CN103604930B - 一种脂蛋白(a)检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂蛋白(a)检测试剂盒,其特征在于,由试剂1、试剂2和工作校准液组成。试剂1由缓冲液、BSA、表面活性剂、羊IgG和NaN3组成,试剂2由缓冲液、脂蛋白(a)单抗胶乳微球、BSA、表面活性剂、羊IgG、稳定剂和NaN3组成。可应用于全自动生化分析仪上,检测结果准确性强,与不同人群不同大小的脂蛋白(a)绝对浓度有良好的可比性;与纤溶酶原没有交叉反应、不受类风湿因子干扰、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广,而且仅需要脂蛋白(a)的一株单抗,节省了试剂盒制备的成本和时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂蛋白(a)检测试剂盒。
背景技术
脂蛋白(a)是一种与LDL(低密度脂蛋白)结构相近的人体血清中的蛋白,密度介于HDL(高密度脂蛋白)与LDL之间。脂蛋白(a)核心部分为中性脂质和apoB-100分子,其外围包绕着亲水性的apo(a),二者以二硫键共价连接;其中apo(a)是高度糖化的亲水性蛋白质,肽链长度很不一致,分子大小呈明显多态性。对apo(a)cDNA的分析发现,apo(a)属于纤溶酶原基因超家族,与纤溶酶原有高度同源性。与纤溶酶原类似,apo(a)含有一个羧基端蛋白酶样结构域和一个Kringle结构域,尽管apo(a)的蛋白酶结构域与纤溶酶原85%同源,却没有催化活性,所以脂蛋白(a)可以竞争性干扰纤溶酶原的生理功能。纤溶酶原分子中有5种Kringle(分别命名为K1、K2、K3、K4、K5,各一个),apo(a)中只有一个K5(与纤溶酶原的K5同源85%)和若干个K4(与纤溶酶原K4同源78%-88%),所以apo(a)的多克隆抗体难免与纤溶酶原有交叉反应。
由于apo(a)大小不均一性,脂蛋白(a)含十几个至50多个的K4,使apo(a)占脂蛋白(a)分子的百分比从27%到51%不等。目前临床实验室常用的免疫比浊法所用的单抗或多抗主要作用于K4,导致对不同大小脂蛋白(a)的检测产生较大的偏差。
大量的流行病学和临床研究表明,脂蛋白(a)在不同人群的血液中差异很大,不同个体间脂蛋白(a)的水平可相差100倍。但在同一个体血清中浓度相对稳定,除遗传因素外,几乎不受年龄、性别、吸烟、饮食、脂代谢、药物、环境等因素的影响。因此脂蛋白(a)是一种比较稳定的生物标记物。血清中高浓度的Lpa是动脉硬化和心脏疾病危险程度的指标。血浆脂蛋白(a)升高与多种心血管疾病,包括外周血管病、脑血管病、早发冠心病和糖尿病血管并发症等有关。脂蛋白(a)浓度超过30mg/dL时,通常患心脏疾病的危险性比正常人高2倍。
目前,脂蛋白(a)的检测方法有:放射免疫法、ELISA法、免疫比浊法和脂蛋白(a)-胆固醇法等,其中放射免疫法因其存在放射性污染而已渐被市场淘汰;酶联免疫法自动化程度不高,且受人为因素影响较大;脂蛋白(a)-胆固醇法是近年来兴起的一种方法,优点在于可避免免疫测定法中因apo(a)多态性给Lp(a)测定带来的难题,缺点是方法操作复杂,需要用超速离心或其它方法从血浆中分离出脂蛋白(a),然后再用胆固醇酶法检测脂蛋白(a),因此难以得到广泛应用;免疫比浊法与其它方法相比,优点是简便快速、灵敏可靠,不需要从血浆中分离出脂蛋白(a),可直接用于自动或半自动生化分析仪,有较大应用范围,市场前景良好,缺点是对不同大小的apo(a)分子检测偏差较大,与纤溶酶原有交叉反应,易受类风湿因子干扰。因此,找到一种既能够避免检测偏差又操作简便的检测方法是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提出一种应用于免疫比浊法的脂蛋白(a)检测试剂盒,解决免疫比浊法对不同大小的apo(a)分子检测偏差较大、与纤溶酶原有交叉反应以及易受类风湿因子干扰的问题。
基于上述目的本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒由试剂1、试剂2和工作校准液组成:
其中试剂1的组分为(各组分的百分比为质量浓度百分比):
试剂2的组分为(各组分的百分比为质量浓度百分比):
工作校准液(各组分的百分比为质量浓度百分比)
优选的试剂1、试剂2和工作校准液的组分分别为:
试剂1:(各组分的百分比为质量浓度百分比)
试剂2:(各组分的百分比为质量浓度百分比)
工作校准液(各组分的百分比为质量浓度百分比)
