CN113049834B - 胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂,包括试剂1和试剂2,所述试剂1为pH值为7.5的缓冲液,试剂2为包被有动物抗人CysC抗体的乳胶微球分散液,其特征在于:所述乳胶微球还包被有对应动物的Normal IgG,所述Normal IgG在抗体系统中占比30%‑60%。本发明在抗体体系中添加一定比例的Normal IgG,达到在调整反应曲线,保证试剂灵敏度和/或延展性的基础上,还能确保样本测值准确性的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂,属于医学免疫领域。
背景技术
胱抑素C(CysC):也称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、γ-微量蛋白或γ-后球蛋白,广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中,是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质,分子量为13.3KDa,由122个氨基酸残基组成,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定。CysC血清浓度与肾功能损害程度高度相关,能够准确反映人体GFR的变化,是评估肾功能的一个重要指标。
免疫比浊法是目前检测CysC最主流的方法。在测定过程中,若所用抗原抗体反应速率过快时会导致试剂延展性不好,需要调整反应曲线至试剂兼顾灵敏度及延展性。为达到上述目的,通常单独或配合使用以下三种方法:一是降低抗体使用量,二是调试试剂2的粒子浓度,三是调整试剂在生化仪上计算吸光度差值的读点。但通过上述方法进行的调试通常会影响样本测值(尤其是高浓度范围),导致试剂整体相关性变差(slope升高或降低,r降低)。
发明内容
本发明的目的是提供一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂,通过在乳胶微球上连接一定比例的Normal IgG,达到在调整反应曲线,保证试剂灵敏度和/或延展性的基础上,还能确保样本测值准确性的目的。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂,包括试剂1和试剂2,所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液,试剂2为包被有动物抗人CysC抗体的乳胶微球分散液,其特征在于:所述乳胶微球还包被有对应动物的Normal IgG,所述Normal IgG在抗体系统中占比30%-60%,Normal IgG在抗体系统中占比30%-60%是指Normal IgG占所有抗体重量的30-60%。
优选的,所述Normal IgG为正常未免疫兔的IgG,所述CysC抗体为兔抗人CysC抗体。
优选的,所述Normal IgG为正常未免疫山羊的IgG,所述CysC抗体为山羊抗人CysC抗体。
优选的,所述试剂2还包括pH7.5的磷酸缓冲液0.1M,防腐剂Proclin300 0.01g/L及NaCl 0.1g/L。
优选的,所述试剂1还包括pH7.5的磷酸缓冲液0.1M,防腐剂Proclin300 0.01g/L及NaCl 0.1g/L。
本发明提供了一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂,采用了乳胶微球上包被一定比例的Normal IgG与特异性抗体共同结合乳胶微球上的结合位点,减慢了特异性抗原抗体的反应速率,达到在调整反应曲线,保证试剂灵敏度和/或延展性的基础上,还能确保样本测值准确性的目的。另外,不同批次抗体可通过调整与Normal IgG的比例,在一定程度上解决抗体批间差导致的试剂反应性差异的问题。
附图说明
图1为Rabbit Normal IgG占比为0%、40%及60%的试剂与在售试剂的反应性对比。
图2为Rabbit Normal IgG占比为40%及60%的试剂与在售试剂的样本相关性。
图3为Goat Normal IgG占比为0%、30%及50%的试剂与在售试剂的反应性对比。
图4为Goat Normal IgG占比为30%及50%的试剂与在售试剂的样本相关性。
具体实施方式
实施例1
配制试剂1:试剂1成分如下:
磷酸缓冲液0.1M/L 磷酸缓冲液pH 7.5
Tween20 0.01g/L
NaCl 0.1g/L
Proclin300 0.01g/L。
配制试剂2:使用兔IgG系统,即兔抗人CysC多克隆抗体及正常未免疫兔的IgG(Rabbit Normal IgG)。
(1)溶液制备
a.活化缓冲液:100mM/L磷酸缓冲液,pH7.5;
b.活化剂:按照10mg/ml的浓度称量EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐),现用现配;
c.封闭液:10%(w/v)BSA;
