CN108267580B

CN108267580B - 一种利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂

Info

Publication number: CN108267580B
Application number: CN201711271866.6A
Authority: CN
Inventors: 徐林
Original assignee: Nanjing Tzong Blotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Tianzong Yijun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN108267580A

Abstract

本发明涉及一种利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂，公开的是一类可以抑制RF干扰的免疫比浊试剂，本试剂为双试剂产品，包括试剂1和试剂2，其中试剂1为含有促聚剂的缓冲液，试剂2为包被抗体的乳胶颗粒。本发明是将一种具有活性的二肽添加到试剂1中，此二肽具有与IgM型RF结合的活性基团，使其在检测样本时，即抗原抗体结合时能够有效抑制样本中的IgM型RF对被检抗原的干扰。本发明方案提出一种简单、高效、通用型免疫比浊试剂的配置，特异有效的消除RF的干扰，提高检测结果的特异性和准确性，试剂组成简单，具有广泛的通用性。

Description

一种利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂

技术领域：

本发明涉及一种免疫检测试剂，特别是一种抑制RF干扰的免疫比浊试剂。

背景技术：

类风湿因子(rheumatoid factor，RF)于20世纪四十年代被Waller发现，是一种能特异性地结合IgG分子Fc片段CH2和CH3区域，形成免疫复合物的变异的自身抗体。研究发现，RF也能与其它抗原性物质如某些病毒蛋白、核小体发生免疫交叉反应。此外，RF在肺结核、系统性红斑狼疮、口咽干燥综合症、肝炎等免疫疾病中也发现存在。RF的类型有 IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五型，其中IgM型RF阳性率为60％-78％。

免疫比浊法的常规检测中常常受到样本中RF的干扰，RF是抗人IgG分子Fc片段上抗原决定簇的特异性抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。它的存在通常会导致检测结果过高或过低，造成临床误判的发生。RF干扰的发生具有随机性。某一个体，RF的干扰没有规律可循。其中的原因可能与RF自身的特异性和同系的特异性有关，一种RF抗原不能与所有的IgG分子Fc部分的抗原结合，只有当RF抗原的决定簇与IgG分子上Fc段对应的空间结构有互补性时才有可能结合，所以RF与IgG Fc段的结合是随机的，没有规律可言。RF的干扰程度与RF浓度的剂量效应不明确。无论高浓度还是低浓度的RF均会对免疫检测引起干扰。

目前对于免疫检测干扰确认的方法主要分为以下几种：(1)样本梯度稀释检测法：通过对分析样本进行连续的稀释，分析稀释系数与浓度梯度变化的线性关系，若线性关系良好，则分析该样本中不存在干扰现象，若线性相关不好，则说明被检样本中存在干扰物质。 (2)加样回收实验：通过向检测样本中加入已知量的分析物，计算回收率，如果回收率在检测系统预定回收率范围内，可排除干扰的存在，如果回收率高于检测系统正常回收率，提示检测结果偏高，样本检测结果可能存在假性增高，如果回收率远低于检测系统正常回收率，提示检测结果偏低，样本检测结果可能存在假性降低。(3)使用不同方法学或不同厂商的检测系统复查：使用不同方法学或不同厂商的检测系统复查，寻找与测量的替代方法之间的差异。

在免疫检测及免疫研制过程中减少RF干扰的方法通常有：(1)样品前处理：在检测和分析前对样本进行预处理以减少样本中RF的干扰，通常的处理方法包括：使用固相IgG吸附剂吸附样本中的RF，或向其中加入动物血清或者IgG，或者加入封闭阻断试剂等。但是这样的操作会增加产品使用的复杂性，向其中加入蛋白也可能影响产品检测的准确性。(2)选择使用商品化的特定封闭剂，这样可有效减少RF引起的干扰，但是对于企业而言，相对应的高成本投入又是不被接受的。(3)在产品研制过程中，选择截断Fc部分，仅保留Fab 段的抗体进行标记。但是这样的修改可能增加抗体的包被和标记的难度，目前市场上也无此类检测系统。

