WO2005114186A1 - ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 - Google Patents

ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 Download PDF

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WO2005114186A1
WO2005114186A1 PCT/JP2005/008523 JP2005008523W WO2005114186A1 WO 2005114186 A1 WO2005114186 A1 WO 2005114186A1 JP 2005008523 W JP2005008523 W JP 2005008523W WO 2005114186 A1 WO2005114186 A1 WO 2005114186A1
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hyaluronic acid
habp
reagent
antibody
latex particles
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PCT/JP2005/008523
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Kyoichi Sumida
Kazunari Fujio
Shinzo Kobatake
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Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, e.g. Konjac gum, Locust bean gum, Guar gum
    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring hyaluronic acid with excellent storage stability and high accuracy, and a reagent kit thereof.
  • Hyaluronic acid is mainly contained in connective tissues such as animal joint fluid, eye glass fluid, umbilical cord, and dermis surface layer. Its blood concentration is known to increase during rheumatism, cancer and liver diseases, and is considered to be useful for diagnosis of these diseases. Various measurement methods are currently being developed!
  • a measuring method using latex particles as a reagent for measuring hyaluronic acid is described, for example, in Japanese Patent No. 3424504.
  • the publication discloses that a hyaluronic acid-binding protein (hyaluronic acid-binding protein) is supported on carrier particles, reacted with hyaluronic acid in a sample to form a reaction mixture, and the resulting mixture is detected to measure hyaluronic acid.
  • the method is described, and in the examples, experiments are performed using latex particles having an average particle size of 368 mm.
  • latex particles having an average particle diameter of 300 nm (0.3 m) or more are liable to settle. Therefore, when used as a reagent, latex particles usually need to be used after being dispersed by shaking or the like. Therefore, when sedimentation occurs, it is desired to develop a reagent for measuring hyaluronic acid using a carrier such as latex particles, which does not require complicated operations.
  • Patent Document 1 Patent No. 3424504 Patent Publication
  • the present invention provides a method and a kit for measuring hyaluronic acid using a carrier, in which the sedimentation of the carrier is small, the storage stability thereof is excellent, and the accuracy is as high as conventional reagents.
  • the task is to provide
  • a hyaluronic acid-binding protein (hereinafter, referred to as an "average particle diameter of 0 or less") hardly sediment, so that a reagent for measuring hyaluronic acid using latex particles can be stored more stably.
  • HABP may be abbreviated) by chemical bonding or physical adsorption.
  • latex particles were pre-sensitized with a monoclonal antibody against HABP to a latex particle, and a complex of HABP and hyaluronic acid was reacted there. Can be efficiently induced.
  • the latex particles sensitized with the monoclonal antibody against HABP and the hyaluronic acid binding protein are stored as separate reagents, and the complex is formed by reacting hyaluronic acid and HABP in advance as described above.
  • the reagent can be used as a reagent for measuring hyaluronic acid with excellent storage stability, and the present invention was completed.
  • the present invention provides
  • the hyaluronic acid in the sample is brought into contact with HABP to form a hyaluronic acid-ZHABP complex, and then the complex is reacted with a carrier carrying an anti-HABP antibody. Measuring the change in hyaluronic acid and calculating the amount of hyaluronic acid measured,
  • Reagent kit for measuring hyaluronic acid comprising a reagent comprising HABP and a reagent comprising a carrier carrying an anti-HABP antibody
  • the measurement method of the present invention it is possible to perform a simpler measurement than the conventional method, for example, it is not necessary to shake the reagent at the time of use, and to measure hyaluronic acid with the same high accuracy as the conventional reagent Becomes possible.
  • the reagent kit of the present invention is excellent in storage stability with little sedimentation of the carrier, and the use of the kit enables highly accurate measurement of hyaluronic acid equivalent to conventional reagents. Can be determined.
  • the hyaluronic acid binding protein (HABP) according to the present invention is not particularly limited as long as it includes a hyaluronic acid binding portion in a protein having a property of binding to hyaluronic acid, such as proteodarican, link protein, and hyaluronectin.
  • a protein having a property of binding to hyaluronic acid such as proteodarican, link protein, and hyaluronectin.
  • the gene for the hyaluronic acid binding portion in the protein may be cut, whether it is the protein itself, a partial protein containing the hyaluronic acid binding portion in the protein, or a substance containing the protein. It may be a recombinant protein or the like obtained by incorporating it into another protein.
  • the anti-HABP antibody according to the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody against HABP, but a polyclonal antibody or monoclonal antibody prepared by affinity purification of a single epitope is preferable.
  • Monoclonal antibodies capable of binding hyaluronic acid efficiently are particularly preferred. Among them, it is preferable to appropriately digest with enzymes such as pepsin and papain and use as Fab, Fa, (Fab ') 2 or the like.
  • the antibody can be prepared by a conventional method, such as the method described in “Introduction to Immunology Experiments, Second Printing, Nao Matsuhashi, Gakkai Shuppan Center, 1981” and the like. , Cows, sheep, rabbits, goats, rats, mice, and other animals are immunized with an HA-binding protein.
  • a monoclonal antibody is used as an anti-HABP antibody
  • the antibody is prepared by a conventional method, According to the cell fusion method established by Stein (G. Kohler and C.
  • milstein nature, 256, 495, 1975
  • cells from a tumor line of a mouse and splenocytes of a mouse previously immunized with an HA-binding protein were used. It is produced by a hybridoma obtained by fusion.
  • any carrier can be used as long as it is a carrier used in a usual immunoassay.
  • natural organic high molecular substances such as erythrocytes, bacteria, cell debris and the like can be used.
  • Ribosomes, molecular aggregates such as polymer micelles, polystyrene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, polyglycidyl methacrylate, polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polycarbonate, silicone resin, silicone rubber
  • Preferred are those prepared using inorganic substances such as synthetic polymer compounds such as porous glass, ground glass, alumina, silica gel, activated carbon, and metal oxides. .
  • These carriers can be used in various forms such as tubes, beads, disc-shaped pieces, fine particles, latex particles, and the like.
  • latex particles are artificial carriers, and are particularly preferable in that the surface of the carrier can be easily chemically treated according to the purpose, and nonspecific reaction hardly occurs.
  • the material is not particularly limited, for example, styrene-based latex particles such as polystyrene latex particles, acrylic acid-based latex particles, and the like are preferable, and examples thereof include those.
  • polystyrene latex particles obtained by emulsion polymerization without using an emulsifier have a strong hydrophobicity on the surface, so that proteins or peptides are smoothly adsorbed and negative charges on the surface are negatively charged. It is particularly preferable because it has a property of being stably dispersed in a solution without an emulsifier, based on the repulsion of the resin.
  • modified latex particles for example, carboxylic acid-modified latex particles having a carboxyl group introduced into polystyrene
  • magnetic latex particles latex particles containing magnetic particles
  • latex particles used in the present invention commercially available latex particles can be used.