d.复溶溶液(即R2缓冲液):磷酸缓冲液0.1M/L pH 7.5,NaCl 0.1g/L,Proclin3000.01g/L。
(2)特异性兔抗人抗CysC多克隆抗体及兔Normal IgG的包被
①取粒径为150nm的聚苯乙烯乳胶粒子10mg与活化缓冲液a按体积比1:20进行在37℃条件下混合后混匀10分钟;
②向步骤①中加入0.5mg的混合抗体(特异性兔抗人抗CysC多克隆抗体及兔Normal IgG,其中Normal IgG蛋白占比不同):配比1的Normal IgG占比0%(即CysC多克隆抗体0.5mg,Normal IgG 0.0mg)、配比2占比20%(即CysC多克隆抗体0.4mg,Normal IgG0.1mg)、配比3占比40%(即CysC多克隆抗体0.3mg,Normal IgG 0.2mg)、配比4占比60%(即CysC多克隆抗体0.2mg,Normal IgG 0.3mg)、配比5占比80%即CysC多克隆抗体0.1mg,Normal IgG 0.4mg),37℃条件下混合60分钟;
③向步骤②加入100ul的活化剂b,37℃条件下混合60分钟;
④向步骤③中加入0.5ml的封闭液c,37℃条件下混合60分钟;
⑤步骤④反应完成后,离心并去除上清液。离心条件为转速15000rpm,离心时间为30分钟,温度设定10℃;
⑥去除上清液,并用复溶溶液复溶,重悬乳胶微球,重悬过程可使用细胞破碎仪辅助重悬。试剂2制备完成。
检测方法
使用全自动生化分析仪东芝40FR来检测CysC。检测条件如下:
样本量3ul
试剂1量235ul
试剂2量50ul
主波长540nm
副波长700nm
在全自动生化分析仪东芝40FR上设置好以上参数,检测在售试剂及不同NormalIgG占比组(配比1、配比2、配比3、配比4、配比5)的吸光度,结果如表1所示。对比检测15例血清样本的浓度,得到的结果如表2所示。
从表1可以看出,随Normal IgG蛋白占比增加,在校准范围内(0-8mg/L)试剂的反应性降低(0.5mg/L时的dAbs降低)、延展性增加(8m/L信号与4mg/L信号的比值越高),在检测高浓度抗原时(>8mg/L)试剂prozone越好(50mg/L信号与8mg/L信号的比值越高)。与在售试剂相比,Normal IgG蛋白占比在40-60%时试剂灵敏度及延展性较合适。
表1 Rabbit Normal IgG蛋白占比分别为0%,20%,40%,60%,80%时的反应性及延展性对比
从表2可以看出:未添加Normal IgG(0%)时,由于测值范围仅到4mg/L,未进行样本测值确认。
添加了Normal IgG的试剂与在售试剂对比,slope值及r值越接近1,说明样本测值的相关性越好。随Normal IgG蛋白占比增加,高浓度样本测值越高。Normal IgG蛋白占比在40-60%时,无论slope还是r,均与在售试剂相当。
表2在售试剂、Rabbit Normal IgG占比分别为20%,40%,60%,80%时的样本测值对比
表1结果表明配比3、配比4的灵敏度及延展性较好。与在售试剂反应曲线对比图见图1。
表2结果表明配比3、配比4的样本测值与在售试剂最接近,相关性slope 0.90-1.10,r>0.99。与在售试剂的样本相关性图见图2。
根据表1和表2综合结果得知,Rabbit Normal IgG蛋白占比40%~60%之间时结果最优。
实施例2
配制试剂1:试剂1成分如下:
磷酸缓冲液0.1M/L 磷酸缓冲液Ph 7.5
Tween20 0.01g/L
NaCl 0.1g/L
Proclin300 0.01g/L。
配制试剂2:使用山羊IgG系统,即山羊抗人CysC多克隆抗体及正常未免疫山羊的IgG(Goat Normal IgG)。
(1)溶液制备
a.活化缓冲液:100mM/L磷酸缓冲液,pH 7.5;
b.活化剂:按照10mg/ml的浓度称量EDC,现用现配;
c.封闭液:10%(w/v)BSA;
d.复溶溶液(即R2缓冲液):磷酸缓冲液0.1M/L pH 7.5,NaCl 0.1g/L,Proclin3000.01g/L。
(2)特异性山羊抗人CysC多克隆抗体及山羊Normal IgG的包被
①取粒径为150nm的聚苯乙烯乳胶粒子10mg与活化缓冲液a按体积比1:10进行在37℃条件下混合后混匀10分钟;
②向步骤①中加入0.8mg的混合抗体(特异性山羊抗人抗CysC多克隆抗体及兔Normal IgG,其中Normal IgG蛋白占比不同):配比6的Normal IgG占比0%(即CysC多克隆抗体0.8mg,Normal IgG 0.0mg)、配比7占比10%(即CysC多克隆抗体0.72mg,Normal IgG0.08mg)、配比8占比30%(即CysC多克隆抗体0.56mg,Normal IgG 0.24mg)、配比9占比50%(即CysC多克隆抗体0.4mg,Normal IgG 0.4mg)、配比10占比70%即CysC多克隆抗体0.24mg,Normal IgG 0.56mg),42℃条件下混合60分钟;
③向步骤②加入120ul的10mg/ml的活化剂b,37℃条件下混合60分钟;
