-ficoeritrina (R-PE), C-ficocianina (C-PC), B-ficoeritrina (B-PE) o sus combinaciones entre sí o con colorantes fluorescentes, tales como Cy5, Cy7 o Texas Red (Tandem system) (Thammapalerd, N. et al., Southeast Asian Journal of Tropical Medicine & Public Health, 27(2): 297-303 (1996); Kronick, M. N. et al., Clinical Chemistry, 29(9), 1582-1586 (1986); Hicks, J. M., Human Pathology, 15(2), 112-116 (1984)). El colorante XL665, empleado en los ejemplos, está constituido por una aloficocianina reticulada (Glazer, A. N., Rev. Microbiol., 36, 173-198 (1982); Kronick, M. N., J. Imm. Meth., 92, 1-13 (1986); MacColl, R. et al., Phycobiliproteins, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1987); MacColl, R. et al., Arch. Biochem. Biophys., 208(1), 42-48 (1981)).

Además, es preferente, en el procedimiento homogéneo, llevar a cabo la determinación de la poli-ADP-ribosilación de la diana no soportada con un anticuerpo anti-poli-(ADP-ribosa), que esté marcada con un donador-fluoróforo, que sea capaz de transferir energía hasta el aceptor-fluoróforo cuando el donador y el aceptor estén próximos en el espacio mediante el enlace del anticuerpo marcado sobre la histona poli-ADP-ribosilada. Preferentemente se empleará un criptato de europio como donador-fluoróforo para los anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa).

Además del criptato de europio empleado pueden presentarse también otros compuestos como potenciales moléculas donadoras. En este caso puede modificarse, por un lado, la celdilla de criptato. También puede imaginarse la substitución del europio por otro metal de las tierras raras, tal como por ejemplo terbio. Lo decisivo es una duración de vida larga de la fluorescencia, que garantice el retraso temporal (Lopez, E. et al., Clin. Chem. 39/2, 196-201 (1993); US-Patent 5,534,622).

Los procedimientos de detección, precedentemente descritos, están basados en el principio de que la actividad de la PARP está en proporción con la cantidad de los polímeros de ADP-ribosa formados sobre las histonas. El ensayo, descrito en este caso, posibilita la cuantificación de los polímeros de ADP-ribosa por medio de anticuerpos específicos en forma de un ensayo ELISA y de un ensayo HTRF (homogenous time-resolved fluorescence; fluorescencia homogénea desprendida en el tiempo). Las formas concretas de realización de estos dos ensayos han sido descritas con mayor detalle en los ejemplos de realización siguientes.

El sistema de ensayo desarrollado HTRF (Homogenous Time-Resolved Fluorescence) mide la formación de poli-(ADP-ribosa) sobre las histonas mediante cuerpos específicos. A diferencia de ELISA, este ensayo se llevará a cabo en fase homogénea sin etapa de separación ni de lavado. Esto posibilita un elevado caudal de muestras y una reducida susceptibilidad a los errores. El HTRF está basado en la "transferencia de energía de resonancia por fluorescencia -Fluoresenz Resonanz Energie Transfer-" (FRET) entre dos fluoróforos. En un ensayo FRET, un donador-fluoróforo excitado puede transferir su energía hasta un aceptor-fluoróforo cuando se encuentren ambos próximos en el espacio. En la tecnología HTRF, el donador-fluoróforo es un criptato de europio [(Eu)K] y el aceptor es XL665, una aloficocianina estabilizada. El criptato de europio está basado en los trabajos de Jean Marie Lehn (Strasbourg) (Lopez, E. et al., Clin. Chem. 39/2, 196-201 (1993); US-Patent 5,534,622).

En un ensayo homogéneo están presentes todos los componentes incluso durante la medición. Mientras que esto supone ventajas para la realización del ensayo (celeridad, coste), deben excluirse perturbaciones debidas a los componentes del ensayo (fluorescencia propia, extinción debida a los colorantes, etc.). El HTRF excluye estas perturbaciones por medio de una medición retardada en el tiempo con dos longitudes de onda (665 nm, 620 nm). El HTRF tiene un tiempo de atenuación muy largo y por lo tanto puede medirse con retardo temporal. En este caso ya no es perjudicial cualquier fluorescencia de fondo de vida corta, de interferencia (por ejemplo debido a los componentes del ensayo o a inhibidores del banco de substancias). Además se mide permanentemente con dos longitudes de onda, para compensar el "efecto de extinción". Los ensayos HTRF pueden realizarse por ejemplo en formato de placas de microtitulación con 96 o con 384 pocillos y se evalúan en un dispositivo "Discovery HTRF Microplate Analyzer" (Canberra Packard).

Según la invención se prepararán además los siguientes procedimientos de cribado in vitro de los componentes de enlace para PARP, especialmente para un homólogo de la PARP según la invención.

Una primera variante se lleva a cabo de tal manera que

a1): se inmoviliza, al menos, un homólogo de la PARP sobre un soporte;

b1): se pone en contacto el homólogo inmovilizado de la PARP con un analito, en el cual se suponga la presencia de, al menos, un componente de enlace; y

c1): se determina, en caso dado al cabo de una fase de incubación, el componente del analito enlazado sobre el homólogo de la PARP, inmovilizada.

Según una segunda variante

a2): se inmoviliza sobre un soporte un analito, que contiene, al menos, un posible componente de enlace para el homólogo de la PARP;

b2): el analito inmovilizado se pone en contacto, al menos, con un homólogo de la PARP, para el cual se busca un componente de enlace; y

c3): el analito inmovilizado se analiza con relación al enlace con el homólogo de la PARP, en caso dado después de una fase de incubación.

El objeto de la invención está constituido también por un procedimiento para la determinación cualitativa o cuantitativa de un ácido nucleico que codifique homólogos de la PARP, caracterizado porque comprende

a): la incubación de una muestra biológica con una cantidad definida de un ácido nucleico exógeno, según la invención (por ejemplo con una longitud de aproximadamente 20 hasta 500 bases o con una longitud mayor), hibridación, preferentemente bajo condiciones estrictas, determinación de los ácidos nucleicos hibridizantes y, en caso dado, comparación con un patrón; o

b): la incubación de una muestra biológica con una cantidad definida de pares de cebadores de oligonucleótidos, que tienen especificidad para los ácidos nucleicos que codifiquen un homólogo de la PARP, amplificaicón del ácido nucleico, determinación del producto de la amplificación y, en caso dado, comparación con un patrón.

Otro objeto de la invención está constituido por un procedimiento para la determinación cualitativa o cuantitativa de un homólogo de la PARP según la invención, caracterizado porque comprende

a): la incubación de una muestra biológica con, al menos, un componente de enlace específico para un homólogo de la PARP,

b): detección del complejo componente de enlace/PARP y en caso dado

c): comparación del resultado con un patrón.

Preferentemente el componente de enlace en este caso es un anticuerpo anti-PARP o un fragmento enlazante del mismo, que en caso dado porte una marca detectable.

El procedimiento de determinación según la invención para la PARP, especialmente para los homólogos de la PARP y para las secuencias codificantes de los ácidos nucleicos de los mismos son adecuados ventajosamente para diagnosticar daños tisulares provocados por la sepsis o por la isquemia, especialmente de apoplejías, infartos de miocardio, diabetes o choques sépticos.

Además, la invención comprende un procedimiento para la determinación de la actividad de los efectores de la PARP, caracterizado porque comprende

a): la incubación de un homólogo de la PARP según la invención con un analito, que contiene un efector de una actividad de la PARP fisiológica o patológica; en caso dado el efector se separa de nuevo; y

b): la determinación de la actividad del homologo de la PARP, en caso dado tras adición de substratos o de cosubstratos.

Otro objeto de la invención se refiere a agentes para la terapia genética, que contienen un constructo de ácidos nucleicos en un soporte aceptable en terapia genética, que comprende

a): un ácido nucleico antisentido contra un ácido nucleico codificante según la invención; o

b): que contiene un robozima contra un ácido nucleico no codificante, según la invención; o

c): que codifica un inhibidor de la PARP específico.

Además, la invención se refiere a agentes farmacéuticos, que contienen en un soporte, farmacéuticamente aceptable, una proteína PARP según la invención, al menos un componente de enlace de la PARP según la invención o al menos una secuencia de nucleótido codificante según la invención.

\newpage

Finalmente la invención se refiere al empleo de los componentes de enlace de un homólogo de la PARP para el diagnóstico o para la terapia de estados patológicos, en cuya aparición y/o en cuyo transcurso participe al menos una proteína de la PARP, especialmente un homólogo de la PARP según la invención o un polipéptido derivado del mismo. El componente de enlace empleado puede ser, por ejemplo, un componente de enlace de bajo peso molecular, cuyo peso molecular puede ser, por ejemplo, menor que aproximadamente 2.000 Daltons o menor que aproximadamente 1.000 Daltons.

El objeto de la invención está constituido, además, por el empleo de los componentes de enlace de la PARP para el diagnóstico o para la terapia de estados patológicos, que sean inducidos por una deficiencia energética. Una deficiencia energética en el sentido de la presente invención es, especialmente, una deficiencia energética celular, que puede observarse en los pacientes enfermos de manera sistémica o en partes individuales del cuerpo, órganos o partes de órganos, o tejidos o partes de tejidos. Esto se caracteriza por un agotamiento de NAD y/o de ATP hacia arriba o hacia abajo por encima del intervalo de oscilación fisiológico del nivel de NAD y/o de ATP, que se induce, preferentemente, por medio de una proteína con actividad PARP, especialmente un homólogo de la PARP según la invención, o un polipéptido derivado del mismo.

Las "enfermedades inducidas por deficiencia energética" en el sentido de la invención comprenden, además, aquellas en las que un deterioro celular debe considerarse basado en la muerte celular como consecuencia de necrosis o de apoptosis. Los métodos según la invención son adecuados para el tratamiento y la profilaxis de deteriores tisulares como consecuencia de un deterioro celular debido a apoptosis o a necrosis; los deterioros de los tejidos nerviosos debidos a las isquemias y/o a la reperfusión; las enfermedades neurológicas; las enfermedades neurodegenerativas; la apoplejía vascular; para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades cardiovasculares; para el tratamiento de otras enfermedades o estados, tales como, por ejemplo, la degeneración macular debida a la edad, el SIDA u otras enfermedades inmunodepresoras; la artritis; la arterosclerosis; la caquexia; el cáncer; las enfermedades degenerativas de la musculatura del esqueleto; la diabetes; los traumas craneales; las enfermedades inflamatorias del estómago/tracto intestinal, tales como por ejemplo la enfermedad de Crohn; la distrofia muscular; la osteoartritis; la osteoporosis; los dolores crónicos y/o agudos; el fracaso renal; la isquemia de retina; el choque séptico (tal como por ejemplo el choque de endotoxina); el envejecimiento de la piel o el envejecimiento general; las apariciones generales de envejecimiento. Los métodos según la invención pueden emplearse, además, para la prolongación del tiempo de vida y de la capacidad de proliferación de las células corporales y para la sensibilización de células tumorales en el caso de la terapia por irradiación.

El objeto de la invención consiste, especialmente, en el empleo de un componente de enlace de la PARP según la definición anteriormente indicada para el diagnóstico o la terapia (aguda o profiláctica) de estados patológicos inducidos por la deficiencia energética, elegidos entre las enfermedades neurodegenerativas, o lo deterioros de los tejidos debidos a la sepsis o a la isquemia, especialmente a los trastornos neurotóxicos, apoplejías, infartos de miocardio, deterioros durante o después de la infartólisis (por ejemplo con TPA, reteplasa o mecánicamente con láser o con rotoextirpador) y de microinfartos durante y después de la substitución de válvulas cardiacas, resecciones de aneurismas y transplantes de corazón, traumas craneales y de la médula espinal, infartos de los riñones (fracaso renal agudo, insuficiencia renal aguda o deteriores durante y después de transplantes renales), infartos hepáticos (fracaso hepático, daños durante o después de un transplante hepático), daños de la musculatura del esqueleto, neuropatías periféricas, la demencia provocada por el SIDA, choques sépticos, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, que se presentan después de isquemia, traumas (traumas cráneo-cerebrales), hemorragia masiva, hemorragias subaracnoideas y apoplejía, así como enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer, demencia por infarto múltiple, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, especialmente de ataques epilépticos generalizados, tales como por ejemplo el Petit mal (epilepsia menor), y ataques tónico-crónicos y ataques epilépticos parciales, tales como Temporal Lobe, y ataques complejo-parciales, fracaso renal, además en la quimioterapia de tumores y evitación de la formación de metástasis así como para el tratamiento de inflamaciones y de enfermedades reumáticas, por ejemplo de la artritis reumática; además en el tratamiento de una revascularización de coronarias críticamente estrechadas y de arterias periféricas críticamente estrechadas, por ejemplo en arterias de las piernas.

