CN1065729A - 单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

可与人脂蛋白(a)反应但与人血纤维蛋白溶酶原 及脱辅基蛋白B不表现有免疫交叉反应性的单克隆 抗体。可使用至少一种本发明的单克隆抗体，以免疫 比浊分析法定量分析临床样品中的人脂蛋白(a)。

Description

本发明涉及对人体脂蛋白（a）进行免疫比浊定量分析的单克隆抗体。
近年来，已经知道血清富胆固醇脂蛋白是引起包括心肌梗塞在内之动脉硬化性疾病的危险因子。其中脂蛋白（a）是引起动脉硬化的很重要的危险因子。目前正在对脂蛋白（a）进行大量的研究。
脂蛋白（a）含有作为特异性脱辅基蛋白的脱辅基蛋白（a），其结构中具有血液凝固或血纤维蛋白溶解系统蛋白质之特征的蛋白质结构。已知当血凝块产生时，其可表现出干扰血纤维蛋白溶解系统的活性。因此检测血液中的脂蛋白（a）对于在临床上确定动脉硬化性疾病是很重要的。
作为检测血液中脂蛋白的特征性方法，免疫检测法是人们通常熟知的。特别是免疫比浊定量分析法，因为它能够适于用自动分析仪进行自动化分析，并且可分析大批量样品，所以是一种常规检查中所使用的通用方法。在免疫比浊定量分析法中，由于在适于交联的蛋白质的两个或多个抗原决定基位点上同时偶联许多抗体而使脂蛋白（a）难于溶解，从而可对脂蛋白（a）进行免疫比浊分析。因此，一般都知道免疫比浊定量分析可应用于普通的多克隆抗体。但是为了得到多克隆抗体，每次都必须对所得抗原进行纯化。另外，所得多克隆抗体的反应活性也因被免疫动物的个体差异而有所变化。这样就难于每次都能准确地测定血液中的脂蛋白，而持久准确地检测脂蛋白对于病理学估计又是很重要的。
脱辅基蛋白（a）的氨基酸结构与血纤维蛋白溶酶原很相似，后者是一种以较高浓度存在于人血液中的蛋白质。因此，即使使用高度纯化的脱辅基蛋白（a）作免疫原由通常使用的实验动物体内制得抗血清，因为抗血清不可避免地与血纤维蛋白溶酶原发生交叉反应，从而不可能由使用这种抗血清的检测系统准确地测定脂蛋白（a）含量。
借助免疫吸附方法使引起交叉反应的化合物预先与抗血清反应，以便从抗血清中除去不必要的反应活性，是一种本技术领域中已知的从这样表现有交叉反应性的抗血清中得到只具有所需之反应活性的抗血清的方法。但由于作为脂蛋白（a）之特征性组分的脱辅基蛋白（a）与血纤维蛋白溶酶原在结构上有高度同源性，既使是脂蛋白（a）的靶反应性也会使吸附过程减弱。因此，该方法不适用于为在比较短的时间内检测目的化合物而要求抗体表现出强反应性的免疫比浊定量分析。既使勉强使用，它也只能提供极低的灵敏性。所以它不可能检测象人血液中那样的低含量脂蛋白（a）。
因此期望开发使用有高度特异性的但与血纤维蛋白溶酶原不表现有交叉反应性的单克隆抗体，进行持久准确的检测而且有高度可重复性的脂蛋白（a）分析方法。
然而，单克隆抗体的问题是它们只能特异地识别与之反应的抗原上的一种类型的抗原决定基。鉴于这种情况，既使反应完成了，由反应所产生的抗原-抗体产物也只是一个抗体分子与两个抗原分子的复合产物。为此，与用多克隆抗体所得产物相比，这样一个产物是极小的，而用多克隆抗体得到的是多个抗体的复合物并能识别许多各种不同的抗原决定基部位，而且这样的多克隆抗体可与多个抗原反应。因此由抗原与单克隆抗体反应所得到的产物不能用常规免疫浊度检测法检测到。可见，将免疫比浊分析法应用于一种类型的单克隆抗体是不可能的。
