CZ291281B6 - Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití - Google Patents

Abstract

Katalyticky aktivn L-methionin-L-deamino-.gama.-merkaptomethan ly zov² (MET zov²) polypeptid maj c schopnost degradovat methionin (MET), v²hodn rekombinantn . D le polynukleotid, kter² k duje tento polypeptid, farmaceutick² prost°edek pro chemoterapii sav ch malign ch bun k a souprava pro stanoven p° tomnosti nebo nep° tomnosti katalyticky aktivn a katalyticky inaktivn methylthioadenosin fosforyl zy (MTAzy) ve vzorku bun k.\

Description

Vynález se týká způsobu selektivní destrukce maligních buněk u savců na základě metabolického rozdílu mezi těmito buňkami a nemaligními (tj. „normálními”) buňkami. Konkrétně se týká ohrožení maligních buněk, kterým chybí enzym nutný k přeměně methylthioadenosinu na methionin degradací plazmového methioninu a homocysteinu.

Dosavadní stav techniky

Aminokyselina methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních i maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky umírají.

V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z L-homocysteinu (homocystein) nebo methylthioadenosinu (MTA) (produkt polyamidové biosybtetické dráhy). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAza).

V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAza a které tudíž nemohou převádět MTA a MET. Například Katamari a d., Proč. Nati Acad. Sci. USA 78: 1 219-1 223 (1981), uvádějí, že u 23% ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAza, zatímco v každé ze 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAzy přítomna. MTAza-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzní homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle umírají.

Je známo, že L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.1.11; Metáza) degraduje nejen MET, ale také homocystein, Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAza (tj. MTAza-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METázou. Lze předpokládat, že normální MTAza-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET další přeměnou MTA na MET.

Rudimentární verze tohoto přístupu byla navržena poprvé v r. 1972 v Kreis, Cencer Treat. Rprts. 63:1 069-1 072 (1972). Při použití 11 maligních buněčných linií v kulturách prostých MET byl Kreis schopen aplikací METázy na kultury inhibovat růst určitých maligních buněk. Kreis rovněž pozoroval, že po přídavku homocysteinu ke kultuře se 2 normální buněčné linie „zachránily“ před účinky nedostatku MET. Avšak přestože byly tyto studie in vitro povzbuzující, bylo Kreisem popsáno několik překážek, bránících úspěšnému použití METázy v chemoterapii in vivo, zahrnujících nedostupnost prostředků k zajištění přežití normálních buněk in vivo, potenciální imunogenicitu čištěného nebo částečně čištěného enzymu a nutnost aby enzym byl rezistentní vůči degradaci proteolytickými enzymy in vivo (Kreis, Chemotherapy (muggia, FM, ed. Haag, Boston a Londýn: Martinus-Nijihoff, 1983), str. 219-248).

Další překážkou vývoje úspěšného přístupu k vyvolávání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které malignity jsou MTAzanegativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zjišťuje, zdaje malignita MTAza-negativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem, Biophys. Res. Commun. 95:1 861-1 866, 1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAzy in vitro, jestliže

-1 CZ 291281 B6 detekuje, zda je v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zda je katalyticky aktivní v době provádění testu.

Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vývojem imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAzy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátek pro použití při uimunologické detekci MTAzy je pracné a poskytovat relativně špatné výsledky (Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329,1986).

I kdyby byly vyvinuty přiměřené prostředky pro detekci MTAza-negativních buněk, zůstává produkce dostatečné zásoby METázy z přírodních zdrojů stejně obtížnou jako produkce MTAzy. Produkce METázy jiným způsobem než čištěním netivního enzymu se dosud nezdařila zčásti proto , že gen pro METázu by l (do nynějších dnů) pouze částečně sekvenován (Nakayama a d., Biochem. 27:1 587-1 591, 1988).

Ze všech uvedených důvodů zůstává účinný přístup k vyvolání nedostatku MET in vivo v MTAza-maligních buňkách neuskutečnitelný. Tuto potřebu řeší tento vynález.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyázový (METázový) polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 5, nebo sekvenci v podstatě stejnou, a mající schopnost degradovat methionin (MET).

Výhodně se jedná o rekombinantní polypeptid.

Předmětem vynálezu je rovněž polynukleotid, který kóduje výše uvedený katalyticky aktivní METázový polypeptid, kteiý má nukleotidovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.

Dále je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek pro chemoterapii savčích maligních buněk, které myjí absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza, který zahrnuje směs terapeuticky účinného množství výše uvedeného METázového polypeptidu a terapeuticky účinného množství methylthioadenosinu (MTA) ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Vynález zahrnuje rovněž soupravu pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy (MTAzy) ve vzorku buněk savce, obsahující oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují s nukleotidovou sekvencí, která kóduje MTAzu, znázorněnou jako SEQ ID č. 1.

Předmětem vynálezu je rovněž použití směsi terapeuticky účinného množství výše uvedeného METázového polypeptidu a terapeuticky účinného množství MTA ve farmaceuticky přijatelném nosiči pro přípravu farmaceutického prostředku pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza.

S použitím prostředku podle vynálezu se malignita, která byla určena jako MTAza-negativní, ošetřuje terapeuticky účinným množstvím METázy, přednostně rekombinantní METázy, a zejména rekombinační METázy konjugované s polyethylenglykolem nebo ekvivalentní molekulou. Konkrétně se METáza může podávat savci (přednostně člověku) v dávce, která sníží hladinu jeho plazmového MET v rozsahu postačujícím k ohrožení MTAza-negativních buněk nedostatkem methioninu (ke kterému obvykle dochází při asi< 10% hladiny methioninu před terapií). Normálním (MTAza-pozitivním) buňkám je MET dodáván v podstatě současným podáváním MTA.

-2CZ 291281 B6

S použitím vynálezu je možno rovněž provádět detekci MTAza-negativních buněk při malignitě. Konkrétně zahrnuje v jednom provedení produkci protilátek proti MTAze (včetně monoklonálních) a jejich použití při imunoanalýze na MTAzu. V jiném provedení zahrnuje detekci přítomnosti genu, který kóduje MTAzu, použitím analýzy na základě metody amplifikace nukleových kyselin, zejména polymerázové reakce (polymerase chain reaction, PCR).

Rekombinantní METáza může být získána izolací a klonováním genu kódujícího METázu, která umožňuje produkci podstatných množství METázy pro použití podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje schéma metabolické dráhy syntézy polyamidů a redukce MTA MTAzou.

Obr. 2 znázorňuje porovnání MTAza-pozitivních a MTAza-negativních lidských a jiných než lidských buněčných linií, detekovatelných imunoblottingem.

Obr. 3 znázorňuje porovnání MTAza-pozitivních a MTAza-negativních lidských buněčných linií a primárních nádorů detekovaných imunoblottingem.

Obr. 4 znázorňuje porovnání růstu, vyvolaného u MTAza-negativních lidských buněk ošetřených METázou oproti buňkám kultivovaným v prostředí bohatém na methionin.

I. Způsob detekce MTAza-negativních buněk

Obr. 1 schematicky znázorňuje metabolické dráhy syntézy MET z MTA in vivo a degradace MET METázou. Jak výše uvedeno, k dosažení plného přínosu terapie rakoviny na základě nedostatku methioninu musejí být v cílové malignitě detekovány METza-negativní buňky. Za tímto účelem jsou dále popsány alternativní prostředky detekce MTAzy, které jsou vhodné pro použití podle vynálezu.

