JPH04218389A - 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は二重特異性を有するハイ
ブリッドモノクローナル抗体に関する。さらに詳しくは
二重特異性の一方が活性化血小板に対するものであり、
他方が血栓溶解作用を有する物質に対するものであるハ
イブリッドモノクローナル抗体（以下、ハイブリッドＭ
ｏＡｂと略記することがある）に関する。本発明はまた
、上記のハイブリッドＭｏＡｂに血栓溶解作用を有する
物質を免疫結合させてなる血栓溶解剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血栓溶解療法は古くから心筋梗塞，動脈
塞栓症，脳梗塞などの血栓性疾患の治療法として用いら
れ、当初はストレプトキナーゼ（以下、ＳＫと略記する
ことがある）やウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記するこ
とがある）などが有用な血栓溶解剤として臨床応用され
た。特にＵＫはフィブリン溶解能が高いことから比較的
繁用されてきたが、フィブリンに対する選択性が低く、
フィブリノーゲンに対しても作用するため、投与患者に
出血傾向を生ぜしめる欠点を有している。かかる欠点を
踏まえて、次に第２世代の血栓溶解剤としてティッシュ
プラスミノーゲンアクチベータ（以下、ＴＰＡと略記す
ることがある）やプロウロキナーゼ（以下、ＰｒｏＵＫ
と略記することがある）が登場した。これらはＵＫに比
べてフィブリン選択性が高いため、ＵＫでみられた出血
傾向の副作用を軽減すると予測され、数多くの研究がな
された。特に最近では遺伝子組み換え技術を利用するこ
とによって大量生産の途が開かれたことから、臨床への
応用も盛んである〔Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏｏｐｅｒ
ａｔｉｖｅ　　Ｓｔｕｄｙ　　Ｇｒｏｕｐ　　ｆｏｒ　
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ
　　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ラ
ンセット（Ｔｈｅ　　Ｌａｎｃｅｔ），　Ｖｏｌ．　１
，８４２（１９８５）〕。しかしこれらの臨床応用の結
果、ＴＰＡなどにも幾つかの問題があることが分かって
きた。すなわち、■ＴＰＡの半減期は非常に短かく（２
〜３分），血栓溶解には多量のしかも長時間の投与が必
要なこと，■かかる大量療法では必ずしも出血傾向の低
減を期待できないことなどである。

【０００３】そこでさらに効果的な血栓溶解剤の研究・
開発がなされ、修飾ＴＰＡや，ＵＫあるいはＰｒｏＵＫ
とＴＰＡとのハイブリッド蛋白などが作製された。修飾
ＴＰＡに関しては、半減期低下の原因と考えられる糖鎖
構造を一部欠失したＴＰＡムテインを遺伝子工学的に作
製し、肝細胞などの糖鎖レセプターによる捕捉を避け、
血中動態の改善をはかっている。またＵＫ−ＴＰＡのハ
イブリッド蛋白ではＵＫの強い血栓溶解能とＴＰＡのフ
ィブリン親和性とを併用し、投与量の軽減を目指してい
る。これらの血栓溶解剤は従来のものと比べ若干の出血
傾向の減少をもたらすと期待できるが、大巾な改善につ
いてはさらに今後の研究・開発に待たれている。

【０００４】次に第３世代の血栓溶解剤として、抗体タ
ーゲッティングを利用した蛋白複合体が登場した。すな
わち実質的にフィブリノーゲンには反応せずフィブリン
にのみ高い親和性を有する抗体をＵＫ〔Ｃ．Ｂｏｄｅら
：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２９，７６５（１
９８５）〕やＴＰＡ〔Ｍ．　Ｓ．　Ｒｕｎｇｅら：プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス　　ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａ
ｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），　８４，７６５９（１９
８７）〕に化学結合させることにより、フィブリノーゲ
ンの分解を伴うことなくフィブリンのみを分解する血栓
溶解剤が開発された。かかる抗体ターゲッティング化血
栓溶解剤はｉｎ　　ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ実験で、いずれもＵＫやＴＰＡ単剤よりも３−１００
倍の効果を示したと報告されている。しかしながらこれ
らの蛋白複合体では、いずれも抗体と血栓溶解酵素とを
化学結合させており、従って■化学結合操作時に抗体活
性および酵素活性の低下を伴うこと，■抗体と酵素との
１：１蛋白複合体を収率良く得ることが困難なこと，あ
るいは■蛋白変性の結果、投与患者体内での代謝が早ま
ったり、免疫応答を惹起すること、などの欠点を有して
いる。

【０００５】そこで、一方の結合部位でフィブリンに結
合し、他方の結合部位で血栓溶解活性物質に結合できる
二重特異性ＭｏＡｂを作製し、この抗体に血栓溶解活性
物質を免疫結合させて、抗体活性および血栓溶解活性の
低下を伴わない二重特異性ＭｏＡｂと血栓溶解活性物質
との１：１免疫複合体を作製して、フィブリンに特異的
で副作用のない血栓溶解剤が開発された〔特表平２−５
００３２１号公報，ヨーロッパ特許第３６３７１２号公
開公報参照〕。

【０００６】上記の二重特異性ＭｏＡｂ−血栓溶解活性
物質免疫複合体は、フィブリノーゲンに対する反応性が
ほとんど無視しうることから、生体内でフィブリンを主
構成成分として形成される血栓の溶解に特異的かつ効率
的に作用する。しかしながら、生体内で形成される血栓
は血小板を伴うものがほとんどで、その中には血小板を
多量に（ｒｉｃｈ　に）包含し形成されるものもある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗フィブ
リン−抗血栓溶解活性物質二重特異性ＭｏＡｂによる血
栓溶解作用をさらに増強させるため、また血小板リッチ
な血栓の溶解を効率的に実施するために、一方の結合部
位で活性化血小板に特異的に反応し、他方の結合部位で
血栓溶解作用を有する物質に特異的に反応する二重特異
性ＭｏＡｂを作製し、さらにこの抗体に血栓溶解作用を
有する物質を１：１の割合で免疫結合させ、血栓に特異
的で効果的な血栓溶解剤の開発に成功し、さらに研究を
進め本発明を完成した。すなわち本発明は、二重特異性
を有するハイブリッド　ＭｏＡｂであって、二重特異性
の一方が活性化血小板に対するものであり、他方が血栓
溶解作用を有する物質に対するものである抗体を提供す
るものである。また本発明は、上記二重特異性ハイブリ
ッドモノクローナル抗体に血栓溶解作用を有する物質を
免疫結合させてなる血栓溶解剤を提供するものである。

【０００８】本発明における活性化血小板としては、血
液凝固に関与する血小板が挙げられ、例えばトロンビン
，コラーゲン，ＡＤＰ（アデノシン５′−２リン酸）な
ど（好ましくはトロンビン）で活性化された血小板が挙
げられる。また、活性化血小板に特異的なモノクローナ
ル抗体（抗活性化血小板ＭｏＡｂ）としては、活性化血
小板と特異的に結合し、非刺激血小板（ｒｅｓｔｉｎｇ
　　ｐｌａｔｅｌｅｔ）とは実質的に結合しないＭｏＡ
ｂが挙げられ、例えばトロンビンなどによる活性化に伴
って出現する血小板の膜蛋白〔Ｔ．　Ｍ．　Ｐａｌａｂ
ｒｉｃａら：プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス　　ユーエスエー（Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）
，　８６，１０３６（１９８９）；　Ｒ．　Ｐ．　Ｍｃ
Ｅｖｅｒ：スロンボーシス・アンド・ヘモスターシス（
Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ），　６２，
３　（１９８９）；　Ｎ．　Ａｋａｍａｔｓｕら：スロ
ンボーシス・アンド・ヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ．
　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ），　　６２，２５０（１９
８９）など〕を特異的に認識する　ＭｏＡｂが挙げられ
る。