为解决上述问题，本发明使用一种简单的特定二肽来抑制IgM型RF对免疫比浊试剂检测时的干扰，使其与现有抗RF干扰的物质相比，具有简单、经济、有效等优点，具有广泛的通用性，可以提高检测结果的特异性和准确性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂，二肽序列简单、方便合成，对RF抑制效果明显，不同项目间通用性强，可以显著提高检测结果的特异性和准确性。

本发明公开的利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂，包括试剂1和试剂2。其中试剂2为包被抗体的乳胶颗粒，试剂1的pH值为6.5-8.5。优选地，pH 值为7.0-7.5。

本发明公开的利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂的一种改进，试剂1中还包括特定二肽序列，其序列为甘氨酸-苯丙氨酸(Gly-Phe)、谷氨酰胺-苯丙氨酸(Gln-Phe)、半胱氨酸-色氨酸(Cys-Trp)、甲硫氨酸-色氨酸(Met-Trp)、天冬氨酸-苯丙氨酸(Asp-Phe)、天冬氨酸-天冬酰胺(Asp-Asn)、脯氨酸-色氨酸(Pro-Trp)中的一种或多种，优选地，特定二肽为甘氨酸-苯丙氨酸(Gly-Phe)、谷氨酰胺-苯丙氨酸(Gln-Phe)、甲硫氨酸-色氨酸(Met-Trp)、天冬氨酸-苯丙氨酸(Asp-Phe)中的一种。

本发明公开的利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂的一种改进，其中含有盐离子Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、HCO₃ ^-、CO₃ ^2-、PO₃ ^2-、HPO₃ ^-中的一种或几种，优选地，盐离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、HCO₃ ^-、CO₃ ^2-中的一种或几种。

本发明方案中抑制IgMRF结合的原理基于：IgM型RF的活性区域在VL与VH之前，这之间的狭小区域，使其更易结合肽类小分子，而不是大分子的蛋白质。通过将20种常用氨基酸按照的排列组合的方式合成400余种二肽组合序列。通过抑制ELISA试验筛选出易于与IgM型RF结合的二肽序列，将该种二肽序列添加到试剂1，并辅以相应浓度的盐离子及表面活性剂，减弱RF对检测抗体的非特异性结合反应，从而有效消除RF对检测结果的干扰。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明发明而不限制于本发明的范围。

本发明方案广泛通用地适用于免疫比浊方法学，包括普通免疫比浊方法学和胶乳增强免疫比浊法方法学。以下实施例仅列举超敏C反应蛋白(CRP)胶乳增强免疫比浊试剂的应用以说明本发明方案的优越性，但是这并非用于限制本发明方案的保护范围，其仍使用于其它大多数免疫比浊

实施例1

1)超敏CRP胶乳增强免疫比浊试剂2(pH8.0)的组成：

甘氨酸缓冲液(0.05mol/L)、海藻糖(8％)、Tris溶液(0.01mol/L)、包被抗CRP抗体的乳胶微球(0.2％)。

2)添加不同含量、不同类型RF的超敏CRP样本的制备：

向含有5mg/L的CRP的样品中分别添加IgM、IgG、IgA、IgE型的RF 0IU/mL、25IU/mL、50IU/mL、150IU/mL、300IU/mL。

3)试剂1中添加不同序列的二肽：

超敏CRP检测试剂1-1：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Gly-Phe过饱和浓度，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-2：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Gln-Phe过饱和浓度，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-3：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Met-Try过饱和浓度，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-4：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-5：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Pro-Try过饱和浓度，pH7.5。

