JP2000292424A

JP2000292424A - 免疫測定方法

Info

Publication number: JP2000292424A
Application number: JP10232399A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Munebayashi; 孝明宗林; Yasuo Ifuku; 康夫井福; Kazuhiro Nagaike; 一博長池
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2000-10-20

Abstract

(57)【要約】【課題】免疫測定において、測定干渉物質の除去、非
特異反応の検出及び検体分注ミスの確認等を解決し、免
疫測定の信頼性を更に向上させる方法を提供する。【解決手段】不溶性担体粒子に検体中の測定対象物に
対する抗原または抗体を固定化した免疫試薬を用いる免
疫測定において、該測定対象物及び該免疫試薬に対して
特異性を持たない物質を固定化した粒子試薬を用いるこ
とを特徴とする免疫測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は免疫測定方法に関す
る。詳しくは、不溶性担体粒子に固定化した抗体または
抗原と検体中の抗原または抗体の免疫的結合に伴う粒子
凝集反応を利用する免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ポリス
チレンラテックス等の不溶性担体粒子が免疫反応に伴っ
て凝集する反応を利用した免疫測定方法は、迅速、簡便
であると共に、精度の良い測定方法として従来広く利用
されている（特公昭５８−１１５７５号公報等）。ま
た、不溶性磁性担体粒子を使用する方法（特開平１−１
９３６４７号公報、特開平３−５９４５９号公報等）
や、不溶性磁性担体粒子と蛍光標識粒子を組み合わせる
方法（特開昭６１−１２８１６８号公報、特開平７−７
２１５５号公報等）も開発されている。

【０００３】血液検体を採血する場合、真空採血管を用
いることが多い。採血管の種類によっては、管壁に塗布
してある界面活性剤などの成分が検体中に溶け出すこと
もあり、免疫反応に影響を与える場合がある。たとえ
ば、ポリプロピレングリコールが溶出した場合、ＥＩ
Ａ、ＲＩＡなどの洗浄工程を伴う測定法では影響しない
が、ラテックス免疫比濁法のように分離洗浄工程を持た
ず、微粒子を担体とする方法では、溶出物質が粒子表面
に吸着するため免疫反応に影響を与える場合があった。

【０００４】また、検体中に存在する、たとえばある種
の蛋白質には、不溶性担体粒子表面に吸着しやすい性状
を持つものがあり、そのため、ラテックス免疫比濁法な
どの粒子凝集反応では非特異反応をおこす場合があっ
た。更に、自動免疫測定装置を使用する場合には、まれ
に試薬中に検体が分注されないというミスが生じること
もあった。

【０００５】本発明は、これらの測定干渉物質の除去、
非特異反応の検出及び検体分注ミスの確認等の少なくと
も一つの課題を解決し、免疫測定の信頼性を更に向上さ
せるものである。また、従来の免疫測定方法は１回の測
定につき測定対象が１項目であったが、本発明の方法は
２項目を同時測定することも可能とするものである。

【０００６】

【課題を解決する手段】本発明者らは、上記の課題につ
いて鋭意検討した結果、従来の免疫測定方法において、
試薬や試薬の測定対象物に対して特異性を持たない特定
の物質を固定化した粒子を更に使用することにより、上
記の課題を解決できることを見出し、本発明に到達し
た。すなわち、本発明の要旨は不溶性担体粒子に、検体
中の測定対象物に対する抗原または抗体を固定化した免
疫試薬を用いる免疫測定において、該測定対象物及び該
免疫試薬に対して特異性を持たない物質を固定化した粒
子試薬を用いることを特徴とする免疫測定方法に存す
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明は「免疫試薬の測定対象物
及び免疫試薬に対して特異性を持たない物質を固定化し
た粒子試薬」（以下、「非特異性粒子試薬」という）を
免疫反応時及び／または測定時に免疫反応液中に共存さ
せることを特徴とし、この「特異性を持たない物質」と
して特定の物質を選択することにより、（１）検体中の測定干渉物質の除去（２）非特異反応の検出（３）検体分注ミスの確認（４）２項目同時測定を可能とするものである。

