JPH03103175A - ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤 - Google Patents

ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤

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JPH03103175A
JPH03103175A JP1208936A JP20893689A JPH03103175A JP H03103175 A JPH03103175 A JP H03103175A JP 1208936 A JP1208936 A JP 1208936A JP 20893689 A JP20893689 A JP 20893689A JP H03103175 A JPH03103175 A JP H03103175A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は二重特異性を有するハイブリッドモノクローナ
ル抗体に関する。さらに詳しくは二重特異性の一方がフ
ィブリンに対するものであり、他方が血栓溶解作用を有
する物質に対するものであるハイブリッドモノクローナ
ル抗体（以下、ハイブリッドＭｏＡｂと略記することが
ある）および該抗体を産生ずるポリドーマに関する。
本発明はまた、上記のハイブリッドＭｏＡｂに血栓溶解
作用を有する物質を免疫結合させてなる血栓溶解剤に関
する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕血栓
溶解療法は古くから心筋梗塞，動脈塞栓症，脳梗塞など
の血栓性疾患の治療法として用いられ、当初はストレプ
トキナーゼ（以下、ＳＫと略記することがある）やウロ
キナーゼ（以下、ＵＫと略記することがある）などが有
用な血栓溶解剤として臨床応用された。特にＵＫはフィ
ブリン溶解能が高いことから比較的繁用されてきたが、
フィブリンに対する選択性が低く、フィブリノーゲンに
対しても作用し、投与患者に出血傾向を生ぜしめる欠点
を有している。かかる欠点を踏まえて、次に第２世代の
血栓溶解剤としてティッンユプラスミノーゲンアクチベ
ータ（以下、ＴＰＡと略記することがある）やプロウロ
キナーゼ（以下、Ｐ　ｒｏＵ　Ｋと略記することがある
）が登場した。これらはＵＫに比べてフィブリン選択性
が高いため、ＵＫでみられた出血傾向の副作用を軽減す
ると予測され、数多くの研究がなされた。特に最近では
遺伝子組み換え技術を利用することによって大量生産の
途が開かれたことから、臨床への応用も盛・んである［
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　　Ｓｔ
ｕｄｙ　　Ｇｒｏｕｐｒｏｒ　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ　　Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ　　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇ
ｅｎＡｃｔ　ｉｖａｔｏｒ　：ランセット（Ｔｈｅ　　
Ｌａｎｃｅｔ），　８　４　２（１９８５））　　。
しかしこれらの臨床応用の結果、ＴＰＡなどにも幾つか
の問題かあることが分かってきた。すなわち、■ＴＰＡ
の半減期は非常に短かく（２〜３分），血栓溶解には多
量のしかも長時間の投与が必要なこと，■かかる大量療
法では必ずしも出血傾向の低減を期待できないことなど
である。
そこでさらに効果的な血栓溶解剤の研究・開発がなされ
、修飾ＴＰＡや，ＵＫあるいはＰｒｏＵＫとＴＰＡとの
ハイブリッド蛋白などが作製された。
修飾ＴＰＡに関しては、半減期低下の原因と考えられる
糖鎖構造を一部欠失したＴＰＡムテインを遺伝子工学的
に作製し、肝細胞などの糖鎖レセプターによる捕捉を避
け、血中動態の改善をはかっている。またＵＫ−ＴＰＡ
のハイブリッド蛋白ではＵＫの強い血栓溶解能とＴＰＡ
のフィブリン親和性とを併用し、投与量の軽減を目指し
ている。
これらの血栓溶解剤は従来のものと比べ若干の出血傾向
の減少をもたらすと期待できるが、大巾な改善について
はさらに今後の研究・開発が待たれる。
次に第３世代の血栓溶解剤として、抗体ターケッティン
グを利用した蛋白複合体が登場した。すなわち実質的に
フィブリノーゲンには反応せずフィブリンにのみ高い親
和性を有する抗体をＵＫ［：ＣＢｏｄｅら：サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ），　２　２　９　，　７　６　５（
１９８５））やＴ　Ｐ　Ａ　（Ｍ．　Ｓ．　Ｒｕｎｇｅ
ら：プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス　ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８４．７６５９（
１　９８７））に化学結合させることにより、フィブリ
ノーゲンの分解を伴うことなくフィブリンのみを分解す
る血栓溶解剤が開発された。かかる抗体ターゲッティン
グ化血栓溶解剤はｉｎ　　ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ　　
ｖｉｖｏ実験で、いずれもＵＫやＴＰＡ単剤よりも３−
１００倍の効果を示したと報告されている。しかしなが
らこれらの蛋白複合体では、いずれも抗体と血栓溶解酵
素とを化学結合させており、従って■化学結合操作時に
抗体活性および酵素活性の低下を伴うこと，■抗体と酵
素とのｌ：ｌ蛋白複合体を収率良く得ることが困難なこ
と，あるいは■蛋白変性の結果、投与患者体内での代謝
が早まること、などの欠点を有している。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、上記に示した生体内代謝，フィブリン親
和性，血栓溶解能などに関する従来の血栓溶解剤でみら
れた問題点を解決するため、近年開発された二重特異性
ハイブリソドモノクローナル抗体の新技術に着目し、血
栓溶解活性物質をかかる二重特異性ハイブリッドモノク
ローナル抗体に免疫結合させ、抗体活性および血栓溶解
活性の低下を伴わないような、二重特異性ハイブリッド
モノクローナル抗体と血栓溶解活性物質とのｌ：ｌ免疫
複合体を作製して、フィブリンに特異的で副作用のない
血栓溶解剤を開発した。すなわち本発明は、二重特異性
を有するハイブリッドＭｏＡｂであって、二重特異性の
一方がフィブリンに対するものであり、他方が血栓溶解
作用を有する物質に対するものである抗体、およびこれ
を産土するポリドーマを提供するものである。
また本発明は、上記二重特異性ハイブリッドモノクロー
ナル抗体に血栓溶解作用を有する物質を免疫結合させて
なる血栓溶解剤を提供するものである。
本発明で用いられる抗フィブリン抗体産生ノ１イブリド
ーマの作製にあたっては、該ハイブリドーマがフィブリ
ノに特異的で実質的にフィブリノーゲンと結合しないＭ
ｏＡｂを産生するものであればいずれのものでもよい。
例えばかかるフィブリン特異抗体は、フィブリノーゲン
が分解されて生ずるフィブリンの、α鎖Ｎ末端フラグメ
ントベブチドあるいはβ鎖Ｎ末端フラグメントペブチド
を免疫原として用いることにより作製される［Ｋ．　Ｙ
．Ｈｕｉら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）．　２　２
　２　，　１　１　２　９（１９８３），あるいは特開
昭６３−９３８００号公報〕。また、フィブリンは噛乳
動物のものであればいずれでもよいが、好ましくはヒト
フィブリンが挙げられ、とりわけヒトフィプリンのβ鎖
Ｎ末端部に相当するペプチドが用いられる。これにキャ
リア蛋白を結合させて、動物（例、ウサギ，ラット，マ
ウス，モルモノトなど）を免疫し抗体産生細胞を得る。
次いで免疫動物より採取したこれらの抗体産生細胞、例
えば肝臓細胞やリンパ節細胞などを骨髄腫細胞と融合し
