TW201605904A - 治療凝血病變之新穎方法及抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於促凝血人類蛋白質S抑制劑，諸如可在不考慮抑制劑狀況且不干擾蛋白質S之非凝血功能的情況下作為血友病患者之預防性治療皮下投予的抗體或其抗原結合片段。

Description

治療凝血病變之新穎方法及抗體 【序列表以引用之方式併入】
名稱為「SEQUENCE LISTING」之序列表創建於2014年11月6日且以引用之方式併入本文中。
本發明係關於與蛋白質S特異性結合之抑制劑，諸如抗體。
在具有凝血病變之個體中，諸如在患有血友病A及B之人類中，凝血級聯之各個步驟因例如凝血因子不存在或存在不足而呈現功能異常。凝血級聯之一部分的該功能異常導致血液凝血不足及可能危及生命之出血，或對內臟(諸如關節)之破壞。患有血友病A及B之個體(諸如人類)可分別接受凝血因子替代療法，諸如外源性因子VIII(Factor VIII；FVIII)或因子IX(Factor IX；FIX)。然而，該等患者具有出現對該等外源性因子之「抑制劑」(抗體)的風險，使得之前有效之療法無效。此外，外源性凝血因子僅可靜脈內投予，其使患者相當不便且不適。舉例而言，嬰兒及幼童可能必須在胸靜脈中以手術方式插入有靜脈內導管，以保證靜脈進入口。此使其具有出現細菌性感染之極大風險。具有凝血病變之個體僅可在開始出血之後接受療法，而非作為預防措施，其常常影響其一般生活品質。
血液凝血系統之激活依賴於複雜之生物學反應級聯。當血管壁受傷時，組織因子(tissue factor；TF)暴露於循環血液之內含物中，且 TF與因子VII/經活化因子VII(Factor VII/activated Factor VII；FVII/FVIIa)在攜有TF之細胞的表面上形成複合物。此導致因子X(Factor X；FX)活化為FXa，其與FVa一起產生有限量之凝血酶(FIIa)。少量凝血酶活化血小板，其導致支持由經活化FVIII：FIX(activated FVIII：FIX；FVIIIa/FIXa)組成之X酶複合物(tenase complex)結合的磷脂在表面暴露。
X酶複合物產生大量FXa，其隨後促使完整凝血酶破裂。機械上強之血纖維蛋白結構的形成及血栓之穩定化需要完整凝血酶破裂。FVIII或FIX分別在血友病A及B患者中缺失或以較低含量存在，且歸因於所導致之X酶活性缺乏，產生FXa之能力較低且不足以支持凝血之增殖階段。與此對比，TF介導之起始階段不視X酶複合物之形成而定。然而，TF路徑將在初始FXa產生之後不久由血漿抑制劑阻斷。
儘管處於X酶複合物(其在血友病中不足)之後階段，但基因剔除模型中之若干活體內研究以證實FVa含量增加之明顯改善作用。為增加FVa含量而實行之方法包括直接補充外源性FVa或藉由經活化之蛋白質C(activated protein C；APC)來干擾FVa失活。
凝血酶產生受大量調控，且下調的關鍵之一為FVa及FVIIIa之失活。此等分子由APC藉由蛋白分解裂解而失活。FVa及FVIIIa兩者之失活速率由蛋白質S增加，該蛋白質S為APC之輔因子。已展示APC/蛋白質S複合物減少FVa/FXa凝血酶原酶及FVIIIa-FIXaX酶複合物兩者之壽命。
蛋白質S與APC結合之阻斷下調正常血漿中APC之抗凝血潛能(Dahlback等人JBC(1990)265,8127-35；He等人Eur.J.Biochem(1995)227,433-40；Giri等人Thromb.Haemost(1998)80,798-804；Stenberg等人Eur.J.Biochem(1998)251,558-64；Hackeng等人Biochem J.(2000)349,757-64；T.K.Giri,2002,ISBN：91-628-4164-5；Mille-Baker等人Blood(2003)101,1416-8；Baroni等人Thromb.Res.(2010)125,e33-9；Andersson等人Blood(2010) 115,4878-85。
然而，已在患有蛋白質S同型接合子缺乏症之個體中觀測到重度血栓栓塞疾病，且已展示異型接合子蛋白質S缺乏症在具有其他方面正常凝血系統之人員中導致高血栓症發病率(Marlar及Neumann,Semin Thromb Hemost.(1990)16：299-309；Schwarz等人，Blood(1984)64：1297-1300)。已在鼠類模型中進行類似觀測(Burstyn-Cohen等人，J Clin Invest.(2009)119：2942-2953)。
蛋白質S包含五種獨特結構域；N端γ-羧化(Gla)結構域及芳族堆疊、所謂「凝血酶敏感區(thrombin-sensitive region；TSR)」、四個表皮生長因子(epidermal growth factor；EGF)狀結構域(EGF1-4)、及稱為性激素結合球蛋白(sex-hormone binding globulin；SHBG)狀結構域之大C端區。
Dahlbäck等人(1990)揭示其中針對蛋白質S培養具有未揭示序列之若干Ca2+依賴性單株抗體的實驗，在下文假設抗體結合在蛋白質S之Gla結構域、凝血酶敏感區及EGF1或EGF2結構域中。此等抗體(就序列而言不確定)用於研究蛋白質S在正常(亦即非血友病性)血漿中之APC輔因子活性。
據報導，SHBG狀結構域對FVa及FVIIIa經APC催化之失活中的完整輔因子活性表現而言必不可少(Evenäs等人，Thromb Haemost(2000)84：271-277；Nyberg等人，FEBS Lett(1998)433：28-32)。
用於非醫藥試管內目的之抗蛋白質S單株抗體可商購(此處之實例參見表3)。
在最近摘要中，Bologna等人陳述，如由在夾尾分析中以及在急性關節血腫模型中出血表型之活體內改善所判定的，已提供阻斷蛋白質S具有改善血友病A之第一證據(Bologna等人摘要，Blood；2013年11 月15日；122(21))。
本文揭示新穎抗蛋白質S抑制劑，呈具有新穎特徵及用途之抗體形式。此等抗體適合於醫藥開發。該等抗體可對罹患一種凝血病變形式(諸如血友病)之個體的生活品質具有實質影響。
本發明係關於調節蛋白質S活性之抑制劑及其治療用途。
詳言之，本發明係關於與蛋白質S特異性結合之單株抗體或其抗原結合片段及其治療用途，且係關於來源於此等抗體或具有與此等抗體類似之結合特性的其他相關抗體。
本發明亦提供編碼本發明抗體之多核苷酸，諸如編碼本發明之抗體輕鏈及/或抗體重鏈之多核苷酸。本發明亦包含攜載該等多核苷酸之細胞。
本發明亦提供包含本發明之抗體或多核苷酸及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。
亦提供本發明之抗體、多核苷酸及組成物，其用於(a)治療或預防凝血病變(出血病症)或(b)刺激血液凝結中。亦即，本發明提供一種用於(a)治療或預防凝血病變(出血病症)或(b)刺激血液凝結之方法，該方法包含向有需要之患者投予治療或預防有效量的本發明之抗體、多核苷酸或組成物。
本發明之抗體、多核苷酸及組成物可尤其適用於在存在或不存在抑制劑之情況下治療血友病A及B。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39及K40以及C41、E42及F43中之一或多者的抗原決定基。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段在輕鏈 內可具有以下CDR序列中之一或多者：RASSSVSYMY(SEQ ID NO：49之CDR1殘基24-33)、ATSNLAS(SEQ ID NO：49之CDR2殘基49-55)及QQWSSIPPT(SEQ ID NO：49之CDR3殘基88-96)。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段在重鏈內可具有以下CDR序列中之一或多者：SYWIN(SEQ ID NO：50之CDR1殘基31-35)、RIDPYDSETHYAQKFQG(SEQ ID NO：50之CDR2殘基50-66)及WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：50之CDR3殘基99-108)。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈可變區SEQ ID NO：49，其中胺基酸殘基L45經P取代，且視情況L46經W取代，及包含SEQ ID NO：50之重鏈可變區，該重鏈可變區視情況進一步包含一或多個選自由M70L、R72V、T74K及V79A組成之群的取代。
序列表簡要描述
SEQ ID NO：1給出desGla人類蛋白質S之胺基酸序列。截斷蛋白質之N端對應於EGF1區開始處之N端。所列序列中之殘基564-578表示選殖間隔基(ALA)後接HPC4純化標記(EDQV DPRLIDGK)。
SEQ ID NO：2給出人類蛋白質S EGF1-4結構域之胺基酸序列。所列序列中之殘基174-188表示選殖間隔基(ALA)後接HPC4純化標記(EDQVDPRLIDGK)。
SEQ ID NO：3給出食蟹獼猴(Macaca fascicularis)蛋白質S之胺基酸序列。所列序列中之殘基636-647表示HPC4純化標記(EDQV DPRLIDGK)。
SEQ ID NO：4及5分別給出M-hProtS-2F188A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：6及7分別給出M-hProtS-2F380A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：8及9分別給出M-hProtS-2F382A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：10及11分別給出M-hProtS-2F4A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：12及13分別給出M-hProtS-2F82A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：14及15分別給出M-hProtS-3F2A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：16及17分別給出M-hProtS-3F38A2單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：18及19分別給出M-hProtS-3F62A5單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：20及21分別給出M-hProtS-6F101A3單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：22及23分別給出M-hProtS-6F120A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：24及25分別給出M-hProtS-6F128A2單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：26及27分別給出M-hProtS-6F138A3單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：28及29分別給出M-hProtS-6F145A11單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：30及31分別給出M-hProtS-6F151A2單株抗體之輕鏈可變結 構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：32及33分別給出M-hProtS-6F153A2單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：34及35分別給出M-hProtS-6F159A11單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：36及37分別給出M-hProtS-6F170A2單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：38及39分別給出M-hProtS-6F206A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：40及41分別給出M-hProtS-6F216A3(mAb 0914)單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：42及43分別給出M-hProtS-6F230A10單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：44及45分別給出M-hProtS-6F265A1單株抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：46給出人類蛋白質S之胺基酸序列(信號肽忽略)。
SEQ ID NO：47給出用於HC(VH結構域)擴增之反向引子序列。
SEQ ID NO：48給出用於LC擴增之反向引子序列。
SEQ ID NO：49給出人類化單株抗體0322-0000-1152之輕鏈可變結構域(VL)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：50給出人類化單株抗體：0322-0000-1152、0322-0000-1166及0322-0000-1223之重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：51給出人類化單株抗體：0322-0000-1166、0322-0000-1201、0322-0000-1238及0322-0000-1239之輕鏈可變結構域(VL)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：52給出人類化單株抗體：0322-0000-1201及0322-0000-1246 之重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：53給出人類化單株抗體：0322-0000-1223、0322-0000-1246、0322-0000-1248及0322-0000-1249之輕鏈可變結構域(VL)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：54給出人類化單株抗體：0322-0000-1238及0322-0000-1248之重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：55給出人類化單株抗體：0322-0000-1239及0322-0000-1249之重鏈可變結構域(VH)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：56給出人類化單株抗體0322-0000-1152之輕鏈(light chain；LC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：57人類化單株抗體：0322-0000-1152、0322-0000-1166及0322-0000-1223之重鏈(heavy chain；HC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：58給出人類化單株抗體：0322-0000-1166、0322-0000-1201、0322-0000-1238及0322-0000-1239之輕鏈(LC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：59給出人類化單株抗體：0322-0000-1201及0322-0000-1246之重鏈(HC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：60給出人類化單株抗體：0322-0000-1223、0322-0000-1246、0322-0000-1248及0322-0000-1249之輕鏈(LC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：61給出人類化單株抗體：0322-0000-1238及0322-0000-1248之重鏈(HC)的胺基酸序列。
SEQ ID NO：62給出人類化單株抗體：0322-0000-1239及0322-0000-1249之重鏈(HC)的胺基酸序列。
連接融合瘤之名稱及ID、重組表現小鼠IgG1抗體及重組表現鼠類-人類嵌合抗體與SEQ ID NO之表包括在實例25中(表15)。
圖1：在來自患有重度血友病A之個人的血漿中抗蛋白質S濃度依賴性之促凝血作用
多株抗蛋白質S抗體濃度依賴性地減少在FVIII不足人類血漿中在APC存在下之凝結時間。
圖2：在先天性人類血友病A血漿中最大促凝血作用之試管內呈現
在先天性人類血友病A血漿中用DAKO抗蛋白質S所獲得之最大促凝血作用與用5%-10% FVIII所獲得之作用相當。
欄1：HA血漿，2：1% FVIII，3：5% FVIII，4：10% FVIII，5：NHP，6：1mg/ml抗蛋白質S抗體，7：蛋白質S不足血漿+抗FVIII。
資料為平均值±SD，n=3次實驗。HA：血友病A，NHP：正常人類血漿，ProS：蛋白質S。ULOD：偵測上限(Upper Limit Of Detection)。
圖3：針對全長及Gla結構域缺失小鼠蛋白質S之多株抗體的活體內作用
在夾尾(4mm)之前5分鐘分別用針對全長及desGla結構域小鼠蛋白質S的家兔多株抗體(49mg/kg，IV)處理之血友病A小鼠。
圖4：單株抗體在血友病A患者血漿中之試管內作用
增加抗體濃度在重度血友病A患者之血小板稀少血漿中在2nM經活化蛋白質C(Activated Protein C；APC)存在下對凝血酶產生參數峰值凝血酶之作用(點線)。在4μM磷脂存在下用5pM組織因子觸發凝血酶產生，且基於由凝血酶轉化為FluCa試劑(Thrombinoscope，#TS50.00)所產生之連續螢光讀數來估計所產生凝血酶之量。
圖5：單株抗體在正常及血友病A患者血漿中對凝血酶產生之試管內作用
(A)在血小板稀少正常人類血漿(實心圓)或添加有緩衝液(空心圓)、63nM單株抗體(monoclonal antibody；mAb)0910(空心三角形)、160nM mAb 0910(實心三角形)、63nM mAb 0914(空心方形)或160nM mAb 0914(實心方形)之重度血友病A患者血漿中的凝血酶產生。(B)在血小板稀少重度血友病A患者血漿中在不存在5nM經活化蛋白質C(APC)(實心圓)或存在5nM經活化蛋白質C及緩衝液(空心圓)、63nM單株抗體mAb 0910(空心三角形)、160nM mAb 0910(實心三角形)、63nM mAb 0914(空心方形)或160nM mAb 0914(實心方形)的情況下之凝血酶產生。(C-D)增加mAb 0910(三角形)及mAb 0914(方形)之濃度在重度血友病A患者血漿中在(C)經活化蛋白質C(APC)不存在下或在(D)5nM APC(D)存在下對凝血酶產生參數峰值凝血酶的作用。在所有圖中，在4μM磷脂存在下 用5pM組織因子觸發凝血酶產生。
圖6：單株抗體在家兔及獼猴血漿中對凝血酶產生之試管內作用
在家兔及獼猴血小板稀少血漿(經1：3稀釋)中在凝血調節蛋白(50nM)存在下及增加0322-0000-0114(mAb 0114)(A)及0322-0000-0914(mAb 0914)(B；n=3)之濃度(0nM-1000nM)下的凝血酶產生。僅在獼猴血漿(經1：3稀釋)中進行0322-0000-0910(mAb 0910)(C)之劑量響應。在4μM磷脂存在下用5pM組織因子觸發凝血酶產生。點線指示在不添加TM之情況下個別實驗之峰值凝血酶濃度。
圖7：SPR結合感應圖譜
單株抗體0322-0000-0114(mAb 0114)(實線)及0322-0000-0203(mAb 0203)(點線)與在含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡上俘獲之蛋白質S結合的SPR感應圖譜。
圖8：SPR結合感應圖譜
自由蛋白質S(100nM)或與單株抗體(500nM)一起培育之蛋白質S(100nM)與含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡結合的SPR感應圖譜。
圖9及圖10：CDR註解
序列表(下文描述)之SEQ ID NO：4-45的CDR註解(CDR1為粗體，CDR2為深灰色/綠色，CDR3為淺灰色/青色)。
圖11：抗蛋白質S mAb 0914在具有誘導血友病A之家兔表皮出血模型中的作用
抗蛋白質S mAb 0914相對於同型對照抗體明顯減少出血(p=0.013)。
圖12：FXa單獨或在蛋白質S及mAb存在下之活性
藉由量測小發色受質S-2765之水解來隨時間追蹤FXa單獨或在蛋白質S及mAb存在下之活性。FXa單獨(黑色實線)，與TFPI一起(黑色虛線)，與TFPI/蛋白質S一起(灰色實線)；與TFPI/蛋白質S/-1069(灰色虛線)一 起，與TFPI/蛋白質S/-1139一起(灰色點線)。
圖13：與mAb複合之自由蛋白質S與人類TFPI的結合
自由蛋白質(黑色實線)或與0322-0000-1069(黑色點線)、0322-0000-1139(黑色虛線)或0322-0000-0023(灰色實線)複合之蛋白質S與人類TFPI的結合。
圖14：0322-0000-0914輕鏈可變結構域(light chain variable domain；VL)之人類化模型
來源於如實例22中所描述之人類化方案的潛在回復突變以灰色突出顯示。如由Kabat所定義之CDR 1、CDR 2及CDR 3以粗體展示且帶有下劃線。
圖15：0322-0000-0914重鏈可變結構域(heavy chain variable domain；VH)之人類化模型
來源於如實例22中所描述之人類化方案的潛在回復突變以灰色突出顯示。如由Kabat所定義之CDR 1、CDR 2及CDR 3以粗體展示且帶有下劃線。
本發明係關於調節蛋白質S活性之促凝血抑制劑。本發明亦 係關於該等抑制劑之用途，諸如治療及醫藥用途。本發明亦係關於視情況併入編碼該抑制劑之載體中的多核苷酸。
在一些具體實例中，抑制劑為罹患凝血病變之患者提供按需或預防性治療選項。
在一些具體實例中，抑制劑為血友病患者提供具有或不具有抑制劑之按需或預防性治療選項。
在一些具體實例中，抑制劑為調節蛋白質S活性單株抗體或其抗原結合片段。
在一些具體實例中，抑制劑為能夠抑制蛋白質S之抗凝血作用的抗體或其抗原結合片段。
在一些具體實例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段為罹患凝血病變之患者提供按需或預防性治療選項。
本發明亦提供一種用於以FVIII及FIX非依賴性方式治療血友病患者之方法。因此，在一些具體實例中，本文所描述之抗體為血友病A及B患者提供具有或不具有抑制劑之按需或預防性治療選項。
已發現針對人類蛋白質S培養之多株抗體明顯改善血友病性血漿活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time：APTT)分析中之凝結時間。
類似地，針對鼠類蛋白質S培養之多株抗蛋白質S抗體明顯地減少血友病性小鼠尾部出血模型中之失血。
此外，已展示單株抗蛋白質S抗體明顯減少家兔血友病模型中之活體內失血。
另外，已發現單株抗蛋白質S抗體能夠增加人類血友病A(haemophilia A；HA)(FVIII不足)血漿中之凝血酶產生。
抗體可皮下投予，且因此與目前市場上之治療選項相比明顯 減少治療負擔。
因此，本發明之抗體、其他分子及組成物具有涉及治療及預防凝結相關病症之許多試管內及活體內治療效用。舉例而言，此等抗體及組成物可向人類個體投予以預防或治療多種病症。