【０００８】本発明の「非特異性粒子試薬」は、不溶性
の担体粒子に免疫試薬の測定対象物及び免疫試薬に対し
て特異性を持たない物質を固定化したものである。不溶
性の担体粒子としては、免疫試薬として一般的に用いら
れている不溶性担体粒子（詳細は後述）を使用すること
ができる。本発明において「免疫試薬の測定対象物及び
免疫試薬に対して特異性を持たない」とは、免疫試薬と
抗原抗体反応を起こさず、かつ、免疫試薬の測定対象物
とも抗原抗体反応を起こさないことである。「特異性を
持たない物質」は、上記の目的（１）〜（４）に応じて
適宜選択する必要があるが、通常は動物由来の蛋白質、
アミノ酸、高分子有機物及び糖類から選択される。

【０００９】非特異性粒子試薬は、適当な分散媒に分散
して使用する。分散媒としては、通常、緩衝液、生体由
来成分、塩類、界面活性剤及びこれらの組み合わせを含
む水が用いられる。緩衝液を使用する場合には、通常水
に対して１〜５００ｍＭ使用する。また、通常ｐＨ５〜
１０、好ましくはｐＨ６〜９となるように調整する。緩
衝液としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、
リン酸などが挙げられる。生体由来成分を使用する場
合、通常水に対して０．０１重量％〜１０重量％含有さ
せる。生体由来成分としては、牛血清アルブミン、ゼラ
チンなどが挙げられる。塩類を使用する場合、通常水に
対して０．１〜１０重量％含有させる。塩類としては、
塩化ナトリウムなどが挙げられる。界面活性剤を使用す
る場合、通常水に対して０．０００１〜１％含有させ
る。界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤、アニ
オン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活
性剤、及びこれらの組み合わせが挙げられる。また、非
特異性粒子試薬は、通常免疫測定反応に使用される免疫
試薬、反応緩衝液、前処理試薬等に添加して使用しても
よい。非特異性粒子試薬は、免疫試薬に対して、その担
体粒子の重量濃度として、通常１０％〜３００倍、好ま
しくは１〜１００倍使用する。

【００１０】本発明において、「不溶性担体粒子」とし
ては、有機高分子物質、生体由来物質、脂質粒子、金属
コロイド粒子及び無機微粉末等を使用することができる
が、液体媒体中に分散させたとき、測光するまでは自然
の沈降が無く、浮遊しているものが望ましい。有機高分
子物質としては、スチレン、ビニルトルエン、メチルメ
タクリレート、メタクリル酸等を乳化重合して得られる
単独重合体もしくは共重合体からなるラテックス等が挙
げられる。生体由来物質としては、赤血球などが挙げら
れる。脂質粒子としては、リポソーム等が挙げられる。
金属コロイド粒子としては金コロイド等が挙げられる。
無機微粉末としては、セラミック微粒子、シリカ、アル
ミナ、シリカアルミナ、炭素粉末等が挙げられる。これ
らの中でも、特にポリスチレンラテックスが有効であ
る。

【００１１】不溶性担体粒子の粒径としては、通常０．
０１〜１０μｍのものが用いられ、好ましくは０．１〜
１μｍである。本発明の「免疫試薬」としては、一般的
に免疫測定に使用されるものを使用することができる
が、上記の不溶性担体粒子に検体中の測定対象物に対す
る抗原または抗体を固定化したものである。不溶性担体
粒子に抗原または抗体を固定化する方法としては、物理
的吸着法、または、カルボジイミドなどの縮合剤を用い
る等の化学結合法が用いられる。固定化する抗原または
抗体の量は、通常不溶性担体粒子１ｍｇあたり５０ｎｇ
〜５００μｍであり、好ましくは５００ｎｇ〜２００μ
ｍである。

【００１２】免疫試薬は、免疫反応液に、不溶性担体粒
子の重量濃度として、通常０．０００１〜１％、好まし
くは０．０００３〜０．３％となるように分散した懸濁
液の形成で使用する。尚、不溶性担体粒子は、免疫測定
の種類によって選択され、磁性体を含有させた不溶性磁
性担体粒子、標識剤含有粒子等を使用する場合もある。
不溶性磁性担体粒子としては、上記の不溶性担体粒子中
に磁性体として、鉄または磁性酸化鉄等を５〜１００重
量％含有するように調整されたものが用いられる。標識
剤含有粒子としては、上記の不溶性担体粒子中に標識剤
として、酵素、色素、蛍光色素、化学発光性物質または
電気化学発光性物質等を含有させたものが挙げられる
が、標識剤に直接抗原または抗体を固定化して免疫試薬
として使用する場合もある。この場合には、通常抗原ま
たは抗体１分子あたり標識剤０．１〜１００分子を結合
させたものを使用する。