En el sentido de la invención la expresión "isquemia" comprende una disminución del aporte localizado de oxígeno a un tejido, provocado por el bloqueo del flujo sanguíneo arterial. Se presenta una isquemia global cuando el flujo sanguíneo queda interrumpido en todo el cerebro durante un tiempo limitado. Esto puede estar condicionado, por ejemplo, por la parada cardiaca. La isquemia focal se presenta cuando una parte del cerebro queda separada de su aporte sanguíneo normal. La isquemia focal puede estar provocada por una obstrucción tromboembólica de un bazo sanguíneo, mediante un trauma cerebral, un edema o un tumor cerebral. Incluso las isquemias pasajeras pueden conducir a deterioros neuronales amplios. Aún cuando los deterioros en los "tejidos nerviosos" puedan presentarse días o semanas desde el inicio de la isquemia, se presentan algunos daños permanentes (por ejemplo muerte celular por necrosis) en los primeros minutos tras la interrupción del flujo sanguíneo. Estos daños están condicionados, por ejemplo, por la neurotoxicidad del glutamato y se producen después de una reperfusión secundaria, tal como por ejemplo liberación de radicales (por ejemplo radicales de oxígeno, radicales NO). Las isquemias pueden presentarse igualmente en otros órganos y tejidos tal como por ejemplo en el corazón (infarto de miocardio y otras enfermedades cardiovasculares provocadas por la obstrucción de las arterias coronarias) o en el ojo (isquemia de la retina).

El objeto de la invención está constituido, además, por el empleo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un componente de enlace de la PARP para influenciar la actividad neuronal. En el sentido de la invención "actividad neuronal" puede consistir en una estimulación de las neuronas dañadas, en el favorecimiento de la regeneración neuronal o en el tratamiento de estados patológicos neuronales.

En el sentido de la invención la expresión "daños neuronales" comprende cualquier tipo de deterioro del "tejido nervioso" y cualquier detrimento corporal o intelectual o muerte como consecuencia de este deterioro. El origen del deterioro puede ser, por ejemplo, de tipo metabólico, tóxico, químico, térmico y comprende las isquemias, las hipoxias, los traumas, los daños cerebrovasculares, las operaciones, la presión, las hemorragias, las irradiaciones, los espasmos vasculares, las enfermedades neurodegenerativas, las infecciones, la epilepsia, los trastornos de la percepción, los trastornos en el metabolismo de glutamato y los efectos secundarios provocados por los mismos.

En el sentido de la invención, la expresión "tejido nervioso" comprende los diversos componentes que forman el sistema nervioso, elegidos entre otros entre las neuronas, las células Glia, los astrocitos, las células de Schwann, el sistema vascular interno y de alimentación, el sistema nervioso central, el cerebro, el tronco encefálico, la médula espinal, el sistema nervioso periférico, etc.

En el sentido de la invención la expresión "neuroprotector" comprende la reducción, la detención, la ralentización o la mejora de daños neuronales y la protección, la reanimación, la regeneración del tejido nervioso, que ha estado sometido a un deterioro neuronal.

Una "prevención de las enfermedades neurodegenerativas" comprende la posibilidad de impedir, ralentizar y mejorar las enfermedades neurodegenerativas en personas en las cuales haya sido diagnosticada tal enfermedad o que pertenezcan al grupo de riesgo correspondiente para estas enfermedades neurodegenerativas. Del mismo modo quiere indicarse el tratamiento de personas que padezcan ya de síntomas de estas enfermedades.

En el sentido de la invención la expresión "tratamiento" comprende

(i): la evitación de una enfermedad, de un trastorno o de un estado en personas con una predisposición a los mismos;

(ii): la evitación de una enfermedad, de un trastorno o de un estado mediante la ralentización de su avance; y

(iii): la mejoría de una enfermedad, de un trastorno o de un estado.

Ejemplos de "enfermedades neurológicas", que pueden ser tratadas mediante los métodos según la invención, son neuralgias (tigeminal, glosofaríngea), Myasthenia gravis, distrofias musculares, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular progresiva, neuropatías periféricas provocadas por envenenamiento (por ejemplo envenenamiento con plomo), síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, o enfermedades del plexo. Los métodos según la invención están adecuados preferentemente para el tratamiento de enfermedades neurológicas, elegidas entre las neuropatías periféricas, provocadas por lesiones o enfermedades físicas; traumas craneales, tales como por ejemplo el trauma cerebral traumático; el deterioro físico de la médula espinal; apoplejía acompañada por deterioro cerebral, tal como apoplejía vascular en combinación con hipoxia y deterioro cerebral, y deterioros cerebrales por reperfusión; enfermedades desmielinizantes (mielopatías, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica).

Los métodos según la invención pueden emplearse, además, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En el sentido de la invención la expresión "enfermedades cardiovasculares" comprende aquellas que provocan isquemias o que están provocadas por isquemias o isquemia/reperfusión del corazón. Son ejemplos las enfermedades de los bazos coronarios (por ejemplo la arterosclerosis), la Angina pectoris, el infarto de miocardio, los daños cardiovasculares provocados por la parada cardiaca o por la operación de bypass.

Los métodos según la invención pueden emplearse para el tratamiento del cáncer o para la sensibilización de las células cancerosas durante la terapia por irradiación. La expresión "cáncer" debe entenderse en el sentido más amplio de la palabra. Los moduladores o las proteínas según la invención pueden emplearse como " productos terapéuticos anticáncer". A modo de ejemplo, los métodos pueden emplearse para el tratamiento de tipos de cáncer o células tumorales, tales como tumores productores de ACTH, leucemias linfáticas o linfoblásticas agudas; leucemias linfocíticas agudas o crónicas; leucemias no linfocíticas agudas; cáncer de vejiga, tumores cerebrales; cáncer de mama; carcinoma cervical; leucemia mielocítica crónica; cáncer de colon; linfoma de las zonas T; endometriosis, cáncer de esófago; cáncer de la vejiga biliar; sarcoma de Swing; cáncer de cabeza y de la nuca; cáncer de lengua; linfoma de Hodgkin; sarcoma de Kaposi; cáncer renal; cáncer hepático; cáncer pulmonar, mesotelioma; mieloma múltiple; neuroblastoma; linfoma de non-Hodgkin; osteosarcoma; carcinoma de los ovarios; gliablastoma; carcinoma de mama; carcinoma cervical; cáncer de próstata; cáncer de páncreas; cáncer del pene; retinoblastoma; cáncer cutáneo; cáncer del estómago; cáncer de tiroides; carcinoma de útero; carcinoma vaginal; tumor de Wilm; o trofoblastoma.

En el sentido de la invención las expresiones "radiosensibilizador" o "sensibilizadores a la irradiación" se refieren a las moléculas, que aumentan en el organismo la sensibilidad de las células frente a una irradiación con rayos electromagnéticos (por ejemplo irradiación de rayos X) o que aceleran este tratamiento mediante irradiación. Los sensibilizadores a la irradiación aumentan la sensibilidad de las células tumorales contra los efectos tóxicos de la irradiación electromagnética. En la literatura se conocen, entre otros, la mitomicina C, la 5-bromodeoxiuridina y el metronidazol. Pueden emplearse irradiaciones con longitudes de onda en el intervalo desde 10^{-20} hasta 10 metros, preferentemente la irradiación gama (10^{-20} hasta 10^{-13} m), la irradiación de rayos X (10^{-11} hasta 10^{-9} m), la irradiación ultravioleta (10 nm hasta 400 nm), la luz visible (400 nm hasta 700 nm), la irradiación infrarroja (700 nm hasta 1 mm) y la irradiación de microondas (1 mm hasta 30 cm).

Las enfermedades que pueden ser tratadas con una terapia de este tipo son, ante todo, enfermedades neoplásticas, tumores benignos o malignos y cáncer. Del mismo modo es posible el tratamiento de otras enfermedades con empleo de irradiación electromagnética.

La presente invención se describirá ahora con mayor detalle haciendo referencia a las figuras adjuntas. En éstas:

la figura 1 muestra un alineamiento de la secuencia de la PARP humana (humanPARP1) y dos PARPs preferentes según la invención (humanPARP2, humanPARP3, murinPARP3). Las coincidencias de secuencia entre humanPARP1 y humanPARP2, humanPARP3 o bien murinPARP3 se han representado recuadradas. La secuencia mayoritaria se ha indicado por encima de la alineación. Los motivos de dedo de estaño de la humanPARP1 se encuentran en los segmentos de la secuencia que corresponden a los aminoácidos 21 hasta 56 y 125 hasta 162;

la figura 2 muestra las transferencias Northern (Northern Blots) con diversos tejidos humanos para poner de manifiesto la distribución tisular de las moléculas de la PARP2 y de la PARP3 según la invención; cinta 1: cerebro, cinta 2: corazón; cinta 3: músculo del esqueleto; cinta 4: intestino grueso; cinta 5: timo; cinta 6: bazo; cita 7: riñones; cinta 8: hígado; cinta 9: intestino delgado; cinta 10: placenta; cinta 11: pulmón; cinta 12: leucocitos sanguíneos periféricos; se ha dado la posición correspondiente del patrón dimensional (kb).

la figura 3 muestra una transferencia Northern con otros tejidos humanos diferentes para poner de manifiesto la distribución del tejido de la molécula de la PARP3 según la invención; cinta 1: corazón; cinta 2: cerebro; cinta 3: placenta; cinta 4: pulmón; cinta 5: hígado; cinta 6: músculo del esqueleto; cinta 7: riñones; cinta 8: páncreas; se ha dado la posición correspondiente del patrón dimensional (kb).

la figura 4 muestra una transferencia Western (Western Blot) con diversos tejidos humanos para poner de manifiesto la distribución del tejido de la molécula de la PARP3 según la invención a nivel de proteína; cinta 1: corazón; cinta 2: pulmón; cinta 3: hígado; cinta 4: bazo; cinta 5: riñones cinta 6: intestino grueso; cinta 7: músculo; cinta 8: cerebro; se ha indicado la posición correspondiente del patrón dimensional (kD).

la figura 5 muestra una transferencia Western (Western Blot) con tejidos humanos diferentes para poner de manifiesto la distribución del tejido de la molécula de la PARP3 según la invención; cinta 1: cortex frontal; cinta 2: cortex posterior; cinta 3: cerebelo; cinta 4: hipocampo; cinta 5: bulbo olfatorio; cinta 6: estriato; cinta 7: tálamo; cinta 8: mesencéfalo; cinta 9: cortex entorrinal; cinta 10: puentes; cinta 11: médula; cinta 12: médula espinal.

la figura 6 muestra una representación esquemática del ensayo PARP (ELISA)

la figura 7 muestra una representación esquemática del ensayo PARP (HTRF)

Otras formas preferentes de realización de la invención han sido descritas en los párrafos siguientes.

Homólogos de la PARP y equivalentes funcionales

En tanto en cuanto no se den otras indicaciones, se indicarán en el ámbito de la presente descripción las secuencias de aminoácidos comenzando por el N-término. Cuando se utilice el código de una letra para los aminoácidos, G significará glicina, A significará alanina, V significará valina, L significará leucina, I significará isoleucina, S significará serina, T significará treonina, D significará ácido asparagínico, N significará asparagina, E significará ácido glutamínico, Q significará glutamina, W significará triptofano, H significará histidina, R significará arginina, P significará prolina, K significará lisina, Y significará tirosina, F significará fenilalanina, C significará cisteína y M significará metionina.

La presente invención no está limitada a los homólogos de la PARP descritos de manera concreta anteriormente. Por el contrario quedan comprendidos, también, aquellos homólogos que representen equivalentes funcionales de los mismos. Los equivalentes funcionales comprenden tanto las variantes naturales, tales como por ejemplo las específicas de la especie o las específicas de los órganos, así como también las variantes generadas artificialmente de las proteínas descritas aquí de manera concreta. Los equivalentes funcionales, según la invención, se diferencian por la adición, la substitución, la inversión, la inserción y/o la eliminación de uno o varios restos de aminoácidos de la humanPARP2 (SEQ ID NO:2), humanPARP3 (SEQ ID NO: 4 y 6) y mausPARP3 (SEQ ID NO: 8 y 10), manteniéndose al menos la función de enlace de NAD de la proteína, inducida por un dominio C-terminal catalítico, funcional. Del mismo modo debería mantenerse preferentemente la actividad catalítica generada por la poli(ADP-ribosa). Los equivalentes funcionales comprenden en caso dado también aquellas variantes en las que la región similar a la cremallera de leucina se conserva de manera esencial.

En este caso pueden reemplazarse, por ejemplo, a partir de la secuencia para humanPARP2 o humanPARP3, determinados aminoácidos por aquellos con propiedades fisicoquímicas similares (relleno del espacio, basicidad, hidrofobicidad, etc.). A modo de ejemplo pueden intercambiarse restos de arginina por restos de lisina, restos de valina por restos de isoleucina o restos de ácido asparagínico por restos de ácido glutamínico. No obstante pueden cambiarse también uno o varios aminoácidos con respecto a su orden, pueden introducirse o pueden eliminarse, o pueden combinarse entre sí varias de estas medidas. Las proteínas modificadas de este modo frente a la secuencia humanPARP2 o humanPARP3 tienen, al menos, un 60%, preferentemente al menos un 75%, de forma muy especialmente preferente al menos un 85% de homología con respecto a la secuencia de partida, calculado según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.

Las siguientes homologías se determinaron en el plano de los aminoácidos o bien en el plano del ADN entre las humanPARP1, 2 y 3 (programa FastA, Pearson y Lipman, véase más arriba):

\vskip1.000000\baselineskip

Homología de los aminoácidos

1

Las cifras entre paréntesis indican el número de los aminoácidos solapantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Homología de ADN

3

Las cifras entre paréntesis indican el número de los nucleótidos solapantes.