【０００９】本発明で用いられる抗活性化血小板ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマの作製にあたっては、該ハイブリ
ドーマが活性化血小板に特異的でかつ実質的に非刺激血
小板と結合しないＭｏＡｂを産生するものであれば、い
ずれのものでもよい。例えばかかる活性化血小板特異Ｍ
ｏＡｂはトロンビンで活性化された血小板（好ましくは
ヒト血小板）を免疫原として用いることにより作製され
る〔Ｃ．　Ｌ．　Ｂｅｒｍａｎら：ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．　Ｃｌｉｎ
．　Ｉｎｖｅｓｔ．），　７８，１３０（１９８６）お
よび　Ｎ．　Ａｋａｍａｔｓｕら：スロンボーシス・ア
ンド・ヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ），６２，２５０（１９８９）〕。また、用
いる血小板は哺乳動物のものであればいずれでもよいが
、好ましくはヒト血小板が挙げられる。この活性化血小
板を動物（例、ウサギ，ラット，マウス，モルモットな
ど）に免疫し抗体産生細胞を得、次いで免疫動物より採
取したこれらの抗体産生細胞、例えば脾臓細胞やリンパ
節細胞などを骨髄腫細胞と融合する。得られるハイブリ
ドーマの中から実質的に非刺激血小板に反応せず活性化
血小板に特異的に結合する抗体産生細胞をスクリーニン
グすることによって、目的とする抗活性化血小板ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマを取得することができる。

【００１０】また本発明における血栓溶解作用を有する
物質（以下、血栓溶解作用物質と略記することがある）
としては、血栓溶解能を持つ蛋白あるいは血栓溶解作用
を促進する物質であればいずれのものでも良い。これら
の例として、プロテアーゼおよびその前駆体，あるいは
血栓溶解促進物質（例、ＴＰＡ，ＵＫ，ＰｒｏＵＫ，Ｓ
Ｋ，トリプシン，プラスミン，プロテインＣ，プロテイ
ンＳなど）などが挙げられ、なかでもプロテアーゼが好
ましく、さらに好ましくはＴＰＡ，ＵＫおよびＰｒｏＵ
Ｋなどが用いられる。また　　ＴＰＡについては一本鎖
および二本鎖のいずれのものでもよく、またＵＫについ
ても一本鎖および二本鎖のいずれのものでもよく［Ｅ．
　Ｈａｂｅｒら，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４
３，５１（１９８９）］、低分子ＵＫ，ＰｒｏＵＫなど
を用いてもよい。抗血栓溶解物質ＭｏＡｂ産生ハイブリ
ドーマの作製については、上記の蛋白を常法に従い動物
に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融
合させる方法が用いられる。特に抗ＵＫ抗体産生ハイブ
リドーマの作製については、低分子ＵＫを動物に免疫し
て得られる抗体産生細胞を用いるのが好都合である。動
物を免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと
融合させ、抗体産生ハイブリドーマを得る方法について
は、抗活性化血小板抗体産生ハイブリドーマを得る方法
と同様な操作を行ってもよい。

【００１１】免疫動物としては、例えばウサギ，ラット
，マウス，モルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製
造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方
法としては、通常実施される方法に従えばよく、例えば
活性化血小板に特異的な抗体を作製する場合にはマウス
に１回１０８〜１０１０個，好ましくは０．５〜２×１
０９個の洗浄ヒト血小板を生理食塩水，ヘペス緩衝液あ
るいはリン酸食塩緩衝液（以下、ＰＢＳと略記すること
がある）に懸濁して、トロンビンで活性化後腹腔内に１
０　〜１４日毎に３〜８回接種する方法がとられる。血
栓溶解作用物質に特異的な抗体を作製する場合には、マ
ウスに１回１〜１００μｇ、好ましくは１０〜２５μｇ
の血栓溶解作用物質を等容量（０．１ｍｌ）の生理食塩
水およびフロイントの完全アジュバンドで乳化して、背
部，腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６　
回接種する方法がとられる。これらの免疫動物、例えば
マウスから抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日
後に脾臓およびあるいはリンパ節を採取し、それらに含
まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操
作は既知の方法に従い実施でき、融合促進剤としてはポ
リエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略することがあ
る）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましく
はＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０など、特にＮＳ−１やＰ３Ｕ１が
好ましく用いられる。例えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との
好ましい比率は１：１〜１０：１で、これに分子量１，
０００〜９，０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で添
加され、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜
１０分インキュベートするのが良い。

【００１２】抗活性化血小板ＭｏＡｂ産生ハイブリドー
マのスクリーニングには種々の方法が使用できる。例え
ば、マイクロプレートに非刺激血小板あるいはトロンビ
ン活性化血小板を結合させ、１％ホルマリンで固定化し
て固相抗原として使用する。これにハイブリドーマ培養
上清を添加し、プレートに結合した抗活性化血小板抗体
を酵素標識第２抗体で検出する酵素免疫測定法（以下、
ＥＩＡと略記することがある）により培養上清中の抗体
価を測定し、非刺激および活性化血小板との結合の差の
大きなものを選択する。例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）添加培地で選別、育種
された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニ
ングに供されるが、通常これは限界希釈法などで容易に
実施される。クローン化されたハイブリドーマ培養上清
の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い抗
体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とするモノ
クローナルな抗活性化血小板特異抗体産生ハイブリドー
マを取得することができる。

【００１３】以上のような製造法に従って作製した抗活
性化血小板ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマの例として、後
述の実施例１に示したマウスハイブリドーマ２Ｔ６０が
挙げられる。また血栓溶解作用を有する物質に対するＭ
ｏＡｂ（抗血栓溶解作用物質ＭｏＡｂ）を産生するハイ
ブリドーマのスクリーニングは、それぞれ該物質を吸着
させたマイクロプレートを用いるＥＩＡで簡便に実施で
きる。 クローニングも上記した常法に従って実施し、目的の抗
血栓溶解作用物質ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得で
きる。以上のような製造法に従って作製した抗ＴＰＡ　
　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマの例として、後述の参考
例９に示したマウスハイブリドーマＴＰＡ１−４１，Ｔ
ＰＡ１−７０およびＴＰＡ２−１４、また抗ＵＫ　　Ｍ
ｏＡｂ産生ハイブリドーマの例として後述の参考例１１
に示したマウスハイブリドーマＵＫ１−３およびＵＫ１
−８７あるいは参考例１２に示したマウスハイブリドー
マＵＫ１−６が挙げられる。

【００１４】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
　　ＭｏＡｂを作製するにはいくつかの方法がある。１
つは化学的な方法で、この場合活性化血小板に対して特
異的なＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質に対するＭ
ｏＡｂとを共有結合させる。また別法として、抗活性化
血小板ＭｏＡｂおよび抗血栓溶解作用物質ＭｏＡｂをそ
れぞれ産生する２種のハイブリドーマを細胞融合し、ハ
イブリッド・ハイブリドーマ（例、テトラオーマなど）
を作製し目的の二重特異性抗体を作製する方法がある。 一定した高い品質の抗体を大量に収率良く得る手段とし
ては後者のハイブリッド・ハイブリドーマ法が好ましく
用いられる。

【００１５】２種のＭｏＡｂを化学的に結合させるため
に、抗体分子中に存在している置換基、例えばアミノ基
、カルボキシル基、ヒドロキシル基またはスルフヒドリ
ル基などを利用することができる。例えば、（１）一方
の抗体の反応性アミノ基と他方の反応性カルボキシル基
とを水溶性カルボジイミド試薬〔　例、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド，
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−
カルボジイミド−ｐ−トルエンスルホネートなど〕を用
いて水性溶媒中で脱水縮合させる、（２）一方の抗体の
反応性アミノ基をＮ−ヒドロキシスクシミドの活性エス
テル〔例、ｐ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−
カルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステル，Ｎ
−（ε−マレイミドカプロイロキシ）スクシミドエステ
ルなど〕と反応させマレイミド化したのち、ｉ）他方の
抗体をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した抗体、
あるいはｉｉ）他方の抗体にＮ−スクシミジル−３−（
２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）でス
ルフヒドリル基を導入した抗体、あるいはｉｉｉ）他方
の抗体をペプシン処理後還元して得られるＦａｂ’画分
のスルフヒドリル基とチオエーテル結合させる、（３）
２種の抗体双方の反応性アミノ基をスクシンジアルデヒ
ドやグルタルアルデヒドなどのジアルデヒド試薬を用い
て結合させる、（４）２種の抗体をＤＴＴで還元あるい
はＳＰＤＰでスルフヒドリル基を導入し、再酸化により
ヘテロダイマーを作製する、（５）２種の抗体をいずれ
もペプシン処理後還元し、Ｆａｂ’としたのち再酸化し
Ｆａｂ’ヘテロダイマーを作製する、などの方法がある
。またこれらの方法を種々組み合わせて、２種の抗体活
性をできるだけ損なわずに効率良く目的のヘテロダイメ
リックな二重特異性抗体を作製する報告があり　〔Ｍ．
　Ｊ．　Ｇｌｅｎｎｉｅ　ら：ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．），　１３９，２３
６７（１９８７）；北川常広：有機合成化学，４２，２
８３（１９８４）　　〕、本発明の二重特異性ハイブリ
ッドＭｏＡｂの作製に利用できる。