A: Imunoanalýza obsahu MTAzy

1. Produkce antigenní MTAzy a MTAzových peptidů

Protilátky, specifické pro MTAzu, se získají imunizací živočicha jiného než člověka antigenní MTAzou nebo MTAzovými peptuidy. Antigenní MTAzové peptidy mohou být obecně izolovány a čištěny ze savčí tkáně způsobem popsaným Ragnionem a d., J. Biol. Chem. 265:6 241-6 246 (1990). Příklad provedení tohoto postupuje uveden dále v příkladech provedení, odkazuje se rovněž na aminokyselinovou sekvenci plné délky MTA, která je zde uvedena jako SEQ ID. NO. 1.

2. Imunizace antigenními MTAzovými peptidy k vyvolání tvorby anti-MTAzových protilátek

Jakmile se získá antigenní MTAza nebo MTAzové peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidů zavedením peptidů do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTA peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěný MTA při ředění 1 : 1 500, resp. 1 :4000.

Pro imunizaci živočichů antigenními MTAzovými peptidy se přednostně používá imunizační protokol s vícerázovou injekcí (viz například Langone a d., ed., „Production of Antisera with Smáli Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections“, Methods of Enzymology

-3CZ 291281 B6 (Acad. Press, 1981)). Příznivou protilátkovou odpověď je možno získat například u králíků při intradermální injekci 1 mg antigenního MTAzového peptidů emulgovaného v kompletním Freundově adjuvans, po níž za několik týdnů následuje jedna nebo několik posilovačích dávek téhož antigenu v neúplném Freundově adjuvans.

Je-li to žádoucí, je možno imunizující peptid navázat na nosný protein konjugací s použitím známých metod. Běžně používané nosiče, které se chemicky navazují na peptid, zahrnují hemocyanin přísavky keyhole limpet (KLH), thyreoglobulin, bovinní sérový albumin (BSA) a tetanový toxoid. Navázaný peptid se pak použije k imunizaci živočicha (například myši nebo králíka). Jelikož se má v současnosti za to, že MTAza je zachovávána mezi savčími druhy, je použití nosného proteinu ke zvýšení imunogenicity MTAzových proteinů preferováno.

Polyklonální protilátky, produkované imunizovanými živočichy, mohou být dále čištěny, například vazbou a eluci na matrici, k níž je navázán peptid, proti němuž byly vyvolány protilátky. Odborníkům jsou známy různé metody, běžné v oboru imunologie pro čištění a/nebo koncentraci polyklonálních protilátek, stejně jako monoklonálních protilátek (viz například Coligan a d., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Pro použití při detekci MTAza-negativních buněk jsou pro svou specificitu a snadnost produkce preferovány monoklonální protilátky. Pro přípravu monoklonálních protilátek je preferována imunizace myší nebo krys. Výraz „protilátka“ zde rovněž zahrnuje intaktní molekuly a jejich fragmenty, jako jsou například Fab a F(ab')₂, které jsou schopné vázat epitopovou determinantu. V tomto kontextu se rovněž výraz „mAb podle vynálezu“ vztahuje na monoklonální protilátky specifické pro MTAzu.

Obecná metoda produkce hybridomů vylučujících monoklonální potilátky (mAb) je známa (Kohler a Milstein, Nátuře 256:495, 1975). Stručně řečeno zahrnovala metoda popsaná Kohlerem a Milsteinem izolaci lymfocytů z regionálních odtékajících mízních uzlin pěti různých pacientů' buď smelanomem, teratokarcinomem nebo rakovinou čípku, gliomu nebo plic, lymfocyty byly získány z chirurgických vzorků, spojeny a pak fúzovány s SHFP-1. Hybridomy byly podrobeny screeningu na produkci protilátky, která se vázala na rakovinné buněčné linie. Ekvivalentní metody lze použít k produkci a identifikaci mAb specifických pro MTAzu.

Potvrzení MTAzové specificity mezi mAb podle vynálezu je možno provádět pomocí relativně rutinních metod screeningu (například enzymová imunoanalýza ELISA) za účelem stanovení elementárního reakčního schématu příslušné mAb.

Bez zbytečné experimentální práce je rovněž možno hodnotit mAb za účelem stanovení, zda má stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, stanovením, zda testovaná mAb brání vazbě mAb podle vynálezu na MTAzu. Jestliže testované mAb soutěží s mAb podle vynálezu, což je patrné z poklesu vazby mAb podle vynálezu, pak je pravděpodobné, že se obě monoklonální protilátky vážou na stejný nebo blízce příbuzný epitop.

Další možností, jak zjistit, zda má mAb stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, je preinkubace mAb podle vynálezu s antigenem, s nímž normálně reaguje, a stanovení, zda testovaná mAb je inhibována ve své schopnosti vázat antigen. Je-li testovaná mAb inhibována, pak ve vší pravděpodobnosti má stejnou nebo blízce příbuznou epitopovou specificitu jako mAb podle vynálezu.

3. Postup imunoanalýzy prodetekci MTAza-negativních buněk

Jakmile se výše popsaným způsobem získají vhodné protilátky, použijí se k detekci MTAzy v malignitě. Příklad imunoanalýzy, vhodné pro tento účel (například imunoblotting) je blíže popsán dále v příkladu I. Odborníkovi v imunologii je však zřejmé, že MTAzu je možno

-4CZ 291281 B6 detekovat pomocí výše popsaných protilátek i v jiných formátech imunoanalýzy buď v kapalné nebo pevné fázi (je-li navázána na nosič).

Detekci MTAzy pomocí anti-MTAzových protilátek je možno provádět pomocí imunoanalýzy, které se provádějí postupným, obráceným nebo simultánním způsobem, včetně imunohistochemických analýz na fyziologických vzorcích. Vhodné postupy imunoanalýzy zahrnují kompetitivní a nekompetitivní protokoly, prováděné v přímém nebo nepřímém formátu. Příklady takových imunoanalýz jsou radioimunoanalýza (RIA) a sendvičová (imunometrická) analýza. Odborník zná nebo může bez nadměrného experimentování snadno určit další formáty imunoanalýzy.

Protilátky používané při imunoanalýzách mohou být kromě toho detekovatelně značeny,. Značka je látka, která může být kovalentně spojena nebo pevně asociována se sodnou nukleové kyseliny, což umožňuje sondu detekovat. Značkou může být například radioizotop, enzymový substrát nebo inhibitor, enzym, radioopakní látka (včetně koloidních kovů), fluorescenční látka, chemiluminiscenční molekula, Iiposomy, obsahující kteroukoli zvýše uvedených značek nebo specifický člen vazebného páru. Vhodná značka neztrácí během amplifikace vlastnost odpovědnou za detekovatelnost.

Odborníkům v oboru diagnostiky jsou známy vhodné detekovatelné značky pro použití v detekčních analýzách in vitro. Vhodné radioizotopy například zahrnují ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ¹⁴C, ³⁵S. Amplifikované fragmenty, značené radioizotopem, mohou být detekovány přímo gama čítačem nebo denzitometrií autoradiogramů, Southemovým blottingem amplifikovaných fragmentů v kombinaci s denzitometrií. Příklady vhodných chemiluminiscenčních molekul jsou akridiny nebo luminol. Cílové sekvence hybridizované se sondami, derivatizovanými aktidiumesterem, jsou chráněny před hydrolýzou interkalací. Příklady vhodných fluorescenčních látek jsou fluorescein, fykobiliprotein, cheláty vzácných zemin, dansyl nebo rhodamin.

Příklady vhodných substrátů nebo inhibitorů enzymů jsou sloučeniny, které se specificky vážou na křenovou peroxidázu, glukózu, oxidázu, glukózu-6-fosfát dehydrogenázu, β-galaktosidázu, pyruvát kinázu nebo acetylcholinesterázu alkalické fosfatázy. Příklady radioopakních látek jsou koloidní zlato nebo magnetické částice.