Los polipéptidos según la invención pueden clasificarse, debido a su elevada similitud en la zona de los dominios catalíticos como homólogos de las poli(ADP-ribosa)polimerasas.

Es esencial además para la invención que los nuevos homólogos de la PARP no presenten motivos tradicionales de dedos de cinc. Esto significa que estos enzimas no intervienen en la reparación del ADN o que intervienen de una manera diferente a la de la PARP1, pero que pueden ejercer todavía su mecanismo patológico (consumo de NAD^{+} y, por lo tanto, consume energético debido al consumo de ATP). Esta potente expresión de las proteínas, ante todo de la PARP3, que se observa en el Western-Blot, permite suponer un papel significativo en el consume de NAD. Esto tiene un significado especial para el desarrollo de productos activos. Los nuevos inhibidores, potenciales, contra las polimerasas según la invención pueden inhibir por lo tanto las funciones patológicas, sin tener efectos negativos sobre las propiedades fisiológicas deseadas. Hasta el presente esto no era posible con inhibidores de las PARPs conocidas hasta ahora, puesto que se inhibía simultáneamente siempre al mismo tiempo la función reparadora del ADN. El efecto mutágeno potencial de los inhibidores conocidos de la PARP puede entenderse por lo tanto fácilmente. Además puede imaginarse configurar a los inhibidores de la PARP de tal manera que inhiban de manera efectiva todos los homólogos de la PARP con elevada afinidad. En este caso puede imaginarse en caso dado un efecto potenciado.

El homólogo preferente de la PARP, según la invención, según la SEQ ID NO:2 (human PARP2) puede aislarse ventajosamente a partir del cerebro, del corazón, del músculo del esqueleto, de los riñones y del hígado, humanos. La humanPARP2 se expresa de una manera claramente más débil en otros tejidos u órganos.

El homólogo preferente de la PARP, según la invención, según SEQ ID NO: 4 y 6 (humanPARP3) puede aislarse ventajosamente a partir del cerebro (en este caso preferentemente a partir del hipocampo), del corazón, del músculo del esqueleto, del hígado o de los riñones humanos. La humanPARP3 se expresa de una manera claramente más débil en otros tejidos u órganos, tales como músculo o hígado.

El técnico en la materia familiarizado con el aislamiento de las proteínas utilizará, para la obtención de las PARPs naturales, según la invención a partir de tejidos o las PARPs preparadas de manera recombinante, según la invención a partir de cultivos celulares, la combinación más adecuada en cada caso de medidas para los procedimientos preparativos. Los métodos patrón preparativos adecuados están descritos por ejemplo en las publicaciones de Cooper, T.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, New York o en la publicación de Scopes, R. Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.

El objeto de la invención está constituido, además, por homólogos de la PARP2 y de la PARP3, que ciertamente pueden ser aislados a partir de otras especies eucariotas, es decir los evertebrados (invertebrados) o los vertebrados, especialmente otros mamíferos, tales como el ratón, la rata, el gato, el perro, el cerdo, el cordero, la ternera, el caballo o el mono o a partir de otros órganos, tales como por ejemplo el miocardio, pero que tienen las propiedades esenciales estructurales y funcionales predeterminadas de las PARPs según la invención.

Especialmente la humanPARP2, que puede aislarse a partir del cerebro humano, y su equivalente funcional son agentes preferentes para el desarrollo de inhibidores contra las enfermedades neurodegenerativas, tales como por ejemplo la apoplejía. Puede suponerse concretamente que el desarrollo de los productos activos, basados en la PARP2 como indicador, posibilita el desarrollo de inhibidores, que estén optimizados para la aplicación en el cerebro humano. Sin embargo no puede excluirse que los inhibidores, desarrollados a base de la PARP2, puedan emplearse también para la terapia de los estados patológicos inducidos por la PARP de otros órganos (véase la distribución en el tejido de las proteínas según la invención).

De manera similar a lo que ocurre en el caso de la PARP1, se activarán también la PARP2 y, probablemente, la PARP3 mediante el ADN dañado, aún cuando esto se haga probablemente por medio de otro mecanismo. Puede imaginarse una significación en la reparación del ADN. El bloqueo de las PARPs según la invención sería útil también en indicaciones tales como el cáncer (por ejemplo en la radiosensibilización de los pacientes con tumores).

Otra propiedad biológica esencial de las PARPs, según la invención, y sus equivalentes funcionales debe considerarse en su capacidad para enlazar un componente de interacción. A diferencia de lo que ocurre con las PARPs conocidas hasta ahora, procedentes de eucariotas superiores, tales como especialmente los mamíferos, las humanPARP2 y 3 disponen de motivos potenciales denominados de cremallera de leucina. Este es un motivo típico para las interacciones entre proteína-proteína. Estos motivos permiten posiblemente una modulación de la actividad de la PARP mediante un componente de interacción. De este modo este elemento estructural adicional proporciona también un posible punto de partida para el desarrollo de efectores de la PARP, tales como por ejemplo inhibidores.

Otro objeto de la invención está constituido, por lo tanto, por proteínas, que interaccionan con la PARP2 y/o 3, preferentemente aquellas que provocan su activación o inactivación.

Otro objeto de la invención está constituido por proteínas que presentan todavía la actividad enlazante de los ligandos anteriormente citada y que pueden prepararse, a partir de las secuencias concretas de aminoácidos divulgadas, mediante modificaciones específicas.

A partir de la secuencia de péptidos de las proteínas según la invención pueden generarse péptidos sintéticos, que se empelan individualmente o en combinación como antígenos para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales. También es posible emplear la proteína PARP o trozos de la misma para la generación de anticuerpos. El objeto de la invención está constituido, por lo tanto, también por fragmentos de péptidos de proteínas PARP, según la invención, que presenten secuencias parciales características, especialmente aquellos oligopéptidos o polipéptidos, que abarquen al menos uno de los motivos de secuencia anteriormente citados. Tales fragmentos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante digestión proteolítica de las proteínas PARP o mediante vía química por síntesis de péptidos.

Nuevos componentes de enlace PARP2 y PARP3

Mediante el empleo de los sistemas de ensayo específicos, anteriormente descritos, para componentes de enlace de la PARP2 y de la PARP3 se desarrollaron inhibidores activos y, preferentemente, selectivos contra las proteínas según la invención. Estos inhibidores son activos en caso dado también contra la PARP1.

Los inhibidores, preparados según la invención, tienen frente a la PARP2 una actividad inhibidora fuertemente marcada. Los valores K_{i} pueden ser en este caso menores que aproximadamente 1.000 nM, tal como por ejemplo menor que aproximadamente 700 nM, menor que aproximadamente 200 nM o menor que aproximadamente 30 nM, tal como por ejemplo aproximadamente desde 1 hasta 20 nM.

Los inhibidores, preparados según la invención, pueden tener además una selectividad sorprendente para la PARP2. La relación K_{i}(PARP1): K_{i}(PARP2) para tales inhibidores, según la invención, es por ejemplo mayor que 3 o mayor que 5, tal como por ejemplo mayor que 10 o mayor que 20.

A modo de ejemplo puede citarse la 4-(N-(4-hidroxifenil)aminometil)-(2H)-dihidroftalazin-1-ona. La obtención de este compuesto y de compuestos análogos se lleva a cabo de acuerdo con las indicaciones dadas en la publicación de Puodzhyunas et al., Pharm. Chem. J., 1973, 7, 566 y siguientes, o de Mazkanowa et al., Zh. Obshch. Khim., 1958, 28, 2798 y siguientes, o de Mohamed et al., Ind. J. Chem. B. 1994, 33, 769 y siguientes, a las que se hace aquí referencia expresa.

El compuesto anteriormente citado tiene, frente a la PARP2, un valor K_{i} de 113 nM y tiene una actividad frente a la PARP2 aproximadamente 8 veces más selectiva que frente a la PARP1.

Ácidos nucleicos que codifican homólogos de la PARP

Cuando no se diga otra cosa, se producirá en el ámbito de la presente descripción, la indicación de las secuencias de los nucleótidos en el sentido 5' hacia 3'.

Otro objeto de la invención está constituido por secuencias de ácidos nucleicos, que codifican las proteínas anteriormente citadas, especialmente que codifican aquellas secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, sin que quede limitada a las mismas. Las secuencias de ácidos nucleicos, necesarias según la invención, comprenden también variantes alelofórmicas, que, tal como se ha descrito anteriormente para las secuencias de los aminoácidos, pueden obtenerse mediante eliminación, inversión, inserción, adición y/o substitución de nucleótidos, preferentemente de nucleótidos según las SEQ ID NO: 1, 3, 7 y 9, conservándose sin embargo esencialmente las propiedades biológicas o bien la actividad biológica del producto génico correspondiente. Las secuencias de nucleótidos utilizables se obtienen, por ejemplo, mediante substituciones de nucleótidos, que provocan modificaciones de aminoácidos silenciosos (sin modificación de la secuencia de los aminoácidos) o modificaciones de los aminoácidos conservadoras (intercambio de aminoácidos del mismo tamaño, carga, polaridad o solubilidad).

Además, las secuencias de los ácidos nucleicos, según la invención, comprenden también equivalentes funcionales de los genes, tales como los homólogos eucarióticos por ejemplo procedentes de evertebrados, tales como Caenorhabditis o Drosophila, o vertebrados, preferentemente de los mamíferos descritos anteriormente. Son preferentes los genes procedentes de vertebrados, que codifiquen un producto genético que tenga las propiedades esenciales según la invención, anteriormente descritas.

Los ácidos nucleicos según la invención pueden obtenerse de manera tradicional por diversas vías

A modo de ejemplo puede revisarse una biblioteca génica o una biblioteca cADN con relación al ADN, que codifique una molécula de la PARP o una parte de la misma. A modo de ejemplo puede revisarse una biblioteca de cADN, obtenida a partir de cerebro, de corazón o de riñones humanos, con una sonda adecuada, tal como por ejemplo con un fragmento marcado de ADN de hebra monocatenaria, que corresponda a una secuencia parcial, elegida entre las SEQ ID NO: 1 o 3, de longitud adecuada o a una secuencia complementaria con la anterior. Para ello pueden distribuirse en pocillos los fragmentos de ADN de la biblioteca, transformados en un vector de clonación adecuado, después de la transformación en un bacterium, sobre placas de agar. Los clones pueden transferirse a continuación sobre filtros de nitrocelulosa y pueden hibridizarse con la sonda marcada tras la desnaturalización del ADN. Los clones positivos se aíslan a continuación y se caracterizan.

El ADN que codifica los homólogos de la PARP o fragmentos parciales, según la invención, puede sintetizarse también químicamente a partir de las informaciones secuenciales contenidas en la presente solicitud. A modo de ejemplo pueden sintetizarse para ello oligonucleótidos con una longitud de aproximadamente 100 bases, en forma en sí conocida y ligarse secuencialmente, habiéndose previsto, por ejemplo, puntos de corte por restricción terminales adecuados.

Las secuencias de nucleótidos, según la invención, pueden prepararse también con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello se somete a hibridación a un ADN diana, tal como por ejemplo ADN procedente de un clon adecuado de longitud completa, Full-Length-Klon, con un par de cebadores de oligonucleótidos con una longitud aproximada de 15 bases, que se enlazan en los extremos opuestos del ADN diana. A continuación se completa el segmento secuencial, situado entre medias, con ADN-polimerasa. La repetición múltiple de este ciclo permite una amplificación del ADN diana (véase la publicación de White et al.(1989), Trends Genet. 5, 185).

Además deben entenderse bajo las secuencias de los ácidos nucleicos, según la invención, también secuencias acortadas ADN de hebra monocatenaria o ARN de las secuencias de ADN complementarias, codificantes y no codificantes, secuencias de mRNA y cADNs derivados de las mismas.

La invención comprende, además, las secuencias de nucleótidos hibridizadas con las secuencias anteriores bajo condiciones estrictas. Las condiciones estrictas de hibridación en el sentido de la presente invención están dadas cuando las secuencias hibridizantes presenten una homología de aproximadamente el 70 hasta el 100%, tal como por ejemplo desde el 80 hasta el 100% o desde el 90 hasta el 100% (preferentemente en un segmento de aminoácidos con al menos aproximadamente 40, tal como por ejemplo aproximadamente 50, 100, 150, 200, 400 o 500
aminoácidos).

Las condiciones estrictas para la selección del ADN, especialmente de los bancos de cADN, se da por ejemplo cuando crezca la carga de hibridación a una temperatura de aproximadamente 60ºC con 0,1X SSC-tampón (20X SSC-tampón = 3M NaCl, 0,3M citrato de sodio, pH 7,0) y 0,1% de SDS.

Los análisis Northern-Blot se cultivan bajo condiciones estrictas, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 65ºC con 0,1X SSC, 0,1% de SDS.

Derivados de los ácidos nucleicos y construcciones de expresión

Se entenderán por secuencias de ácidos nucleicos también derivados, tales como por ejemplo las variantes del promotor o las variantes alternativas de corte y empalme. Los promotores, que están conectados aguas arriba de las secuencias de nucleótidos según la invención, mediante enlace operativo, pueden estar modificados en este caso mediante una o varias adiciones o mediante una o varias substituciones, o mediante una o varias inversiones, mediante una o varias inserciones y/o mediante una o varias eliminaciones de nucleótidos, sin que se influya negativamente sobre la funcionalidad o bien sobre la actividad de los promotores.