詳言之，本發明提供用於治療出血病症或用於增強血液凝結之方法，其包含向有需要之患者投予有效量的本發明之抗體或其他分子或組成物。舉例而言，該等方法可用於治療凝血因子缺乏症，諸如血友病A、血友病B、因子XI缺乏症、因子VII缺乏症、血小板減少症或馮威里氏病(von Willebrand's disease)。該等方法可用於治療伴隨凝血因子抑制劑之存在的病狀。該等方法可用於治療過量出血。本發明之抗體及組成物可用於在手術或抗凝血劑療法之前、期間或之後或在外傷之後治療患者。本文所描述之抗體及組成物可用於任何該等治療中或可用於製造用於任何該等治療之藥劑。
在一些治療應用中，向已罹患如上文所描述之病症或病狀的個體以足以治癒、緩解或部分停滯該病狀或其症狀中之一或多者的量投予抗體或組成物。
該等治療性治療可導致疾病症狀之嚴重性降低，或無症狀週期之頻率或持續時間增加。足以實現此之量定義為「治療有效量」。舉例而言，在其中治療用於非所需出血之情況下，療法可定義為減少出血量或適合之凝血以一起停止出血。
在預防性(prophylactic)或預防性(preventive)應用中，向具有如上文所描述之病症或病狀風險的個體以足以預防或減少該病狀或其症狀中之一或多者之後續作用的量投予抗體或組成物。足以實現此之量定義為「預防有效量」。舉例而言，在其中治療為預防非所需出血之情況下，預防性作用可定義為預防出血或與在不存在調節劑之情況下所見的相比較 減少出血之時間段或數量。
用於各目的之有效量將視疾病或損傷之嚴重性以及個體之重量及一般狀態而定。
凝血病變/血友病
在具有凝血病變之個體中，諸如在患有血友病A及B之人類中，凝血級聯之各個步驟因例如凝血因子不存在或存在不足而呈現功能異常。凝血級聯之一部分的該功能異常導致血液凝血不足及可能危及生命之出血，或對內臟(諸如關節)之破壞。患有血友病A及B之個體可分別接受凝血因子替代療法，諸如外源性因子FVIII或FIX。然而，該等患者具有出現對該等外源性因子之中和抗體(所謂「抑制劑」)的風險，使得之前有效之療法無效。
此外，外源性凝血因子僅可靜脈內投予，其使患者相當不便且不適。舉例而言，嬰兒及幼童可能必須在胸靜脈中以手術方式插入有靜脈內導管，以保證靜脈進入口。此使其具有出現細菌性感染之極大風險。具有凝血病變之個體僅可在開始出血之後接受療法，而非作為預防措施，其常常影響其一般生活品質。
目前，治療血友病之最高準則為預防性替代療法(其中治療必須每週靜脈內2-3次)，或經修改之變化形式(其中治療必須每7-10天或每四天靜脈內投予FIX及FVIII變異體)，相應地對患者造成明顯負擔。此外，大約30%用例如FVIII治療之患者出現降低有效預防性治療之可能性的抑制劑。
如本文所用之術語「個體」包括任何人類患者，或非人類脊椎動物。
如本文所用之術語「凝血病變」係指可由正常凝血級聯之任何促凝血組分之任何定性或定量不足或纖維蛋白溶解之任何上調造成的出 血性傾向增加。該等凝血病變可為先天性及/或獲得性及/或醫原性的且由熟習此項技術者鑑別。
先天性低凝血病之非限制性實例為血友病A、血友病B、因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XI缺乏症、馮威里氏病及血小板減少症，諸如格蘭士文氏血小板無力症(Glanzmann's thombasthenia)及伯納德-蘇利耶症候群(Bernard-Soulier syndrome)。該等血友病A或B可為重度、中度或輕度的。血友病之臨床嚴重性藉由血液中之FIX/FVIII之功能單元之濃度來測定且分類為輕度、中度或重度。重度血友病定義為凝血因子含量<0.01U/ml，對應於<1%正常含量，而中度及輕度患者之含量分別為1%-5%及>5%。
具有「抑制劑」(亦即針對因子VIII之同種抗體)之血友病A及具有「抑制劑」(亦即針對因子IX之同種抗體)為部分先天性及部分獲得性之凝血病變的非限制性實例。
獲得性凝血病變之一個非限制性實例為由維生素K缺乏症造成之絲胺酸蛋白酶缺乏症；該維生素K缺乏症可能由投予諸如華法林(warfarin)之維生素K拮抗劑造成。亦可在大面積外傷後出現獲得性凝血病變。在另外稱為「血性惡性循環」之此情況下，其特徵在於血液稀釋(稀釋性血小板減少症及凝血因子稀釋)、體溫過低、凝血因子消耗及代謝紊亂(酸中毒)。流體療法及增加之纖維蛋白溶解可使此情況加重。該等出血可來自身體之任何部分。
醫原性凝血病變之一個非限制性實例為過量給予可指定用於治療血栓栓塞疾病之抗凝血劑，諸如肝素、阿司匹林(aspirin)、華法林及其他血小板凝集抑制劑。醫原性凝血病變之第二非限制性實例為藉由過度及/或不當流體療法誘發之凝血病，諸如可藉由輸血誘發之凝血病變。
在本發明之一個具體實例中，出血與血友病A或B相關聯，在另一個具體實例中，出血與具有獲得性抑制劑之血友病A或B相關聯。 在另一個具體實例中，出血與血小板減少症相關聯。在另一個具體實例中，出血與馮威里氏病相關聯。在另一個具體實例中，出血與嚴重組織損傷相關聯。在另一個具體實例中，出血與嚴重外傷相關聯。在另一個具體實例中，出血與手術相關聯。在另一個具體實例中，出血與出血性胃炎及/或腸炎相關聯。在另一個具體實例中，出血為子宮大出血，諸如在胎盤拉斷之情況下。在另一個具體實例中，出血發生於機械式止血可能性有限之器官中，諸如顱內、鼻內或眼內。在另一個具體實例中，出血與抗凝血劑治療相關聯。
如本文所用之術語「治療」指有需要之任何人類或其他動物個體的醫學療法。該個體預期由醫學從業者進行身體檢查，該醫學從業者給予指示使用該特定治療對該人類或其他動物個體之健康有益的試驗性或決定性診斷。該治療之時機及目的可根據個體之健康現狀在個體之間變化。
因此，該治療可為預防性、緩解性及/或症狀性的。就本發明而言，預防性、緩解性及症狀性可表示本發明之獨立態樣。
蛋白質S
蛋白質S為主要在肝臟內合成的分子量為大約70kDa之維生素K依賴性血漿糖蛋白。然而，亦在內皮細胞中大量合成。成熟蛋白質S包含五種獨特結構域，包括N端γ-羧化(Gla)結構域(殘基1-37)及芳族堆疊(殘基38-45)、所謂「凝血酶敏感區」(TSR；殘基46-74)、4個EGF狀結構域[EGF1(殘基75-115)、EGF2(殘基116-159)、EGF3(殘基160-201)及EGF4(殘基202-242)]、及稱為性激素結合球蛋白(SHBG)狀結構域的393個胺基酸之大C端區(殘基243-635)(其結構表示兩個層黏連蛋白G型結構域)。
蛋白質S之血漿濃度為約350nM且大致60%與補體4結合蛋白(complement 4 binding protein；C4b-BP)結合，而其餘部分以「自由」 蛋白質S形式循環。複合物結合之蛋白質S的抗凝血劑活性與自由蛋白質S相比較大約為其40%。血漿半衰期為48-60小時。
蛋白質S之定點突變誘發已用於測定APC之相互作用位點。研究展示APC結合位點位於蛋白質S之Gla結構域、TSR、及EGF1及EGF2結構域中。然而，研究亦已表明可涉及EGF3-4結構域，且一個結合位點是否可為APC之顯性相互作用保持未知。
據報導，SHBG狀結構域對FVa及FVIIIa經APC催化之失活中的完整輔因子活性表現而言必不可少(Evenäs等人，Thromb Haemost(2000)84：271-277；Nyberg等人，FEBS Lett(1998)433：28-32)。
除抗凝血功能之外，蛋白質S亦在其他過程中起作用。因此，已描述蛋白質S介導凋亡細胞之清除，在小鼠中具有神經保護性且為血管生成之內源性抑制劑。
調控凝血酶的關鍵之一為藉由APC及其輔因子蛋白質S而使因子Va失活。
產生凝血酶破裂為在損傷血管壁之後產生穩定凝結之中心。產生凝血酶之關鍵為因子Xa及其輔因子因子Va。此複合物在凝血過程起始階段期間產生血小板第一活化所需之初始少量凝血酶，且在凝血增殖階段期間產生經活化之血小板的凝血酶破裂，其中由因子VIIIa：因子IXa複合物產生大量FXa。
在患有血友病A或B之患者中，增殖階段無法進行且因此所產生凝血酶不足以形成凝結。
替代性治療可為排他性地加強凝血起始階段中凝血酶之產生。凝血酶產生受大量調控，且下調的關鍵之一為因子Va之失活。因子Va由APC藉由在Arg 506及Arg 306處蛋白分解裂解而失活。在試管內，Arg 506之裂解為動力學有利的且產生輔因子活性大約為因子Xa之40%的 因子Va，而Arg 306之裂解導致因子Va幾乎完全失活。因子Va之失活速率由蛋白質S增加，該蛋白質S為APC之輔因子。因此，儘管Arg 306處之裂解增加大約20倍，Arg 506處之裂解增加5倍。
然而，已在患有蛋白質S同型接合子缺乏症之個體中觀測到重度血栓栓塞疾病，且已展示異型接合子蛋白質S缺乏症在具有其他方面正常凝血系統之人員中導致高血栓症發病率(Marlar及Neumann,Semin Thromb Hemost.(1990)16：299-309；Schwarz等人，Blood(1984)64：1297-1300)。已在鼠類模型中進行類似觀測(Burstyn-Cohen等人，J Clin Invest.(2009)119：2942-2953)。
凝血因子
因子V
因子V(Factor V；FV)由肝臟合成，且所分泌之FV以非活性促凝血之330kDa單鏈多肽形式在血漿中循環。FV由2196個胺基酸組成，包括28個胺基酸之信號肽。其由六個結構域A1(Aa30-329)、A2(Aa 348-684)、B(Aa 692-1573)、A3(Aa 1578-1907)、C1(Aa 1907-2061)及C2(Aa 2066-2221)構成。兩種蛋白質之A及C結構域與FVIII之等效結構域大約40%同源，但B結構域不具保守性。如FVIII之情況，FV活性經由位點特異性蛋白水解而受嚴格調控。凝血酶及因子Xa(Factor Xa：FXa)(在較小程度上)是造成FV在位置Arg709-Ser710、Arg1018-Thr1019及Arg1545-Ser1546處經由蛋白分解裂解而活化之主要原因。此等裂解釋放B結構域且產生由含有A1及A2結構域之105kDa重鏈及含有A3、C1及C2結構域之71至74kDa輕鏈構成的二聚分子。此兩個鏈由殘基Asp139及Asp140處之鈣及疏水性相互作用結合在一起。重鏈提供FXa及凝血酶原兩者之接觸，而輕鏈中之兩個C結構域為FVa與磷脂表面之相互作用所需的。
因此，FV作為凝血酶酶(thrombinase)複合物之FXa的輔 因子起作用，並且經活化之FXa酶需要鈣及FVa來將細胞表面膜上之凝血酶原轉化為凝血酶。輕鏈中之A3結構域涉及FXa及磷脂相互作用兩者。綜合而言，兩個FVa鏈將FXa連結至在損傷位點處由血小板栓形成之磷脂表面，且使得FXa能夠有效結合凝血酶原及使之裂解以產生凝血酶。FV能夠與經活化之血小板結合。儘管FV主要作為可溶性組分見於血漿中，但FV之一部分亦存在於血小板之α-顆粒中，由血小板特異性FV缺乏症所證明，該FV對正常止血而言至關重要。
因子VIII
因子VIII(FVIII)為主要由肝細胞產生之較大複合糖蛋白。FVIII由2351個胺基酸(包括信號肽)組成，且含有如由同源性所定義之若干獨特結構域。存在三個A結構域、一個獨特B結構域及兩個C結構域。結構域次序可列為NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII以在B-A3邊界處分開之兩條鏈形式在血漿中循環。鏈由二價金屬離子結合而連接。A1-A2-B鏈稱為重鏈(HC)，而A3-C1-C2稱為輕鏈(LC)。小酸性區A1之C端(a1區)及A2之C端(a2區)及A3結構域之N端(a3區)在其與其他凝血蛋白(包括凝血酶及馮威里氏因子(von Willebrand factor；vWF或VWF，用於FVIII之載體蛋白))之相互作用中起重要作用。
內源性FVIII分子以具有各種大小之B結構域的分子彙集形式在活體內循環，其中最短者之C端在位置740處，亦即在A2-a2之C端處。具有不同長度之B結構域的此等FVIII分子均具有全部促凝血活性。在用凝血酶活化後，在A1-a1位置372處之C端、A2-a2位置740處之C端及在位置1689處a3與A3之間裂解，其中後一裂解釋放a3區且伴隨對VWF之親和力損失。經活化之FVIII分子稱為FVIIIa。活化允許FVIIIa與如經活化之血小板及經活化之因子IX(activated Factor IX；FIXa)的磷脂表面相互作用，亦即形成X酶複合物，允許因子X(FX)之有效活化。
B結構域在若干不同位點處裂解，在循環血漿FVIII分子中產生較大非均質性。大量糖基化之B結構域的準確功能未知。
因子IX
FIX為具有與因子VII、凝血酶原、因子X及蛋白質C結構相似性之維生素K依賴性凝血因子。循環酶原形式由分成四個獨特結構域之415個胺基酸組成，該等結構域包含一個富含N端γ羧基麩胺酸(Gla)之結構域、兩個EGF結構域及一個C端胰蛋白酶狀絲胺酸蛋白酶結構域。
藉由在Arg145-Ala146及Arg180-Val181處之有限蛋白水解進行FIX之活化，釋放35個胺基酸之片段(所謂活化肽)。活化肽經大量糖基化，含有兩個N鍵聯及至多四個O鍵聯聚糖。經活化之因子IX稱為因子IX(a)或FIX(a)。FIX(a)為胰蛋白酶狀絲胺酸蛋白酶，其在止血中藉由產生大部分在凝血期間支持恰當凝血酶形成之因子Xa作為X酶複合物之一部分來起關鍵作用。
除非另外說明，否則，FIX結構域包括以下胺基酸殘基：Gla結構域，其為殘基Tyr1至Lys43之區；EGF1，其為殘基Gln44至殘基Leu84之區；EGF2，其為殘基Asp85至殘基Arg145之區；活化肽，其為殘基Ala146至殘基Arg180之區；及蛋白酶結構域，其為殘基Val181至Thr414之區。輕鏈係指涵蓋Gla結構域、EGF1及EGF2之區，而重鏈係指蛋白酶結構域。
因子X
凝血因子X(FX)為具有與因子VII、凝血酶原、因子IX(FIX)及蛋白質C結構相似性之維生素K依賴性凝血因子。其由以用於分泌之蛋白質為目標的含有疏水性信號序列(Aa1-31)之40個殘基之預前導序列合成。前導肽對引導因子X之輕鏈的γ羧化而言至關重要。循環人類FX酶原由分成四個獨特結構域之445個胺基酸組成，該等結構域包含一個N端富含γ羧基麩胺酸(Gla)之結構域、兩個EGF結構域及一個C端胰 蛋白酶狀絲胺酸蛋白酶結構域。成熟雙鏈形式之FX由藉由二硫橋鍵(Cys172-Cys342)及藉由Arg-Lys-Arg(RKR)三肽結合在一起之輕鏈(Aa41-179)及重鏈(Aa183-488)組成。輕鏈含有11個Gla殘基，其對FX與帶負電磷脂膜之Ca2+依賴性結合而言至關重要。野生型人類凝血因子X在活化肽中具有兩個N糖基化位點(Asn221及Asn231)及兩個O糖基化位點(Thr199及Thr211)。β-羥基化在第一EGF結構域中之Asp103處進行，產生β-羥基天冬胺酸(hydroxyaspartic acid；Hya)。藉由在Arg234-Ile235處之有限蛋白水解進行FX之活化，釋放52個胺基酸之活化肽(Aa183-234)。在外源性路徑中，此發生在內皮下細胞膜上之組織因子(TF)暴露於血漿中及FVIIa之後續活化後。經由內源性路徑之活化由FIXa、FVIIIa、鈣及酸性磷脂表面之相互作用而發生。凝血酶原為FXa之最重要受質，但活化需要FXa之輔因子FVa、鈣及酸性磷脂表面。FX缺乏症為發病率在一般人群中為1：1,000,000之罕見常染色體隱性出血病症。儘管其產生可變出血傾向，但患有重度FX缺乏症之患者傾向於在具有罕見凝血缺陷之患者當中受最嚴重影響。異型接合子FX缺乏症之發病率為約1：500，但通常臨床上無症狀。
抗體
術語「抗體」在本文中係指來源於生殖系免疫球蛋白序列之蛋白質，該能夠與抗原或其部分特異性結合。術語抗體包括任何類別(或同型)之全長抗體，亦即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及/或IgY。與抗原或其部分特異性結合之抗體可與該抗原或其部分排他性地結合，或其可與有限數目之同源抗原或其部分結合。
天然全長抗體通常包含至少四條多肽鏈：兩條重(heavy；H)鏈及兩條輕(ight；L)鏈，其由二硫鍵連接。在一些情形下，天然抗體包含少於四條鏈，如在駱駝中所發現之僅重鏈抗體(VHH片段)及在軟骨魚(Chondrichthyes)中所發現之IgNAR的情況下。醫藥學上尤其關注之一類免 疫球蛋白為IgG。在人類中，IgG類別可基於其重鏈恆定區之序列而次分成4個子類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。輕鏈可基於其序列組成之不同而分成兩種類型：κ及λ鏈。IgG分子由經兩個或兩個以上二硫鍵互連之兩條重鏈及各自由二硫鍵附接至重鏈上之兩條輕鏈組成。IgG重鏈可包含重鏈可變區(VH)及至多三個重鏈恆定(heavy chain constant；CH)區：CH1、CH2及CH3。輕鏈可包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(light chain constant region；CL)。VH及VL區可進一步再分為稱為互補決定區(complementarity determining region；CDR)或高變區(hypervariable region；HvR)的具有高變性之區，其穿插有稱為構架區(framework region；FR)的較具保守性之區。VH及VL區典型地由三個CDR及四個FR組成，其以如下次序自胺基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的具有高變區之可變結構域形成能夠與抗原相互作用之結構域，而抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與如下宿主組織或因子之結合，包括(但不限於)：免疫系統之各種細胞(效應細胞)、Fc受體及經典補體系統之C1複合物的第一組分(C1q)。
本發明之抗體可為單株抗體，意謂其表示由單個B細胞或由B細胞純系群表現的一組獨特重鏈及輕鏈可變結構域序列。本發明之抗體可使用熟習此項技術之者已知之各種方法來產生及純化。舉例而言，抗體可由融合瘤細胞產生。抗體可由B細胞擴增產生。抗體或其片段可在哺乳動物或微生物表現系統中重組表現或藉由試管內轉譯獲得。
抗體或其片段亦可藉助於例如噬菌體呈現、細菌呈現、酵母呈現、哺乳動物細胞呈現或核糖體或mRNA呈現而重組表現為細胞表面結合分子。
本發明之抗體可經分離。術語「經分離抗體」係指已與產生抗體之環境中的(另一種)其他組分分離及/或自(另一種)其他組分回收 的抗體及/或已自產生抗體之環境中所存在之組分混合物純化的抗體。
在本發明之上下文中，抗體之某些抗原結合片段可為適合的，因為已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段進行。
術語抗體之「抗原結合片段」係指保持與抗原特異性結合或識別抗原之能力夫人抗體之一或多個片段，諸如如本文所描述的蛋白質S之EGF1-4區。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型地為抗體之單臂的VL及VH結構域)、單鏈Fv(scFv；參見例如Bird等人，Science 1988；242：423-426；及Huston等人，PNAS 1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(典型地為VH及CH1結構域)及dAb(典型地為VH域)片段；VH、VL、VhH及V-NAR結構域；包含單個VH及單個VL鏈之單價分子；微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及κ體(參見例如Ill等人，Protein Eng(1997)10：949-57)；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多個經分離CDR或功能性互補位，其中該等經分離CDR或抗原結合殘基或多肽可結合或連接在一起以形成功能性抗體片段。各種類型之抗體片段已描述或綜述於例如Holliger及Hudson,Nat Biotechnol(2005)23：1126-1136；WO2005040219及已公開之美國專利申請案20050238646及20020161201中。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段可經篩選而以與完整抗體相同之方式進行應用。
抗體之「Fab片段」，包括「Fab」及「F(ab')2」片段，藉由使重鏈在連接抗體重鏈之鉸鏈半胱胺酸殘基之N端或C端側的鉸鏈區裂解而來源於該抗體。Fab片段包括輕鏈之可變及恆定結構域及重鏈之可變結構域及第一恆定結構域(CH1)。「F(ab')2」片段包含一般由其鉸鏈半胱胺酸共價連接之「Fab'」片段對。Fab'藉由使連接F(ab')2中之重鏈的鉸鏈二硫鍵裂解而形式上來源於F(ab')2片段。此項技術中亦已知抗體片段之除二硫鍵以外的其他化學偶合。Fab片段可能以較低親和力保持親本抗體與其抗原結合之能 力。F(ab')2片段能夠二價結合，而Fab及Fab'片段可單價結合。
一般而言，Fab片段缺乏恆定CH2及CH3結構域，亦即將與Fc受體發生相互作用之Fc部分。因此，Fab片段一般不含效應功能。Fab片段可藉由此項技術中已知之方法，藉由使抗體酶促裂解來產生，例如使用番木瓜蛋白酶以獲得Fab或使用胃蛋白酶以獲得F(ab')2，包括Fab、Fab'、F(ab')2之Fab片段可使用熟習此項技術之者熟知之技術來重組產生。
「Fv」片段為含有完整抗原識別及結合位點之抗體片段，且一般包含本質上可共價結合之一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域的二聚物，例如在單鏈可變結構域片段(single chain variable domain fragment；scFv)中。在此組態中，各可變結構域之三個高變區相互作用以在VH-VL二聚物之表面上界定抗原結合位點。六個高變區或其子集共同地賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至僅包含三個對抗原具有特異性之高變區的單個可變結構域亦可保持識別及結合抗原之能力，但通常親和力低於全部結合位點(Cai及Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：6280-6285)。舉例而言，僅具有一個重鏈可變結構域(VHH)的天然存在之駱駝抗體可結合抗原(Desmyter等人J.Biol.Chem.(2002)277：23645-23650；Bond等人J.Mol.Biol.(2003)332：643-655)。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中此等結構域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步在VH與VL結構域之間包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。scFv之綜述參見Plückthun,1994，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編Springer-Verlag,New York，第269-315頁中。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中片段包含連接至同一多肽鏈(VH及VL)中之輕鏈可變結構域(VL) 上的重鏈可變結構域(VH)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個可變結構域之間不能配對的連接子，迫使可變結構域與另一條鏈之互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 0404097；WO 93/11161；及Hollinger等人Proc.Natl.Acad..USA(1993)90：6444-6448中。
術語「線性抗體」係指如Zapata等人Protein Eng.(1995)8(10)：1057-1062中所描述之抗體。簡言之，此等抗體含有串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)對，其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對。線性抗體可具有雙特異性或單特異性。
如本文所用之術語「單功能抗體」係指具有重鏈可變結構域且無輕鏈可變結構域之抗原結合分子。單功能抗體可在不存在輕鏈之情況下與抗原結合且典型地具有三個高變區，例如標示為CDRH1、CDRH2及CDRH3之CDR。重鏈IgG單功能抗體具有兩個由二硫鍵連接之重鏈抗原結合分子。重鏈可變結構域包含一或多個高變區，較佳CDRH3或HVL-H3區。