  • 1S latex particles with a small average particle size that is, those with a large surface area per unit weight, can support antibodies efficiently and have good storage stability (dispersibility in aqueous solution). Since it is used, it is preferably used. More specifically, usually 0.0
  • Those having an average particle size of 5 to 0.3 m, preferably 0.1 to 0.25 m are preferred.
  • a material having a small average particle size sedimentation of latex particles can be suppressed, and the anti-HABP antibody can be efficiently carried on the latex particles. That is, by using such anti-HABP antibody-supported latex particles, the stability of the measurement reagent is improved, and highly accurate measurement becomes possible.
  • the method of supporting the anti-HABP antibody of the present invention on the carrier of the present invention is not particularly limited as long as it is performed by bringing the anti-HABP antibody into contact with the carrier.
  • all known loading methods used in this field can be mentioned, for example, a so-called physical adsorption method (physical adsorption method) in which an anti-HABP antibody is physically adsorbed on a carrier and the anti-HABP antibody is loaded on the carrier.
  • the method generally includes, for example, synthetic polymer compounds such as polystyrene, polypropylene, polychlorinated vinyl, polyethylene, and polycarbonate carbonate; activated carbon such as porous glass, ground glass, alumina, silica gel, metal oxide, and the like.
  • synthetic polymer compounds such as polystyrene, polypropylene, polychlorinated vinyl, polyethylene, and polycarbonate carbonate
  • activated carbon such as porous glass, ground glass, alumina, silica gel, metal oxide, and the like.
  • an inorganic substance such as hydroxyapatite
  • it is particularly preferable to use glass, polystyrene, polyvinyl chloride, or the like in the form of, for example, tubes, beads, disc pieces, fine particles, latex particles, and the like.
  • the anti-HABP antibody according to the present invention is usually 0.05 to 2 mg / ml, preferably 0.1 to Lmg / ml.
  • the latex particles are usually added and suspended in a solvent such as a buffer solution containing 0.1 ml to 10% (w / v), preferably 0.2 to 5% (w / v).
  • a solvent such as a buffer solution containing 0.1 ml to 10% (w / v), preferably 0.2 to 5% (w / v).
  • post-treatments performed in this field such as centrifugation, for example, blocking treatment using a solution containing a suitable protein such as bovine serum albumin (BSA), etc.
  • BSA bovine serum albumin
  • the anti-HABP antibody can be carried on a carrier by using a method using a chemical bond used in this field.
  • the method for measuring hyaluronic acid according to the present invention comprises contacting hyaluronic acid in a sample with the HABP according to the present invention to form a hyaluronic acid ZHABP complex, and then forming the complex and the anti-HABP antibody according to the present invention.
  • the reaction is carried out by reacting the carrier with the carrier, and the optical change due to the aggregate generated by the reaction is measured, and the measured value is calculated by calculating the amount of hyaluronic acid.
  • the measurement of the optical change as used herein refers to the measurement of an optical change resulting from immunoagglutination, and specifically, a reverse passive agglutination reaction method, an immunoflux method, an immunoturbidity method. Immunization coagulation method such as the law. These measurement methods may be performed according to a method known per se.For example, when the reverse passive agglutination method is used, ⁇ Tokyo Kagaku Doujin Seikagaku Kenkyusho 5 Lecture on Immunobiochemistry p.36-37 '' For example, in ⁇ Kinbara Publishing Co., Ltd., Clinical Laboratory Method Proposal, 30th Edition, p. 844-845 '', etc. 853 et al., Etc., use the method described in Kanehara Publishing Co., Ltd., Clinical Laboratory Methods, 30th Edition, p. 853-854, etc. Just do it.
  • the measurement method of the present invention will be described below more specifically by taking, for example, an immunoturbidimetric method using latex particles as a carrier. That is, a sample containing hyaluronic acid (more specifically, for example, a body fluid such as blood, plasma, serum, synovial fluid, auxiliary fluid, lymph, bone marrow fluid, urine, etc.) is contacted with a reagent containing HABP as described above. Mix to form hyaluronic acid ZHABP complex. Then, for example, the anti-HABP antibody as described above is loaded on latex particles having an average particle size of 0.05 to 0.3 / zm, preferably 0.1 to 0.25 / zm, and is sensitized.
  • hyaluronic acid more specifically, for example, a body fluid such as blood, plasma, serum, synovial fluid, auxiliary fluid, lymph, bone marrow fluid, urine, etc.
  • the drug is allowed to react with the above complex, the degree of aggregation that results is measured using, for example, absorbance, and the concentration of the hyaluronic acid in the sample is determined by determining the concentration of the calibration curve of the standard obtained in advance. Is quantified.
  • the absorbance may be measured at a wavelength of usually from 340 to 1000 nm, preferably from 500 to 900 nm.
  • the degree of aggregation is not limited to the absorbance, and any value may be used as long as it is a method known per se, for example, a method such as nephelometry or counting imnoassay.
  • an appropriate An aggregation promoter may be added. Specific examples of such an aggregation promoter will be described in the section of the reagent kit of the present invention.
  • the concentration of HABP used in the HABP reaction varies depending on the calibration limit of hyaluronic acid, but the concentration of hyaluronan corresponding to the normally set calibration limit concentration is varied.
  • the concentration is at least the concentration capable of binding to all, preferably at least 5 times the concentration, more preferably at least 10 times the concentration.
  • the upper limit in this case is not particularly limited as long as it does not affect the measurement. However, considering an economical amount, it is usually 50,000 times or less, preferably 10,000 times or less.
  • the calibration limit is usually 10 to LOOOngZml. Therefore, the concentration of HABP used in the HABP reaction should be appropriately set within the above range based on this calibration limit. Just fine.
  • the pH during the reaction is not particularly limited as long as it does not prevent the complex from being formed. It is not limited, and usually ranges from 5 to 10, preferably from 6 to 8, and the temperature during the reaction is not particularly limited as long as it does not prevent the complex from being formed, and is usually from 5 to 40. ° C range.
  • the reaction time varies depending on the HABP used and the reaction conditions such as pH and temperature, and the reaction may be carried out for several seconds to several hours as appropriate.
  • the concentration of the anti-HABP antibody-carrying carrier used in the reaction of the anti-HABP antibody-carrying carrier and the hyaluronic acid ZHABP complex varies depending on the HABP concentration used above. In the case of using latex particles having a loading of HABP antibody of 0.01 to 0.1 mg / mg, it is usually 0.2 to 25 mg / ml, preferably 0.5 to 12 mg / ml, and the concentration is within the range. Then, the hyaluronic acid in the sample can be accurately measured.
  • the reaction conditions and reaction time for reacting the anti-HABP antibody-carrying carrier with the hyaluronic acid ZHABP complex may be the same as those for the above-mentioned HABP reaction.
  • the reagent kit for measuring hyaluronic acid of the present invention comprises a reagent comprising HABP,
  • the reagent kit may contain a standard substance.