Specifický vazebný pár zahrnuje dvě různé molekuly, přičemž jedna z nich má na svém povrchu nebo v dutině oblast, která se specificky váže na konkrétní prostorovou a polární organizaci jiné molekuly. Členové specifického vazebného páru se často označují jako ligand a receptor nebo ligend a antiligend. Je-li například receptorem, protilátka, je ligandem odpovídající antigenem. Další specifické vazebné páry dvojice hormon-receptor, enzym-substrát, biotin-avidin a glykolprotrein-receptor. Zahrnuty jsou rovněž fragmenty a části specifických vazebných párů, které si uchovávají vazebnou specificitu, jako jsou fragmenty imunoglobulinů, včetně fragmentů Fab apod. Protilátky mohou být buď monoklonální nebo polyklonální. Použije-li se člen specifického vazebného páru jako značka, zahrnuje výhodný dělicí postup afinitní chromatografii.

Protilátky mohou být rovněž navázány na nosič. Příklady známých nosičů zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dextran, nylon, amylózy, přírodní a modifikované celulózy, polyakrylamidy, agarózy a magnetit. Charakter nosiče může být pro účely vynálezu buď rozpustný nebo nerozpustný. Odborníkovi jsou známy další vhodné nosiče pro vazbu protilátek neboje schopen je určit rutinními experimenty.

B. Detekce MTAza-negativních buněk analýzou na bázi PCR

Z důvodu relativní snadnosti a rychlosti detekce imunoanalýzou s použitím MTAza-specifických protilátek podle vynálezu je imunoanalýza výhodným prostředkem detekce MTAza-negativních buněk. Odborník si je však vědom, že k detekci přítomnosti MTAza-negativních buněk

-5CZ 291281 B6 v malignitě je možno použít dalších detekčních prostředků. Například na základě popisu sekvence nukleových kyselin uvedených v SEQ ID NO 1 by odborník mohl konstruovat oligonukleotidové sondy, které by hybridizovaly s DNA MTAzy přítomnou v buněčném vzorku. Naopak, protože se má za to, že deficit MTAzy je důsledkem genomické delece gemu, který by kódoval MTAzový protein, je možno předpokládat, že není-li v buněčném vzorku detekován žádný gen kódující MTAzu, jsou buňky MTAza-negativní.

Podrobný popis pracovního postupu pro amplifikaci a detekci genu MTAzy je uveden v dosud neukončené patentové přihlášce USA č. 08/176 855, podané 29.12.1993. Pasáž přihlášky č. 08/176 855, týkající se tohoto pracovního postupuje zde zahrnuta formou odkazu.

C. MTAza-negativní kandidáti na terapii nedostatkem MTAzy

Malignita, která je kandidátem na terapii podle vynálezu (tj. terapii vyvoláním nedostatku MET), je taková, v níž není detekovatelně přítomen protein MTAza, ať katalyticky aktivní nebo inaktivní. Ve všech dosud studovaných maligních buněčných liniích je MTAza-negativita (je-li přítomna) shodným lysém celé buněčné populace. Jinými slovy je možno očekávat, že jsou-li některé buňky v malignitě MTAza-negativní, budou MTAza-negativní všechny buňky v malignitě. Tato skutečnost souhlasí s dosavadním názorem, že deficit MTAzy je výsledkem delece genu spíše než mutace. Homogenita MTAza-negativity v malignitě by měla významně zvyšovat účinnost vyvolání nedostatku MET jako terapie rakoviny oproti terapiím zaměřeným na heterogenní rysy, jako jsou nádorové antigeny, na něž je cílena terapie monoklonálními protilátkami. Pro účely vynálezu však postačuje, je-li malignita na MTAzu „v podstatě deficitní“, tzn. že neobsahuje detekovatelně množství proteinu MTAzy.

Lidské malignity, které se v současnosti považují za v podstatě deficitní na MTAzu, zahrnují:

Tabulka I

malignita	deficit MTAzy zjištěn:
nemalobuněčné rakoviny plic:	imunoanalýzou*

A-549 (adenosarkom) Sk-Lu-1 (adenosarkom)

H322 (bronchoalvedor

H1334 (velkobuněčný karcinom)

H1437 (adenosarkom)

H1581 (velkobuněčný karcinom)

buněčné linie mozkových nádorů*:

imunoanalýzou*

A172

U-87MG U-138MG Hs683

primární mozkové nádory:

imunoanalýzou ♦

astrocytom multiformní glioblastom oligostrocytom

lymfomy a leukemie:

imunoanalýzou ♦

CEM (akutní lymfocytické leukemie) K-T-l (akutní lymfocytická leukemie) NALL-1 (akutní lymfocytická leukemie) K562 (chronická myeloidní leukemie)

-6CZ 291281 B6 deficit MTAzy zjištěn:

Tabulka I - pokračování malignita

DHL-9 (maligní lymfon)

HSB2 (akutní lymfoxytická leukemie)

Jiné:

sarcinosarkom Walker 256

Jurkat

K562

Capan-1 (adenosarkom pankreatu) klinickým důkazem” imunoanalýzou

imunoanalýzou

Legenda:

získáno z Američan Type Culture Collection, Rockville, MD., uvedeno Kriesem a d., Cancer Res. 33:1 866-1 869 (1973), uvedeno Rangionem a d., Biochem. J. 281:533-538 (1992), uvedeno Kriesem a d., Cancer Trmt. Rpts. 63:1 069-1 072 (1979), ♦ deficit MTAsy ve všech ostatních malignitách byl detekován a zaznamenán Noborim a d. v Cancer Res. 53:1 098-1 101 (1993) a v Cancer Res. 51:3 193-3 197(1991).

Pomocí zde popisovaných detekčních metod je odborník schopen bez přílišného experimentování detekovat deficit MTAzy v dalších malignitách.

II. Terapie nedostatkem MET

A. Produkce MEtázy

Pro použití v metodách podle vynálezu je vyžadován zdroj jak MTA, tak METázy. Prostředky pro získání MTA jsou popsány výše. METáza se pro použití v metodách podle vynálezu čistí z mikroorganismů, zahrnujících Trichomonas vaginalis (Lockwood a d., J. Biochem. 279:675-682, 1991), Clostridium sporogenes (viz například výše Kries a d., 1 867; EC4.4.1.11) a Pseudomonas putidaQ4akayama ad., Biochem. 2ΤΛ 587-1 591, 1988).

Pomocí knihovny cDNA konstruované zP. putida byla identifikována plná délka sekvence nukleotidů pro METázu a je uvedena v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 4; sekvence aminokyselin je uvedena jako SEQ ID NO 5.

S touto informací je možno METázu snadno syntetizovat nebo experimovat z klonu DNA známými metodami, jaké jsou popsány výše s ohledem na MTAzu. Podrobný popis klonování a exprese v E. coli je uveden dále v příkladech II a lil.

V terapeutické metodě podle vynálezu je možno použít čištěné, částečně čištěné, syntetizované nebo rekombinanční METázy, avšak z důvodu snadného získání a relativně nízké imunogenicity je preferována rekombinanční METáza. Imunogenicitu enzymu je možno dále snížit, a přednostně se to provádí navázáním na polyethylenglykol (PEG) nebo na ekvivalentní biologicky kompatibilní molekulu, je možno očekávat, že navázání na PEG rovněž snižuje poločas existence konjugátu METázy in vivo.

