CN117192132B - 一种vWF片段残留检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种vWF片段残留检测试剂盒及方法。该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，所述的捕获抗体为15B11A8，其CDR序列为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5和KVS；所述的检测抗体为5D4A10，其CDR序列为SEQ ID NO.6‑SEQ ID NO.10和EAN。所述的方法能够检测通过专利CN 111440820 B制备的FVIII蛋白中的vWF片段残留的含量，并且该方法的R2均≥0.994，定量范围为0.50 ng/mL‑2.50 ng/mL；定量限检测值在0.47 ng/mL‑0.52 ng/mL之间。具有良好的专属性、准确度、精密度、定量限、线性和范围。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种vWF片段残留检测试剂盒及方法。
背景技术
A型血友病是一种遗传性出血疾病，由凝血因子VIII(FVIII)的缺乏或完全缺失引起。这种疾病的特点是反复出血，主要在肌肉和关节，可发展为衰弱性关节病。严重A型血友病的定义为FVIII<1%，可导致损伤后频繁的自发性或过度出血。在中度和轻度A型血友病患者中，出血症状通常与损伤和手术相关。
A型血友病的主要治疗方法是使用血浆或重组人凝血因子VIII（phFVIII或rhFVIII）浓缩物为基础的替代疗法。phFVIII是人血浆经分离纯化获得，由于受到原料的产能限制及潜在的病毒感染风险等因素的影响，rhFVIII正逐渐取代phFVIII成为替代疗法的首选药物。然而，由于结构复杂，分子量巨大，rhFVIII的单位产量低下，导致价格昂贵，阻碍了A型血友病的治疗与预防。
为克服上述困难，庄亚（北京）生物科技有限公司发明了rhFVIII共表达载体技术：血管性血友病因子片段和八因子的共表达载体（授权公告号，CN 111440820 B）。通过在工程细胞中使用同一个表达载体共表达截短型血管性血友病因子（vWF-D’D3片段）与重组人凝血因子VIII（rhFVIII），优化了重组凝血因子VIII的代谢，大大提高了rhFVIII在工程细胞中的单位产量及稳定性。
为制备高纯度的rhFVIII，与rhFVIII共表达的截短型血管性血友病因子需要通过层析方法从vWF-D’D3片段/FVIII复合物中分离并去除。为检测残留的vWF-D’D3片段含量是否达到要求，需要开发针对该残留物的检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测vWF-D’D3残留的试剂盒及方法，所述的方法能够检测通过专利CN 111440820 B制备的FVIII蛋白中的vWF-D’D3含量，该方法具有良好的专属性、准确度、精密度、定量限、线性和范围。
术语：
本发明中，捕获抗体是特异性结合待测物质的抗体，用以捕获和固定待测物质。
本发明中，检测抗体是与待测物质结合的抗体，用于检测待测物质的存在。其结合位点需要有别于待测物质与捕获抗体结合的位点。
一方面，本发明提供了一种检测vWF片段的试剂盒，所述的试剂盒包括捕获抗体和检测抗体；所述的捕获抗体为15B11A8，包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
（1）HCDR1为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（2）HCDR2为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（3）HCDR3为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
（4）LCDR1为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
（5）LCDR2的氨基酸序列为KVS；
（6）LCDR3为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
所述的检测抗体为5D4A10，包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述的轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
（1）HCDR1为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
（2）HCDR2为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；