【００１６】以上のような結合反応終了後、二重特異性
抗体結合物はセファデックスＧ１００もしくはＧ２００
，セファロース６Ｂもしくは４Ｂ（ファルマシア社製）
、ウルトロゲル　　ＡｃＡ４４もしくは３４（ＬＫＢ製
），セファクリルＳ２００（ファルマシア社製）などの
ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製・分取できる。 あるいは抗原結合カラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーを組み合わせることにより選択的な分取も
可能である。

【００１７】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
モノクローナル抗体を産生するハイブリッド・ハイブリ
ドーマの作製にはいくつかの手法があり〔例、新本洋士
ら：蛋白質・核酸・酵素，３３，２１７（１９８８）な
ど〕、いずれの方法を用いてもよいが例えば、■前記し
たＨＡＴ抵抗性の血栓溶解作用を有する物質に対するＭ
ｏＡｂを産生するハイブリドーマを、５−ブロモデオキ
シウリジン（以下、５−ＢｒｄＵと略記することがある
）添加の培養液に段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ
欠損株をクローン化しＨＡＴ感受性とする。同様にＨＡ
Ｔ抵抗性の抗活性化血小板特異ＭｏＡｂ産生ハイブリド
ーマを８−アザグアニン（以下、８−ＡＺＧと略記する
ことがある）耐性とし、ヒポキサンチン−グアニン−ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ欠損株をクローン化し
ＨＡＴ感受性とする。次いで常法に従い両者を融合して
得られるテトラオーマをＨＡＴ添加培地で選別後、活性
化血小板および血栓溶解作用を有する物質の両者に結合
能を有するハイブリッドＭｏＡｂを分泌するテトラオー
マをクローン化する、■抗活性化血小板特異ＭｏＡｂ産
生ハイブリドーマをフルオレセイン・イソチオシアネー
ト（以下、ＦＩＴＣと略記することがある）で標識し、
もう一方の血栓溶解作用を有する物質に対するＭｏＡｂ
を産生するハイブリドーマをテトラメチル・ロダミン・
イソチオシアネート（以下、ＴＲＩＴＣと略記すること
がある）で標識後、常法に従い両者を融合する。得られ
た細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベイティッド
・セルソーター（以下、ＦＡＣＳと略記することがある
）に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣの赤色の蛍
光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化する
などの方法が挙げられる。また両親株のマーカーを全く
逆にして使用し、テトラオーマを選別・クローン化する
ことも可能である。

【００１８】これらの操作における細胞融合に当っては
センダイウイルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは
電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが
用いられ、以下にその一例を挙げるが、もちろんこの方
法に限定されるものではない。すなわち、分子量約１，
０００〜９，０００、濃度約１０〜８０％等のＰＥＧが
用いられ、処理時間は約０．５〜３０分であるが、好ま
しい条件の一例として、約３５〜５５％のＰＥＧ　６，
０００を約４〜１０分間、３７℃で細胞と接触させ、効
率よく融合させることができる。

【００１９】ポリドーマ（例、トリオーマ、テトラオー
マなど）の選択は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施で
きるが、このため８−ＡＺＧ、６−チオグアニン（６−
ＴＧ）あるいは５−ＢｒｄＵなどの薬剤馴化法により、
それぞれの薬物耐性株が取得される。また新しいマーカ
ーの融合細胞への導入により、種々の選択培地が用いら
れる。このような例として、ネオマイシンやハイグロマ
イシンＢ添加培地などが挙げられる〔Ｂ．　Ｓｕｇｄｅ
ｎら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．），５，４１０（
１９８５）〕。さらに前記したように、異った蛍光色素
で標識したハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二重標
識されたハイブリッド・ハイブリドーマをソーティング
する方法もある〔Ｌ．　Ｋａｒａｗａｊｅｗら：ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），９６，２６５（１９８７）
〕。

【００２０】ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリ
ーニングには種々の方法が使用できる。例えば、■前述
した抗活性化血小板特異ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマと
血栓溶解作用を有する物質に対するＭｏＡｂを産生する
ハイブリドーマのスクリーニングのための　ＥＩＡの併
用，■活性化血小板結合マイクロプレートに被検培養上
清を添加し、次にＨＲＰ標識した血栓溶解作用を有する
物質を加えて二重特異性を有するハイブリッド抗体検出
のためのＥＩＡ、あるいは抗活性化血小板特異抗体と異
なるサブクラスに属する血栓溶解作用を有する物質に対
する抗体を用いる場合は，■活性化血小板結合マイクロ
プレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識した
該抗マウスＩｇＧサブクラス特異抗体を加えて二重特異
性抗体を検出するＥＩＡ、およびこれらの変法などを適
宜組み合せて用いることができる。ハイブリッド抗体活
性陽性のポリドーマは直ちにクローニングに供されるが
、これは通常限界希釈法などで容易に実施される。クロ
ーン化されたポリドーマの培養上清については、上記の
方法でその抗体価を測定し、安定的に力価の高い抗体を
産生するポリドーマを選択することにより、目的とする
モノクローナルなハイブリッド抗体産生ポリドーマを取
得することができる。

【００２１】上記した本発明のポリドーマの培養は通常
、液体培地中、または動物の腹腔内（例えば、マウス等
哺乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施できる。 培養液および腹水中の抗体の精製については公知の生化
学的手法を組み合わせて用いることによりできる。例え
ば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り
出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナト
リウムを用いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物
を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィ
ー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡ
カラム、ヒドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的
とする抗体を分離精製することができる。以上のような
分離精製操作により、例えば１リットルの培養上清から
タンパク重量比で８０％以上の純度のハイブリッドＭｏ
Ａｂを約１〜５ｍｇ得ることができる。また、２０ｍｌ
の腹水液からは同様の抗体が３〜１０ｍｇ得られる。以
上のようにして得られた二重特異性を有するハイブリッ
ドＭｏＡｂは蛋白質として均一であり、蛋白分解酵素（
ペプシンなど）処理などにより、活性化血小板および血
栓溶解作用を有する物質に対する結合能を保持するＦ（
ａｂ’）２　断片などを得ることができ、これらは本発
明のハイブリッドＭｏＡｂと同様の目的で用いることが
できる。

【００２２】以上のような製造法に従って作製したハイ
ブリッドＭｏＡｂ産生ポリドーマの例として、後述の実
施例２に示したマウスハイブリッド・ハイブリドーマ（
テトラオーマ）ＵＰ３−１７５が挙げられる。なお、本
発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生するポリドーマとし
て、抗活性化血小板ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマと血栓
溶解作用を有する物質に対するＭｏＡｂを産生するハイ
ブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のＭ
ｏＡｂを産生するハイブリドーマと他方のＭｏＡｂを産
生する細胞とのトリオーマあるいはそれぞれのＭｏＡｂ
を産生する細胞をエプスタイン・バー・ウイルスなどに
より不滅化後、細胞融合して得られるハイブリドーマな
どであっても、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生す
るものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用い
ることができる。