Konjugát PEG-METáza je možno vytvořit kovalentním navázáním PEG na enzym, jak je popsáno pro L~asparagen (viz například Benedich a d., Clin. Exp. Immunol. 48:273-278, 1982). Metody navázání PEG na proteiny jsou známy a nejsou zde proto podrobněji popisovány. Na základě výsledků klinických pokusů na lidech při léčbě nehodgkinovského lymfomu pomocí L-asparaginázy navázané na PEG nelze očekávat, že by vazba METázy na PEG významně

-7CZ 291281 B6 snižovala její aktivitu in vivo (viz výsledky in vivo získané s PEG-L-asparagináza, Muss a d., Invest. New Drugs 8:125-130, 1990). odborník si je však vědom, že existují další prostředky prodloužení poločasu existence proteinů in vivo, které mohou být vhodné pro použití u METázy a které zahrnují, aniž by se však na ně omezovaly, glykosylaci a sukcinylaci.

B. Terapeutické metody

Malignity, které jsou v podstatě deficitní na MTAzu, se podle vynálezu částečně ošetřují podáváním METázy. Přednostně se jedná o ty malignity, které je možno léčit regionální chemoterapií, tzn. takové, kde malignita je lokalizována a obsažena v oblasti těla, která je přístupná intraarteriální infuzí, nebo zaváděním METázy topickou, transdermální nebo ekvivalentní cestou přímo do místa malignity. Příklady malignit, které jsou přístupné regionální chemoterapii, jsou melanomy, rakovina vaječníků (peritoneálním katétrem) a rakovina močového měchýře (uretrálním katétrem). další malignity, které je možno ošetřovat regionální chemoterapií podle vynálezu, jsou-1 i MTAza-negativní, jsou známy onkologickým odborníkům.

Odborník si je vědom, že terapeutické přípravky podle vynálezu je možno rovněž podávat systemicky. Je však nutno upravit dávkování ke kompenzaci clearance přípravků a potenciální toxicity vůči normálním buňkám. Zejména je nutno přísně sledovat klinické důkazy nedostatku methioninu v normálních buňkách a podle potřeby jej vyrovnávat podáváním dalšího množství MTA.

Malignity, v podstatě deficitní na MTAzu, se podle vynálezu ošetřují takto:

METáza se podává savci přednostně člověku) parenterálně, přednostně intraarteriální infuzí. Podává se ve farmaceuticky přijatelném nosiči, který může zahrnovat sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej, a injekční organické estery, jako je ethyloleát. Vhodné nosiče zahrnují vodu, alkoholické vodné roztoky, emulze nebo suspenze včetně solného roztoku a pufrovaných médií. Jak je uvedeno výše, METáza je ke snížení imunogenicity přednostně konjugována s PEG.

Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátované Ringerovo médium nebo fixované oleje. Intravenózní vehikula zahrnují tekuté a živné doplňky, elektrolytové doplňky (například na bázi Ringerovy dextrózy) apod. Mohou být přítomny rovněž konverzační a jiné přísady, například antimikrobiální, antioxidační nebo chelatační prostředky a inertní plyny apod.

Dávkování METázy se může pohybovat od asi 10 do 20 000, přednostně od asi 5 000 do 6000 jednotek/m² (nebo níže, aplikuje—li se intraarteriální infuzí) v jedné nebo několika dávkách týdně v jednom nebo několika dnech. Obvykle lze očekávat, že METáza má u savce clearanci do asi 24 h po podání; použitím prostředků prodloužení poločasu existence, například konjugace s PEG, je možno tento poločas prodloužit o několik hodin až několik dní. Měla by být tedy monitorována hladina plazmového methioninu savce a podle potřeby by měly být podávány další dávky METázy k dosažení terapeuticky významného snížení koncentrace methioninu v plazmě savce. Takové snížení bude dostatečné k vyvolání detekovatelného poklesu objemu MTAza-negativních buněk, tj. poklesu objemu maligních buněk nebo nádorového zatížení savce. Dávka, kterou se dosahuje tohoto účinku, se považuje za „terapeuticky účinnou“ dávku. Na základ studií in vivo na hlodavcích s částečně čištěnou METázou lze obecně očekávat, že terapeuticky účinná dávka je taková, která snižuje hladinu methioninu v plazmě pacienta na asi < 10 % příslušné hladiny před terapií.

Hladinu plazmového methioninu ( a její změny) je možno monitorovat periodickými (přednostně každodenními) testy in vitro na krevních vzorcích odebíraných pacientovi, jemuž je aplikována METáza, v průběhu jejího podávání. Obecně je možno na základě studií prováděných na

-8CZ 291281 B6 hlodavcích očekávat, že hladina methioninu v plazmě se na hodnotu < 10 % příslušné hladiny před terapií sníží během asi 1 h podávání METázy. testy na plazmový methionin jsou známy; například je možno stanovit koncentraci methioninu ve vzorku krve metodou rozdělovači plynové chromatografie (GLC) esterifikovanych aminokyselin (n-butylester), která je popsána vRoach a d., J. Chromatog: 44:269-278 (1969). Jiné ekvivalentní postupy detekce methioninu v plazmě jsou odborníkovi známy neboje může snadno nalézt.

Je nutno upozornit, že METáza nemůže degradovat intracelulámí methionin. Proto jsou MTAza-pozitivní buňky s přiměřenou zásobou MTA pro tvorbu intracelulámího methioninu obvykle schopny přežít redukci exogenního methioninu METázou. Naopak MTA-negativní buňky s absolutní potřebou methioninu obvykle bez zásoby exogenního methioninu (nebo L-homocysteinového substrátu pro methionin, který je také degradován METázou) nepřežijí úbytek methioninu v plazmě.

Účinnost této terapie je možno potvrdit a monitorovat pomocí jakéhokoli klinického důkazu snížení buněčného objemu malignit}' (zjišťovaného známými prostředky) a/nebo periodickou detekcí objemu MTAza-negativních buněk v malignitě pomocí zde popsaných detekčních prostředků. Na základě údajů ohledně použití L-asparaginázové terapie u lidí je možno očekávat, že toxicita METázové terapie bude značně nízká a může spočívat primárně v alergických reakcích, léčitelných prostředky, známými klinickému odborníkovi, například podáváním epinefrinu.

MTA se tedy podává savci v podstatě souběžně s METázou. Přednostně se MTA a METáza podávají současně. Protože MTA se nechová jako substrát pro METázu, mohou být obě látky spolu kombinovány v jednom farmaceuticky přijatelném nosiči. Alternativně je možno MTA podávat do asi 24 h po podání METázy (přednostně dříve) pro „záchranu“ MTAza-pozitivních buněk, jejichž endogenní zásoba methioninu začíná být vyčerpána.

Dávka MTA, potřebná k záchraně normálních buněk, se liší v závislosti na různých klinických faktorech, zahrnujících umístění malignity, objem MTAza-negativních buněk v malignitě, délku METázové terapie a dostupnost MET pro pacienta ve výživě. Obecně se však MTA podává v dávkách, dostatečných k udržení hladiny methioninu v plazmě na asi 1 až 10 μΜ.

Příklady provedení vynálezu

K bližšímu osvětlení provedení vynálezu, který je výše podrobně popsán, jsou uvedeny příklady, které však nelze chápat jako omezující rozsah vynálezu, který je definován v připojených patentových nárocích.