为此，对于使用单克隆抗体的免疫比浊法来说必须使用可识别混合物中不同抗原决定基部位的两种或多种类型的单克隆抗体。然而正如上面提到的，因为脱辅基蛋白（a）的结构与血纤维蛋白溶酶原十分相似，其特异性抗原决定基部位极其有限，所以就很难于得到大量能彼此协同作用以形成大分子抗原-抗体结合材料的特异性单克隆抗体。基于这些原因，一般认为以使用单克隆抗体的免疫比浊分析法检测人脂蛋白（a）是很困难的。没有一种单克隆抗体能适用于这样的免疫比浊分析法是本领域中已知的事实。
鉴于这种情况，本发明人已制备了大量与人脂蛋白（a）反应的单克隆抗体，以便不仅用常规酶免疫方法，而且还用免疫比浊方法研究它们的特性。结果，本发明人发现有几种与人血清脂蛋白（a）单独地发生特异性反应的单克隆抗体产生了能用常规分光光度计检测的结合产物。这一发现导致了本发明的完成。
因此，本发明的一个目的是提供可与人脂蛋白（a）反应但不表现与人血纤维蛋白溶酶原和脱辅基蛋白B有免疫交叉反应性的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供以至少使用一种所说的单克隆抗体的免疫比浊分析法检测人脂蛋白（a）的方法。
可根据下面的描述更清楚地了解本发明的其它目的、特征及优点。
图1是图解显示用Western吸印方法测出的抗脱辅基蛋白（a）、脱辅基蛋白B和人血纤维蛋白溶酶原之28205号单克隆抗体的反应性。
图2是用于以28205号单克隆抗体检测人脂蛋白（a）的标定曲线。
本发明的单克隆抗体特征在于它们对人脂蛋白（a）的特异反应性，即它们与人脂蛋白（a）反应，但不表现与人血纤维蛋白溶酶原及脱辅基蛋白B有免疫交叉反应性。这样的单克隆抗体包括那些单独使用或联合使用时与人脂蛋白（a）产生沉淀或混浊的抗体。
可使用人脂蛋白（a）作为免疫抗原，按照常规方法制备本发明的单克隆抗体。作为免疫抗原，用于制备单克隆抗体的人脂蛋白（a）是本发明人从人血清中分离并纯化的脂蛋白。在制备本发明的抗体时，脂蛋白（a）不一定要纯化，而可以使用含有脂蛋白（a）的粗制品。在一个制备本发明抗体的特定优选实施例中，将用脂蛋白（a）免疫的被转化的哺乳动物细胞与哺乳动物浆细胞瘤相融合，以产生杂交瘤。从杂交瘤中选择识别脂蛋白（a）的克隆。然后从该克隆中得到靶单克隆抗体。
上述方法中，对于用免疫抗原即脂蛋白（a）转化的哺乳动物细胞没有限制。需要考虑的是被选择的免疫抗原与参予融合之哺乳动物浆细胞瘤的相容性。一般较好是使用小鼠、大鼠等动物。
可按常规方法如通过静脉内或腹腔内途径给动物注射脂蛋白（a）来进行免疫。具体地讲，用PBS或生理盐水将脂蛋白（a）稀释到适当浓度，并连同适应的佐剂一起注射给动物，必要时可间隔2-21天重复注射几次直至总量达到1-100μl/动物。注射时可使用常规载体。脂蛋白（a）注射完成后3天从动物体内切除脾脏，分离脾细胞以用作免疫细胞。
可使用各种已知的骨髓瘤细胞作为与上述免疫细胞相融合的哺乳动物浆细胞瘤。例如这样的骨髓瘤细胞包括p3（p3/×63-Ag8）〔Nature，256，495-497（1975）〕、p3-U1〔Current  Topics  of  Microbiology  and  Immunology，81，1-7（1987）〕、NS-1〔Eur.J.Immunol.，6，511-519（1976）〕、MPC-11〔Cell，8，405-415（1976）〕、PS  2/0〔Nature，276，269-270（1978）〕、FO〔J.Immunol.Meth.，35，1-21（1980）〕、X63，6，5，3〔J.Immunol.，123，1548-1550（1979）〕、S194〔J.EXP.Med.，148，313-323（1978）〕以及大鼠的R  210〔Nature，277，131-133（1979）〕等。