（3）HCDR3为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；
（4）LCDR1为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
（5）LCDR2的氨基酸序列为EAN；
（6）LCDR3为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
具体的，所述的捕获抗体15B11A8重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11或与SEQ ID NO.11具有80%以上序列相似性的序列；
所述的捕获抗体15B11A8轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12或与SEQ IDNO.12具有80%以上序列相似性的序列；
所述的检测抗体5D4A10，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.13或与SEQ IDNO.13具有80%以上序列相似性的序列；
所述的检测抗体5D4A10，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.14或与SEQ IDNO.14具有80%以上序列相似性的序列；
具体地，所述的捕获抗体15B11A8重链氨基酸序列为SEQ ID NO.15或与SEQ IDNO.15具有65%以上序列相似性的序列；
所述的捕获抗体15B11A8轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.16或与SEQ ID NO.16具有65%以上序列相似性的序列；
所述的检测抗体5D4A10重链氨基酸序列为SEQ ID NO.17或与SEQ ID NO.17具有65%以上序列相似性的序列；
所述的检测抗体5D4A10轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.18或与SEQ ID NO.18具有65%以上序列相似性的序列。
具体地，所述的捕获抗体固定至固相载体上；所述的检测抗体经生物素标记。
进一步具体地，所述的固相载体可以是酶标板。
具体地，所述的试剂盒还包括但不限于：vWF蛋白标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
进一步具体地，所述的抗体稀释液为PBS，pH7.4；所述的洗液为含0.05% Tween-20的PBS；所述的封闭液/样品稀释液为含2% BSA的PBST；所述的终止液为2 M H2SO4。
具体地，所述的vWF为截短型vWF；所述的截短型vWF为vWF的D’D3区包含半胱氨酸突变。
进一步具体地，所述的vWF的氨基酸序列为SEQ ID NO.19。
具体地，前述的试剂盒包括以下步骤：
（1）将捕获抗体包被固相载体；
（2）在固相载体中加入蛋白标准品和待测样品，孵育；
（3）弃掉固相载体中的蛋白标准品和待测样品，加入生物素标记的检测抗体，孵育；
（4）弃掉固相载体中的检测抗体，加入酶标亲和素，孵育；
（5）在固相载体中加入底物，孵育后加终止液；
（6）测定OD值。
进一步具体地，所述的蛋白标准品和待测样品使用变性缓冲液进行稀释。
更进一步具体地，所述的变性缓冲液可以是Triton X-100和SDS的混合液，优选地，所述的变性缓冲液为0.2-0.4% Triton X-100和1-2% SDS溶液等体积混合。进一步优选地，所述的变性缓冲液为0.3% Triton X-100和1.5% SDS溶液等体积混合。
进一步具体地，所述的捕获抗体的浓度可以是2-4μg/mL，按照65-125μL/孔的用量加入固相载体中；所述的检测抗体0.5-2μg/mL，按照50-200μL/孔的用量加入固相载体中。
优选地，所述的捕获抗体的浓度为2.5μg/mL，按照100μL/孔的用量加入固相载体中；所述的检测抗体1μg/mL，按照100μL/孔的用量加入固相载体中。
又一方面，本发明提供了一种检测vWF片段残留的方法，所述的方法通过前述的试剂盒进行检测。
又一方面，本发明提供了前述的试剂盒在检测vWF片段残留中的应用。
本发明所取得的技术效果：
（1）具有良好的线性和范围，R2均≥0.994，定量范围为0.50ng/mL-2.50ng/mL；
（2）专属性强，样品缓冲液的检测值均低于标准品最低点的检测值；
（3）定量限低，定量限检测值在0.47ng/mL-0.52ng/mL之间；
（4）准确度高，不同时间，不同分析人员的样品加标回收率在68%-138％之间。
附图说明
图1为抗体15B11A8和抗体5D4A10的SDS-PAGE图谱，其中1为抗体15B11A8还原样品；M为10-180 KDa Marker；2为抗体5D4A10还原样品。
