JPS61122224A - 部位選択性プラスミノ−ゲン活性化因子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、動物血液（ヒト血液も含める）中のプラスミ
ノーゲンを活性化し、投与時にフィブリン溶解が望まし
い特異な部位にプラスミノーゲン活性化因子を選択的に
作用させ得るような、ウロキナーゼとストレプトキナー
ゼ抗体接合体に関する。さらに、本発明はこのような接
合体の製造方法及び治療用途に関する。

［従来の技術及び発明の解決しようとする問題点〕 ウロキナーゼは公知のプラスミノーゲン活性化因子であ
る。ウロキナーゼは特に肺塞栓症、心筋梗塞、深在静脈
血栓症及び末梢動脈閉塞の治療に対する臨床用途を有し
ている。しかし、入手される形態のウロキナーゼはその
作用部位に関してかなり非選択的である。従って冠動脈
内に局在するフィブリン塊のような、局在したフィブリ
ン塊を溶解し得る程のウロキナーゼを投与するためには
、望ましい反応部位における究極的な有効量をはるかに
越える多量の投与量がが必要になる。さらに、ウロキナ
ーゼは循環系の環境内では約１０分間程度の非常に短い
半減期を特徴とする。このために有効投与量として必要
な量（及びコスト）はさらに増大することになる。薬剤
を一般的に特異な細胞上の抗原に直接作用させる抗体法
については、幾つかの提案及び可能な適用が行われてい
るが、ウロキナーゼをフィブリン塊に直接作用させるよ
うな一般的な方法の適用は今までに試みられていない。

これには幾つかの理由が考えられる。今までに提案され
た、または開発された抗体直接作用法は大抵（全部では
ないとしても）、活性物質をかなり簡単に直接作用させ
ることに限定されていた。例えば、ヴイテソタ（Ｖｉｔ
ｅＬｔａ　）等は「イムノトキシン：癌治療の新しいア
プローチ」〔サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２１９
号、６４４頁〕の中で、毒性成分としてリジンを用いる
実験を述べ、この他の種々な毒性成分を挙げている。こ
のような成分は、時には自然に酵素によって複雑にある
いはかなり容易に分解されるが、標的物質（例えば癌細
胞）に直接作用する機序、あるいはウロキナーゼの作用
機序とは非常に異なる作用機序を存している。しかし、
ウロキナーゼは循環する前酵素プラスミノーゲンを活性
化することによってフィブリンの破壊に間接的にのみ作
用するので、ウロキナーゼ作用は非常に異なっている。

ウロキナーゼ抗体結合物質は循環プラスミノーゲンを活
性化しなければならないが、これだけではなくプラスミ
ンのフィブリン溶解作用を妨げるものであってはならな
い。

血流中でのウロキナーゼの半減期が非常に短いことは、
抗体法によって克服できないと予想される障害である。

いずれにせよ、有効な臨床使用を実現するためにウロキ
ナーゼに抗体法を適用することが重要であるとは考えら
れない。

もうひとつの公知のプラスミノーゲン活性剤はストレプ
トキナーゼである。ストレプトキナ；　　　−ヤ、、、
ヤオ、。や６、。。、２．。６も含めた血流中でのスト
レプトキナーゼ反応はウロキナーゼ反応とは同じではな
いが、それにも拘らず本発明の原理はストレプトキナー
ゼにも適用できるものである。

［問題点を解決するための手段］ 今までに知られている先行の研究者とは異なって、本発
明者は、フィブリンまたはミオシンに特異的なモノクロ
ーン抗体をウロキナーゼと結合させると、プラスミン作
用を妨げることなくプラスミノーゲンを活性化させると
いう部位選択性のウロキナーゼ作用が生じ、これによっ
て少量のヒト及び動物における臨床的に有効な量でのウ
ロキナーゼ（またはストレプトキナーゼ）療法が可能に
なることを結論した。本発明では特に、ウロキナーゼ必
要量をモノクローン抗体による部位選択性によって減す
ることができるのみでなく、さらにこの接合体がヒトの
血清環境において意外に良好な安定性を有することを開
示する。このような２つの効果が相乗的に作用して、フ
ィブリン塊の溶解に必要なウロキナーゼ（またはストレ
プトキナーゼ）の量を実質的に減少させるという効力増
強作用が生ずるのである。さらに、本願では本発明の好
ましい実施態様で用いる結合剤について述べる。