、得られるハイブリドーマの中から実質的にフィブリノ
ーゲン、に反応せずフィブリンに特異的に結合する抗体
産生細胞をスクリーニングする。上記のヒトフィブリン
β鎖Ｎ末端ペブチドとして、次のごときアミノ酸配列を
有するものが特に好ましく用いられる。
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｒ−Ｃｙｓ−０１１〔式中、ＲはＬ　ｙｓ　
−　Ａ　ｒｇ　−　Ｇ　ｌｕ　−　Ｇ　ｌｕで示される
ベブチド又はその一部を示す〕。Ｃ末端のＣｙｓはキャ
リア蛋白との化学結合用のリンカ一部に用いられる。す
なわちキャリア蛋白を予め、例えばＮ一（γ−マレイミ
ドブチリルオキシサクシニミド）（以下、ＧＭＢＳと略
記することがある）でマレイミド化あるいはＮ−サクシ
ニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（以下、ＳＰＤＰと略記することがある）でジチオビリ
ジル化することにより、上記ペブチドのＣ末端Ｃｙｓの
ＳＨ基を介してキャリア蛋白に化学結合させることが可
能である。
また本発明における血栓溶解作用を有する物質としては
、血栓溶解能を持つ蛋白あるいは血栓溶解作用を促進す
る物質であれぽい”ずれのものでも良い。これらの例と
して、プロテアーゼおよびその前駆体，あるいは血栓溶
解促進物質（例、ＴＰＡＵＫ，ＰｒｏＵＫ，ＳＫ，　ト
リブシン，ブラスミン，プロテインＣ，プロテインＳな
ど〉などが挙げられ、なかでもプロテアーゼが好ましく
、さらに好ましくはＴＰＡおよびＵＫなどが用いられる
。またＴＰＡについては一本鎖および二本鎖のいずれの
ものでもよく、またＵＫについても一本鎖および二本鎖
のいずれの．ものでもよ＜　［Ｅ　，　ｌｌａｂｅｒら
，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）．　２　４　３　．　
５　１　（　１　９　８　９　）］、低分子ＵＫ　＋　
Ｐ　ｒｏＵ　Ｋなどを用いてもよい。抗体産生ハイブリ
ドーマの作製については、上記の蛋白を常法に従い動物
に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融
合させる方法が用いられる。特に抗ＵＫ抗体産生ハイブ
リドーマの作製については、低分子ＵＫを動物に免疫し
て得られる抗体産生細胞を用いるのが好都合である。動
物を免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと
融合させ、抗体産生ハイブリドーマを得る方法について
は、抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマを得る方法と
同様な操作を行ってもよい。
免疫動物としては、例えばウサギ，ラット，マウス，モ
ルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製造の場合には
マウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては、
通常実施される方法に従えばよく、例えばマウスに１回
１〜１００μｇ１好ましくは１０〜２５μｇを等容量（
０．１ｄ）の生理食塩水およびフロイントの完全アジュ
バンドで乳化して、背部，腹部の皮下あるいは腹腔内に
２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。
これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に牌臓およびあるいはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施で
き、融合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下
、ＰＥＧと略することがある）やセンダイウイルスなど
が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄
腫細胞としてはＮｉｌ、Ｐ３Ｕ　ｌ，Ｓ　Ｐ２／０など
、特にＰ３Ｕ　１が好ましく用いられる。例えば牌臓細
胞と骨髄肺細胞との好ましい比率は１：ｌ〜１０：ｌで
、これに分子量１，０００〜６，０００のＰＥＧが１０
〜８０％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好ましくは
３０〜３７℃で３〜１０分インキコベートするのが良い
。
抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
には種々の方法が使用できる。例えば、マイクロプレー
トにフィブリノーゲンを吸着させたのち、トロンビンを
作用させフィブリノーゲンをフィブリンに変換する。次
いで過剰のフィブリノーゲン存在下でハイブリドーマ培
養上清をフィブリン固定マイクロプレートに添加し、プ
レートに結合した抗フィブリン特異抗体を検出する酵素
免疫測定法（以下、ＥｔＡと略記することがある）によ
り培養土清中の抗体価を測定する。ＨＡＴ（ヒボキサン
チン・アミノブテリン・チミジン）添加培地で選別、育
種された抗体活性陽性のハイプリドーマは直ちにクロー
ニングに供されるが、通常これは限界希釈法などで容易
に実施される。クローン化されたハイブリドーマ培養上
清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高い
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、目的とするモ
ノクローナルな抗フィブリン特異抗体産生ノ＼イブリド
ーマを取得することができる。
以上のような製造法に従って、作製した抗フィブリン抗
体産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例１に示
したＦＩＢ　　１１１，ＦＩＢ　　２ｌ１が挙げられる
。
また血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を産生ずる
ハイブリドーマのスクリーニングは、それぞれ該物質を
吸着させたマイクロプレートを用いるＥＩＡで簡便に実
施できる。クローニングも上記した常法に従って実施し
、目的の抗体産生ノ＼イブリドーマを取得できる。
以上のような製造法に従って作製した抗ＴＰＡ抗体産生
ハイブリドーマの例として、後述の実施例２に示したＴ
ＰＡ　　１−４１，ＴＰＡ　　１−７０，ＴＰＡ　　２
−１４また抗ＵＫ抗体産生ノ＼イブリドーマの例として
後述の実施例３に示したＵＫ　　１−３，ＵＫ　　ｌ−
１，および後述の実施例１２に示したｔＪＫ　　１−６
が挙げられる。
本発明の二重特異性を有するハイブリッドＭｏＡｂを産
生ずるポリドーマの作製には幾つかの手法があり〔例、
新本洋士ら：蛋白質・核酸・酵素，　　３３，２１７（
１９８８）など〕，いずれの方法を用いてもよいが例え
ば、■上記のＨＡＴ抵抗性の血栓溶解作用を有する物質
に対する抗体を産生ずるハイブリドーマを、５−プロモ
デオキシウリジン（以下、ＢｔｄＵと略記することがあ
る）添加の培養液に段階的に馴化させ、チミジンキナー
ゼ欠損株をクローン化しＨＡＴ感受性とする。同様にＨ
　Ａ　Ｔ抵抗性の抗フィブリン特異抗体産生ハイブリド
ーマを８−アザグアニン（以下、ＡｚＧと略記すること
がある）耐性とし、ヒポキサンチンーグアニンーホスホ
リポシルトランスフェラーゼ欠損株をクローン化しＨ　
Ａ　Ｔ感受仕とする。次いで常法に従い両者を融合して
得られるテトラオーマをＨＡＴ添加培地で選別後、フィ
ブリンおよび血栓溶解作用を有する物質の両者に結合能
を有するハイブリッドＭｏＡｂを分泌するテトラオーマ
をクローン化する，■抗フィブリン特異抗体産生ハイブ
リドーマをフルオレセイン・イソチオシアネート（以下
、ＦＩＴＣと略記することがある）で標識し、もう一方
の血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を産生ずるハ
イブリドーマをテトラメチル・ロタミン・イソチオシア