本发明的脂蛋白(a)检测试剂盒的试剂1选用pH6.0-9.0的缓冲液,选自PBS缓冲液、GOOD’S缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种。表面活性剂有利于样本中各种物质的溶解,减少样本脂浊对测定结果的影响,可以选用Tween20(吐温-20)、TritonX-100等非离子型表面活性剂。IgG可以消除非特异性干扰和类风湿因子干扰,可以选自羊IgG、鼠IgG和兔IgG中的一种。
试剂2选用pH7.0-9.0的缓冲液,有利于脂蛋白(a)单抗胶乳微球的稳定性,选自PBS缓冲液、GOOD’S缓冲液、Tris-HCl缓冲液和硼酸缓冲液中的一种。表面活性剂有利于试剂中脂蛋白(a)单抗胶乳微球的稳定性,可以选用Tween20、TritonX-100等非离子型表面活性剂。稳定剂有利于试剂中脂蛋白(a)单抗胶乳微球的稳定性,可以选用蔗糖、甘油、乙二醇或PEG20000等。IgG可以消除非特异性干扰和类风湿因子干扰,可以选自羊IgG、鼠IgG和兔IgG中的一种。
工作校准液的缓冲液选自PBS缓冲液、GOOD’S缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种。稳定剂有利于脂蛋白(a)稳定性,可以选用蔗糖、甘油、乙二醇或PEG20000等。
脂蛋白(a)单抗胶乳微球的制备方法如下:
1)用50mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释单抗至1mg/ml。
2)用MES缓冲液(10mMpH5.0)稀释100nm胶乳微球至质量浓度为2%,共400μl。
3)用MES缓冲液(10mMpH5.0)分别配制EDC(2mg/ml)400μl,NHS(2mg/ml)400μl。
4)向胶乳微球溶液中逐滴加入300μlEDC溶液,然后逐滴加入300μlNHS溶液,室温搅拌15min。
5)将活化的微球和单抗混合,室温搅拌2小时。
6)反应后离心,去上清,沉淀用6ml试剂2缓冲液重悬,超声分散。
本发明公开的脂蛋白(a)检测试剂盒,采用的测定方法为两点终点法,温度为37℃,反应方向向上,样本:试剂1:试剂2为2:180:60,测定主/副波长为600/none,取180μl试剂1加入2μl样本或校准后37℃稳定孵育250秒,然后加入60μl试剂2继续孵育50秒,记录吸光度值A1,再继续反应300秒后记录吸光度值A2。
计算方法:ΔA=A2-A1
脂蛋白(a)浓度=(ΔA样本/ΔA校准)×校准液浓度
本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒可应用于全自动生化分析仪上,检测结果准确性强,与不同人群不同大小的脂蛋白(a)绝对浓度有良好的可比性;与纤溶酶原没有交叉反应、不受类风湿因子干扰、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广,而且仅需要脂蛋白(a)的一株单抗,节省了试剂盒制备的成本和时间。
附图说明
图1为本发明实施例2根据两点终点法测定结果绘制的标准曲线图;
图2为本发明的脂蛋白(a)检测试剂盒与脂蛋白(a)-胆固醇法测定值的相关性图;
图3为现有技术的脂蛋白(a)检测试剂盒与脂蛋白(a)-胆固醇法测定值的相关性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
实施例1
脂蛋白(a)检测试剂盒的制备
试剂1为:
试剂2为:
脂蛋白(a)单抗胶乳微球的制备
1)用50mMHEPES缓冲液(pH7.5)稀释单抗至1mg/ml。
2)用MES缓冲液(10mMpH5.0)稀释100nm胶乳微球至质量浓度为2%,共400μl。
3)用MES缓冲液(10mMpH5.0)分别配制EDC(2mg/ml)400μl,NHS(2mg/ml)400μl。
4)向胶乳微球溶液中逐滴加入300μlEDC溶液,然后逐滴加入300μlNHS溶液,室温搅拌15min。
5)将活化的微球和单抗混合,室温搅拌2小时。
6)反应后离心,去上清,沉淀用6ml试剂2缓冲液重悬,超声分散。
工作校准液为:
下述实施例2-6所采用的本试剂为实施例1制备的试剂盒,不含IgG的本试剂即为没有添加羊IgG的试剂,其他组分的量和比例不变。
实施例2
本发明脂蛋白(a)检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线