抗體片段可使用習知重組或蛋白質工程改造技術來獲得，且該等片段可針對以與完整抗體相同之方式與人類uPA結合或另一功能進行篩選。
本發明之抗體片段可藉由截斷(例如藉由自多肽之N端及/或C端移除一或多個胺基酸)來製備。片段亦可由一或多個內部缺失產生。
本發明之抗體可為或可包含抗蛋白質S抗體或其變異體之片段。
本發明之抗體可為或可包含此等抗體或其變異體中之一者的抗原結合部分。舉例而言，本發明之抗體可為此等抗體或其變異體中之一者的Fab片段，或其可為來源於此等抗體或其變異體中之一者的單鏈抗體。
變異抗體可包含如上文所述之具體序列及片段的1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30個或30個以上之胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失」變異體可包含缺失個別胺基酸；缺失較小胺基酸組，諸如2、3、4或5個胺基酸；或缺失較大胺基酸區，諸如缺失特定胺基酸結構域或其他特徵。「插入」變異體可包含插入個別胺基酸；插入較小胺基酸組，諸如2、3、4或5個胺基酸；或插入較大胺基酸區，諸如插入特定胺基酸結構域或其他特徵。「取代」變異體較佳涉及用相同數目之胺基酸替代一或多個胺基酸及進行保守胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似特性之替代性胺基酸取代，例如另一種鹼性胺基酸、另一種酸性胺基酸、另一種中性胺基酸、另一種帶電荷胺基酸、另一種親水性胺基酸、另一種疏水性胺基酸、另一種極性胺基酸、另一種芳族胺基酸或另一種脂族胺基酸。可用於選擇適合之取代基的20種主要胺基酸之一些特性如下：
較佳「衍生物」或「變異體」包括其中呈現在序列中之胺基酸並非天然存在之胺基酸而為其結構類似物的彼等衍生物或變異體。用於序列中之胺基酸亦可為經衍生或修飾的(例如經標記)，其限制條件為抗體之功能不受明顯不利影響。
取代可為(但不限於)保守取代。
如上文所描述之衍生物及變異體可在抗體合成期間或藉由產生後修飾來製備，或在抗體為重組形式時使用定點突變誘發、隨機突變 誘發、或酶促裂解及/或核酸接合來製備。
如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有如下可變區之抗體，其中構架區之至少一部分及/或CDR區之至少一部分來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。舉例而言，人類抗體可具有如下可變區，其中構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。另外，若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
該人類抗體可為人類單株抗體。該人類單株抗體可由融合瘤產生，該融合瘤包括獲自轉殖基因非人類動物(例如具有包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因區段譜系之基因組的轉殖基因小鼠)的B細胞與不朽化細胞融合。
人類抗體可自選擇人類生殖系序列時建構之序列文庫分離，進一步用天然及合成序列多樣性多樣化。
人類抗體可藉由試管內免疫人類淋巴細胞，繼而用艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)使淋巴細胞轉型來製備。
術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾形式，諸如抗體與另一種藥劑或抗體之結合物。
如本文所用之術語「人類化抗體」係指含有來源於非人類免疫球蛋白之序列(CDR區或其部分)的人類/非人類嵌合抗體。因此，人類化抗體為其中至少來自接受者高變區之殘基由來自非人類物種(諸如來自小鼠、大鼠家兔或非人類靈長類)抗體(供者抗體)高變區之殘基替換的人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其具有所需特異性、親和力、序列組成及功能性。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基由對應非人類殘基替換。該修飾之一個實例為引入一或多個所謂回復突變，其典型地為來源於 供者抗體之胺基酸殘基。抗體之人類化可使用熟習此項技術者已知之重組技術來進行(參見例如Antibody Engineering,Methods in Molecular Biology，第248卷，Benny K.Lo編)。輕鏈與重鏈可變結構域之適合人類接受者構架可由例如序列或結構同源性鑑別。替代性地，可例如基於結構、生物物理學及生物化學特性之知識使用固定接受者構架。接受者構架可來源於生殖系或來源於成熟抗體序列。來自供者抗體之CDR區可藉由CDR移植而轉移。
移植有CDR之人類化抗體可藉由鑑別其中再引入(回復突變)來自供者抗體之胺基酸殘基對人類化抗體之特性具有有益影響的關鍵構架位置來對例如親和力、功能性及生物物理學特性進一步最佳化。除來源於供者抗體之回復突變之外，人類化抗體可藉由在CDR或構架區中引入生殖系殘基、消除免疫原性抗原決定基、定點突變誘發、親和力成熟等來進行工程改造。
此外，人類化抗體可包含未見於接受者抗體或供者抗體中之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個(典型地兩個)可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區且其中所有或實質上所有FR殘基為人類免疫球蛋白序列之彼等FR殘基。人類化抗體可視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、典型地人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。
術語「人類抗體衍生物」係指人類化抗體之任何經修飾形式，諸如抗體與另一種藥劑或抗體之結合物。
如本文所用之術語「嵌合抗體」係指其輕鏈及重鏈基因已自來源於不同物種之免疫球蛋白可變及恆定區基因(典型地藉由基因工程改造)構築的抗體。舉例而言，可將來自小鼠單株抗體之基因的可變區段接合於人類恆定區。
抗體之片段可結晶區(「Fc區(Fc region)」/「Fc結構域(Fc domain)」)為抗體之N端區，其包含恆定CH2及CH3結構域。Fc結構域可與稱為Fc受體之細胞表面受體以及補體系統之一些蛋白質相互作用。Fc區使得抗體能夠與免疫系統相互作用。在本發明之一個態樣中，抗體可經工程改造以在Fc區內包括修飾，以尤其典型地改變一或多種其功能特性(諸如血清半衰期、補體結合(complement fixation)、Fc受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原依賴性細胞毒性)或缺乏該等功能特性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分附接至抗體上)，或經修飾以改變其糖基化而再改變該抗體之一或多種功能特性。IgG1抗體可攜載包含一或多種及可能所有以下突變的經修飾之Fc結構域，該等突變將分別導致對某些Fc受體之親和力降低(L234A、L235E及G237A)及C1q介導之補體結合減少(A330S及P331S)(殘基編號根據EU索引)。
本發明抗體之同型可為IgG，諸如IgG1，諸如IgG2，諸如IgG4。若需要，抗體之類別可藉由已知技術「轉換」。舉例而言，原先以IgM分子形式產生之抗體可類別轉換為IgG抗體。類別轉換技術亦可用於將一個IgG子類別轉化為另一個子類別，例如：將IgG1轉化為IgG2或IgG4；將IgG2轉化為IgG1或IgG4；或將IgG4轉化為IgG1或IgG2。亦可藉由組合來自不同IgG子類別之區來進行抗體工程改造以產生恆定區嵌合分子。
在一個具體實例中，修飾CH1之鉸鏈區以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於例如Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。
可修飾恆定區以使抗體穩定，例如以降低二價抗體分成兩個單價VH-VL片段之風險。舉例而言，在1gG4恆定區中，殘基S228(根據EU索引編號索引，根據Kabat為S241)可突變為脯胺酸(proline；P)殘基以使鉸鏈處之重鏈間二硫化物橋形成穩定(參見例如，Angal等人Mol Immunol.(1993)30：105-8)。
抗體或其片段亦可根據其互補決定區(CDR)定義。術語「互補決定區(complementarity-determining region)」或「高變區(hypervariable region)」在用於本文時係指抗體中涉及抗原結合之胺基酸殘基所位於的區。在抗體可變結構域之胺基酸比對中，高變區或CDR區可鑑別為具有最高變化性之區。可使用資料庫進行CDR鑑別，諸如Kabat資料庫，其中CDR例如定義為包含輕鏈可變結構域之胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)以及重鏈可變結構域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)。替代性地，CDR可定義為來自「高變環(hypervariable loop)」之彼等殘基(輕鏈可變結構域中之殘基26-33(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)以及重鏈可變結構域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol(1987)196：901-917)。典型地，此區中胺基酸殘基之編號藉由Kabat等人同前文獻中所描述之方法來進行。本文中諸如「Kabat位置」、「Kabat殘基」及「根據Kabat」之片語係指用於重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或對應於可變結構域之構架(FR)或CDR之縮短序列或其中之插入序列的額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可在CDR H2之殘基52後包括胺基酸插入序列(根據Kabat，殘基52a、52b及52c)且在重鏈FR殘基82後包括插入之殘基(根據Kabat，例如殘基82a、82b及82c)。對於給定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。
術語「構架區(framework region)」或「FR」殘基係指不在如本文所定義之CDR內的VH或VL胺基酸殘基。
本發明之抗體可包含來自本文所揭示之特異性抗體中之一或多者的CDR區。
如本文所用之術語「抗原決定基」在「抗原結合多肽」(Ab)與其對應「抗原」(AG)之間分子相互作用的情形下定義。
如本文所用，術語「Ab」包括(但不限於)與對應Ag特異性結合之抗體、Fab、F(ab')2或Fv片段。術語「Ag」係指用於對免疫活性脊椎動物進行免疫接種以產生識別該Ag之Ab的分子實體。本文中，Ag之名稱更廣泛且一般意欲包括由Ab特異性識別之分子，因此包括用於產生Ab之免疫接種過程中所用的分子之片段或模擬物。
一般而言，「抗原決定基」係指Ag上Ab特異性結合之區域或區，亦即與Ab物理接觸之區域或區。物理接觸可使用Ab及Ag分子中原子之各種判據(例如距離截止為2-6Å，諸如3Å，諸如4Å，諸如5Å；或溶劑可接近性)來定義。蛋白質抗原決定基可包含Ag中直接涉及與Ab結合之胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫顯性組分)及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如藉由Ab有效阻斷之Ag胺基酸殘基，亦即在Ab之「溶劑排斥表面」及/或「足跡」內之胺基酸殘基。
在其最詳細水準下，Ag與Ab之間相互作用的抗原決定基可由界定Ag-Ab相互作用中所存在之原子接觸的空間座標以及關於其對結合熱力學之相對貢獻的資訊來描述。
在不太詳細之水準下，抗原決定基可由界定Ag與Ab之間原子接觸的空間座標來特性化。
在甚至更不詳細之水準下，抗原決定基可如藉由特定判據(諸如Ab：Ag複合物中原子之間的距離或其溶劑可接近性)所定義，由其所包含之胺基酸殘基來特性化。
在更不詳細之水準下，抗原決定基可由功能，例如藉由與其他Ab之競爭結合來特性化。抗原決定基亦可更一般地定義為包含在由另一個胺基酸取代時將改變Ab與Ag之間相互作用之特徵的胺基酸殘基。
給定Ab/Ag之抗原決定基可在不同細節水準下使用多種實驗及計算抗原決定基定位方法來界定及特性化。實驗方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance；NMR)光譜法及氫氘交換質譜(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry；HX-MS)法及各種競爭結合方法。由於各方法依賴於獨特原理，故對抗原決定基之描述與用於測定其之方法緊密相關。由此，視所採用之抗原決定基定位方法而定，將不同地界定給定Ab/Ag對之抗原決定基。
基於抗原決定基之描述及定義視所用抗原決定基定位法而定，在不同細節水準下獲得的事實，故可類似地在不同細節水準下進行同一Ag上針對不同Ab之抗原決定基的比較。
若在胺基酸水準上所描述的例如由X射線結構確定之抗原決定基含有相同胺基酸殘基組，則將其稱為一致的。若抗原決定基共用至少一個胺基酸，則將該等抗原決定基稱為重疊的。若抗原決定基不共用胺基酸殘基，則將該等抗原決定基稱為獨立(獨特)的。
若對應Ab之結合為相互排它性的，亦即一個Ab之結合不包括同時結合其他Ab，則將由競爭結合來特性化之抗原決定基稱為重疊的。若Ag能夠同時容納對應Ab兩者之結合，則將抗原決定基稱為獨立(獨特)的。
一般而言，術語「互補位」係指Ab上與Ag特異性結合之區域或區。
除非另行說明(例如在一些情形下，本發明係關於與特定胺基酸殘基直接結合之抗體)，否則術語抗原決定基在本文中包括蛋白質S之任何特定區中與抗蛋白質S抗體或本發明之另一種蛋白質S特異性藥劑特異性結合的兩種類型之結合位點。蛋白質S可包含多種不同抗原決定基，其可包括(但不限於)(1)線形肽抗原決定子，(2)構形抗原決定子，其 由一或多個在成熟蛋白質S構形中位置彼此接近之非鄰接胺基酸組成；及(3)轉譯後抗原決定子，其由共價附接至蛋白質S上之分子結構的整體或部分組成，諸如碳水化合物基團。
術語「互補位」之定義藉由將視角逆轉來源於以上「抗原決定基」之定義。因此，術語「互補位」係指Ab上與Ag特異性結合之區域或區，亦即其與Ag物理接觸之區域或區。
給定抗體/抗原對之抗原決定基及互補位可藉由常規方法來鑑別。舉例而言，抗原決定基之一般位置可藉由評定抗體與不同蛋白質S片段結合之能力來測定。蛋白質S內與抗體接觸之特定胺基酸(抗原決定基)及抗體中與蛋白質S接觸之特定胺基酸(互補位)亦可使用常規方法來測定。舉例而言，抗體及靶標分子可組合且Ab：Ag複合物可結晶。可測定複合物之晶體結構且將其用於鑑別抗體與其靶標之間相互作用的特定位點。
與同一抗原結合之抗體可關於其同時與其共同抗原結合之能力進行特性化且可經歷「競爭結合」/「分組(binning)」。在本發明之上下文中，術語「分組」係指一種將與同一抗原結合之抗體分組的方法。抗體之「分組」可基於兩個抗體與其共同抗原在基於標準技術(諸如表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)、生物層干涉量測術、ELISA或流動式細胞量測術)之分析中的競爭結合。
抗體之「分組(bin)」可使用單個參考抗體或替代性地使用參考抗體組來界定。給定抗體之「分組」鑑別的解析度將隨著所用參考抗體之數目而增加。當使用單個參考抗體時，若第二抗體不能與參考抗體同時與抗原結合，則將第二抗體稱為屬於與參考抗體相同之「分組」。在此情形下，參考抗體及第二抗體競爭性地與抗原之同一部分結合且編撰為「競爭抗體」。若第二抗體能夠與參考抗體同時與抗原結合，則將第二抗體稱為 屬於獨立「分組」。在此情形下，參考抗體及第二抗體不競爭性地與抗原之同一部分結合且編撰為「非競爭抗體」。當使用參考抗體組用於「分組」鑑別時，該參考抗體組可包含可用於藉由交叉競爭分析來界定個別抗體「分組」的已知或新穎抗體組，其中分析該組內之各抗體對與該組各成員結合之抗原的競爭。當抗體A與抗體B在交叉競爭分析中展現相同結合模式時，將抗體A稱為屬於與抗體B相同之「分組」。當抗體A與抗體B針對參考組中個別抗體中之一或多者展現不同競爭結合特徵時，將抗體A稱為屬於與抗體B不同之「分組」。競爭結合特徵為其中分析組內之各抗體與該組內另一個成員同時結合抗原之能力的編譯資料組。例如，抗體A相對於參考抗體組1、2及3之抗原結合特徵如下：A+1=A不結合；A+2=A結合；A+3=A結合。若B+1=B結合；B+2=B結合；B+3=B結合，則抗體B具有與抗體A相比不同之競爭結合特徵且該兩個抗體稱為屬於不同「分組」。若C+1=C不結合；C+2=C結合；C+3=C結合，則抗體C具有與抗體A相比類似之結合特徵且該兩個抗體稱為屬於相同「分組」。如所陳述，給定抗體之「分組」鑑別的解析度將隨著所用參考抗體之數目而增加。競爭性結合分析不提供結合親和力之資訊，且分析必須以使得測試抗體單獨能夠結合抗原至足以充當結合競爭者的方式設計。
抗體「分組」不提供關於抗原決定基之直接資訊。競爭抗體，亦即屬於相同「分組」之抗體，可具有相同抗原決定基、重疊抗原決定基或甚至獨立抗原決定基。後者之情況為若與抗原上之其抗原決定基結合的參考抗體佔據第二抗體接觸該抗原上之其抗原決定基所要的空間(「位阻(steric hindrance)」)。非競爭抗體一般具有獨立抗原決定基。
術語「結合親和力」在本文中用作兩個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間的非共價相互作用之強度的量度。術語「結合親和力」用於描述單價相互作用(內源性活性)。
兩個分子(例如抗體或其片段與抗原)之間經由單價相互作用的結合親和力可藉由測定平衡解離常數(KD)來量化。隨後，KD可藉由量測複合物形成及解離之動力學，例如藉由SPR法來測定。對應於單價複合物之締合及解離的速率常數分別稱為締合速率常數ka(或kon)及解離速率常數kd(或koff)。KD經由等式KD=kd/ka與ka及kd相關。
遵循上述定義，與不同分子相互作用相關聯之結合親和力(諸如不同抗體對給定抗原之結合親和力的比較)可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD值來比較。
根據本發明之抗體可能夠與另一個分子(諸如天然存在之配體或受體或另一個抗體)競爭與蛋白質S結合。因此，根據本發明之抗體可能夠以比亦能夠結合蛋白質S之另一個分子高的親和力結合蛋白質S。
抗體與天然配體/受體競爭與抗原結合之能力可藉由測定及比較所關注之相互作用(諸如抗體與抗原之間的特定相互作用)的KD值與不關注之相互作用的KD值來評定。典型地，抗體關於靶標之KD將為關於其他非靶標分子(諸如無關材料或環境中之伴隨材料)之KD的至多五分之一，更佳十分之一。更佳地，KD將為至多1/50，諸如1/100或1/200；甚至更佳地至多1/500，諸如1/1,000或1/10,000。
此解離常數之值可藉由熟知方法直接測定。評估配體(諸如針對靶標之抗體)之結合能力的標準分析為此項技術中已知的且包括例如ELISA、西方墨點、RIA及流動式細胞量測術分析。抗體之結合動力學及結合親和力亦可藉由此項技術中已知之標準分析(諸如SPR)來評定。
可進行競爭性結合分析，其中將抗體與靶標之結合與該靶標之另一個配體(諸如另一個抗體)與靶標之結合相比較。
多核苷酸
術語核酸分子「 」及「多核苷酸」在本文中可互換使用，且 係指聚合形式的任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其類似物。多核苷酸之非限制性實例包括基因、基因片段、信使RNA(messenger RNA；mRNA)、cDNA、重組多核苷酸、質體、載體、任何序列之經分離DNA、任何序列之經分離RNA、核酸探針及引子。本發明之多核苷酸可以經分離或經純化之形式提供。
「編碼」所選擇之多肽的核酸序列為當置於適當調節序列之控制下時活體內轉錄(在DNA之情況下)及轉譯(在mRNA之情況下)為多肽的核酸分子。
編碼序列之邊界藉由5'(胺基)端之起始密碼子及3'(羧基)端之翻譯終止密碼子來確定。出於本發明之目的，該等核酸序列可包括(但不限於)來自病毒、原核或真核mRNA之cDNA，來自病毒或原核DNA或RNA之基因組序列，及甚至合成DNA序列。轉錄終止序列可位於編碼序列之3'處。
在一個具體實例中，本發明之多核苷酸包含編碼如上文所描述之VH或VL胺基酸序列的序列。舉例而言，本發明之多核苷酸可編碼如上文所描述包含SEQ ID NO：49-55之序列或其變異體或片段的多肽。適合之多核苷酸序列可替代性地為此等特定多核苷酸序列之一的變異體。舉例而言，變異體可為以上核酸序列中之任一者之取代、缺失或添加變異體。變異體多核苷酸可包含序列表中所給定之序列的1、2、3、4、5、多至10、多至20、多至30、多至40、多至50、多至75個或75個以上核酸取代及/或缺失。
因此，本發明之抗體可產生自編碼其及能夠表現其之多核苷酸或以該多核苷酸之形式輸送。在其中抗體包含兩條或兩條以上鏈之情況下，本發明之多核苷酸可編碼一或多條抗體鏈。舉例而言，本發明之多核苷酸可編碼抗體輕鏈、抗體重鏈或兩者。可提供兩種多核苷酸，其中之一 編碼抗體輕鏈而其中另一個編碼對應抗體重鏈。該多核苷酸或多核苷酸對可一起表現以產生本發明之抗體。
本發明之多核苷酸可根據此項技術中熟知之方法來合成，如例如在Sambrook等人(1989,Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)中所描述的。
本發明之核酸分子可以表現卡匣形式提供，其包括控制序列、可操作地連接至插入序列上之信號肽序列，因此允許活體內表現本發明之抗體。此等表現卡匣隨後典型地在載體(例如質體或重組病毒性載體)內提供。該表現卡匣可向宿主個體直接投予。
替代性地，包含本發明之多核苷酸的載體可向宿主個體投予。較佳地，多核苷酸使用遺傳載體來製備及/或投予。適合之載體可為能夠攜載足夠量之遺傳資訊且允許表現本發明之多肽的任何載體。
因此，本發明包括包含該等多核苷酸序列之表現載體。該等表現載體在分子生物學之技術中常規地構築，且可例如涉及使用質粒DNA及適當起始子、啟動子、強化子、信號肽序列及其他要素，諸如可能必需且已正確定向定位之聚腺苷酸化信號，以允許表現本發明之肽。其他適合之載體將為熟習此項技術者顯而易見的。就此進一步舉例而言，吾等參考Sambrook等人。
本發明亦包括已經修飾以表現本發明之抗體的細胞。該等細胞包括短暫或較佳地穩定高等真核細胞系(諸如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)、低等真核細胞(諸如酵母)或原核細胞(諸如細菌細胞)。可為藉由插入編碼本發明之抗體的載體或表現卡匣來修飾之細胞的特定實例包括哺乳動物HEK293、CHO、BHK、NSO及人類視網膜細胞。較佳地，所選擇之細胞系將為不僅穩定且亦允許多肽之成熟糖基化及細胞表面表現的一個細胞系。
本發明之該等細胞系可使用常規方法培養以產生本發明之抗體，或可治療或預防地用於向個體輸送本發明之抗體。替代性地，本發明之多核苷酸、表現卡匣或載體可向來自個體之細胞活體外投予且該細胞隨後返回個體身體中。
醫藥組成物
在另一個態樣中，本發明提供包含本發明之分子，諸如如本文所描述之抗體、多核苷酸、載體及細胞的組成物及調配物。舉例而言，本發明提供一種醫藥組成物，其包含一或多種與醫藥學上可接受之載劑一起調配的本發明之抗體。
因此，本發明之一個目標為提供一種醫藥組成物，其包含以0.25mg/ml至250mg/ml之濃度存在的該抗體，且其中該組成物之pH值為2.0至10.0。組成物可進一步包含以下各者中之一或多者：緩衝劑系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑或界面活性劑以及其各種組合。在醫藥組成物中使用防腐劑、等張劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑為技術人員熟知的。可參考Remington：The Science and of Pharmacy，第19版，1995。