ネート（以下、ＴＲＩＴＣと略記することがある）で標
識後、常法に従い両者を融合する。得られた細胞懸濁液
をフルオレセイン・アクティベイティッド・セルソータ
−（以下、ＦＡＣＳと略記することがある）に供し、Ｆ
ＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣの赤色の蛍光を同時に有
するテトラオーマを選別・クローン化スるなどの方法が
挙げられる。また両親株のマーカーを全く逆にして使用
し、テトラオーマを選別・クローン化することも可能で
ある。
これらの操作における細胞融合に当ってはセンダイウイ
ルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは電気刺激など
の方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが用いられ、以
下にその一例を挙げるが、もちろんこの方法に限定され
るものではない。すなわち、重合度約ｔ．ｏｏｏ〜６，
０００，濃度約１０〜８０％等のＰＥＧが用いられ、処
理時間は約０．５〜３０分であるが、好ましい条件の一
例として、約３５〜５５％のＰＥＧ　６，０００を約４
〜１０分間、３７゜Ｃで細胞と接触させ、効率よく融合
させることができる。
ポリドーマの遺択は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施
できるが、このため８−ＡＺＧ、６〜チオグアニン（６
−ＴＧ）あるいは５　−　Ｂ　ｒｄＵなとの薬剤馴化法
により、それぞれの薬物耐性株が取得される。また新し
いマーカーの融合細胞への導入により、種々の選択培地
が用いられる。このような例として、ネオマイシンやハ
イグロマイシンＢ添加培地などが挙げられる（Ｂ．　Ｓ
ｕｇｄｅｎら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（ＭｏｌＣｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．），５，４　
１　０（１　９８５））。
さらに前記したように、異った蛍光色素で標識したハイ
ブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二重標識されたハイブ
リッド・ハイブリドーマをソーティングする方法もある
［Ｌ．　Ｋａｒａｗａｊｅｗら：ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッズ（Ｊ，　ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ），　９　６　．　２　６　５　（１　９　
８　７　）］。
ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できる。例えば、■前述した抗フィプ
リン特異抗体産生ハイブリドーマと血栓溶解作用を有す
る物質に対する抗体を産生ずるハイブリドーマのスクリ
ーニングのためのＥＩＡの併用，■フィブリン結合マイ
クロプレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識
した血栓溶解作用を有する物質を加えて二東特異性を有
するハイブリッド抗体検出のためのＥＩＡ、あるいは抗
フィブリン特異抗体と異なるサブクラスに属する血栓溶
解作用を有する物質に対する抗体を用いる場合は，■フ
ィブリン結合マイクロプレートに被検培養上清を添加し
、次にＨＲＰ標識した該抗マウスＩｇＧサブクラス特異
抗体を加えて二重特異性抗体を検出するＥＩＡ、および
これらの変法などを適宜組み合せて用いることができる
。
ハイブリッド抗体活性陽性のポリドーマは直ちにクロー
ニングに供されるが、これは通常限界希釈法などで容易
に実施される。クローン化されたポリドーマの培養土清
については、上記の方法でその抗体価を測定し、安定的
に力価の高い抗体を産生ずるポリドーマを選択すること
により、目的とするモノクローナルなハイブリッド抗体
産生ポリドーマを取得することができる。
上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培地中
、または動物の腹腔内（例えば、マウス等噛乳動物の腹
腔内）で公知の方法により実施できる。培養液および腹
水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を組み
合わせて用いることによりできる。例えば、細胞培養液
もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り出し、塩折（通
常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用いる
）を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶液に
溶解し、透析後力ラムクロマトグラフイ−（イオン交換
カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡカラム、ヒドロ
キシアバタイトカラム等）に付し、目的とする抗体を分
離精製することができる。以上のような分離精製操作に
より、例えば１＆の培養上清からタンパク重量比で８０
％以上の純度のハイブリッドＭｏＡｂを約１〜５ｍｇ得
ることができる。また、２０ｍの腹水液からは同様の抗
体が３〜ｌｏｉｇ得られる。
以上のようにして得られたハイブリソドＭｏＡｂは蛋白
質として均一であり、蛋白分解酵素（ペプシンなど）処
理などにより、フィプリンおよび血栓溶解作用を有する
物質に対する結合能を保持するＦ　（ａｂ’）！断片な
どを得ることができ、これらは本発明のハイブリッドＭ
ｏＡｂと同様の目的で用いることができる。
以上のような製造法に従って作製したハイブリッド抗体
産生ポリドーマの例として、後述の実施例４，５および
ｌ３に示したテトラオーマか挙げられる。
なお、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生ずるポリド
ーマとして、抗フィブリンＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ
と血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を産生ずるハ
イブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方の
ＭｏＡｂを産生ずるハイブリドーマと他方のＭｏＡｂを
産生ずる細胞とのトリオーマあるいはそれぞれのＭｏＡ
ｂを産生ずる細胞をエブスタイン・バー・ウイルスなど
により不滅化後、細胞融合して得られるハイブリドーマ
などであっても、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生
ずるものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用
いることができる。
また、これらのポリドーマがマウスＩｇＧＭｏＡｂを産
生ずる場合には、該二重特異性ハイブリッドＭｏＡｂの
抗原認識部位を含む可変領域あるいは超可変領域をコー
ドするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術（Ｚ．　
Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら：プロシーディングス・オブ・
ナショナル●アカデミー・サイエンス　ユーエスエー（
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ
），８５．４８５２（１９８８）］を用いてヒ１−１．
ｇＧの定常領域をコードする遺伝子を結合させ、マウス
ーヒトキメラ抗体を作製することもできる。かかるキメ
１ラ抗体はヒトへの投与に際し、抗原性か小さいため有
利に用いられる。
本発明の二重特異性ハイブリッドＭｏＡｂあるいは血栓
