JP2938214B2 - 血小板凝集阻害作用を持つ新規なモノクローナル抗体、およびその断片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト血小板凝集を強力に
阻害する活性がある新規なモノクローナル抗体、及びそ
の断片に関する。更に詳しくは、本発明は血小板膜糖蛋
白質（グリコプロテイン）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（以下ＧＰ
ＩＩｂ／ＩＩＩａという）に対する特異性、親和性に優
れ、かつヒトの血小板凝集を強力に阻害し、機能的なフ
ィブリノーゲン受容体としてのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複
合体の精製や抗原量の測定により有利に用いることが出
来るばかりでなく、巨核芽細胞の分化のマーカー分子と
して新規な血小板増殖因子の探索の手段として用いた
り、更には体内診断薬として血小板血栓の部位やＧＰＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａを表面に発現するようになったある種の
癌細胞の部位を探索したり、或は血小板凝集を伴った疾
患やＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを表面に発現するようになっ
たある種の癌細胞を含む癌の治療薬としても利用できる
可能性を持つ新規なモノクローナル抗体、及びその断片
に関する。

【０００２】

【従来の技術】血小板は血液中に存在する無核細胞であ
る。流血中の血小板は、傷害された血管内皮細胞に接触
すると、そこで粘着、凝集反応を起こす。この反応は生
理的な止血機序にとって重要な意味を持っている。この
反応に、血小板表面に存在する膜蛋白質群が重要な役割
を果たしていることが知られている。中でもとりわけ重
要なのがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと呼ばれる膜蛋白質複合
体である。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは血小板活性化に伴っ
てＣａ^２＋濃度依存的にコンフォーメーション変化を起
こし、フィブリノーゲン受容体として機能し、血小板を
架橋する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａはＲＧＤ（アルギニン
−グリシン−アスパラギン酸）配列を持った蛋白質分子
群に対する受容体群（インテグリン・ファミリー）の一
員である。その他の膜蛋白質群についても、各々血小板
機能に深く関与した物質であることが近年次々と明らか
になってきている。例えば、トロンビン凝集にはＧＰＩ
ｂ／ＩＸ及びＧＰＶが重要な役割を果たしている。ま
た、ＰＡＤＧＥＭ／ＧＭＰ１４０のように血小板活性化
にともなってその表面上に表れる分子も発見されてい
る。

【０００３】一方で生理的な止血機序に関わっているの
みでなく、数々の血栓性疾患に血小板は深く関与してい
ることが知られている。血栓性疾患に於て、血栓の位置
を感度高く、また精度良く知ることは治療戦略を立てる
上で重要なことであり、これまでにフィブリノーゲンを
放射性標識したり、血小板を放射性標識して血栓部位を
探索する試みが数多く行われてきた。しかしながら、こ
れらの技術は未だその特異性、精度に於いて不十分なも
のであり、改善が期待されている。また他方では、ティ
ッシュー・プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−Ｐ
Ａ）やｓｃｕ−ＰＡ等の新しい血栓溶解剤を用いた心筋
梗塞の治療に於ける再開通後再閉塞や、狭心症治療に於
けるＰＴＣＡ後再狭窄といった問題に於いて明らかにな
ってきたように、一つの機序に基づいた治療のみでは現
在の段階では完全な治療は困難で、血栓性疾患の治療に
於いても、血小板機能を抑えることが重要な課題になり
つつある（これらの点についてはたとえばＮ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３２２巻第１号第３３頁（１９９０
年）に詳しく記述されている。）。血小板機能を抑える
上では、フィブリノーゲン受容体として血小板凝集の最
終段階で機能するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの位置づけはた
いへん重要である。

【０００４】ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの血小板活性化に伴
う分子の変化を調べる為の探り針（ｐｒｏｂｅ）とし
て、或は巨核芽細胞の分化のマーカー分子として、また
はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ欠損性疾患である血小板無力症
等の病因を探る手段として、等種々の目的でこれまでに
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するいくつかの抗体が得られ
てきた。例えばＡＰ２［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
第７１巻第３８５頁（１９８３年）］，ＬＪＰ５［Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第７６巻第１９５０頁（１９
８５年）］，ＰＡＣ−１［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第
２６０巻第２０号第１１１０７頁（１９８５年）］，Ｇ
ｉ４［Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．第３８巻第５４７頁（１
９８５年）］等である。いくつかの抗体については、血
栓の部位探索の体内診断薬、或は抗血小板剤としての利
用が考えられ、研究が進められてきた。