Příklad I

Imunoanalýza na MTAzu

A. Produkce protilátek proti MTAze

MTAza byla čištěna z hovězích jater, jak uvádí výše citovaný Rangione a d. Z izolovaného enzymu bylo konvenčními technikami sekvenováno několik tryptických peptidů. Na základě získaných sekvencí byly syntetizovány peptidy 40 ( o délce 18 aminokyselin, viz SEQ ID NO 2) a 51 (o délce 14 aminokyselin viz SEQ ID NO 3) modifikaci známé Merrifíeldovy metody syntézy v pevné fázi (viz například Chen a d., Proč. Nat7 Acad. Sci. USA 81:1 784-1 788,1984). Všechny peptidy obsahovaly na karboxylovém konci cysteinový zbytek pro usnadnění chemické vazby na nosný protein KLH pomocí m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidového esteru.

-9CZ 291281 B6

Pomocí konjugátů peptid-KLH byli ve dvouměsíčních intervalech imunizováni novozélandští bílí králíci (dva králíci pro jeden peptid). Počáteční injekce obsahovaly 1 mg konjugátu syntetický peptid-KLH emulgovaného ve Freundově kompletním adjuvans. Posilovači injekce obsahovaly 1 mg antigenu v nekompletním Freundově adjuvans. Po 3 až 4 injekcích byla séra částečně přečištěna 50% nasyceným roztokem síranu amonného a byla podrobena screeningu na anti-peptidovou a anti-MTAzovou reaktivitu pomocí ELISA.

Konkrétně byly mikrotitrační plotny předem povlečeny peptidy nebo MTAzou v koncentraci 10 pg/ml v BBS (0,2 M boritanu sodného-0,15 M NaCl, pH 8,5) a ponechány přes noc při 4 °C. Plotny byly jednou promyty BBS s obsahem 0,05 % Tween 20 a pak byly inkubovány 4 h s BBS, obsahujícím 1 % bovinního sérového albuminu, pro blokování nespecifických vazebných míst. Pak byla v 0,1 ml alikvotech aplikována různá ředění kontrolního séra nebo antiséra proti peptidu a podrobena inkubaci přes noc. Plotny byly dvakrát promyty BBS s obsahem 0,05 % Tween20 a pak na 1 h exponovány kozímu anti-králičímu imunoglobulinu F(ab')₂, značenému alkalickou fosfázou (Jackson Laboratories, lne., West Groove, PA), ve zředění 1:1 000 v BBS. Po promytí ploten bylo do každé jamky přidáno 0,2 ml 0,1 M />-nitrofenylfosfátu disodného v 0,1 M NaHCOj, pH 9,0. Po 30 min byla měřena absorpce při 405 nm.

B. Pracovní postup imunoblottingové analýzy na imunoreaktivní MTAzu

Několik lidských buněčných linií a nádorových biopsii bylo hodnoceno v přítomnosti MTAza-negativních buněk (viz tabulka 1, položky označené „imunoanalýzou“). Jiný vzorek, který testoval MTAza-pozitivní buňky, byly BV-173 (chronická myeloidní leukemie, „CML“) Molt-16 (akutní lymfocytická leukemie, „ALL“), Molt-4 (ALL), U397 (histiocytický lymfom), SUP-T8 (ALL), U-373MG (glioblastom) a T98G (glioblastom).

Buněčné extrakty, připravené z enzym-pozitivních buněk, byly podrobeny elektroforéze na 12,5% polyakrylamidovém gelu s obsahem 0,1% dodecylsulfátu sodného spolu s různými množstvími MTAzy, která byla čištěna, jak výše uvedeno, z hovězích jater.

Konkrétně byly surové buněčné extrakty (10 až 150pg/pruh) rozděleny elektroforézou na 12,5% polyakrylamidových gelech s obsahem 0,1 % dodecylsulfátu sodného. Po elektrotransferu na nitrocelulózové membrány (0,45 mm, Bio-Rad, Richmond, CA) byla nespecifická vazebná místa blokována 3% práškového mléka v BBS. Proteiny pak byly po dobu 16 h při teplotě místnosti sondovány antiséry ve zředění 1:500 v BBS s 3 % práškového mléka. Po intenzivním promytí proteinů pomocí BBS byly vazbou ¹²⁵I-protein A (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) po dobu 1 h detekovány reaktivní pásy. Membrány byly promyty a přeneseny na papírové ubrousky a vystaveny při -70 °C filmu Kodak XAR-5™.

Na autoradiogramech byly denzitometrem (Bio-Rad) skanovány pásy a kvantifikovány pomocí kalibrační křivky získané z imunoreaktivních pásů čištěného enzymu.

C. Výsledky

U neplicních buněčných linií a biopsii (tj. v gliomech) bylo 67 % (4 ze 6) zcela deficitních na imunoreaktivní enzym (obr. 2). Ze Šesti postupných bioptických vzorků z lidských gliomů s různými histologickými charakteristikami (tabulka I) bylo pět zcela deficitních (obr. 3). Kontrolní pokusy ukázaly, že normální lidský mozek má hojnou MTAzovou aktivitu (obr. 3, pruh 7). Úplný deficit MTAzy je tedy v lidských gliomech společnou a specifickou metabolickou abnormalitou.

Z 19 testovaných buněčných linií nemalobuněčné rakoviny plic MTAza zcela chyběla v 6 buněčných liniích (viz tabulka I a obr. 4).

-10CZ 291281 B6

Příklad II

Klonování METázy z Pseudomonas putida

S odkazem na částečnou sekvenci aminokyselin MTAzy, publikovanou Wakayamou a d., Biochem. 27:1 587-1 591, 1988) byly navrženy degenerované oligonukleotidové primery a použity v PCR analýze ne gen pro METázu.

Při této PCR analýze se amplifikoval fragment o přibližně 300 bp. Produkt PCR 300 bp byl subklonován do plazmidu pBluescript II KS (Stratagene, San Diego). Pomocí inertní oligonukleotidové sondy k produktu PCR byla Southemovým blottingem tohoto subklonovaného produktu PCR potvrzena identita toho fragmentu jako genu METázy. Další Southemův blotting ukázal, že tento fragment, vytvořený pomocí PCR, hybridizoval s fragmentem Bgl II 5,0 kb v DNA Pseudomonas putida.

Na základě těchto výsledků byla konstruována knihovna bakteriofágové genomové DNA, obsahující genomovou DNA Pseudomonas putida. Pseudomonas putida, digerována Bgl II, byla podrobena elektroforéze na 0,8% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání. Byly vyříznuty fragmenty Bgl II o velikosti v rozmezí 4 kb až 6 kb a čištěny z gelu. Pomocí KlenoWova fragmentu byly fragmenty Bgl II částečně zarovnány a subklonovány do bakteriofágového vektoru yFix II. Tento vektor byl digerován s Xho I a částečně zarovnán Klenowem. Knihovna byla balena do bakteriofágových částic pomocí balicího extraktu gigapack od Stratagene. Po obalení byla knihovna amplifikována a titrována.

Za účelem izolace kompletního genu METázy byla tato knihovna podrobena screeningu fragmentem vytvořeným pomocí PCR. Po screeningu 200 000 klonů bylo izolováno osm nezávislých primárních klonů. Z těchto osmi klonů byly pouze dva skutečně pozitivní a jedinečné. Jeden klon obsahoval inzert o velikosti 5,1 kb a druhý obsahoval inzert o velikosti 5,9 kb. Tyto inzerty byly subklonovány do pBluescript II KS a pak mapovány a sekvenovány. Stanovili jsme, že sekvence genu METázy má 1615 bp (viz SEQ ID NO 4).