图2为试剂盒标准曲线，以vWF蛋白标准品浓度为横坐标，OD检测值为纵坐标，对实验数据进行线性拟合。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，FVIII为按照专利CN 111440820 B的方法制备的FVIII蛋白。
本发明中，vWF为按照专利CN 111440820 B的方法制备的FVIII蛋白中的残留vWF片段。
实施例1 抗体的制备与纯化
1.1杂交瘤法制备单克隆抗体及氨基酸测序
将vWF片段（D’D3-Fc）注射到小鼠体内，在一定时间后，提取小鼠免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合以形成可持续分泌针对抗原的单抗杂交瘤细胞（金斯瑞, 南京）。经过筛选共获得两种抗体：1）抗vWF-D’D3抗体； 2）抗Fc抗体。得到的两种重组单克隆抗体分别命名为15B11A8与5D4A10，经基因测序确定两种抗体的可变区序列（德泰生物，南京），两种抗体的氨基酸序列信息见表1-a和表1-b。
表1-a 抗体15B11A8的序列信息
表1-b 抗体5D4A10的序列信息
1.2重组抗体15B11A8与5D11A8的制备与纯化
根据测序结果，将目的基因克隆至表达载体以制备重组抗体。经真核细胞表达，protein A亲和层析纯化，收获抗体纯度达到95%以上。
实施例2vWF片段检测方法及验证
2.1 vWF片段检测方法
2.1.1主要试剂及设备
主要仪器见表2：
表2
主要试剂见表3：
表3
本发明所使用的样品见表4：
表4
2.1.2检测步骤
用vWF Antibody 15Bl1A8包被酶标板4℃过夜，孵育结束洗涤三次后，37℃封闭90min。孵育结束，洗涤三次后，分别加入经过变性处理的vWF蛋白标准品、FVIII蛋白（待测样品），37℃孵育60 min。孵育结束，洗涤后向孔板中加入稀释的生物素标记的Fc Antibody（5D4A10-Biotin），37℃孵育60 min。孵育结束，再次洗涤三次后，加入稀释的StreptavidinHRP，37℃孵育60 min。孵育结束后进行洗板、显色、酶标仪检测。使用分析软件进行数据处理，以vWF蛋白标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，将样品的检测值代入标准曲线计算样品中vWF片段残留的含量。
2.2方法验证
2.2.1线性和范围
以6个标准品溶液浓度点（如0ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、1.50ng/mL、2.00ng/mL、2.50ng/mL）生成标准曲线（以标准品溶液浓度对其相应的OD值作四参数拟合，求得拟合方程）。线性数据和范围见表5：
表5线性和范围数据汇总
可接受标准：R2应 ≥ 0.950，曲线各浓度点OD值的CV应 ≤ 25%（≥ 0.50ng/mL)。
验证结果：R2均 ≥ 0.994，曲线各浓度点OD值的CV ≤ l4%（≥ 0.50ng/mL)。
2.2.2专属性
将样品用样品缓冲液稀释1000倍，取一定量的标准品溶液加入样品缓冲液，加标终浓度为1.00ng/mL，分别测定样品缓冲液和样品缓冲液的加标样品中的vWF浓度。假设样品缓冲液加标样品的vWF的浓度为C(ng/mL)，理论加标量为B(ng/mL)，加标前样品缓冲液（经稀释）中vWF的量A(ng/mL)，通过以下公式计算加标前样品缓冲液（经稀释）中vWF的量A=C-B。专属性结果见表6：
表6专属性结果汇总
注： ST Conc.05为标准品溶液浓度最低点。
可接受标准：样品缓冲液的检测值应不高于标准品溶液浓度最低点(0.50ng/mL)的检测值。
验证结果：样品缓冲液的检测值分别为0.22ng/mL，0.13ng/mL和0.02ng/mL, 标准品溶液浓度最低点(0.50ng/mL)的检测值分别为0.51ng/mL、0.52ng/mL、 0.47ng/mL，样品缓冲液的检测值均低于标准品溶液浓度最低点的检测值，该方法专属性验证结果符合可接受标准。
2.2.3定量限
检测标准品溶液浓度最低点(0.50ng/mL)样品。结果见表7：
表7定量限结果汇总
注：回收率＝样品检测值÷理论值×100%
可接受标准：样品的vWF残留浓度检测值应在最低点(0.50ng/mL)标示值的50%-150％之间(0.25ng/mL-0.75ng/mL)。
验证结果：定量限检测值在0.47ng/mL-0.52ng/mL之间，该方法的定量限验证结果符合可接受标准。
2.2.4精密度
2.2.4.1重复性
同一分析人员进行样品检测，重复性结果见表8：
表8重复性样品数据汇总
可接受标准：6份样品vWF残留浓度检测值RSD应 ≤ 25%。
验证结果：6份样品的vWF残留浓度检测值RSD为14%。该方法的精密度-重复性验证结果符合可接受标准。
2.2.4.2中间精密度