【０００５】こうした動きの中で、本発明の抗体と類似
する抗体として、コラー等（Ｃｏｌｌｅｒｅｔ ａ
ｌ．）は複数の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル
抗体を発展させた。このうち１０Ｅ５と名付けられた抗
体及びその断片は文献［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，第７２巻第３２５頁（１９８３年）］によって公
知であり、７Ｅ３と名付けられた抗体及びその断片は、
特許公報［特開昭６２−３０７２８号及び特開昭６２−
２９９９５号］によって公知である。これら２つの抗体
はマウス骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ＢＡＬＢ／
ｃと予め血小板によって免疫処置されたマウスからの脾
細胞との融合によって形成されたハイブリドーマによっ
て産生されるモノクローナル抗体で、１０Ｅ５は正常血
小板とは容易に反応するがイヌ血小板とは反応せずＡＤ
Ｐによって誘発されるフィブリノーゲンの血小板との相
互作用を阻止することを特徴とするＩｇＧ_２ａクラスの
モノクローナル抗体であり、７Ｅ３は正常ヒト血小板及
びイヌ血小板と容易に反応し、ＡＤＰによって誘発され
るフィブリノーゲンの血小板との相互作用を完全に阻止
することを特徴とするＩｇＧ_１クラスのモノクローナル
抗体である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】１０Ｅ５はそのサブク
ラスがＩｇＧ_２ａである。マウスＩｇＧ_２ａは、ＩｇＧ
_１とは異なり、補体系を活性化する。生体内で補体系を
活性化することは、治療薬として抗体を用いようとする
時、血小板減少など、本来期待すべき作用とは異なる副
作用を惹起せしめる可能性が高く、不利にはたらくこと
がある。また７Ｅ３はイヌ血小板と反応性であるが、こ
のことは霊長類の血小板とのみ反応するタイプの抗体に
比較して、その特異性に於いて劣ると考えられる。また
７Ｅ３は血小板に対する親和性に於いても若干ではある
が１０Ｅ５に劣っている（７Ｅ３ではＫｄ値が３．４ｎ
Ｍ、それに対して１０Ｅ５ではＫｄ値が１．２ｎＭ
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第７６巻第１０１頁（１
９８５年））。

【０００７】またこれらを含む従来のモノクローナル抗
体は、抗原に対する親和性、或は特異性に劣り、動物に
投与した際に血小板減少をもたらしたり、血管内皮細胞
に結合して血管内皮傷害の恐れがあるなど、治療薬、或
は体内診断薬の材料として考えるとき、或は巨核芽球系
細胞の分化マーカーその他の目的に用いるとき、未だ不
十分であり、その改善が強く望まれていた。すなわち、
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体とし
て１０Ｅ５及び７Ｅ３モノクローナル抗体等に優る性質
を有し、しかも治療薬としてはヒト試験に先立ち生体内
試験が行ない得るようにサル等の試験動物血小板とも反
応する抗体の提供が強く望まれていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を克服するため、予め血小板及びその可溶化膜画
分によって免疫されたマウスからの脾細胞とＰ３Ｘ６３
Ａｇ８／Ｕ１マウス骨髄腫細胞との融合によってハイブ
リドーマを形成し、下記性質を持つことを特徴とするモ
ノクローナル抗体の取得を試み、成功した。本発明のモ
ノクローナル抗体は、ヒト血小板と反応性であり、高い
親和性を持ち（非活性化血小板上で解離定数 Ｋｄ＝
０．８３±０．１５ｎＭ）、かつ、ヒト血管内皮細胞と
実質上非反応性である。また、サル血小板と反応性であ
り、イヌ、ウサギ、ラット、マウスの血小板とは非反応
性である。また、ヒト及びサルのアデノシン二燐酸（Ａ
ＤＰ）、ウマ腱コラーゲン、トロンビン、アラキドン
酸、エピネフリンによる血小板凝集反応をｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで阻害する。本発明のモノクローナル抗体はヒト血
小板上の抗原決定因子を認識し、その抗原決定因子はＧ
ＰＩＩｂ／ＩＩＩａであることを特徴としている。

【０００９】しかし、ヒト血小板膜をドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）で可溶化、変性し、電気泳動を行っ
て、ニトロセルロース膜上に転写して調製したＧＰＩＩ
ｂおよびＩＩＩａには非反応性である。更に、ヒト血小
板上に活性化時にのみ発現されるフィブリノーゲン受容
体と反応性であり、ヒト血小板の活性化時にフィブリノ
ーゲンとの相互作用を阻害する。そして、ＧＰＩＩｂ／
ＩＩＩａのフィブリノーゲン結合部位、或いはその近傍
を抗原決定部位として認識する。本発明のモノクローナ
ル抗体はＩｇＧであり、そのサブクラスはＩｇＧ_１アイ
ソタイプである。更に本発明抗体は、サルに静脈内単回
投与した実験において、血小板減少を引き起こさず、Ａ
ＤＰ、ウマ腱コラーゲンによる血小板凝集反応をｅｘ
ｖｉｖｏで阻害する点で、抗血小板剤としての有用性も
高いものである。また、本発明抗体の蛋白質分解酵素に
よる消化断片例えばＦ（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′も同様の
活性を持つことを明らかにし、より応用の可能性を広げ
たものである。