采用的测定方法为两点终点法,温度为37℃,反应方向向上,样本:试剂1:试剂2为2:180:60,测定主/副波长为600/none,取180μl试剂1加入2μl样本或校准后37℃稳定孵育250秒,然后加入60μl试剂2继续孵育50秒,记录吸光度值A1,再继续反应300秒后记录吸光度值A2。ΔA=A2-A1
以标准品的浓度为横坐标,相应的ΔA为纵坐标,采用Spline非线性拟合,绘制标准曲线如图1。
实验结果表明:标准曲线为一条直线,说明在样本浓度为0-100mg/dl范围内没有前带和后带现象。
实施例3
由于目前常用的免疫比浊法检测脂蛋白(a)所用的抗体主要作用于K4,对不同大小的apo(a)分子检测偏差较大。脂蛋白(a)-胆固醇测定法可以克服由于apo(a)分子的多态性导致的偏差较大的问题。本发明以脂蛋白(a)-胆固醇测定法(超速离心-琼脂糖凝胶电泳法)为参照,分别比较本发明实施例1制备的脂蛋白(a)检测试剂盒和同类产品与脂蛋白(a)-胆固醇测值的相关性。现有技术中的同类产品为德赛诊断系统有限公司(DiaSysDiagnosticSystemsGmbH)生产的脂蛋白(a)测定试剂盒,测定方法为颗粒增强型免疫透射比浊方法。脂蛋白(a)-胆固醇检测试剂盒为北京利德曼生化股份有限公司研发生产的脂蛋白胆固醇检测试剂盒。相关性测定结果见表1、图2和图3。
表1:相关性测值数据
脂蛋白(a)-胆固醇 | 本试剂盒 | 同类产品 | |
nmol/L | mg/dL | mg/dL | |
样本1 | 14.8 | 8.93 | 6.22 |
样本2 | 26.2 | 16.05 | 14.82 |
样本3 | 17.8 | 13.72 | 11.45 |
样本4 | 11.3 | 7.11 | 5.67 |
样本5 | 13.1 | 6.93 | 7.65 |
样本6 | 52.4 | 35.99 | 24.47 |
样本7 | 4.01 | 2.09 | 0.47 |
样本8 | 36.2 | 21.27 | 27.74 |
样本9 | 30.6 | 19.89 | 14.06 |
样本10 | 150.7 | 89.7 | 140.1 |
样本11 | 215.8 | 149.23 | 234.63 |
样本12 | 79.8 | 54.91 | 84.69 |
样本13 | 86.3 | 60.34 | 96.11 |
样本14 | 69.6 | 51.38 | 67.64 |
样本15 | 90.5 | 59.92 | 102.65 |
样本16 | 107.3 | 66.96 | 108.76 |
样本17 | 175.4 | 117.59 | 139.4 |
样本18 | 133.3 | 85.45 | 93.98 |
样本19 | 178.8 | 123.33 | 153.6 |
实验结果表明:本发明的脂蛋白(a)试剂盒与脂蛋白(a)-胆固醇法的相关性为y=0.6721x-0.7013R2=0.9930;现有技术的试剂与脂蛋白(a)-胆固醇法的相关性为y=0.9788x-6.7431R2=0.9453。本发明的试剂与脂蛋白(a)-胆固醇法具有良好的相关性。
实施例4
在同一份人血浆样本中分别加入不同浓度的纤溶酶原(10、20、40、80、160、320mg/dl),本发明的脂蛋白(a)试剂盒分别检测各样本中脂蛋白(a)的浓度,与空白对照组相比,计算偏差(偏差绝对值≤10%,为对测值无影响),并与现有技术中的同类产品作对比。同类产品为德赛诊断系统有限公司(DiaSysDiagnosticSystemsGmbH)的脂蛋白(a)测定试剂盒,测定方法为颗粒增强型免疫透射比浊方法。表2中每一组测定值下方的数值为与空白对照组的偏差。
表2:抗纤溶酶原干扰实验
实验结果表明:本发明的脂蛋白(a)试剂盒在纤溶酶原≤320mg/dl时对测值没有影响,现有技术仅在纤溶酶原≤10mg/dl时对测值没有影响,本发明去除羊IgG的试剂仅在纤溶酶原≤20mg/dl时对测值没有影响。
实施例5
在同一份人血浆样本中分别加入不同浓度的类风湿因子(100、200、400、800、1000IU/ml),本发明的脂蛋白(a)试剂盒分别检测各样本中脂蛋白(a)的浓度,与空白对照组相比,计算偏差(偏差绝对值≤10%,为对测值无影响)。并与现有技术中同类产品作对比。同类产品为德赛诊断系统有限公司(DiaSysDiagnosticSystemsGmbH)的脂蛋白(a)测定试剂盒,测定方法为颗粒增强型免疫透射比浊方法。表3中每一组测定值下方的数值为与空白对照组的偏差。
表3:抗类风湿因子干扰实验