在一個具體實例中，醫藥組成物為水性調配物。該調配物典型地為溶液或懸浮液，但亦可包括膠體、分散液、乳液及多相物質。術語「水性調配物」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣，術語「水溶液」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。在另一個具體實例中，醫藥組成物為經冷凍乾燥之調配物，醫師或患者在使用前向其中添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一個態樣中，醫藥組成物包含該抗體之水溶液及緩衝液，其中該抗體以1mg/ml或1mg/ml以上之濃度存在，且其中該調配物之pH值為約2.0至約10.0。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容 之任何及全部溶劑、分散介質、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似物。較佳地，載體適合於非經腸，例如靜脈內、肌肉內或皮下投予(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，抗體可包覆在材料中以保護抗體不受酸及可能使該抗體失活或變性之其他天然條件的作用。
較佳醫藥學上可接受之載劑包含水性載劑或稀釋劑。可在本發明之醫藥組成物中採用的適合之水性載劑的實例包括水、緩衝水及鹽水。其他載劑之實例包括乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包覆材料(諸如卵磷脂)、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持恰當之流動性。在許多情況下，在組成物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。
本發明之醫藥組成物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。此等組成物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。預防微生物之存在可藉由滅菌程序(同前文獻)及藉由包括各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保。亦可需要在組成物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
治療性組成物典型地必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組成物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。
無菌可注射溶液可藉由以所需量將活性劑(例如抗體)與上文所列舉之一種成分或成分組合一起併入適當之溶劑中，繼而滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將活性劑併入含有鹼性分散介質及上文所 列舉之彼等成分中所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其由其先前無菌過濾溶液得到活性劑加任何額外所需成分之粉末。
本發明之醫藥組成物可包含額外之活性成分以及本發明之抗體。如上文所提及，本發明之組成物可包含一或多種本發明之抗體。其亦可包含額外治療劑或預防劑。舉例而言，在其中本發明之醫藥組成物欲用於在治療出血病症中使用的情況下，其可另外包含一或多種意欲減少出血病症之症狀的藥劑。舉例而言，組成物可包含一或多種凝血因子。組成物可包含一或多種意欲改善患者之病狀的其他組分。舉例而言，在其中組成物欲用於在治療罹患非所需出血之患者(諸如進行手術之患者或罹患外傷之患者)中使用的情況下，組成物可包含一或多種鎮痛劑、麻醉劑、免疫抑制劑或消炎劑。亦處於本發明之範疇內的為包含本發明之抗體或其他組成物以及使用說明書的套組。該套組可進一步含有一或多種額外試劑，諸如如上文所論述之額外治療劑或預防劑。
投藥模式
本發明之抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物可經由一或多種投藥途徑使用此項技術中已知之多種方法中的一或多者來投予。如熟習此項技術者應瞭解的，投藥途徑及/或模式將視所需結果而變化。
本發明之抗體或組成物的較佳投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投藥途徑，例如藉由注射或輸注。
替代性地，本發明之抗體可經由非經腸以外之途徑，諸如經口或局部投予。
本發明之抗體可預防或治療地投予(按需)。
如本文所用之片語「非經腸投藥」意謂除腸內及局部投藥之 外的投藥模式，其通常藉由注射來進行。替代性地，本發明之抗體或組成物可經由非經腸以外之途徑，諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑來投予。
類似地，本發明之抗體可用於製造適合於非經腸投藥之藥劑。
本發明之抗體可用於製造適合於靜脈內投藥之藥劑。
本發明之抗體可用於製造適合於肌肉內投藥之藥劑。
本發明之抗體可用於製造適合於皮下投藥之藥劑。
劑量
本發明之抗體的適合劑量可由熟習醫學之行醫者確定。本發明之醫藥組成物中活性成分之實際劑量水準可變化，以獲得在對患者無毒性之情況下有效地達成特定患者、組成物及投藥模式之所需治療響應的活性成分之量。所選擇之劑量水準將視多種藥物動力學因素而定，包括所採用特定抗體之活性，投藥途徑，投藥時間，抗體排泄速率，治療持續時間，與所採用之特定組成物組合使用的其他藥物、化合物及/或材料，所治療之患者的年齡、性別、重量、病狀、一般健康狀況及先前病史，及醫學技術中熟知之類似因素。
本發明之抗體的適合之劑量可例如在待治療之患者每公斤體重約0.1μg至約100mg範圍內。舉例而言，適合之劑量可為每天每公斤體重約1μg至約10mg或約1mg至約5mg。本發明之抗體的適合之劑量可在2至200mg/kg、諸如約150-200mg/kg、諸如約150-170mg/kg、諸如約100-150mg/kg、諸如約50-100mg/kg、諸如約70-90mg/kg、諸如約10-50mg/kg、諸如約10-30mg/kg範圍內。
其他適合之劑量可為大約0.1-10mg/kg，諸如大約0.1-1mg/kg，諸如大約1-2mg/kg或大約2-3mg/kg或大約4-5mg/kg或大約5-6mg/kg或大約6-7mg/kg或大約7-8mg/kg或大約8-9mg/kg或大約9-10 mg/kg；或大約10-21mg/kg，諸如大約10-11mg/kg或大約11-12mg/kg或大約12-13mg/kg或大約13-14mg/kg或大約14-15mg/kg或大約15-16mg/kg或大約16-17mg/kg或大約17-18mg/kg或大約18-19mg/kg或大約19-20mg/kg或大約20-21mg/kg。向個體投予之單株抗體的量可使得其投藥產生約10μg/ml至約40μg/ml、諸如約15-35μg/ml、諸如約10-15μg/ml、諸如約15-20μg/ml、諸如約20-25μg/ml、諸如約25-30μg/ml、諸如約30-35μg/ml、諸如約35-40μg/ml該單株抗體之個體血漿濃度。
給藥方案
可調節給藥方案以提供最佳所需響應(例如治療響應)。舉例而言，可單次投予大丸劑，可隨時間分若干次投予分次劑量，或可如治療情況之緊急需要所指示而按比例減少或增加劑量。就投予之容易性及劑量之均勻性而言，將非經腸組成物調配成單位劑型尤其有利。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單個劑量用於待治療之個體的實體上離散之單位；各單位含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療效果的預定量之活性化合物。
抗體可以單個劑量或以多個劑量形式投予。多個劑量可經由相同或不同途徑及向相同或不同位置投予。替代性地，抗體可以持續釋放調配物之形式投予，在此情況下需要較不頻繁之投藥。劑量及頻率可視抗體在患者中之半衰期及所需治療持續時間而變化。投藥之劑量及頻率亦可視治療為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，在長時間段內，可以相對不頻繁之間隔投予相對低之劑量。在治療應用中，可投予相對高之劑量，例如直至患者展示疾病症狀之部分或完全改善。
因此，本發明之抗體可按以下投予：大約每日，大約每隔一天，大約每三天，大約每四天，大約每五天，大約每六天；大約每週，諸如每5、6、7、8、9或10天；大約每隔一週，諸如每11、12、13、14、15、 16或17天；大約每三週，諸如每18、19、20、21、22、23或24天；大約每四週，諸如每25、26、27、28、29、30或31天。
本發明之抗體亦可按需投予。
其他具體實例
提供以下具體實例以幫助理解本發明，然而，本發明不僅限於以下具體實例。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合且抑制蛋白質S與APC之相互作用的抑制劑(諸如(但不限於)抗體、Fabs或其他片段、肽或適體)。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合且抑制蛋白質S與APC之相互作用的抗體或其抗原結合片段。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合且在不干擾蛋白質S之已知非凝血功能的情況下抑制蛋白質S與APC之相互作用的抗體或其抗原結合片段。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合且抑制蛋白質S與APC之相互作用的抗體或其抗原結合片段的用途，其用於治療凝血病變，諸如血友病。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合且在不干擾蛋白質S之已知非凝血功能的情況下抑制蛋白質S與APC之相互作用的抗體或其抗原結合片段的用途，其用於血友病治療。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合之抑制劑的用途，其用於獨立於APC而治療凝血病變，諸如血友病。
在一個具體實例中，本發明係關於在不干擾蛋白質S之已知非凝血功能的情況下與蛋白質S結合之抑制劑的用途，其用於獨立於APC而進行血友病治療。
在一個具體實例中，本發明係關於與蛋白質S結合之抗體或其抗原結合片段的用途，其用於獨立於APC而治療凝血病變，諸如血友病。
在一個具體實例中，本發明係關於在不干擾蛋白質S之已知非凝血功能的情況下與蛋白質S結合之抗體或其抗原結合片段的用途，其用於獨立於APC而進行血友病治療。
在一個具體實例中，本發明提供一種治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-4區中的蛋白質S抑制劑來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種用於治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-3區中的蛋白質S抑制劑來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種用於治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-2區中的蛋白質S抑制劑來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種用於治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1區中的蛋白質S抑制劑來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-4區中的抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-3區中的抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1-2區中的抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種治療凝血病變之方法，其使用能夠結合在蛋白質S之EGF1區中的抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段來進行。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-4區中之蛋白質S抑制劑的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-3區中之蛋白質S抑制劑的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-2區中之蛋白質S抑制劑的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1區中之蛋白質S抑制劑的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-4區中之抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-3區中之抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1-2區中之抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，本發明提供一種能夠結合在蛋白質S之EGF1區中之抗蛋白質S抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製造用於治療凝血病變之藥劑。
在一個具體實例中，該凝血病變為血友病，諸如血友病A 或B。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與人類蛋白質S結合。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與來自食蟹獼猴之蛋白質S結合。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與家兔蛋白質S結合。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠明顯地減少家兔血友病模型中之活體內失血。
在一個具體實例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其能夠在基於人類FVIII不足血漿之凝血酶產生分析中增加凝血酶產生。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不阻止人類蛋白質S與脂質表面結合。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不阻止人類蛋白質S與C4BP結合。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠以Ca2+非依賴性方式結合其抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段具有縮短人類FVIII不足血漿中之凝結時間或減少人類全血凝結時間(如在血栓彈力描記術(thromboelastography；TEG)分析中所量測)的能力。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不影響TFPI上蛋白質S之輔因子功能。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段不阻止蛋白質S與脂質表面或C4BP或TFPI結合，但針對來自不同物種之蛋白質S具有交叉反應性而同時適用於治療凝血病變(諸如血友病)。
在一個具體實例中，本發明之抗體可為視情況包含一或多個回復突變之人類抗體或人類化抗體。
在一個具體實例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其半衰期可藉由應用已知延長原理(包括聚乙二醇乙醯化等)來加以延長。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含來自本文所揭示之特異性抗體中之一或多者的CDR區，諸如在如本文所描述的由SEQ ID NO：4至55表示之可變輕鏈及可變重鏈序列中任一者內的CDR區(SEQ ID NO4-45之註解CDR序列亦參見圖9及10)。
在一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段輕鏈內的CDR序列處於殘基SASSSVSYMY(SEQ ID NO：36之CDR1殘基24-33)、DTSNLAS(SEQ ID NO：36之CDR2殘基49-55)及QQWSSYPLT(SEQ ID NO：36之CDR3殘基88-96)處。
在一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段重鏈內的CDR序列處於殘基TSGMGVS(SEQ ID NO：37之CDR1殘基31-37)、HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO：37之CDR2殘基52-67)及YGNYGDY(SEQ ID NO：37之CDR3殘基100-106)處。
在另一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段輕鏈內的CDR序列處於殘基RASSSVSYMY(SEQ ID NO：40之CDR1殘基24-33)、ATSNLAS(SEQ ID NO：40之CDR2殘基49-55)及QQWSSIPPT(SEQ ID NO：40之CDR3殘基88-96)處。
在另一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段重鏈內的CDR序列處於殘基SYWIN(SEQ ID NO：41之CDR1殘基31-35)、RIDPYDSETHYNQKFKD(SEQ ID NO：41之CDR2殘基50-66)及WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：41之CDR3殘基99-108)處。
在另一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段 輕鏈內的CDR序列處於殘基SVSSSVSYMH(SEQ ID NO：10之CDR1殘基24-33)、DTSNLVS(SEQ ID NO：10之CDR2殘基49-55)及QQYSGYLYT(SEQ ID NO：10之CDR3殘基88-96)處。
在另一個具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段重鏈內的CDR序列處於殘基DAWMD(SEQ ID NO：11之CDR1殘基31-35)、EIRSKANNHATYYAESVKG(SEQ ID NO：11之CDR2殘基50-68)及TTAFLFDY(SEQ ID NO：11之CDR3殘基101-108)處。
在又一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段輕鏈內的CDR序列處於殘基SATSSVTYMH(SEQ ID NO：26之CDR1殘基24-33)、STSNLAS(SEQ ID NO：26之CDR2殘基49-55)及QQRSSYPPT(SEQ ID NO：26之CDR3殘基88-96)處。
在另一個具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段重鏈內的CDR序列處於殘基GYGVS(SEQ ID NO：27之CDR1殘基31-35)、MIWGDGTTDYNSTLKS(SEQ ID NO：27之CDR2殘基50-65)及DPGAMDY(SEQ ID NO：27之CDR3殘基98-104)處。
在又一個該具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段輕鏈內的CDR序列處於殘基SASSSVSYMY(SEQ ID NO：12之CDR1殘基24-33)、STSNLAS(SEQ ID NO：12之CDR2殘基49-55)及QQWSSNPYT(SEQ ID NO：12之CDR3殘基88-96)處。
在另一個具體實例中，在本發明之抗體或其抗原結合片段重鏈內的CDR序列處於殘基SYWMN(SEQ ID NO：13之CDR1殘基31-35)、RIDPYDTETHYNQKFED(SEQ ID NO：13之CDR2殘基50-66)及WAGSSYAMDY(SEQ ID NO：13之CDR3殘基99-108)處。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段在輕鏈內可具有以下CDR序列中之一或多者：RASSSVSYMY(SEQ ID NO：49之 CDR1殘基24-33)、ATSNLAS(SEQ ID NO：49之CDR2殘基49-55)及QQWSSIPPT(SEQ ID NO：49之CDR3殘基88-96)。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段在重鏈內可具有以下CDR序列中之一或多者：SYWIN(SEQ ID NO：50之CDR1殘基31-35)、RIDPYDSETHYAQKFQG(SEQ ID NO：50之CDR2殘基50-66)及WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：50之CDR3殘基99-108)。
在一個具體實例中，在抗體或其抗原結合片段中CDR2區中之潛在天冬胺酸位點可能經歷異構化成為異天冬胺酸(isoaspartic acid；isoAsp)，其藉由用不為半胱胺酸(cysteine；C)之不同胺基酸殘基取代SEQ ID NO：50、52、54或55之胺基酸殘基D55來加以避免。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含以下兩個CDR3序列(分別來自輕鏈及重鏈)：QQYSGYLYT(SEQ ID NO：10之CDR3殘基88-96)及TTAFLFDY(SEQ ID NO：11之CDR3殘基101-108)。
在一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含以下兩個CDR3序列(分別來自輕鏈及重鏈)：QQWSSNPYT(SEQ ID NO：12之CDR3殘基88-96)及WAGSSYAMDY(SEQ ID NO：13之CDR3殘基99-108)。
在一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含以下兩個CDR3序列(分別來自輕鏈及重鏈)：QQRSSYPPT(SEQ ID NO：26之CDR3殘基88-96)及DPGAMDY(SEQ ID NO：27之CDR3殘基98-104)。
在一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含以下兩個CDR3序列(分別來自輕鏈及重鏈)：QQWSSIPPT(SEQ ID NO：40之CDR3殘基88-96)及 WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：41之CDR3殘基99-108)。