  • the standard substance may be a substance commonly used in this field. For example, potassium hyaluronate (derived from cockscomb: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) And sodium hyaluronate (derived from Streptococcus: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the reagent containing HABP in the reagent kit for measuring hyaluronic acid of the present invention is obtained by dissolving HABP in an appropriate buffer as long as the reagent contains HABP as described above.
  • Buffers used for this purpose include, for example, all buffers commonly used in immunoassays, such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, and good buffer.
  • the concentration is usually 5 to 300 mM, preferably 10 to 150 mM, and the pH is appropriately selected usually from the range of 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • the concentration of HABP in the reagent containing HABP varies depending on the type of HABP used, but it is usually 0.1 to 500 ⁇ g as long as the concentration during the reaction is set to be the above concentration. / ml, preferably from 0.5 to 100 ⁇ g / ml.
  • the anti-HABP antibody-supporting carrier in the reagent kit for measuring hyaluronic acid of the present invention must not be contained.
  • the reagent to be used is a suspension of the anti-HABP antibody-carrying carrier in an appropriate buffer as long as it contains the above-described anti-HABP antibody-carrying carrier, or a lyophilized product thereof.
  • the buffer used for this purpose may be any buffer that does not have the property of preventing the anti-HABP antibody of the present invention from binding to HABP, and the buffer used in the above-described reagent containing HABP may be used.
  • the same agents as those mentioned above may be mentioned, and their pH and concentration may be similarly set according to the above values.
  • the reagent containing the anti-HABP antibody-carrying carrier is often subjected to measurement in the form of a suspension suspended in a solution such as a buffer solution.
  • the buffer used for preparing the buffer is not particularly limited as long as it is usually used in this field, but it is usually pH 5.0 to 10.0, preferably pH 6.5 to 8.5. Those having an action, for example, phosphate buffer, Tris buffer, Good buffer and the like are preferable. Depending on the properties of the insoluble fine particles to be used, spontaneous aggregation may easily occur when left in a suspension state.
  • a weakly alkaline glycine buffer, boric acid It is preferable to prepare a suspension using a buffer solution or the like in terms of storage stability.
  • the buffer concentration of these buffers is appropriately selected usually from the range of 10 to 500 mM, preferably from 10 to 300 mM.
  • the reagent may include, for example, stabilizers such as sugars, proteins, and surfactants, salts such as NaCl, and preservatives, which are commonly used in this field. May be added.
  • the concentration of the carrier carrying the anti-HABP antibody varies depending on the type of carrier and anti-HABP antibody used. As long as the concentration is set to the above concentration, it is usually selected from 1 to: LOOmg / ml, preferably 2 to 50 mg / ml.
  • an immune reaction promoter eg, polyethylene glycol, polybutyl alcohol, etc.
  • the protein component in the measurement reagent may be denatured due to some factor and become non-specific even in the presence of these agglutination accelerators. Turbidity can be suppressed or reduced.
  • used as an aggregation promoter described in JP-A-2002-365296 is disclosed.
  • the concentration range in which the monomer or polymer to be used may be contained as an aggregation promoter may be selected according to the values described in JP-A-2002-365296.
  • the monomers and polymers may be prepared according to the method described in the above-mentioned publication.
  • the reagent kit for measuring hyaluronic acid of the present invention is used for carrying out the measuring method of the present invention as described above, and preferred embodiments and specific examples of the constituent elements are as described above. is there.
  • the sample according to the present invention may be any sample containing hyaluronic acid, and specifically, for example, a body fluid such as blood, plasma, serum, joint fluid, synovial fluid, lymph, bone marrow fluid, or the like.
  • a body fluid such as blood, plasma, serum, joint fluid, synovial fluid, lymph, bone marrow fluid, or the like.
  • Urine and the like are mentioned, and among them, serum, urine and the like are preferable.
  • hyaluronic acid-binding protein purified from Pepsi nasal septum cartilage by a modified method of Laurent et al. (Manufactured by Seikagaku Corporation) was added to 10 ml of lOOmM HEPES buffer solution (0.1% BSA and l% NaCl, pH 7.0). This was used as the first test solution in Example.
  • purified water 800 1, latex particle solution 100 1 (N200 manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd .: N200: 10 wt%, latex particle size 220 nm), 500 mM borate buffer (pH 7.3) 100 ⁇ l, Add 50 mM anti-HABP monoclonal antibody ASES buffer 100 1 (4.24 mg / ml, pH 6.5), and incubate at room temperature for 100 minutes with stirring to remove the latex particle suspension carrying the anti-HABP monoclonal antibody. Obtained.
  • the anti-HABP monoclonal antibody used was one prepared by a conventional method.
  • the suspension of latex particles carrying the anti-HABP monoclonal antibody was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes. Remove the supernatant, add 1 ml of 50 mM borate buffer (containing 2.5% BSA, pH 7.3) to the pellet at the bottom of the container, and sonicate for 1 minute while cooling on ice to resuspend the pellet. Was. Then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. The supernatant was removed, and 1 ml of 50 mM borate buffer (containing 2.5% BSA, pH 7.3) was added to the pellet at the bottom of the container. Thereafter, the pellet was resuspended by sonication for 1 minute while cooling on ice. Further, the mixture was incubated at room temperature for 120 minutes while stirring, and the antibody was supported on the surface of the latex particles. The remaining area was covered with BSA.
  • 50 mM borate buffer containing 2.5% BSA, pH 7.3
  • Potassium hyaluronate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 10, 100, or 1000 ng / ml to obtain a standard hyaluronic acid solution.
  • the amount of hyaluronic acid in the standard hyaluronic acid solution prepared in 1. was measured using a fully automatic measuring system (JEOL: BM-8) under the following measurement conditions.
  • Measurement method 2-point end method
  • Table 1 shows the obtained results.
  • the values in the table are values obtained by subtracting the blank value (value obtained when the hyaluronic acid concentration is 0) from the obtained absorbance power and multiplying it by 10,000.
  • reaction solution was centrifuged at 18000 rpm for 20 minutes. The supernatant was removed, and the pellet at the bottom of the vessel was added with 1 ml of 50 mM borate buffer (containing 0.5% BSA, pH 7.3). afterwards
  • the pellet was resuspended by sonication for 1 minute while cooling on ice, and the same operation was repeated twice more.
  • the obtained solution was used as a second test solution (1).
  • HABP-sensitized latex particles were prepared in the same manner as in Comparative Example 1, except that a carboxylic acid latex particle solution of 10 wt%, 210 nm, and a carboxylic acid content of 0.5 meqZg was used. The obtained solution was used as a second reagent (2).
  • the reaction was then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. The supernatant was removed, and the pellet at the bottom of the vessel was added with 1 ml of 50 mM borate buffer (containing 2.5% BSA, pH 7.3). Then, the mixture was sonicated for 1 minute while cooling on ice, and the pellet was resuspended. It was then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes. The supernatant was removed, and 1 ml of 50 mM borate buffer (containing 2.5% BSA, pH 7.3) was added to the pellet at the bottom of the container. Furthermore, the pellet was resuspended by sonication for 1 minute while cooling on ice, incubated at room temperature for 60 minutes with stirring, and then incubated at 5 ° C overnight.