Příklad III

Exprese rekombinanční METázy

Gen rekombinanční METázy byl exprimován ve vektoru C5, což je tentýž vektor, který byl použit pro expresi MTAzy (viz například příklad VII neukončené přihlášky USA č. 08/176 855, podané 29.12.1993). K inokulaci o objemu 50 ml kultury byla použita bakteriální kultury v malém i velkém měřítku bylo použito standardní médium LB, doplněné 50 pg/ml ampicilinu. 50ml inokulovanéá kultura byla inkubována přes noc při 37 °C. Pak byla kultura lOOnásobně naředěna do čerstvého média LB. Ve velké kultuře (11) byly buňky pěstovány po dobu 1,5 h při 37 °C za intenzivního třepání. K vyvolání exprese METázy byl k velké kultuře přidán izopropylthio-p-D-galaktosid [IPTG] v konečné koncentraci 0,01, 0,1 a 1 mM a kultury byly inkubovány další 4 h. Bylo zjištěno, že optimální koncentrace IPTG pro expresi proteinu je 1 mM.

Po 4 h od přídavku IPTG byly buňky shromážděny a odděleny odstředěním při 19 000 g po dobu 10 h při 4 °C. Supematant byl odstraněn a peleta byla suspendována a promyta chladným solným roztokem a pak znovu odstředěna. Resuspendovaná peleta buněk byla promyta ve 100 až 200 ml pufru s 20 mM fosforečnanu draselného o pH 7,5, obsahujícího 15 μΜ 2-merkaptoethanolu. Bylo přidáno 1 mM EDTA a 30 μΜ pyridoxal-5'-fosfátu (pufr A) a pak byla peleta znovu odstředěna. Promytá resuspendovaná (v pufru) suspenze buněk byla vložena do bomby na rozrušování buněk. Rozrušování buněk bylo prováděno po dobu 20 min s použitím tlaku N₂ 2200 psi. Lyžované buňky byly odstřeďovány 20 min při 4 °C při 43 000 g. Supematant z buněčného extraktu byl dále čištěn na sloupci s afinitou barvivo-ligand.

-11 CZ 291281 B6

Buněčný extrakt (10 ml) byl vložen na sloupec (12 x 2,6 cm) gelu „DYEMATRIX“ [Orange A] (Amicon lne., Beverly, MA). Kolona byla plněna a ekvilibrována podle pokynů výrobce. Po nanesení vzorku byla kolona propláchnuta 5násobným objemem pufru A k odstranění nenavázaného podílu. Po tomto stupni byl navázaný podíl eluován lineárním gradientem 0 až 1,5 M KC1 v pufru A. Byly shromážděny frakce po 10 ml a podrobeny analýze na enzym γ-lyázu. Frakce obsahující hlavní pík methionin γ-lyázové aktivity byly spojeny a zkoncentrovány na přístroji „CENTRICON 30“ (Amicon lne.) na 2 až 3 ml.

Ke koncentrovaným frakcím (0,314 g/ml) byl přidán pevný (NH4)₂SO₄ do konečné koncentrace 2,4M, vzorek byl odstřeďován 10 min při 13 000 g a supematant byl přefiltrován přes filtr acrodis 0,45 pm (Amicon, lne.), načež byl nastříknut na sloupec FPLC s hydrofobní interakcí Alkyl „SUPEROSE“ (agaróza) Hr5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 2,4M (NH4ESO4, rozpuštěným v pufru A, použitém pro předchozí stupně. Navázaný protein byl eluován s lineárně klesající koncentrací (NH4)₂SO₄ (průtok 0,5 ml/min). Frakce, obsahující METázovou aktivitu, byly spojeny a zkoncentrovány výše uvedeným způsobem, Koncentrace proteinu byla měřena metodou, popsanou Bradfordem.

Čistota enzymového preparátu byla kontrolována pomocí 1 mm gelu SDS s 10% glycin-tris (Novex, San Diego, CA). Metázová aktivita byla analyzována měřením produkce 2-ketomáselné kyseliny podle návodu Esakiho & Škody (Meth. Enzymol. 143:459-465, 1987), který je zde zahrnut. Konečný enzym měl specifickou aktivitu 300 U/mg, kde 1 U = 1 μΜ produktu, vzniklého za minutu.

Příklad IV

Selektivní ohrožení MTAza-negativních buněk v buněčných liniích nemalobuněčné rakoviny plic

MTAza-negativní buněčné linie nemalobuněčné rakoviny plic, uvedené v příkladu I, byly in vitro v buněčné kultuře podrobeny terapeutickému působení METázy a MTA podle vynálezu. Konkrétně byly enzym-pozitivní (SK-MES-1) a negativní (A-549) buněčné linie kultivovány 4 dny v (a) médiu obsahujícím methionin, doplněném 10 % dialyzovaného koňského séra, (b) v médiu zbaveném methioninu, doplněném 10% dialyzovaného koňského séra, a (c) v médiu zbaveném methioninu, doplněném 10% dialyzovaného koňského séra a 16 μΜ MeSAdo. Proliferace obou buněčných linií, zvláště enzym-negativních buněk A-549, byla výrazně retardována v médiu s chybějícím methioninem (27 %, resp. 3,3 % růstu kontroly u buněk SK-MES-1, resp. A-549). Když byl ke stejnému médiu přidán MTA, zvyšoval růst enzym-pozitivních buněk SK-MES-1 (77 % růstu kontroly). Proliferace enzym-negativních buněk A-549 však nebyla v přítomnosti MTA podpořena (4,3 % růstu kontroly; tabulka II).

Z těchto údajů vyplývá, že růst buněk, negativních na MeSAdo fosforylázu, může být selektivně blokován v médiu zbaveném methioninu, doplněném MeSAdo.

růst (% kontroly)15
bez methioninu
buněčná linie	statut enzymu3 bez MeSAdo	s MeSAdo
SK-MES-1	+ 27 ± 2,6	77 ± 4,7
A-549	3,3 ± 0,6	4,3 ± 1,1

+ přítomen, - nepřítomen, procento růstu kontroly = 100 x (růst buněk v médiu zbaveném methioninu s MTA nebo bez MTA) / (růst buněk v médiu s obsahem methioninu).

- 12CZ 291281 B6

Příklad V

Nedostatek methioninu u lidských maligních buněk s rekombinanční METázou

Pro studium antiproliferativních účinků rekombinanční METázy, získané podle příkladů II a III, byly lidské buňky SK-MES-1 a A-549 kultivovány v médiu DMEM a v 10% dialyzovaném fetálním bovinním séru doplněném 0,06 U/ml rekombinační METázy. Po 3 dnech byla zjišťována proliferace buněk. Účinky METázy byly vyjádřeny jako procento růstu buněk v médiu bez přidávaného enzymu.

Jak je znázorněno na obr. 4, růst buněk se v médiu, doplněném METázou, zvýšil v případě enzym-pozitivního média (SK-MES-1) o 26,6 % a v případě enzym-negativního média (A-549) o 2,96 %. Jestliže však bylo přidáno 20 QM MTA jako alternativní zdroj buněčného methioninu, obnovil se růst u enzym-pozitivních buněk na 61,4% hodnoty kontroly, zatímco u enzym-negativních buněk poklesl na 2,0 %.

PŘEHLED SEKVENCÍ

SEQ ID č. 1 je aminokyselinová sekvence pro plnou délku MTAzy.

SEQ ID č. 2 je aminokyselinová sekvence antigenního MTAzového peptidu.

SEQ ID č. 3 je aminokyselinová sekvence aktigenního MTAzového peptidu, který se liší aminokyselinovou sekvencí od peptidu SEQ ID č. 2.

SEQ ID NO 4 je nukleotidová sekvence polynukleotidu kódujícího METázu.

