CN103852584B - 一种定量检测c肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，由C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品组成；其中C肽R1试剂包含缓冲液、保护剂Ⅰ、反应增强剂和防腐剂，C肽R2试剂包含缓冲液、保护剂Ⅰ、防腐剂和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，C肽校准品包含缓冲液、保护剂Ⅱ、防腐剂和C肽重组蛋白。本发明制备的试剂盒适用于半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪，具有操作简单、快速、测试精确度高、自动化程度高的优点，适用于在临床上广泛使用，特别是对急诊能实现快速定量测定。

Description

一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法定量测定检测标本中C肽含量的试剂盒。
背景技术
C肽（C-Peptide）又称连接肽，由31个氨基酸组成，分子量为3020道尔顿，是胰岛素原中连接胰岛素A链和B链的一段短肽，其作用在于促进胰岛素分子在β细胞内质网中合成，并使胰岛素进行有效折叠和装配。临床上对于C肽的测定主要用来正确评价胰岛β细胞功能变化及发展规律，以及对糖尿病类型的准确判断和病情监控。
人体胰岛β细胞合成胰岛素原，随后胰岛素原被等摩尔地切割成胰岛素和C肽。因此，胰岛β细胞分泌的胰岛素和C肽呈等分子关系，血中C肽浓度可间接反应胰岛素浓度。而与胰岛素相比，C肽在体内不被肝脏分解，只能通过肾脏清除，且半衰期较长（C肽的半衰期大于30min，胰岛素的半衰期为3～4min），在血清中的浓度几乎是胰岛素的10倍，因此C肽水平更能准确反映胰腺中β细胞的分泌功能。
此外，人源和动物源以及各种改进的胰岛素在氨基酸序列和结构上类似，导致了它们的免疫原性相近，在检测中不易区分。如果通过检测血中的胰岛素水平来评价胰岛功能，容易受到外源性胰岛素的影响，而外源性胰岛素中不含有C肽，且C肽不受胰岛素治疗中产生的胰岛素自身抗体的干扰，因此，测定C肽对内源性胰岛素的分泌能力评价更具有临床意义。尽管测量C肽的抗体容易与胰岛素原发生交叉反应，但是胰岛素原一般不会出现在血中，游离C肽的含量大概占总C肽含量的90%以上，所以临床上一般通过直接测定血清总C肽的含量来对β细胞进行评价。
目前，临床上对C肽的测定方法主要包括放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked，ImmunosorbentAssay，ELISA）及化学发光法等，其中RIA法虽然灵敏度高，但对设备要求较高、检测结果不稳定且存在放射性污染；ELISA定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，无法满足临床上大量、快速检测的需求；化学发光法则存在仪器维护昂贵，易受干扰，重复性差的缺点。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：提供一种稳定性好，测试效率高，测试结果准确，灵敏度高的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品；
所述C肽R1试剂由缓冲液、保护剂Ⅰ、反应增强剂和防腐剂得到；
所述C肽R2试剂由缓冲液、保护剂Ⅰ、防腐剂和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒得到；其中包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒由抗人C肽抗体和聚苯乙烯胶乳颗粒偶联得到；所述抗人C肽抗体为鼠源抗人C肽抗体、兔源抗人C肽抗体或者羊源抗人C肽抗体；
所述C肽校准品由缓冲液、保护剂Ⅱ、防腐剂和C肽重组蛋白得到。
上述技术方案中，将抗人C肽抗体以定向化学偶联的方式连接在聚苯乙烯胶乳颗粒表面，当检测标本中的C肽抗原与试剂盒中的抗人C肽抗体发生免疫反应后形成聚集颗粒而产生浊度，通过在400～700nm波长下测定其浊度即可计算出检测标本中的C肽含量。
上述技术方案中，C肽R2试剂中包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒由抗人C肽抗体和聚苯乙烯胶乳颗粒偶联得到，其中抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比可以为0.5～20：100，抗人C肽抗体为鼠源抗人C肽抗体、兔源抗人C肽抗体或者羊源抗人C肽抗体，其可以和检测样本中的抗原发生免疫反应；优选鼠源抗人C肽抗体，这是因为其免疫原性、抗原结合亲和力、血清半衰期更为理想，与血清中的C肽特异性结合能力高，可以大大提高检测的准确性。
作为优化，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或者几种；
其中C肽R1试剂中缓冲液的浓度为20～200mM；C肽R2试剂中缓冲液的浓度为20～200mM；C肽校准品中缓冲液的浓度为20～200mM。
上述技术方案中缓冲液的主要作用是保证配制胶乳增强免疫比浊试剂盒的过程中，各组分的pH值保持在一定的范围内，使个组分的性能保持稳定。所述C肽R1试剂中缓冲液的浓度为20～200mM，pH优选为4～10；所述C肽R2试剂中缓冲液为20～200mM，pH优选为4～10；所述C肽校准品中缓冲液的浓度为20～200mM，pH优选为6～8；这样C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品中缓冲液的加入量、pH值保持在一个适中的范围，使各组份的酸碱度保持稳定，不会对其他物质的性能产生影响，从而保证试剂盒整体性能的稳定，使测试结果更准确。