【００１０】このような性質を有するモノクローナル抗
体、及び断片は従来全く知られておらず、新規なモノク
ローナル抗体、及び断片である。本発明のモノクローナ
ル抗体は、ＩｇＧ_１であるという点で上記１０Ｅ５とは
明確に異なり、イヌ血小板に反応しない、という点で上
記７Ｅ３とも明確に異なる。ＩｇＧ_１であるということ
は重要な意味を持つ。マウスＩｇＧ_２ａは補体系を活性
化させるので、治療薬としての利用を考えたとき不利で
ある。また、霊長類以外の血小板、例えばイヌ血小板と
本抗体が反応しないということは、本抗体が進化の過程
で保存されていない、霊長類に於いて特異的な特別な抗
原決定基を認識していると考えられ、その特異性の高さ
を裏付けるものと考えられる。本抗体は更にその血小板
への高い親和性、また血管内皮細胞とは反応しないとい
う特異性を大きな特徴としており、新規であるというば
かりではなく産業上有用な抗体である。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体、或は断片と
しては上記性質をすべて兼ね備えたものであればいずれ
も包括されるが、特にヒト血小板及びその可溶化膜画分
で感作して上述のように作製したモノクローナル抗体Ｃ
４Ｇ１及びその断片Ｆ（ａｂ’）_２Ｆａｂ’、Ｆａｂが
挙げられる。モノクローナル抗体Ｃ４Ｇ１はマウスハイ
ブリドーマＣ４Ｇ１、或はハイブリドーマＣ４Ｇ１を限
界希釈法等の方法で更にクローニングして選ばれるとこ
ろの、例えば抗体生産性が高いＣ４Ｇ１細胞の変種を培
地またはマウスの腹水中で培養することにより生産され
る。その断片Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂはモノ
クローナル抗体Ｃ４Ｇ１を、蛋白質分解酵素、好ましく
はトリプシン、パパイン、ペプシンからなる群より選ば
れた酵素を用いて消化し、適切な精製を行うことによっ
て得られる。或はＣ４Ｇ１遺伝子の一部を発現ベクター
に組み込み、大腸菌に導入して生産させることによって
も得ることが出来る。マウスハイブリドーマＣ４Ｇ１は
健常人血小板及びその可溶化膜画分で感作したＢａｌｂ
／ｃ系マウスの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３
Ａｇ８／Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）とを常法、例えばケーラーと
ミルスタイン（Ｋｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ）の細胞融合法により融合して得ることが出来る
（後記実施例参照）。（尚、マウスハイブリドーマＣ４
Ｇ１は工業技術院微生物工業枝術研究所に寄託され、受
託番号 微工研菌寄第１１８５２号を与えられた。）

【００１２】上記ハイブリドーマを培養する培地として
は、ダルベッコ氏変法イーグル氏最少必須培地（Ｄａｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｎｉｍｕｍ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ；以下ＤＭＥＭと略
称する）にウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、グルコー
ス、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール
及び抗生物質（例えばペニシリンＧ、ストレプトマイシ
ン、ゲンタマイシン等）を含有せしめた培地等が使われ
る。この発明のハイブリドーマの培養は通常、培地中で
３７℃にて５％二酸化炭素、９５％空気の気相で２〜４
日間、或は２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデ
カン（商品名プリスタン、アルドリッチ社製）で前処置
されたＢａ１ｂ／ｃ系マウスの腹腔内にて１０〜２０日
間程度で行われ、精製可能な量の抗体が産生される。こ
のように製造されたモノクローナル抗体は培養上清或は
腹水から蛋白質の単離精製の常法により分離精製するこ
とが出来る。そのような方法としては例えば、遠心分
離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、ハイドロキシルアパタイト、プロテイン−Ａ
アガロース等によるカラムクロマトグラフィー等が挙げ
られる。このように分離精製された抗体につき、常法に
より、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって
消化を行い、引続き蛋白質の単離精製の常法によって単
離精製を行って活性ある断片、例えばＦ（ａｂ’）_２、
Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖを得ることができる。

【００１３】

【実施例】以下実施例を掲記し、本発明を詳細に説明す
る。 実施例 １ ハイブリドーマＣ４Ｇ１の調製 ａ）血小板の調製 本発明のモノクローナル抗体は血小板の単離から始めて
次のように作られる。血液を正常のヒトのドナーから得
て、０．１Ｍクエン酸塩緩衝溶液で９：１（ｖ／ｖ）の
比で凝血防止した。このクエン酸塩含有血液を１６０×
ｇで１０分間遠心分離することにより血小板濃厚血漿
（ＰＲＰ）を調製した。更に２５０×ｇで１５分間遠心
分離することにより血小板を濃縮し、タイロード−ヘペ
ス（Ｔｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳ）緩衝液に再懸濁して血
小板濃縮体を単離した。

【００１４】このようにして調製した血小板濃縮体の一
部を用いて血小板膜画分を調製した。１０ ^９個／ｍｌ
に調製した血小板浮遊液１ｍｌを５ｍｌのグリセリン
（０−４０％）勾配に載せ、スイングローターを使って
４℃、１５００×ｇで３０分間、更に引き続いて６００
０×ｇで１０分間遠心して、ペレットを得た。このペレ
ットに０．４ｍｌの０．２５Ｍスクロース−１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を加えて充分ピペッティングしながら
浮遊させ、更にｖｏｒｔｅｘミキサーで５分間充分撹拌
した。これを３ｍｌのスクロースの上に重層し、スイン
グローターを使って４℃、６３，５００×ｇで６０分間
遠心した。このとき遠心管内で見られた両液の間の白い
層を、パスツールピペットを用いて吸い上げ、タイロー
ド−ヘペス緩衝液を５ｍｌ加えて充分混和し４℃、１０
５，０００×ｇで４５分間遠心した。このようにして得
られたペレットをそのまま−８０℃で次の目的に用いる
まで保存した。これが血小板膜画分である。これに１％
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００−生理食塩水を少量加えて溶解
し、更に蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製したものが
可溶化膜画分である。