本発明は、マウスまたは他の適当な動物に投与し、後に
これらの動物を殺して、脾臓から抗体産生細胞を得るこ
とによる、ヒトまたは他の動物のフィブリンまたはミオ
シンに対する抗体製造法に関するものである。得られた
抗体産生細胞を次に同じ種属の骨髄腫細胞と融合させ、
望ましい生成細胞をクローン化させて、目的のモノクロ
ーン抗体を産生ずる連続的な、すなわち永久的に続（細
胞ラインを得る。このようなモノクローン抗体とウロキ
ナーゼ（またはストレプトキナーゼ）から、ウロキナー
ゼ（またはストレプトキナーゼ）のプラスミノーゲン活
性化作用と、部位特異性を共に備え、意外にもヒト血清
中で非常に長い生存期間を示す接合体を製造するもので
ある。

本発明によると、処置すべきヒトまたは動物のフィブリ
ンのフラグメントまたは心臓ミオシンによって、第二種
属の動物（例えばマウス）を免疫化することによって抗
体を製造する。第二種属の骨髄腫細胞を免疫化第二種属
の脾臓細胞と融合させると、抗体を産生ずる永久的な雑
種細胞が得られる。この雑種細胞をクローン化し、選択
し及びサブクローン化することによって、標的たんぱく
質に特異的であるが、フィブリノーゲンには非特異的で
ある抗体を産生ずる雑種細胞が得られる。抗体をサブク
ローン培養培地から単離し、ウロキナーゼ（またはスト
レプトキナーゼ）と結合させると、本発明の部位選択性
プラスミノーゲン活性化複合体（活性化因子）が得られ
る。これらの段階を実施するために特に実例となるよう
な方法を次の実施例に示す。

市販されている高純度のヒトフィブリノーゲンをトロン
ビンの作用によってフィブリンに転化させる。フィブリ
ンを７０％ギ酸中に、１％のたんぱく質濃度になるよう
に溶解する。臭化シアン（１，３ｇ／　１００ｍ１　）
を室温で撹拌しながら加え、混合物を２４時間反応させ
る。回転式蒸発器を用いて溶液を蒸発させ、残渣を１０
％酢酸に加え、１０％酢酸と平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１００内でゲル濾過する。

（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ分画を濃縮し、セファデックス（ＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上でのイオン交換クロマトグ
ラフィーによって塩勾配を利用して、さらに精製する。

これらの方法はブロムバック（Ｂ　ｌｏｍｂａｃｋ　）
等〔生物化学誌（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２４
７．１４９６頁（１９７２年）：生物化学誌（Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２４８．５８０６頁（１９７３
年）〕及び　クドリック（Ｋｕｄｒｙｋ）等（分子免疫
学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　２
０＋　１１９１頁（１９８３年）〕の方法に従ったもの
である。

（フィブリンペプチド−ＭＢ−ＫＬＨ）による「ヒトフ
ィブリン抗体を誘導する抗原の製造ヒトフィブリンのβ
鎖のアミン末端部と同じのアミノ酸配列を有するヘプタ
ペプチドを標準的なメリフィールド固相方法〔メリフィ
ールド、アメリカ化学誌（Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　）９５．２１４９頁（１９６２年）；スチュ
ワート及びヤング（Ｊ、Ｍ、　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｊ、
　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ）　＋固相ペプーチ」二倫ソ逸フリ
ーマン出版、サンフランシスコ、約１９６９年、２７−
６２頁〕によって、化学的に合成する。ペプチドのカル
ボキシル末端リジル残基にシステイニル残基を付加させ
て、このペプチドをマレイミドベンゾイル化キーホール
リムペット・ヘモシアニン（ＭＢ−ＫＬＨ）に共有結合
させる。

このフィブリン様ペプチドのような、特異的な配列を有
する合成ペプチドは例えばリサーチ・プラス（Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｐｌｕｓ　Ｌｕｂｓ）社にュージャージー州
、ベイヨン）のような会社から市販されている。結合手
段としては、０．０５　Ｍリン酸塩緩衝液０．２５ｍ１
に溶かしたキーホールリムベット・ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）　５５ｍｇとｍ−マレイミドヘンシイルーＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）　（テトラヒ
ドロフラン１ｍｌ中にＭＢＳ　５ｍｇ）を、１／４０の
ＫＬＩＩ／ＭＢＳの比で、室温において３０分間反応さ
せる。生成したＭＢ−ＫＬＨ中間体をセファデックス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５上でのゲル濾過クロマト
グラフィによって単離する。０．１Ｍリン酸塩緩衝溶液
０．５ｍｌに溶かした合成ペプチド５ｍｇをＭＢ−ＫＬ
Ｈと混合し、室温において３時間インキュベートする。