  • 50 mM borate buffer containing 2.5% BSA, pH 7.3
  • LOOmMHEPES buffer (0.1% BSA, containing l% NaCl, pH 7.0) as the first reagent, and 2nd reagents (1) to (4) as the second reagent, 50 mM borate buffer (containing 0.5% BSA, pH7)
  • the amount of hyaluronic acid in the standard hyaluronic acid solution was measured in the same manner as in Example 1 (2) except that it was used after diluting 3.33 times in .3).
  • the first reagent solution and the second reagent solution used in Example 1 were stored at 30 ° C. for one month, and the amount of hyaluronic acid was measured using the reagent solution in the same manner as in Example 1 (2). Further, the first TS used in Comparative Example 1 and the second TS (4) of Comparative Example 1 were stored at 30 ° C for one month, and the hyaluronic acid was used using the TS in the same manner as in Comparative Example 1 (5). The amount was measured.
  • Table 2 shows the obtained measurement results.
  • the value in the absorbance column in the table is a value obtained by subtracting a blank value (a value obtained when the hyaluronic acid concentration is 0) from the obtained absorbance and multiplying it by 10,000.
  • the retention of absorbance is a value obtained by dividing the obtained absorbance by the absorbance measured before incubation for one month, and expressed as a percentage.

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Abstract

　本発明は、担体の沈降が少なく、その保存安定性に優れ、且つ従来の試薬と同等に高精度な、担体を用いたヒアルロン酸測定方法及び試薬キットの提供を課題とする。また、「試料中のヒアルロン酸とHABPを接触させてヒアルロン酸／HABP複合体を形成させ、次いで該複合体と、抗HABP抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値からヒアルロン酸量を算出することを特徴とするヒアルロン酸の測定方法」並びに「 HABPを含んでなる試薬と、抗HABP抗体を担持させた担体を含んでなる試薬とからなる、ヒアルロン酸測定用試薬キット」に関する発明である。

Description

明 細 書
ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 技術分野
[0001] 本発明は保存安定性に優れ、高精度なヒアルロン酸の測定方法及びその試薬キッ トに関する発明である。
背景技術
[0002] ヒアルロン酸は、主として動物の関節液や眼球ガラス体液、臍帯、真皮表層などの 結合組織等に含まれるものである。その血中濃度は、リウマチ、癌、肝臓疾患時に上 昇することが知られ、これら疾患に対する診断に有用なものとされており、種々の測 定方法が現在開発されて!ヽる。
[0003] 一方、免疫学的測定方法において、ラテックス粒子を用いた測定方法は、その簡 便さや汎用装置への対応が容易なことから、広く使用されるようになっている。ヒアル ロン酸測定用試薬として、ラテックス粒子を用いた測定法は、例えば特許第 3424504 号特許公報等に記載されている。該公報には、ヒアルロン酸結合タンパク質 (ヒアル口 ン酸バインディングプロテイン)を担体粒子に担持させ、試料中のヒアルロン酸と反応 させて反応混合物を生成させ、それを検出することによりヒアルロン酸を測定する方 法が記載されており、実施例では、平均粒径 368應のラテックス粒子を用いて実験 がなされている。しかしながら、平均粒径が 300nm(0. 3 m)以上のラテックス粒子は 沈降し易いため、通常、試薬として用いる場合には振とう等によりラテックス粒子を分 散させた後に使用する必要があった。そのため、沈降が起きに《使用前に振とうす ると!/、つた煩雑な操作が不要な、ラテックス粒子等の担体を用いたヒアルロン酸測定 用試薬の開発が望まれていた。
[0004] 特許文献 1：特許第 3424504号特許公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 上記状況に鑑み、本発明は、担体の沈降が少なぐその保存安定性に優れ、且つ 従来の試薬と同等に高精度な、担体を用いたヒアルロン酸測定方法及び試薬キット の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、ラテックス粒子を用いたヒアルロン酸測定試薬をより安定に保存でき るようにするため、沈降しにくいラテックス粒子（平均粒径 0. 以下）にヒアルロン 酸バインディングプロテイン (以下、 HABPと略記する場合がある）を化学結合又は物 理的吸着により担持させることを試みたが、効率よく担持させることが難しぐ高精度 な測定はできな力つた。そこで、更に鋭意研究を重ねた結果、 HABPに対するモノク ローナル抗体を予めラテックス粒子に感作させ、そこへ HABPとヒアルロン酸との複合 体を反応させることにより、ヒアルロン酸量に対応したラテックス粒子凝集反応を効率 よく惹起させ得ることを見出した。更に、 HABPに対するモノクローナル抗体を感作さ せたラテックス粒子と、ヒアルロン酸バインディングプロテインを別々の試薬として保存 し、且つ上記の如く予めヒアルロン酸と HABPとを反応させて複合体を形成させて、該 複合体と HABPに対する抗体を感作させたラテックス粒子とを反応させるように操作す ることにより、保存安定性に優れたヒアルロン酸測定用試薬となることを見出し、本発 明を完成するに至った。
[0007] 即ち、本発明は、
「試料中のヒアルロン酸と HABPを接触させてヒアルロン酸 ZHABP複合体を形成させ 、次いで該複合体と、抗 HABP抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生 じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値力 ヒアルロン酸量を算出すること を特徴とするヒアルロン酸の測定方法」並びに
「 HABPを含んでなる試薬と、抗 HABP抗体を担持させた担体を含んでなる試薬とか らなる、ヒアルロン酸測定用試薬キット」
に関する。
発明の効果