实验结果表明:本发明的试剂类风湿因子≤1000IU/ml对测值没有影响,现有技术和不添加羊IgG的本发明试剂仅在类风湿因子≤400IU/ml对测值没有影响。
实施例6
本发明脂蛋白(a)试剂盒的各项性能评价
1、线性实验:将脂蛋白(a)高值样本做倍比稀释,每个浓度测3次,求平均值,与理论浓度相比较,计算线性偏差,见表4。实验结果表明:本发明试剂盒的最高检测范围可达到108mg/dl,相关系数R2=0.9994,回归方程y=108.2514x-0.7433,绝对偏差和相对偏差都较小,说明本发明试剂盒线性较好。
表4:本发明试剂盒的线性
2、精密度:用本发明试剂盒分别检测脂蛋白(a)低值、中值和高值样本,每个样本重复测定15次,计算变异系数(CV)。实验结果表明:低值、中值和高值样本的CV分别为3.88%,1.42%,1.51%,均小于4%,说明本发明试剂盒精密度较好。
表5:本发明试剂盒的精密度
3、抗干扰:在同一份人血浆样本中分别加入不同浓度的抗干扰物,分别检测各样本中脂蛋白(a)的浓度,与空白对照相比,计算偏差(偏差绝对值≤10%,为对测值无影响)。实验结果表明:加入不同浓度的干扰物后,检测结果偏差均≤10%,说明样本中胆红素≤200umol/L,Vc≤0.5g/L、血红蛋白≤5g/L、乳糜≤0.3%,肝素钠≤100IU,不会对测定结果造成影响。
表6:本发明试剂盒的抗干扰
4、稳定性:在2-8℃条件下,每隔2个月分别测脂蛋白(a)中值和高值样本3次,共测12个月,计算偏差。实验结果表明:本发明试剂盒在2-8℃条件下放置12个月,测值偏差均小于5%,说明本发明试剂盒在2-8℃条件下可以稳定放置12个月。
表7:2-8℃实时稳定性
从上述分析可以看出,本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒可应用于全自动生化分析仪上,检测结果准确性强,与不同人群不同大小的脂蛋白(a)绝对浓度有良好的可比性;与纤溶酶原没有交叉反应、不受类风湿因子干扰、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广,而且仅需要脂蛋白(a)的一株单抗,节省了试剂盒制备的成本和时间。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种脂蛋白(a)检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒由试剂1、试剂2和工作校准液组成,其中:
所述试剂1由PBS缓冲液、BSA、吐温-20、羊IgG和NaN3组成;所述PBS缓冲液的pH值为7.0;所述BSA的质量百分比为0.5%;所述吐温-20的质量百分比为0.1%;所述羊IgG的质量百分比为1%;所述NaN3的质量百分比为0.1%;
所述试剂2由PBS缓冲液、脂蛋白(a)单抗胶乳微球、BSA、吐温-20、羊IgG、蔗糖和NaN3组成;所述PBS缓冲液的pH值为7.0;所述脂蛋白(a)单抗胶乳微球的质量百分比为0.2%;所述BSA的质量百分比为0.2%;所述吐温-20的质量百分比为0.1%;所述羊IgG的质量百分比为1%;所述蔗糖的质量百分比为2.0%;所述NaN3的质量百分比为0.1%;
所述工作校准液由Tris-HCl缓冲液、脂蛋白(a)、NaCl、蔗糖、BSA、EDTA和NaN3组成;所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0;所述脂蛋白(a)浓度为100mg/dl;所述NaCl的量为150mM;所述蔗糖的质量百分比为5.0%;所述BSA的质量百分比为1.0%;所述EDTA的量为10mM;所述NaN3的质量浓度百分比为0.1%。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒,其特征在于,所述脂蛋白(a)单抗胶乳微球的制备方法为:
1)用50mM的HEPESpH7.5缓冲液稀释单抗至1mg/ml;
2)用10mM的MESpH5.0缓冲液稀释100nm胶乳微球至质量浓度为2%,共400μl;
3)用10mM的MES缓冲液pH5.0分别配制2mg/ml的EDC400μl,2mg/ml的NHS400μl;
4)向胶乳微球溶液中逐滴加入300μlEDC溶液,然后逐滴加入300μlNHS溶液,室温搅拌15min;
5)将活化的微球和单抗混合,室温搅拌2小时;
6)反应后离心,去上清,沉淀用6ml试剂2缓冲液重悬,超声分散。
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