この反応の生成物が抗原のフィブリンペプチド−ＭＢ−
ＫＬＨである。この方法はシイ（ＫｗａｎＨ，Ｈｕｉ）
等〔サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２１１２９−
３９頁（１９８３年））が述べているものである。

家兎心臓ミオシンの精製法として述べられている方法〔
ウィクマンーコフエルトＵ、　Ｗｉｋｍａｎ−Ｃｏｆｆ
ｅｌｔ）等、生物化学生物物理調査誌（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）　５
１１０９７−１１０４頁１９７３）　）を用いて、ヒト
心臓からのヒト心臓ミオシンを精製する。この方法はヒ
ト心臓のＭｌ織をリン酸塩緩衝液中に均質化し、これを
遠心分離によって分画化し、硫酸アンモニウムを加え、
希薄なイオン溶液からミオシンを結晶化させる。

得られた結晶化生成物を抗原として用いる。

肺細胞を製造する方法のひとつでは、例えば上述の実施
例のひとつによって製造した抗原を最初は１００μｇ用
量で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔的注入する。抗原はリ
ン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）と完全フロインドアジュ
バントのｌ：１混合物に懸濁させる；二次用量は１か月
後に投与する。抗原をブースター静注した３日後に、マ
ウスを殺し、脾臓を取り出した。ステンレススチール製
メソシュから脾臓組織を押し出して、ｌＩ！臓細胞の単
細胞懸濁液を調整した。

上述の実施例はヒトフィブリンまたはミオシンに対して
抗体活性を有する脾臓細胞を得るための通常の公知の方
法を説明するものであり、それ自体では本発明の一部を
構成するものではない。このような方法の説明として、
例えば、フィ（Ｋｗａｎ　Ｈ，Ｈｕｉ）等〔サイエンス
誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２、１１２９−３２頁（１９
８３年）〕及びクドリック（Ｂ。

Ｋｕｄ−ｒｙｋ）等〔分子免疫学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｕ８９真（１９８４年）〕
が参考になる。さらに、この説明は、ラットのような他
の動物またはヒトも選択できるとしても、抗体産生動物
としてマウスに限定されたものである。

例えば、上述のようにして製造した脾臓細胞をマウスの
骨髄細胞ラインＰ３−ＮＳＩ／４−ＡＧ−４−１と融合
させる。例えば、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）等の融合
方法〔免疫字詰（Ｊ、　Ｌｍｍｕｎｏｌ、）、　１２Ｂ
＋　２７０９−２７１３頁（１９８２）　）の次のよう
な改良法を用いることができる。特に、３５％ポリエチ
レングリ（ヨーｔ、１０００よ、わ、ケア５ニアいオあ
つ）’ｆｐｐ□１１６４０培地に加えた融合培地０．５
ｍｌ中で、脾臓細胞２億個を骨髄細胞２０００万個に融
合させる。細胞融合後に、ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジン（）ＩＡＴ　）を含む培地中で、５％
二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃においてこれらの細
胞を数週間培養する。次に培養上清の５０μｌアリコー
トを取り出し、これをフィブリン免疫化細胞の場合には
重合フィブリンまたは吸収フィブリノーゲンのいずれか
を含み、ミオシン免疫化細胞の場合には心臓ミオシンを
含むマイクロタイター凹み（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗ
ｅｌｌ　）に加えることによって、雑種コロニーに対し
て抗体産生に関するスクリーニングを行う。

３７゛Ｃにおいて３０〜９０分間インキユヘートした後
、、プレートを洗浄し、酵素が結合したヤギ抗マウス免
疫グロブリン（Ｉｇ−ペルオキシダーゼ）の調整物を加
え、プレートを３７℃においてインキュベートし、再び
洗浄する。次にペルオキシダーゼの代わりに色素体基質
混合物（例えば、０．０４％０−フェニレンジアミン及
び０．０１２％過酸化水素を含む、ｐｕ５．ｏの０．０
５　Ｍリン酸ナトリウム−０，０２４Ｍクエン酸塩緩衝
液）をこの凹みに加える。この基質混合物とのインキュ
ベーション時に発生した発色度によってフィブリン（ま
たはミオシン）及びフィブリノーゲンに対する抗体の量
的及び質的存在とモニターする。