[0008] 本発明の測定方法によれば、試薬を用時振とうする必要がない等、従来の方法よ り簡易な測定を可能とし、また従来の試薬と同等に高精度なヒアルロン酸の測定が可 能となる。また、本発明の試薬キットは、担体の沈降が少なぐ保存安定性に優れるも のであり、また、該キットを用いれば、従来の試薬と同等に高精度なヒアルロン酸の測 定が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明に係るヒアルロン酸バインディングプロテイン（HABP)としては、プロテオダリ カン、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン等のヒアルロン酸と結合する性質を有する蛋 白質中のヒアルロン酸結合部を含むものであれば特に限定されず、上記蛋白質それ 自体であっても、上記蛋白質中のヒアルロン酸結合部を含む部分蛋白質又はその部 分蛋白質を含む物質であっても、上記蛋白質中のヒアルロン酸結合部の遺伝子を切 り出しそれを他の蛋白質に組み込んだ遺伝子組み換え蛋白質等であってもよ 、。
[0010] 本発明に係る抗 HABP抗体としては、 HABPに対する抗体であればポリクローナル 抗体でもモノクローナル抗体でも何れでもよ 、が、単一ェピトープのァフィ-ティー精 製をしたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が好ましく、効率よくヒアルロン 酸と結合できるモノクローナル抗体が特に好ましい。中でもペプシン、パパイン等の 酵素を用いて適宜消化し、 Fab, Fa 、（Fab')2等として用いることが好ましい。抗 HABP抗体としてポリクローナル抗体を用いる場合、該抗体は、常法、例えば「免疫学 実験入門、第 2刷、松橋直ら、（株)学会出版センター、 1981」等に記載の方法に準 じて馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に HA結合性蛋白を免疫して調製 され、また、抗 HABP抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合、該抗体は、常法、 即ちケラーとミルスタイン（G.Kohler and C.milstein;nature,256,495,1975)により確立 された細胞融合法に従い、例えばマウスの腫瘍ラインからの細胞と、 HA結合性蛋白 で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイプリドーマ等により産 生される。
[0011] 本発明に係る担体としては、通常の免疫学的測定法で用いられる担体であれば何 れも使用可能であるが、例えば、赤血球、バクテリア、細胞片等の天然有機高分子物 質、リボソーム、高分子ミセル等の分子会合体、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタ クリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタタリレート、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ ニール、ポリエチレン、ポリクロ口カーボネート、シリコーン榭脂、シリコーンラバー等の 合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属 酸ィ匕物等の無機物質等を材料として調製されたものが好ましいものとして挙げられる 。また、これら担体は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子、ラテックス粒子等多 種多様の形態で使用し得る。中でも、ラテックス粒子は、人工担体であり、 目的に応じ て担体表面を化学的処理し易 、こと、また非特異反応が起こりにく 、こと等の点から 特に好ましい。その材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス粒子 等のスチレン系ラテックス粒子、アクリル酸系ラテックス粒子等が好まし 、ものとして挙 げられる。
[0012] 尚、これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られるポリ スチレンラテックス粒子等は、表面の疎水性が強いため、タンパク質或いはペプチド をスムーズに吸着し、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液 中で安定に分散するという性質を有しているので、特に好ましい。また、種々の変性 ラテックス粒子 (例えば、上記ポリスチレン中にカルボキシル基を導入したカルボン酸 変性ラテックス粒子）、磁性ラテックス粒子 (磁性粒子を内包させたラテックス粒子)等 ち使用でさる。
[0013] また、本発明に於いて用いられるラテックス粒子としては、市販のものが使用できる
1S ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単位重量あたりの表面積が大き いものが、抗体を効率良く担持させることができ且つ保存時の安定性 (水溶液中での 分散性)も良好であるので好ましいものとして用いられる。より具体的には、通常 0. 0
5〜0. 3 m、好ましくは 0. 1〜0. 25 mの平均粒径のものが好ましい。このような 平均粒径の小さいものを用いることにより、ラテックス粒子の沈降を抑えることができ、 また、抗 HABP抗体をラテックス粒子に効率よく担持させることが可能となる。即ち、こ のような抗 HABP抗体担持ラテックス粒子を用いることにより測定用試薬の安定性を 向上させ、精度の高い測定が可能となる。
[0014] 本発明に係る担体に本発明に係る抗 HABP抗体を担持させる方法は、抗 HABP抗 体と担体とを接触させることによってなされればよぐ特に限定されない。通常この分 野で利用される自体公知の担持方法は全て挙げられ、例えば、抗 HABP抗体を担体 に物理的に吸着させて抗 HABP抗体を担体に担持させる、所謂物理的吸着法〔特公 平 5- 41946号公報、スミロン テク-カルレポート， SUMILON ELISAシリーズ 1 ELISA測定法の紹介，住友ベークライト (株)発行、スミロン テクニカルレポート， S UMILON ELISAシリーズ 2 ELISA製品の固相表面，住友ベークライト（株）発 行等〕が、代表的なものとして挙げられる。該方法は、通常、例えば、ポリスチレン，ポ リプロピレン，ポリ塩ィ匕ビニール，ポリエチレン，ポリクロ口カーボネート等の合成高分 子化合物、活性炭、例えば多孔性ガラス，スリガラス，アルミナ，シリカゲル，金属酸 化物，ヒドロキシアパタイト等の無機物質を担体として用いた場合に、好ましい方法と して用いられる。なかでも、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩ィ匕ビニール等を、例えばチュ ーブ、ビーズ、ディスク片、微粒子、ラテックス粒子等の形態として用いた場合が、特 に好ましい。
[0015] 例えばラテックス粒子に本発明に係る抗 HABP抗体を担持させる場合を例に取ると 、本発明に係る抗 HABP抗体を通常 0. 05〜2mg/ml、好ましくは 0. 1〜： Lmg/ml含む 緩衝液等の溶媒中にラテックス粒子を通常 0. l〜10%(w/v)、好ましくは 0. 2〜5% (w/v)となるように添加、懸濁させ、通常 5〜30°Cで通常 2〜3時間反応させた後、こ の分野で行われる後処理、例えば遠心分離、例えば牛血清アルブミン (BSA)等の適 当なタンパク質を含有する溶液を用いるブロッキング処理等の処理を行うことにより担 持させることができる。尚、この分野で用いられる化学結合を用いる方法を用いても 抗 HABP抗体を担体に担持させることができる。