【００１３】本発明の免疫測定には、通常反応緩衝液を
使用する。反応緩衝液としては、通常水にトリスヒドロ
キシメチルアミノメタン、リン酸、酢酸ナトリウム、グ
リシン、ホウ酸など１〜５００ｍＭを添加し、ｐＨ１〜
１０に調整した緩衝液に、塩化ナトリウムなどの無機塩
類を０．５〜２０重量％、牛血清アルブミン、正常ウサ
ギ血清などの生体成分を０．１〜１０重量％及び界面活
性剤を０．０００３〜１重量％含むものを使用する。反
応系により、反応緩衝液は１種類または２種類以上使用
される。緩衝液が１種類の場合、ｐＨは６〜９の中性付
近を用いることが多いが、２種類以上使う時は、初めが
ｐＨ２、後から別の緩衝液を加えて、最終的には中性付
近とすることもある。塩濃度、蛋白濃度なども、反応系
によりかなり異なるため、使用する幅は広い。以下、目
的別の非特異性粒子試薬及びそれを用いる免疫測定方法
について説明する。

【００１４】（１）検体中の測定干渉物質の除去を行う
場合この目的で非特異性粒子試薬を使用する場合の免疫測定
は、通常、計測が光学的に行われる。即ち、通常、免疫
試薬の凝集反応による反応液の濁度または透過度の変化
を測定する。このため、非特異性粒子試薬は、光学的測
定の邪魔にならない程度に、粒子試薬の粒径と濃度を工
夫する必要があるが、効果を考えると、非特異性粒子試
薬の濃度は通常の免疫試薬よりも多いことが好ましく、
従って、なるべく小さい粒径の粒子を用いることが好ま
しい。一般的には、非特異性粒子試薬の担体は粒径０．
００５〜１０μｍのものが用いられ、好ましくは０．０
０５〜１μｍ、特に好ましくは０．０５〜０．５μｍで
ある。担体粒子の材質としては、従来の免疫測定におい
て使用されている不溶性担体粒子と同様の物を、使用す
ることができる。

【００１５】この目的に使用する場合、非特異性粒子試
薬の担体粒子に固定化する「特異性を持たない物質」と
しては、免疫試薬や免疫試薬の測定対象物に対して特異
性を持たないものであればよく、具体的には、下記のも
のが挙げられる。免疫試薬非特異性粒子試薬抗ＨＢｓ抗体正常ウサギＩｇＧ抗ＣＥＡ抗体牛血清アルブミン抗ＣＡ１９−９抗体グリシンＨＣＶ抗原デキストラン

【００１６】これらの「特異性を持たない物質」を固定
化した非特異性粒子試薬を共存させることにより、測定
干渉物質をあらかじめ非特異性性粒子試薬に吸着させる
ことにより、免疫試薬への影響を軽減させることができ
る。また、検体中の非特異的反応成分の除去も可能。検
体中の吸着成分をあらかじめ非特異性粒子試薬に吸着さ
せることにより、免疫試薬への影響を軽減させることが
できる。この非特異性粒子試薬は、反応容器に検体、反
応緩衝液、及び、不溶性担体粒子に抗体もしくは抗原を
固定化した免疫試薬を分注後、攪拌し、抗原抗体反応に
よる粒子の凝集反応を吸光度または散乱光により計測す
る免疫測定方法において好適に使用される。

【００１７】（２）非特異反応の検出の場合この目的に本発明の非特異性粒子試薬を使用する場合、
特異性を持たない物質を固定化する担体粒子としては、
従来の免疫測定において使用されている不溶性担体粒子
であれば、特に制限無く使用することができる。また、
非特異性粒子試薬の担体粒子に固定化する「特異性を持
たない物質」としては、免疫試薬や免疫試薬の測定対象
物に対して特異性を持たないものであればよく、具体的
には、下記のものが挙げられる。不溶性磁性粒子試薬非特異性粒子試薬抗ＨＢｓ抗体正常ウサギＩｇＧ抗ＣＥＡ抗体牛血清アルブミン抗ＣＡ１９−９抗体グリシンＨＣＶ抗原デキストラン