SEQ ID NO 5 je aminokyselinová sekvence METázy předpokládaná z nukleotidové sekvence SEQ ID NO 4.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB SELEKTIVNÍHO VYVOLÁVÁNÍ NEDOSTATKU METHIONINU V MALIGNÍCH BUŇKÁCH U SAVCŮ (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5* Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

-13CZ 291281 B6 (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-286 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2763 párů bází (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..2763

-14CZ 291281 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:

TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACAIATTTG60

AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG120

ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CrGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT180

TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT240

TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG 7CAACTACCA300

GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG360

TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA420

CANHNHNNMX NNHNNNNNNH GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT480

TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT540

GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT600

TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT660

TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG720

GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG780

GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT840

ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT THNNHNNNNM NNNNNNNNNK900

AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC960

TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG1020

GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG1080

GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA1140

ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA1200

GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT1260

GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA1320

AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA1380

GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT1440

TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTAMM NNNNNNNNNN KNNNNHNNNM NNTACCCTAC1500

ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG1560

GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC1620

-15CZ 291281 B6

AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680 TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740 AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800 TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860 WCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTAC1AC7 ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920 AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGAHNX KKNKNNXNNN NNAATAAACA 19B0 ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040 CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100 AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160 TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT ΤΤΤΠΤΤΤΤΤ AACAAACATC 2220 TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280 CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340 CATTCTAATT CEAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400 ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460 TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520 AETAAEATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580 CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640 CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700 GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760 TAC 2763

-16CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..17 (xi) POPIS SEKVENCE:SEQ ID NO 2:

Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu

10 15

Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:

Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu

5 10

-17CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1615 párů bází (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methionin-gama-lyáza (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 304..1497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:

-18CZ 291281 B6

ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT TTTTGGAAAA AATCGGGCAG CTCGGTGGCA