フィブリン（またはミオシン）に対する抗体を産生ずる
がフィブリノーゲンに対する抗体を産生じないことが判
明したコロニーをクローン化し、クローン化コロニーを
フィブリン（またはミオシン）に対する抗体産生に関し
て再テストする。フィブリンフラグメントに対する抗体
に関して陽性であるが精製フィブリノーゲンに対する抗
体に関しては陰性であるクローン、またはミオシンＨ鎖
を識別するがＬ鎖を識別しないクローンをサブクローン
化し、組織培養で増殖させる。適当なりローンのサンプ
ルは総て、後の使用に備えて凍結する。

上述のクローニング法自体はコーラ−（Ｋｏｈ−１ｅｒ
　）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の論文〔自
然学（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６４９５−４９７頁（１９
７５年）〕及びさらに最近の刊行物に述べられているも
のである。モノクローン抗体法は現在発展して、これら
の試薬が製造されて種々の目的に用いられるまでになっ
ている〔カング及びゴルシュタイン（Ｐ、　Ｃ−Ｋｕｎ
ｇとＧ、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）、米国特許明細書筒４
．３８１．２８５号（１９８３年）参照〕。上述の公知
の特異的なりローユング法はそれ自体で、本発明の一部
をなすものではない。もちろん、マウス以外の動物を抗
体産生に用いることができるとしても、パイブリドーマ
を得たのと同じ動物種を一般に骨髄腫供給源にしなけれ
ばならない。

ウロキナーゼと家兎の抗ヒトフィブリノーゲンは結合試
薬としてＮ−スクシンイミジル・３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いて、適切に結
合させることができる。これはカールソン（Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ）等が開発したヘテロニ官能性試薬である〔「た
んぱくチオール化と可逆的なたんぱく−たんぱく共役、
新規なペテロ会官能性試薬：Ｎ−スクシンイミジル・３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート」生物化字詰
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　　１７３７２３頁（１９７
８年）〕。この試薬はたんぱく質の両アミノ基とスルフ
ヒドリル基と反応することができる。この種類の試薬は
、特に被接合たんぱく質の一方がＭ離スルフヒドリル基
または遊離アミノ基のいずれかを有していない場合に生
じ得る分子内架橋量を減する。ウロキナーゼは遊離アミ
ノ基を有しているが、遊離スルフヒドリル基を有してい
ない。

そのため、ＳＰＤＰはウロキナーゼと反応して、ウロキ
ナーゼのアミノ残基を介してウロキナーゼ１分子につき
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基が１つまた
はそれ以上共有結合した誘導体を形成する。ウロキナー
ゼとＳＰＤＰが適切に反応すると、３−（２−ピリジル
ジチオ）−プロピオニル−ウロキナーゼ（ＰＤＴＰ−Ｖ
Ｋ　）が生ずる。家兎抗ヒトフィブリノーゲンを混合す
る前に、ＰＤＴＰ−ＵＫを大規模に透析して、過剰なｓ
ｐ叶を除去する。家兎抗ヒトフィブリノーゲン（ＲＡＨ
Ｆ）をジチオスレイトールによって緩和に還元して、ス
ルフヒドリル基を抗体分子に暴露させる。家兎抗ヒトフ
ィブリノーゲンをＰＤＴＰ−１１にの反応によって次の
化合物が生ずる筈であり、実際に生したと考えられる。

ＵＫ　−ＮＨ−Ｃ−Ｃ，Ｈｚ　−ＣＨｚ　−Ｓ　−Ｓ　
−ＲＡＨＦ上述のウロキナーゼ（ＵＫ）と家兎抗ヒトフ
ィブリノーゲン（ＲＡＨＦ）の適切な接合に用いたＳＰ
ＤＰ結合方法は、ジョー（旧−Ｈｅｒ　Ｊａｕ）　［酵
素学方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）９２）ラゴン（Ｊ、Ｊ。