在一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段包含以下兩個CDR3序列(分別來自輕鏈及重鏈)：QQWSSIPPT(SEQ ID NO：49之CDR3殘基88-96)及WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：50之CDR3殘基99-108)。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：10之輕鏈可變區及SEQ ID NO：11之重鏈可變區。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區及SEQ ID NO：13之重鏈可變區。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：26之輕鏈可變區及SEQ ID NO：27之重鏈可變區。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：40之輕鏈可變區及SEQ ID NO：41之重鏈可變區。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：49之輕鏈可變區及SEQ ID NO：50之重鏈可變區。
在某些具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：49之輕鏈可變區，其中胺基酸殘基L45經P取代，且視情況L46經W取代，及SEQ ID NO：50之重鏈可變區，該重鏈可變區視情況進一步包含一或多個選自由M70L、R72V、T74K及V79A組成之群的取代。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：51之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：50之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：51之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：52之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：51之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：54之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：51之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：55之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：53之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：50之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：53之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：52之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：53之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：54之重鏈可變區。
在一個該具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含SEQ ID NO：53之輕鏈可變區，及SEQ ID NO：55之重鏈可變區。
在特定具體實例中，本發明包含以下單株抗體或其抗原結合片段：一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：56且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：57。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：58且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：57。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：58且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：59。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：60且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：57。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：58且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：61。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：58且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：62。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：60且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：59。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：60且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：61。
一種抗體，其中該抗體之輕鏈包含SEQ ID NO：60且該抗體之重鏈包含SEQ ID NO：62。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42及F43。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、 C41及E42。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40及C41。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39及K40。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38及E39。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42及F43。
在一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42及F43。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基 結合：SEQ ID NO：2之P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41及E42。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40及C41。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42及F43。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41及E42。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之G35、W36、Q37、G38、E39、K40及C41。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基結合：SEQ ID NO：2之S20、C21、K22、G24、C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42、F43。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段能夠與包含一或多個選自由以下各者組成之群之殘基的人類蛋白質S抗原決定基 結合：SEQ ID NO：2之S20、C21、K22、D23、G24、K25、A26、S27、F28、T29、C30、C32、K33、P34、G35、W36、Q37、G38、E39、K40、C41、E42、F43。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基S20的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基C21的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基K22的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基G24的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基A26的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基S27的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基F28的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基T29的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基C30的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基C32的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能 夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基K33的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基P34的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基G35的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基Q37的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基G38的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基E39的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基K40的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基C41的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基E42的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基F43的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39及K40的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39及K40以及C41、E42及 F43中之一或多者的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39、K40及F43以及C41及E42中之一或多者的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39、K40、C41及F43以及C41及E42中之一或多者的抗原決定基。
在一個具體實例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可能能夠結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39、K40、C41、E42及F43的抗原決定基。
本發明之特定具體實例
態樣1.一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1-3區中結合的抑制劑，其用於治療人類個體中之凝血病變。
2.根據態樣1所用之抑制劑，其中該抑制劑能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合以用於治療人類個體中之凝血病變。
3.根據態樣1或2所用之抑制劑，其中該抑制劑為抗體或其抗原結合片段。
4.一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合的抗體或其抗原結合片段，其中該結合區包含一或多個選自由以下各者組成之群的胺基酸殘基：SEQ ID NO：2之W36、E39、K40、C41、E42及F43。
5.根據態樣4之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合：SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39、K40及胺基酸殘基C41、E42及F43中的一或多者。
6.一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之輕鏈包含包含SEQ ID NO：49之殘基88-96(QQWSSIPPT)的CDR3序列，其中該等殘基中之一個或兩個可經不同殘基取代，且該抗體或抗原結合片段之重鏈包含包含SEQ ID NO：50之殘基99-108(WGGSGYAMDY)的CDR3序列，其中該等殘基中之一個或兩個可經不同殘基取代。
7.根據態樣6之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之該輕鏈包含包含SEQ ID NO：49之殘基24-33(RASSSVSYMY)的CDR1序列，及/或包含SEQ ID NO：49之殘基49-55(ATSNLAS)的CDR2序列，及/或包含SEQ ID NO：49之殘基88-96(QQWSSIPPT)的CDR3且該抗體或抗原結合片段之該重鏈包含包含SEQ ID NO：50之殘基31-35(SYWIN)的CDR1序列，及/或包含SEQ ID NO：50之殘基50-66(RIDPYDSETHYAQKFQG)的CDR2序列，及/或包含SEQ ID NO：50之殘基99-108(WGGSGYAMDY)的CDR3序列。
8.根據態樣6或7之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：49，其中胺基酸殘基L45經P取代，且視情況L46經W取代，及該抗體或抗原結合片段之重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50， 視情況進一步包含一或多個選自由M70L、R72V、T74K及V79A組成之群的取代。
9.根據態樣6、7或8之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51或53，且該抗體之該重鏈重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50、52、54或55。
10.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50。
11.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：52。
12.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：54。
13.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：55。
14.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50。
15.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：52。
16.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含 SEQ ID NO：54。
17.根據態樣9之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：55。
18.根據態樣7至17之抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：50之重鏈可變結構域(VH)CDR2胺基酸殘基D55視情況可經不為C之不同胺基酸殘基取代。
19.根據態樣3至18中任一個之抗體，其中該抗體為單株抗體。
20.一種多核苷酸，其編碼根據態樣1至19中任一個之抑制劑、抗體或其抗原結合片段。
21.一種醫藥組成物，其包含根據態樣4至19中任一個之抑制劑、抗體或其抗原結合片段或多核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
22.一種用於治療人類個體中之凝血病變的根據態樣4至19中任一個之抗體或其抗原結合片段。
23.根據態樣22之抗體或其抗原結合片段，其用於治療人類個體中之血友病。
24.一種真核細胞，其表現根據態樣4至19中任一個之抑制劑、抗體或其抗原結合片段。
25.一種抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體在與人類蛋白質S之結合中競爭，其中該參考抗體包含根據態樣8或18中任一個之重鏈可變區及輕鏈可變區。
實施例
實施例1：藉由針對人類血友病血漿中之蛋白質S的多株抗體來改善APTT
多株抗蛋白質S抗體濃度依賴性地減少在FVIII不足人類血 漿中在APC存在下之凝結時間(圖1)。將先天性FVIII不足人類血漿(George King Biomedical公司)與0.3μg/ml APC(Innovative Research)及指定含量之多株抗蛋白質S(DAKO #A0384)以及APTT試劑(APTT-SP,IL)一起在37℃下培育300秒，隨後再鈣化。使用ACL9000(ILS)來量測血纖維蛋白凝結形成之時間。平均EC50為37.1μg/ml(SD=2.4，n=3次實驗)，對應於大約250nM。
實施例2：抗蛋白質S抗體之促凝血作用與血友病A血漿中之FVIII相比較
將FVIII不足血漿中抗蛋白質S抗體之最大作用分別與正常人類血漿及具有1%、5%及10% FVIII(自產的)人類血漿之凝結時間相比較(圖2)。資料指示使用抗蛋白質S之充分響應類似於具有5%-10% FVIII之血漿的凝結時間。藉由建立具有過量中和FVIII抗體(自產的)之蛋白質S不足血漿(Haemochrom Diagnostica)的凝結時間來證實蛋白質S之完全中和作用(類似於雙重蛋白質S及FVIII不足血漿)。
將血漿與不同組合之APC(0.3μg/mL)及抗蛋白質S(DAKO,#A0384)或FVIII以及APTT試劑(APTT-SP,IL)一起混合，且在37℃下培育300秒，隨後再鈣化。使用ACL9000(ILS)來量測血纖維蛋白凝結形成之時間。資料為平均值±SD，n=3次實驗。
實施例3：針對全長及Gla結構域缺失小鼠蛋白質S之多株抗體的活體內作用
在夾尾(4mm)之前5分鐘分別用針對全長及desGla結構域小鼠蛋白質S的家兔多株抗體(49mg/kg，IV)處理之血友病A小鼠。經30分鐘時間段測定失血(Holmberg等人JTH,7,1517-1522(2006))。資料為平均值±SEM，n=6-8。針對蛋白質S(全長)以及desGla蛋白質S兩者之多株抗體明顯地減少血友病A小鼠尾部出血模型中之失血(圖3)。
藉由分別用全長及desGla小鼠蛋白質S免疫家兔來自產地產生家兔多株抗體。隨後自血漿中純化家兔IgG。
實施例4：缺少人類蛋白質S之Gla結構域及EGF1-4結構域的人類蛋白質S之產生及純化
人類desGLA蛋白質S，SEQ ID NO：1之表現
用於表現人類desGLA蛋白質S的基於GS之載體的產生
對於在來自Lonza的基於GS之表現系統中表現人類desGLA蛋白質S(SEQ ID NO：1)，根據隆薩所描述之標準程序且如下文所進一步概述來產生載體pBOK822。表現載體包含兩個表現卡匣，一個用於表現人類desGLA蛋白質S而第二個用於表現麩醯胺合成酶(Glutamine synthetase；GS)選擇標記物。
1.人類desGLA蛋白質S表現卡匣含有：
a.人類細胞巨大病毒主要立即早期(human cytomegalovirus major immediate early；hCMV-MIE)啟動子，其包括來自CMV-MIE基因座之5'未轉譯序列以促進轉錄/轉譯
b.編碼人類desGLA蛋白質S之cDNA序列
c. SV40聚腺苷酸化信號(SV40聚A位點)
2. GS表現卡匣含有：
a. SV40晚期啟動子
b. GS微基因
c.兩個聚腺苷酸化信號(聚-A位點1或2)。
載體之其餘部分含有細菌colE1複製源及安比西林(ampicillin)抗性基因，兩者均用於大腸桿菌(E.coli)中之載體增殖(vector propagation)。
a.將用於人類desGLA蛋白質S之cDNA選殖至載體pEE14.4 4(Lonza) 中以用於產生載體pBOK822，其藉由將PmeI/BsiWI限制性片段自現存基於pTT之載體pJSV320中轉移至經NruI/BsiWI線性化之pEE14.4載體中來進行。
使用全長人類蛋白質S(IMAGE選殖ID 3909023)作為模板藉由PCR擴增處於對應於EGF1 N端之位置處的GLA結構域之人類蛋白質S cDNA 3'來產生原始基於pTT之載體。藉由標準限制性消化/接合將經擴增之片段插入攜載用於人類CD33之信號肽及HPC4純化標記的基於pTT之載體中。用5' CD33信號肽序列及包括Ala-Leu-Ala(ALA)選殖間隔基(SEQ ID NO：1之殘基564-578)的3' HPC4標記序列兩者在框架內插入人類desGLA蛋白質S cDNA。
b.藉由對人類desGLA蛋白質S插入物進行定序來檢驗最終載體pBOK822之序列。
c.在製備以用於轉染中，藉由AclI限制消化來使載體pBOK822線性化，且使用QIAEX II凝膠萃取套組(Qiagen)來分離。
人類desGLA蛋白質S生產細胞系發展
1.用經線性化之人類desGLA蛋白質SGS表現載體pBOK822藉由電穿孔來轉染CHOK1SV細胞，且根據來自Lonza之標準方案以有限密度接種於20個96孔培養板中。
2.在含有25μM或37μM甲硫胺酸磺醯亞胺(methionine sulphoximine；MSX)(Sigma)；麩醯胺合成酶(GS)選擇性抑制劑的無麩醯胺之CD CHO(Gibco)培養基中培育經轉染之細胞。在約3週之後藉由目視檢查培養板來鑑別選殖系。
3.將24個所選擇之選殖系自96孔固定培養物中擴展至含有25μM MSX之CD CHO培養基中的24孔固定培養物中。
4.基於在24孔固定培養物中經7天之累積人類desGLA蛋白質S產量來分級及選擇個別選殖系。藉由下文斑點/西方墨點分析來量測蛋白質S產 量，且選擇最佳3個選殖系用於進一步分析：
a.將5μl細胞培養物點樣在硝基纖維素膜上且使之乾燥。
b.在含有2% v/v Tween-20之TBS中阻斷該膜持續2分鐘。
c.將該膜轉移至含有0.1% v/v Tween-20及多株家兔抗蛋白質C(HPC4)-標記抗體(Genscript)之1：1000稀釋液的TBS中，且在室溫下培育60分鐘。
d.在含有0.1% v/v Tween-20之TBS中洗滌該膜3次，每次持續5分鐘。
e.將該膜轉移至含有0.1% v/v Tween-20及螢光標記抗家兔Ig抗體(Licor)之1：10000稀釋液的TBS中，且在室溫下培育60分鐘。
f.在含有0.1% v/v Tween-20之TBS中洗滌該膜3次，每次持續5分鐘，且使用Odyssey成像系統(Licor)加以掃描。
5.將所選擇之細胞系自24孔固定培養物中擴展至50ml生物反應器管中之5ml震盪器培養物(TTP)中，繼而擴展至125ml愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flasks)(Corning)中之30ml培養物中。在此階段，將選擇壓力保持在25μM MSX下。基於在震盪器培養物(過生長(over-growth；OG)培養物)中經7天之累積蛋白質S產量來選擇最高生產性之人類desGLA蛋白質S細胞系。藉由標準西方墨點分析來量測蛋白質S產量。