可基本上按照已知方法如Milestein等人的方法〔Methods  Enzymol.，73，3-46（1981）〕，在普通营养培养基中，并在融合加速剂存在下完成免疫细胞与浆细胞瘤的融合。可使用聚乙二醇（PEG）、仙台病毒（HVJ）等常规融合加速剂，并可选择性地加入二甲基亚砜等佐剂来提高融合效率。免疫细胞与浆细胞瘤的融合比例可以是通常比例，如每个浆细胞瘤融合1-10个免疫细胞。作为融合的培养基，可使用适于培养浆细胞瘤的任何培养基，例如，PRMI1640培养基，MEM培养基，以及各种用于培养这种类型细胞的其他培养基。从胎牛血清（FCS）除去血清补体后所得到的血清即是一种典型的培养基。为进行融合，可彻底混合预定量的免疫细胞和浆细胞瘤，然后再使该混合物与加入了约30-60%（W/V）PEG（如平均分子量为1，000-6，000的PEG）并已逐渐加热到大约37℃的培养基混合。在HAT培养基中持续培养足以使杂交瘤以外细胞（如未融合的细胞）死亡的时间，通常是持续培养几天到几周。对所得杂交瘤进行常规有限稀释以检验产生抗体的靶细胞系，并使之单克隆化。
可按照通常用于检测抗体的标准方法〔Hybridoma  and  Monoclonal  Antibody，R  &  D  Planning  Co.，30-53，（1982）〕，如ELISA方法〔Engvall，E.，Methods  Enzymol.，70，419-439（1980）〕、噬斑法、点印迹法、凝集反应法、Ouchterlony方法以及放射免疫法（RIA）等方法检测抗体生成细胞系。期望使用上述脂蛋白（a）作为进行这一检测的抗原。
可在常规培养基中传代培养如此得到的产生靶单克隆抗体的杂交瘤，并可在液氮中长期保存之。
为了从杂交瘤中收集本发明的单克隆抗体，可按常规方法培养杂交瘤，并以上清液形式得到单克隆抗体，或者将此杂交瘤注入可对其增殖相容的哺乳动物体内，然后从腹水液中收集单克隆抗体。前一种方法适于制备高纯度的单克隆抗体，后一种方法则适于大量生产单克隆抗体。
可借助盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法纯化如此得到的单克隆抗体。
可借助酶免疫检测法（EIA）、火箭电泳法、免疫比浊法等常规免疫检测法，使用该单克隆抗体，以简单方式高度灵敏、准确而又特异地检测人脂蛋白（a）。其中较好的方法是免疫比浊法，因为该方法适于自动分析，而且可以一次检测大量样品。具体地说，可将一种或多种本发明的单克隆抗体加入到人血清、人血浆等样品中使之发生反应，并在反应前后分别测定吸光率变化以检测样品中脂蛋白（a）的含量。
可按本领域中已知的方法建立检测系统并修正和应用该系统。
因为本发明的单克隆抗体可与人脂蛋白（a）发生特异性反应，而且不表现与血纤维蛋白溶酶原及脱辅基蛋白B的免疫学交叉反应性，故可将它们用于免疫检测特别是免疫比浊法中以检测临床样品中的人脂蛋白（a），从而能够筛选各种心脏病并诊断疾病状况。
本发明的其他方面将在下列实施例的描述中变得更加明显，给出这些实施例是为了举例说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1：制备抗原
于室温下溶解实验开始前一直在-20℃保存的冻干血清，并用超离心法分离含大量脂蛋白（a）的部分（密度：1.06-1.12kg/L）。将这些部分加于100×2.6Cm  Sephallose  CL-6B柱上并在4℃下以8ml/小时的流速用含有0.15M  NaCl的0.1M  Tris缓冲液（pH7.4）洗脱，以收集各部分，每管收集5ml。因为首先洗脱的是高分子化合物，所以在这些条件下测280nm处吸收值时依次出现的是脂蛋白（a）、LDL（低密度脂蛋白）和HDL（高密度脂蛋白）峰。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析各部分，以收集只呈现与脂蛋白（a）相应的第一个峰的峰值部分，从而避免LDL的污染。将所得部分用作抗原溶液。