【００１８】非特異反応を検出するための本発明の非特
異性粒子試薬は、免疫試薬として抗原または抗体を固定
化した不溶性磁性担体粒子を用いる免疫測定に好適に利
用することができる。このような不溶性磁性担体粒子を
用いる免疫測定方法としては、例えば、反応容器に検
体、反応緩衝液、磁性粒子に抗体または抗原を固定化し
た第一の免疫試薬、標識された抗体または抗原を含有す
る第二の免疫試薬を分注、攪拌し、反応後、磁力分離、
洗浄を行い、抗原抗体反応により磁性粒子に結合したか
または結合しなかった標識剤の濃度を計測する免疫測定
方法、第二の免疫試薬が、抗体または抗原に標識剤を直
接結合したものであるかまたは、標識剤を含有した不溶
性粒子である上記免疫測定方法、第一の免疫試薬による
第一反応と第二の免疫試薬による第二反応の間に分離洗
浄工程が入るかまたは入らない上記免疫測定方法、第二
の免疫試薬による第一反応と、分離洗浄工程を入れず
に、第一の試薬による第二反応が行われる免疫測定方法標識剤の検出法が、吸光度、蛍光、化学発光、電気化学
発光である上記免疫測定法、磁性免疫試薬の測定対象物
とは特異性を持たない物質を固定化した不溶性担体粒子
試薬を第一反応液中に共存させ、粒子の凝集反応を計測
することで、磁性免疫試薬の測定対象物とは異なる物質
を観測する免疫測定法等を挙げることができ、１つの反
応容器の中で不溶性磁性粒子試薬による測定対象物の測
定と、非特異的な粒子凝集反応を同時に検出することに
より、不溶性磁性粒子試薬の非特異的な凝集により生じ
る可能性のある判定ミス（偽陽性）を防止するのに有効
である。特に、感染症など陽性と判定された場合に影響
が大きい項目を測定する時に、測定の信頼性向上に役立
つ。通常、非特異反応の可能性が示唆された場合、確認
試薬による確認、検体を希釈などの前処理をして再検、
別の測定法での確認、などの処置を取るため、本発明に
より次のアクションが迅速に取れる。

【００１９】（３）検体分注ミスの確認この目的に本発明の非特異性粒子試薬を使用する場合、
特異性を持たない物質を固定化する担体粒子としては、
従来の免疫測定において使用されている不溶性担体粒子
であれば、特に制限無く使用することができる。また、
非特異性粒子試薬の担体粒子に固定化する「特異性を持
たない物質」としては、免疫試薬や免疫試薬の測定対象
物に対して特異性を持たないものであり、かつ対象とな
るすべての検体中に一般的に存在する成分と反応するも
のが使用できる。例えば検体がヒト血液である場合に
は、抗ヒト体液性分を固定化する。具体的には、下記の
ものが挙げられる。不溶性磁性粒子試薬非特異性粒子試薬抗ＨＢｓ抗体抗ヒトＩｇＧ抗体ＨＣＶ抗原抗ヒトハプトグロビン抗体ＨＩＶ抗原抗ヒトアルブミン抗体

【００２０】検体分注ミスを確認するための本発明の非
特異性粒子試薬は、免疫試薬として抗原または抗体を固
定化した不溶性磁性担体粒子を用いる免疫測定に好適に
利用することができる。このような不溶性磁性担体粒子
を用いる免疫測定方法としては、上記（２）と同様の方
法が挙げられる。１つの反応容器の中で、不溶性磁性粒
子試薬による測定対象物の測定と、検体中に通常存在す
る成分を同時に測定することで、自動免疫測定装置にお
いて、反応容器内への検体分注ミスにより生じる判定ミ
ス（偽陰性）を防止することが可能となる。自動免疫測
定装置では各種のエラー表示機構が整備され、検体分
注、試薬分注などに関しても、エラーが生じた場合、メ
ッセージを表示する機能が整備されているものが多い。
しかし、たとえば、感染症のように、なんらかの機構動
作エラーにより、検体が反応容器内に分注されず、さら
にエラー表示もされない状況で陰性と判断してしまうこ
とで、非常に大きな影響を生じることも想定される。目
視で結果を判定するイムノクロマト試薬（たとえば妊娠
検査薬）などでは、測定工程が正常に行われたかどうか
を判断するための発色ポイントを、特異的反応検出ポイ
ントの近傍に持つことは通常行われている。