a.藉由SDS-PAGE，繼而根據上述用於斑點/西方墨點分析之方案藉由標準西方墨點分析來分析上清液。
6.選擇用於產生人類desGLA蛋白質S之最終細胞系為：BRTK822_25_2_C10。
7.為進行生產，將BRTK822_25_2_C10之培養物擴展且接種於含有25μM MSX之CD CHO培養基中的2×1L培養物中，且在36.5℃、8% CO2及85-125rpm下之定軌震盪器中在3L愛倫美氏燒瓶中培育7天。
8.在7天之後，藉由離心採集上清液，繼而使用0.22μm PES過濾單元(Corning)來過濾。
人類蛋白質S EGF1-4，SEQ ID NO：2之表現
用於表現人類蛋白質S EGF1-4的基於GS之載體的產生
對於在來自Lonza的基於GS之表現系統中表現人類蛋白質S EGF1-4(SEQ ID NO：2)，根據隆薩所描述之標準程序且如下文所進一步概述來產生載體pBOK821。表現載體包含兩個表現卡匣，一個用於表現人類蛋白質S EGF1-4而第二個用於表現麩醯胺合成酶(GS)選擇標記物。
1.人類蛋白質S EGF1-4表現卡匣含有：
a.人類細胞巨大病毒主要立即早期(hCMV-MIE)啟動子，其包括來自CMV-MIE基因座之5'未轉譯序列以促進轉錄/轉譯
b.編碼人類蛋白質S EGF1-4之cDNA序列
c. SV40聚腺苷酸化信號(SV40聚A位點)
2. GS表現卡匣含有：
a. SV40晚期啟動子
b. GS微基因
c.兩個聚腺苷酸化信號(聚-A位點1及2)。
載體之其餘部分含有細菌colE1複製源及安比西林抗性基因，兩者均用於大腸桿菌中之載體增殖。
d.將用於人類蛋白質S EGF1-4之cDNA選殖至載體pEE14.4(Lonza)中以用於產生載體pBOK821，其藉由將PmeI/EcoRI限制性片段自現存基於pTT之載體(pJSV321)中轉移至經NruI/EcoRI線性化之pEE14.4載體中來進行。
使用全長人類蛋白質S(IMAGE選殖ID 3909023)作為模板藉由PCR擴增覆蓋EGF1-4結構域之人類蛋白質S cDNA來產生原始基於pTT之載體。藉由標準限制性消化/接合將經擴增之片段插入攜載用於人類CD33之信號肽及HPC4純化標記的基於pTT之載體中。用5' CD33信號肽 序列及包括Ala-Leu-Ala選殖間隔基(SEQ ID NO：2之殘基174-188)的3' HPC4標記序列兩者在框架內插入人類蛋白質S EGF1-4cDNA。
e.藉由對人類蛋白質S EGF1-4插入物進行定序來檢驗最終載體pBOK821之序列。
f.在製備以用於轉染中，藉由AclI限制消化來使載體pBOK821線性化，且使用QIAEX II凝膠萃取套組(Qiagen)來分離。
人類蛋白質S EGF1-4生產細胞系發展
1.用經線性化之人類蛋白質S EGF1-4 GS表現載體pBOK821藉由電穿孔來轉染CHOK1SV細胞，且根據來自Lonza之標準方案以有限密度接種於20個96孔培養板中。
2.在含有25μM或37μM甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)(Sigma)；麩醯胺合成酶(GS)選擇性抑制劑的無麩醯胺之CD CHO(Gibco)培養基中培育經轉染之細胞。在約3週之後藉由目視檢查培養板來鑑別選殖系。
3.將24個所選擇之選殖系自96孔固定培養物中擴展至含有25μM MSX之CD CHO培養基中的24孔固定培養物中。
4.基於在24孔固定培養物中經7天之累積人類蛋白質S EGF1-4產量來分級及選擇個別選殖系。藉由下文斑點/西方墨點分析來量測蛋白質產量，且選擇最佳3個選殖系用於進一步分析：
a.將5μl細胞培養物點樣在硝基纖維素膜上且使之乾燥。
b.在含有2% v/v Tween-20之TBS中阻斷該膜持續2分鐘。
c.將該膜轉移至含有0.1% v/v Tween-20及多株家兔抗蛋白質C(HPC4)-標記抗體(Genscript)之1：1000稀釋液的TBS中，且在室溫下培育60分鐘。
d.在含有0.1% v/v Tween-20之TBS中洗滌該膜3次，每次持續5分鐘。
e.將該膜轉移至含有0.1% v/v Tween-20及螢光標記抗家兔Ig抗體(Licor)之1：10000稀釋液的TBS中，且在室溫下培育60分鐘。
f.在含有0.1% v/v Tween-20之TBS中洗滌該膜3次，每次持續5分鐘，且使用Odyssey成像系統(Licor)加以掃描。
5.將所選擇之細胞系自24孔固定培養物中擴展至50ml生物反應器管中之5ml震盪器培養物(TTP)中，繼而擴展至125ml愛倫美氏燒瓶(Corning)中之30ml培養物中。在此階段，將選擇壓力保持在25μM MSX下。基於在震盪器培養物(過生長(OG)培養物)中經7天之累積蛋白質S產量來選擇最高生產性之人類蛋白質S EGF1-4細胞系。藉由標準西方墨點分析來量測蛋白質S產量。
a.藉由SDS-PAGE，繼而根據上述用於斑點/西方墨點分析之方案藉由標準西方墨點分析來分析上清液。
6.選擇用於產生人類蛋白質S EGF1-4之最終細胞系為：BRTK821_37_2_B11。
7.為進行生產，將BRTK821_37_2_B11之培養物擴展且接種於含有25μM MSX之CD CHO培養基中的2×1L培養物中，且在36.5℃、8% CO2及85-125rpm下之定軌震盪器中在3L愛倫美氏燒瓶中培育7天。
8.在7天之後，藉由離心採集上清液，繼而使用0.22μm PES過濾單元(Corning)來過濾。
純化
藉由親和色譜法(抗HPC4瓊脂糖)繼而在Superdex 75管柱上凝膠過濾來純化重組人類desGLA蛋白質S及人類蛋白質S EGF1-4。藉由SDS-及SEC-HPLC估計人類蛋白質S EGF1-4之最終純度為100%。內毒素<0.1EU/mg(藉由動力學濁度測試來量測)。對於人類desGLA蛋白質S，純度為95%且內毒素<0.04EU/mg。
實施例5：全長獼猴蛋白質S，SEQ ID NO：3之表現及純化
用於表現獼猴蛋白質S之pQMCF1載體的產生
使用來自Icosagen之QMCF表現平台來表現獼猴(食蟹獼猴)蛋白質S(SEQ ID NO：3)。
1. QMCF CHO細胞系CHOEBNAL85支持伴隨之QMCF質體的穩定維持及分割。
2. QMCF質體含有：
a.小鼠多瘤病毒(polyomavirus；Py)DNA複製源，其與
b.艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)EBNA-1蛋白質結合位點組合確保質體在QMCF細胞中穩定增殖。
用於表現全長獼猴蛋白質S的基於QMCF之表現載體經由一系列步驟來產生：
a.使用基於用於寄存XM_005548385之序列而設計的擴增引子來自食蟹獼猴cDNA選殖獼猴蛋白質S之cDNA。
b.純化經擴增之片段且將其選殖至用於序列檢驗之Zero-BLUNT topo載體(Invitrogen)中。
c.對於最終表現載體pBOK835，使用接附子引子引入以下各者來擴增獼猴蛋白質S：1)ATG起始密碼子之Kozak序列基元(GCCGCCACC)5'及5'端NotI限制位點，2)蛋白質S序列C端處之HPC4標記(SEQ ID NO：3之殘基636-647)及3'端EcoRI限制位點。
d.純化所得PCR片段且將其用作使用第二組接附子引子引入以下各者之二級PCR擴增的模板：1)Kozak序列末端NheI限制位點5'及ATG起始密碼子及2)HPC4標記序列之末端AscI限制位點3'。
e.自所得PCR片段產生NheI/AscI限制性片段且將其插入經NheI/AscI線性化之pQMCF1載體中。
f.藉由對獼猴蛋白質S插入物進行定序來檢驗最終載體pBOK835之序列。
全長獼猴蛋白質S之轉染/表現
1.將CHOEBNALT85細胞維持在由等量CD CHO培養基(Gibco)及補充有6mM L-麩醯胺(Gibco)、0.5×HT補充劑(Gibco)及20μg/ml嘌呤黴素(Gibco)之293 SFM II培養基(Gibco)製備的QMix1培養基中。
2.採集細胞，洗滌且再懸浮於CH CHO培養基中(10E7個細胞在0.7ml中)，隨後用10μg獼猴蛋白質S pQMCF1表現載體(pBOK835)藉由使用Gene PulserXcellTM電穿孔系統(Biorad)及指數電穿孔方案(300V，900μF，∞Ω，4mm比色皿)電穿孔來轉染。
3.在電穿孔之後立即將細胞轉移至125ml錐形瓶中之20ml QMix1培養基中，且在36.5℃，8% CO2，125rpm下之定軌震盪器中培育。
4.在轉染後24小時，添加G418選擇試劑(Gibco)至最終濃度為700μg/ml，且使細胞復原持續72-96小時。藉由使用Cedex HiRes細胞計數器量測細胞培養物存活性及密度來監測復原。
5.當細胞再次主動分裂時，擴展培養物至到達最終生產體積，將細胞維持在0.2×10E6-3×10E6個細胞/毫升之間。
6.對於最終生產，將2×1L培養物接種於3L愛倫美氏燒瓶中補充有700μg/ml G418及5μg/ml維生素K之QMix1培養基中，且在36.5℃，8% CO2及85rpm下之定軌震盪器中培育7天。
在7天之後，藉由離心採集上清液，繼而使用0.22μm PES過濾單元(Corning)來過濾。如以上實施例所描述進行純化。藉由SDS-PAGE、N端胺基酸序列分析及LC-MS估計獼猴蛋白質S之最終純度較高，然而，藉由SEC-HPLC所量測之單體分率為48%。內毒素為63EU/mg。
實施例6：抗蛋白質S(EGF1-4)單株抗體之產生
用來源於人類血漿(HTI)之蛋白質S免疫RBF小鼠，其中重組人類蛋白質S缺少Gla結構域(desGLA蛋白質S SEQ ID NO：1)或重組 蛋白質僅包含人類蛋白質S之EGF1-4結構域(SEQ ID NO：2)。在免疫接種之前，在弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant)中使蛋白質乳化。在免疫接種起始時對小鼠進行注射皮下，繼而每兩週進行三次腹膜內免疫接種。在最後免疫接種之後10天時自小鼠收集血液且製備血清，藉由ELISA來測定抗EGF1-4抗體效價，其中用人類蛋白質S之EGF1-4結構域塗佈NUNC Maxisorp培養板且阻斷，隨後施加經稀釋之血清。在培育及洗滌之後，添加HRP標記之山羊抗小鼠IgG二級抗體(Jackson)，且在培育及洗滌之後藉由添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺來使ELISA出現。
響應於抗EGF1-4之小鼠在無佐劑之情況下用desGLA蛋白質S或人類蛋白質S之EGF1-4結構域靜脈內(intravenously；i.v.)增強免疫。在增強免疫之後三天時無菌移除脾臟且分散至單個細胞懸浮液中。藉由標準電融合來進行小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653，ATCC-# CRL1580)之融合，且將細胞接種於微量滴定板中且在37℃，5% CO2下培養。經13天之時間段更換組織-培養基兩次，且在HAT/HT培養基(Sigma)中選擇融合瘤。
亦可藉由用噬菌體呈現篩選Fab、scFv等文庫來鑑別與蛋白質S及蛋白質S片段結合之抗體。亦可藉由用噬菌體呈現或適體文庫篩選肽文庫來獲得促凝血蛋白質S結合子。
實施例7：初步篩選與人類蛋白質S及獼猴蛋白質S之EGF1-4結構域結合的抗體
如上文所描述在ELISA中分析融合瘤上清液結合人類EGF1-4及之後結合獼猴重組蛋白質S(SEQ ID NO：3)的能力。自融合瘤上清液表現及純化與人類蛋白質S及獼猴蛋白質S兩者之EGF1-4結構域結合的抗體，隨後進行功能特性化。為產生單株及穩定融合瘤細胞系，藉由有限稀釋次選殖融合瘤細胞。以1個細胞/孔之密度將細胞接種於96孔培養板 中。在兩週之後，如上文所描述篩選來自各孔之上清液與人類蛋白質S之EGF1-4結構域的結合。
實施例8：篩選抗蛋白質S(EGF1-4)介導的FVa之ACP/蛋白質S失活保護
在室溫下在生物化學分析中量測蛋白質S結合抗體(典型地以0-400nM範圍內之濃度存在於FVa失活反應步驟中)對APC介導之FVa失活之蛋白質S輔因子活性的中和作用。
簡言之，在微量滴定板(Perkin Elmer，#6005659)中將30μL經純化之抗體(在20mM Tris中，pH 7.4)與20μL人類蛋白質S(Haematologic Technologies公司，#HCPS-0090)在分析緩衝液(30mM HEPES，135mM NaCl，1mM EDTA，0.1% BSA，pH 7.4)中混合。培育反應30分鐘以允許抗原結合。隨後，添加20μL含有人類APC(Haematologic Technologies公司，#HCAPC-0080)及磷脂-TGT(Rossix，#PL604T)之混合物，且在下培育反應5分鐘。隨後，添加20μL人類因子Va(Haematologic Technologies公司，#HCVA-0110)，且使失活反應進行30分鐘。在此步驟中，蛋白質S之濃度為10nM，APC為65pM，且FVa為50pM。隨後，添加100μL人類凝血酶原(Enzyme Research Laboratories，#HP 1002)及人類FXa(Enzyme Research Laboratories，#HFXa 1011)兩者之混合物以引發凝血酶產生，其中FVa為速率限制決定子。反應進行10分鐘。在此步驟中，磷脂之濃度為23.8μM，凝血酶原為100nM，且FXa為0.5nM。最後，添加100μL溶解於EDTA緩衝液(20mM HEPES，140mM NaCl，20mM EDTA，1g/L BSA，pH 7.4)中之發色凝血酶肽受質S-2238(Chromogenix，#S-2238)至最終濃度為400μM，且立即且反覆在405nm下每30秒讀取一次培養板，持續10分鐘。計算各抗體濃度之初始反應速度，且將其用作其餘FVa輔因子活性之量度。根據兩個不含任何抗體之對照組正規化此信號；其中兩者均含有FVa及APC， 但+/-蛋白質S。因此，0%對應於在蛋白質S存在下之信號，而100%對應於在不存在蛋白質S之情況下的信號。可以濃度依賴性方式使FVa輔因子活性恢復至最大輔因子活性之30%或30%以上的抗體視為功能上中和蛋白質S。選殖滿足該判據之抗體，且如以下實施例中所描述進一步研究。
實施例9：自融合瘤上清液純化之單株抗體與蛋白質S及其變異體的ELISA結合
在及ELISA中證實自融合瘤上清液純化之抗體與人類蛋白質S及獼猴蛋白質S之EGF1-4結構域的結合(參見實施例6)。此外，研究與來源於血漿之蛋白質S(HTI)及人類蛋白質S之EGF1-2及EGF3-4結構域的結合(表1)。在無鈣TBS緩衝液(138μM NaCl，270nM KCl，pH 8，Sigma T6664)中進行所有結合實驗。因此，所鑑別之抗蛋白質S mAb能夠以鈣非依賴性方式結合蛋白質S。
hPS-dGla：Gla結構域缺失之重組人類蛋白質S；hEGF1-4：重組人類蛋白質 S之EGF結構域1至4；hEGF1-2：重組人類蛋白質S之EGF結構域1及2；hEGF3-4：重組人類蛋白質S之EGF結構域3及4；CyPS-dGla：Gla結構域缺失之重組獼猴蛋白質S。抗-TNP：小鼠抗TNP陰性ctrl mAb。『+』：結合，『-』：無結合。
隨後對分子選殖抗體之子集重複結合資料(描述於以下實施例中；表2)。
hPS-dGla：Gla結構域缺失之重組人類蛋白質S；hEGF1-4：重組人類蛋白質S之EGF結構域1至4；hEGF1-2：重組人類蛋白質S之EGF結構域1及2；hEGF3-4：重組人類蛋白質S之EGF結構域3及4；CyPS-dGla：Gla結構域缺失之重組獼猴蛋白質S。抗-TNP：小鼠抗TNP陰性ctrl mAb。
實施例10：來自經分離融合瘤之抗蛋白質S(EGF1-4)單株抗體可變輕鏈及可變重鏈cDNA的選殖及定序
此實施例描述表1中所列之鼠類抗蛋白質S抗體重鏈及輕鏈序列的選殖及定序。
使用來自Qiagen之RNeasy微套組自融合瘤細胞提取全部RNA，且將其用作cDNA合成之模板。在5'-RACE反應中使用來自Clontech之SMARTTM RACE cDNA擴增套組來合成cDNA。藉由PCR使用Phusion熱起始聚合酶(Finnzymes)且使用包括在SMARTTM RACE套組中之通用引子 混合物(UPM)作為正向引子來進行HC及LC序列之後續靶標擴增。
具有以下序列之反向引子用於HC(VH結構域)擴增(SEQ ID NO：47)：5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'
具有以下序列之反向引子用於LC擴增(SEQ ID NO：48)：5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'
藉由凝膠電泳來分離PCR產物，使用來自GE保健Bio-Sciences之GFX PCR DNA及凝膠紋純化套組來提取，且選殖以用於使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組及化學適應性TOP10大腸桿菌(Invitrogen)來定序。自藉由標準鹼性裂解方案使用來自Qiagen之DNA小型製備套組所產生之質粒製劑獲得用於定序之DNA質粒材料。替代性地，自使用來自Applied Biosystems之AmpliTaq金母板混合物及M13uni/M13rev引子對所選擇之菌落進行的菌落PCR反應獲得用於定序之DNA材料。使用ExoSAP-IT酶混合物(USB)來進行菌落PCR清除。在MWG Biotech,Martinsried Germany使用M13uni(-21)/M13rev(-29)定序引子進行定序。使用VectorNTI程序分析及註解序列。所有套組及試劑均根據製造商之說明來使用。
鑑別每一個融合瘤之單個獨特鼠類κ類型LC及單個獨特鼠類HC、子類別mIgG1。
可變重鏈及可變輕鏈序列之胺基酸序列指定為SEQ ID NO：4-45(不包括前導肽序列)，亦參見上文『序列表簡要描述』部分。在圖9及10中註解及突出顯示CDR序列。
實施例11：抗蛋白質S抗體之重組表現
用於重組表現抗蛋白質S抗體之載體的產生：
產生一系列基於CMV啟動子之表現載體(pTT載體)以用於在EXPI293F細胞(Life Technologies)(0322-0000-1069)中短暫表現小鼠 IgG1及小鼠/人類IgG4(S241P)嵌合抗蛋白質S抗體。Yves Durocher開發用於短暫蛋白質表現之pTT載體(Durocher等人Nucleic Acid Research,2002)。除CMV啟動子之外，基於pTT之載體含有pMB1源、EBV源及Amp抗性基因。
輕鏈(LC)表現載體：
產生基於pTT之LC載體以用於短暫表現小鼠抗蛋白質S抗體。最初對於各抗蛋白質S抗體(參見表1)，由原始TOPO定序選殖使用含有對所鑑別可變結構域序列之3'區及5'區具有特異性之序列的引子來PCR擴增對應於抗體可變輕鏈(VL)結構域之區。另外，正義引子(sense primer)含有與人類CD33信號肽序列3'端之DNA序列互補的序列。相應地，反義引子含有與輕鏈恆定區5'端之DNA序列互補的序列。使用GFX PCR純化套組(GE Healthcare)純化所產生之PCR片段，且選殖至基於pTT之載體的經PCR擴增之片段中，該片段含有CD33信號肽序列及小鼠κ恆定區之序列(用於小鼠抗體表現)或人類κ恆定區之序列(用於嵌合抗體表現)。藉由使用對人類CD33信號肽序列3'端具有特異性之反義引子及對輕鏈恆定區之5'端具有特異性之正義引子PCR擴增pTT載體來獲得載體片段。用DpnI限制核酸酶處理載體片段以移除模板DNA且使用GFX PCR純化套組(GE Healthcare)來純化。使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech)根據製造商之說明將經擴增之VL片段選殖至在CD33信號肽與輕鏈恆定區之間的框架內載體中。隨後將選殖反應轉型為用於選擇之大腸桿菌。最終構築體之序列藉由DNA定序來檢驗。
重鏈(HC)表現載體：
產生基於pTT之HC載體以用於短暫表現小鼠抗蛋白質S抗體。最初對於各抗蛋白質S抗體(參見表1)，由原始TOPO定序選殖使用含有對所鑑別可變結構域序列之3'區及5'區具有特異性之序列的引子來 PCR擴增對應於抗體可變重鏈(VH)結構域之區。另外，正義引子含有與人類CD33信號肽序列3'端之DNA序列互補的序列。相應地，反義引子含有與重鏈恆定區5'端之DNA序列互補的序列。使用GFX PCR純化套組(GE Healthcare)純化所產生之PCR片段，且選殖至基於pTT之載體的經PCR擴增之片段中，該片段含有CD33信號肽序列及小鼠IgG1恆定區之序列(用於小鼠抗體表現)或人類IgG4(S241P)恆定區之序列(用於嵌合抗體表現)。在IgG4鉸鏈區中引入位置241處(根據Kabat編號，對應於EU編號系統(Edelman G.M.等人Proc.Natl.Acad.USA 63,78-85(1969))之殘基228)的脯胺酸突變，以消除單體抗體片段，亦即由一個LC及一個HC組成之「半抗體」的形成。
藉由使用對人類CD33信號肽序列3'端具有特異性之反義引子及對重鏈恆定區之5'端具有特異性之正義引子PCR擴增pTT載體來獲得載體片段。用DpnI限制核酸酶處理載體片段以移除模板DNA且使用GFX PCR純化套組(GE Healthcare)來純化。使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech)根據製造商之說明將經擴增之VH片段選殖至在CD33信號肽與重鏈恆定區之間的框架內載體中。隨後將選殖反應轉型為用於選擇之大腸桿菌。最終構築體之序列藉由DNA定序來檢驗。
單株抗體之重組表現：
在EXPI293F細胞(Life Technologies)中藉由根據製造商之說明共轉染基於pTT之LC/HC表現載體來短暫表現抗蛋白質S抗體。以下程序描述通用EXPI293F表現方案。
細胞維持：
在Expi293TM表現培養基(Life Technologies)中之懸浮液中生長EXPI293F細胞。在36.5℃、8% CO2及85-125rpm下之定軌震盪器培育箱中在愛倫美氏震盪器燒瓶中培養細胞，且維持細胞密度在0.4-4×106個細 胞/毫升之間。
DNA轉染：
1)最初製備DNA及轉染試劑之獨立稀釋液。
a)每毫升細胞培養物使用總共1μg載體DNA(0.5μg LC載體及0.5μg HC載體)。在Opti-MEM培養基(Gibco)中以50微升培養基/微克DNA稀釋DNA，混合且在室溫(23℃-25℃)下培育5分鐘。
b)以每微克DNA 2.7μl之濃度使用ExpifectaminTM293(Life Technologies)作為轉染試劑。在Opti-培養基(Gibco)中將ExpifectaminTM溶液稀釋18.5倍，混合且在室溫(23℃-25℃)下培育5分鐘。
2)混合DNA及ExpifectaminTM 293稀釋液且使之在室溫(23℃-25℃)下培育10分鐘。
3)將DNA-ExpifectaminTM 293混合物直接添加至EXPI293F細胞培養物中。
a)在轉染時，EXPI293F培養物之細胞密度應為2.8-3.2×106個細胞/毫升。
4)將經轉染之細胞培養物轉移至在36.5℃、8% CO2及85-125rpm下之定軌震盪器培育箱中。
5)轉染後18小時時，添加每毫升培養物5μl ExpifectaminTM 293轉染增強劑1及每毫升培養物50μl ExpifectaminTM 293轉染增強劑2，且將培養物放回在36.5℃、8% CO2及85-125rpm下之定軌震盪器培育箱中。
6)轉染後5天時，藉由離心採集細胞培養物上清液，繼而經由0.22μm PES過濾單元(Corning)來過濾。
實施例12：藉由凝血酶產生分析來鑑別血友病性血漿中之中和抗蛋白質S抗體