Además, los promotores pueden acrecentar su actividad mediante la modificación de su secuencia o pueden intercambiarse por completo por promotores más activos incluso de organismos de otra especie. Las variantes de los promotores anteriormente descritas se emplearán para la obtención de las cajas de expresión según la invención.

Como ejemplos concretos de las variantes humanas de corte y empalme de la humanPARP2 deben citarse

Variante humanPARP2a: eliminación de los pares de bases 766 hasta 904 (véase SEQ ID NO:1). Esto conduce a un desplazamiento del marco de lectura con un nuevo codón de detención ("TAA" según los nucleótidos 922 hasta 924 en la SEQ ID NO:1). Variante humanPARP2b: inserción de 5'- gta tgc cag gaa ggt cat ggg cca gca aaa ggg tct ctg -3' tras el nucleótido 204 (SEQ ID NO:1). Esto prolonga la secuencia de los aminoácidos en la inserción: GMPGRSWASKRVS.

Se entenderán por derivados de los ácidos nucleicos también aquellas variantes cuyas secuencias de ácidos nucleicos hayan sido modificadas en la zona desde -1 hasta -1.000 por delante del codón de inicio de tal manera que, aumente la expresión genética y/o la expresión proteica.

Además de la secuencia de nucleótido, anteriormente descrita, las construcciones de ácidos nucleicos utilizables según la invención comprenden, en enlace funcional, operativo, una o varias secuencias reguladoras adicionales, tales como promotores, señales de amplificación, reforzantes, secuencias de poliadenilación, orígenes de replicación, genes mensajeros, genes marcadores seleccionables y similares. Este enlace puede conducir, según la aplicación deseada, a un aumento o a una disminución de la expresión genética.

Además de las nuevas secuencias de regulación, puede estar presente todavía la secuencia de regulación natural por delante de los genes estructurales propiamente dichos. Esta regulación natural puede desconectarse en caso dado mediante modificación genética y puede aumentarse o reducirse la expresión de los genes. La construcción genética puede estar constituida también de manera sencilla, es decir que no se insertan señales adicionales de regulación por delante de los genes estructurales y no se retira el promotor natural con su regulación. En lugar de ello se mutará la secuencia de regulación natural de tal manera, que ya no se produzca ninguna regulación y que la expresión genética aumente o disminuya. También en el extremo 3' de la secuencia de los ácidos nucleicos pueden insertarse, ventajosamente, elementos reguladores adicionales. Las secuencias de los ácidos nucleicos pueden estar contenidas en una o en varias copias de la construcción genética.

Las secuencias de regulación ventajosas para el procedimiento de expresión, según la invención, están contenidas, por ejemplo, en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, 1-PR o en el promotor 1-PL, que encuentran aplicación ventajosamente en las bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de la levadura ADC1, MFa, AC, P-60, CYCl, GAPDH o en los promotores vegetales CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor de la ubiquitina o de la faseolina.

En principio pueden emplearse todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación. Además pueden emplearse ventajosamente, también, promotores sintéticos.

Las secuencias reguladoras, citadas, deben posibilitar la expresión específica de las secuencias de los ácidos nucleicos y la expresión de las proteínas. Esto puede significar, por ejemplo, según el organismo huésped, que el gen exprese o sobreexprese solamente después de la incubación, o que exprese y/o sobreexprese inmediatamente.

Las secuencias o bien los factores reguladores pueden influenciar de manera positiva, preferentemente, a la expresión y, de este modo, aumentarla o disminuirla. De este modo puede verificarse un refuerzo de los elementos reguladores ventajosamente sobre el plano de la transcripción, empleándose señales de transición potentes tales como promotores y/o "reforzadores". Además es posible también un reforzamiento de la traducción, mejorándose, por ejemplo la estabilidad del mRNA.

Se entenderán por "reforzadores" por ejemplo secuencias de ADN, que provoquen una expresión acrecentada mediante una interacción mejorada entre la ARN-polimerasa y el ADN.

La construcción de ácido nucleico recombinante o bien la construcción genética se insertará, ventajosamente, en un vector específico del huésped, para la expresión en un organismo huésped no humano adecuado, que posibilite una expresión óptima del gen en el huésped. Los vectores son perfectamente conocidos por el técnico en la materia y pueden tomarse por ejemplo de la publicación "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Se entenderán por vectores, además de los plásmidos, también todos los otros vectores, conocidos por el técnico en la materia, tales como por ejemplo fagos, virus, como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, plásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o pueden replicarse de manera cromosómica.

Expresión de las construcciones

Ventajosamente se introducirán y se expresarán las construcciones recombinantes, descritas según la invención, en sistemas huésped adecuados. En este caso se emplearán preferentemente los métodos de clonación y de transfección conocidos en general por el técnico en la materia para hacer que se expresen los ácidos nucleicos citados en el correspondiente sistema de expresión. Los sistemas adecuados han sido descritos por ejemplo en la publicación Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997.

Como organismos huésped son adecuados, en principio, todos los organismos no humanos, que posibiliten una expresión de los ácidos nucleicos según la invención, de sus variantes alelofórmicas, de sus equivalentes funcionales o derivados o de la construcción recombinante de los ácidos nucleicos. Se entenderán por organismos huésped, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, células vegetales o animales. Los organismos preferentes son las bacterias, tales como aquellas de los géneros Escherichia, tal como por ejemplo Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, microorganismos eucariotas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, células eucariotas superiores de animales o de vegetales, por ejemplo Sf9 o células CHO.

En caso deseado puede provocarse que el producto genético exprese en organismos transgénicos tales como animales transgénicos no humanos, como especialmente ratones, corderos o plantas transgénicas. Los organismos transgénicos, no humanos, pueden estar constituidos por los animales o plantas denominados con genes inactivos, en los cuales se ha desconectado el correspondiente gen endógeno, tal como por ejemplo mediante mutación o eliminación parcial o total.

La combinación formada por los organismos huésped no humanos y por los vectores adaptados a los organismos, tales como plásmidos, virus o fagos, tales como por ejemplo plásmidos con el sistema ARN-polimerasa/promotor, los fagos \lambda, \mu u otros fagos atenuados o transposones y/o otras secuencias reguladoras ventajosas, forma el sistema de expresión. Preferentemente se entenderá por el concepto de sistema de expresión, por ejemplo, la combinación de células de mamíferos, tales como células CHO, y vectores, tal como el vector pcADN3neo, que son adecuados para las células de los mamíferos.

Tal como se ha descrito anteriormente, puede hacerse que el producto genético exprese ventajosamente también en animales transgénicos no humanos, por ejemplo en ratones, corderos o en plantas transgénicas. Del mismo modo es posible programar sistemas de traducción exentos de células con el ARN derivado de los ácidos nuclei-
cos.

Además, el producto genético puede expresar también en forma de fragmentos adecuados desde el punto de vista terapéutico o de diagnóstico. Para el aislamiento de la proteína recombinante pueden emplearse ventajosamente sistemas vectoriales u oligonucleótidos, que prolonguen al cADN en determinadas secuencias de nucleótidos y, de este modo, codifiquen polipéptidos modificados, que sirven para una purificación sencilla. Tales modificaciones adecuadas son, por ejemplo, los denominados "Tags", que actúan como anclajes, tal como por ejemplo la modificación conocida como anclaje de hexa-histidina, o epitopos, que pueden ser reconocidos como antígenos de anticuerpos (descritos por ejemplo en la publicación de Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Estos anclajes pueden servir para la fijación de las proteínas sobre un soporte sólido, tal como por ejemplo sobre una matriz polímera, que puede cargarse, por ejemplo, en una columna para cromatografía, o puede emplearse sobre una placa de microtitulación o sobre un soporte de otro tipo.

Al mismo tiempo estos anclajes pueden emplearse también para el reconocimiento de las proteínas. Para el reconocimiento de las proteínas pueden emplearse, además, marcadores usuales, tales como colorantes de fluorescencia, marcadores enzimáticos, que forman tras la reacción con un substrato un producto de la reacción detectable, o marcadores radioactivos, solos o en combinación con anclajes para la derivatización de las proteínas.

Obtención de los anticuerpos

La obtención de los anticuerpos anti-PARP2 se lleva a cabo en una manera conocida por el técnico en la materia. Por anticuerpos quieren indicarse tanto los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos o humanizados o fragmentos de los mismos, anticuerpos monocatenarios (single chain) o incluso anticuerpos sintéticos, así como los fragmentos de los anticuerpos tales como Fv, Fab y F(ab)'_{2}. Los procedimientos de obtención adecuados están descritos, por ejemplo, en las publicaciones de Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology, (1987) Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford y de Breitling, F. y Dübel, S., Rekombinante Antikörper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

Otra aplicación de la secuencia codificante

El cADN presente ofrece, además, la base para clonar la secuencia génica de los nuevos genes de la PARP. Entre éstos se encuentran también las correspondientes secuencias reguladoras o promotoras, que pueden obtenerse, por ejemplo, mediante secuenciación de la zona de los cADN según la invención, situada en 5' aguas arriba o pueden encontrarse en los intrones de los genes. La información de la secuencia de los cADN constituye también la base para la obtención de moléculas antisentido o de ribozimas con ayuda de métodos conocidos (véanse las publicaciones de Jones, J.T. y Sallenger, B.A. (1997) Nat. Biotechnol. 15, 902; Nellen, W. y Lichtenstein, C. (1993) TIBS, 18, 419). El ADN génico puede emplearse igualmente para la obtención de las construcciones génicas anteriormente
descritas.

Otra posibilidad para emplear la secuencia de nucleótido o partes de la misma consiste en la generación de animales transgénicos no humanos. La sobreexpresión transgénica o la desactivación genética de la información secuencial en modelos de animales adecuados puede proporcionar otras informaciones valiosas sobre la (pato-)fisiología.

Aplicaciones terapéuticas

En situaciones, en las cuales reine un defecto de una proteína según la invención, pueden emplearse varios métodos para la substitución. Por un lado puede aplicarse la proteína natural o recombinante directamente o de manera geneticoterapéutica en forma de sus ácidos nucleicos codificantes (ADN o ARN). Para ello pueden emplearse vectores arbitrarios por ejemplo tanto vehículos víricos así como también vehículos no víricos. Los métodos adecuados han sido descritos, por ejemplo, por Strauss y Barranger en Concepts in Gene Therapy (1997), Walter de Gruyter, Hrsg. La estimulación del gen endógeno, fisiológico, ofrece otra alternativa con ayuda de medios adecuados.

También pueden bloquearse la renovación o la inactivación de las PARPs según la invención, por ejemplo por proteasas. Finalmente pueden emplearse inhibidores o agonistas de las PARPs según la invención.

En situaciones, en las que se presente PARP en exceso o PARP sobreactivada, pueden emplearse diversos tipos de inhibidores. Esta inhibición puede conseguirse tanto por medio de moléculas antisentido, ribozimas, oligonucleótidos o anticuerpos así como, también, mediante compuestos de bajo peso molecular.

Los productos activos según la invención, es decir las proteínas de la PARP, los ácidos nucleicos y los componentes de enlace de la PARP, tales como por ejemplo los anticuerpos o los moduladores, pueden administrarse bien como único producto activo terapéutico o en forma de mezclas con otros productos activos terapéuticos. Éstos pueden administrarse como tales, en general se administrarán, sin embargo, en forma de agentes farmacéuticos, es decir en forma de mezclas del o de los productos activos con, al menos, un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los productos activos o los agentes pueden administrarse por cualquier vía adecuada para la finalidad terapéutica correspondiente, por ejemplo por vía oral o parenteral.

El tipo del agente farmacéutico y del soporte o del diluyente farmacéutico depende del tipo deseado para la administración. Los agentes orales pueden presentarse, por ejemplo, en forma de tabletas o de cápsulas y pueden contener excipientes usuales, tales como aglutinantes (por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbita, tragacanto o polivinilpirrolidona), cargas (por ejemplo lactosa, azúcares, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbita o glicina), agentes lubrificantes (por ejemplo estearato de magnesio, calcio, polietilenglicol o dióxido de silicio), agentes desintegrantes (por ejemplo almidones) o agentes humectantes (por ejemplo laurilsulfato de sodio). Los preparados líquidos, orales, pueden presentarse en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes, elixires o aerosoles, etc. acuosos u oleaginosos, o pueden presentarse en forma de polvo seco para la reconstitución con agua o con otro soporte adecuado. Tales preparados líquidos pueden contener aditivos usuales, por ejemplo agentes de suspensión, productos mejoradores del sabor, diluyentes o emulsionantes. Para la administración parenteral pueden emplearse soluciones o suspensiones con soportes farmacéuticos usuales. La aplicación parenteral de los productos activos según la invención se lleva a cabo ventajosamente mediante el empleo de un agente farmacéutico, líquido, parenteral, especialmente administrable por vía intravenosa. Éste contiene preferentemente una cantidad activa de, al menos, un producto activo preferentemente en un soporte farmacéuticamente aceptable, adecuado para esta finalidad, preferentemente en forma disuelta. Ejemplos a este respecto de soportes farmacéuticos adecuados son, especialmente, las soluciones acuosas, tales como, por ejemplo, la solución fisiológica de sal común, la solución de sal común tamponada con fosfato, la solución de Ringer, solución de Ringer lacteada y similares además, el agente puede contener otros aditivos tales como antioxidantes, agentes formadores de quelatos o agentes antimicrobianos.

