CN117487011A - 一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体及制备方法与应用，通过杂交瘤融合方案制备高特异性的鼠抗人Tg单克隆抗体，可以特异性识别Tg肽段，使其能够应用于基于使用液质联用质谱法的样品前处理过程，特异性富集样本中的Tg肽段，以进一步提高检测精确度。本发明为建立灵敏度高、稳定性好的Tg检测方法提供了新思路，提高了甲状腺癌症早期诊断与甲状腺相关疾病动态监测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
甲状腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)是一种大分子蛋白质，由数千个氨基酸残基组成。该蛋白主要由两个多肽亚基组成，每个亚基含有大约3000个氨基酸。这些氨基酸通过碘化和氧化反应，形成碘化酪氨酸(Monoiodotyrosine，MIT)和二碘酪氨酸(Diiodotyrosine，DIT)。MIT和DIT之间可以通过酪氨酸残基之间的碳碳键连接形成T3和T4，即甲状腺激素。
Tg的检测在甲状腺疾病的诊断和治疗过程中具有重要意义。首先，Tg可以作为甲状腺癌的标志物。术前和术后的Tg水平可以用来评估甲状腺癌的存在、肿瘤负荷和复发风险。在术后的监测中，Tg水平的升高可以表示癌细胞残留、转移或复发。其次，Tg的检测可以用于甲状腺功能评估。正常情况下，甲状腺激素合成和分泌过程中，Tg被完全消耗，血液中Tg的浓度较低。如果Tg水平升高，则可能表示甲状腺功能异常或甲状腺癌的存在。再次，自身免疫性甲状腺疾病(如Graves病和甲状腺自身免疫性疾病)也可能伴随着Tg的升高。所以建立灵敏度高、稳定性好的Tg检测方法尤其重要。
目前检测Tg含量的方法主要是酶联免疫吸附测定(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)、免疫化学发光法(Immuno Chemiluminometric Assay，ICMA)、放射免疫测定法(Radio Immuno Assay，RIA)质谱法等，其中ELISA、ICMA、RIA均基于三明治夹心(抗体-抗原-抗体)的方法，使用捕获抗体捕获Tg，再引入酶标记或者其他发光基团标记的检测抗体，最终对标记基团进行定量；而质谱法是一种利用分子质量和分子碎片的质量/电荷比进行分析的技术，可通过测量Tg在样品中的质量来确定其浓度，具有精确的测量能力。
目前的ELISA、ICMA、RIA均面临方法学问题，如标准化的差异、批间稳定性、精确度的变化性、钩状效应等，降低了临床上对肿瘤标志物Tg日常监测的准确性，影响对疾病进程的判断。而质谱法虽然测量精确度高，但对于样品的前处理要求较为苛刻。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体及其应用，通过杂交瘤融合方案制备一种高特异性的鼠抗人Tg单克隆抗体，可以特异性识别Tg肽段，使其能够应用于基于使用液质联用质谱法的样品前处理过程，特异性富集样本中的Tg肽段，以进一步提高检测精确度。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区包含：
CDR1：SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，
CDR2：SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，
CDR3：SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
FR1：SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，
FR2：SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，
FR3：SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，
FR4：SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；以及，
可变区：SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
CDR1：SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列，
CDR2：SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，
CDR3：SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列；
FR1：SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，
FR2：SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列，
FR3：SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，
FR4：SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；以及，
可变区：SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选方案，所述重链可变区包含：
CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，
CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；以及，
可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
作为本发明的一种优选方案，所述轻链可变区包含：
CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，
CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，
CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，
FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，
FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，
FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；以及，
可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。
本发明还提供了上述抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法为对小鼠进行多次Tg肽段免疫，待小鼠血清效价达到融合标准时，取小鼠脾脏得到脾细胞后与SP2/0进行PEG融合，对杂交瘤细胞进行筛选与亚克隆，通过腹水制备抗体小样，纯化后得到抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体。
作为本发明的一种优选方案，所述制备方法包括以下步骤：
1)抗原的选择；
2)抗原的免疫：使用抗原免疫小鼠，五次免疫；
3)小鼠脾细胞与SP2/0的融合：取五次免疫后小鼠的脾脏制备成B细胞悬液，将SP2/0细胞悬液与B细胞悬液混合，离心去上清，将PEG加入到细胞沉淀中，搅匀，静置后加入无血清培养基，离心去上清后的沉淀加入至筛选培养基中，置于二氧化碳培养箱培养；
4)杂交瘤的筛选与亚克隆：使用抗原通过ELISA法检测细胞上清，并进行有限稀释法亚克隆，最终阳性率大于98％即为稳定的单克隆细胞株；
5)单克隆抗体腹水的制备与纯化：预刺激小鼠腹腔，7-10天后注射杂交瘤细胞株，每株细胞注射5只小鼠，7-14天内收集小鼠腹水，用辛酸沉淀预处理后，使用Protein G与Protein A凝胶进行亲和纯化，超滤至PBS缓冲液中，得到抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗原为为Tg氨基酸序列的1003aa-1032aa。
作为本发明的一种优选方案，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，筛选培养基配方为1640培养基，10％FBS，10％克隆生长因子，2％HAT与1％P/S配制得到。
本发明还提供了上述抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体在免疫检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明通过杂交瘤融合方式筛选得到了一株抗Tg单克隆抗体，该抗体可以特异性识别Tg肽段，可在LC-MS检测平台样品前处理阶段高效的、特异性的富集样品中的Tg肽段。
2)本发明为建立灵敏度高、稳定性好的Tg检测方法提供了新思路，提高了甲状腺癌症早期诊断与甲状腺相关疾病动态监测的准确性。
3)本发明从免疫学角度，通过杂交瘤融合方案制备高特异性的鼠抗人Tg单克隆抗体，可以特异性识别Tg肽段，使其能够应用于基于使用液质联用质谱法的样品前处理过程，特异性富集样本中的Tg肽段，以进一步提高检测精确度。
附图说明
图1是空白对照质谱图。
图2是单克隆抗体4-2的质谱图。
图3是单克隆抗体7-4的质谱图。
图4是单克隆抗体55-4的质谱图。
图5是富集效果对比图。
图6是空白对照+1ng/mL(稀释于含有25％正常人血清的PBS)质谱图。
图7是单克隆抗体7-4+1ng/mL(稀释于含有25％正常人血清的PBS)质谱图。
图8是富集对比图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
单克隆抗体的制备与鉴定：
1)抗原的选择
抗原为Tg氨基酸序列的1003aa-1032aa，序列为：FYQRRRFSPDDSAGASALLRSGPYMPQCDA(SEQ ID NO.1)；
2)抗原的免疫与效价检测
使用抗原免疫4只4-6周龄的Balb/c小鼠，首次免疫使用弗氏完全佐剂与抗原等比混匀后乳化，以100μg/只的抗原量、0.5mL/只的体积量进行免疫，采用大腿内侧肌肉注射和背部皮下多点注射法；14天后进行第二次免疫，改为弗氏不完全佐剂与抗原乳化，注射量与注射方法与首次免疫相同；14天后进行第三次免疫，使用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释抗原，注射量与前两次免疫相同，同时改为腹腔免疫；14天后进行第四次免疫，方法与第三次相同。
第五次免疫10天后采血进行血清效价检测，采用间接ELISA法，将抗原以100μg/mL，50μl/孔包被酶标板，4℃过夜包被后PBST(含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗1次，1％BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)37℃封闭1小时，PBST洗1次，将小鼠血清分别稀释1:100倍、1:400倍、1:1600倍、1:6400倍、1:25600倍、1:102400倍、1:409600倍，同时加入空白对照，37℃孵育30min(分钟)，PBST洗5次，加入稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)，37℃孵育30min后，PBST洗5次后TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)显色液显色，最终OD450nm结果见表1：
表1.OD450nm结果
由表1可见，4号小鼠效价最高，大于1:409600倍，所以选择4号小鼠进行融合。