【００２３】特に、抗活性化血小板特異ＭｏＡｂ産生ハ
イブリドーマに、血栓溶解作用物質を免疫した動物の脾
臓細胞を融合させる方法では、増殖能をもつトリオーマ
はいずれも抗活性化血小板ＭｏＡｂ産生能を有するハイ
ブリドーマ由来に限られるため、血栓溶解作用物質に対
する抗体活性測定法だけをスクリーニング法として用い
て、目的の二重特異性抗体産生トリオーマを選択できる
。かかる方法では種々の二重特異性抗体産生トリオーマ
が効率良く取得できる。また、これらのポリドーマがマ
ウスＩｇＧ　　ＭｏＡｂを産生する場合には、該二重特
異性ハイブリッドＭｏＡｂの抗原認識部位を含む可変領
域あるいは超可変領域をコードするＤＮＡを取得し、こ
れに遺伝子操作技術〔Ｚ．　Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら：
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
サイエンス　　ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８５，４８５２（１
９８８）〕を用いてヒトＩｇＧの定常領域をコードする
遺伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製する
こともできる。かかるキメラ抗体はヒトへの投与に際し
、抗原性が小さいため有利に用いられる。

【００２４】本発明の二重特異性ハイブリッドＭｏＡｂ
あるいは血栓溶解作用を有する物質と該二重特異性ハイ
ブリッドＭｏＡｂとから作製される選択的な血栓溶解蛋
白複合体を用いる血栓溶解治療法においては、幾つかの
方法が用いられる。例えば、■本発明のハイブリッドＭ
ｏＡｂを予め血栓性疾患患者に投与し、患者体内に形成
された血栓に結合させるべく十分な時間経過後に、血栓
溶解作用を有する物質、例えばＴＰＡやＵＫを投与する
，■該ハイブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物
質とを同時に血栓性疾患患者に投与する。あるいは■予
め該ハイブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質
とを反応させ、未反応の血栓溶解物質を分離後、得られ
た選択的血栓溶解蛋白複合体を血栓性疾患患者に投与す
るなどの方法が挙げられる。

【００２５】本発明の血栓溶解剤，ハイブリッドＭｏＡ
ｂあるいは血栓溶解作用を有する物質は、必要により例
えばメンブレインフィルター等によるろ過除菌操作の後
に、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容され得る担
体，賦形剤，希釈剤などと混合し、注射剤などとして製
剤化して、哺乳動物（マウス，ラット，ネコ，イヌ，ブ
タ，ウシ，サル，ヒトなど）に投与し、例えば心筋梗塞
，末梢動・静脈閉塞症，網膜動・静脈閉塞症，脳梗塞，
肺塞栓症などの血栓・閉塞性疾患の治療に用いることが
可能である。

【００２６】本発明の血栓溶解剤の投与量は、対象とな
る疾患，症状あるいは投与ルートなどによって異なるが
、例えば心筋梗塞の成人患者に静脈内投与する場合、ハ
イブリッドＭｏＡｂとして１日当り約０．０２〜１ｍｇ
／ｋｇ好ましくは約０．０４〜０．４ｍｇ／ｋｇ、血栓
溶解作用を有する物質として１日当りＴＰＡでは約０．
０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ好ましくは約０．０２〜０．２
ｍｇ／ｋｇ，ＵＫでは約０．０１〜０．５ｍｇ／Ｋｇ好
ましくは約０．０２〜０．２ｍｇ／ＫｇあるいはＰｒｏ
ＵＫでは約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．
０２〜０．５ｍｇ／ｋｇである。

【００２７】以上のような方法で、標的血栓部位に対し
て特異的に結合可能であり、実質的に非刺激血小板と結
合しない本発明のハイブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用
を有する物質とを用いることにより、血小板ｒｉｃｈ　
な血栓であっても選択的かつ効率的に血栓を溶解・除去
することができる。さらに本発明の二重特異性ハイブリ
ッドＭｏＡｂは、抗フィブリン−抗血栓溶解作用物質二
重特異性ＭｏＡｂと併用し、血栓溶解作用物質と同時投
与することにより、より一層効率的にかつ迅速に血栓を
溶解・除去できる。

【００２８】

【実施例】以下に参考例・実施例により本発明を具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことは言うまでもない。なお、参考例および実施例
で用いられている動物細胞は、以下の表に示すように寄
託が行なわれている。

【００２９】参考例１　　抗血小板抗体測定用ＥＩＡ■
固定化血小板の作製 クエン酸採血したヒト新鮮血から遠心分離法により多血
小板血漿を取得し、ＡＤＰ分解酵素を含むタイロード−
ヘペス緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した。この洗浄血小
板を２×１０７個／ウエルでマイクロプレートに播き、
トロンビン（０．２ユニット／ｍｌ）で活性化したのち
遠心した。次いで２％ホルマリンで固定化後、５％牛血
清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記することがある）含
有ＰＢＳでブロッキングして活性化血小板プレートを作
製した。 非刺激血小板プレートは上記の操作中、トロンビン活性
化操作を省略して作製した。 ■ＥＩＡ操作法 ハイブリドーマ培養上清１００μｌを血小板プレートに
添加し、室温で３時間反応後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　
２０　含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ）で洗浄、ホースラッ
ディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体を添加し、さらに室温で２時間反応させ
た。洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミン
およびＨ２Ｏ２を含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液を各
ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で
反応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて波
長４９２ｎｍで発色色素量を測定した。

【００３０】参考例２　　抗ＴＰＡ抗体測定用ＥＩＡＴ
ＰＡ　５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレートに１
００μｌずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン，
０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ　　１５０μｌを添
加して感作プレートを作製した。　上記の液を除去しＰ
ＢＳ−Ｔｗで洗浄後、被検ハイブリドーマ培養上清１０
０μｌを添加し室温で２時間反応させた。以下、参考例
１に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測定した。

【００３１】参考例３　　抗ＵＫ抗体測定用ＥＩＡ参考
例２に記載のＴＰＡの代りにＵＫを使用し、ＵＫ感作プ
レートを作製後、同様の方法で抗ＵＫ抗体価を測定した
。

【００３２】参考例４　　抗低分子ＵＫ抗体測定用ＥＩ
Ａ参考例２に記載のＴＰＡの代りに低分子ＵＫ（２本鎖
低分子ＵＫ，ＪＣＲ社販売）を使用し、低分子ＵＫ感作
プレートを作製後、同様の方法で抗低分子ＵＫ抗体価を
測定した。

【００３３】参考例５　　抗活性化血小板−抗ＵＫハイ
ブリッド抗体測定用ＥＩＡ 参考例１で作製した活性化血小板感作プレートに被検ハ
イブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させ
た。次いでＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後、ビオチン標識したＵ
Ｋを添加し、さらに室温で２時間反応させた。次にアビ
ジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温で１時間反応後、固相
に結合したＨＲＰ活性を参考例１に示した方法で測定す
る。

【００３４】参考例６　　抗活性化血小板−抗ＴＰＡハ
イブリッド抗体測定用ＥＩＡ 参考例５に記載のビオチン標識したＵＫの代りに、ビオ
チン標識ＴＰＡを使用し、参考例５と同様の方法で二重
特異性抗体価を測定した。

【００３５】参考例７　　フィブリン溶解反応中和試験
ＴＰＡ溶液（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＵＫ溶
液（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）に被検ハイブリドーマ培
養上清希釈液を添加し、３７℃で１時間反応後反応混液
をフィブリンアガロースプレートの１ウェル当り５μｌ
注入した。 ３７℃で２〜６時間後にフィブリンの溶解斑（直径）を
測定し、ＴＰＡもしくはＵＫの酵素活性に対するハイブ
リドーマ培養上清に含まれるＭｏＡｂの中和能を測定し
た。

【００３６】参考例８　　ＵＫ酵素活性中和試験ＵＫ溶
液（最終濃度１．７μｇ／ｍｌ）に被検抗体溶液を添加
し室温で３０分反応後、ペプチド合成基質Ｓ−２４４４
（１ｍＭ，ピログルタミル・グリシル・アルギニル・パ
ラニトロアニリド，カビ社製）を添加した。さらに３７
℃で１５分反応後、遊離したパラ・ニトロアニリド（４
０５ｎｍにおける吸光度）を測定した。