La elección respectiva de la dosificación de los productos activos según la invención y el correspondiente plan de dosificación quedan a la decisión del médico encargado del tratamiento. Éste elegirá una dosis adecuada y un plan correspondiente de dosificación en función de la vía de administración elegida, de la actividad del medicamento correspondiente, del tipo y de la gravedad de la enfermedad a ser tratada, del estado en que se encuentre el paciente y su respuesta a la terapia. De este modo pueden administrarse, por ejemplo, las substancias farmacológicamente activas, según la invención, a los mamíferos (seres humanos y animales) en dosis desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal por día. Éstas pueden administrarse en dosis individuales o en varias dosis.

Aplicaciones no terapéuticas

Además, los ácidos nucleicos según la invención, tales como por ejemplo los cADN, los ADN génicos, el promotor, así como también el polipéptido, así como fragmentos parciales de los mismos pueden emplearse en forma recombinante o no recombinante para la planificación de diversos sistemas de ensayo.

A modo de ejemplo, puede establecerse un sistema de ensayo, que sea adecuado para medir la actividad del promotor o de la proteína en presencia de una substancia a ser ensayada. Preferentemente se trata en este caso de métodos de medición sencillos, por ejemplo colorimétricos, luminométricos, fluorimétricos, inmunológicos o radioactivos, que permitan una rápida medición, preferentemente de una pluralidad de substancias a ser ensayadas. Tales ensayos son adecuados ventajosamente para un denominado cribado químico ultrarrápido. Estos sistemas de ensayo permiten una evaluación de las substancias a ser ensayadas con relación a su enlace sobre las proteínas según la invención o con relación a su agonismo, antagonismo o inhibición de las mismas.

La determinación de la cantidad, de la actividad y de la distribución de las proteínas según la invención o de sus mRNA en los que están basadas, en el cuerpo humano puede servir para el diagnóstico, para la determinación de la predisposición y para el seguimiento de determinadas enfermedades. Del mismo modo puede utilizarse la secuencia de los cADN así como la secuencia génica para la predicción de orígenes genéticos y predisposiciones para determinadas enfermedades. Para ello pueden aplicarse tanto sondas de ADN/ARN así como, también, anticuerpos de tipo diferente. Además las secuencias de nucleótidos según la invención partes de las mismas pueden servir, en forma de sondas adecuadas para descubrir mutaciones puntuales, eliminaciones o inserciones.

Además, las proteínas según la invención pueden emplearse para determinar y para aislar sus ligandos naturales o componentes de interacción. Además, las proteínas según la invención pueden emplearse para determinar y para aislar ligandos artificiales o sintéticos. Para ello puede derivatizarse la proteína preparada de manera recombinante o la proteína natural adecuada de tal manera que porte modificaciones que permitan un enlace con materiales de soporte. Tales proteínas enlazadas pueden incubarse con diversos analitos, tales como, por ejemplo, extractos de proteínas y bibliotecas de péptidos u otras fuentes de ligandos. Los péptidos, las proteínas o las substancias de bajo peso molecular, no proteinógenas, específicamente enlazadas pueden aislarse de este modo y caracterizarse. Se entenderán por substancias de bajo peso molecular, no proteinógenas, por ejemplo aquellas substancias químicas, de bajo peso molecular, que, por ejemplo, puedan proceder de la síntesis clásica de los productos activos o de las denominadas bibliotecas de substancias, que hayan sido sintetizadas con ayuda de la combinatoria.

Los extractos proteínicos empleados se derivan, por ejemplo, de homogenatos de vegetales o de partes de vegetales, de microorganismos, de tejidos o de órganos humanos o animales.

Los ligandos o los componentes de interacción pueden identificarse además mediante procedimientos tal como el de la levadura "sistema de dos híbridos -Two-Hybrid-System-" (Fields, S. y Song, O. (1989) Nature, 340, 245). Los bancos de expresión, empleables en este caso, pueden derivarse por ejemplo de tejidos humanos, tales como por ejemplo el cerebro, el corazón, los riñones, etc.

Las secuencias de ácidos nucleicos, según la invención, y las proteínas codificadas por lo mismos pueden emplearse para el desarrollo de reactivos, de agonistas y de antagonistas o de inhibidores para el diagnóstico y la terapia de enfermedades crónicas y agudas, que estén asociadas con la expresión o con la activación de una de las secuencias proteínicas según la invención, tal como por ejemplo con su expresión acrecentada o disminuida. Los reactivos, agonistas, antagonistas o inhibidores desarrollados pueden emplearse a continuación para la obtención de preparaciones farmacéuticas para el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de enfermedades del cerebro de sistema nervioso periférico, del sistema cardio-circulatorio o del ojo, del choque séptico, de la artritis reumatoide, de la diabetes, del fracaso renal agudo, o del cáncer.

La relevancia de las proteínas según la invención para las indicaciones citadas se verificó por medio de inhibidores específicos en modelos de ensayo relevantes.

La invención se explicará ahora con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos de realización.

Ejemplo 1 Aislamiento de los PARP2 y los PARP3-cADN

En el análisis secuencial de clones de cADN de una biblioteca de cADN procedente de cerebro humano (Human Brain 5'Stretch Plus cADN Library, # HL3002a, firma Clontech) se encontró por primera vez la presente secuencia de cADN. Los clones de ratón PARP3 se aislaron a partir de una librería de cADN de cerebro de ratón Lambd-Triplex "Lambda-Triplex mouse brain cADN library" (Clontech número para la adquisición ML5004t). Las secuencias de estos clones han sido descritas en las SEQ ID NO:1, 3, 7 y 9.

Ejemplo 2 Expresión de la PARP2 o bien de la PARP3 en tejidos humanos

Se ensayó la expresión de humanPARP2 o bien de humanPARP3 en doce tejidos humanos diferentes por medio del análisis Northern Blot. Para ello se hibridizó con una sonda de ARN un ``Human Multiple Tissue Northern Blot (MTN™) de la firma Clontech (#7760-1 y #7780-1). La sonda se preparó mediante transcripción in vitro de los cADN correspondientes de la PARP2 humana o bien de la PARP3 humana en presencia de nucleótidos marcados con digoxigenina según la rutina del fabricante (BOEHRINGER MANNHEIM DIG Easy Hyb número para la adquisición 1603 558, DIG Easy Hyb rutina para la hibridación ARN:ARN). A diferencia del protocolo se llevó a cabo la hibridación previa: 2x1 h mediante adición de ADN de esperma de arenque (10 mg/ml de solución de hibridación). La hibridación se llevó a cabo entonces durante la noche mediante adición de ADN de esperma de arenque (10 mg/ml de solución de hibridación). La detección de las bandas se llevó a cabo con empleo del protocolo CDP-Star (BOEHRINGER MANNHEIM CDP-Star™ número para la adquisición 1685 627).

Tras lavado estricto se detectó la transcripción de la PARP2 fundamentalmente en el cerebro, en el corazón, en el músculo del esqueleto, en los riñones y en el hígado humanos. El tamaño del transcripto de aproximadamente 1,9 kb corresponde a la longitud del cADN determinado (1,85 kb) (véase la figura 2(A)).

La humanPARP2 está expresada de una manera claramente más débil en otros tejidos u órganos.

Tras lavado estricto se detectó la expresión del transcripto de la PARP3 fundamentalmente en el corazón, en el cerebro, en los riñones, en el músculo del esqueleto y en el hígado. La expresión en otros tejidos (placenta, pulmón, páncreas) es claramente más débil (véase la figura 2(B)). Para la humanPARP3 existen, al menos, 2 transcriptos, que probablemente pueden explicarse debido a puntos de poliadenilación diferentes o a cortes y empalmes alternativos. Su tamaño (aproximadamente 2,2 kb o bien 2,5 kb) corresponde a la longitud del cADN determinada (2,3 kb). Se lavaron 2 x 5 minutos con 0,2 x SSC/0,2% de SDS a temperatura ambiente y a continuación 2 x 15 minutos con 0,1 x SSC/0,1% de SDS a 65ºC (preparado a partir de 20X SSC: 3M NaCl, 0,3M citrato de sodio, pH 7,0).

Ejemplo 3 Obtención de anticuerpos

Se prepararon anticuerpos específicos contra las proteínas según la invención. Éstos sirvieron, entre otras cosas, para el análisis de la distribución en los tejidos a nivel de las proteínas de la PARP2 y de la PARP3 mediante análisis Immunoblot (Western-Blot). A continuación se han dado ejemplos para la fabricación de tales anticuerpos.

Se prepararon los péptidos siguientes para la obtención de los anticuerpos sintéticamente en la forma conocida por el técnico en la materia. Parcialmente se colgaron de las secuencias un resto de cisteína N-terminal o C-terminal, para facilitar el acoplamiento sobre el KLH (ojo de cerradura de la hemocianina de la lapa -key hole limpet hemocyanin-).

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

Como ejemplo representativo se explicará la obtención de un anticuerpo anti-PARP3.

Se generaron anticuerpos policlonales para la PARP3 humana en conejos con empleo de un péptido sintético con la secuencia peptídica H_{2}N-KQQIARGFEALEALEEALK-CO_{2}H (SEQ ID NO:27) (aminoácidos 230-248 de la secuencia proteínica PARP3 humana). La secuencia correspondiente del ratón en este intervalo se diferencia únicamente en un aminoácido (H_{2}N-KQQIARGFEALEALEEAMK-CO_{2}H; SEQ ID NO:28). Además se colgó una cisteína en la posición N-terminal para posibilitar la copulación de la proteína sobre la KLH.

Se inmunizaron conejos a intervalos de 7-14 días, cinco veces en total, con el conjugado del péptido de la KLH. El antisuero obtenido se purificó por afinidad frente al antígeno. El aislamiento de la fracción específica IgG procedente del suero se llevó a cabo por medio de los péptidos correspondientes, que habían sido inmovilizados previamente sobre una columna de afinidad de una manera conocida por el técnico en la materia. Sobre esta columna de afinidad se cargó el antisuero correspondiente, las proteínas sorbidas de manera no específica se eluyeron con tampón. La fracción de IgG enlazada de manera específica se eluyó con tampón de 0,2 M glicina/HCl, a pH 2,2.El valor del pH se aumentó inmediatamente a pH 7,5 con un tampón 1M TRIS/HCl. El eluato con la fracción de IgG se combinó en la proporción 1 : 1 (volumen) con solución saturada de sulfato de amonio y se incubó durante 30 minutos a +4ºC para completar la precipitación. El precipitado formado se centrifugó a 10.000 g, se liberó del sobrenadante y se disuelve en la menor cantidad posible de PBS/TBS. La solución formada se dializó a continuación contra PBS/TBS en la proporción de 1 : 100 (volumen). Los anticuerpos se ajustaron a una concentración de aproximadamente 100 \mug de IgG/ml. Los anticuerpos de la PARP3 purificados de este modo tenían una elevada especificidad frente a la PARP3. Mientras que la mausPARP3 fue reconocida perfectamente, no se observó ninguna reacción cruzada con la PARP1 ni con la PARP2.

Ejemplo 4 Análisis de la distribución en los tejidos por medio de inmunotransferencias (Immunoblots (Western Blot))

Se investigó la distribución en los tejidos en el plano de las proteínas para la PARP2 y para la PARP3 por medio de análisis de inmunotransferencia Immunoblot (Western-Blot).

Preparación de tejidos de ratón para geles de proteína

Se homogeneizan tejidos o células por medio del dispositivo Ultra-Turrax. Para ello se incubaron 0,5 g de tejido (o de células) con 5 ml de tampón (10 mM Tris-HCl a pH 7,5, 1 mM EDTA, 6 mM MgCl_{2}), una tableta de cóctel de inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim, número para la adquisición 1836153) y benzonasas (grado de purificación I, MERCK) durante 30 minutos a 37ºC. Se prepararon muestras de tejido de ratón para el corazón, el pulmón, el hígado, el bazo, los riñones, el intestino, los músculos, el cerebro y para las células renales embrionarias humanas (HEK293, human embryonal kidney).

Geles de proteína

Para los geles de proteína se empleó el sistema NuPAGE de la firma NOVEX según la rutina. Se emplearon geles de poliacrilamida (NuPAGE 4-12% de BisTris, NOVEX NP 0321), tampón en circulación (MES-Running Buffer, NOVEX NP 0002), antioxidante (NOVEX NP 0005), patrón dimensional de la proteína (Multi Mark Multi Colored Standard, NOVEX LC 5725), tampón de muestra (NuPAGE LDS Sample Buffer (4X), NOVEX NP 0007). El tiempo de desplazamiento de los geles fue de 45 minutos a una tensión de 200 V.

Transferencia de Western

Se llevaron a cabo transferencias de Western (Western Blots) con el sistema de la firma NOVEX según la rutina. Se empleó una membrana de nitrocelulosa (tamaño de los poros de la nitrocelulosa 45 \mum, NOVEX LC 2001). El tiempo de transferencia fue de 1 hora a una intensidad de corriente de 200 mA. El tampón de transferencia estaba constituido por 50 ml de concentrado de tampón de transferencia (NOVEX NP 0006), 1 ml de antioxidante (NOVEX NP 0002), 100 ml de metanol para análisis y 849 ml de H_{2}O.