鑑別抗蛋白質S抗體在基於血漿之凝血酶產生分析中能夠 在外源性添加之APC的存在下增加凝血酶產生。在最終分析中在室溫下以0nM-500nM測試經純化之測試抗體。簡言之，將儲存在-80℃下之人類血友病A(HA)(FVIII不足)血漿(Georg King Medical，#0800)在37℃下於水中解凍5分鐘，且隨後在室溫下儲存直至使用。向384孔微量滴定板(Perkin Elmer)中添加18μL血漿，且隨後添加2μL抗體溶液(在20nM Tris中，pH 7.4)，且抗原結合進行20分鐘。隨後，向分析中添加5μL溶液(其中APC(Haematologic Technologies公司，#HCAPC-0080)注射(100倍稀釋液)至所製備之PPP-Reagent LOW試劑(Thrombinoscope，#TS31.00)中)，其最終使得在最終分析中APC為2nM，組織因子為1pM且磷脂未4μM。在未進行培育之情況下，添加5μL所製備之FluCa試劑(Thrombinoscope，#TS50.00)，且每30秒一次進行連續螢光讀取，持續2小時。凝血圖(thrombogram)計算為完整螢光曲線之一階導數，且ETP及峰值凝血酶參數由凝血圖計算且用於評估凝血酶產生。將某些商業單株抗體(表3)與以下自產抗蛋白質S抗體之子集的效能相比較：0322-0000-0114、0322-0000-0914、0322-0000-0910、0322-0000-0916及僅緩衝液(圖4)。
實施例13：藉由校準自動凝血圖譜所量測的抗體在人類、獼猴及家兔血漿之凝血酶產生中的作用
人類血友病A血漿中之凝血酶產生
抗體在存在及不存在經活化之蛋白質C(APC)的情況下均以濃度依賴性方式增加血小板稀少重度血友病A患者血漿中之凝血酶產生(圖5)。血漿中所產生之凝血酶的量藉由校準自動凝血圖譜來量測(Hemker 等人「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」,Pathophysiol Haemost Thromb.33：4-15(2003)；Hemker等人「Thrombin Generation in Plasma：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」,Thromb Haemost.74：134-138(1995))。在96孔培養板中，將72μL來自缺少因子VIII抑制劑之重度血友病A患者的因子VIII不足血漿彙集(<1%殘餘活性，血小板稀少)(George King Bio-Medical,Overland Park,Kans.)與8μL抗體一起在37℃下培育10分鐘，且隨後與10 μL APC或HEPES-BSA緩衝液及20μL Thrombinoscope PPP引發劑(5pM組織因子及4μM磷脂)混合，且藉由與20μL螢光受質(Z-Gly-Gly-Arg-AMC)於包括0.1M CaCl2之HEPES-BSA緩衝液中的溶液混合來立即開始反應。所有試劑預升溫至37℃。使用Fluoroskan Ascent讀取器(Thermo Labsystems OY,Helsinki,Finland)以20秒間隔監測螢光信號在37℃下之出現。藉由來自凝血酶校準劑樣品之參考信號來校正螢光信號(Hemker等人「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」,Pathophysiol Haemost.33：4-15(2003))且如先前所描述計算以nM為單位之實際凝血酶產生(Hemker等人「Thrombin Generation in Plasma：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」,Thromb Haemost.74：134-138(1995))(圖5)。
經稀釋之家兔及獼猴血漿中的凝血酶產生
抗體在存在凝血調節蛋白(thrombomodulin；TM)之情況下以濃度依賴性方式增加血小板稀少獼猴血漿中之凝血酶產生(圖6)。家兔及獼猴血漿(經HEPES-BSA緩衝液1：3稀釋)中所產生之凝血酶的量藉由校準自動凝血圖譜來量測(Hemker等人「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」,Pathophysiol Haemost Thromb.33：4-15(2003)；Hemker等人「Thrombin Generation in Plasma：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」,Thromb Haemost.74：134-138(1995))。在 96孔培養板中，將72μL來自家兔或獼猴的經稀釋之血漿彙集(自產的)與8μL抗體一起在37℃下培育10分鐘，且隨後與10μL凝血調節蛋白(在血漿中之最終濃度為50nM)(Haematologic Technologies公司，VT,USA，HTI家兔凝血調節蛋白RABT-4202)或HEPES-BSA緩衝液及20μL Thrombinoscope PPP引發劑(5pM組織因子及4μM磷脂)混合，且藉由與20μL螢光受質(Z-Gly-Gly-Arg-AMC)於包括0.1M CaCl2之HEPES-BSA緩衝液中的溶液混合來立即開始反應。所有試劑預升溫至37℃。使用Fluoroskan Ascent讀取器(Thermo Labsystems OY,Helsinki,Finland)以20秒間隔監測螢光信號在37℃下之出現。藉由來自凝血酶校準劑樣品之參考信號來校正螢光信號(Hemker等人「Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma」,Pathophysiol Haemost.33：4-15(2003))且如先前所描述計算以nM為單位之實際凝血酶產生(Hemker等人「Thrombin Generation in Plasma：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential」,Thromb Haemost.74：134-138(1995))(圖6)。
實施例14：藉由抗蛋白質S(EGF1-4)單株抗體之HX-MS進行抗原決定基定位(epitope mapping)
HX-MS介紹
HX-MS技術利用蛋白質之氫交換(hydrogen exchange；HX)後接質譜(MS)。藉由用含氘之水性溶劑替換含氫之水性溶劑，在蛋白質中之給定位點處併入氘原子將使質量增加1Da。此質量增加可藉由質譜分析來自交換反應之中止樣品而隨時間變化進行監測。氘標記資訊可藉由中止條件下之胃蛋白酶消化及之後所得肽之質量增加而次侷限於蛋白質之區中。
HX-MS之一個用途為藉由鑑別蛋白質-蛋白質複合物形成後減少之氫交換區來探測涉及分子相互作用之位點。通常，結合界面將藉由 因溶劑之空間排阻所致的氫交換顯著減少來揭示。蛋白質-蛋白質複合物形成可由HX-MS簡單地藉由量測在存在及不存在相應結合搭配物之情況下併入任一蛋白質成員中之氘總量隨時間的變化來偵測。HX-MS技術使用天然組分，亦即蛋白質及抗體或Fab片段，且在溶液中進行。因此，HX-MS提供模擬活體內條件之可能性(對HX-MS技術之綜述參見例如Wales及Engen,Mass Spectrom.Rev.25,158(2006))。
材料
所用蛋白質：
人類蛋白質S：在本發明之研究中使用與C端HCP4純化標記融合的含有人類蛋白質S所有EGF1-4結構域(SEQ ID NO：2)之蛋白質分子(EGF1-4)。
mAb分子：
0322-0000-0017
0322-0000-0114
0322-0000-0158
0322-0000-0203
0322-0000-1069(鼠類-人類IgG4嵌合物)
所有蛋白質在實驗之前緩衝液交換至25mM MES pH 6.5，5mM CaCl2，150mM NaCl中。
方法：HX-MS實驗
儀器使用及資料記錄
在與Synapt G2質譜儀(Waters公司)耦接的具有HDX技術之nanoACQUITY UPLC系統(Waters公司)上進行HX實驗。Waters HDX系統含有由LeapShell軟體(Leap Technologies公司/Waters公司)操作之Leap機器人(H/D-x PAL；Waters公司)，其進行起始氘交換反應、反應時間控制、 中止反應、注射至UPLC系統上及消化時間控制。Leap機器人配備有兩個溫度受控堆疊，其分別維持在20℃下以用於緩衝液儲存及HX反應及維持在2℃下以用於儲存蛋白質及中止溶液。此外，Waters HDX系統含有在0.5℃下固持預柱及分析管柱以及LC管及轉換閥的溫度受控腔室。一個單獨溫度受控腔室在25℃下固持胃蛋白酶管柱。對於直線胃蛋白酶消化，將100μL含有200pmol EGF1-4之中止樣品在2℃下培育60秒，且隨後使用100μL/min之無梯度流動速率(0.1%甲酸：CH3CN 95：5)注射且經過置放在25℃下之Poroszyme®固定胃蛋白酶柱體(2.1×30mm(Applied Biosystems))。在VanGuard預柱BEH C181.7μm(2.1×5mm(Waters公司))上截留所得肽且脫鹽。隨後，轉換閥以使預柱與分析管柱UPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters公司))成直線，且使用以40μl/min自nanoAQUITY UPLC系統(Waters公司)輸送之9分鐘10-50% B之梯度分離肽。移動相由A：0.1%甲酸及B：0.1%甲酸之CH3CN溶液組成。使用具有離子遷移之Synapt G2質譜儀(Waters Inc.)以陽離子模式獲得ESI MS資料及獨立高能量(MSE)實驗使用白胺酸-腦啡肽作為鎖定質量([M+H]+離子，在m/z 556.2771下)，且以連續模式收集資料(進一步描述參見Andersen及Faber,Int.J.Mass Spec.,302,139-148(2011))。
資料分析
在獨立實驗中使用標準MSE方法鑑別胃蛋白酶肽，其中肽及片段利用Synapt G2(Waters公司)之離子遷移特性進一步比對。使用Global Server 2.5版(Waters公司)處理MSE資料，且在肽檢索中包括Asn或Asp之視情況選用之羥基化，此係因為EGF結構域含有此轉譯後修飾。在DynamX 2.0軟體(Waters公司)中處理HX-MS原始資料檔案。DynamX自動進行鎖定質量校正及氘併入測定(亦即氘化肽之質心測定)。此外，手動檢查所有肽以確保軟體進行正確峰及氘化指定。
抗原決定基定位實驗
藉由在存在或不存在mAb 0322-0000-0017、0322-0000-0114、0322-0000-0158、0322-0000-0203或0322-0000-1069之情況下將EGF1-410倍稀釋至對應氘化緩衝液(亦即在D2O中自濃縮儲備液製備之25mM MES，5mM CaCl2，150mM NaCl，最終94% D2O，pH 6.5(未校正值))中來起始醯胺氫/氘交換(hydrogen/deuterium exchange；HX)。所有HX反應在20℃下進行且在不存在或存在2.4μM mAb之情況下含有4μM EGF1-4，因此得到1.2倍莫耳過量之mAb結合區。在時間間隔0.25、0.5、1、3、10及30分鐘時，藉由50μl冰冷中止緩衝液(1.35M TCEP，2M尿素)中止50μl HX反應等分試樣，得到最終pH值2.5(未校正值)。
結果及討論
人類蛋白質S蛋白質
含有人類蛋白質S結構域之EGF1-4的蛋白質分子用於本發明之研究。EGF結構域含有涉及Ca2+結合的Asn或Asp殘基之羥基化(Stenberg等人J.Biol.Chem.(1997)272：23255-23260)。在MS-MS實驗中偵測到未修飾序列及經羥基化序列兩者，且在資料分析中包括此等胃蛋白酶肽之兩個版本(參見表4)。在此實施例及表4中之所有編號係參考SEQ ID NO：2。
HX-MS分析
在不存在或存在mAb 0322-0000-0017、0322-0000-0114、0322-0000-0158、0322-0000-0203或0322-0000-1069之情況下監測覆蓋95%之EGF1-4一級結構的42個胃蛋白酶肽之HX時程。在不存在或存在mAb 0322-0000-0017、0322-0000-0114、0322-0000-0158、0322-0000-0203或0322-0000-1069之情況下在早期時間點(<10分鐘)所觀測之交換模式可分成兩個不同組：一組EGF1-4胃蛋白酶肽顯示不受mAb結合影響之交換模 式。與此對比，另一組EGF1-4中之肽展示在mAb結合後對交換之保護(參見表4)。在重疊胃蛋白酶肽之情況下，交換保護資訊嘗試次侷限於肽內之特定拉伸處，獲得肽N末端與第一肽鍵之完全回復交換。肽中之交換保護指示此區涉及mAb結合。因此，抗原決定基部分或完全位於由特定肽所界定之區內。然而，此係因為HX-MS之解析度係基於氘化蛋白質之胃蛋白酶消化，給定區內之交換保護不暗示由胃蛋白酶肽所界定之區內的每一殘基均必須涉及mAb結合。
mAb 0322-0000-0017、0322-0000-0203及0322-0000-1069之抗原決定基定位
mAb 0322-0000-0017、mAb 0322-0000-0203及mAb 0322-0000-1069之HX模式類似且因此將在此處組合描述。在EGF1結構域中直至殘基Phe43處觀測到mAb 0322-0000-0017、-0203及-1069之抗原決定基信號(參見表4)。肽自起點(殘基1或4)延長愈長，交換保護變得愈強，因此指示交換保護在肽之較C端區中。與此對比，肽1-15、4-15及4-19不展示交換保護。
因此，0322-0000-0017、0322-0000-0203及0322-0000-1069之抗原決定基自EGF1結構域內之SCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEF序列，亦即SEQ ID NO：2之殘基20-43出現。
mAb 0322-0000-0114及0322-0000-0158之抗原決定基定位
mAb 0322-0000-0114及mAb 0322-0000-0158之HX模式類似且因此將在此處組合描述。在肽中EGF2結構域中殘基Val78處起始觀測到mAb 0322-0000-0114及-0158之抗原決定基信號(參見表4)。交換保護在EGF3結構域及肽中繼續直至殘基Phe111。然而，因為在肽中殘基103及更高處起始未觀測到交換保護(參見表4)，殘基105及更高可自抗原決定基區排除。因此，0322-0000-0114及0322-0000-0158兩者之抗原決定基自EGF2-3 結構域內之VMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCK序列，亦即SEQ ID NO：2之殘基78-105出現。
EX：在抗體結合後之交換保護指示抗原決定基區(在至少三個時間點時>0.3Da)。
N：在抗體結合後無交換保護(<0.3Da)。
na：在相應實驗中不可分析。
實施例15：藉由抗蛋白質S(EGF1-4)單株抗體之HX-MS的殘基特異性抗原決定基定位
此實施例進一步描述在蛋白質S EGF1-4結構域(SEQ ID NO：2)上定位的抗體NNC 0322-0000-1069之抗原決定基。其為實施例14中所描述之抗原決定基定位實驗的延伸。此處所描述之實驗係基於與實施例14中之實驗相同的氫-氘交換原理，但進一步利用肽之碎片化使得能夠進行氘併入之殘基特異性測定。
使用氫-氘交換(HX)質譜(MS)與經氫-氘交換之肽的電子轉移解離(electron transfer dissociation；ETD)碎片化組合進行解析度直至單一殘基水準之抗原決定基定位。
ETD造成肽之快速碎片化，同時保持經氫-氘交換之質子在主鏈醯胺氮上的位置。以此方式可能以定位氘併入直至蛋白質主鏈中單一殘基。
藉由ETD之碎片化在醯胺氮與C-α碳之間斷裂肽主鏈。含 有肽之N端部分的片段指示為C片段，而含有肽之C端部分之片段指示為Z片段。C1片段將由肽之第一(N端)殘基以及肽之第二殘基的主鏈醯胺組成。同樣，Z1片段由肽遠離主鏈醯胺基之最後(C端)殘基組成。在以下結果部分中，C片段及可自其測定主鏈醯胺HX之對應殘基列於表5中，而Z片段及可測定其測定主鏈醯胺HX之對應殘基列於表6中。
實驗
將蛋白質S EGF1-4單獨的或在抗體0322-0000-1069之一存在下的溶液在氘化MES緩衝液(25mM MES，150mM氯化鈉，5mM氯化鈣，pH 6.5)中稀釋25倍。藉由稀釋至氕化MES緩衝液中來製備非氘化對照組。在具有HDX技術之nanoAcquity UPLC系統(Waters公司，Milford,MA,USA)上進行氫交換實驗，其包括用於自動樣品製備之HD-x PAL自動取樣器(LEAP Technologies公司，Carrboro,NC,USA)及超高效液相層析(ultra-high performance liquid chromatography；UPLC)系統。UPLC管、預柱及分析管柱以及轉換閥位於冷卻至0.3℃之腔室中。胰蛋白酶消化管柱儲存在25℃下。氫交換反應在20℃下進行。質量分析使用Waters SYNAPT G2 HDMS質譜儀線上進行。
將在存在或不存在330pmol抗體之情況下含有300pmol蛋白質S EGF1-4之體積稀釋至氘化MES緩衝液中。在時間間隔15秒、分鐘、4分鐘及16分鐘時，將50μl樣品在調節至pH 2.7之50μl 1.35mM三(2-羧基乙基)膦中中止且保持在3℃下。將中止樣品在3℃下培育60秒，且隨後使用5%甲醇，0.1%甲酸移動相及100μl/min流動速率將99μl中止溶液立即注射且經過Porozyme固定胃蛋白酶管柱(2.1mm×30mm)(Applied Biosystems,Technologies公司，Carlsbad,CA,USA)且截留在Waters VanGuard BEH C18 1.7μm(2.1mm×5mm)上。以40μl/min流動速率使用15min 10%-40%含有0.1%甲酸之乙腈梯度在水UPLC BEH C18 1.7(1.0mm×100 mm)管柱上分離肽。向移動相中添加用於增壓之0.1% 3-硝基苯甲醇以增強ETD碎片化。
質譜儀以啟用ETD碎片化之陽離子模式運行。所用儀器參數為3.0kV毛細管，18V採樣錐及4V萃取錐凸出部分，100ml/min去溶劑化氣體流及25ml/min錐氣流。將來源區塊加熱至90℃，將去溶劑化氣體加熱至350℃。用14ml/min緩衝液氣流沖洗截留及轉移區以截留離子。將截留波高度降低至0.5V以用於有效ETD碎片化。使用1,4-二-氰基苯作為ETD試劑，且使用25ml/min補充氣流及71V放電電流來產生離子。基於實施例14中所描述之抗原決定基定位的結果，選擇肽D16-F28及T29-F43用於殘基特異性抗原決定基定位，因為覆蓋蛋白質S EGF1-4上NNC 0322-0000-1069之抗原決定基的此等肽豐富且結果高。
使用自產Microsoft Excel宏手動分析資料，該宏藉由採用由強度權重之m/z值平均值來測定指定時間間隔之平均質量。交換保護藉由自在不存在抗體之情況下所量測的片段平均質量減去在存在mAb 0322-0000-1069之情況下所量測的片段平均質量來計算。保護程度測定為實驗中所包括四個培育時間的平均值。各樣品重複量測2次，且將結果平均。
結果
來自肽D16-F28之結果不確定。在抗體0322-0000-1069與蛋白質S EGF1-4結構域結合後氫-氘交換之保護分別展示在表5(C離子片段系列)及表6(Z離子片段系列)中。
片段C1-C5之氘併入不可測定。C6片段觀測到0.04Da之交換保護。此因其低於0.09Da而不視為明顯差異。片段C7觀測到交換保護明顯增加，指示殘基W36涉及抗體結合。片段C8及C9未觀測到交換保護明顯增加。片段C10之氘併入不可測定。片段C11觀測到氫交換保護明顯增加，指示殘基E39及K40中之至少一者涉及抗體結合。氫交換保護較大增加(0.39Da)可支持兩個殘基均有助於抗體結合。片段C12之氘併入不可測定。片段C13觀測到交換保護明顯增加，指示殘基C41及E42中之一或兩者有助於抗體結合。
片段Z1-Z3之氘併入不可測定。片段Z4觀測到明顯氫交換保護，指示殘基C41、E42及F43中之一或多者有助於抗體結合。Z5片段觀測到氫交換保護明顯增加，指示殘基K40有助於抗體結合。片段Z6之氘併入不可測定。Z7片段觀測到氫交換保護增加，指示殘基G38及E39中之一 或兩者有助於抗體結合。Z8片段未觀測到氫交換保護明顯增加。Z9片段之氘併入不可測定。Z10片段觀測到氫交換保護明顯增加，指示殘基G35及W36中之一或兩者有助於抗體結合。片段Z11、Z12或Z13未觀測到氫交換保護明顯增加。片段Z14之氘併入不可測定。
C離子片段系列揭示當結合抗體NNC 0322-0000-1069時殘基W36、殘基E39及K40中之一或兩者以及殘基C41及E42中之一或兩者觀測到氫氘交換保護。另外，Z離子片段系列揭示殘基G35及W36中之一或兩者、殘基G38及E39中之一或兩者、殘基K40以及殘基C41、E42及F43中之一或多者在抗體結合後針對氫氘交換受保護。
因此，組合自C離子及Z離子片段系列獲得之資訊將針對氫-氘交換受保護的殘基限制為與殘基W36、E39、K40以及殘基C41、E42及F43中之一或多者結合的抗體。
因此，在抗體NNC 0322-0000-1069與蛋白質S(EGF1-4)結合後針對氫-氘交換受保護之殘基包括殘基W36、E39、K40以及殘基C41、E42及F43中之一或多者。
實施例16：蛋白質S/抗蛋白質S抗體複合物與脂質表面之相互作用
藉由表面電漿子共振使用Biacore3000儀器評估人類蛋白質S/抗蛋白質S複合物與含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡的結合。如Hodnik等人Methods Mol Biol.(2010)627：201-11中所描述在L1感測器晶片(GE healthcare目錄號BR-1005-58)上俘獲脂質囊泡。
將含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡(Avanti Polar Lipids公司；目錄號211635)固定在主動流動單元上，而磷酸膽鹼囊泡(Avanti Polar Lipids公司；目錄號211621)固定在參考單元上。
在脂質表面(大約200RU)上俘獲人類蛋白質S(Haematologic 公司；目錄號HCPS-0090)(100nM)，且監測單株抗體(250nM)之結合。藉由含EDTA之再生緩衝液自感測器表面移除所結合之蛋白質。
圖7展示單株抗體0322-0000-0114(實線)及0322-0000-0203(點線)與在含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡上俘獲之蛋白質S結合的表面電漿子共振(SPR)感應圖譜。抗體能夠與結合在脂質表面上之蛋白質S結合。
在類似實驗中，將蛋白質S之連續稀釋液(100nM及2倍連續稀釋)與飽和濃度之單株抗體(500nM)一起培育，隨後注射在晶片表面上方。自結合感應圖譜導出蛋白質S/抗蛋白質S複合物與脂質表面結合之估計親和力，且將其與自由蛋白質S相比較。親和力如下：自由蛋白質S：2.5nM，蛋白質S/0114：4.0nM，蛋白質S/0203：4.0nM。
圖8展示自由蛋白質S(100nM)或與指定單株抗體(500nM)一起培育之蛋白質S(100nM)與含磷脂醯絲胺酸之脂質囊泡結合的SPR感應圖譜。包括抗體2F140(結合蛋白質S之Gla結構域之抗體)作為對照組。2F140如所預期地阻止蛋白質S與脂質表面結合。
結論為，蛋白質S與脂質表面之結合親和力在0322-0000-0114及-0203存在下保留，且因此該等單株抗體不阻止蛋白質S與脂質表面結合。
實施例17：抗蛋白質S mAb 0914之活體內作用
如Hilden等人Blood(2012年)6月14；119(24)：5871-8所描述，在誘發血友病A之家兔模型中檢測抗蛋白質S抗體對表皮出血之活體內作用。簡言之，藉由靜脈內投予對家兔FVIII具有交叉反應性之單株抗人類FVIII抗體(每公斤2000家兔貝什斯達單位(Bethesda unit))來使經麻醉之家兔具有短暫血友病性。在抗FVIII投藥之後八分鐘時，以9mg/kg使用1.18ml/kg之給藥體積向兩組每組10只家兔給予抗蛋白質S抗體mAb 0914或同型對照抗體。在再12分鐘之後，藉由切割第三趾指甲端部(包括表皮 頂點)來誘發出血，且在37℃鹽水中收集血液以在其後60分鐘時使用。藉由量測鹽水中出血之血紅素來量化出血。
如由針對不同變化的使用威爾奇校正(Welch's correction)之兩個尾部T檢驗所測定的，抗蛋白質S抗體造成平均失血統計顯著(p=0.013)地自14 563nmol血紅素(95% CI：5,845-23,281nmol)減少至2,712nmol(95% CI：1,060-4,363nmol)，參見下表7及圖11。