[0016] 本発明のヒアルロン酸の測定方法は、試料中のヒアルロン酸と本発明に係る HABP を接触させてヒアルロン酸 ZHABP複合体を形成させ、次いで該複合体と、本発明に 係る抗 HABP抗体を担持させた担体とを反応させ、該反応により生じた凝集物による 光学的変化を測定し、該測定値力 ヒアルロン酸量を算出することによりなされる。
[0017] 尚、ここでいう光学的変化の測定とは、免疫凝集の結果生じる光学的変化を測定 することであり、具体的には、逆受身凝集反応法、免疫比ろう法、免疫比濁法等の免 疫凝集法等が挙げられる。これら測定方法は、自体公知の方法に準じて行えばよい 力 例えば、逆受身凝集反応法を用いる場合には、「東京化学同人 続生化学実験 講座 5 免疫生化学研究法 p.36-37」、「金原出版株式会社 臨床検査法提要 第 30版 p.844-845」等に、例えば、免疫比ろう法を用いる場合には「金原出版株式会 社 臨床検査法提要 第 30版 p.851-853等」等に、免疫比濁法を用いる場合には、 「金原出版株式会社 臨床検査法提要 第 30版 p.853-854」等に記載の方法に準じ て行えばよい。
本発明の測定方法を、例えば担体としてラテックス粒子を用いた免疫比濁法を例に とって、より具体的に以下に説明する。即ち、ヒアルロン酸を含む試料 (より具体的に は、例えば血液、血漿、血清、関節液、助膜液、リンパ液、骨髄液等の体液や尿等） と上記の如き HABPを含む試薬とを接触混合させてヒアルロン酸 ZHABP複合体を形 成させる。次いで、例えば上記の如き抗 HABP抗体を例えば平均粒径 0. 05〜0. 3 /z m、好ましくは 0. 1〜0. 25 /z mのラテックス粒子に担持 (感作)させたもの力もなる試 薬と、上記複合体とを反応させ、その結果生じた凝集の度合いを例えば吸光度を用 いて測定し、予め求めてあった標準品の検量線力もその濃度を求めることによって試 料中のヒアルロン量を定量する。尚、吸光度の測定波長は、通常 340〜1000nm、好 ましくは 500〜900應で測定すればよい。また、凝集の度合いは、吸光度に限定さ れるものではなぐ自体公知の方法であればいずれでもよぐ例えばネフェロメトリー、 カウンティングィムノアッセィ等の方法により値を測定してもよい。また、ヒアルロン酸 ZHABP複合体と、抗 HABP抗体をラテックス粒子等の担体に担持させたもの（以下、 抗 HABP抗体担持担体と略記する場合がある）カゝらなる試薬を反応させる際、適当な 凝集促進剤を添加してもよい。尚、このような凝集促進剤の具体例については、本発 明の試薬キットの項で説明する。
本発明の測定方法に於ける、 HABP反応時の HABPの使用濃度としては、ヒアルロン 酸の検量限界をどの程度に設定するかによって変動はあるが、通常設定された検量 限界濃度に相当するヒアルロン酸全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその 5倍濃 度以上、より好ましくは 10倍濃度以上である。尚、この際の上限としては測定に影響 を与えない量であれば特に限定はされないが、経済的な量を考慮すると、通常その 5 万倍以下、好ましくはその 1万倍以下である。具体的には、通常 0.1〜： LOOO /z g/ml、 好ましくは 0.5〜： LOOO μ g/ml、より好ましくは 0.5〜： LOO μ g/mlである。例えば、血清 中のヒアルロン酸濃度を測定する場合、その検量限界は通常 10〜： LOOOngZmlであ るので、 HABP反応時の HABPの使用濃度は、この検量限界に基づいて上記範囲内 で適宜設定すればよい。
また、該反応時の pHとしては、複合体が形成されるのを妨げない範囲であれば特に 限定はされず、通常 5〜10、好ましくは 6〜8の範囲が挙げられ、反応時の温度も複 合体が形成されるのを妨げな 、範囲であれば特に限定されず、通常 5〜40°Cの範 囲が挙げられる。また、その反応時間は、用いられる HABP並びに pH及び温度等の 反応条件により異なるので、各々に応じて数秒間乃至数時間適宜反応させればよい
[0019] 本発明の測定方法に於ける、抗 HABP抗体担持担体とヒアルロン酸 ZHABP複合体 を反応させる際の抗 HABP抗体担持担体の使用濃度としては、上記で用いられる HABPの濃度により異なる力 抗 HABP抗体の担持量が 0. 01〜0. lmg/mgのラテツ タス粒子を用いる場合には、通常 0. 2〜25mg/ml、好ましくは 0. 5〜12mg/mlであり 、該濃度範囲内であれば、試料中のヒアルロン酸を精度よく測定することができる。尚 、抗 HABP抗体担持担体とヒアルロン酸 ZHABP複合体を反応させる際の反応条件 及び反応時間は、上記の HABP反応時のそれに準じて行われればよ 、。
[0020] 本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットとしては、 HABPを含んでなる試薬と、抗
HABP抗体担持担体を含んでなる試薬とからなるものが挙げられる。尚、該試薬キット は、標準物質を含んでいてもよぐ該標準物質としては、通常この分野で用いられて いるもので、例えばヒアルロン酸カリウム (鶏冠由来:和光純薬工業 (株)製）、ヒアルロ ン酸ナトリウム (ストレプトコッカス属由来：和光純薬工業 (株)製)等が挙げられる。
[0021] 本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットに於ける HABPを含んでなる試薬は、上記 の如き HABPを含む試薬であればよぐ適当な緩衝液中に HABPを溶解させたもので ある。この目的に使用される緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベ ロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常免疫学的測定法において用い られている緩衝剤は全て挙げられ、その濃度としては通常 5〜300mM、好ましくは 1 0〜150mMであり、その pHは、通常 5〜10、好ましくは 6〜8の範囲から適宜選択さ れる。
[0022] 上記 HABPを含んでなる試薬中の HABPの濃度としては、用いられる HABPの種類 により異なるが、反応時の濃度が上記濃度となるように設定されればよぐ通常 0.1〜 500 μ g/ml好ましくは 0.5〜100 μ g/mlの範囲になるように適宜選択される。
[0023] 本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットに於ける抗 HABP抗体担持担体を含んでな る試薬は、上記抗 HABP抗体担持担体を含むものであればよぐ適当な緩衝液中に 抗 HABP抗体担持担体を懸濁させたもの若しくはこれを凍結乾燥したものである。こ の目的に用いられる緩衝剤としては、本発明に係る抗 HABP抗体が HABPに結合す るのを妨げる性質を有さな 、ものであればよく、上記 HABPを含んでなる試薬で用い られる緩衝剤と同じものが挙げられ、その pH及び濃度も同様に上記の値に準じて設 定すればよい。
[0024] また、抗 HABP抗体担持担体を含んでなる試薬は、緩衝液等の溶液に懸濁させた 懸濁液の形態で測定に供される場合が多 、が、このような懸濁液を調製するために 用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されな いが、通常 pH5.0〜10.0、好ましくは pH6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有するもの 、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。尚、使用する不 溶性微粒子の性質によっては、懸濁液の状態で放置しておくと自然凝集を起こしや すいものもあるが、このような場合には、弱アルカリ性のグリシン緩衝液、ホウ酸緩衝 液等を使用して懸濁液を調製する方が保存安定性の面力も好ましい。また、これらの 緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常 10〜500mM、好ましくは 10〜300mMの範囲から 適宜選択される。尚、該試薬には、通常この分野で使用されている、例えば、糖類， タンパク質，界面活性剤等の安定化剤、 NaCl等の塩類、防腐剤等を、通常この分野 で使用される範囲内で添加してもよい。