Además de las transferencias preparadas se utilizaron transferencias preparadas de antemano por ejemplo de la firma Chemicon (Mouse Brain Blot, Chemicon, Katalog Nr.: NS 106 con los tejidos 1. cortex frontal, 2. cortex posterior, 3. cerebelo, 4. hipocampo, 5. bulbo olfatorio, 6. estriatum, 7. tálamo, 8. mesencéfalo, 9. cortex entorrinal, 10. puentes, 11. médula, 12. médula espinal).

Reacción de anticuerpos contra PARP3

Las transferencias de Western se bloquearon durante al menos 2 horas en TBST (TBS + 0,3% Tween 20) con un 5% de polvo de leche seco (TBS: 100 mM Tris a pH 7,5, 200 mM NaCl). La reacción de los anticuerpos con el anticuerpo primario (dilución 1:1.000) se llevó a cabo durante al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC bajo ligera aplicación de sacudidas (dispositivo aplicador de sacudidas por la cabeza) en TBST con un 5% de polvo de leche seco (véase más arriba). A continuación se lavaron tres veces durante 5 minutos en TBST. La incubación con el anticuerpo secundario (anti-Rabbit IgG, peroxidasa copulada, SIGMA A-6154, dilución 1:2.000) se llevó a cabo durante 1 hora en TBST con un 5% de polvo de lecho seco. A continuación se lavó, como anteriormente, tres veces durante 5 minutos cada vez. Se llevó a cabo a continuación la detección basada en la quimiluminiscencia con el estuche SUPER BLAZE (Pierce, Signal BLAZE Chemiluminescent Substrate 34095) según las indicaciones del fabricante. Se empleó la "Lumi-Film" (Chemiluminescent Detection Film, Boehringer número para la adquisición.: 1666916). La película se reveló durante aproximadamente 2 minutos (concentrado revelador de rayos X, ADEFO-Chemie GmbH), se lavó, se fijó durante aproximadamente 4 minutos (Acidofix 85 g/l /AGFA), se lavó y a continuación
se secó.

Ejemplo 5 Obtención de los enzimas

Se expresó la PARP1 humana, en comparación con el sistema recombinante en baculovirus, en la forma conocida por el técnico en la materia y se purificó parcialmente como se ha descrito (Shah et al., Analytical Biochemistry 1995, 227, 1-13). Se adquirió de la firma BIOMOL (número para la adquisición SE-165) PARP1 de ternera con una pureza del 30-50% (c = 0,22 mg/ml, actividad específica 170 nmol de ADP-ribosa/minuto/mg de proteína total a 25ºC). Se expresaron las PARP2 y PARP3 humanas y de ratón, de manera recombinante, en el sistema de baculovirus (sistema Bac-to-Bac, BRL LifeScience). Para ello se clonaron los cADNs en el vector pFASTBAC-1. Tras la obtención del baculovirus-ADN recombinante mediante recombinación en E. coli, se llevó a cabo la transfección de células de insectos (Sf9 o High-Five) con los correspondientes baculovirus-ADNs recombinantes. La expresión de las proteínas correspondientes se verificó mediante análisis de transferencia de Western. Se amplificaron cepas de virus en la forma conocida por el técnico en la materia. Mayores cantidades de proteínas recombinantes se prepararon mediante infección de 500 ml de cultivo de células de insectos (2 x 10^{6} células/ml, con virus infectados con un MOI (multiplicidad de infección; relación entre virus y células) de 5-10 y se incubaron durante 3 a 4 días). A continuación se pelletizaron las células de los insectos mediante centrifugación y se purificaron las proteínas procedentes de los
pellets.

La purificación se llevó a cabo mediante métodos clásicos, conocidos por el técnico en la materia, para la purificación de proteínas con detección de los enzimas con anticuerpos específicos correspondientes. En parte se purificaron por afinidad las proteínas también a través de una columna de 3-aminobenzamida/afinidad como se ha descrito (Burtscher et al., Anal Biochem 1986, 152:285-290). La pureza fue > 90%.

Ejemplo 6 Sistema de ensayo para la determinación de la actividad de la PARP2 y de la PARP3 y del efecto inhibidor de los efectores sobre la PARP1, PARP2 y PARP3 a) Obtención de anticuerpos contra poli-(ADP-ribosa)

Como antígenos para la generación de anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa) puede emplearse la poli-(ADP-ribosa). La obtención de los anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa) ha sido descrita en la literatura. (Kanai Y et al. (1974) Biochem Biophys Res Comm 59:1, 300-306; Kawamaitsu H et al. (1984) Biochemistry 23, 3771-3777; Kanai Y et al. (1978) Immunology 34, 501-508).

Entre otros se emplearon: anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa) (antisueros policlonal, conejo), BIOMOL; número para la adquisición SA-276. Anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa) (monoclonal, ratón; clon 10H; sobrenadante del hibridoma, purificado por afinidad).

Los antisueros o los anticuerpos monoclonales, obtenidos a partir del sobrenadante del cultivo de hibridoma, se purificaron por medio de una cromatografía de proteína-A-afinidad en la forma conocida por el técnico en la
materia.

\vskip1.000000\baselineskip

b) ELISA Materiales Reactivo cromático para ELISA: TMB-Fertigmix SIGMA T-8540

Se cargó una placa de microtitulación con 96 pocillos (FALCON Micro-Test III™ Flexible Assay Plate, # 3912) con histonas (SIGMA, H-7755). Las histonas se disolvieron para ello en tampón de carbonato (0,05 M Na_{2}HCO_{3}; pH 9,4) en una concentración de 50 \mug/ml. Los pocillos individuales de la placa de microtitulación se incubaron al menos durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC con, respectivamente, 150 \mul de esta solución de histona. A continuación se bloquearon los pocillos, mediante adición de 150 \mul de una solución al 1% de BSA (SIGMA, A-7888) en tampón de carbonato durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación se realizaron las fases de lavado con tampón para lavado (0,05% de Tween 10 en 1x PBS; PBS (Phosphate buffered saline; Gibco, número para la adquisición 10010): 0,21 g/l de KH_{2}PO_{4}, 9 g/l de NaCl, 0,726 g/l de Na_{2}HPO_{4} x\cdot7H_{2}O, pH 7,4). Las etapas de lavado se realizaron directamente con un dispositivo lavador de las placas de microtitulación (lavador para placas de microtitulación "Columbus", SLT-Labinstruments, Austria).

Para la reacción enzimática se requirieron una solución de reacción enzimática y una solución de substrato respectivamente como "premezcla -Pre-Mix-". La cantidad absoluta de estas soluciones depende del número de pocillos de ensayo previstos.

\newpage

Composición de la solución de la reacción enzimática por pocillo:

: 4 \mul de la PARP-tampón de reacción (1M Tris-HCl a pH 8,0, 100 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT)

: 20 ng de la PARP1 (humana o bovina) o 8 ng de la PARP2 (humana o de ratón)

: 4 \mul de ADN activada (1 mg/ml; SIGMA, D-4522)

: hasta 40 \mul de H_{2}O

\vskip1.000000\baselineskip

Composición de la solución de substrato por pocillo:

: 5 \mul de la PARP-tampón de reacción (10x)

: 0.8 \mul de solución de NAD (10 mM, SIGMA N-1511)

: 44 \mul de H_{2}O.

Los inhibidores se disolvieron en 1x PARP-tampón de reacción. El DMSO, que se empleó ocasionalmente para la disolución de los inhibidores a concentraciones elevadas, no presentó problemas hasta una concentración final del 2%. Para la reacción enzimática se dispusieron 40 \mul de la solución de la reacción enzimática por pocillo y se incubaron con 10 \mul de solución de inhibidor durante 10 minutos. A continuación se inició la reacción enzimática mediante adición de 50 \mul de solución de substrato por pocillo. La reacción se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se detuvo mediante tres lavados con tampón de lavado.

Como anticuerpos primarios se emplearon anticuerpos específicos anti-poli-(ADP-ribosa) con una dilución de 1:5.000. La dilución se llevó a cabo en tampón de anticuerpos (1% de BSA en PBS; 0,05% de Tween 20). El tiempo de incubación para los anticuerpos primarios fue de una hora a temperatura ambiente. Al cabo de tres lavado consecutivos con tampón de lavado se llevó a cabo una incubación durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (anti-ratón-IgG, fragmento Fab, peroxidasa acoplada, Boehringer Mannheim, número para la adquisición 1500.686; anti-conejo-IgG, peroxidasa acoplada, SIGMA, número para la adquisición A-6154) en una dilución de 1:10.000 en tampón de anticuerpos. Al cabo de tres lavados con tampón de lavado se llevó a cabo la reacción cromática con empleo de 100 \mul de reactivo cromático (TMB-Fertigmix, SIGMA) por pocillo durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción cromática se detuvo mediante adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 2M. A continuación se midió inmediatamente en el dispositivo de lectura ELISA-placas ("Easy Reader" EAR340AT, SLT-Labinstruments, Austria) (450 nm frente a 620 nm). El principio de medida se ha representado esquemáticamente en la figura 6.

Para la determinación el valor K_{i} de un inhibidor se utilizaron diversas concentraciones para el establecimiento de una curva dosis-actividad. Para una determinada concentración de inhibidor se levantan valores 3 veces mayores. Se determinan los valores de la media aritmética con Microsoft© Excel. La determinación del IC_{50} se lleva a cabo con el programa de ordenador Microcal© Origin Software (Vers. 5.0) ("Sigmoidal Fit"). Las conversiones de los valores IC_{50}, calculados de este modo, a valores K_{i} se llevan a cabo mediante el empleo de "inhibidores de calibración". Los "inhibidores de calibración" se midieron al mismo tiempo en cada análisis. Los valores K_{i} de los "inhibidores de calibración" se determinaron en el mismo sistema de ensayo mediante análisis por diagrama de Dixon de una manera conocida por el técnico en la materia.

b) Ensayo HTRF (Homogenous time-resolved fluorescence)

En el ensayo de HTRF-PARP según la invención se marcan histonas como proteínas diana o modificación por PARP indirectamente con un XL665 fluoróforo. El anticuerpo anti-poli-(ADP-ribosa) se marca directamente con un criptato de europio (anti-PAR-criptato). Si se encuentra el XL665-fluoróforo en una proximidad especial inmediata, que garantice un enlace sobre la histona mediante un enlace sobre la poli-(ADP-ribosa), entonces es posible la transferencia de energía. La emisión a 665 nm es, por lo tanto, directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo enlazado, que corresponde, a su vez, a la cantidad de poli-(ADP-ribosa). Por lo tanto la señal medida corresponde a la actividad de la PARP. El principio de medición se ha representado esquemáticamente en la figura 7. Los materiales empleados son, cuando no se haya dicho expresamente otra cosa, idénticos a los que se han utilizado en el ELISA (véase más arriba).

Se disolvieron histonas en tampón de Hepes (50 mM, pH = 7,5) para dar 3 mg/ml. La biotinización se llevó a cabo con sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce, #21335T). Se empleó una relación de 4 moléculas de biotina por histona. El tiempo de incubación fue de 90 minutos (temperatura ambiente). A continuación se purificaron las histonas biotinizados a través de una columna G25 SF HR10/10 (Pharmacia, 17-0591-01) en tampón Hepes (50 mM, pH = 7,0), para eliminar el reactivo de biotinización en exceso. Los anticuerpos anti-poli-(ADP-ribosa) se marcaron por medio de reactivos de copulación bifuncionales con criptato de europio (Lopez, E. et al., Clin. Chem. 39(2), 196-201 (1993); US-Patent 5,534,622). La purificación se llevó a cabo sobre una columna G25SF HR10/30.

Se consiguió una relación molar de 3,1 criptatos por anticuerpo. El rendimiento fue del 25%. Los conjugados se almacenaron en presencia de 0,1% de BSA en tampón de fosfato (0,1 M, pH = 7) a -80ºC.

Para la reacción enzimática se pipetaron conjuntamente por pocillo:

: 10 \mul de solución de la PARP en tampón de reacción PARP-HTRF (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl_{2}, 1 mM DTT) con 20 ng de la PARP1 (humana o bovina) o 8 ng de la PARP2 (humana o de ratón).

: 10 \mul de ADN activado en tampón de reacción PARP-HTRF (50 \mug/ml)

: 10 \mul de histonas biotinizados en tampón de reacción PARP-HTRF (1,25 \muM)

: 10 \mul de inhibidor en tampón de reacción PARP-HTRF

Los reactivos se sometieron a una incubación previa durante 2 minutos, antes de iniciarse la reacción mediante adición de

: 10 \mul de solución de NAD en tampón de reacción PARP-HTRF (41 \muM/ml). El tiempo de reacción fue de 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación se detuvo la reacción mediante adición de

: 10 \mul de inhibidor de la PARP (25 \muM, K_{i}= 10 nM) en tampón de "revelado" (100 mM Tris-HCl pH 7.2, 0,2 M KF, 0,05% de BSA).

A continuación se añadieron:

: 10 \mul de solución de EDTA (SIGMA, E-7889, 0,5 M en H_{2}O)

: 100 \mul de Sa-XL665 (Packard Instruments) en tampón de "revelado" (15-31,25 nM)

: 50 \mul de anti-PAR-criptato en tampón de "revelado" (1,6-3,3 nM).

A continuación pudo efectuarse la medición al cabo de 30 minutos (hasta 4 horas). La medición se llevó a cabo en un "Discovery HTRF Microplate Analyzer" (Canberra Packard Instruments). El cálculo de los valores de K_{i} se llevó a cabo como se ha descrito en ELISA.