Ｌａｇｏｎｅ）とヴアナキス（Ｈ，Ｖａｎ　Ｖａｎａｋ
ｉｓ）、　　Ｃアカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ）にューヨーク）　（１９８３）　、　
２５７頁〕とファーマシア・ファイン・ケミカルズ（（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａＩｓ
）社にュージャージー州、ビス力タウエイ）〕によって
開発されたものである。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含
有するｐＨ７，２のＯ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液
０．５ｍｌ中の約ｉｏｏ、ｏｏｏｃＴへ単位のウロキナ
ーゼを１０ｍＭ　ＳＰＤＰ（エタノール中）０．０１５
ｍ１と室温において３０分間反応させた。混合物を０．
１５Ｍ塩化ナトリウム含有のｐＨ７，５の０．１ＦＩリ
ン酸ナトリウム緩衝溶液（ＰＢＳ　）に対して４℃にお
いて一晩透析した。フィブリノーゲン（ＰＢＳ中に９ｍ
ｇ／ｍｌ）に対する抗体を室温において１時間、０．１
Ｍジチオスレイトール中でインキュベートすることによ
って、一部還元した。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ−２５上でゲル濾過して、過剰なジチオスレイト
ールを除去した後、還元抗体１　、７ｍｇを透析したＰ
ＤＴＰ−ＵＫ中間体と混合し、この混合物を室温におい
て２４時間インキュベートした。インキュベーション後
に得られた反応混合物は目的物であるウロキナーゼ−抗
体を含んでいた。上述の反応混合物のウロキナーゼ活性
に関するテストは、最初のウロキナーゼ活性の２２％以
上が回復可能であることを示している。

この接合体をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−
２００上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって未反
応物から骨部した。

ウロキナーゼ−抗フィブリノーゲン接合体をテストして
、官能性家兎抗ヒトフィブリノーゲン抗体が存在する程
度を測定し、ウロキナーゼ活性を特徴づけた。次に、プ
レートをリン酸塩緩衝化食塩水にフィブリノーゲンを加
えた溶液と共にインキュベートすることによって、マイ
クロタイター・プレート凹みをヒトフィブリノーゲンで
被覆した。このプレートを完全にすすぎ洗いして未結合
フィブリノーゲンを除去し、次に接合体のサンプルがま
たは未結合家兎抗ヒトフィブリノーゲンとウロキナーゼ
の混合物のいずれかをフィブリノーゲン被覆凹みに加え
た。

３７℃で９０分間インキュベートした後に、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ　２０含有のリン酸塩緩衝化食塩水でプレー
トを再び大規模に洗浄した。この凹みを（１１バール（
Ｄ、Ｐａａｒ）とマルタ（Ｄ、Ｍａｒｕｋｎ）が生物化
字詰（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ）　１８．５５７頁（１９８０年）に述べて
いる一般的な方法によるウロキナーゼ・アミダーゼ活性
、（２）ウオール（Ｒ。

Ｃ，ＷｏｈｌＬスマリア（Ｃ，Ｓｕｍｍａｒｉａ）とロ
ビンスに、　Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ）が生物化字詰（Ｊｌ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５５、２００５頁（１
９８０年）に述べている一般的な方法によるウロキナー
ゼ・プラスミノーゲン活性化因子活性、及び（３）結合
した家兎抗ヒトフィブリノーゲンに関してテストした。

ウロキナーゼ・アミダーゼ活性は相対的なウロキナーゼ
選択性基質Ｓ−２４４４（ピログルタミル−グリシル−
アルギニル−ｐ−ニトロアニリド）を用いて測定した。

ウロキナーゼによるＳ−２４４４の加水分解は、Ｓ−２
４４４からｐ−ニトロアニリンの放出によって生ずる４
０５頁ｍの吸収の増加を観察することによってモニター
した。これらの分析結果は下記の表１に示す。対照凹み
では未結合ウロキナーゼ及びこの複合体中に存在すると
算出されたよりも６００倍まで多い家兎抗ヒトフィブリ
ノーゲン抗体をテストし、ウロキナーゼ抗ヒトフィブリ
ノーゲン複合体と同様な方法で洗浄した。洗浄した対照
凹みは検出され得る程の家兎免疫グロブ５　　　　　　
″ノ′を含有１ず・表１９示すよう４゛つ°１ナーゼ活
性に対して実際に陰性であった。

プラスミノーゲンをこの凹みに加えることによって、ウ
ロキナーゼ−家兎抗ヒトフィブリノーゲンのウロキナー
ゼプラスミノーゲン活性化因子活性を測定し、次に１５
分間インキエヘートした後に、凹みにプラスミン基質Ｓ
−２２５１（ＩＩ−Ｄ−シミｌ−１ｅｕ−１ｙｓ−ｐ−
ニトロアニリド）を加えて、プラスミン活性を測定した
。Ｓ−２４４４の場合と同様に、Ｓ〜２２５１の加水分
解を４０５頁ｍの吸光度の増加によってモニターした。