【００２１】（４）２項目同時測定この目的に本発明の非特異性粒子試薬を使用する場合、
特異性を持たない物質を固定化する担体粒子としては、
従来の免疫測定において使用されている不溶性担体粒子
であれば、特に制限無く使用することができる。また、
非特異性粒子試薬の担体粒子に固定化する「特異性を持
たない物質」としては、免疫試薬の測定対象物とはこと
なる測定対象物に対して特異性を有する抗原または抗体
であって、免疫試薬や免疫試薬の測定対象物に対して特
異性を持たないものが使用できる。具体的には、下記の
ものが挙げられる。不溶性磁性粒子試薬非特異性粒子試薬抗ＣＡ１９−９抗体抗ＣＥＡ抗体抗ＣＥＡ抗体抗ＡＦＰ抗体抗ＨＢｓ抗体ＨＣＶ抗原

【００２２】２項目を同時測定するための本発明の非特
異性粒子試薬は、免疫試薬として抗原または抗体を固定
化した不溶性磁性担体粒子を用いる免疫測定に好適に利
用することができる。このような不溶性磁性担体粒子を
用いる免疫測定方法としては、上記（２）と同様の方法
が挙げられる。１つの反応容器の中で、２種の異なる成
分を同時に測定することが可能となり、必要検体量の削
減、測定時間の短縮が達成できる。

【００２３】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではな
い。

【００２４】実施例１（測定干渉物質である採血管溶出
物質の影響を除去した例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−１００（三菱化学株式
会社製）を用い、以下の測定を行った。粒径０．５μｍ
の不溶性担体粒子（ポリスチレンラテックス）に抗αフ
ェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（ウサギポリクローナル
F(ab')₂）を物理吸着法により固定化し、牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）含有トリス緩衝液で処理することによ
り、ＡＦＰ測定試薬（免疫試薬）を調製した。

【００２５】さらに、粒径０．１μｍのポリスチレンラ
テックスを上記ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理し、表面
にＢＳＡが固定化した非特異性粒子試薬を調製した。各
濃度（0, 5, 50ng/ml）のＡＦＰ標準品を、無処理のポ
リスチレンチューブまたは、Ｂ社真空採血管に２ｍｌ入
れ、室温で３０分間振とうし、測定サンプルを調製し
た。ＢＳＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８．２）の反応緩衝
液に、上記非特異性粒子試薬を０、０．０５、０．１、
０．２、０．５重量％になるように添加し、ＡＦＰ測定
試薬により測定サンプルを測定した。

【００２６】１０分間の平均吸光度変化量（ｘ１０³）
を反応速度とし、各測定時の反応速度を測定した。無処
理のポリスチレンチューブ中で振とうしたサンプル（コ
ントロールサンプル）のうち、非特異性粒子試薬を使用
しなかったものの反応速度は、ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍｌ
のもので２．９、５ｎｇ／ｍｌのもので４８．１、５０
ｎｇ／ｍｌのもので３４５．４であった。この時の反応
速度を１００としたときの、この反応速度に対する他の
サンプルの反応速度の割合を表−１に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】採血慣用出物質により、免疫測定に影響が
でると、上記の反応速度は小さくなる。非特異性粒子試
薬の濃度が０．０５重量％以下の場合、コントロールサ
ンプルに比べて採血管処理サンプルでは４７−９２％の
低い値を示したが、非特異性粒子試薬を０．１重量％以
上共存させることにより、コントロールサンプルには影
響せず、採血管処理の影響を排除することができたこと
がわかる。

【００２９】実施例２（測定干渉物質である採血管溶出
物質の影響を除去した例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−１００（三菱化学株式
会社製）を用いた。粒径０．５μｍの不溶性担体粒子
（ポリスチレンラテックス）に抗ガン胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）抗体（ウサギポリクローナルF(ab')₂）を物理吸着
法により固定化し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ト
リス緩衝液で処理することにより、ＣＥＡ測定試薬（免
疫試薬）を調製した。

【００３０】さらに、粒径０．１μｍのポリスチレンラ
テックスを上記ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理し、表面
にＢＳＡが固定化した非特異性粒子試薬を調製した。各
濃度（0, 5, 40ng/ml）のＣＥＡ標準品を、無処理のポ
リスチレンチューブまたは、Ｂ社真空採血管に２ｍｌ入
れ、室温で６０分間振とうし、測定サンプルを調製し
た。ＣＥＡ測定用前処理液として、０．１Ｍグリシンｐ
Ｈ２．０を用い、各前処理液をそのまま使用した（非特
異性粒子試薬を使用しなかった）場合と、前処理液に上
記非特異性粒子試薬０．１％を含有させた場合につい
て、それぞれ測定サンプルと１：１で混合後、測定し
た。