Ejemplo 7 Sistema de ensayo para la determinación de la actividad terapéutica de los inhibidores de la PARP

Los nuevos inhibidores de la PARP pueden ensayarse en modelos farmacológicamente relevantes en cuanto a su actividad terapéutica. En la tabla 1 se han indicado ejemplos para algunos modelos adecuados.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

a) Modelo de la NMDA-exocitotoxicidad

El glutamato es el neurotransmisor excitante más importante en el cerebro. Bajo condiciones normales se desprende glutamato en el intersticio sináptico y estimula a los receptores del glutamato post-sinápticos, específicamente a los receptores del glutamato de tipo "NMDA" y de tipo "AMPA". Esta excitación juega un papel significativo en un gran número de funciones cerebrales con inclusión del aprendizaje, de la memoria y el control motriz.

Sin embargo, bajo condiciones de neurodegeneración aguda y crónica (por ejemplo apoplejía) se verifica un aumento fuerte de la generación presináptica de glutamato, lo cual tiene como consecuencia una estimulación excesiva de los receptores. Esto conduce a la muerte celular de las correspondientes células excitadas. En una serie de enfermedades neurológicas o de trastornos psíquicos se presentan estas actividades acrecentadas de glutamato, que conducen a estados de sobreexcitación o a efectos tóxicos en el sistema nervioso central (ZNS) así como también en el sistema nervioso periférico. Por lo tanto el glutamato interviene en un gran número de enfermedades neurodegenerativas, especialmente en trastornos neurotóxicos tras hipoxia, anoxia, isquemia y después de lesiones, como las que se presentan tras apoplejía y trauma, apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de "Lou Gehrigs"), traumas craneales, traumas de la médula espinal, demencia provocada por el SIDA y la enfermedad de Parkinson. Otra enfermedad significativa en los receptores de glutamato es la epilepsia (véanse las publicaciones Brain Res Bull 1998; 46(4):281-309, Eur Neuropsychopharmacol 1998, 8(2):141-52.).

El glutamato induce sus efectos a través de diversos receptores. Uno de estos receptores se denomina receptor NMDA-(N-metil-D-aspartato) según un agonista específico. (Arzneim.Forschung 1990, 40, 511-514; TIPS, 1990, 11, 334-338; Drugs of the Future 1989, 14, 1059-1071). El N-metil-D-aspartato es un agonista potente de una clase determinada de receptores de glutamato (tipo "NMDA"). La excitación del receptor NMDA conduce a la penetración de calcio en la célula y a la generación de radicales. Los radicales conducen a deterioros del ADN y a la activación de la PARP. La PARP provoca, a su vez, la muerte celular debido a un agotamiento de la célula en fosfatos ricos en energía (NAD y ATP). Esto explica la toxicidad del NMDA. El tratamiento de animales con NMDA puede considerarse, por lo tanto, como modelo para las enfermedades anteriormente citadas, en las cuales juega un papel la exocitotoxicidad.

Debido al significado de los receptores del glutamato en la neurodegeneración se han dirigido, hasta ahora, muchas hipótesis farmacológicas a bloquear específicamente estos receptores. Sin embargo se han revelado como problemáticas estas hipótesis debido a su significado en la conducción normal de la excitación (efecto secundario). Además, la excitación de los receptores es un suceso que se produce de manera muy rápida de tal manera que la aplicación de los receptores se produce frecuentemente demasiado tarde (problema "ventana temporal"). Por lo tanto son elevadas las necesidades de nuevos principios activos y de inhibidores de la neurotoxicidad dependiente de la NMDA.

La protección contra la sobreexcitación cerebral debido a los aminoácidos excitantes (antagonismo de NMDA en el ratón) puede servir como demostración suficiente de la actividad de un efector farmacológico de la PARP en enfermedades basadas en la exocitotoxicidad. Mediante aplicación intracerebral de aminoácidos excitantes EAA (Excitatory Amino Acids) se induce una sobreexcitación tan masiva que ésta conduce en un breve espacio de tiempo a convulsiones y a la muerte del animal (ratón).

En el caso presente se aplicaron, monolateralmente, de manera intracerebroventricular, 10 \mul de una solución acuosa al 0,035% de NMDA al cabo de 120 minutos tras la administración intraperitoneal (administración i.p.) de la substancia a ser ensayada. Mediante administración sistémica, por ejemplo intraperitoneal, de los productos activos con actividad central, pueden inhibirse estos síntomas. Puesto que la activación excesiva de los receptores EAA del sistema nervioso central juega un papel significativo en la patogénesis de diversas enfermedades neurológicas, puede deducirse, a partir del antagonismo EAA, demostrado, una posible aplicación terapéutica de las substancias contra tales enfermedades del sistema nervioso central (ZNS). Como magnitud para medir la actividad de las substancias se dedujo un valor ED50, con el cual es asintomático el 50% de los animales mediante una dosis predeterminada de NMDA por medio de una administración i.p. precedente de la substancia a ser medida.

b) Modelo cardíaco de Langendorf (modelo para el infarto de miocardio)

Para el ensayo se emplearon ratas macho Sprague-Dawley (peso corporal 300-400 g; origen Janvier, Le Genest-St-Isle, Francia). Las ratas se trataron oralmente mediante sondas faríngeas con la substancia activa o con placebo (volumen: 5 ml/kg). Al cabo de 50 minutos se aplica intraperitonealmente heparina (Liquemin N Roche, 125 IU/animal en 0,5 ml). Los animales se anestesian con Inactin® T133 (tiobetabarbital sódico, 10%), se fijan sobre la mesa de operaciones, se traqueotomizan y se ventilan con una "bomba ventiladora Harvard" (40 impulsos/minuto, 4,5 ml/impulso). La toracotomía va seguida inmediatamente de un cateterizado de la aorta, extirpación del corazón y perfusión retrógrada inmediata. Los corazones se perfundieron a una presión constante de 75 mmHg, lo cual se consiguió por medio de una "bomba de perfusión Gilson Minipuls 2". Composición del perfundido (mmol/l): NaCl 118, KCl 4,7, CaCl_{2} x 2 H_{2}O 2,52, MgSO_{4} x 7 H_{2}O 1.64, NaHCO_{3} 24,88, KH_{2}PO_{4} 1,18, glucosa 11. La temperatura se mantiene a 37ºC durante todo el experimento. Los parámetros funcionales fueron indicados de manera continua por medio de un "grafo Gould de 4 canales". Se midieron la presión ventricular izquierda (LVP; mmHg), LVEDP (mmHg), la liberación enzimática (creatinaquinasa, mU/ml/g), el caudal coronario (ml/min), la HR (frecuencia del pulso, min^{-1}). La presión ventricular izquierda se midió por medio de un balón de látex relleno de líquido y de un Statham23 Db captador de la presión. El volumen del balón se adaptó permanentemente para alcanzar una LVEDP (presión final diastólica ventricular izquierda -left ventricular end diastolic pressure-) de aproximadamente 12 mmHg. Se deduce la Dp/dt_{max} (fuerza máxima de la bomba) a partir de la señal de presión mediante un módulo diferenciador. La frecuencia cardiaca se calculó a partir de la señal de la presión. El caudal se determinó por medio de un contador de gotas (BMT Messtechnik GmbH Berlín). Al cabo de un tiempo, para alcanzar el equilibrio, de 20 minutos, se sometieron los corazones a una isquemia global durante 30 minutos, que se realizó mediante la detención del aporte de perfundido termostatado a 37ºC. Durante el período subsiguiente de reperfusión de 60 minutos se tomaron muestras del perfundido al cabo de 3, de 5, de 10, de 15, de 30, de 45 y de 60 minutos para el análisis de la actividad de la creatinaquinasa (CK). Los valores medios y las desviaciones con respecto al patrón de los parámetros medidos se analizaron estadísticamente (ensayo de Dunnett). El límite significativo se encontraba en p = 0,05.

De manera similar se llevó a cabo el ensayo con corazones de conejo. Se emplearon conejos machos, blancos de Nueva Zelanda (referencia: Interfauna). La preparación de los corazones se llevó a cabo como se ha descrito precedentemente en el modelo con ratas. La presión de perfusión se estableció a 60 mmHg como máximo, el flujo se ajustó aproximadamente a 25 ml/min. El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio fue de aproximadamente 30 minutos. La aplicación de la substancia se llevó a cabo por infusión directa por delante del corazón. Al cabo de 15 minutos, desde el inicio de la infusión, se aplicó una isquemia global durante 30 minutos mediante detención del flujo con termostatado del corazón.

Se llevó a cabo una reperfusión durante 30 minutos. Se verificaron tomas de perfundido para el ensayo de la actividad CK antes de la administración de la substancia, al cabo de 15 minutos y a diversos intervalos (5, 10, 15, 20, 30 minutos) durante la perfusión. Se midieron los parámetros: LVP (mmHg), LVEDP, LVdp/dt, PP (mmHg), HR (frecuencia del pulso; impulsos/minuto), actividad CK (U/minuto/g de peso del corazón).

c) Modelo animal para el fracaso renal agudo

Se ensayó el efecto protector de los inhibidores PARP mediante una administración intravenosa (4 días) sobre la función renal de ratas con fracaso renal agudo postisquémico.

Se emplearon ratas macho Sprague-Dawley (aproximadamente 330 g al inicio del ensayo; criador: Charles River). Se emplearon de 10 a 15 animales por grupo de ensayo. La aplicación de la substancia activa/placebo se llevó a cabo de manera continua con microbomba osmótica en la v. femoralis. La toma de sangre se llevó a cabo por vía orbital (1,5 ml de sangre integral) bajo narcosis por inhalación con Enfluran (Ethrane Abbott, Wiesbaden).

Una vez determinados los valores previos (toma de sangre) y determinación de la cantidad de orina recogida en 24 horas se narcotizaron las ratas ("Nembutal", pentobarbital sódico, Sanofi CEVA; 50 mg/kg i.p., volumen de la inyección 1,0 ml/kg) y se fijaron sobre una mesa de operaciones calentable (37ºC). A continuación se produjo la administración de heparina (Liquemin N, Roche) 125 IU/kg i.v. en la vena caudalis. Se abrió la cavidad abdominal y se descubrió el riñón derecho. Se descubrieron las arterias renales irradiantes y se pinzaron por la parte superior con pinzas de resorte (según Diefenbach 38 mm). Del mismo modo se descubrió la arteria renal izquierda y se obturó mediante pinzamiento (por la parte superior, aproximadamente a ½ distancia hasta el riñón). Durante la operación se implantó una microbomba osmótica en la V. femoralis. Se introdujo de nuevo el intestino y se compensó la pérdida de líquidos con NaCl al 0,9% templado. Los animales se cubrieron con un paño húmedo y se mantuvieron calientes bajo luz roja. Al cabo de 40 minutos se documentó el aspecto de los riñones y se retiró la pinza derecha, a continuación la izquierda. El intestino se recolocó y se añadieron 2 gotas de antibiótico (Tardomyocel, Bayer). Se cerró el tegumento abdominal con Catgut estéril (Ethicon Nr.4) y se trató nuevamente con 1 gota de antibiótico. La epidermis se cosió con Ethibond Exel estéril (Ethicon) número 3/0 y la costura se pulverizó con aerosol para lesiones (Yamanouchi). Se administró como bolus i.v. un décimo de la dosis diaria de producto activo/placebo.

Se llevaron a cabo tomas de muestras y de sangre los días de ensayo 1, 2 y 4 para el ensayo de los parámetros clínicos, químicos en el suero y en la orina: Na, K, creatinina, proteína (únicamente en la orina). Además se determinaron el consumo de pienso y de agua, el peso corporal y el volumen de orina. Al cabo de 14 días se sacrificaron los animales y se peritaron los riñones.