实施例2：制备抗人脂蛋白（a）抗体
用牛血清白蛋白溶液作为标准对照，以Lawry方法测定实施例1中制得之抗原溶液的蛋白质浓度。使蛋白质浓度相当于10μg的溶液与100μl完全弗氏佐剂彻底混合，并注射到BALB/C小鼠腹腔内。同时，作为加强免疫，将蛋白质浓度为10μg的上述溶液与不完全弗氏佐剂充分混合并经腹腔内注射两次，自第一次注射后每次间隔两周。末次注射后1周，将10μl抗原溶液与生理盐水混合并通过尾静脉注射。三天后切除脾脏分离脾细胞并用培养基（PRMI 1640）冲洗之。将如此制得的脾细胞（2.5×108）与已按同样方法用培养基充分洗过的SP2/OAg14小鼠骨髓瘤细胞（2.5×107）混合。将混合物（0.25ml）缓慢滴入培养基〔含50%PEG（w/v）〕中。混合1分钟后，缓慢加入8mlGKN培养基稀释PEG，以终止反应。将所得混合物离心（1，500rpm）5分钟，以收集细胞。用2ml培养基洗细胞并悬浮于30mlHAT培养基中。将0.1ml等分的细胞悬浮液接种到96孔微量滴定板的各小井内，并在8%CO2环境中于37℃保温10天。用0.2mlHT培养基（与HAT培养基相同，但不含氨基喋呤）置换各小井内的上清液。该过程重复3次后，检测最后得到的上清液中所含抗体的特性。检测中，适当稀释用于免疫的含脂蛋白（a）的抗原溶液并装满微量滴定板的各小井，以使之吸附到各小井表面上。加入上述上清液并保温，然后加入用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，以使用保留在小井内的过氧化物酶活性作为标准检测抗体活性。另外，用按常规方法从人血清中制得的血纤维蛋白溶酶原和LDL充满微量滴定板并使之吸附在小井表面上，用上述检测抗人脂蛋白（a）抗体活性的同样方法检测抗这些成分的抗体活性。通过这些操作选择只与人脂蛋白（a）反应的小井。用有限稀释法克隆这些小井内的细胞并对选择之小井的培养液重复进行两次抗体活性检测，最后得到6个能产生对人脂蛋白（a）有特异性之抗体的克隆。然后将这些克隆注射到已用姥鲛烷处理的BALB/C小鼠的腹腔内。10-20天后，分几次收集小鼠的腹水液，以从中得到单克隆抗体。检测该单克隆抗体的分类及亚类。结果示于表1中。以硫酸铵分级分离法并使用DEAE  Sephallose以离子交换层析法从腹水液中得到IgG粗制品。按下述方法针对上面分离的各部分来估计免疫比浊定量分析法的可行性。将20μl含有50mg/dl人脂蛋白（a）的血清与300μl含有3%PEG、0.15M  NaCl和3%葡聚糖的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）混合。将混合物保温5分钟以检测340nM处的吸光率。再向此混合物中加入浓度已调整到1mg/ml的150μlIgG粗制品，保温5分钟后测定340nm处的吸光率。由此最后得到的吸光率减去加入IgG部分（其加入量已根据反应混合物的量加以校正）之前的吸光率值，如此计算出因与人脂蛋白（a）反应而造成的吸光率增加。结果示于表2中，其中列出了几个由于与含人脂蛋白（a）的血清样品反应而呈现吸光率之特征性增加的克隆。其中，产生28205号单克隆抗体的克隆已保藏在Fermentation  Research  Institute，Agency  of  Industrial  Science  andTechnology（FERM  P-12114）。