實施例18：蛋白質S/蛋白質S-mAb複合物與C4b結合蛋白之相互作用
藉由表面電漿子共振使用Biacore T200儀器來評估自由人類蛋白質S(來自Enzyme Research Laboratories，目錄號HPS)及與mAb 0322-0000-1069或對應Fab(0322-0000-1139)複合之蛋白質S與C4b結合蛋白(C4BP；來自Hyphen BioMed，目錄號PP015A)的結合。
簡言之，藉由標準胺偶合化學將以α鏈為靶標之多株抗C4BP抗體(來自abcam之ab83755)固定在CM5 Biacore感測器晶片上。俘獲C4BP，繼而注射自由蛋白質S或與莫耳過量mAb/Fab一起培育之蛋白質S的連續稀釋液。在補充有0.005% Tween20之10mM Hepes，pH 7.4；150mM NaCl；10M CaCl2中進行實驗，且用甘胺酸-HCl pH 1.7再生晶片。自由蛋白質S與C4BP結合之估計親和力測定為2nM。作為對照組，研究與LamG特異性抗體0322-0000-0023複合之蛋白質S的結合。C4BP與蛋白質S之結合經由蛋白質S之結構域介導(He X.等人Biochemistry,1997；36(12)：3745-54)，且如所預期，0322-0000-0023完全阻斷蛋白質S與C4BP之間的相互作用。
mAb及Fab均不阻止蛋白質S與C4BP結合。為進一步支持mAb及Fab不干擾蛋白質S與C4BP結合之結論，測定0322-0000-1139與C4BP上所俘獲之蛋白質S的親和力。0322-0000-1139與C4BP上所固定之蛋白質S結合得親和力類似於蛋白質S與全長抗體0322-0000-1069結合之親和力(K D 分別為10及20nM)。
實施例19：在血友病A狀血液中刺激血栓彈力描記術
經由血栓彈力描記術使用TEG®止血分析儀來量測血液在血栓形成期間之彈性特性(美國專利第5,223,227號及Luddington,RJ,「Thrombelastography/thromboelastometry」Clin Lab Haematol.27：81-90(2005))。TEG®止血分析儀在類似於緩慢靜脈血流之較低剪切環境下在誘發血液凝結時監測血液之彈性特性。出現之凝結剪切彈性變化之模式使得能夠測定凝結形成之動力學以及所形成凝結之強度及穩定性；簡而言之出現之凝結的機械特性。在TEG®中，將總體積為340μL之預加熱(37℃)人類全血與化合物、中和多株抗FVIII抗體、經活化蛋白質C(APC)或凝血調節蛋白(TM)及組織因子(TF)之組合一起培育。此血液用20μL氯化鈣(0.2M)再鈣化，起始TEG分析。
R值(s)為凝結時間，定義為自起始至幅度到達2mm時之時間。血栓產生最大速率(maximum rate of thrombus generation；MTG；mmx100/s)定義為及時幅度一階導數之全域最大值。
結果
表8至11提供在正常及血友病A狀人類血液中(亦即在不存在或存在中和抗FVIII多株抗體，0.1mg/mL之情況下)所測定之血栓彈力描記術參數R值及MTG。表8及9展示在1nM APC存在及抗體0322-0000-0114、0322-0000-0910及0322-0000-0914之濃度增加下(0nM至1633nM)的此等值(表8為R值而表9為MTG)。
表10及11展示在5nM TM存在及相同抗體之濃度增加下的此等值(表10為R值而表11為MTG)。在血液中測試來自兩個不同供者之各抗體。使用經40,000倍稀釋之TF(Innovin，大約6nM儲備溶液，150fM最終濃度)起始血栓彈力描記術。所有三種蛋白質S抗體濃度依賴性地減少R值及增加MTG。
實施例20：評估0322-0000-1069/1139對於蛋白質S對TFPI之FXa抑制之輔因子功能的作用
已報導蛋白質S藉由加強FXa活性之TFPI抑制來充當TFPI輔因子(Hackeng T.M.等人PNAS(2006)103(9)：3106-11)。為研究0322-0000-1069及0322-0000-1139對蛋白質S之輔因子活性的作用，建立FXa活性分析。簡言之，將人類蛋白質S(50nM，來自Enzyme Research)與脂質囊泡(25μM；25：75 POPS：POPC，來自Avanti Polar Lipids)及mAb/Fab(500nM)一起在25℃下培育10分鐘。添加人類全長TFPI(5nM)及S-2765(200μM，來自Chromogenix)，且用人類FXa(0.5nM；來自Haematologic technologies)起始反應。在補充有1mg/ml牛血清白蛋白及1mg/ml PEG8000之50mM Hepes，pH 7.4；0.1M NaCl；10mM CaCl2中進行實驗。藉由使用SpectraMax M2儀器量測405nm處之吸光度來隨時間追蹤FXa特異性受質之水解。
如先前所報導，蛋白質S加強TFPI之抑制活性，且0322-0000-1069及fab片段、0322-0000-1139(數據未示)影響蛋白質S對TFPI之輔因子功能。然而，LamG結構域靶向抗體0322-0000-0032完全消除蛋白質S之作用(圖12)。
實施例21：評估自由蛋白質S及與0322-0000-1069/0322-0000-1139複合之蛋白質S與TFPI的相互作用
藉由表面電漿子共振使用Biacore T200儀器來研究自由人類蛋白質S(來自Enzyme Research Laboratories)及與0322-0000-1069或0322-0000-1139複合之蛋白質S與全長人類TFPI的結合。
簡言之，藉由標準胺偶合化學將TFPI固定在CM5 biacore感測器晶片上。評估自由蛋白質S(200nM)或與0322-0000-1069(200nM) 或0322-0000-1139(400nM)複合之蛋白質S(200nM)的結合。作為對照組，包括以蛋白質S之LamG結構域為靶標的0322-0000-0023。在補充有0.005% Tween20之10mM Hepes，pH 7.4；150mM NaCl；10M CaCl2中進行實驗，且用甘胺酸-HCl pH 2.5再生晶片。蛋白質S與TFPI之結合不受0322-0000-1069或0322-0000-1139阻止，而蛋白質S與TFPI之結合完全由0322-0000-0023抑制(圖13)。
此等觀測與抗體之已知抗原決定基良好吻合。0322-0000-1069/0322-0000-1139結合蛋白質S之EGF-1結構域，該結構域位於遠離已知介導與TFPI之結合的LamG結構域處(Reglilska-Matveyev N.等人Blood(2014)123(25)：3979-3987)。0322-0000-0023以LamG結構域為靶標，且因此最可能具有與TFPI重疊之抗原決定基。
實施例22：抗蛋白質S mAb 0322-0000-0914之人類化
使用MOE中之標準技術(可自www.chemcomp.com購得)來建立表示鼠類抗蛋白質S抗體0322-0000-0914之Fab片段的3D模型(VH/VL亦表示在嵌合mAb 0322-0000-1069中)，且在有效CDR區之4.5Å內的所有殘基(VH：31-35B、50-58、95-102；VL：24-34、50-56、89-97)定義為遮蔽殘基(根據Kabat編號)。遮蔽殘基對於維持CDR中之結合均可能至關重要。
0322-0000-0914之遮蔽殘基包括以下位置：重鏈之1-4、23-37、47、50-59、69-71、73、76、78、91-103及輕鏈之1-5、22-36、46-60、62、63、65、69-71、87-98(根據Kabat編號)。
使用生殖系同源性檢索及手動序列合格性評估，將VH1_46a03及J6a02鑑別為重鏈之適當人類生殖系組合，而將VK3_11a01及JK4a02鑑別為輕鏈之適當人類生殖系組合，儘管其他生殖系亦可符合作為人類化骨架之條件。
‧隨後根據以下流程來進行人類化，且概述於圖14(輕鏈)及圖15(重鏈)中：
‧遮蔽外之殘基視為人類殘基。
‧遮蔽內且Kabat CDR內之殘基視為鼠類殘基。
‧遮蔽內且Kabat CDR外具有小鼠/人類生殖系共同序列之殘基視為共同序列。
‧遮蔽內且Kabat CDR外具有小鼠/人類生殖系差異之殘基視為：- 人類殘基，亦即未經歷回復突變，或- 鼠類殘基，亦即經歷潛在回復突變
來源於所描述之人類化流程的具有及不具有潛在回復突變的人類化輕鏈及重鏈可變區列於以下。亦列出CDR區及個別回復突變。
在上述人類化流程之後，初始人類化0322-0000-0914 VH構築體攜載根據最少CDR移植策略設計之VH CDR2，其中VH CDR2以比Kabat定義(殘基50-65)短之版本(殘基50-59)移植。此導致在重鏈CDR2之遠端部分中對應於殘基60-65(根據Kabat編號)處引入人類生殖系序列。亦產生根據人類化流程設計但在重鏈中攜載完整鼠類CDR2的人類化0322-0000-0914VH構築體之替代性版本(VHCDR2*)(參見以下CDR序列)。
人類化VL區
HZ 0914_VL(SEQ ID NO：49)
人類化VL區之CDR區
CDR1：RASSSVSYMY(SEQ ID NO：49之殘基24-33)
CDR2：(SEQ ID NO：49之殘基49-55)
CDR3：QQWSSIPPT(SEQ ID NO：49之殘基88-96)
如在以上序列中以灰色突出顯示的人類化VL區中潛在回復突變之列表(根據Kabat編號)。
HZ 0914_VL E1Q
HZ 0914_VL T5S
HZ 0914_VL S22T
HZ 0914_VL L46P
HZ 0914_VL L47W
HZ 0914_VL I58V
HZ 0914_VL D70S
HZ 0914_VL F71Y
人類化VH區
HZ 0914_VH(SEQ ID NO：50)
人類化VH區之CDR區
CDR1：SYWIN(SEQ ID NO：50之殘基31-35)
CDR2：RIDPYDSETHYAQKFQG(SEQ ID NO：50之殘基50-66)
CDR3：WGGSGYAMDY(SEQ ID NO：50之殘基99-108)
CDR2*：RIDPYDSETHYNQKFKD(SEQ ID NO：41之殘基50-66)
如在以上序列中以灰色突出顯示的人類化VH區中潛在回復突變之列表(根據Kabat編號)。
HZ 0914_VH A60N
HZ 0914_VH M69L
HZ 0914_VH R71V
HZ 0914_VH T73K
HZ 0914_VH V78A
實施例23：用於短暫表現人類化抗蛋白質S抗體變異體之表現載體的產生
根據上述人類化流程來合成表示人類化0322-0000-0914 VH及VL區之編碼區的DNA片段(GENEART AG/Life Technologies)。
獲得具有/不具有8個潛在回復突變的用於人類化VL區之序列。亦合成一組8種在VL區中攜載個別8個回復突變之變異體。藉由定點突變誘發使用突變誘發引子及來自Agilent之QuickChange®快速定點或QuickChange®快速多定點突變誘發套組來產生許多攜載2、3、4、5、6及7各所鑑別潛在VL回復突變之組合的變異體。根據製造商之方案使用套組。藉由使用經設計以向攜載單一回復突變之變異體添加回復突變的突變誘發引子或經設計以自攜載所有8個回復突變之變異體移除回復突變的突變誘發引子來產生組合突變。
獲得具有/不具有5個潛在回復突變的人類化VH區之序列。亦合成一系列5種在VH區中攜載個別5個回復突變的變異體及攜載2、3及4個所鑑別潛在VH回復突變之組合的25種變異體之組合庫。另外，亦合成攜載完整鼠類VH CDR2(如以上CDR2*所列)但無另外回復突變的人類化VH構築體。
對於VL及VH構築體兩者，包括人類CD33之前導肽序列以代替天然免疫球蛋白信號肽序列，且在ATG起始密碼子上游立即引入Kozak序列(5'-GCCGCCACC-3')
產生基於pTT之表現載體以用於將人類化抗蛋白質S抗體短暫表現為人類κ/IgG4(S241P)同型。在IgG4鉸鏈區中包括位置241處(根 據Kabat編號，對應於EU編號系統(Edelman G.M.等人Proc.Natl.Acad.USA 63,78-85(1969))之殘基228)的脯胺酸突變，以消除單體抗體片段，亦即包含一個LC及一個HC之「半抗體」的形成。
使用基於標準限制之選殖(HindIII/NheI限制酶消化)自GENEART選殖載體切除VH片段，且在框架中選殖至經線性化的含有用於人類IgG4(S241P)CH結構域之序列的基於pTT之載體中(HindIII/NheI限制酶消化)。使用基於標準限制之選殖(HindIII/BsiWI限制酶消化)自GENEART選殖載體切除VL片段，且在框架中選殖至經線性化的含有用於人類κ CL結構域之序列的基於pTT之載體中(HindIII/BsiWI限制酶消化)。隨後將組裝載體轉型為用於選擇之大腸桿菌。最終構築體之序列藉由DNA定序來檢驗。如上文所提及，藉由定點突變誘發使用突變誘發引子及來自Agilent之QuickChange®快速定點或QuickChange®快速多定點突變誘發套組來產生攜載VL回復突變之組合的變異體。
如實施例11中所描述，在EXPI293F細胞(Life Technologies)中藉由共轉染不同基於pTT之LC/HC表現載體以表現短暫人類化變異體。
人類化過程以反覆蛋白質工程改造過程形式來進行。以下概述變異體產生、生產及測試之反覆步驟：
步驟1：將移植有CDR之人類化變異體(0322-0000-1152)與原始鼠類抗體(0322-0000-0914)之鼠類-人類嵌合版本(0322-0000-1069)相比較。在整個人類化過程中使用鼠類-人類嵌合抗體作為參考。亦測試攜載所有5個潛在VH及所有8個潛在VL回復突變的移植有CDR之變異體(0322-0000-1155)，以及攜載所有5VH回復突變但在移植有CDR之輕鏈中無回復突變的變異體(0322-0000-1154)或攜載所有8個VL回復突變但在移植有CDR之重鏈中無回復突變的變異體(0322-0000-1153)。
步驟2：將攜載個別8個潛在VL或5個潛在VH回復突變 的變異體(例如0322-0000-1166)與鼠類-人類嵌合mAb(0322-0000-1069)及攜載完整5個VH或8個VL回復突變之組的人類化變異體(分別0322-0000-1154或0322-0000-1153)相比較。
步驟3：在多次反覆中，測試具有不同VL回復突變或VH回復突變之組合的人類化變異體(例如0322-0000-1223)以及具有不同VL及VH突變之組合的人類化變異體(例如0322-0000-1201)，且與先前鑑別之變異體及鼠類-人類嵌合mAb(0322-0000-1069)參考相比較。表12展示較佳人類化變異體。
在結合、功能性分析中測試人類化變異體，且評估其生物物理學/化學特性及免疫原性。
為在本發明抗體之序列中避免潛在isoAsp位點SEQ ID NO：50(亦即人類化重鏈)之D55，此殘基可在一個具體實例中經不為半胱胺酸(C)之不同胺基酸殘基取代。
實施例24：使用凝血酶產生分析評估抗蛋白質S人類化變異體在血友病性血漿中之功效
使用Calibrated Automated Thrombogram®(CAT)系統與0322-0000-1069相比較評估0322-0000-1069之人類化變異體在血友病性血漿中改善凝血酶產生的能力。
簡言之，將人類化變異體與外加經活化之蛋白質C(APC；Haematologic Technologies))的人類血友病A(HA)血漿(George King Bio-medical公司)混合。血漿中之抗體濃度在3與1000nM之間變化，且血漿中APC濃度為5nM。然後，一式兩份地在Immulon 2 HB-High結合96孔U底培養板(VWR)中將80μl此血漿混合物與含有最終濃度分別為5pM 及4μM之組織因子及磷脂的20μl PPP試劑(Thrombinoscope)一起在37℃下培育10分鐘。在對照孔中，將80μl血漿(無抗體或APC)與20μl凝血酶校準劑混合。添加20μl預升溫(37℃)的含有CaCl2及螢光凝血酶受質之FluCa試劑(Thrombinoscope)來起始反應。每20秒監測一次螢光，持續60分鐘，且使用Thrombinoscope分析5.0版來進行分析。軟體提供自完整螢光曲線之一階導數所計算的凝血圖，以及與凝血圖相關聯之參數，諸如以nM為單位量測之峰值凝血酶。
將不含有回復突變(back mutation；BM)之人類化變異體(0322-0000-1152)與鼠類-人類IgG4嵌合體0322-0000-1069相比較(參見表13)。
最初，在LC中含有L46P突變之變異體(即0322-0000-1166)與無任何BM之變異體相比能夠改善凝血酶產生活性。
作為進一步人類化之一部分，引入回復突變(BM)之組合，其全部在LC中含有L46P突變。所測試之所有組合具有改善凝血酶產生之能力，且打算多數組合產生凝血酶之水準等於或優於0322-0000-1166。
使用凝血酶產生直接比較最終八個組合(參見表14)。所有此等8個分子之活性與0322-0000-1069相當。
實施例25：對應ID編號及名稱
最後四個數字來縮寫為mAb 1069或Fab 1139。
儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵，但一般熟習此項技術者現將想到多種修改、取代、變化及等效物。因此，應理解，所附申請專利範圍意欲涵蓋如屬於本發明之真實精神內的所有該等修改及變化。
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<400> 62

Claims (25)

  1. 一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1-3區中結合的抑制劑，其用於治療人類個體中之凝血病變。
  2. 如申請專利範圍第1項所用之抑制劑，其中該抑制劑能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合以用於治療人類個體中之凝血病變。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所用之抑制劑，其中該抑制劑為抗體或其抗原結合片段。
  4. 一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合的抗體或其抗原結合片段，其中該結合區包含一或多個選自由以下各者組成之群的胺基酸殘基：SEQ ID NO：2之W36、E39、K40、C41、E42及F43。
  5. 如申請專利範圍第4項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合SEQ ID NO：2之胺基酸殘基W36、E39、K40及胺基酸殘基C41、E42及F43中的一或多者。
  6. 一種能夠特異性地在人類蛋白質S之EGF1區中結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之輕鏈包含包含SEQ ID NO：49之殘基88-96(QQWSSIPPT)的CDR3序列，其中該等殘基中之一個或兩個可經不同殘基取代，且該抗體或抗原結合片段之重鏈包含包含SEQ ID NO：50之殘基99-108(WGGSGYAMDY)的CDR3序列，其中該等殘基中之一個或兩個可經不同殘基取代。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之該輕鏈包含 包含SEQ ID NO：49之殘基24-33(RASSSVSYMY)的CDR1序列，及/或包含SEQ ID NO：49之殘基49-55(ATSNLAS)的CDR2序列，及/或包含SEQ ID NO：49之殘基88-96(QQWSSIPPT)的CDR3且該抗體或抗原結合片段之該重鏈包含包含SEQ ID NO：50之殘基31-35(SYWIN)的CDR1序列，及/或包含SEQ ID NO：50之殘基50-66(RIDPYDSETHYAQKFQG)的CDR2序列，及/或包含SEQ ID NO：50之殘基99-108(WGGSGYAMDY)的CDR3序列。
  8. 如申請專利範圍第6項或第7項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段之輕鏈可變結構域(light chain variable domain；VL)包含SEQ ID NO：49，其中胺基酸殘基L45經P取代，且視情況L46經W取代，且該抗體或抗原結合片段之重鏈可變結構域(heavy chain variable domain；VH)包含SEQ ID NO：50，視情況進一步包含一或多個選自由M70L、R72V、T74K及V79A組成之群的取代。
  9. 如申請專利範圍第6項、第7項或第8項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51或53，且該抗體之該重鏈重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50、52、54或55。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50。
  11. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕 鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：52。
  12. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：54。
  13. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：51且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：55。
  14. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：50。
  15. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：52。
  16. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：54。
  17. 如申請專利範圍第9項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之該輕鏈可變結構域(VL)包含SEQ ID NO：53且該抗體之該重鏈可變結構域(VH)包含SEQ ID NO：55。
  18. 如申請專利範圍第7項至第17之抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO：50之重鏈可變結構域(VH)CDR2胺基酸殘基D55視情況可經不為C之不同胺基酸殘基取代。
  19. 如申請專利範圍第3項至第18項中任一項之抗體，其中該抗體為單株抗體。
  20. 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之抑制劑、抗體或其抗原結合片段。
  21. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第4項至第19項中任一項之抑制劑、抗體或其抗原結合片段或多核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  22. 一種用於治療人類個體中之凝血病變的如申請專利範圍第4項至第19項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  23. 如申請專利範圍第22項之抗體或其抗原結合片段，其用於治療人類個體中之血友病。
  24. 一種真核細胞，其表現如申請專利範圍第4項至第19項中任一項之抑制劑、抗體或其抗原結合片段。
  25. 一種抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體在與人類蛋白質S之結合中競爭，其中該參考抗體包含如申請專利範圍第8項或第18項中任一項之重鏈可變區及輕鏈可變區。
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