【００３７】参考例９　　マウス抗ＴＰＡモノクロナー
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免　　疫 市販の１本鎖ＴＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売）２０
０μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全ア
ジュバンドを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（
♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部
皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回
の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体
について、ＴＰＡ抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。 ■細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個を添加し、ＰＥＧ　６００
０を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）〕に準
じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポキ
サンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、いわ
ゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後は
、親細胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノプテ
リンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。 ■ハイブリドーマの選択およびクローニング固相にＴＰ
Ａを吸着させたマイクロプレートを用いる参考例２に記
載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定し
た。融合１０日から２０日後でハイブリドーマの出現を
認め、かつＴＰＡに特異結合する抗体がみられた。特に
結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法に
よるクローニングに供した。クローン化したハイブリド
ーマの培養上清を同様に参考例２のＥＩＡのスクリーニ
ングに供し、ＴＰＡ結合能の強い３種の抗ＴＰＡＭｏＡ
ｂ産生マウスハイブリドーマＴＰＡ１−４１，ＴＰＡ１
−７０およびＴＰＡ２−１４が得られた。これらのハイ
ブリドーマが産生するマウスＭｏＡｂの免疫グロブリン
クラス、サブクラスはオークターロニー法による測定で
、それぞれＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ１およびＩｇＧ１であっ
た。 ■モノクローナル抗体の作製 予め０．５ｍｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウ
スに５×１０６個の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ産生ハイブリ
ドーマを腹腔内接種した。約１０−１５日後に腹水の貯
溜が見られた。抗体の精製は常法により、４５−５０％
飽和硫酸アンモニウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロース
およびプロテインＡカラムクロマトグラフィーに供し実
施し、マウスハイブリドーマＴＰＡ１−４１，ＴＰＡ１
−７０およびＴＰＡ２−１４からそれぞれマウス抗ＴＰ
Ａモノクローナル抗体ＴＰＡ１−４１，ＴＰＡ１−７０
およびＴＰＡ２−１４を得た。

【００３８】参考例１０　　抗ＴＰＡモノクローナル抗
体のＴＰＡフィブリン溶解能に対する中和活性参考例９
−■で作製した抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂを、参考例７に記
載のフィブリンアガロースプレートを用いるフィブリン
溶解反応中和試験に供し、ＴＰＡに対する中和活性を測
定した。抗体ＴＰＡ１−４１は弱い中和活性を、抗体Ｔ
ＰＡ１−７０は強い中和活性を示したが、抗体ＴＰＡ２
−１４は全く中和活性を示さなかった。

【００３９】参考例１１　　マウス抗ＵＫモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免　　疫 参考例９−■に記載のＴＰＡの代りにＵＫ（日本製薬製
造）を用いて、以下全く同様の方法でマウスへの免疫を
実施した。 ■細胞融合 参考例９−■に記載の方法に従い細胞融合を実施した。 ■ハイブリドーマの選択およびクローニングＵＫ結合マ
イクロプレートを用いる参考例３に記載のＥＩＡでハイ
ブリドーマをスクリーニングし、以下参考例９−■と同
じ方法で抗ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得し
た。これらのうち、フィブリン溶解能を損うことなくＵ
Ｋに特異結合する抗ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ
としてマウスハイブリドーマ　ＵＫ１−３およびＵＫ１
−８７が得られた。得られたハイブリドーマからそれぞ
れ産生されるマウス抗ＵＫ　ＭｏＡｂ　ＵＫ１−３およ
びＵＫ１−８７の免疫グロブリンクラス，サブクラスは
オークターロニー法による測定で、それぞれＩｇＧ１お
よびＩｇＧ２ｂであった。

【００４０】参考例１２　　マウス抗低分子ＵＫモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免　　疫 参考例９−■に記載のＴＰＡの代りに市販の二本鎖低分
子ＵＫ（ＪＣＲ社販売）を用いて、以下全く同様の方法
でマウスへの免疫を実施した。 ■細胞融合 参考例９−■に記載の方法に従い細胞融合を実施した。 ■ハイブリドーマの選択およびクローニング低分子ＵＫ
結合マイクロプレートを用いる参考例４に記載のＥＩＡ
でハイブリドーマをスクリーニングし、以下参考例９−
■と同じ方法で抗低分子ＵＫ　　ＭｏＡｂ産生ハイブリ
ドーマを取得した。これらの中、フィブリン溶解能を損
うことなくＵＫに特異結合する抗低分子ＵＫ　　ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマとしてマウスハイブリドーマ　　
ＵＫ１−６が得られた。得られたハイブリドーマから産
生されるマウス抗ＵＫ　ＭｏＡｂ　ＵＫ１−６の免疫グ
ロブリンクラス，サブクラスはオークターロニー法によ
る測定で、ＩｇＧ１（κ鎖）であった。

【００４１】参考例１３　　抗ＵＫモノクローナル抗体
の精製 参考例１１および１２で得た抗ＵＫモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマＵＫ１−３，ＵＫ１−８７およびＵ
Ｋ１−６を参考例９−■と同様の方法で腹水化し、さら
にその腹水液を塩析処理およびカラムクロマト操作によ
り精製し、マウス抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ１−３
，ＵＫ１−８７およびＵＫ１−６を取得した。

【００４２】参考例１４　　抗ＵＫモノクローナル抗体
の中和活性 参考例１３で得たマウス抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ
１−３，ＵＫ１−８７およびＵＫ１−６を、参考例８に
記載のペプチド合成基質Ｓ−２４４４を用いるＵＫ酵素
活性中和試験に供した。いずれのマウス抗ＵＫモノクロ
ーナル抗体もＵＫ抗体活性を阻害しなかった。

【００４３】参考例１５　　抗フィブリン抗体測定用Ｅ
ＩＡ ３．３Ｍ尿素，０．０１％　ＥＤＴＡ含有リン酸食塩緩
衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．３）に溶解したヒトフィブリン
モノマー溶液１ｍｇ／ｍｌを、９６穴マイクロプレート
に５０μｌずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン
，０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μｌを添加
して感作プレートを作製した。次に１００単位／ｍｌヘ
パリン，３ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド含
有ＰＢＳに溶解したヒトフィブリノーゲン溶液１０ｍｇ
／ｍｌを、等量の被検ハイブリドーマ培養上清と混じ、
室温で３０分間反応後、その１００μｌを上記のフィブ
リン感作プレートに添加し室温で２時間反応させた。　
０．０５％　ＰＢＳ−Ｔｗでプレートを十分に洗浄後、
ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、さらに
室温で２時間反応させた。以下、参考例１に記載の方法
で酵素反応を実施し抗体価を測定した。

【００４４】参考例１６　　抗フィブリン−抗ＵＫハイ
ブリッド抗体測定用ＥＩＡ 参考例３で作成したＵＫ感作プレートにハイブリッド抗
体含有検液を添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ
−Ｔｗで洗浄後、ビオチン標識した参考例１７−■に記
載のヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−
ＢＳＡ複合体を添加し、さらに室温で２時間反応させた
。 次にアビジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温で１時間反応
後、固相に結合したＨＲＰ活性を参考例１に示した方法
で測定した。

【００４５】参考例１７　　マウス抗ヒトフィブリンモ
ノクロナール抗体産生ハイブリドーマの作製■免疫原の
調製 公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム，モデル４３０Ａ型）を用いて作製されたヒト
フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−Ｃｙｓ３
．３ｍｇを、予めマレイミド化したＢＳＡ（ＢＳＡ１モ
ル当り１３モルのマレイミド基を導入）１２　ｍｇ／２
ｍｌ水溶液に加え３０℃で１時間反応させ、ヒトフィブ
リンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−ＢＳＡ複合体を
得た。次いで生理食塩水で３回透析後（３リットル×３
）、凍結保存し免疫原として用いた。 ■免　　疫 ペプチド−ＢＳＡ複合体１ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に
等量のフロイント完全アジュバンドを加え、マウス（♀
，ｎ＝１０：０．１ｍｇ／０．２ｍｌ／マウス）の背部
および腹部皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫原
に等量のフロイント不完全アジュバンドを加えて、２−
３週毎に５回接種し実施した。 ■細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個を添加し、ＰＥＧ　６００
０を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５　　（１９７５）〕
に準じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒ
ポキサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、
いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以
後は、親細胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノ
プテリンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。 ■ハイブリドーマの選択およびクローニング固相にヒト
フィブリンモノマーを吸着させたマイクロプレートを用
いる参考例１に記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上清
の抗体価を測定した。融合１０日から２０日後でハイブ
リドーマの出現を認め、かつヒトフィブリンに特異結合
する抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブリドー
マについて、限界希釈法によるクローニングに供した。 クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にＥＩ
Ａのスクリーニングに供し、ヒトフィブリン結合能の強
いものを選択した。これらの結果、高濃度ヒトフィブリ
ノーゲン存在下でフィブリンに特異結合するＭｏＡｂ産
生マウスハイブリドーマ　　ＦＩＢ１−１１が得られた
。得られたハイブリドーマから産生される抗体ＦＩＢ１
−１１の免疫グロブリンクラス、サブクラスはオークタ
ーロニー法による測定で、ＩｇＧ１であった。