この結果は、この複合体がプラスミノーゲン活性化因子
活性を有することを示している。

に一り のウロキナーゼ・アミダーゼ活性 ＋　４０５頁ｍにおける吸光度 血漿中でのウロキナーゼの安定性すなわち血漿による非
修飾ウロキナーゼの抑制が報告されている。例えばウォ
ーラー（Ｅ、に、　Ｗａｌｌｅｒ　）等、生物化字詰（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）　２１５１２３頁（１９８３
年）：村！Ｌ’Ｆ　（Ｇ、Ｍｕｒａｎｏ）等、血液（Ｂ
ｌｏｏｄ）　５５．４３０頁（１９８０年）〔血漿によ
るウロキナーゼ抑制〕及びフェルストレーテ（Ｍ、　Ｖ
ｅｒｓｔｒａｅｔｅ　）　　ｒフィブリン溶解」クライ
ン（Ｄ、Ｌ、　Ｋ１１ｎｅ　）とレディ（Ｋ、Ｎ、　Ｎ
、　Ｒｅｄｄｙ　）　ｋｌａ集、シーアールシー・プレ
ス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）　（オハイオ州クリーブランド
）出版、１９８０年、１８７頁〔血漿からウロキナーゼ
のクリアランス〕を参照のこと。ヒト血漿中のウロキナ
ーゼ−抗体物質の安定性が非修飾ウロキナーゼの安定性
よりも非常に大きいことをテストが示したことは、特に
重要である。このようなテストでは、抗凝固剤としてヘ
パリンを用いて（全血５０ｍ　ｌにつきヘパリン２００
０単位）ヒト血を採取し、形成された要素を遠心分離に
よって取り出した。ウロキナーゼまたはウロキナーゼ−
°家兎抗ヒトフィブリノーゲンを３７℃において血漿と
ともにインキュベートした。匹敵し得るウロキナーゼ活
性単位を含むアリコートを種々なインキュベーション時
間後に取り出し残留するウロキナーゼ活性を小アミダー
ゼ粘質、１．−ｐｙｒｏｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｐ−
ニトロアニリドを用いてＷ（Ｉ＋定した。結果はウロキ
ナーゼがウロキナーゼ−家兎抗ヒトフィブリノーゲン複
合体よりもかなり急速に、大きな程度で不活化されるこ
とを示した。

特に、ヒト血漿とともに生体外でインキュベートした未
結合ウロキナーゼに関しては、３時間のインキュベーシ
ョン後に約３０％のウロキナーゼ活性が残留することを
テストは示している。

同じ条件下で、上述のように製造した接合体のウロキナ
ーゼ活性は約８０％残留した。生体外と生体内では条件
は異なるが（一部は、生体内の血液中では問題のたんぱ
く質の実際の排泄または、クリアランスが生じるため）
、生体外の血漿中でのウロキナーゼの安定性と生体内の
半減期との間には実際に相互関係が存在する。例えばウ
ォーラー（Ｅ、　Ｅ、　Ｗａｌｌｅｒ）等生物化字詰（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）　　２１５．１２３頁（１９
８３年）；、村野（Ｇ、　Ｍｕｒａｎｏ　）等、血液（
Ｂｌｏｏｄ）　５５．４３０　ＷＬ（１９８０年）及び
フェルストレーテ（Ｍ、　Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）「フ
ィブリン溶解」クライン（Ｄ、Ｌ、　Ｋ１１ｎｅ　）と
レディ（Ｋ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｒｅｄｄｙ　）　ｋｍ集、
シーアールシー・プレス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）　　（オ
ハイオ州クリーブランド）出版（１９８０年＞　１８７
　頁参照のこと。

結合剤としては、ウロキナーゼのアミノ基と反応する官
能基を有する結合剤がウロキナーゼ−抗体接合体製造に
対して最も効果的であると考えられる。ヘテロニ官能性
物質５ｐｏｐによって行ったように、チオール基をウロ
キナーゼに導入することができるが、最初の反応はウロ
キナーゼのアミノ基に関係する。ゲルタールアルデヒド
のようなホモニ官能性基に活性な接合体を形成させるよ
うな反応条件は発見されているが、分子内反応が生成す
る接合体の酵素活性を大きく減するまたは排除すると思
われる。このため、本発明の望ましい実施態様によると
、結合剤はウロキナーゼのアミノ基と反応し、次に抗体
のスルフヒドリル基と反応する、例えば５ｐｏｐもしく
はスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート（ＳＭＰＢ）のようなヘテロニ官能性物質で
ある。抗体のスルフヒドリル基と反応する結合剤の官能
基はＳＰ叶におけるようなジスルフィド、ＳＭＰＢにお
けるようなマレイミドまたはこの他の同様な活性を有す
る基である。抗体に他の酵素が非常に適切に結合するこ
とは、結合反応において抗体分子が非常にフレキシブル
であることを示している。結合が抗体たんぱく質のアミ
ノ基またはスルフヒドリル基のいずれを介して行われた
場合にも、抗体の特異性は保有されている。二官能性結
合剤の官能基間のスペーサー基の変化は全く重要でない
ように思われ、゛活性なウロキナーゼ−抗体接合体の形
成を可能にするような多くの変化が可能である。