在同一实验室，由不同分析人员在不同日期进行了3次方法重复性实验，每次3个重复。结果见表9：
表9中间精密度样品数据汇总
可接受标准：不同人员间样品的vWF残留浓度检测值的RSD应 ≤ 25%。
验证结果：不同人员间样品的vWF残留浓度检测值的RSD为14%。该方法的精密度-中间精密度验证结果符合可接受标准。
2.2.5准确度
取一定量的标准品溶液加入样品，分别测定样品和加标样品中的vWF浓度。可使用同一份样品分别制备3份高、中、低3种不同加标浓度(l.50ng/mL、1.00ng/mL、0.50ng/mL)。设加标前样品（经稀释）中vWF的量为A(ng/mL)，加标后样品的vWF的量为C(ng/mL)，理论加标量为B(ng/mL)，通过公式(C-A)/B×100%，计算回收率。本发明在不同的时间，不同的分析人员进行了3次准确度的测试，每次3个重复。回收率见表10：
表10准确度样品数据汇总
可接受标准：样品加标回收率应在60%-140％之间。
验证结果：样品加标回收率在68%-138％之间，该方法的准确度验证结果符合可接受标准。
2.3验证评价和结论
专属性、准确度、精密度、定量限、线性和范围等关键项目所有的测试均顺利完成，并符合预订的接受标准。以上结果表明，该试剂盒可用于使用专利CN 111440820 B中的方法制备的多种重组凝血因子Ⅷ产品，比如猪FⅧ、犬FⅧ以及经改造的长效FⅧ产品等，用以控制重组FⅧ产品中的vWF片段的残留量。
实施例3 应用实施例
参照实施例的方法对专利CN 111440820 B制备的FVIII样本进行检测，检测样本信息见表11：
表11样品信息
标准曲线信息见表12：
表12标准曲线检测数据
vWF检测结果见表13：
表13样品检测实验数据
结果表明，FVIII样品中，vWF的浓度<15 ng/mL，vWF残留量<190 ppm。
Claims (10)
1.一种检测vWF片段残留的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括捕获抗体和检测抗体；
所述的捕获抗体为15B11A8，包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11；所述的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；
所述的检测抗体为5D4A10，包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；所述的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.14。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体固定至固相载体上；所述的检测抗体经生物素标记。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为酶标板。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括vWF蛋白标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的vWF为截短型vWF；所述的截短型vWF为vWF的D’D3区包含半胱氨酸突变。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的vWF的氨基酸序列为SEQ IDNO.19。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将捕获抗体包被固相载体；
S2、在固相载体中加入蛋白标准品和待测样品，孵育；
S3、弃掉固相载体中的蛋白标准品和待测样品，加入生物素标记的检测抗体，孵育；
S4、弃掉固相载体中的检测抗体，加入酶标亲和素，孵育；
S5、在固相载体中加入底物，孵育后加终止液；
S6、测定OD值。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，S2中的蛋白标准品经过变性缓冲液处理。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的变性缓冲液为Triton X-100与SDS的混合液。
10.一种检测vWF片段残留的方法，其特征在于，所述的方法通过权利要求1-9任一项所述的试剂盒进行检测。
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| 血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测方法的研究新进展;姚拾秀等;《国际检验医学杂志》(第15期);第81-84页 * |
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