【００３１】１０分間の平均吸光度変化量（ｘ１０³）
を反応速度とし、各サンプルの反応速度を測定した。無
処理のポリスチレンチューブ中で振とうしたサンプル
（コントロールサンプル）のうち、非特異性粒子試薬を
使用しなかったものの反応速度は、ＣＥＡ濃度５ｎｇ／
ｍｌのもので１４．４、４０ｎｇ／ｍｌのもので１０
３．８であった。この反応速度を１００としたときの、
この反応速度に対する他のサンプルの反応速度の割合を
表−２に示した。

【００３２】

【表２】

【００３３】前処理液に含有させた非免疫反応性試薬
は、コントロールサンプルに影響を与えず、採血管処理
サンプルの反応性低下を回避することができたことがわ
かる。

【００３４】実施例３（非特異反応の検出例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株
式会社製）を用いた。粒径１．０μｍの不溶性磁性担体
粒子に抗Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体（マウス
モノクローナルF(ab')₂）を化学結合法により固定化
し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することにより、Ｈ
ＢｓＡｇ測定不溶性磁性担体粒子試薬（磁性免疫試薬）
を調製した。さらに、粒径０.４μｍのＥｕ錯体含有ラテ
ックスに抗ＨＢｓＡｇ抗体（ウサギポリクローナルF(a
b')₂）を化学結合法により固定化し、ＢＳＡ含有トリ
ス緩衝液で処理することにより、ＨＢｓＡｇ測定蛍光粒
子試薬（蛍光免疫試薬）を調製した。

【００３５】さらに粒径０.５μｍのポリスチレンラテ
ックスに正常ウサギポリクローナルF(ab')₂を化学結合
法により固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理する
ことにより、検体中や上記免疫試薬に対して特異性を持
たない非特異性粒子試薬を調製した。コントロール測定
法として、非特異反応測定については、ＢＳＡ含有トリ
ス緩衝液からなる反応緩衝液と不溶性担体試薬（ポリス
チレンラテックス）を用いた。

【００３６】１５例の検体についてあらかじめＬＰＩＡ
・Ｆ−ＨＢｓ抗原試薬（ダイアヤトロン社製）を用い
て、測定検体がＨＢｓＡｇ陰性であることを確認した。
ＨＢｓＡｇ陰性を確認した検体の内、７例について、標準
ＨＢｓＡｇを添加し、模擬陽性検体を調製した。非特異性
反応を確認するために、一次反応用の第一試薬として、
非特異性粒子試薬及びＢＳＡ含有トリス緩衝液からなる
第一反応緩衝液並びに上記蛍光免疫試薬を用い、二次反
応用の第二試薬として、ＢＳＡ含有トリス緩衝液からな
る第二反応緩衝液及び上記磁性免疫試薬を用いた。測定
は、まず検体中に第一試薬を分注し反応させた後、非特
異性粒子試薬の凝集反応の有無を吸光度変化の測定によ
り確認し、更に第二試薬を分注し反応を行った後、磁力
を利用して未反応物を分離洗浄し、検体中のＨＢｓＡｇ
と磁性免疫試薬、蛍光免疫試薬の結合体の標識濃度を測
定した。

【００３７】ＨＢｓＡｇ測定結果（標識濃度測定結果）
及び非特異反応判定結果（吸光度変化による凝集反応有
無の確認）を表−３に示した。ＨＢｓＡｇ陽性かつ非特
異確認陽性の場合、判定保留と判定した。また、別途同
じ１５例の検体についてコントロール試薬で非特異反応
の可能性の判定を行い、その結果を併せて表−３に示し
た。表から、非特異反応が疑われる検体において、本同
時測定試薬が有効に判定できることがわかる。

【００３８】

【表３】

【００３９】実施例４（検体分注ミスの確認例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株
式会社製）を用いた。粒径1.0μｍの磁性粒子に抗HBsAg
抗体（マウスモノクローナルF(ab')2）を化学結合法に
より固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理すること
により、HBsAg測定磁性粒子試薬を調製した。さらに、
粒径0.4μｍのEu錯体含有ラテックスを抗HBsAg抗体（ウ
サギポリクローナルF(ab')2）を化学結合法により固定
化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することにより、
HBsAg測定蛍光粒子試薬を調製した。さらに粒径0.5μｍ
のポリスチレンラテックスに抗ハプトグロビン抗体（H
p,ウサギポリクローナルF(ab')2）を化学結合法により
固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することによ
り、Hp測定試薬を調製した。