Para la evaluación se excluyeron todos los animales que habían muerto de infarto durante el ensayo, o bien que presentaban un infarto a la hora de la sección el decimocuarto día. Se calculó la depuración de la creatinina y la secreción fraccional de sodio como parámetros de la función renal mediante comparación de los animales tratados con controles y placebo.

d) Modelo in vitro para la radiosensibilización (terapia tumoral)

Se cultivaron células MCF-7 (carcinoma humano de mama) en medio de Dulbecco modificado de Eagles con un 10% de FCS termoactivado y 2 mM de L-glutamina. Las células se sembraron durante la noche en densidades celulares de 100, de 1.000 o de 10.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y a continuación se sometieron a una irradiación ionizante con una dosis en un intervalo desde 0 hasta 10 Gy (^{137}Cs, Shepard Mark, modelo I-68A, velocidad de dosificación 3,28 Gy/minuto). El ensayo se evaluó al cabo de 10 días desde la irradiación, contándose como positivas colonias con 50 células.

e) Modelo de apoplejía (isquemia cerebral focal; MCA (arteria cerebral media) oclusión en la rata

Se realizó una isquemia focal mediante cauterización de la MCA distal derecha en ratas Sprague-Dawley o Long-Evans. Las ratas pudieron se tratadas con moduladores de las proteínas según la invención antes o después del inicio de la oclusión de la MCA. Por regla general se elegirán dosificaciones de 1 a 10 mg/kg (aplicación en forma de bolus), seguido en caso dado por una infusión permanente de 0,5 a 5 mg/kg/h. Las ratas se anestesian con Halothan en una mezcla constituida por 70% de nitrógeno y por 30% de oxígeno (4% para el inicio y 0,8 a 1,2% durante la operación). La temperatura del cuerpo se midió por vía rectal de manera permanente y se mantuvo constante a un valor de 37,5ºC \pm 0,5ºC por medio de una manta de calefacción regulable. Además se midieron, en caso dado, por medio de un catéter en la vena de la cola, la presión arterial, el pH arterial, el PaO_{2} y el PaCO_{2}. La isquemia focal se llevó a cabo, a continuación, según los métodos de Chen et al. (Stroke 17: 738-743; 1986) o Liu et al. (Am. J. Physiol. 256: H589-593; 1989) por medio de cauterización permanente de la parte distal de la MCA derecha. Una vez concluida la operación se mantuvieron los animales en un recinto caliente durante otras 24 horas. A continuación se sacrifican mediante el empleo de CO_{2} y se decapitan. Los cerebros se retiran inmediatamente, se liofilizan (hielo seco o nitrógeno líquido) y se conservan a -80ºC. Los cerebros se cortan en discos con un espesor de 0,02 mm, tomándose para el análisis subsiguiente uno de cada veinte cortes. Los cortes correspondientes se colorean con violeta de cresilo (coloración Nissl). Alternativamente puede efectuarse la coloración con TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetraztolio). El volumen del infarto puede evaluarse a continuación en el microscopio. Para la cuantificación exacta puede emplearse un programa informático para la evaluación de imágenes (J. Cereb. Blood Flow Metabol. 10: 290-293; 1990).

f) Choque séptico

Se tratan grupos de, respectivamente, 10 ratones macho C57/BL (peso corporal 18-20 g) con LPS (lipopolisacárido de E. coli, LD_{100} = 20 mg/animal i. v.) más galactosamina (20 mg/animal i. v.). La substancia a ser ensayada se aplica durante tres días sucesivos por vía i. p. o por vía i. v. (por ejemplo 1-10 mg/kg), administrándose la primera dosis al cabo de 30 minutos tras la aplicación del LPS. La cuota de mortalidad se determina cada 12 horas. Alternativamente puede aplicarse la substancia también en varias dosis distribuidas a lo largo del día.

g) Determinación de la expresión genética modificada en células en envejecimiento

El envejecimiento de las células se simula mediante la modificación de los medios de cultivo del medio completo a medio con una concentración reducida en suero y a continuación se analiza por medio del ensayo cuantitativo PCR o Northern Blot (Linskens et al., Nucleic Acids Res. 1995; 23(16): 3244-51). Como marcadores típicos para el envejecimiento de la piel pueden actuar, por ejemplo, colágeno o elastina. Se emplean fibroblastos o líneas celulares de fibroblastos humanos, que pueden representar el envejecimiento de la piel. Los moduladores de las proteínas según la invención se aplican al medio y se observa su acción sobre a variación de la expresión genética. Puede observarse una producción acrecentada de elastina en las células con proceso de envejecimiento reducido mediante los moduladores.

\global\parskip0.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: BASF Aktiengesellschaft

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): LUGAR: Ludwigshafen

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 67065

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Nuevos genes de la poli ADP ribosa polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): VERSIÓN LEIBLE MEDIANTE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC DOS/MS DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1843 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN INICIAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: cerebro

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:3..1715

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS/producto= "Poli ADP ribosa polimerasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 571 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2265 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN INICIAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: útero

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:242..1843

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/producto= "Poli ADP ribosa polimerasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 534 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2265 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN INICIAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: útero

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:221..1843

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/producto= "Poli ADP ribosa polimerasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 541 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1740 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN INICIAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: músculo de rata

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:112..1710

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

29

30

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 533 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1587 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN INICIAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: músculo de rata

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:1..1584

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 528 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa de 1 a 5 aminoácidos más"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ile o Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa 1 a 5 aminoácidos más "

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:16

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:21

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ile o Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:24

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa 1 a 5 aminoácidos más"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:25

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ser o Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Leu o Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:21

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Asp o Glu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:22

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa 10 u 11 aminoácidos más "

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Ile o Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:14

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa 7 a 9 aminoácidos más "

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN:2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTROS DATOS:/nota= "Xaa significa Tyr o Phe"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INDICACIONES RELATIVAS A LA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> BASF Aktiengesellschaft

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevos genes de poli(ADP-ribosa)polimerasa

\vskip0.400000\baselineskip

<130> M/39113-PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/EP 99/03889

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-06-04

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cerebro

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1715)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto = Poli ADP ribosa polimerasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 570

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cerebro

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Útero

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (242)..(1843)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto=Poli ADP ribosa polimerasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 533

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Útero

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Útero

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (221)..(1843)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto=Poli ADP ribosa polimerasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 540

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Útero

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1740

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Músculo de rata

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)..(1710)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

73

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 533

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Músculo de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1587

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Músculo de rata

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1584)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 528

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Músculo de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa 1 a 5 aminoácidos más

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Thr o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa 1 a 5 aminoácidos más

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ser o Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ile o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa 1 a 5 aminoácidos más

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ser o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Leu o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Asp o Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa 11 u 11 aminoácidos más

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Ile o Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa 7 a 9 aminoácidos más

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

91

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>POSICIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa significa Tyr o Phe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

98

Claims

1. Homólogos de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) y sus equivalentes funcionales, caracterizados porque presentan una secuencia de aminoácidos, que presenta

a): un dominio de enlace funcional NAD^{+} y

b): ausencia de motivo de secuencia de dedo de cinc de la fórmula general

CX_{2}CX_{m}HX_{2}C

: en la que

: m significa un valor entero de 28 o 30 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera;

comprendiendo el dominio de enlace NAD+ funcional el motivo de secuencia PX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFA, en el que

n significa un valor entero desde 1 hasta 5 y los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera.

2. Homólogos de la PARP según la reivindicación 1, caracterizados porque el dominio de enlace NAD^{+} funcional comprende uno de los motivos de secuencia generales siguientes:

\quad: (S/T)XGLR(I/V)XPX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFA o

\quad: LLWHG(S/T)X_{7}IL(S/T)XGLR(I/V)XPX_{n}(S/T)GX_{3}GKGIYFAX_{3}SKSAXY

en los que n y X se definen como en la reivindicación 1.

3. Homólogos de la PARP según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende, al menos, otro de los siguientes motivos de secuencia parcial:

\quad: LX_{9}NX_{2}YX_{2}QLLX(D/E)X_{10/11}WGRVG,

\quad: AX_{3}FXKX_{4}KTXNXWX_{5}FX_{3}PXK,

\quad: QXL(I/L)X_{2}IX_{9}MX_{10}PLGKLX_{3}QIX_{6}L,

\quad: FYTXIPHXFGX_{3}PP; y

\quad: KX_{3}LX_{2}LXDIEXAX_{2}L,

en los que los restos X significan, independientemente entre sí, un aminoácido cualquiera.

4. Homólogos de la PARP según una de las reivindicaciones precedentes, elegidos entre los homólogos de la PARP humanos, caracterizados por la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2 o según la SEQ ID NO:4 o 6; o los homólogos de la PARP murinos, caracterizados por la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:8 o según la SEQ ID NO:10.

5. Componente de enlace para los homólogos de la PARP según una de las reivindicaciones precedentes, elegido entre los anticuerpos y los fragmentos de los mismos.

6. Ácido nucleico, que comprende

a): una secuencia de nucleótido que codifica, al menos, un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 1 a 4, o la secuencia de nucleótido complementaria del mismo;

b): secuencias de nucleótidos, que se derivan de las secuencias de nucleótidos, definidas en a), por desnaturalización del código genético, y que codifican una proteína con actividad poli-ADP-ribosilante.

7. Ácido nucleico, según la reivindicación 6, que comprende

a): los nucleótidos + 3 hasta + 1715 según la SEQ ID NO:1;

b): los nucleótidos + 242 hasta + 1843 según la SEQ ID NO:3;

c): los nucleótidos + 221 hasta + 1843 según la SEQ ID NO:5;

d): los nucleótidos + 112 hasta + 1710 según la SEQ ID NO:7; o

e): los nucleótidos'+ 1 hasta + 1584 según la SEQ ID NO:9.

8. Caja de expresión, que contiene, al menos, una secuencia de nucleótido, según una de las reivindicaciones 6 y 7, bajo el control genético de, al menos, una secuencia de nucleótido reguladora.

9. Vector recombinante, que comprende, al menos, una caja de expresión según la reivindicación 8.

10. Microorganismo recombinante, que contiene, al menos, un vector recombinante según la reivindicación 9.

11. Procedimiento de detección, in vitro, de los inhibidores de la PARP, caracterizado porque

a): se incuba con una mezcla de reacción una diana poli-ADP-ribosilable, no soportada o soportada, que comprende

a1): un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 1 a 4,

a2): ADN activado como activador de la PARP; y

a3): un inhibidor de la PARP o un analito, en le que se suponga la presencia de, al menos, un inhibidor de la PARP;

b): se lleva a cabo la reacción de poli-ADP-ribosilación; y

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se somete a una incubación previa al homólogo de la PARP con el activador de la PARP y con el inhibidor de la PARP o con un analito, en el que se suponga la presencia de, al menos, un inhibidor de la PARP, como paso previo a la realización de la reacción de poli-ADP-ribosilación.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque la diana poli-ADP-ribosilable es una proteína de histona.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque se inicia la reacción de poli-ADP-ribosilación mediante la adición de NAD^{+}.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque se determina la poli-ADP-ribosilación de la diana soportada con un anticuerpo anti-poli-(ADP-ribosa).

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la diana no soportada está marcada con un fluoróforo aceptor.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque se determina la poli-ADP-ribosilación de la diana no soportada con un anticuerpo anti-poli-(ADP-ribosa), que está marcado con un fluoróforo donador, que es capaz de transferir energía hasta el fluoróforo aceptor.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque la diana es histona biotinizada y porque el fluoróforo aceptor está copulado con la misma a través la avidina o de la estreptavidina.

19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 y 18, caracterizado porque el anticuerpo anti-poli-(ADP-ribosa) porta un criptato de europio como fluoróforo donador.

20. Procedimiento de cribado in vitro de los componentes de enlace para una molécula de la PARP, caracterizado porque

a1): se inmoviliza sobre un soporte, al menos, un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 1 a 4;

b1): se pone en contacto el homólogo de la PARP, inmovilizado, con un analito, en le que se suponga la presencia de, al menos, un componente de enlace; y

c1): se determinan los componentes de analito, enlazados sobre el homólogo de la PARP, inmovilizado, en caso dado tras una fase de incubación;

\hskip0.5cm

o

a2): se inmoviliza sobre un soporte un analito que contenga, al menos, un posible componente de enlace para una molécula de la PARP;

b2): el analito, inmovilizado, se pone en contacto con, al menos, un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se busca un componente de enlace; y

c2): se analiza el analito inmovilizado, en caso dado tras una fase de incubación, con relación al enlace con el homólogo de la PARP.

21. Procedimiento para la determinación cualitativa o cuantitativa de ácidos nucleicos, que codifiquen homólogos de la PARP según una de las reivindicaciones 1 4, caracterizado porque

a): se incuba una muestra biológica con una cantidad definida de un ácido nucleico exógeno, según una de las reivindicaciones 6 y 7, se efectúa la hibridación bajo condiciones estrictas, se determinan los ácidos nucleicos hibridizantes y, en caso dado, se comparan con un patrón; o

b): se incuba una muestra biológica con un par de cebadores oligonucleótidos, que tienen especificidad para un ácido nucleico, que codifique un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 6 y 7, se efectúa la amplificaicón del ácido nucleico, se determina el producto de la amplificación y, en caso dado, se compara con un patrón.

22. Procedimiento para la determinación cualitativa o cuantitativa de un homólogo de la PARP según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque

a): se incuba una muestra biológica con un componente de enlace específico para un homólogo de la PARP, según la reivindicación 5,

b): se detecta el complejo componente de enlace/PARP y, en caso dado

c): se compara el resultado con un patrón.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque el componente de enlace es un anticuerpo o un fragmento enlazante del mismo, que porta, en caso dado, una marca detectable.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23 para el diagnóstico de enfermedades inducidas por la deficiencia energética.

25. Procedimiento para la determinación de la actividad de los inhibidores de la PARP, caracterizado porque

a): se incuba un homólogo de la PARP, según una de las reivindicaciones 1 a 4, con un analito, que contiene un inhibidor de la PARP; en caso dado se separa de nuevo el inhibidor; y

b): se determina la actividad del homólogo de la PARP, en caso dado tras adición de substratos o de cosubstratos.

26. Agente para la terapia génica, caracterizado porque contiene, en una soporte aceptable para la terapia génica, una construcción de ácido nucleico, que codifica

a): un ácido nucleico antisentido contra un ácido nucleico codificante, según una de las reivindicaciones 6 y 7; o

b): un ribozima contra un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 6 o 7.

27. Agente farmacéutico, que contiene en una soporte farmacéuticamente aceptable, al menos, una proteína de la PARP según una de las reivindicaciones 1 a 4, al menos un componente de enlace de la PARP, según la reivindicación 5 o, al menos, una secuencia de nucleótido codificante, según las reivindicaciones 6 o 7.

28. Empleo de componentes de enlace de la PARP según la reivindicación 5 para la fabricación de un agente farmacéutico para el diagnóstico o la terapia de estados patológicos, que están inducidos por una deficiencia energética.