3)小鼠脾细胞与SP2/0的融合
4号Balb/c小鼠在融合的前72小时前进行最后一次冲击免疫，融合前麻醉后处死，浸泡于75％乙醇15min后将小鼠转移至生物安全柜中的无菌解剖台上，打开小鼠腹腔后取出脾脏，置于无菌培养皿中，使用无血清培养基冲洗5次后，加入20mL无血清培养基并反复挤压脾脏制备为B细胞悬液，最后过筛后置于离心管中备用；将SP2/0细胞收集至离心管中，计数后均吸取个细胞至新的离心管中，使用无血清培养基洗2次后备用；将B细胞和SP2/0细胞混合，混合后离心并弃去上清，将细胞沉淀拍散后分别加入1mL PEG，在1min内缓慢加入，轻轻搅匀，静置1min后缓慢加入无血清培养基以终止融合，1500rpm离心5min，弃去上清后加入至筛选培养基中，筛选培养基配方为1640培养基+10％FBS+10％克隆生长因子+2％HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine选择培养基)+1％P/S，置于二氧化碳培养箱培养。
4)杂交瘤的筛选与亚克隆
10天后使用抗原通过ELISA法检测细胞上清：将细胞板中所有孔的细胞上清分别吸至酶标板中，孵育30min，PBST洗板5次后加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗，再次孵育30min后洗板5次，加入TMB底物显色10min后终止。读取OD450nm后将ELISA检测阳性的细胞扩大培养，同时将筛选培养基中的HAT换为HT(Hypoxanthine-Thymidine培养基)。
培养2天后对已扩大的阳性孔进行二次ELISA检测，将转阴的孔弃去，并将仍然为阳性的孔进行有限稀释法亚克隆：将阳性孔中的细胞进行计数，最终吸取100-150个细胞混匀后加入至每块96孔细胞培养板中，培养10天后在倒置显微镜下挑选单个细胞团的孔进行ELISA检测，阳性孔再次亚克隆，培养10天后整板检测，阳性率大于98％的即为获得稳定的单克隆细胞株。
共获得3株鼠抗单克隆抗体3株，分别命名为：4-2、7-4、55-4。
5)单克隆抗体腹水的制备与纯化
小鼠首先进行石蜡油注射，预刺激小鼠腹腔，7-10天后注射杂交瘤细胞株，每株细胞注射5只小鼠，7-14天内收集小鼠腹水，用辛酸沉淀预处理后，选择Cytiva公司的ProteinG与Protein A凝胶进行亲和纯化，最终超滤至PBS缓冲液中，测定浓度后-20℃保存。
6)单克隆抗体的效价与交叉性鉴定
将抗原分别包被酶标板，进行间接ELISA法检测，将纯化后的3株单克隆抗体分别稀释至4.00μg/mL、1.33μg/mL、0.44μg/mL、0.15μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL，同时加入空白对照，37℃孵育30min(分钟)，PBST(含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗5次，加入稀释至工作浓度的羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)，37℃孵育30min后，PBST洗5次后TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)显色液显色，最终OD450nm结果见表2：
表2.OD450nm结果
7)单克隆抗体7-4亚型鉴定
使用福因德科技有限公司的小鼠单抗Ig类亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体7-4，其重链亚型为IgG1，轻链亚型为Kappa。
8)单克隆抗体7-4重轻链可变区序列的测定
取单克隆抗体7-4的细胞，用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit提取细胞总RNA，通过反转录获得cDNA，并使用高保真酶进行PCR扩增，分别得到重链和轻链的可变区片段，将其进行核酸电泳后，选择单一条带进行切胶回收，连接T载体后送测序，即得到重轻链可变区基因序列。
7-4重轻链可变区基因序列表见表3。
表3.7-4重轻链可变区基因序列
实施例2
单克隆抗体7-4在LC-MS检测平台的应用：
1)同时对比4-2、7-4、55-4单克隆抗体在LC-MS平台样品前处理时富集效果，具体实验过程如下：
将4-2、7-4、55-4分别与磁珠偶联，之后分别加入等体积稀释于PBS的浓度为1ng/mL的抗原进行孵育，模拟样品前处理过程，最后将磁珠分离后取上清进行LC-MS上机检测，最终得到结果见表4，图1，图2，图3，图4与图5。
表4.不同单克隆抗体的质谱信号
参见表4，图1，图2，图3，图4与图5，可以看出4-2和7-4这2株单克隆抗体具有富集Tg的效果，其中7-4这株富集效果最好。
2)鉴定该抗体在前处理平台中是否存在基质效应：
由于人血清成分复杂，极易造成检测平台的基质效应，所以在前处理稀释液中加入25％血清，模拟真实血清检测体系，确认7-4单抗是否能够在真实样本检测前处理中保持稳定的富集效果：
将7-4与磁珠偶联，之后加入稀释于含有25％正常人血清的PBS浓度为1ng/mL的抗原，模拟样品前处理过程，同时对比2种方法，最后将磁珠分离后取上清进行LC-MS上机检测，最终得到表5，图6，图7与图8。
表5.单克隆抗体7-4与空白组的质谱信号
| 样品 | 峰面积(信号) |
| 空白对照+1ng/mL抗原(+25％正常人血清) | 44.375 |
| 7-4+1ng/mL抗原(+25％正常人血清) | 47863.148 |
参见表5，图6，图7与图8，可以看出7-4这株单克隆抗体在富集Tg使时几乎不会被血清中的复杂物质影响，几乎没有基质效应。
本发明通过杂交瘤融合方式筛选得到了一株抗Tg单克隆抗体，该抗体可以特异性识别Tg肽段，可在LC-MS检测平台样品前处理阶段高效的、特异性的富集样品中的Tg肽段，为建立灵敏度高、稳定性好的Tg检测方法提供了新思路，提高了甲状腺癌症早期诊断与甲状腺相关疾病动态监测的准确性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区包含：