【００４０】検体分注同時確認試薬として、一次反応用
の第一試薬として、Hp測定用ラテックス試薬及びＢＳＡ
含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液とHBsAg測定
用蛍光粒子試薬、二次反応用の第二試薬として、ＢＳＡ
含有トリス緩衝液からなる第二反応緩衝液とHBsAg測定
用磁性粒子試薬を用いた。測定は実施例３と同様に行っ
た。

【００４１】１０例の検体についてあらかじめＬＰＩＡ
・Ｆ−ＨＢｓ抗原試薬（ダイアヤトロン）を用いてHBsA
g陰性を確認し、その内、５例について、標準HBsAgを添
加し、模擬陽性検体を調製した。また、検体分注エラー
をシミュレートするために、空のサンプルカップを２検
体分測定した。HBsAgとHpの測定による判定結果を表−
４に示した。Hp陰性の場合は、判定保留とした。検体分
注エラーによる偽陰性に対して、有効な判定ができたこ
とがわかる。

【００４２】

【表４】

【００４３】実施例５（検体分注ミスの確認例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株
式会社製）を用いた。粒径1.0μｍの磁性粒子に抗HBsAg
抗体（マウスモノクローナルF(ab')2）を化学結合法に
より固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理すること
により、HBsAg測定磁性粒子試薬を調製した。さらに、
粒径0.4μｍのEu錯体含有ラテックスを抗HBsAg抗体（ウ
サギポリクローナルF(ab')2）を化学結合法により固定
化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することにより、
HBsAg測定蛍光粒子試薬を調製した。さらに粒径0.5μｍ
のポリスチレンラテックスに抗SOD抗体（ヤギポリクロ
ーナルIgG）を化学結合法により固定化し、ＢＳＡ含有
トリス緩衝液で処理することにより、SOD測定試薬を調
製した。

【００４４】検体分注同時確認試薬として、一次反応用
の第一試薬として、SOD測定用ラテックス試薬及びＢＳ
Ａ含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液とHBsAg測
定用蛍光粒子試薬、二次反応用の第二試薬として、ＢＳ
Ａ含有トリス緩衝液からなる第二反応緩衝液とHBsAg測
定用磁性粒子試薬を用いた。１０例の検体について、Ｌ
ＰＩＡ・Ｆ−ＨＢｓ抗原試薬（ダイアヤトロン）を用い
てあらかじめHBsAg陰性を確認し、その内、５例につい
て、標準HBsAgを添加し、模擬陽性検体を調製した。ま
た、検体分注エラーをシミュレートするために、空のサ
ンプルカップを２検体分測定した。

【００４５】上記検体分注同時確認試薬におけるHBsAg
とSODの測定による判定結果を表−５に示した。SOD陰性
の場合は、判定保留とした。検体分注エラーによる偽陰
性に対して、有効な判定ができた。

【００４６】

【表５】

【００４７】実施例６（２項目同時測定の例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株
式会社製）を用いた。粒径1.0μｍの磁性粒子に抗CA19-
9抗体（マウスモノクローナルF(ab')2）を化学結合法に
より固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理すること
により、CA19-9測定磁性粒子試薬を調製した。さらに、
粒径0.4μｍのEu錯体含有ラテックスを上記抗CA19-9抗
体を化学結合法により固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝
液で処理することにより、CA19-9測定蛍光粒子試薬を調
製した。さらに粒径0.5μｍのポリスチレンラテックス
に抗ＣＥＡ抗体（ウサギポリクローナルF(ab')2）を化
学結合法により固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処
理することにより、ＣＥＡ測定試薬を調製した。

【００４８】２項目同時測定用試薬として、一次反応用
の第一試薬として、ＣＥＡ測定用ラテックス試薬及びＢ
ＳＡ含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液とCA19-9
測定用蛍光粒子試薬、二次反応用の第二試薬として、Ｂ
ＳＡ含有トリス緩衝液からなる第二反応緩衝液とCA19-9
測定用磁性粒子試薬を用いた。コントロール測定法とし
て、CA19-9測定については、一次反応用の第一試薬とし
て、ＢＳＡ含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液と
蛍光粒子試薬、二次反応用の第二試薬として、ＢＳＡ含
有トリス緩衝液からなる第二反応緩衝液と磁性粒子試薬
を用いた。CEA測定については、ＢＳＡ含有トリス緩衝
液からなる反応緩衝液とラテックス試薬を用いた。