【００１５】ｂ）免疫した脾細胞の調製 Ｂａｌｂ／ｃ系雌マウス（免疫開始時で６週齢）に、一
匹当り５×１０^９個の血小板を０．５ｍｌの燐酸緩衝生
理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させたものと、５０μｇ／
２５０μｌに調製した可溶化膜画分を同容量のフロイン
ド完全アジュバントと混合して乳濁化させたものを同時
に腹腔内投与した（初回免疫）。以後１〜２週間の間隔
で３回、別のドナーからの血小板及び初回免疫と同量の
可溶化膜画分を同容量のフロインド不完全アジュバント
と混合して乳濁化させたものでブースター投与を行っ
た。第４回免疫の６週間後、一匹当り５×１０^９個の血
小板を０．５ｍｌの燐酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）に
懸濁させて、腹腔内投与した（最終免疫）。最終免疫の
３日後に脾臓細胞を３匹のマウスから採取し、ＤＭＥＭ
培地に懸濁させた。赤血球は０．１７Ｍ塩化アンモニウ
ムで０℃にて１０分間処理することにより破壊し、遠心
分離することにより除去した。

【００１６】ｃ）ハイブリドーマＣ４Ｇ１の調製 上記で調製した脾細胞（５×１０^８個）をマウス骨髄腫
細胞 Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（１×１０
^８個）と、ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒ
ｅ，第２５６巻第４９５頁（１９７５年）参照］により
融合した。即ち脾細胞とＰ３Ｕ１細胞をＤＭＥＭで数回
洗浄した後、両者を５０ｍｌプラスチック製遠心管に入
れ、充分混合した。次いで遠心分離して培地を除去し、
これに３７℃に保温した５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレン
グリコール（シグマ社製、平均分子量３６４０）を含む
ＤＭＥＭ１ｍｌを１分間を要して撹拌下徐々に加えた。
次に３７℃に保温したＤＭＥＭ１０ｍｌを滴下して細胞
融合反応を終了させた。

【００１７】反応液を遠心分離し、上澄液を除去した
後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン（１×１０^−４Ｍ）、
アミノプテリン（４×１０^−７Ｍ）、チミジン（１．６
×１０^−５Ｍ）を添加した１０％ウシ胎仔血清を含むＤ
ＭＥＭ培地］を残さに加え、脾細胞濃度が５×１０^−５
細胞数／ｍｌになるようにした。この懸濁液を９６穴プ
ラスチック製プレートに、１穴当り２００μｌ（脾細胞
１×１０^−５個）ずつ分注した。３〜４日毎に培地の半
量を吸引除去し、上記ＨＡＴ培地を加えた。細胞融合の
７〜１０日後約半数の穴の中に於てハイブリドーマの増
殖がみられた。下記ｄ）及びｅ）の方法で培養上清中の
抗体活性を測定した。陽性のクローンは４８穴プラスチ
ック製プレートに移し、更に２４穴プラスチック製プレ
ートに移し、アミノプテリンをなくす以外は上述したも
のと同じ培地で培養した。クローンを拡張し、更に抗体
を産生する事を続けた細胞は、ＤＭＥＭ−１０％ＤＭＳ
Ｏ中に懸濁し液体窒素中にて冷凍した。単クローン性を
保証するために、このクローンは限界希釈法によって、
順次クローニングを行った。こうして得られたクローン
の１つをＣ４Ｇ１と名付けた。またハイブリドーマ・ク
ローンＣ４Ｇ１によって産生されるモノクローナル抗体
もＣ４Ｇ１と命名した。

【００１８】ｄ）抗血小板凝集活性の測定 ＰＲＰ（血小板濃厚血漿）（３×１０^８／ｍｌ）２００
μｌと検定されるべき培養上清或は腹水或は精製抗体標
品２５μｌを、シリコン・コートされた円筒型ガラスマ
イクロキュベット中で５分間３７℃で保温したのち、Ａ
ＤＰ、ウマ腱コラーゲン、アラキドン酸、エピネフリン
（シグマ社製）等の凝集惹起物質を添加し、３７℃で１
０分間保温した。２５０μｌのＰＰＰ（血小板欠乏血
漿）を対照として、８チャンネル血小板凝集測定装置
（ＨＥＭＡ−ＴＲＡＣＥＲ／二光バイオサイエンス社
製）にてその光透過度変化を測定した。血小板凝集活性
は光透過度の変化で表わし、血小板凝集阻害活性はＤＭ
ＥＭ或は標品を溶解している緩衝液を添加したときの最
大凝集活性を対照として求めた。