溶解作用を有する物質と該二重特異性ハイブリッドＭ　
ｏ　Ａ　ｂとから作製される選択的な血栓溶解蛋白複合
体を用いる血栓溶解治療法においては、幾つかの方法が
用いられる。例えば、■本発明のハイブリッドＭｏＡｂ
を予め血栓性疾患患者に投与し、患者体内に形成された
血栓に結合させるべく十分な時間経過後に、血栓溶解作
用を有する物質、例えばＴＰＡやＵＫを投与する，■該
ハイブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質とを
同時に血栓性疾患患者に投与する。あるいは■予め該ハ
イブリノドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質とを反
応させ、未反応の血栓溶解物質を分離後、得られた選択
的血栓溶解蛋白復合体を血栓性疾患患者に投与するなど
の方法が挙げられる。
本発明の血栓溶解剤，ハイブリソドＭｏＡｂあるいは血
栓溶解作用を有する物質は、必要により例えばメンブレ
インフィルター等によるろ過除菌操作の後に、それ自体
あるいは適宜の薬即学的に許容され得る担体，賦形剤，
希沢剤などと混合し、注射剤などとして製剤化して、噛
乳動物（マウス，ラット，ネコ，イヌ，ブタ，ウシ，サ
ル，ヒトなど）に投与し、例えば心筋梗塞，末梢動・静
脈閉塞症，網模動・静脈閉塞症，脳梗塞，肺塞栓症など
の直栓・閉塞性疾患の治療に用いることが可能である。
本発明の血栓溶解剤の投与量は、対象となる疾患，症状
あるいは投与ルートなどによって異なるが、例えば心筋
梗塞の成人患者に静脈内投与する場合、ハイブリッドＭ
ｏＡｂとして１日当り約０．０２〜ｌｍｇ／ｋｇ好まし
くは約ｏ．ｏ４〜ｏ．４ｔｎｇ／　ｋｇ、血栓溶解作用
を有する物質としてｌ日当りＴＰＡでは約０．０　１〜
０．５ｍｇ／ｋｇ好ましくは約０．０２〜０．２ｍｇ／
ｋｇ，ＵＫでは約０．０　１〜０．５　ｍｇ／　ｋｇ、
好ましくは約０．０　２〜０．２ｍｇ／ｋｇである。
以上のような方広で、標的血栓部位に対して特異的に結
合可能であり、実質的にフィブリノーケンと結合しない
本発明のハイブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する
物質とを用いることにより、選択的かつ効率的に血栓を
溶解・除去することができる。
〔実施例〕
以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明する
が、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは
言うまでもない。
なお、実施例で用いられている動物細胞は、以下の表に
示すように寄託か行なわれている。
（↓丈下衆ｆ３） （ＩＰＯ）　　　（ＦＲＩ） マウスハイブリドーマ　　　５０１７４　　８Ｐ−２０
８１ＦＩ８　１一ｌｌ マウスハイブリドー７　　　　５０１７５　　８Ｐ−２
０８２ＦＩＢ　２−１１ マウスハイブリドーマ　　　５０１７８　　８Ｐ−２０
８５ＴＰＡ　ｌ−４１ マウスハイブリド−７　　　　５０１７９　　ＢＰ−２
０８６ＴＰＡ　１−７０ マウスハイブリドーマ　　　５０１９４　　８Ｐ−２５
１９ＴＰＡ　２−１４ マウスハイブリドーマ　　　５０１７６　　８Ｐ−２０
ｉ！１３０ＫＩ−３ マウスハイブリドーマ　　　５０１７７　　８Ｐ−２０
８４０Ｋ　　ｌ−８７ マウスハ４　フ’Ｊ　Ｆ−ｖ　　　　９０２＠　　Ｂ？
−２ｓＭ？ｔｌＫ　　１−６ マウスハイブリッドーハイブリドーマ （テトラオーマ’）　ＦＴ２−１４　　　５０１８０　
　ＢＰ−２１５８マウスハイブリッドーハイブリドーマ （テトラオーマ）　Ｆｕｌｌ−７４　　　５０１８５　
　ＢＰ−２３３４Ｉ　ＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪
）ＦＲＩ：通商産業省微生物工業技術研究所また、本明
細書においてアミノ酸およびペプチドはＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法に
より表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、
アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ体を示すものとする。
Ｇｌｎ：　グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：　ブロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：　バリン残基 Ｌｙｓ：　リジン残基 Ｇｌｕ：　グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：　ロイシン残基 Ｐｈｅ：フエニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：　ヒスチジン残基 Ｓｃ＋’：　セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 １１ｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：　トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：　システイン残基 参考例ｌ　抗フィブリン抗体測定用ＥＩＡ３．３Ｍ尿素
，０．０１％ＥＤＴＡ含有リン酸食塩緩衝液（ＰＢＳ，
ｐＨ７．３）に溶解したヒトフィブリンモノマー溶液１
ｍｇ／ｊｌｌ１２を、９６穴マイクロプレートに５０μ
Ｑずつ分注し４゜Ｃで一夜放置後、２％カゼイン，０．
０　１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μｅを添加して
感作プレートを作製した。
次にｌ　Ｏ　Ｏ単位／ｄヘパリン，３＋ｎＭフェニルメ
チルスルホニルフルオリド含有ＰＢＳに溶解したヒトフ
ィブリノーゲン溶液１０ｍｇ／ｍＱを、等量の被検ハイ
ブリドーマ培養上清と混じ、室温で３０分間反応後、そ
のｌ００ｌｌＮを上記のフィブリン感作プレートに添加
し室温で２時間反応させた。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２　０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ
Ｗ）でプレートを十分に洗浄後、ホースラッディノシュ
ベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧ
抗体を添加し、さらに室温で２時間反応させた。
洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミンおよ
びＨ　ｔ　Ｏ　ｔを含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液を
各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。ＩＮ硫酸
で反応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて
波長４９２ｎｍで発色色素量を測定した。
参考例２　抗ＴＰＡ抗体測定用ＥＩＡ ＴＰＡ　　５μｇ／ｍ溶液を９６穴マイクロプレートに
１００μＱずつ分注し４゜Ｃで一夜放置後、２％カゼイ
ン．０．０　１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μＱを
添加して感作プレートを作製した。
上記の液を除去しＰ　Ｂ　Ｓ−ＴＷで洗浄後、被検ノ＼
イブリドーマ培養上清１００μＱを添加し室温で２時間
反応させた。以下、参考例ｌに記載の方法で酵素反応を
実施し抗体価を測定した。
参考例２に記載のＴＰＡの代りにＵＫを使用し、ＵＫ感
作プレートを作製後、同様の方法で抗ＵＫ抗体価を測定
した。
参考例１で作製したフィブリン感作プレートに彼検ハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させる