4)添加不同序列二肽后，试剂的抗干扰能力的测定：

以上配制的五种超敏C反应检测试剂1(试剂1-1、1-2、1-3、1-4、1-5，各试剂所含的二肽序列不同)与统一试剂2配套使用，对待测样本CRP含量进行检测。检测结果如表1 所示，对于添加了IgG型、IgA型、IgE型的RF的样本，二肽添加后试剂的抗干扰能力并未提示，说明二肽对这三种亚型的RF并没有抗干扰能力，但是对于IgM型的RF的干扰， Asp-Phe序列的添加后，所测的含有不同浓度RF的样本结果都接近样本真实浓度，偏差在±10％以内。

实施例2

超敏CRP检测试剂R1中添加Asp-Phe，在不同pH对IgM型RF干扰的抑制比较：

超敏CRP检测试剂1-6：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH6.5。

超敏CRP检测试剂1-7：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH7.0。

超敏CRP检测试剂1-8：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-9：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH8.0。

超敏CRP检测试剂1-10：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，pH8.5。

以上五种超敏CRP检测试剂1(1-6、1-7、1-8、1-9、1-10)各试剂的pH不同，与同一试剂2配套使用，对待测样本CRP进行检测。检测结果如表2所示，在pH6.5、pH7.0、 pH8.0、pH8.5时、对IgA、IgE、IgG型的RF干扰的影响，都没有很好的消除，随着添加的RF的浓度的增高，检测结果也普遍偏高，当试剂1的pH值为7.5时，对于IgM型RF 的干扰消除效果明显，实测结果值与理论值相对偏差可在±10％以内。

实施例3

超敏CRP检测试剂R1添加Asp-Phe pH7.5下，不同的离子类型对IgM型RF干扰的抑制比较：

超敏CRP检测试剂1-11：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，CaCl₂(2mmol/L)，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-12：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，MgCl₂(2mmol/L)，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-13：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，KHCO₃(2mmol/L)，pH7.5。

超敏CRP检测试剂1-14：PBS缓冲液(0.01mol/L)、Tween(0.1％)、NaN₃(0.01％)、PEG6000(1％)、Asp-Phe过饱和浓度，Na₂CO₃(2mmol/L)，pH7.5。

以上四种离子添加的检测试剂1(1-11、1-12、1-13、1-14)各试剂的离子添加种类不同，与同一试剂2配套使用，对待测样本CRP进行检测。检测结果如表3所示，在CaCl₂、Na₂CO₃、MgCl₂添加时、对IgA、IgE、IgG型的RF干扰的影响，都没有很好的消除，随着添加的RF的浓度的增高，检测结果也普遍偏高，当试剂1添加KHCO₃时，对于IgM型 RF的干扰消除效果明显，实测结果值与理论值相对偏差可在±10％以内。

鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不再对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以前述实施例作为代表说明本发明申请优异之处。

本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例，而各个参数之间并不存在严重的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明诉求时可以相互替换，特别声明的除外。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

表1不同序列二肽对不同浓度下不同类型的RF抗干扰能力表

表2 Asp-Phe在不同pH下对不同浓度不同类型的RF抗干扰能力表

表3 Asp-Phe在pH7.5下，添加不同类型的离子对不同浓度不同类型的RF抗干扰能力表

Claims

1.一种利用特定二肽的活性基团抑制IgM型RF干扰的免疫比浊试剂，其特征在于，所述的免疫比浊试剂包括含有与IgM型RF特异结合特定二肽的试剂1和含有抗体的试剂2；

所述的特定二肽为天冬氨酸-苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的免疫比浊试剂，其特征在于，所述试剂1的pH值在6.5-8.5。

3.根据权利要求1所述的免疫比浊试剂，其特征在于，所述试剂1中含有盐离子Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、HCO₃ ^-、CO₃ ^2-、PO₃ ^2-、HPO₃ ^-中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的免疫比浊试剂，其特征在于，所述含有抗体的试剂2中的抗体包被在乳胶颗粒上或不包被在胶乳颗粒上。