【００１９】ｅ）エライザ（ＥＬＩＳＡ）法による抗体
活性の測定 ９６穴平底マイクロタイタープレートの各ウェル（穴）
に可溶化膜画分或は精製したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを
０．０５Ｍ炭酸ナトリウムに１μｇ／ｍｌで溶解し、２
００μｌずつ添加し、湿潤室中で一晩４℃に保存した。
そののち、溶液を捨て、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭトリ
ス緩衝食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ８．０）を２００μｌずつ
添加し、３７℃で１時間静置し、各ウェルの未吸着画分
をブロックした。その後、０．０５％ツィーン２０（Ｔ
ｗｅｅｎ ２０，商品名）を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ）溶液で３分間ずつ数回洗浄を行った。

【００２０】Ｃ４Ｇ１培養上清或は腹水或は各種検体
を、０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＢＳＡ
−ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）溶液で希釈し、２００μｌずつ
各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応を行った。先と
同様にＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、ＢＳＡ−ＴＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ溶液で１μｇ／ｍｌに希釈した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（アマシャム社
製）を２００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で２時
間反応を行った。反応後、先と同様にＴＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ溶液で洗浄後、酵素基質として、０．００６％過酸化
水素水、並びに０．１ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’
−テトラメチルベンチジンを含む０．１Ｍ酢酸−クエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）を２００μｌずつ添
加し、室温で１５分間静置した。静置後、３Ｍ硫酸を５
０μｌずつ加え反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

【００２１】実施例 ２ モノクローナル抗体の産生と精製 ａ）モノクローナル抗体の産生 Ｂａｌｂ／ｃ系雌マウス、生後５〜６週齢に２，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン，商
品名、アルドリッチ社製）０．５ｍｌを腹腔内注射した
後、７〜１４日後に１×１０^７個のハイブリドーマＣ４
Ｇ１を生理的食塩水０．５ｍｌに懸濁して腹腔内に接種
した。１０〜２０日後に産生された腹水を屠殺開腹した
マウスより採取した。１匹のマウスより５〜１０ｍｌの
モノクローナル抗体含有腹水が得られた。

【００２２】ｂ）モノクローナル抗体の精製 この腹水につき遠心分離して不溶物除去後、等容量の飽
和硫酸アンモニウム溶液を加え、４℃で一晩撹拌した。
生じた沈澱を遠心分離し、少量の０．９％の塩化ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ燐酸緩衝溶液（ｐＨ８）に溶解し、
一晩４℃にて１００倍容の同緩衝液に対して透析を行
い、粗精製ガンマグロブリン画分を得た。この画分よ
り、ＭＡＰＳ−ＩＩマウスモノクローナル抗体精製キッ
ト（商標、バイオラッドラボラトリーズ社製）を利用し
てＩｇＧを精製した。即ち、ガンマグロブリン画分に同
容量のバインディングバッファーを加え、混合した後、
同じバインディングバッファーで充分平衡化したＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（ファル
マシア社製）を充填したカラム（ゲルベッドボリューム
２０ｍｌ）にかけ、バインディングバッファー１０カラ
ム容量で洗浄した。ついでキットに含まれる溶出バッフ
ァー約５カラム容量でＩｇＧを溶出した。溶出したＩｇ
Ｇは硫酸アンモニウムによる塩析にて濃縮し、０．９％
の塩化ナトリウムを含む０．０１〜０．１Ｍの燐酸緩衝
液等に対して透析し、これを抗体Ｃ４Ｇ１の精製標品と
した。通常腹水１ｍｌ当りＩｇＧとして７〜２１ｍｇの
抗体Ｃ４Ｇ１の精製標品が得られた。

【００２３】ｃ）モノクローナル抗体の酵素消化、フラ
グメントの調製 実施例２ｂにおいて精製した抗体Ｃ４Ｇ１精製標品につ
いて、その１００ｍｇ（／２０ｍｌ）を０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に透析し、同緩衝液に溶
解した１ｍｇのペプシン（シグマ社製）を添加し、３７
℃で１７時間孵置し、反応液に１規定水酸化ナトリウム
溶液を滴下し、ｐＨを８として反応を停止させた。生成
した不溶物を遠心分離で除いた後、遠心した上清液をＰ
ｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（フ
ァルマシア社製）カラムに通し、未反応のＩｇＧ及びＦ
ｃ断片を吸着させた後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０
０のカラムに添加し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む
１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて
ゲル濾過し、Ｆ（ａｂ’）_２断片を精製した。

【００２４】Ｆａｂ’は、このように調製したＦ（ａ
ｂ’）_２を１０ｍｇ／ｍｌとなるように０．１５ＭＮａ
Ｃｌ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）に透析、溶解し、終濃度が１０ｍＭとなるように２
−メルカプトエタノールを添加し、３７℃で９０分間反
応させた。反応後、反応液を氷水で冷却し、終濃度が１
２ｍＭとなるようにヨードアセトアミドを添加し、氷冷
しながら遮光して４５分間アルキル化反応を行った。反
応後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００のカラムに添加
し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてゲル濾過し、Ｆａ
ｂ’断片を精製した。