。次いでＰ　Ｂ　Ｓ　−ＴＷで洗浄後、ビオチン標識し
たＴＰＡを添加し、さらに室温で２時間反応させる。次
にアビジンーＨ　Ｒ　Ｐ　複合体を添加し室温で１時間
反応後、同相に結合したＨ　Ｒ　Ｐ活性を参考例ｌに示
した方法で測定する。
参考例４に記載のビオチン標識ＴＰＡの代りにビオチン
標識ＵＫを使用し、以下同様の方法で抗フィブリンー抗
ＵＫハイブリッド抗体価を測定する。
参考例６　フィブリン溶解反応中和試験ＴＰＡ溶液（最
終濃度２　０　ｎｇ／　ｙｔ（１　）もしくはＵＫ溶液
（最終濃度２５ｎｇ／ｍ）に披検／％４ブリドーマ培養
上清希釈液を添加し、３７゜Ｃで１時間反応後反応混液
をフィブリンアガロースプレートの１ウエル当り５μｅ
注入した。３７゜Ｃで２〜６時間後にフィブリンの溶解
斑（直径）を測定し、ＴＰＡもしくはＵＫのＭ素活性に
対するノ＼イブリドーマ培養土清に含まれるＭｏＡｂの
中和能を測定した。
ブリッド抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させ
る。Ｐ　Ｂ　Ｓ−ＴＷで洗浄後、ビオチン標識した実施
例１−■記載のヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペブチド（１
−１１．）一Ｂ　Ｓ　Ａ　？ｕ合体を添加し、さらに室
温で２時間反応させる。次にアビジンＨＲＰ複合体を添
加し室温で１時間反応後、固相に結合したＨ　Ｒ　Ｐ活
性を参考例１に示した方法で測定する。
参考例２で作成したＴＰＡ感作プレートにノ１イブリッ
ド抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させる。Ｐ
　Ｂ　Ｓ−ＴＷで洗浄後、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇ
Ｇ＋（γ１鎖特異）抗体（コスモＩくイオＫ．　Ｋ．販
売）を添加し、さらに室温で２時間反応させる。次いで
Ｐ　Ｂ　Ｓ−ＴＷで充分に洗浄後、同相に結合したＨＲ
Ｐ活性を参考例ｌに示した方法で測定する。
参考例３で作成したＵＫ感作プレートにハイブリッド抗
体含有検液を添加し、室温で２時間反応させる。Ｐ　Ｂ
　Ｓ−ＴＷで洗浄後、ピオチン標識した実施例ｌ一■に
記載のヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）
−ＢＳＡ複合体を添加し、さらに室温で２時間反応させ
る。次にアビジンＨＲＰ複合体を添加し室温で１時間反
応後、固ｔ目に結合したＨＲＰ活性を参考例ｌに示した
方法で測定する。
参考例２に記載のＴＰＡの代りに低分子ＵＫ（二本鎖低
分子ＵＫ，ＪＣＲ社販売）を使用し、低分子ＵＫ感作プ
レートを作製後、同様の方法で抗低分子ＵＫ抗体価を測
定した。
参考例１１　　０Ｋ酵素活性中和試験 ＵＫ溶液（最終濃度１．７μｇ・／　ｍＱ　）に被検抗
体溶液を添加し室温で３０分反応後、ペプチド合成基質
ｓ　　２　４　４　４　（１ｍＭ，ピログルタミル・グ
リシル・アルギニル・バラニトロアニリド，カビ社ｖ　
）を添加した。さらに３７°Ｃで１５分反応後、遊離し
たパラ・ニトロアニリド（４０８ｒ＋ｍにおける吸光度
）を測定した。
公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム，モデル４３０Ａ型）を用いて作製されたヒト
フィブリンβ鎖Ｎ末端ベプチド（ｌ１　１）　　Ｃｙｓ
　３．３ｍｇを、予めＧＭＢＳでマレイミド化した牛血
清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）（Ｂ　Ｓ　Ａ１モル当り１
３モルのマレイミド基を導入）１２ｍｇ／２ｙｔｒｎ水
溶液に加え３０℃で１時間反応させ、ヒトフィブリンβ
鎖Ｎ末端ベプチド（１−１１）−ＢＳＡ複合体を得た。
次いで生理食塩水で３回透析後（３＆Ｘ３）、凍結保存
し免疫原として用いた。
■免　疫 ペプチド−ＢＳＡ複合体１　ｍｇ／　ｍｌ生理食塩水溶
液に等量のフロイント完全アジュバンドを加え、マウス
（♀，ｎ−１０：０、ｌｍｇ／０．２ｄ／ｖウス〉の背
部および腹部皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫
原に等量の７ロイント不完全アジュバンドを加えて、２
−３週毎に５回接種し実施した。
■細胞融合 最終免疫後３日で牌臓を摘出し、牌臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ　ｌ）２Ｘ　１０’個を添加し、ＰＥＧ　　
６０００を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）
）に準じて細胞融合に供した。
融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリ
ンおよびチミジンを含む、いわゆるＨ　ＡＴ培地中に懸
濁し、１０日間培養した。以後は、親細胞の選択が終了
次第、ＨＡＴ培地からアミノブテリンを除いたＨＴ培地
に代え培養を続けた。
■ハイブリドーマの選択およびクローニング固＋目にヒ
トフィブリンモノマーを吸着させたマイクロプレートを
用いる参考例ｌに記載のＥＩＡでハイブリドーマ培養上
清の抗体価を測定した。
融合１０日から２０日後でハイブリドーマの出現を認め
、かつヒトフィプリンに特異結合する抗体がみられた。
特に結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈
法によるクローニングに供した。
クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にＥＩ
Ａのスクリーニングに供し、ヒトフィプリン結合能の強
いものを遭択した。
これらの結果、高濃度ヒトフィブリノーゲン存在下でフ
ィブリンに特異結合するＭｏＡｂ産生マウスハイブリド
ーマ　ＦＩＢ　　１−１１およびＦＩＢ２−１１が得ら
れた。得られたハイブリド−マからそれぞれ産生される
抗体ＦＩＢ　　ｌ−１１およびＦＩＢ　　２−１１の免
疫グロブリンクラス、サブクラスはオークターロニー法
による測定で、いずれもＩ　ｇＧ　，であった。
上記の抗ヒトフィプリン特異抗体　ＦＩＢ１−１１およ
びｔｌＢ　　２−１１をフィブリノーゲン存在下および
非存在下で参考例ｌに記載のＥ■Ａで測定した結果を第
ｌ表に示す。なお、コントロールとして抗ヒトフィブリ
ノーゲン抗体ＦＩＢ２−１６２を用いた。
フィブリノー　　フィブリノー ＦＩＢＩ−１１ ＦＩＢ２−　　１１ ０．５０ ０．５ｌ ０．２０ ０．ｌ６ 実施例２　マウス抗ＴＰＡモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマの作製 ■免　疫 市販の１本鎖ＴＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売〉２０
０μｇ／ｍｌｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全
アジュバンドを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス
（♀，２０μｇ／０．２ｄ／マウス）に腹腔および背部
皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回
の追加免疫後、ｌＯ日で最大の血清抗体価を示した個体
について、ＴＰＡ抗原液（５０μｇ／０．１ｄ生理食塩
水／マウス）を静脈内投与した。
■艶思拳塗 実施例ｌ−■に記載の方法に従い、細胞融合を実施した
。
■ハイブリドーマの選択およびクローニングＴＰＡ結合
マイクロプレートを用いる参考例２Ｓ己戟のＥＩＡでハ
イプリドーマをスクリーニングし、以下実施例１−■と
同じ方法で抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得
した。これらの中、フィプリン溶解能を損うことな＜Ｔ
ＰＡに特異結合する抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドー
マとしてマウスハイブリドーマ　ＴＰＡ　　１−４１、
ＴＰＡ中和抗体産生ハイブリドーマとしてマウスハイブ
リドーマＴＰＡ　　１−７０およびＴＰＡに対してプラ
スミノーゲンアクチベータインヒビタ（ＦＡＩ）と競争
的に結合するＴＰＡ非中和抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ産生ハ
イブリドーマとしてマウスハイブリドーマＴＰＡ　　２
−１４が得られた。得られたハイブリドーマからそれぞ
れ産生される抗体ＴＰＡ　　１−１４．１−７０および
２−１４の免疫グロブリンクラス，サブクラスはオーク
ターロニー法による測定で、それぞれＩ　ｇＧ．ｂ，　
Ｉ　ｇＧ　＋およびｌ　ｇＧ　，であった。
上記の抗ＴＰＡ特異抗体　ＴＰＡ　　１−４１（一●−
）およびＴＰＡ　　１−７０（一▲一）を参考例２に記
載のＥＩＡで測定した結果を第１図に表わす。
■免　疫 実施例２−■に記載のＴＰＡの代りにＵＫ（日本製薬製
造）を用いて、以下全く同様の方法でマウスへの免疫を
実施した。
■弧旭錘Ｃ 実施例１−■に記載の方法に従い細胞融合を実施した。
■ハイブリドーマの選択およびクローニングＵＫ結合マ
イクロプレートを用いる参考例３記戦のＣＩＡでハイブ
リドーマをスクリーニングし、以下実施例ｌ−■と同じ
方法で抗ＵＫＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得した。
これらの中、フィブリン溶解能を損うことな＜ＵＫに特
異結合する抗ＵＫＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとしてマ
ウスハイブリドーマ　ＵＫ　　Ｉ−３およびＵＫ　　１
８７が得られた。得られたハイブリドーマからそれぞれ
産生される抗体ＵＫ　　１３およびｌ８７の免疫グロブ
リンクラス，サブクラスはオークターロニー法による測
定で、それぞれＩ　ｇｃ　，および［ｇＧＪであった。
上記の抗ＵＫ特異抗体ＵＫ　　ｌ−３（一●−）および
ＵＫ　　１−８７（一▲一）を参考例３に記載のＥＩＡ
で測定した結果を第２図に表わす。
ル抗体の製造 ■細胞融合 実施例１で取得した抗ヒトフィプリン抗体産生ハイブリ
ドーマＦＩＢ　　１−１１および実施例２で取得した抗
ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマＴＰＡｔ−４１を、それ
ぞれ０．５μｇ／ｄＦＩＴｃおよび１．５μｇ／ｄＴＲ
ＩＴｃ含有イスコフーハムＦ−１２混合培地で３７゜Ｃ
．３０分間インキユベートし、蛍光染色した。次いで、
ＬＳＭ溶液（和光純薬工業Ｋ．　Ｋ．販売）を添加し死
細胞を除去したのち、両ハイブリドーマをｌ：ｌの割合
で混じ、ＰＥＧ６０００を用いて実施例１−■に記戟の
方法で細胞融合した。
３７℃で２時間インキュベートＩＦＡＣＳに供すること
によりフルオレセインおよびローダミンで二重染色され
た細胞２５０００個を分取し、次にフィーダーとしてマ
ウス胸腺細胞を５Ｘ１０５個／ウエル播種した９６穴マ
イクロプレートに、上記の二重染色細胞を１０個／ウエ
ルの割合で播種し培養した。
■ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、それぞれ参考例１，２．７および８に記載のＥＩＡ
に供し抗体活性を測定した。なお、対照として実施例ｌ
−■および実施例２−■でそれぞれ取得したハイブリド
ーマＦＩＢ　　１−１１およびＴＰＡ　　１−４．１の
培養土清の抗体活性を同様にして測定した。結果は第２
表に示した通りであった。
高いハイブリッド抗体活性を示したウエルについて限界
希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異性
抗体産生マウスノ＼イブリッドーノ＼イブリドーマ（テ
トラオーマ）ＦＴ２−１４を取得した。
第２表　ハイブリッドハイブリドーマの産生ずる抗体の
特異性 ＩｇＧｔ β鎖Ｎ末端 ペブチド ハイブリッド ハイブ１ノドー，Ａｌ）　０．６６　　０．９９　　　
１．９０　　　　２．４５ハイブリッド ハイブ，ノドー，Ｂ１）　０．３０　　０．６０　　　
０．５１　　　　２．１９ＦＩＢ　１−１１２）０．２
９　０．００　　０．０１　　　０．００ｌ）実施例４
−■で取得したノ＼イブリ，ノドノ＼イブリドーマ。
実施例１−■で取得した／％イブリドーマ。
実施例２−■で取得したノ＼イブリドーマ。
４９２ｎｍにおける吸光度で示す（参考例１参照）。
参考例１記載のＥＩＡ０ 参考例２記載のＥＩＡ０ 参考例７記載のＥＩＡ０ ８）参考例８記載のＥＩＡ． ■ハイブリッド抗体の精製 予め０．ＦＭ鉱油を腹腔内投与したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃマウス６匹に５Ｘ１０８個／マウスのマウス　ノ＼
イブリッドーハイブリドーマ（テトラオーマ）　ＦＴ２
−１４を腹腔内接種した。約１０〜２０日後に貯ｌ留が
みられた腹水を２０ｄ採取し、さらに５０％飽和硫酸ア
ンモニウムで塩析してＩｇＧ画分を得た。次いで２０ｍ
Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で透析後、フィブリン結合セ
ルロファインカラムに供し、ｐＨ２．９の０．２Ｍグリ
シン・塩酸緩衝液で溶出した。酸溶出画分をＰＢＳで透
析後、ざらにＴＰＡ結合セファロース４Ｂカラムに供し
、ｐＨ２．３の０．２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出し
た。
ＰＢＳで透析することにより二重特異性抗体Ｉ？Ｔ２−
１４　　９．４ｍｇを得た。
得られた抗体を参考例８に記載のＥＩＡに供し、その二
臣特異性抗体の希釈曲線を作製した。結果は第３図に示
した通りであった。第３図から、得られた抗体がＴＰＡ
とフィブリンとの両者１＝対して強い結合能を示したこ
とが分る。
■細胞融合 実施例ｌで取得した抗ヒトフィプリン抗体産生ハイブリ
ドーマＦＩＢ　　１−１１および実施例３で取得した抗
ＵＫ抗体産生ハイブリドーマＵＫ１−３を、実施例４−
■に示した方法に従いそれぞれをＦｒＴＣおよびＴＲＩ
ＴＣで蛍光染色したのちＰＥＧ６０００を用いて細胞融
合した。次にＦＡＣＳに供し二重染色細胞を選別・培養
した。
■ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 融合後ｌ−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養土清
を、それぞれ参考例１，３および９に記載のＥＩＡに供
し抗体活性を測定した。なお、対照として実施例１−■
および実施例３−■でそれぞれ取得したハイブリドーマ
ＦＩＢ　　ｌ−．１１およびＵＫ　　１−３の培養上清
の抗体活性を同様にして測定した。
最犬のハイブリッド抗体活性を示したウエルについて限
界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異
性抗体産生マウスハイブリドーマＦＵＩ−７４を取得し
た。
■ハイブリッド抗体の精製 実施例４−■記載の方法に従い腹水を取得し、さらに硫
安塩析およびフィブリン結合カラムとＵＫ結合カラムと
を用いるイムノアフィニティークロマトにより約２０ｄ
の腹水から本発明の抗ＵＫ一抗ヒトフィプリン二重特異
性抗体ＦＵＩ７４　　１４ｍｇを得た。
得られた抗体を参考例９に記載のＥＩＡに供し、その二
重特異性抗体の希釈曲線を作成した。結果は第４図に示
した通りであった。第４図から明らかなように得られた
ＦＵＩ−７４抗体がＵＫとフィブリンとの両者に対して
強い結合能を示したことが分る。
実施例６　抗ＴＰＡ一抗ヒトフィブリンニ重特異性抗体
ＦＴ　　２−１４の性状■ 径９　．　５　ｍｍのペーパーディスクを２ｍｇ／ｄの
ヒトフィブリノーゲン溶液に浸漬し、次いでヒトトロン
ビン（５０ＮＩＨ単位／ｄ）を添加しペーパーディスク
上にフィブリンクロットを形成させた。
このフィブリン結合ペーパーディスクを十分に洗浄後、