たんぱく質の化学的な架橋に用いられている二官能性試
薬をレヴユーしたものとして、ハン（Ｈａｎ　）等の国
際生物化字詰（Ｉｎｋ、　Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ、）匡１２
９−１４５頁−（１９８４年）を参照されたい。このよ
うな試薬を用いた場合には（好ましくは上述のように、
ウロキナーゼのアミノ基と反応する官能基を有するよう
に選択して）、濃度、温度、時間、ｐＨ等のような反応
条件を効果的な結合が行われるように選択する必要があ
る。例えば、結合剤としてゲルタールアルデヒドを用い
た最初の実験では、好ましからざる沈澱及び不活化が発
見されている。結合剤としてＮ、Ｎ’−ｏ−フェニレン
ジマレイミドを用いてウロキナーゼと抗体の結合を試み
た場合に、高分子量分画（結合した物質の存在が予想さ
れる）にはウロキナーゼ活性が検出されなかった。

実施例　■ ストレプトキナーゼに対する本発明の詳細な説明するた
めに、次の実験を行った。β−溶血性連鎖球菌からのス
トレプトキナーゼを安定剤として５０％ヒト血清アルブ
ミンを含有する凍結乾燥粉末としてシグマ・ケミカル・
カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）から入手した。Ａｆｆｉゲルブルー・クロマト
グラフィによってアルブミンを抽出じだ・：カステリノ
、ソデソツ、ブロックウェイ、シーツリング、（Ｃａｓ
ｔｅｌｌｉｎｏ、　Ｆ、Ｊ、。

５ｏｄｅｔｚ＋　Ｊ、　Ｍｔ＋　Ｂｒｏｃｋ−ｗａｙ＋
　Ｗ、　Ｊ、、　Ｓｉｅｆｒｉｎｇ。

Ｇ、　Ｆ、　Ｊｒ、、）酵素学方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ）　　４５中のストレプ
トキナーゼ、ラスズロ・ローランド（Ｌａｓｚｌｏ　Ｌ
ｏｒａｎｄ）　編集アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　にューヨーク）（１９７６年）
２４４頁〕。ストレプトキナーゼ作用を測定するために
用いた二段階分析方法は、ジャクリン（Ｊａｃｋｓｏｎ
　）　、エズモン（Ｅｓｍｏｎ　）とタング（Ｔａｎｇ
）が述べている方法と実際に同じであった〔酵素学方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｖ）　８
０中のストレプトキナーゼとスタフィロキナーゼ、ｈ　
　　　　　ラスズロ・ローランド（Ｌａｓｚｌｏ　Ｌｏ
ｒａｎｄ）　）７４集、アカデミツクプレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　にニーヨーク’）　（１９８
１年）　、　３Ｂ？頁）〕。この方法ではプラスミン特
異性基質Ｄ−ｖａｌ−１ｅｕ−１ｙｓ−ｐ−ニトロアニ
リド（Ｋａｂｉ　５２２５１）を用いる。５ｐｏｐを用
いる結合方法はウロキナーゼと家兎抗ヒトフィブリノー
ゲンに関して上述した方法と実際に同じであった。リン
酸塩緩衝化食塩水　０．７ｍｌに１．６ｍｇの濃度の凍
結乾燥した精製ストレプトキナーゼを、ｓｐ叶の１０ｍ
Ｍエタノール溶液０．０１ｍ１と結合した。この混合物
を室温で３０分間インキュベートし、次にリン酸塩緩衝
化食塩水１１に対して４°Ｃにおいて一晩透析した。

家兎抗体−ヒトフィブリノーゲンをジチオスレイトール
によって前処理及び透析してから、透析したＰＵＴＰス
トレプトキナーゼと結合させ、混合物を室温で一晩イン
キユベートした。次に、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００
を用いて反応混合物をクログラフィ分析した。初期スト
レプトキナーゼ活性の約５％が５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
２００カラムから回収され、約３％の活性がストレプト
キナーゼ−抗ヒトフィブリノーゲン接合体として存在し
た。