CGTTGTCTTC CAGCAGCTTG ACCCGGCGCC60

TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG120

TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT180

GTTCCAGCAA GCACGCAGAT GCGTGGGCAA240

TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT300

GCC ATG Met

CGC GAC TCC

CAT AAC

AAC Asn

ACC GGT TTT TCC ACA CGG

GCC Ala

ATT Ile 15

348

Arg

Asp

Ser

His 5

Asn

Thr Gly

Phe 10

Ser

Thr

Arg

1

CAC

CAC

GGC

TAC

GAC

CCG

CTT

TCC

CAC

GGT

GGT

GCC

TTG

GTG

CCA

CCG

396

His

His

Gly Tyr

Asp

Pro

Leu

Ser

His

Gly Gly

Ala

Leu

Val

Pro

Pro

20

25

30

CTG

TAC

CAG

ACC

GCG

ACC

TAT

GCC

TTC

CCG

ACT

GTC

GAA

TAC

GGC

GCT

444

Val

Tyr

Gin

Thr

Ala

Thr

Tyr

Ala

Phe

Pro

Thr

Val

Glu

Tyr

Gty

Ala

35

40

45

GCG

TGC

TTC

GCC

GGG

GAG

GAG

GCG

GGG

CAC

TTC

TAC

AGC

CGC

ATC

TCC

492

Ala

Cys

Phe

Ala

oty

Glu

Glu

Ala

Gly

His

Phe

Tyr

Ser

Arg

Ile

Ser

50

55

60

AAC

CCC

ACC

CTG

GCC

TTG

CTC

GAG

CAA

CGC

ATG

GCC

TCG

TTG

GAG

GGT

540

Asn

Pro

Thr

Leu

Ala

Leu

Leu

Glu

Gin

Arg

Met

Ala

Ser

Leu

Glu

Gly

65

70

75

GGT

GAG

GCG

GGA

TTG

GCG

CTG

GCG TCG

GGG

ATG

GGA

GCC ATT

ACT

TCG

588

Gly Glu Ala

Gly

Leu

Ala

Leu Ala

Ser

Gly Met

Gly Ala Ile

Thr

Ser

80

85

90

95

ACC

CTC TGG

ACC

CTG

CTG

CGG

CCT

GGT

GAT

GAG

CTG

ATC GTG

GGG

CGC

636

Thr

Leu Trp

Thr

Leu

Leu Arg

Pro

Gly Asp Glu

Leu

Ile Val

Gly Arg

100

105

110

ACC

TTG TAT

GGC

TGC

ACC

TTT

GCG

TTC

CTG

CAC

CAT

GGC

ATT

GGC GAG

684

Thr

Leu Tyr Gly Cys

Thr

Phe Ala

Phe

Leu

His

His

Gly

Ile

Gly Glu

115

120

125

TTC

GGG

GTC

AAG

ATC

CAC

CAT

GTC

GAC

CTT

AAC

GAT

GCC

AAG

GCC

CTG

732

Phe

Gly

Val

Lys

Ile

His

His

Val

Asp

Leu Asn Asp

Ala

Lys

Ala

Leu

130

135

140

AAA

GCG

GCG

ATC

AAC

AGC

AAA

ACG

CGG

ATG

ATC

TAC

TTC

GAA

ACA

CCG

780

Lys

Ala

Ala

Ile

Asn

Ser

Lys

Thr

Arg

Met

Ile

Tyr

Phe

Glu

Thr

Pro

145 150 155

GCC

AAC

CCC

AAC

ATG

CAA

CTG

GTG

GAT

ATA

GCG

GCG

GTC

GTC

GAG

GCA

828

Ala

Asn

Pro

Asn

Met

Gin

Leu

Val

Asp

He

Ala

Ala

Val

Val

Glu

Ala

160

165

170

175

GTG

CGG

GGG

AGT

GAT

GTG

CTT

GTG

GTG

GTC

GAC

AAC

ACC

TAC

TGC

ACG

876

Val

Arg

Gly

Ser

Asp

Val

Leu

Val

Val

Val

Asp

Asn

Thr

Tyr

cys

Thr

180

185

190

CCC

TAC

CTG

CAG

CGG

CCA

CTG

GAA

CTG

GGG

GCA

GAC

CTG

GTG

GTG

CAT

924

Pro

Tyr

Leu

Gin

Arg

Pro

Leu

Glu

Leu

Gly

Ala

Asp

Leu

Val

Val

His

195

200

205

TCG

GCA

ACC

AAG

TAC

CTC

AGT

GGC

CAT

GGC

GAC

ATC

ACT

GCG

GGC

CTG

972

Ser

Ala

Thr

Lys

Tyr

Leu

Ser

Gly

His

Gly

Asp

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

210

215

220

- 19CZ 291281 B6

GTG

GTG

GGG

CGC

AAG

GCT

TTG

GTC

GAC

CGC

ATT

CGG

CTG

GAA

GGG

CTG

1020

Val

Vat

□ ty

Arg

tys

Ala

Leu

Val

Asp

Arg

Ile

Arg

Leu

Glu

Gly

Leu

225

230

235

AAA

GAC

ATG

ACC

GGG

GCA

GCC

TTG

TCA

CCG

CAT

GAC

GCT

GCG

TTG

TTG

1068

tys

Asp

Met

Thr

Gly

Ala

Ala

Leu

Ser

Pro

His

Asp

Ala

Ala

Leu

Leu

240

245

250

255

ATG

CGC

GGC

ATC

AAG

ACC

CTG

GCG

CTG

CGC

ATG

GAC

CGG

CAT

TGC

GCC

1116

Met

Arg

Gly

Ile

Lys

Thr

Leu

Ala

Leu

Arg

Met

Asp

Arg

His

Cys

Ala

260

265

270

AAC

GCC

CTG

GAG

GTC

CCG

CAG

TTC

CTG

GCC

GGG

CAG

CCC

CAG

GTG

GAG

1164

Asn

Ala

Leu

Glu

Val

Ala

Gin

Phe

Leu

Ala

Gly

Gin

Pro

Gin

Val

Glu

275 280 285

CTG Leu

ATC Ile

CAC His 290

TAC CCG

GGC TTG CCli iCG TTT GCC CAG TAC

GAA CTG

GCA Ala

1212

Tyr

Pro

Gly Leu Pro 295

Ser

Phe

Ala

Gin

Tyr 300

Glu

Leu

CAG

CGG

CAG

ATG

CGT

TTG

CCG

GGC

GGG

ATG

ATT

GCC

TTT

GAG

CTC

AAG

1260

Gin

Arg

Gin

Het

Arg

Leu

Pro

Gly Gly

Met

Ile

Ala

Phe

Glu

Leu

Lys

305

310

315

GGC

GGT

ATC

GAG

GCC

GGG

CGC

GGC

TTC

ATG

AAT

GCC

CTG

CAG

CTT

TTT

1308

Gly Gly

Ile

Glu

Ala

Gly Arg Gly

Phe

Met

Asn

Ala

Leu

Gin

Leu

Phe

320

325

330

335

GCC

CGT

GCG

GTG

AGC

CTG

GGG

GAT

GCC

GAG

TCG

CTG

GCA

CAG

CAC

CCG

1356

Ala

Arg

Ala

Val

Ser

Leu

Gly Asp Ala

Glu

Ser

Leu

Ala

Gin

His

Pro

340

345

350

GCG

AGC

ATG

ACG

CAC

TCC

AGT

TAC

ACG

CCA

CAA

GAG

CGG

GCG

CAT

CAC

1404

Ala

Ser

Met

Thr

His

Ser

Ser

Tyr

Thr

Pro

Gin

Glu

Arg

Ala

His

His

355

360

365

GGG

ATA TCA

GAG

GGG

CTG

GTG

AGG

TTG

TCA

GTG

GGG

CTG

GAG

GAT

GTG

1452

Gly

Ile

Ser

Glu

Gly

Leu

Val

Arg

Leu

Ser

Val

Gly

Leu

Glu

Asp

Val

370

375

380

GAG

GAC

CTG

CTG

GCA

GAT

ATC

GAG

TTG

GCG

TTG

GAG

GCG

TGT

GCA

1497

Glu

Asp

Leu

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Leu

Glu Ala

Cys

Ala

385

390

395

TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC

1557

ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA TGACCGTA

1615

-20CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 398 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:

Met

Arg

Asp

Ser

His

Asn

Asn

Thr

Gly

Phe

Ser

Thr

Arg Ala Ile His

1

5

10

15

His

Gly

Tyr

Asp

Pro

Leu

Ser

His

Gly

Gly

Ala

Leu

Val Pro Pro Val

20

25

30

Tyr

Gin

Thr

Ala

Thr

Tyr

Ala

Phe

Pro

Thr

Val

Glu

Tyr Gly Ala Ala

35

40

45

Cys

Phe

Ala

Gly

Glu

Glu

Ala

Gly

His

Phe

Tyr

Ser

Arg Ile Ser Asn

50

55

60

Pro

Thr

Leu

Ala

Leu

Leu

Glu

Gin

Arg

Met

Ala

Ser

Leu Glu Gly Gly

65

70

75

80

Clu

Ala

Gly

Leu

Ala

Leu

Ala

Ser

cly

Met

Gly

Ala

Ile Thr Ser Thr

85

90

95

Leu

Trp

Thr

Leu

Leu

Arg

Pro

Gly

Asp

Glu

Leu

Ile

Vat Gly Arg Thr

100

105

110

Leu

Tyr

Gly

Cys

Thr

Phe

Ala

Phe

Leu

His

His

Gly

Ile Gly Glu Phe

115

120

125

Gly

Val

Lys

Ile

His

His

Val

Asp

Leu

Asn

Asp

Ala

Lys Ala Leu Lys

130

135

140

Ala

Ala

Ile

Asn

Ser

Lys

Thr

Arg

Met

Ile

Tyr

Phe

Glu Thr Pro Ala

145

150

155

160

-21 CZ 291281 B6

Asn

Pro

Asn

Het

Gin Leu Val Asp Ile Ala Ala Vat Val

Glu

Ala 175

Val

165

70

Arg

Gly

Ser

Asp

Vat

Leu

Val

Val

Val

Asp

Asn

Thr

Tyr

Cys

Thr

Pro

180

185

190

Tyr

Leu

Gin

Arg

Pro

Leu

Glu

Leu

Gly

Ala

Asp

Leu

Val

Val

His

Ser

195

200

205

Ala

Thr

Lys

Tyr

Leu

Ser

Gly

His

Gly Asp

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

210

215

220

Val

Gly Arg Lys

Ala

Leu

Val

Asp Arg

I le

Arg

Leu

Glu

Gly

Leu

Lys

225

230

235

240

Asp

Het

Thr Gly Ala Ala

Leu

Ser

Pro

His

Asp

Ala

Ala

Leu

Leu

Het

2«

250

255

Arg

Gly

Ile Lys

Thr

Leu Ala

Leu

Arg

Het

Asp Arg

His

Cys

Ale

Asn

260

265

270

Ala

Leu

Glu Val

Ala

Gin

Phe

Leu

Ala

Gly

Gin

Pro

Gin

Val

Glu

Leu

275

280

285

Ile

His

Tyr

Pro

Gly

Leu

Pro

Ser

Phe Ala

Gin

Tyr

Glu

Leu Ala

Gin

290

295

300

Arg

Gin

Het

Arg

Leu

Pro

Gly

Gly

Het

Ile

Ala

Phe

Glu

Leu

Lys

Gly

305

310

315

320

Gly

Ile

Gtu

Ala

Gly

Arg

Gly

Phe

Het

Asn

Ala

Leu

Gin

Leu

Phe

Ala

325

330

335

Arg

Ala

Val

Ser

Leu

Gly

Asp

Ala

Glu

Ser

Leu

Ala

Gin

His

Pro

Ala

340

345

3SG

Ser

Het

Thr

His

Ser

Ser

Tyr

Thr

Pro

Gin

Glu

Arg

Ala

His

His

Gly

355

360

365

Ile

Ser

Glu

Gly

Leu

Val

Arg

leu

Ser

Val

Gly

Leu

Glu

Asp

Val

Glu

370

375

380

Asp

Leu

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Cys

Ala

385

390

395

Claims (8)

1. Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyázový (METázový) polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 5, nebo sekvenci v podstatě stejnou, a mající schopnost degradovat methionin (MET).

2. METázový polypeptid podle nároku 1, kterým je rekombinantní polypeptid.

3. METázový polypeptid podle nároku 1, který je kódován polynukleotidem majícím sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.

4. METázový polypeptid podle nároku 3, který je exprimován v prokaryotu.

5. Polynukleotid, který kóduje katalyticky aktivní METázový polypeptid podle nároku 1, který má nukleotidovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.

6. Farmaceutický prostředek pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza, vyznačující setím, že zahrnuje směs terapeuticky účinného množství METázového polypeptidu podle nároku 1 a terapeuticky účinného množství methylthioadenosinu (MTA) ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

7. Souprava pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy (MTAzy) ve vzorku buněk savce, vyznačující se t í m, že zahrnuje oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují snukleotidovou sekvencí, která kóduje MTAzu, znázorněnou jako SEQ ID č. 1.

8. Použití směsi terapeuticky účinného množství METázového polypeptidu podle nároku 1 a terapeuticky účinného množství MTA ve farmaceuticky přijatelném nosiči pro přípravu farmaceutického prostředku pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza.

4 výkresy