【００２５】実施例３ 血小板凝集阻害活性 実施例２において精製した抗体Ｃ４Ｇ１，Ｆ（ａｂ’）
_２断片及びＦａｂ’断片について実施例１ｄ）に示した
方法と同様の方法によって血小板凝集阻害活性を測定し
たところ、５μｇ／ｍｌ以上の濃度でＡＤＰ（２０μ
Ｍ）、ウマ腱コラーゲン（２００μｇ／ｍｌ）による凝
集を完全に阻害した。

【００２６】実施例４ サブクラスの決定 実施例２において精製した抗体Ｃ４Ｇ１を用いて、アマ
シャム杜製マウスモノクローナル抗体タイピング用キッ
トにより抗体Ｃ４Ｇ１のＩｇＧサブクラスを決定した。
本法はイムノブロット法によるものである。本法によっ
て、そのサブクラスをＩｇＧ_１と決定した。

【００２７】実施例５ 血小板との親和性 実施例２において精製された抗体Ｃ４Ｇ１及びＦ（ａ
ｂ’）_２、Ｆａｂ’各々について^１２５Ｉで標識し、静
止血小板への結合を調べた。標識は、ＨｕｎｔｅｒとＧ
ｒｅｅｎｗｏｏｄの方法（ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ法
［Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）．，第１９４巻第４９
５頁（１９６２年）参照］）に若干変更を加えた方法
（ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ添加量を１／１０に低減）
で行い、標識された抗体及びその断片Ｆ（ａｂ’）_２、
Ｆａｂ’とフリーの^１２５Ｉは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５カラムで分離した。^１２５Ｉの結合量は、４００〜
１８００ｃｐｍ／ｆｍｏｌｅであった。血小板は実施例
１ａ）において得られた血小板濃厚血漿（ＰＲＰ）を更
に改良Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（０．１３Ｍ ＮａＣｌ−
０．００２６Ｍ ＫＣｌ−０．０１２Ｍ ＮａＨＣＯ_３
−０．０００４Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４−５．５ｍＭｇｌｕ
ｃｏｓｅ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２％ ｂｏｖｉｎｅ ｓ
ｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ｐＨ７．３）で３回、遠心
法で洗浄して抗体結合実験に供した。

【００２８】血小板浮遊液（３×１０^７／試験管）に一
定量の標識した抗体Ｃ４Ｇ１（１００または２００ｐ
Ｍ）と種々の濃度の非標識の抗体Ｃ４Ｇ１を添加し、室
温で１時間反応させた。反応総液量は０．５ｍｌとし、
抗体及び血小板の希釈はＥＤＴＡ不添加の前記緩衝液を
用いた。反応の停止は２ｍｌの氷冷した緩衝液を添加し
て行い、遠心分離後ペレット中の放射活性をγカウンタ
ーで測定した。非特異的抗体結合は２０μｇ／ｍｌ（標
識抗体の７００−４０００倍量）の非標識抗体を添加し
て測定した。特異的結合は、結合した全放射活性から非
標識抗体添加時の放射活性を差し引いて求めた。解離定
数及び結合サイト数の算出はＳｃａｔｃｈａｒｄの方法
［Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第５１巻第６
６０頁（１９４９年）参照］に従った。

【００２９】図１に抗体Ｃ４Ｇ１の静止血小板への特異
的結合を示す。特異的結合は添加した抗体Ｃ４Ｇ１の添
加量依存的に増加し、１５ｎＭで飽和した。また、図２
はＳｃａｔｃｈａｒｄｐｌｏｔの１例である。本例は５
例中の１例で、この図より解離定数（Ｋｄ）及び結合サ
イト数（Ｂｍａｘ）を求めると、解離定数０．７４ｎ
Ｍ、結合サイト数１０，６００であった。このようにし
て５名の健常血液提供者からの血小板の抗体Ｃ４Ｇ１に
対する解離定数と結合サイト数を算出し平均を求めた。
抗体Ｃ４Ｇ１の解離定数（５例の平均値；Ｍｅａｎ±
Ｓ．Ｅ．）を表１に示した。参考のため１０Ｅ５、７Ｅ
３の解離定数（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第７６巻
第１０１頁（１９８５年））を示す。また、結合サイト
数（５例の平均）は１２，０００±６，０００（Ｍｅａ
ｎ±Ｓ．Ｅ．）であった。

【００３０】 断片Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’の血小板に対する親和性
については、標識した抗体Ｃ４Ｇ１の結合に対する競合
で調べた。Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’ともに非標識の抗
体Ｃ４Ｇ１による阻害とほとんど変わらない結合阻害曲
線を描き（図３）、また、^１２５Ｉ標識したＦ（ａ
ｂ’）_２、Ｆａｂ’の解離定数、結合サイト数について
も検討したが、本抗体Ｃ４Ｇ１は断片化（Ｆ（ａｂ’）
_２、Ｆａｂ’）してもその活性に大きな差はなかった。