CDR1：SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，
CDR2：SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，
CDR3：SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；
FR1：SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，
FR2：SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，
FR3：SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，
FR4：SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；以及，
可变区：SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
CDR1：SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，
CDR2：SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列，
CDR3：SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列；
FR1：SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，
FR2：SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列，
FR3：SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列，
FR4：SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列；以及，
可变区：SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包含：
CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，
CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，
FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，
FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；以及，
可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
3.根据权利要求1所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含：
CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
FR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
FR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，
FR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，
FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；以及，
可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法为对小鼠进行多次Tg肽段免疫，待小鼠血清效价达到融合标准时，取小鼠脾脏得到脾细胞后与SP2/0进行PEG融合，对杂交瘤细胞进行筛选与亚克隆，通过腹水制备抗体小样，纯化后得到抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)抗原的选择；
2)抗原的免疫：使用抗原免疫小鼠，五次免疫；
3)小鼠脾细胞与SP2/0的融合：取五次免疫后小鼠的脾脏制备成B细胞悬液，将SP2/0细胞悬液与B细胞悬液混合，离心去上清，将PEG加入到细胞沉淀中，搅匀，静置后加入无血清培养基，离心去上清后的沉淀加入至筛选培养基中，置于二氧化碳培养箱培养；
4)杂交瘤的筛选与亚克隆：使用抗原通过ELISA法检测细胞上清，并进行有限稀释法亚克隆，最终阳性率大于98％即为稳定的单克隆细胞株；
5)单克隆抗体腹水的制备与纯化：预刺激小鼠腹腔，7-10天后注射杂交瘤细胞株，每株细胞注射5只小鼠，7-14天内收集小鼠腹水，用辛酸沉淀预处理后，使用Protein G与Protein A凝胶进行亲和纯化，超滤至PBS缓冲液中，得到抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原为为Tg氨基酸序列的1003aa-1032aa。
7.根据权利要求5所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求5所述的一种抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤3)中，筛选培养基配方为1640培养基，10％FBS，10％克隆生长因子，2％HAT与1％P/S配制得到。
9.一种如权利要求1-3任一项所述的抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述抗人甲状腺球蛋白的单克隆抗体在免疫检测中的应用。
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