[0025] 上記のような緩衝液に、本発明に係る抗 HABP抗体担持担体を懸濁させる場合、抗 HABP抗体担持担体の濃度は、使用する担体及び抗 HABP抗体の種類により異なる 力 反応時の濃度が上記濃度となるように設定されればよぐ通常 1〜： LOOmg/ml、好 ましくは 2〜50mg/mlの範囲になるように適宜選択される。
[0026] 更に、本発明に係る抗 HABP抗体担持担体を含んでなる試薬中には、免疫反応促 進剤 (凝集反応促進剤) (例えばポリエチレングリコール、ポリビュルアルコール等)が 通常この分野で用いられる濃度範囲で共存して 、てもよく、これら凝集反応促進剤 共存下であっても本発明の方法によれば、測定用試薬中の蛋白成分が、何らかの要 因により変性されて非特異的濁りとなることを、抑制或いは低減することができる。ま た、上記試薬中には、特開 2002-365296号公開公報記載の凝集促進剤として用いら れるモノマーやポリマーを、凝集促進剤として含んでいてもよぐその濃度範囲は特 開 2002-365296号公開公報記載の値に準じて選択されればよい。尚、該モノマーや ポリマーは、上記公開公報記載の方法に準じて調製されればよ!、。
[0027] 本発明のヒアルロン酸測定用試薬キットは、上記した如き本発明の測定法を実施す るために用いられるものであり、その構成要素の好ましい態様、具体例は上で述べた 通りである。
[0028] 本発明に係る試料としては、ヒアルロン酸を含む試料であればょ 、が、具体的には 、例えば血液、血漿、血清、関節液、助膜液、リンパ液、骨髄液等の体液や尿等が挙 げられ、中でも血清、尿等が好ましいものとして挙げられる。
[0029] 以下に実験例、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれ らにより何等限定されるものではない。
実施例 1
[0030] (1)試液の調製
1.第 1試液 (HABP試液)の調製
100 μ gのヒアルロン酸バインディングプロテイン（ゥシ鼻中隔軟骨より Laurentらの 変法で精製されたもの（生化学工業 (株)製)）を 10mlの lOOmM HEPES緩衝液 (0. 1%BSA及び l%NaCl含む、 pH7.0)に溶解した。これを実施例第 1試液とした。
2.第 2試液 (抗 HABPモノクローナル抗体感作ラテックス粒子）の調製
2mlのポリカーボネート製遠心チューブに、精製水 800 1、ラテックス粒子溶液 100 1(積水化学 (株）製 N200 : 10wt%、ラテックス粒径 220nm)、 500mMホウ酸緩衝液 (pH7.3) 100 μ 1、 50mM抗 HABPモノクローナル抗体 ASES緩衝液 100 1 (4.24 mg/ml, pH6.5)を添カ卩し、攪拌しながら室温で 100分間インキュベートし、抗 HABPモ ノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子浮遊液を得た。尚、上記抗 HABPモノク ローナル抗体は常法により作製されたものを用いた。
次 、で、抗 HABPモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子浮遊液を 15000 rpmで 15分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレットに 50mMホウ酸 緩衝液（2.5%BSA含む、 pH7.3) 1mlを添加した後、氷冷しながら 1分間超音波処 理し、ペレットを再浮遊させた。次いで 15000rpmで 15分間遠心分離した。その上清 を除去し、容器底部のペレットに 50mMホウ酸緩衝液（2.5%BSA含む、 pH7.3) lml を添加した。その後、氷冷しながら 1分間超音波処理してペレットを再浮遊させた。更 に、攪拌しながら室温で 120分間インキュベートし、ラテックス粒子表面上に抗体が 担持されて 、な 、領域を BSAで被覆した。
次いで、 15000rpmで 15分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレ ットに 50mMホウ酸緩衝液（0.5%BSA含む、 pH7.3) lmlを添カ卩した。その後、氷冷 しながら 1分間超音波処理してペレットを再浮遊させ、これを 50mMホウ酸緩衝液 (0. 5%BSA含む、 pH7.3)で 3.33倍に希釈したものを、第 2試液とした。
[0031] (2)標準ヒアルロン酸の測定
1.標準ヒアルロン酸溶液の調製
ヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業 (株)製）を、 10、 100、 1000ng/mlとなるように 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で希釈し、標準ヒアルロン酸溶液とした。
2.ヒアルロン酸の測定
1.で調製した標準ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸量を、以下の測定条件で全 自動測定装置システム（日本電子： BM— 8形)を用いて測定した。
試 料： 10 1
第 1試液：90 1
第 2試液：30 1
測定方法： 2ポイントエンド法
主波長 ：571nm
得られた結果を、表 1に示した。尚、表中の値は、得られた吸光度力もブランク値 (ヒ アルロン酸濃度が 0の時に得られた値)を減算し、 10000倍にした値である。
比較例 1
[0032] (1)化学結合による HABP感作ラテックス粒子の調製 1
2mLのポリカーボネート製遠心チューブに 50mM TAPS緩衝液（pH8.0) 900 μ L、 カルボン酸ラテックス粒子溶液（10wt%、カルボン酸ラテックス粒径 200nm、カルボ ン酸量 O.Smeq/g OO /z ^ 10mg/ml水溶解性カルボジイミド (WSC、同仁化学 (株 )製)水溶液 50 μ 1を添加した後、ラテックス粒子表面のカルボキシル基を活性ィ匕する ために 10分間静置した。その後、 1.45mgZml HABPの ASES緩衝液 (50mM、 pH6. 5)276 1を添カ卩し、攪拌しながら室温で 120分間インキュベートした。更に、 2.5%Β SAを含むホウ酸緩衝液（50mM、 pH7.3) 250 μ 1を添カ卩し、攪拌しながら室温で 60 分間インキュベートをした後、 5°Cで終夜インキュベートした。
次いで、反応液を 18000rpmで 20分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部 のペレットに 50mMホウ酸緩衝液（0.5%BSA含む、 pH7.3) lmlを添カ卩した。その後
、氷冷しながら 1分間超音波処理してペレットを再浮遊させ、同様の操作を更に 2回 繰り返した。得られた溶液を第 2試液（1)とした。
[0033] (2)化学結合による HABP感作ラテックス粒子の調製 2
10wt%、 210nm、カルボン酸量 0.5meqZgのカルボン酸ラテックス粒子溶液を使 用した以外は、比較例 1と同じ方法で HABP感作ラテックス粒子を調製した。得られた 溶液を第 2試液 (2)とした。
[0034] (3)物理吸着による HABP感作ラテックス粒子の調製
2mlのポリカーボネート製遠心チューブに、精製水 524 1、ラテックス粒子溶液 (積 水化学 N200 : 10wt%、ラテックス粒径 220ηπι)100 /ζ 1, 500mMホウ酸緩衝液（ρΗ7.