【００４６】参考例１８　　抗ＵＫ−抗ヒトフィブリン
二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の
製造 ■細胞融合 参考例１７で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブ
リドーマＦＩＢ１−１１および参考例１１で取得した抗
ＵＫ抗体産生ハイブリドーマＵＫ１−３を、実施例２−
■に示した方法に従いそれぞれをＦＩＴＣおよびＴＲＩ
ＴＣで蛍光染色したのちＰＥＧ６０００を用いて細胞融
合した。次にＦＡＣＳに供し二重染色細胞を選別・培養
した。 ■ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、それぞれ参考例３，１５および１６に記載のＥＩＡ
に供し抗体活性を測定した。最大のハイブリッド抗体活
性を示したウエルについて限界希釈法によるクローニン
グを実施し、目的の二重特異性抗体産生マウスハイブリ
ドーマ　　ＦＵ１−７４を取得した。 ■ハイブリッド抗体の精製 実施例２−■に記載の方法に従い腹水を取得し、さらに
硫安塩析およびフィブリン結合カラムとＵＫ結合カラム
とを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より約２０ｍｌの腹水から本発明の抗ＵＫ−抗ヒトフィ
ブリン二重特異性抗体ＦＵ１−７４　　１４ｍｇを得た
。

【００４７】実施例１　　マウス抗活性化血小板抗体産
生ハイブリドーマの作製 ■免　　疫 クエン酸採血で得たヒト新鮮血より遠心分離法で洗浄血
小板を取得した。血小板約１０９個にトロンビン０．１
単位／ｍｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートし
たのち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。２週
毎に６−８回免疫した。 ■細胞融合 参考例９−■記載のマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１の代わり
にＮＳ−１を用いて、以下全く同様の方法で細胞融合を
実施した。 ■ハイブリドーマの選択およびクローニング血小板結合
マイクロプレートを用いる参考例１記載のＥＩＡでハイ
ブリドーマをスクリーニングし、以下参考例９−■と同
じ方法で抗活性化血小板ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを
取得した。これらの結果、ヒトおよびウサギ活性化血小
板に特異的に結合するＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ２Ｔ
６０が得られた。 ■モノクローナル抗体の作製 参考例９−■に記載の方法に従い、マウス腹水よりマウ
ス抗活性化血小板ＭｏＡｂ　２Ｔ６０を得た。抗体２Ｔ
６０の免疫グロブリンクラス，サブクラスはオークター
ロニー法による測定で、ＩｇＧ１（κ鎖）であった。上
記の抗活性化血小板ＭｏＡｂ　２Ｔ６０をヒト血小板結
合マイクロプレートを用いる参考例１に記載のＥＩＡで
測定した結果を〔図１〕に表わす。またヒト血小板の代
りにウサギ血小板を用いて、参考例１に記載のＥＩＡと
全く同様の手法で測定した結果を〔図２〕に表わす。〔
図１〕および〔図２〕から、抗体２Ｔ６０はヒトおよび
ウサギの活性化血小板にのみ反応性を示し、非刺激血小
板に対しては実質的に反応性を示さない。

【００４８】実施例２　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の製造
（１） ■細胞融合 実施例１で取得した抗活性化血小板ＭｏＡｂ産生ハイブ
リドーマ２Ｔ６０および参考例１２で取得した抗低分子
ＵＫ　ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマＵＫ１−６を、それ
ぞれ０．５μｇ／ｍｌＦＩＴＣおよび１．５μｇ／ｍｌ
ＴＲＩＴＣ含有イスコフ−ハムＦ・１２混合培地で３７
℃，　３０分間インキュベートし、蛍光染色した。次い
で、ＬＳＭ溶液（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．販売）を添加し
死細胞を除去したのち、　両ハイブリドーマを１：１の
割合で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて参考例９−■に記
載の方法で細胞融合した。３７℃で２時間インキュベー
ト後、ＦＡＣＳに供することによりフルオレセインおよ
びローダミンで二重染色された細胞２５０００個を分取
し、次にフィーダーとしてマウス胸腺細胞を５×１０５
個／ウエル播種した９６穴マイクロプレートに、上記の
二重染色細胞を１０個／ウエルの割合で播種し培養した
。 ■テトラオーマの選択およびクローニング参考例５に記
載のＥＩＡで陽性を示すウエルについて限界希釈法によ
るクローニングを実施し、高いハイブリッド抗体活性を
示すマウスハイブリッド・ハイブリドーマＵＰ３−１７
５を取得した。 ■ハイブリッド抗体の精製 予め０．５ｍｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウ
ス６匹に５×１０６個／マウスのマウスハイブリッド・
ハイブリドーマＵＰ３−１７５を腹腔内接種した。約１
０〜２０日後に腹水の貯溜が認められたのでそれを採取
し、４５−５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩｇ
Ｇ画分を得た。次いで２０ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ８．０）
で平衡化したＵＫ結合カラムに供し、ｐＨ２．３の０．
０５Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出する蛋白画分を採取
し、さらにヒドロキシアパタイトカラムを用いる高速液
体クロマトグラフィーで本発明のマウス抗ＵＫ−抗活性
化血小板二重特異性ＭｏＡｂ　ＵＰ３−１７５を得た。 精製結果は〔図３〕および〔図４〕に示した通りであっ
た。〔図３〕では、ヒドロキシアパタイトカラムで二重
特異性ＭｏＡｂを含む蛋白画分が得られたことを示した
。〔図４〕では、塩析処理して得られた抗体ＩｇＧ画分
およびＵＫ結合カラムのｐＨ２．３酸溶出画分の二重特
異性抗体活性を示した。

【００４９】実施例３　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の製造
（２） ■抗ＵＫ抗体のマレイミド化 参考例１３で取得した抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ１
−３　　１０ｍｇを５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２
ｍｌに溶解後、２倍モルのＮ−（ε−マレイミドカプロ
イロキシ）スクシミドエステルのジメチルホルムアミド
溶液５０μｌを添加し３０℃で２０分間反応させた。反
応混液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ；ｐＨ６．５）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに供し結合試
薬を除去した。 ■抗活性化血小板抗体のスルフヒドリル化実施例１−■
で作製した抗活性化血小板モノクローナル抗体２Ｔ６０
　　１０ｍｇを２ｍｌの０．０５Ｍ　　ＰＢＳ（ｐＨ７
．３）に溶解後、２倍モルのＳＰＤＰメタノール溶液５
０μｌを添加した。３０℃で３０分間反応後、０．１Ｍ
　　ＤＴＴ水溶液５０μｌを添加し還元後、■に記載の
セファデックスＧ−２５カラムに供して過剰の試薬を除
去した。 ■二重特異性抗体の作製 ■で得たマレイミド化抗ＵＫ抗体８ｍｇに、■で作製し
たスルフヒドリル化抗活性化血小板抗体８ｍｇを氷冷下
撹拌しながらゆっくりと添加し、一夜反応させた。反応
混液をセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシア社
製）に供し、未反応の抗体を化学結合二重特異性抗体か
ら分離除去した結果、約１２ｍｇの抗ＵＫ−抗活性化血
小板二重特異性ハイブリッドモノクローナル抗体を得た
。