【００４９】１４例の血清検体を上記２項目同時測定試
薬および、コントロール試薬（CA19-9,CEA）で測定し
た。CA19-9のカットオフ値を37U/ml, CEAのカットオフ
値を2.5ng/mlとすると、判定結果および相関において、
良好な結果を得た。（表−６、図１、２）

【００５０】

【表６】

【００５１】実施例７（２項目同時測定の例）免疫測定装置として、ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱化学株
式会社製）を用いた。粒径1.0μｍの磁性粒子に抗CEA抗
体（マウスモノクローナルF(ab')2）を化学結合法によ
り固定化し、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することに
より、CEA測定磁性粒子試薬を調製した。さらに、粒径
0.4μｍのEu錯体含有ラテックスを抗CEA抗体（ウサギポ
リクローナルF(ab')2）を化学結合法により固定化し、
ＢＳＡ含有トリス緩衝液で処理することにより、CEA測
定蛍光粒子試薬を調製した。さらに粒径0.5μｍのポリ
スチレンラテックスに抗AFP抗体（ウサギポリクローナ
ルF(ab')2）を化学結合法により固定化し、ＢＳＡ含有
トリス緩衝液で処理することにより、AFP測定試薬を調
製した。

【００５２】２項目同時測定用試薬として、一次反応用
の第一試薬として、ＡＦＰ測定用ラテックス試薬及びＢ
ＳＡ含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液とCEA測
定用蛍光粒子試薬、二次反応用の第二試薬として、ＢＳ
Ａ含有トリス緩衝液からなる第二反応緩衝液とCEA測定
用磁性粒子試薬を用いた。コントロール測定法として、
CEA測定については、一次反応用の第一試薬として、Ｂ
ＳＡ含有トリス緩衝液からなる第一反応緩衝液と蛍光粒
子試薬、二次反応用の第二試薬として、ＢＳＡ含有トリ
ス緩衝液からなる第二反応緩衝液と磁性粒子試薬を用い
た。AFP測定については、ＢＳＡ含有トリス緩衝液から
なる反応緩衝液とラテックス試薬を用いた。

【００５３】１２例の血清検体を上記２項目同時測定試
薬および、コントロール試薬（CEA,AFP）で測定した。C
EAのカットオフ値を2.5ng/ml, AFPのカットオフ値を10n
g/mlとすると、判定結果および相関において、良好な結
果を得た。（表−７、図３、４）

【００５４】

【表７】

【００５５】

【発明の効果】免疫測定において本発明の非特異性粒子
試薬を使用することにより、測定干渉物質の除去、非特
異反応の検出及び検体分注ミスの確認等の少なくとも一
つの課題を解決し、免疫測定の信頼性を更に向上させる
ことが可能となり、また２項目を同時に測定することも
可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例６の検体測定結果を示す図であ
る。

【図２】本発明の実施例６の検体測定結果を示す図であ
る。

【図３】本発明の実施例７の検体測定結果を示す図であ
る。

【図４】本発明の実施例７の検体測定結果を示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性担体粒子に検体中の測定対象物に
対する抗原または抗体を固定化した免疫試薬を用いる免
疫測定において、該測定対象物及び該免疫試薬に対して
特異性を持たない物質を固定化した粒子試薬を用いるこ
とを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】不溶性担体粒子が、不溶性磁性担体粒子
である請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】特異性を持たない物質が、検体中に通常
存在する成分とは特異性を持たないことを特徴とする請
求項１または２に記載の免疫測定方法。
【請求項４】特異性を持たない物質が、検体中に通常
存在する成分に対する特異性を持つことを特徴とする請
求項１または２に記載の免疫測定方法。
【請求項５】特異性を持たない物質が、免疫試薬の測
定対象物とは異なる測定対象物に対する抗原または抗体
であることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫
測定方法。
【請求項６】特異性を持たない物質が、動物由来の蛋
白質、アミノ酸、高分子有機物及び糖類から選ばれるこ
とを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の免
疫測定方法。