作为优化，所述保护剂Ⅰ为牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA和明胶中的一种；其中C肽R1试剂中保护剂Ⅰ的浓度为1～10g/L；C肽R2试剂中保护剂Ⅰ的浓度为1～10g/L；
所述保护剂Ⅱ为牛血清白蛋白BSA，其中C肽校准品中保护剂Ⅱ浓度为1～8g/L。
上述技术方案中的保护剂Ⅰ可以使C肽R1试剂和C肽R2试剂在保存期内性能保持稳定；保护剂Ⅱ可以保持C肽重组蛋白的性能稳定，在保存期内使C肽校准品不会因为环境温度的变化而产生变异。
作为优化，所述反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的一种，其中C肽R1试剂中反应增强剂的浓度为10～50g/L。
上述技术方案中，反应增强剂均为非离子型水溶性聚合物，具很强的亲水性，在水中的溶解度比较大，可以调节C肽R1试剂的浓度，促进抗原和抗体分子结合为复合物；同时反应增强剂可以破坏溶液中蛋白质周围的电子云和水化层，促进特异性的抗原和抗体分子聚集形成大分子复合物。
作为优化，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种；
其中C肽R1试剂中防腐剂的浓度为0.3～3g/L；C肽R2试剂中防腐剂的浓度为0.3～3g/L；C肽校准品中防腐剂的浓度为0.3～3g/L。
作为优化，所述聚苯乙烯胶乳颗粒为羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒或者醛基化聚苯乙烯胶乳颗粒，其粒径为200～500nm。
上述技术方案中，羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒采用碳化二亚胺EDAC活化后再与抗人C肽抗体偶联，醛基化聚苯乙烯胶乳颗粒无需活化即可直接与抗人C肽抗体偶联，其中聚苯乙烯胶乳颗粒与EDAC的质量比为0.5～5:100，这样可以使聚苯乙烯胶乳颗粒表面快速活化，使聚苯乙烯胶乳颗粒上的基团与抗人C肽抗体上的氨基缩合形成交联结构，提高了二者之间的作用力以及胶乳颗粒的稳定性，进而可以准确、快速的测试检测标本中的C肽含量。
作为进一步优化，聚苯乙烯胶乳颗粒为羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒，这是因为其更容易被活化，与抗人C肽抗体之间的偶联作用更强。
作为优化，所述抗人C肽抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。这样的抗体与检测样本中的C肽特异性结合能力高；其中优选单克隆抗体，因为单克隆抗体不会与检测样本中的胰岛素原以及其他抗原发生交叉反应，从而保证了测试结果的准确度和可靠性。
与现有技术相比，本发明具如下有益效果：
1、本发明中的试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法的原理来测试待测标本（人血液或者尿液）中的C肽含量，可以适用于半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪，具有操作简单、快速、精确度高、自动化程度高的优点，适用于在临床上广泛使用，特别是对急诊能实现快速定量测定。
2、包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用定向偶联法将抗人C肽抗体包被到胶乳颗粒上得到，抗人C肽抗体的偶联部位为Fc片段，使抗原结合位点指向流动相，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。此外，所使用的致敏性胶乳颗粒稳定性好，抗体不会与胶乳颗粒脱离，而且由于化学偶联过程中，Fc片段发生了结构上的改变，因此减少了类风湿因子RF和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。
附图说明
图1是实施例1制备的C肽检测试剂盒的校准曲线图。
图2是实施例1制备的C肽检测试剂盒的线性范围相关性曲线。
图3是实施例1制备的C肽检测试剂盒与Roche试剂盒检测结果相关性比较的曲线。
具体实施方式
下面结合优选的具体实施例和附图对本发明进行详细的说明。
值得说明的是，本发明所用的原料基本均可以为市售产品，其中三羟甲基氨基甲烷Tris购自Sigma公司；其中羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒以羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液的形式加入，购自Lifetechnologies公司；C肽重组蛋白购自芬兰Hytest公司。
一、定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备
实施例1：
一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品。
以制备1LC肽R1试剂为例，由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和50gPEG6000制备得到，最终C肽R1试剂中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L；
以制备1LC肽R2试剂为例，由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终C肽R2试剂中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
以制备1LC肽校准品为例，由浓度为100mM的PBS缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和C肽重组蛋白以制备得到，最终C肽校准品中PBS缓冲液的浓度为100mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