【００３１】実施例６ 血管内皮細胞との結合性 抗体Ｃ４Ｇ１の血管内皮細胞に対する結合性を調べた。
血管内皮細胞は市販のＥＮＤＯＣＥＬＬ^ＴＭ（クラボウ
社）の３代継代目のものを用いた。サブコンフルエント
迄培養した細胞をＥＤＴＡ処理ではがし、ＰＢＳで３
回、遠心法で洗浄し、２％ＦＣＳ−ＰＢＳ（−）０．１
％ＮａＮ_３に再浮遊して抗体結合実験に供した。血管内
皮細胞浮遊液（１×１０^６／試験管）に種々の濃度の実
施例２において精製した抗体Ｃ４Ｇ１、及び、対比のた
め抗ＰｒｏｔｅｉｎＳ抗体（ＩｇＧ：血管内皮細胞とは
反応しない）と抗ＣＤ５９抗体（ＩｇＧ：血管内皮細胞
と反応する）を添加し、０℃で３０分反応させた。抗体
及び血管内皮細胞の希釈には２％ＦＣＳ−ＰＢＳ（−）
０．１％ＮａＮ_３を用いた。同溶液で３回、遠心法
（１，４００×ｇ）によって洗浄を行なった後、ＦＩＴ
Ｃ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製：Ｎ１０３
１）を上記溶液で１／５０の濃度に希釈した溶液を加
え、０℃で３０分反応させた。再度３回洗浄し１×１０
^６／ｍｌの濃度に再浮遊させ解析まで氷冷保存した。

【００３２】このように調製された血管内皮細胞をＥＰ
ＩＣＳ−Ｐｒｏｆｉｌｅ（コールター社）にて解析し
た。本解析では、細胞に結合した抗体及びその抗体に結
合した蛍光標識された抗体の量が蛍光強度として表わさ
れ、それぞれの蛍光強度に対する細胞数と対比される。
すなわち相対的な蛍光強度（対数値として多く表わされ
る）を横軸にとり、相対的な細胞数を縦軸にとるとき、
分布曲線のピークがより右に移動すればするほど、より
多くの抗体が細胞表面上に結合していることを反映して
いる。図４に抗体Ｃ４Ｇ１の血管内皮細胞への結合解析
のプロフィールの１例を示す。抗体Ｃ４Ｇ１の濃度を変
えて調べたが、２００μｇ／ｍｌと高い濃度でも抗体Ｃ
４Ｇ１は、血管内皮細胞と結合しないことが知られてい
る抗ＰｒｏｔｅｉｎＳ抗体のプロフィールと一致したプ
ロフィールを示し血管内皮細胞と特異的に結合しないこ
とが示された。

【００３３】実施例７ フィブリノーゲンの結合に対する影響 ＨｕｎｔｅｒとＧｒｅｅｎｗｏｏｄの方法に若干変更を
加えた方法（ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ添加量を１／１
０に低減）でヒトフィブリノーゲン（シグマ社製）を
^１２５Ｉで標識し、標識されたフィブリノーゲン抗体と
フリーの^１２５Ｉは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム
で分離した。^１２５Ｉの結合量は、０．０２μＣｉ／μ
ｇであった。ＡＤＰ（１０μＭ）で予め刺激した血小板
（３×１０^７／試験管）すなわち活性化血小板に^１２５
Ｉ−フィブリノーゲン（１μｇ）を、非放射性標識フィ
ブリノーゲン或は実施例２において精製した抗体Ｃ４Ｇ
１の存在下に添加し、室温で１時間反応させた。抗体Ｃ
４Ｇ１は５０ｎＭで^１２５Ｉ−フィブリノーゲンの結合
をほぼ完全に阻害し、その阻害活性の強さは５０％阻害
濃度でみるとき非標識フィブリノーゲンの１００倍以上
であった。静止血小板に対しては、^１２５Ｉ−フィブリ
ノーゲンの特異的結合は全くみられなかった。横軸に添
加蛋白質濃度をとり、縦軸に血小板に結合したフィブリ
ノーゲンの放射活性線を示した。

【００３４】実施例８ サルに於ける（ｅｘ ｖｉｖｏ）血小板凝集抑制効果 実施例２において精製したＣ４Ｇ１Ｆ（ａｂ’）_２を生
理食塩水中１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製し、カ
ニクイザル（雄、３〜６ｋｇ）に、０．４ｍｇ／ｋｇ
（２匹）および１．０ｍｇ／ｋｇ（２匹）の用量で静脈
注射した。０（投与直前）、１、３、６、２４、７２時
間後に塩酸ケタミンを用いた麻酔下、採血を行った。プ
ラセボ・コントロールは実験に用いたのと同じサルを用
いて、投与３週間前に生理食塩水を投与してデータを得
た。

【００３５】採血された血液はすぐにクエン酸と９：１
の比で混ぜ合わせて、凝固を防ぎ、１５０×ｇで１０分
間遠心し、ＰＲＰを調製した。更に残さよりＰＰＰを調
製した。このＰＲＰとＰＰＰを用いてＡＤＰ２０μＭに
よる血小板凝集活性を実施例１ｄと同様の方法によって
測定した。０時間の値を１００（％）として、血小板凝
集活性の時間的推移を調べた。この結果を、横軸に時間
をとり、縦軸に血小板凝集活性をとって、図６に示すよ
うに、１．０ｍｇ／ｋｇの投与では２４時間まで、０．
４ｍｇ／ｋｇの投与でも（少なくとも）６時間まで完全
に血小板凝集は阻害された。ＰＰＰを用いて、ＰＴＴお
よび、ＥＬＩＳＡによってＣ４Ｇ１Ｆ（ａｂ’）_２の血
中濃度を測定した。