【００５０】実施例４　　抗ＴＰＡ−抗活性化血小板二
重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の製
造■抗ＴＰＡ抗体のマレイミド化 参考例９−■で取得した抗ＴＰＡモノクローナル抗体Ｔ
ＰＡ２−１４　　１０ｍｇを実施例３−■と同様の方法
で処理し、マレイミド化ＴＰＡ２−１４約８ｍｇを得た
。 ■二重特異性抗体の作製 ■で得たマレイミド化抗体８ｍｇに、実施例３−■で作
製したスルフヒドリル化抗活性化血小板抗体８ｍｇを添
加し、実施例３−■と同様の方法で約１２ｍｇの抗ＴＰ
Ａ−抗活性化血小板二重特異性ハイブリッドモノクロー
ナル抗体を得た。

【００５１】実施例５　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の製造
（３） ■ＨＡＴ感受性株の取得 実施例１で取得した抗活性化血小板特異ＭｏＡｂ産生ハ
イブリドーマ２Ｔ６０を５μＭ８−ＡＺＧ添加培地で培
養し、順次８−ＡＺＧ濃度を１００μＭまで段階的に上
昇させ、数週間継代培養した。得られた８−ＡＺＧ耐性
・ＨＡＴ感受性株の中で最大の抗活性化血小板ＭｏＡｂ
産生能を有する株を選び、細胞融合に供した。 ■細胞融合 上記■で取得したＨＡＴ感受性の抗活性化血小板ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマ２Ｔ６０に、参考例１１−■で取
得した抗ＵＫ　　ＭｏＡｂ産生脾臓細胞を１：５の割合
で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて参考例９−■に記載の
方法で細胞融合した。 ■トリオーマの選択およびクローニング融合終了後、細
胞混液をＨＡＴ培地中に懸濁し、参考例９−■に記載の
方法に従いＨＡＴ選択培養を実施、目的のトリオーマを
作製した。これらのトリオーマの培養上清を参考例３に
記載のＥＩＡに供して抗ＵＫ抗体活性陽性を示すウェル
を選択した。さらに参考例５に記載のＥＩＡで抗活性化
血小板−抗ＵＫハイブリッド抗体活性を測定した。高い
二重特異性抗体活性を示すウェルについて限界希釈法に
よるクローニングを実施し、マウスハイブリッド・ハイ
ブリドーマＵＰ４−３３を取得した。 ■ハイブリッド抗体の精製 実施例２−■に記載の方法に従い、マウスハイブリッド
・ハイブリドーマＵＰ４−３３を腹水化し、さらにＵＫ
結合カラムおよびヒドロキシアパタイトカラムを用いて
マウス抗ＵＫ−抗活性化血小板二重特異性ＭｏＡｂＵＰ
４−３３を得た。

【００５２】実施例６　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体による
フイブリン溶解能の増強（１） 公知の方法［Ｄ．　Ｃｏｌｌｅｎら：スロンボーシス・
アンド・ヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ），　　４５，　２２５（１９８１）］に従
い、多血小板血漿凝塊溶解試験（ｐｌａｓｍａ　ｃｌｏ
ｔ　ｌｙｓｉｓ　ａｓｓａｙ）を実施した。すなわち、
一定量のＵＫ（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）に種々の濃度
の二重特異性ＭｏＡｂを添加し、室温で２０分間反応さ
せた。このＵＫ−ＭｏＡｂ混液にヒト多血小板血漿を添
加し、次いでヒトトロンビンを最終濃度１．０単位／ｍ
ｌとなるように加えて血漿を凝固させた。６０分後にフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド（最終濃度１ｍＭ）
を添加してＵＫ活性を停止させ、次いで１６，０００回
転／分で５分間遠心分離した。上清のＦＤＰ（ｆｉｂｒ
ｉｎｏｇｅｎ　　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　　ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ）含量を市販のＥＩＡキット（富士レビオ社製
）で測定し、二重特異性ＭｏＡｂのＵＫ活性増強能を判
定した。結果は〔図５〕に示した通りであった。実施例
３に記載の化学結合二重特異性抗体および実施例５に記
載の二重特異性ＭｏＡｂ　　ＵＰ４−３３のいずれもが
その濃度に比例してＵＫのフィブリン溶解能を顕著に増
強した。一方、これら二重特異性抗体の親抗体である、
参考例１１に記載の抗ＵＫ　　ＭｏＡｂ　　ＵＫ１−３
および実施例１に記載の抗活性化血小板ＭｏＡｂ　　２
Ｔ６０はいずれもＵＫ活性を増強しなかった。

【００５３】実施例７　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体による
フィブリン溶解能の増強（２） 実施例６に記載の方法に従い、多血小板血漿凝塊溶解試
験を実施した。ヒトトロンビンにより血漿を凝固させた
後、種々の時間経過後にフェニルメチルスルホニルフル
オリドを添加してＵＫ活性を停止させ、実施例６に記載
の方法と同様にして遊離したＦＤＰ量を測定した。結果
は〔図６〕に示した通りであった。実施例３に記載の化
学結合二重特異性抗体の共存下では、ＵＫ単独の場合に
比べて迅速に血漿凝塊が溶解することが判明した。

【００５４】実施例８　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体による
フィブリン溶解能の増強（３） 一定量のＵＫ（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）に実施例５に
記載の種々の濃度の抗ＵＫ−抗活性化血小板二重特異性
ＭｏＡｂを添加し、室温で２０分間反応させた。次いで
実施例６に記載の方法に従い、ヒト多血小板血漿および
ヒト乏血小板血漿を添加し、ヒトトロンビンで凝固させ
凝塊溶解試験を実施した。生成した上清中のＦＤＰをＥ
ＩＡキットで測定し二重特異性ＭｏＡｂのＵＫ活性増強
能を判定した。結果は〔図７〕に示した通りであった。 乏血小板血漿凝塊に対しては二重特異性ＭｏＡｂ　　Ｕ
Ｐ４−３３はＵＫ活性を増強しなかったが、多血小板血
漿凝塊に対してはＵＰ４−３３の濃度に比例してＵＫの
フィブリン溶解能を顕著に増強した。

【００５５】実施例９　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二重
特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体による
フィブリン溶解能の増強（４） ５０ｎｇ／ｍｌ　ＵＫ溶液に等量の１５０ｎｇ／ｍｌ　
二重特異性ＭｏＡｂ（１．実施例５に記載の抗ＵＫ−抗
活性化血小板二重特異性ＭｏＡｂ　ＵＰ４−３３、２．
参考例１８に記載の抗ＵＫ−抗フィブリン二重特異性Ｍ
ｏＡｂ　ＦＵ１−７４、３．二重特異性ＭｏＡｂ　ＵＰ
４−３３とＦＵ１−７４の等量混合物）を添加し反応後
、ヒト多血小板血漿を添加して実施例６に記載の方法に
従い凝塊溶解試験を実施した。結果は〔図８〕に示した
通りであった。参考例１８に記載の二重特異性ＭｏＡｂ
ＦＵ１−７４および実施例５に記載の二重特異性ＭｏＡ
ｂ　　ＵＰ４−３３はいずれもＵＫのフィブリン溶解能
を増強したが、その１：１抗体混合物はそれぞれ単独の
場合よりＵＫのフィブリン溶解速度および溶解量を相乗
的に増強させた。

【００５６】実施例１０　　抗ＵＫ−抗活性化血小板二
重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体によ
るフィブリン溶解能の増強（５） （１）１２５Ｉ標識プラズマ塊の作製 市販の１２５Ｉ標識ヒトフィブリノーゲン（１０μｇ／
１０μｌ；室町化学工業販売）をヒト多血小板血漿６０
０μｌに加えたのち、ウシトロンビン（１単位／１００
μｌ）を添加し迅速に撹拌した。１０％Ｔｗｅｅｎ８０
で処理したカテーテルに吸い上げ室温で１分間放置後、
さらに３７℃で３０分間インキュベートした。得られた
プラズマ塊を生理食塩水を入れたシャーレに押し出し、
メスで１ｃｍ間隔に切断し、各切片の放射活性をγ−カ
ウンターで測定した。 （２）ハムスター肺動脈塞栓モデル実験ハムスター（体
重８０−１００ｇ）にペントバルビタール（６ｍｇ／０
．３ｍｌ）を腹腔内投与後、大腿静脈に採血用カテーテ
ルを挿入した。次に（１）で作製した１２５Ｉ標識プラ
ズマ塊をカテーテルに吸い上げ頸静脈から注入後、サン
プル投与用カテーテルを挿入した。頸静脈からＮａＩ（
０．２ｍｇ／０．１ｍｌ）とヘパリン（１００単位／０
．１ｍｌ）とを投与後、さらにプロウロキナーゼ（Ｐｒ
ｏＵＫ）もしくはＰｒｏＵＫに２倍モルの実施例５に記
載の二重特異性ＭｏＡｂを添加した免疫複合体３５０μ
ｌを投与した。室温で９０分間放置後採血（１ｍｌ）し
、さらに胸部を開き、右肺、左肺および心臓を摘出し、
それぞれの臓器の放射活性をγ−カウンターで測定した
。投与した全放射活性量に対する３つの臓器における残
存放射活性量の割合から、プラズマ塊の溶解率を測定し
た。結果は〔表１〕に示した通りであった。二重特異性
ＭｏＡｂ　ＵＰ４−３３の添加によりＰｒｏＵＫの溶解
能が２倍以上増強した。