④向步骤③中加入0.5ml的10%的MSA(封闭液c),37℃条件下混合60分钟;
⑤步骤④反应完成后,离心并去除上清液。离心条件为:转速15000rpm,离心时间30分钟,温度设定为10℃;
⑥去除上清液,并用复溶溶液复溶,重悬乳胶微球,重悬过程可使用细胞破碎仪辅助重悬。试剂2制备完成。
检测方法
使用全自动生化分析仪东芝40FR来检测CysC。检测条件如下:
样本量3ul
试剂1量235ul
试剂2量50ul
主波长540nm
副波长700nm
在全自动生化分析仪东芝40FR上设置好以上参数,检测在售试剂及不同NormalIgG占比组(配比6、配比7、配比8、配比9、配比10)的吸光度,结果如表3所示。对比检测15例血清样本的浓度,得到的结果如表4所示。
从表3可以看出,随Normal IgG蛋白占比增加,在校准范围内(0-8mg/L)试剂的反应性降低(0.5mg/L时的dAbs降低)、延展性增加(8m/L信号与4mg/L信号的比值越高),在检测高浓度抗原时(>8mg/L)试剂prozone越好(50mg/L信号与8mg/L信号的比值越高)。与在售试剂相比,Normal IgG蛋白占比在30-50%时试剂灵敏度及延展性较合适。
表3 Goat Normal IgG蛋白占比分别为0%,10%,30%,50%,70%时的反应性及延展性对比
未添加Normal IgG(0%)时,由于测值范围仅到4mg/L,表4中未进行配比6的样本测值确认。
从表4可以看出,添加了Normal IgG的试剂与在售试剂对比,slope值及r值越接近1,说明样本测值的相关性越好。随Normal IgG蛋白占比增加,高浓度样本测值越高。NormalIgG蛋白占比在30-50%时,无论slope还是r,均与在售试剂相当。
表4在售试剂、Goat Normal IgG占比分别为0%,10%,30%,50%,70%时的样本测值对比
表3结果表明配比8、配比9的灵敏度及延展性较好。与在售试剂反应曲线对比图见图3。
表4结果表明配比8、配比9的样本测值与在售试剂最接近,相关性slope0.90-1.10,r>0.99。与在售试剂的样本相关性图见图4。
根据表3和表4综合结果得知,Goat Normal IgG蛋白占比30%~50%之间时结果最优。
以上两组组实验结果说明,Normal IgG蛋白占比在30%~60%时,可在确保试剂灵敏度的基础上,有效改善试剂延展性及样本测值。
Claims (5)
1.一种胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制备方法,所述胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂包括试剂1和试剂2,所述试剂1为pH 值为 7.5 的缓冲液,试剂2为包被有动物抗人CysC抗体的乳胶微球分散液,其特征在于:所述乳胶微球还包被有对应动物的Normal IgG,所述Normal IgG在抗体系统中占比30%-60%;
其中,所述动物抗人抗CysC抗体和动物Normal IgG的包被方法,包括:
①取粒径为150nm的聚苯乙烯乳胶粒子10 mg与活化缓冲液按体积比1:20进行在37℃条件下混合后混匀10分钟;
②向步骤①中加入0.5mg的混合抗体,所述混合抗体包括动物抗人抗CysC多克隆抗体和动物Normal IgG,37℃条件下混合60分钟;
③向步骤②加入100 ul的活化剂b, 37℃条件下混合60分钟;
④向步骤③中加入0.5ml的封闭液c, 37℃条件下混合60分钟;
⑤步骤④反应完成后,离心并去除上清液;离心条件为转速15000 rpm,离心时间为30分钟,温度设定10℃;
⑥去除上清液,并用复溶溶液复溶,重悬乳胶微球,重悬过程可使用细胞破碎仪辅助重悬。
2.根据权利要求1所述的胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制备方法,其特征在于:所述Normal IgG为正常未免疫兔的IgG,所述CysC抗体为兔抗人CysC抗体。
3.根据权利要求2所述的胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制备方法,其特征在于:所述Normal IgG为正常未免疫山羊的IgG,所述CysC抗体为山羊抗人CysC抗体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制备方法,其特征在于:所述试剂2还包括pH7.5的磷酸缓冲液0.1M,防腐剂Proclin300 0.01g/L及NaCl0.1g/L。
5.根据权利要求4所述的胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂的制备方法,其特征在于:所述试剂1还包括pH7.5的磷酸缓冲液0.1M,防腐剂Proclin300 0.01g/L及NaCl 0.1g/L。
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