上述C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品具体可以采用如下方法得到：
1）C肽R1试剂：
称取6.06g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、3gBSA、50gPEG6000、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，用HCl调节pH至7.0，定容至1L即得试剂R1。这样可以使C肽R1试剂中的各个组分分散混合均匀，同时在保存期内其性能不会发生变化。
2）C肽R2试剂：
①乳颗粒的活化、洗涤：
取质量体积比为10%的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液100μL，向其中加入质量浓度为1%EDAC溶液10μL，置于37℃摇床中反应0.5～1h后，再在12000rmp的转速下离心分离30min，然后倒掉上层清液，再用浓度为50mM、pH为7.2的甘氨酸缓冲液洗涤三次，最后将沉淀分散于1L浓度为50mM、pH为7.2的甘氨酸缓冲液中，使最终溶液中聚苯乙烯胶乳颗粒的浓度（以质量体积比计）为0.5～1%。
上述技术方案中，羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒以羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液的形式加入，其作用等同于羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒；而且羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒在溶液中分布均匀，用EDAC溶液可以将官能团充分活化，可以与抗体形成偶联结构。
②抗体的纯化：
将鼠源抗人C肽抗体加入到透析袋中，在100mM、pH为7.2的PBS缓冲液中透析48小时，在透析的过程中换缓冲液3次，得到纯化的鼠源抗人C肽抗体；这样可以去除鼠源抗人C肽抗体中的稳定剂等杂质，以避免测试结果不准确。
③抗体胶乳颗粒的偶联：
将经过步骤①活化后的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液与步骤②纯化后的抗体混合，混匀后置于37℃摇床孵育2h，得到抗体-胶乳颗粒复合物；然后将抗体-胶乳颗粒复合物在12000rpm离心30min，倒掉上清液，再用浓度为100mM、pH为7.2的PBS缓冲液洗涤2次，最后再加入浓度为50mM、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液10ml，搅拌混合均匀即可。其中10ml的Tris-HCl缓冲液中含有0.5mg的牛血清白蛋白BSA和1mg的叠氮钠；所述包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.05～0.20%；这样能够保持羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒与鼠源抗人C肽抗偶联结构的长期稳定性。
3）C肽校准品：
称取35.61Na2HPO4·2H2O、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1L，将C肽重组蛋白溶于上述配制好的溶液中，配制成C肽重组蛋白的浓度分别为0、200pmol/L、500pmol/L、1000pmol/L、2000pmol/L和4000pmol/L的溶液，即得到C肽校准品。
实施例2：
一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品。
以制备1LC肽R1试剂为例，由浓度为200mM甘氨酸缓冲液、5g牛血清白蛋白BSA、2g叠氮钠和40gPEG8000制备得到，最终C肽R1试剂中甘氨酸缓冲液的浓度为200mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为2g/L，PEG8000的浓度为40g/L；
以制备1LC肽R2试剂为例，由浓度为50mM的硼砂缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、0.3g的叠氮钠和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终C肽R2试剂中硼砂缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为0.3g/L；
以制备1LC肽校准品为例，其由浓度为100mM的PBS缓冲液、2g牛血清白蛋白BSA、2g叠氮钠和C肽重组蛋白制备得到，最终C肽校准品中PBS缓冲液的浓度为100mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为2g/L，叠氮钠的浓度为2g/L；
上述C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品的制备方法可以采用实施例1中的制备方法。
实施例3：
一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品。
以制备1LC肽R1试剂为例，由浓度为200mM的PBS缓冲液、5g牛血清白蛋白BSA、3g叠氮钠和50gPEG8000制备得到，最终C肽R1试剂中PBS缓冲液的浓度为200mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为3g/L，PEG8000的浓度为50g/L；