【表１】 　　───────────────────────
──────　　　　　　サンプル　　（ｍｇ／ｋｇ）
　　─────────────　　　　　　プラズマ
塊溶解率（％）　　　　ＰｒｏＵＫ　　二重特異性Ｍｏ
Ａｂ　　　　───────────────────
──────────　　　　　　　　コントロール　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０±　７　　
　　０．５　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２９±　１　　　　１．０　　
　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４８±　８　　　　２．０　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　　６７±
１４　　　　４．０　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　７３±１１　　　　０
．５　　　　　　　　　　　　３．０　　　　　　　　
　　　　　　　　　３５±　６　　　　１．０　　　　
　　　　　　　　６．０　　　　　　　　　　　　　　
　　　６８±１０　　　　２．０　　　　　　　　　　
　１２．０　　　　　　　　　　　　　　　　　８６±
　４　　─────────────────────
────────

【００５７】実施例１１　　抗ＵＫ−
抗活性化血小板二重特異性を有するハイブリッドモノク
ローナル抗体の血小板のＡＤＰ凝集に対する効果 ヒト多血小板血漿２００μｌを６チャンネル凝集計（二
光バイオサイエンス社製；ＮＫＫ　　Ｈｅｍａｔｒａｃ
ｅｒ　　Ｉ−モデルＴ−６３４）のキュベットに添加し
３７℃で撹拌し、さらにプラスミノーゲン液１２．５μ
ｌ（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）とＵＫ／二重特異性Ｍ
ｏＡｂ免疫複合体液２５μｌとを同時添加した。１分後
にＡＤＰ液２０μｌ（最終濃度１．２μＭ）を加えて凝
集曲線を観察した。 ＵＫ／二重特異性ＭｏＡｂ免疫複合体はＵＫ（最終濃度
５．６μｇ／ｍｌ）に等モルのＭｏＡｂ（最終濃度１６
．６μｇ／ｍｌ）を加え室温で３０分間インキュベート
し作製した。コントロールとしてはＵＫに等モルの正常
マウスＩｇＧを加えた混合液を使用した。得られた結果
は〔図９〕に示した通りであった。ＵＫ／正常マウスＩ
ｇＧ混合液ではＡＤＰ凝集にほとんど影響を及ぼさない
が、ＵＫ／二重特異性ＭｏＡｂ免疫複合体はヒト血小板
のＡＤＰ凝集の二次凝集波を顕著に解離した。

【００５８】

【発明の効果】本発明の二重特異性ハイブリッドＭｏＡ
ｂは、実質的に非刺激血小板と反応せず活性化血小板と
のみ特異的に結合し、またフィブリン溶解能を損なうこ
となく血栓溶解作用を有する物質とも特異的に結合する
ことが可能である。従って、二重特異性ハイブリッドＭ
ｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質との１：１免疫複合
体を容易に作製することができ、また両者を併用するこ
とにより、選択的かつ効率的な血栓の溶解・除去が可能
である。さらに、抗フィブリン−抗血栓溶解作用物質二
重特異性ＭｏＡｂと組み合わせ、血栓溶解作用物質と併
用すれば、より効率的で迅速な血栓溶解が可能となる。

【００５９】

【図面の簡単な説明】

【図１】は実施例１に記載の抗活性化血小板抗体２Ｔ６
０のヒト活性化血小板（○）および非刺激血小板（●）
に対する反応性を、参考例１に記載のＥＩＡで測定した
結果を表す（実施例１参照）。

【図２】は実施例１に記載の抗活性化血小板抗体２Ｔ６
０のウサギ活性化血小板（○）および非刺激血小板（●
）に対する反応性を、参考例１に記載のＥＩＡで測定し
た結果を表す（実施例１参照）。

【図３】は実施例２に記載の抗ＵＫ−抗活性化血小板二
重特異性ＭｏＡｂ　　ＵＰ３−１７５の精製結果を表す
。すなわち、抗体ＵＰ３−１７５を含有する腹水液より
塩析処理によりＩｇＧ画分を取得し、さらにＵＫ結合カ
ラムで精製したのち、ハイドロキシアパタイトカラムに
供した結果を示す。実線は溶出液の２８０ｎｍでの吸光
度（蛋白質含量）を、点線は参考例５に記載のＥＩＡで
測定した二重特異性抗体活性を示す。

【図４】は参考例５に記載のＥＩＡで測定した二重特異
性抗体活性を表す。抗体ＵＰ３−１７５を含有する腹水
液の塩析ＩｇＧ画分（○）およびＵＫ結合カラムのｐＨ
２．３酸溶出画分（●）の抗体希釈曲線を示す（実施例
２参照）。

【図５】

【図６】は実施例７に記載のＦＤＰ−ＥＩＡキットで測
定したＦＤＰ含量を示し、ＵＫ単独（　□　）およびＵ
Ｋ／化学結合二重特異性抗体複合体（　×　）の血漿凝
塊溶解曲線を示す。

【図７】

【図８】は実施例９に記載のＦＤＰ−ＥＩＡキットで測
定したＦＤＰ含量を示すが、この場合経時的に反応混合
物を遠心分離し、上清のＦＤＰ量を測定した。ＵＫ単独
（○）、抗ＵＫ−抗活性化血小板二重特異性ＭｏＡｂ　
　ＵＰ４−３３（□）、抗ＵＫ−抗フィブリン二重特異
性ＭｏＡｂ　　ＦＵ１−７４（●）および二重特異性Ｍ
ｏＡｂ　　ＦＵ１−７４とＵＰ４−３３の等量混合物（
△）の血漿凝塊溶解曲線を示す。

【図９】は実施例１１に記載のヒト血小板のＡＤＰ凝集
曲線を示す。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】二重特異性を有するハイブリッドモノクロ
   ーナル抗体であって二重特異性の一方が活性化血小板に
   対するものであり、他方が血栓溶解作用を有する物質に
   対するものである抗体。
2. 【請求項２】活性化血小板がトロンビンで活性化したヒ
   ト血小板である請求項１記載の二重特異性抗体。
3. 【請求項３】血栓溶解作用を有する物質がプロテアーゼ
   である請求項１記載の抗体。
4. 【請求項４】プロテアーゼがウロキナーゼである請求項
   ３記載の抗体。
5. 【請求項５】プロテアーゼがプロウロキナーゼである請
   求項３記載の抗体。
6. 【請求項６】プロテアーゼがティッシュプラスミノーゲ
   ンアクチベータである請求項３記載の抗体。
7. 【請求項７】請求項１記載の抗体に、血栓溶解作用を有
   する物質を免疫結合させてなる血栓溶解剤。
8. 【請求項８】血栓溶解作用を有する物質がプロテアーゼ
   である請求項６記載の血栓溶解剤。
9. 【請求項９】プロテアーゼがウロキナーゼである請求項
   ７記載の血栓溶解剤。
10. 【請求項１０】プロテアーゼがプロウロキナーゼである
    請求項７記載の血栓溶解剤。
11. 【請求項１１】プロテアーゼがティッシュプラスミノー
    ゲンアクチベータである請求項７記載の血栓溶解剤。