フィブリノーゲン（３ｍｇ／ｍ＋２）存在下、実施例４
−■で得た二重特異性抗体ＦＴ　　２−１４溶液に浸し
、抗体のペーパーディスクへの結合量をＨＲＰ標識した
抗マウスＩｇＧｚｂ抗体で測定した。
結果は第５図に示した通りであった。
フィブリノーゲン（３ｍｇ／ｄ）存在下（膳）において
も非存在下（口）とほぼ同等のフィブリン結合能を示し
、本発明のＦＴ　　２−１４抗体がフィブリンに特異的
であることが示された。
種々の濃度のＴＰＡを実施例４−■で得た二重特異性抗
体Ｆ’Ｔ　　２−１４の４．３倍モル濃度溶液と３７℃
で３０分間反応させ、ＴＰＡとＦＴ２−１４抗体との免
疫複合体（ＴＰＡ／ＦＴ　　２ｌ４抗体）を作製し、次
いで３ｍＭのペプチド合成基質Ｓ−２２８８（カビ社製
）を添加してさらに３７゜Ｃて２時間反応させた。遊離
したパラーニトロアニリンの４０５ｎｒｒｌにおける吸
光度を測定し、上記のＴＰＡ／ＦＴ　　２−１４抗体複
合体の酔素活性をＴＰＡ単剤と比較した。結果は第６図
に示した通りであった。
第６図中、●はＴＰＡ／ＦＴ　２−１４抗体の酵素活性
を示し、○はＴＰＡ単剤の酵素活性を示す。ＴＰＡは本
発明の二重特異性抗体ＦＴ　　２−１４との結合によっ
ても全く酵素活性を減少しないことが明らかとなった。
２−１４抗体溶液を加えて３７゜Ｃで９０分間反応後、
十分に洗浄した。次いで１　０　０　ｎｙ，のＴＰＡと
３７℃で４０分間反応し洗浄後、さらにブラスミノーゲ
ン（３単位／ｄ）を添加し３７゜Ｃで１時間反応させた
。上澄液中に遊離したペプチド（フィブリン分解産物：
ＦＤＰ）をＦＤＰ−ＥＩＡキノト（アメリカン・ダイア
グノスティックス社製）で測定した。
結果は第７図に示した通りであった。
二重特異性抗体ＦＴ　　２−１４で予め処理したフィブ
リンーセル口ファイン粒子に対してＴＰＡはより効果的
に働らき、フィブリン溶解能が増強された。
ヒトフィブリ／−ゲンを公知の方法に従いセルロファイ
ン粒子（生化学工業株式会社販売）に結合させ不溶化し
たのち［戎井悦子ら：生化学，５４，７　３　２（１　
９　８　２）］，ヒトトロンビンを加えてフィブリンに
変換した。このフィブリンーセルロファイン粒子０．２
ｇに１　０μｇ／５００１！のＦＴＵＫ溶液（２　５　
ｎｇ／ｍ）２．　５　ｉｔＱおよび実施例５一■で得た
二重特異性抗体ＦＵＩ−７４溶液（４０ｎｇ／ｍまたは
１　６　０ｎｇ／ｄ）２．５　μ（ｌを参考例６に記・
載のフィブリンアガロースプレートのｌウエルに注入し
３７℃で４時間反応後、フィブリンの溶解斑を測定し、
ＵＫ単剤とのフィブリン溶解斑を比較した。結果は第８
図に示した通りであった。ＵＫ単剤に比べ、ＦＵＩ−７
４抗体の共存により３−５倍のフィブリン溶解能の増強
が観察された。
実施例８で得たフィブリンーセル口ファイン粒子を充填
したカラムに、それぞれ実施例４−■で得たＦＴ２−　
１　４（０−　１　００μｇ／ｄ）および実施例５−■
で得たＦＵＩ−７４（０−５０μｇ／ｄ）を結合させた
のち、０．０１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔ）で洗浄した。次いでＦＴ２−１４処理カラムに
はＴＰＡ溶液を、ＦｔＪ１−７４処理カラムにはＵＫ溶
液をそれぞれ２４０ｄ／時間の流速で２００μｇ／４０
０ｍ注入した。
ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、担体セル口ファイン粒子を試験管
内に移しプラスミノーゲン（４、５単位／１．ＦＭ）を
添加後、３７゜Ｃで２時間反応させた。
等量の６１＋ＩＭバラーアミジノフェニルメタンスルホ
ニルフルオリドを添加したのち、セル口ファイン粒子よ
り遊離したフィブリン分解産物（ＦｉｂｒｉｎＤｅｇ？
ａｄａｔｉｏｎＰ？ｏｄｕｃｔｓ；　ＰＤＰ）をＥＩＡ
キット（アメリカンダイアグノスティカ社製）で測定し
た。
結果は第９図に示した通りであった。抗体未処理のフィ
ブリンーセルロファイン粒子に対するＴＰＡ（○）およ
びＬＪＫ（●）のフィブリン分解量をそれぞれ１とした
時、１００μｇ／ｍ　　ＦＴ２−１４処理フィブリンー
セル口ファイン粒子（○）では３．８倍，５０μｇ／ｍ
　　ＦＵＩ−７４処理フィブリンーセル口ファイン粒子
（●）では８．５倍のフィブリン分解能の増強がみられ
た。
ウサギ（雄，　　２　．　５　−　３　．　５　ｋｇ）
にベントバルビタ一ル（９　０　ｍｇ／　１　．　５　
ｄ／ウサギ）およびウレタン（１　．　５　ｍｇ／　３
　ｄ／ウサギ）を腹腔内注射し麻酔後、右大肚静脈に採
血用カニューレ，左頚静脈に血液注入用カニューレおよ
び毛糸を挿入した。当該頚静脈にクリップをかけ約３ｃ
ｍ幅の血流を遮断し、生理食塩水，次いでｌ　Ｏ　Ｕ／
ｄ　｝ロンビン含有１　２ｍＭ　Ｃ　ａＣ　Ｑｔ溶液０
．２ばて血管内を洗浄した。
洗浄した血管内に大腿静脈から採血した自家血０．２ｄ
を注入し、直ちにカニューレを抜き穴を結索後、３０分
間放置して血液を凝固させた。
■被検薬液の注入 血栓モデルウサギにヘパリンを腹腔内（２５０Ｕ　／　
ｋｇ）および皮下（５　０　０　Ｕ／ｋｇ）注射し、頚
静脈部のクリップをはずした。次に対側の耳静脈に注射
針を挿入して、まず用量のｌＯ％被検薬液を２ｍ／ウサ
ギで静注、残る９０％をｉ／時間の流速で４時間かけて
持続注入した。４時間後に毛糸に付着した血栓を取りだ
し、その湿重量を測定した。被検８７（ｌとして、コン
トロールとしての生理食塩水，　Ｔ　Ｐ　Ａ　（０．　
２　５　ｍｇ／ｋｇおよび１　．　０　ｍｇ／　ｋｇ）
，実施例４−■で得たＦＴ２−　１　４抗体液（１　．
　２　ｍｇ／　ｋｇ）およびＴＰＡ／ＦＴ２−１４抗体
複合体液（ＴＰＡ０．２５ｍｇ／ｋｇ＋ＦＴ２−　１４
１　．　２　ｍｇｌ　ｋｇ）を用いた。結果は第１０図
に示した通りであった。
Ｔ　ＰＡ（０．２　５ｍｇ／ｋｇ）を４時間持続注入す
ると、血栓の湿重量はコントロール群の６１．５±７．
２ｍｇ（ｎ＝４）から３１．７±１０．１ｍｇ（ｎ＝６
）に減少したが、Ｔ　ＰＡ（０．２５ｒｎｇ／ｋｇ）と
ＦＴ２−　１　４　（　１．２ｍｇ／ｋｇ）との併用群
（ＴＰＡと二重特異性抗体（ｂｓＡＢ）とのモル比ｌ：
２）では１９．６±６　．　５　ｍｇ（ｎ＝　７　）と
、さらに血栓溶解能が増強され、Ｔ　Ｐ　Ａ　（　１　
．　０　ＩＩｌｇ／　ｋｇ）投与群の血栓湿重量１５．
５±５　，　Ｏ　ｍｇ（ｎ＝　３　）とほぼ同等の血ｂ
ｍ　解能を示した。なお、ＦＴ２−１４（１．２ｍｇ／
　ｋｇ）投与群では血栓湿重量が４　１．５ｍｇ（ｎ＝
１）であった。
■免　疫 実施例２−■に記載のＴＰＡの代りに市販の二本鎖低分
子ＵＫ（ＪＣＲ社販売）を用いて、以下全く同様の方法
でマウスへの免疫を実施した。
■雛躯里冶 実施例１−■に記載の方法に従い細胞融合を実施した。
■ハイブリドーマの遭択およびクローニング低分子ＬＪ
Ｋ結合マイクロプレートを用いる参考例．ｔ　ｏ　記載
のＥＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以下実
施例１−■と同じ方法で抗低分子ＵＫ　　ＭｏＡｂ産生
ハイブリドーマを取得した。
これらの中、フィブリン溶解能を損うことなくＵＫに特
異結合する抗低分子ＵＫ　　ＭｏＡｂ産生ハイブリドー
マとしてマウスハイブリドーマ　ＵＫ１−６が得られた
。得られたハイブリドーマから産生される抗体ＵＫ　　
１−６の免疫グロブリンクラス，サブクラスはオークタ
ーロニー法による測定で、ＩｇＧ＋（κ鎖）であった。
実施例ｌ３　抗ＵＫ一抗ヒトフィブリンニ重特異性を有
するハイブリッドモノクロー ナル抗体の製造■ ■細胞融合 実施例ｌで取得した抗ヒトフィプリン抗体産生ハイブリ
ドーマＦＩＢ　　１−１１および実施例１２で取得した
抗低分子ＵＫ抗体産生ハイブリドーマＵＫ　　ｌ−６を
、実施例４−■に示した方法に従いそれぞれをＦ　ＩＴ
ＣおよびＴＲＩＴＣで蛍光染色したのちＰＥＧ６０００
を用いて細胞融合した。次にＦＡＣＳに供し二重染色細
胞を選別・培養した。
■ハイブリッドハイブリドーマの遺択およびクロー二冫
グ 融合後ｌ−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、それぞれ参考例１．９およびＩＯに記載のＥＩＡに