【００３６】採血した血液の一部についてはＥＤＴＡを
用いて凝固を防ぎ、血小板数、白血球数、赤血球数、ヘ
マトクリット値等血液学的パラメターを調べた。０．４
ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇのいずれの投与量でも、
血小板数をはじめとして、白血球数、赤血球数、ヘマト
クリット、ＰＴＴいずれのパラメターに於いても大きな
変動は認められなかった。このように、Ｃ４Ｇ１Ｆ（ａ
ｂ’）_２はサルの血小板凝集を、血小板減少を伴わずに
強力に阻害することが示された。

【００３７】

【発明の効果】このようにして得られた抗体、及びその
断片は、血小板に対するその強い親和性と、血小板にの
み反応し、血管内皮細胞には反応せず、ＧＰＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａのフィブリノーゲン結合部位或はその近傍に反応
するという高い特異性故に、血小板含有部位（例えば血
小板血栓）の位置に関するきわめて正確な情報を提供で
きる。これまでに知られている活性化血小板特異的と呼
ばれている抗体の多くは実は血管内皮細胞上にもその抗
原決定基が存在する（例えばＰＡＤＧＥＭ／ＧＰ１４０
に対する抗体）。本抗体の抗原決定基は活性化血小板上
には存在するが、血管内皮細胞上には存在しない。従っ
て、その有用性は遥かに大きいと考えられる。

【００３８】本発明の抗体或はその断片のヒト、或はサ
ル血小板凝集に対する阻止能力はきわめて強く、しかも
（サル）体内に投与したときその効果が長時間持続す
る。更に、その際に血小板数の変動（血小板減少）を引
き起こさないことから、血小板凝集が関与する疾患（血
栓性疾患、不安定狭心症、その他）の治療薬として使用
される。

【００３９】本発明の抗体或はその断片は検出可能標
識、例えば放射性標識、蛍光団、或はＮＭＲコントラス
ト剤を形成する常磁性イオンで以て標識を付け、人の患
者に於ける血小板血栓含有部位を検出するのに、患者へ
標識化抗体を投与しそして標識化された免疫複合体を検
出することを含む方法に於て、使用される。本発明の抗
体或はその断片はある種の癌細胞（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ
ａをその表面に発現するようになった細胞）の部位探索
診断薬、或はその治療薬としても使用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明における抗体Ｃ４Ｇ１の静止血小
板への特異的結合を示す。

【図２】図２は抗体Ｃ４Ｇ１の静止血小板への特異的結
合のＳｃｈａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔの１例を示す。

【図３】図３は抗体Ｃ４Ｇ１断片の血小板に対する親和
性の比較を示す。

【図４】図４は抗体Ｃ４Ｇ１の血管内皮細胞に対する結
合性の解析結果を示す。

【図５】図５はフィブリノーゲンの結合に対する抗体Ｃ
４Ｇ１の影響を示す。

【図６】図６はＣ４Ｇ１Ｆ（ａｂ’）_２のサルでのｅｘ
ｖｉｖｏ血小板凝集阻害効果の時間的推移を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６０７ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ ６３５ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ (72)発明者 古市 喜義 埼玉県浦和市太田窪２−15−21 (56)参考文献 特開 昭62−30728（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／200（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／4634（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／11538（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/08 C07K 16/28 C12N 5/18 - 5/20 C12N 15/06 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を持つことを特徴とするモノク
   ローナル抗体或いはモノクローナル抗体を蛋白質分解酵
   素で消化することにより得られうる断片。 （ａ）ヒト血小板と反応性であり、高い親和性を持ち、
   かつ、ヒト血管内皮細胞と実質上非反応性である。 （ｂ）サル血小板と反応性である。 （ｃ）ヒト及びサルの血小板凝集反応をｉｎ ｖｉｔｒ
   ｏで阻害する。 （ｄ）ヒト血小板上の抗原決定因子を認識し、その抗原
   決定因子は糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／Ｉ
   ＩＩａ）である。 （ｅ）ヒト血小板上に活性化時にのみ発現されるフィブ
   リノーゲン受容体と反応性であり、ヒト血小板の活性化
   時にフィブリノーケンとの相互作用を阻害する。 （ｆ）ＩｇＧ _１ アイソタイプである。
2. 【請求項２】 蛋白質分解酵素がトリプシン、パパイ
   ン、ペプシンからなる群から選ばれた酵素であることを
   特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体断片。
3. 【請求項３】 Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆ
   ｖからなる群から選ばれた断片である請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体断片。
4. 【請求項４】 標識化した請求項１乃至３記載のモノク
   ローナル抗体或いはモノクローナル抗体断片。
5. 【請求項５】 請求項１記載の抗体を産生することがで
   きるハイブリドーマ。
6. 【請求項６】 ハイブリドーマが、ハイブリドーマＣ４
   Ｇ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８５２）或いはその変種であ
   る請求項５記載のハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 請求項１乃至３記載のモノクローナル
   抗体或いはモノクローナル抗体断片を含むことを特徴と
   する血小板凝集阻害剤。