以制备1LC肽R2试剂为例，由浓度为50mM的硼砂缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终C肽R2试剂中硼砂缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
以制备1LC肽校准品为例，由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和C肽重组蛋白制备得到，最终C肽校准品中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
上述C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品的制备方法可以采用实施例1中的制备方法。
实施例4：
一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品。
以制备1LC肽R1试剂为例，由浓度为200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液、3.5g牛血清白蛋白BSA、2g叠氮钠和30gPEG8000制备得到，最终C肽R1试剂中柠檬酸-磷酸盐缓冲液的浓度为200mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3.5g/L，叠氮钠的浓度为2g/L，PEG8000的浓度为30g/L；
以制备1LC肽R2试剂为例，由浓度为50mM的甘氨酸缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终C肽R2试剂中甘氨酸缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
以制备1LC肽校准品为例，由浓度为100mM的PBS缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和C肽重组蛋白制备得到，最终C肽校准品中PBS缓冲液的浓度为100mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
上述C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品的制备方法可以采用实施例1中的制备方法。
二、定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒的使用方法
检测仪器：OLYMPUSAU640全自动生化分析仪
分析方法：采用两点终点法，具体参数为：测定波长：600nm；C肽校准品：25μL；C肽R1试剂：240μL；C肽R2试剂：80μL；校准方式：多点校准；反应方向：+。
将C肽校准品与C肽R1试剂混合均匀，37℃孵育1min后，读取吸光度值A1，反应4min后读取吸光度值A2，计算吸光度变化值△A=A2-A1；然后以△A值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制校准曲线，校准曲线如图1所示。
取待测样本25μL，按相同的方法测定其△A，代入校准曲线，即可计算出待测样本中C肽的含量。如果血清或尿液样本中C肽的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。
三、定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒的性能测试
将实施例1制备的检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒进行性能测试，主要测试其线性范围、最低检出限、重复性和准确度以及稳定性，同时将其与Roche公司生产的试剂盒进行比较。
1）线性范围
将浓度为3710pmol/L的C肽样本与生理盐水按照体积比1：1、1：2、1：4、1：8、1：16和1：32稀释成六个浓度（Xi）的溶液，用所述测定方法测定各稀释样本浓度。每个浓度重复测定3次，取均值（Yi）。以xi为自变量，以yi为因变量求出线性回归方程。按公式（1）计算相关系数r，结果显示线性回归方程为y=1.0131x+5.3413，相关系数r=0.9991，线性范围相关性如图2所示，结果表明试剂盒在18～3600pmol/L线性范围内相关性较好。
2）最低检出限
以质量浓度为5%的BSA生理盐水为空白样本，按所述生化分析仪检测方法重复测定20次，以空白均值加两倍标准差报告最低检测限，结果显示其最低检出限为11pmol/L。
3）重复性和准确度
用Roche公司标示值分别为200pmol/L和1000pmol/L的C肽血清作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值（）和标准差（S），以S/×100%计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为3.51%和3.71%；以（1-/标示值）×100%计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为3.88%和1.40%，测试结果如表1所示：
3）稳定性测试
稳定性从开瓶稳定性和长期稳定性两个方面进行表征。
所述开瓶稳定性：将实施例1制备的试剂盒开瓶后置于2℃～8℃保存30天后取出，按所述生化分析仪检测方法测定Roche公司标示值分别为200pmol/L和1000pmol/L的血清，各浓度重复测定3次取均值，计算检测结果与标示值的相对偏差，测试结果如表2所示，由表中可以看出：开瓶30天后试剂盒检测值与标示值的相对偏差分别为2.08%和1.10%，其开瓶稳定性较好。