供し抗体活性を測定した。
最大のハイブリッド抗体活性を示したウエルについて限
界希釈法によるクローニングを実施し、目的め二重特異
性抗体産生マウスハイブリッドハイブリドーマＦＵ　　
２−１６を取得した。
上記のハイブリッドハイブリドーマＦＵ　　２−１６の
培養土清を、参考例５に記載のＥＩＡで測定した結果を
第１１図に表わす。
■ハイブリッド抗体の精製 実施例４−■記載の方法に従い腹水を取得し、さらに硫
安塩析およびフィブリン結合カラムとＵＫ桔合カラムと
を用いるイムノアフィニティークロマトにより約２０ｄ
の腹水から本発明の抗ＵＫ一抗ヒトフィブワン二重特異
性抗体ＦＵ　　２−６約２３＋ｎｇを得た。
実施例１４　抗ＵＫモノクローナル抗体の性状■実施例
３および１２で得た抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ　　
ｌ−３．１−８７および１−６を、ＵＫおよび低分子Ｕ
Ｋ結合マイクロプレートを用いるＥＩＡ（それぞれ参考
例３および１０記載）に供し、ＵＫ［第１２図（Ａ）］
および低分子ｕ　Ｋ　ｃＷ１２図（Ｂ）］への結合能を
比較した。結果は第１２図に示した通りであった。
ＵＫ　　ｌ−３抗体は低分子ＵＫには結合しないが、Ｕ
Ｋ　　１−８７およびＵＫ　　１−６抗体はいずれもＵ
Ｋと低分子ＵＫとに対して同等の反応性を示した。
実施例ｌ５　抗ＵＫモノクローナル抗体の性状■実施例
３および１２で得た抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ　　
１−３，１４７および１−６を、参考例１１記載のペプ
チド合成基質Ｓ−２４４４を用いるＵＫ酵素活性中和試
験に供した。結果は第１３図に示した通りであった。
いずれの抗ＵＫモノクローナル抗体もＵＫ酵素活性を阻
害しなかった。
〔発明の効果〕
本発明のハイブリッドＭｏＡｂは、実質的にフィブリノ
ーゲンと反応せずフィブリンに特異的に結合し、またフ
ィブリン溶解能を損うことなく血栓溶解作用を有する物
質とも特異的に結合することが可能である。従って、ハ
イブリッドＭｏＡｂと血栓溶解作用を有する物質との１
：１免疫複合体を容易に作製することができ、また両者
を併用することにより、選択的かつ効率的な血栓の溶解
・除去が司能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は参考例２記載のＥＩＡで作製した抗ＴＰＡ特異
抗体ＴＰＡ　　１−４１およびＴＰＡ　　１−７０の希
釈曲線を表わす（実施例２参照）。 第２図は参考例３記載のＥＩＡで作製した抗ＵＫ特異抗
体ＵＫ　　１−３およびＵＫ　　１−８７の希釈助線を
表わす（実施例３参照）。 第３図は参考例８記載のＥＩＡで作製した抗ＴＰＡ一抗
ヒトフィプリン二重特異性抗体ＦＴ２−Ｉ４の希釈曲線
を表わす（実施例４参照）。 第４図は参考例９記載のＥＩＡで作成した抗ＵＫ一抗ヒ
トフィプリン二重特異性抗体ＦＵＩ７４の希釈曲線を表
わす（実施例５参照）。 第５図は実施例４−■で作製した二重特異性抗体ＦＴ　
　２−１４のフィブリン結合ベーバーディスクへの結合
量を示す。第５図中、■はフィブリノーゲン（３ｎ＋ｇ
／ｄ）存在下であることを示し、口はフィブリノーゲン
非存在下であることを示す（実施例６参照）。 第６図はＴＰＡと実施例４−■で作製した二重特異性抗
体ＦＴ　　２−１４との免疫複合体（・）の酵素活性を
ＴＰＡ単剤（ｏ）の酵素活性と比較した結果を示す（実
施例７参照）。 第７図は、フィブリン結合セル口ファイン粒子を実施例
４−■で作製した二重特異性抗体ＦＴ２−ｌ４で予め処
理した時（ＴＰＡ／ＦＴ　　２１４）あるいは処理しな
い時（ＴＰＡ）のＴＰＡのフィブリン溶解能を示す（実
施例８参照）。 第８図はＵＫ単剤およびＵＫと実施例５−■で作製した
二重特異性抗体ＦＵＩ−７４との免疫複合体のフィブリ
ン溶解能を示す（実施例９参照）。 第９図はＴＰＡ単独もしくはＴＰＡと実施例４■で作製
した二重特異性抗体ＦＴ２−１４とを併用した場合のフ
ィブリン溶解能（○），およびＵＫ単独もしくはＵＫと
実施例５−■で作製した二重特異性抗体ＦＵＩ−７４と
を併用した場合のフィブリン溶解能（●）を示す（実施
例１０参照）。 第ＩＯ図は、実施例４−■で作製した二重特異性抗体Ｆ
Ｔ２−　１　４によるＴＰＡの血栓溶解能の増強を、ウ
サギ頚静脈血栓モデルにおいて示した結果である（実施
例ｌ１参照）。 第１１図は実施例ｌ３で作製した抗ＵＫ一抗ヒトフィプ
リン二重特異性抗体産生マウスハイブリッドハイブリド
ーマＦＵ　　２−１６の培養上清の希釈曲線を表わす（
実施例ｌ３参照）。 第１２図は参考例３および１０記載のＥＩＡで作製した
抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ　　１−３，■−８７お
よびｌ−６の希釈曲線を表わす（実施例３，１２および
ｌ４参照）。第１２図（Ａ）はＵＫ１ミ対する反応性を
示し、第１２図（Ｂ）は低分子ＵＫに対する反応性を示
す。 第１３図は参考例１１記載のＵＫ酵素活性中和試験で測
定した抗ＵＫモノクローナル抗体ＵＫ１−３．１−８７
および１−６の酵素活性阻害曲線を表わす（実施例３，
１２および１５参照）。 箒１図

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル
    抗体であって、二重特異性の一方がフィブリンに対する
    ものであり、他方が血栓溶解作用を有する物質に対する
    ものである抗体を産生するポリドーマ。
  2. （２）血栓溶解作用を有する物質がプロテアーゼである
    請求項１記載のポリドーマ。
  3. （３）プロテアーゼがティッシュプラスミノ−ゲンアク
    チベータである請求項２記載のポリドーマ。
  4. （４）プロテアーゼがウロキナーゼである請求項２記載
    のポリドーマ。
  5. （５）抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマと抗ティッ
    シュプラスミノ−ゲンアクチベータ抗体産生ハイブリド
    ーマとを融合して得られるテトラオーマであって、１分
    子上でフィブリンとティッシュプラスミノ−ゲンアクチ
    ベータとの両者に結合できる二重特異性ハイブリッドモ
    ノクローナル抗体を産生するテトラオーマ。
  6. （６）抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマと抗ウロキ
    ナーゼ抗体産生ハイブリドーマとを融合して得られるテ
    トラオーマであって、１分子上でフィブリンとウロキナ
    ーゼとの両者に結合できる二重特異性ハイブリッドモノ
    クローナル抗体を産生するテトラオーマ。
  7. （７）二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル
    抗体であって二重特異性の一方がフィブリンに対するも
    のであり、他方が血栓溶解作用を有する物質に対するも
    のである抗体。
  8. （８）血栓溶解作用を有する物質がプロテアーゼである
    請求項７記載の抗体。
  9. （９）プロテアーゼがティッシュプラスミノ−ゲンアク
    チベータである請求項８記載の抗体。
  10. （１０）プロテアーゼがウロキナーゼである請求項８記
    載の抗体。
  11. （１１）請求項７記載の抗体に、血栓溶解作用を有する
    物質を免疫結合させてなる血栓溶解剤。
  12. （１２）血栓溶解作用を有する物質がプロテアーゼであ
    る請求項１１記載の血栓溶解剤。
  13. （１３）プロテアーゼがティッシュプラスミノ−ゲンア
    クチベータである請求項１２記載の血栓溶解剤。
  14. （１４）プロテアーゼがウロキナーゼである請求項１２
    記載の血栓溶解剤。
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