表1
抗体编号  分类  类型
28203  G  r，K
28204  G  r，K
28205  G  r，K
28206  G  r，K
28207  G  r，K
28209  G  r，K
表2
抗体编号  吸光率
28203  0.020
28204  0.007
28205  0.053
28206  0.019
28207  0.007
28209  0.004
实施例3：证实抗脱辅基蛋白（a）单克隆抗体的特异性
为了证实抗脱辅基蛋白（a）单克隆抗体的特异性，用Western吸印法研究了经过筛选所得到的抗辅基蛋白（a）、脱辅基蛋白B及人血浆纤维蛋白溶酶原之单克隆抗体的反应活性。以脱辅基蛋白（a）、脱辅基蛋白B和血纤维蛋白溶酶原作为试验样品，使用4-20%SDS梯度聚丙烯酰胺凝胶对含有已在1mM巯基乙醇存在下用SDS修饰的人脂蛋白（a）的血清、用SDS修饰的纯化的LDL以及市售的血纤维蛋白溶酶原进行电泳分离。电泳后，使用转印装置以20V处理8小时，将凝胶中的蛋白质转印到硝化纤维素滤膜上。将膜浸入1%脱脂乳中封闭后，冲洗该膜并浸入浓度已调整到约14.2mg/dl的抗体溶液中，以进行抗原-抗体反应。彻底洗膜后，加入作为第二抗体的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体溶液。反应后，加入底物3，3′-二氨基联苯胺以显色。结果示于图1中，其中显示28205号单克隆抗体只与在滴有含人脂蛋白（a）之血清的泳道上的具有相当于脱辅基蛋白（a）之分子量的蛋白质反应，而在滴加LDL或血纤维蛋白溶酶原的泳道上未出现色带，从而证明28205号抗体显示有抗脱辅基蛋白（a）的特异性抗体活性。
实施例4：证实定量分析效果
用生理盐水稀释人脂蛋白（a）含量过高的待检血清样品，以制备一系列稀释的样品。每份20μl稀释的样品各加入350μl含有3%PEG、0.15M  NaCl和3%葡聚糖的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0），并将混合物保温5分钟以测定340nm处的吸光率。加入50μl浓度为0.6mg/dl的实施例2中制得的含有本发明之单克隆抗体的粗制IgG溶液后，将混合物保温5分钟以检测340nm处的吸光率。由最后测得的吸光率减去加入IgG部分（其加入量已根据混合物量加以校正）之前的吸光率值，算出与各不同浓度之人脂蛋白（a）相对应的吸光率。以这些吸光率值对标准样品中人脂蛋白浓度作图，得到一条有良好相关性的标定曲线。
该标定曲线如图2所示，它证明本发明的单克隆抗体可单独用于人脂蛋白（a）的免疫比浊分析。
显然，有可能根据上述教导对本发明作多方面的修改和变动。因此应明确的是，既使不完全按照本文的具体描述亦可实践本发明，而这些也应包括在本发明待批权利要求之内。

Claims (3)

1、与人脂蛋白(a)反应但与人血纤维蛋白溶酶原和脱辅基蛋白B不表现有免疫交叉反应性的单克隆抗体。
2、根据权利要求1的单克隆抗体，其可单独或联合用于人脂蛋白（a）的免疫比浊定量分析。
3、检测人脂蛋白（a）的方法，特征在于使样品与至少一种与人脂蛋白（a）反应但与人血纤维蛋白溶酶原和脱辅基蛋白B不表现有免疫交叉反应性的单克隆抗体反应，并检测所得反应混合物的吸光率。
CN92102038A 1991-03-25 1992-03-25 单克隆抗体 Pending CN1065729A (zh)

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