所述长期稳定性：将实施例1制备的试剂盒置于2℃～8℃保存18个月后取出，按所述生化分析仪检测方法测定Roche公司标示值分别为200pmol/L和1000pmol/L的血清，各浓度重复测定3次取均值，计算检测结果与标示值的相对偏差，测试结果如表2所示，由表中可以看出：在2℃～8℃保存18个月后，试剂盒的检测值与标示值的相对偏差分别为4.65%和2.25%，其长期稳定性较好。
4）与Roche公司生产的C肽检测试剂盒相关性比较
选择79份新鲜血清样本，其中男性42例，女性37例；年龄27～85岁，平均年龄47.5岁。其中正常糖耐量患者17例；空腹血糖升高或糖耐量减低者25例；2型糖尿病患者37例。使用实施例1制备的C肽检测试剂盒和进口Roche公司生产的C肽检测试剂盒分别对同一份血清进行测定，每份血清测定2次取均值，对79例样本检测结果进行线性回归分析，并计算2种试剂检测结果的相关系数r。
结果如图3所示，由图中可以看出，两种试剂盒检测结果的线性回归方程为：y=0.9317x+33.64，相关系数r=0.9962。根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）文件要求（r>0.975），本发明的技术方案制备的检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒在临床上可以替代进口试剂盒使用，从而可以降低检测成本。
四、实施例1～4得到的试剂盒的性能比较
为了进一步验证本发明的效果，将实施例1～4得到的试剂盒进行性能对比测试，其中主要测试了检测限、准确度、重复性和长期稳定性四个方面的性能。
测试结果如表3所示：
由表3中可以看出：本发明得到的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒具有较高的稳定性、灵敏度等优点；其中实施例1得到的试剂盒的测试效果最好。
最后说明的是，以上实施例是对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括C肽R1试剂、C肽R2试剂和C肽校准品；
所述C肽R1试剂由缓冲液、保护剂Ⅰ、反应增强剂和防腐剂得到；
所述C肽R2试剂由缓冲液、保护剂Ⅰ、防腐剂和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒得到，其中包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用定向偶联法将抗人C肽抗体包被到聚苯乙烯胶乳颗粒上得到，抗人C肽抗体的偶联部位为Fc片段；所述抗人C肽抗体为鼠源抗人C肽抗体、兔源抗人C肽抗体或者羊源抗人C肽抗体；
所述C肽校准品由缓冲液、保护剂Ⅱ、防腐剂和C肽重组蛋白得到；
所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或者几种；
其中C肽R1试剂中缓冲液的浓度为20～200mM；C肽R2试剂中缓冲液的浓度为20～200mM；C肽校准品中缓冲液的浓度为20～200mM；
所述保护剂Ⅰ为牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA和明胶中的一种；其中C肽R1试剂中保护剂Ⅰ的浓度为1～10g/L；C肽R2试剂中保护剂Ⅰ的浓度为1～10g/L；
所述保护剂Ⅱ为牛血清白蛋白BSA，其中C肽校准品中保护剂Ⅱ浓度为1～8g/L。
2.根据权利要求1所述的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述反应增强剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的一种，其中C肽R1试剂中反应增强剂的浓度为10～50g/L。
3.根据权利要求1所述的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种；
其中C肽R1试剂中防腐剂的浓度为0.3～3g/L；C肽R2试剂中防腐剂的浓度为0.3～3g/L；C肽校准品中防腐剂的浓度为0.3～3g/L。
4.根据权利要求1所述的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯胶乳颗粒为羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒或者醛基化聚苯乙烯胶乳颗粒，其粒径为200～500nm。
5.根据权利要求1所述的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述抗人C肽抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的定量检测C肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，
所述C肽R1试剂1L，由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和50gPEG6000制备得到，最终C肽R1试剂中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L；
所述C肽R2试剂1L，由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终C肽R2试剂中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
所述C肽校准品1L，由浓度为100mM的PBS缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和C肽重组蛋白以制备得到，最终C肽校准品中PBS缓冲液的浓度为100mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L。
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