従ってウロキナーゼ接合体の活性測定手段として上述し
た方法と同じマイクロタイタープレート法を用いた場合
に、ストレプトキナーゼ−抗ヒトフィブリノーゲン接合
体がヒトフィブリノーゲンと結合すること及びプラスミ
ノーゲン活性化力を保有することが判明した。

［発明の効果ｊ 以上のような本発明により提供される新規な部位選択性
プラスミノーゲン活性化因子により、プラスミン作用を
妨げることなく、しかも従来の如く多量のウロキナーゼ
（ストレプトキナーゼ）を用いることなくプラスミノー
ゲンを活性化することができる。よって臨床で有効策に
よりウロキナーゼ（ストレプトキナーゼ）での治療を行
うことが可能となり、しかも本発明の因子は半減期が比
較的長く、ヒト血清中での安定性をも示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ひとつの動物種属のフィブリン及び心臓ミオシンか
   ら選択した標的たんぱく質に対して特異的であり血漿中
   での比較的長いウロキナーゼ半減期を特徴とするモノク
   ローン抗体−ウロキナーゼ接合体の製造方法において、
   標的たんぱく質によって第二種属の動物を免疫化し、第
   二種属動物の骨髄腫細胞を免疫化第二種属動物からの脾
   臓細胞と融合させて抗体を産生する永久的な雑種細胞を
   得、雑種細胞をクローン化し、標的たんぱく質に対して
   特異的であるがフィブリノーゲンに対して非特異的な抗
   体を産生する雑種細胞のクローンを選択して培地内でサ
   ブクローン化し、このようにして産生した抗体を単離し
   、モノクローン抗体をウロキナーゼに結合させる段階か
   ら成る、部位選択性プラスミノーゲン活性化因子の製造
   方法。 ２　結合剤がウロキナーゼのアミノ基と反応する基を有
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　ひとつの動物種属のフィブリン及び心臓ミオシンか
   ら選択した標的たんぱく質に対して特異的である酵素ウ
   ロキナーゼ及びストレプトキナーゼから選択され、血漿
   中での比較的長いウロキナーゼ半減期を特徴とするモノ
   クローン抗体−酵素接合体の製造方法において、標的た
   んぱく質によって第二種属の動物を免疫化し、第二種属
   動物の骨髄腫細胞を免疫化第二種属動物からの脾臓細胞
   と融合させて抗体を産生する永久的な雑種細胞を得、雑
   種細胞をクローン化し、標的たんぱく質に対して特異的
   であるがフィブリノーゲンに対して非特異的な抗体を産
   生する雑種細胞のクローンを選択して培地内でサブクロ
   ーン化し、このようにして産生した抗体を単離し、モノ
   クローン抗体を選択された酵素に結合させる段階から成
   る、部位選択性プラスミノーゲン活性化因子の製造方法
   。 ４　第二種属の動物がマウスである特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５　結合剤がＳＰＤＰである特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ６　結合剤がＳＭＰＢである特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ７　第二種属動物を標的たんぱく質によって免疫化し、
   このように免疫化した第二種属動物からの脾臓細胞と第
   二種属動物の骨髄腫細胞を融合させて抗体を産生する永
   久的な雑種細胞を得、雑種細胞をクローン化し、標的た
   んぱく質に対して特異的であるがフィブリノーゲンに対
   して非特異的な抗体を産生する雑種細胞のクローンを選
   択して培地内でサブクローン化し、このようにして産生
   した抗体を単離し、ウロキナーゼとストレプトキナーゼ
   から成る群から選択した酵素とモノクローン抗体を結合
   させて得られた反応生成物であって、フィブリンと心臓
   ミオシンから選択した標的たんぱく質によって識弁され
   る動物種属において部位選択性作用によるフィブリン溶
   解に適した治療用物質である、部位選択性プラスミノー
   ゲン活性化因子。 ８　酵素がウロキナーゼであり、結合剤がウロキナーゼ
   のアミノ基と反応する基を有する、特許請求の範囲第７
   項記載の部位選択性プラスミノーゲン活性化因子。 ９　結合剤がＳＰＤＰである特許請求の範囲第７項記載
   の部位選択性プラスミノーゲン活性化因子。 １０　結合剤がＳＭＰＢである特許請求の範囲第７項記
   載の部位選択性プラスミノーゲン活性化因子。 １１　特許請求の範囲第７項記載の治療用物質の有効量
   を動物に投与することによるフィブリン溶解方法。