3) 100 μ 1、 1.45mg/ml HABP水溶液 276 μ 1を添カロし、携枠しな力 Sら室温で 120分 間インキュベートした。
次いで、反応液を 15000rpmで 15分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部 のペレットに 50mMホウ酸緩衝液（2.5%BSA含む、 pH7.3) lmlを添カ卩した。その後 、氷冷しながら 1分間超音波処理し、ペレットを再浮遊させた。次いで 15000rpmで 1 5分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレットに 50mMホウ酸緩衝液 (2.5%BSA含む、 pH7.3) lmlを添加した。更に、氷冷しながら 1分間超音波処理し てペレットを再浮遊させ、攪拌しながら室温で 60分間インキュベートをした後、 5°Cで 終夜インキュベートした。
次いで、 15000rpmで 15分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレツ トに 50mMホウ酸緩衝液（0.5%BSA含む、 pH7.3) lmlを添カ卩した。
その後、氷冷しながら 1分間超音波処理によりペレットを再浮遊させ、これを第 2試液 (3)とした。 [0035] (4)抗 HABPモノクローナル抗体を介した HABP感作ラテックス粒子の調製 1
2mlのポリカーボネート製遠心チューブに実施例 1で調製した抗 HABPモノクローナ ル抗体感作ラテックス粒子溶液 lml、 896 μ g/ml抗 HABP水溶液 33.5 1を添カロし、 攪拌しながら室温で 120分間， 5°Cで 2日間インキュベートした。得られた溶液を 150 OOrpmで 15分間遠心分離した。その上清を除去し、容器底部のペレットに 50mMホ ゥ酸緩衝液 (0.5%BSA含む、 pH7.3) 1mlを添加した。その後、氷冷しながら 1分間 超音波処理してペレットを再浮遊させ、これを第 2試液 (4)とした。
[0036] (5)各ラテックス粒子溶液を使用したヒアルロン酸測定試薬の検量線比較
第 1試液として lOOmMHEPES緩衝液（0.1%BSA、 l%NaCl含む、 pH7.0)を、 第 2試液として第 2試液（1)〜（4)を 50mMホウ酸緩衝液 (0.5%BSA含む、 pH7.3) で 3.33倍に希釈して用いた以外は実施例 1 (2)と同じ方法で、標準ヒアルロン酸溶 液中のヒアルロン酸量を測定した。
[0037] 得られた結果を、実施例 1の結果を併せて表 1に示した。尚、表中の値は、得られ た吸光度力もブランク値 (ヒアルロン酸濃度が 0の時に得られた値)を減算し、 10000 倍にした値である。
[0038] [表 1]
Figure imgf000013_0001
[0039] 表 1の結果から明らかなように、化学結合により HABPを感作させたラテックス粒子を 用いた場合 (表 1中の第 2試液 (1)〜(2))及び物理的吸着により HABPを感作させたラ テックス粒子を用いた場合 (表 1中の第 2試液 (3))、ヒアルロン酸濃度によるラテックス 粒子の凝集は見られず正確な測定はできな力つた。また、予め HABPを抗 HABPモノ クローナル抗体が担持されたラテックス粒子に結合させたものを含む試液を第 2試液 とした場合 (表 1中の第 2試液比較例 (4))と、 HABPを含む試液を第 1試液、抗 HABP モノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む試液を第 2試液とした場合 (表 1中の実施例第 2試液)では、その測定結果に大きな違いは見られず、これらを用い ることで精度の高いヒアルロン酸測定ができることが分力つた。
実験例 1
[0040] 試液の経時安定性比較
実施例 1で用いた第 1試液及び第 2試液を 30°Cで 1ヶ月間保存し、該試液を用いて 実施例 1 (2)と同様にヒアルロン酸量を測定した。また、比較例 1で用いた第 1試液と 比較例 1の第 2試液 (4)を 30°Cで 1ヶ月間保存し、該試液を用いて比較例 1 (5)と同 様にヒアルロン酸量を測定した。
[0041] 得られた測定結果を表 2に示した。尚、表中の吸光度欄の値は、得られた吸光度か らブランク値 (ヒアルロン酸濃度が 0の時に得られた値)を減算し、 10000倍にした値 である。また、吸光度の保持率は、得られた吸光度を 1ヶ月のインキュベート前に測定 した吸光度で割った値を百分率で表した値である。
[0042] [表 2]
Figure imgf000014_0001
[0043] 表 2の結果から明らかなように、第 2試液 (4)、即ち HABPを抗 HABPモノクローナル 抗体が担持されたラテックス粒子と結合したものを含む試液を第 2試液とした場合、 1 ヶ月経過後の吸光度は、経過前の吸光度と比較して明らかに低下していることが分 かった。一方、実施例 1の試液、即ち HABPを含む試液を第 1試液、抗 HABPモノクロ ーナル抗体が担持されたラテックス粒子を含む試液を第 2試液とした場合、吸光度の 保持率は 80%以上であり、第 2試液 (4)を用いた場合の結果と比較すると試薬の安 定性が高いことは明らかであった。即ち、本発明の試薬キットを用いれば、長期間保 存した場合であっても精度の高いヒアルロン酸を測定できることが分力つた。

Claims

請求の範囲
[1] 試料中のヒアルロン酸とヒアルロン酸バインディングプロテインを接触させてヒアルロ ン酸 Zヒアルロン酸バインディングプロテイン複合体を形成させ、次 、で該複合体と、 抗ヒアルロン酸バインディングプロテイン抗体を担持させた担体とを反応させ、該反 応により生じた凝集物による光学的変化を測定し、該測定値力 ヒアルロン酸量を算 出することを特徴とするヒアルロン酸の測定方法。
[2] 担体がラテックス粒子である請求項 1に記載の方法。
[3] ラテックス粒子の粒径力 0. 05〜0. 3 μ mである請求項 2記載の方法。
[4] ヒアルロン酸バインディングプロテイン力 プロテオグリカン、リンクプロテイン及びヒア ルロネクチンよりなる群力 選ばれるものである請求項 1に記載の方法。
[5] 光学的変化が濁度若しくは吸光度の変化又は散乱光強度の変化である請求項 1に 記載の方法。
[6] ヒアルロン酸バインディングプロテインを含んでなる試薬と、抗ヒアルロン酸バインディ ングプロテイン抗体を担持させた担体を含んでなる試薬とからなる、ヒアルロン酸測定 用試薬キット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009128448A1 (ja) * 2008-04-15 2009-10-22 和光純薬工業株式会社 新規なヒアルロン酸結合能を有するタンパク質及びこれを用いたヒアルロン酸の測定方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170074868A1 (en) * 2009-12-20 2017-03-16 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for the evaluation of renal injury using hyaluronic acid
US20130252264A1 (en) * 2010-09-24 2013-09-26 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for the evaluation of renal injury using hyaluronic acid
LT2661276T (lt) * 2011-01-07 2017-12-11 Revance Therapeutics, Inc. Paviršinio naudojimo kompozicija, apimanti botulino toksiną ir dažą
US20150241415A1 (en) * 2012-08-11 2015-08-27 Astute Medical, Inc. Evaluating renal injury using hyaluronic acid
CN106093373A (zh) * 2016-05-27 2016-11-09 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种测定透明质酸的试剂盒
CN106198994A (zh) * 2016-06-22 2016-12-07 浙江达美生物技术有限公司 一种透明质酸的测定试剂及其制备方法
MX2019001651A (es) 2016-08-10 2019-09-04 Univ Ajou Ind Academic Coop Found Citocina fusionada a fc heterodimerico, y composicion farmaceutica que comprende la misma.
TW202033547A (zh) 2018-10-23 2020-09-16 美商蜻蜓醫療公司 異二聚體fc融合蛋白
AU2021260960A1 (en) 2020-04-22 2022-11-24 Dragonfly Therapeutics, Inc. Formulation, dosage regimen, and manufacturing process for heterodimeric Fc-fused proteins
CN113433064A (zh) * 2021-05-29 2021-09-24 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 一种透明质酸检测试剂盒及其方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0541946A (ja) 1991-08-13 1993-02-23 Miyamura Tekkosho:Kk 生茶葉の蒸熱処理法
JPH08193999A (ja) 1995-01-13 1996-07-30 Sekisui Chem Co Ltd 免疫測定法
JPH1114628A (ja) 1997-06-24 1999-01-22 Mitsubishi Chem Corp タンパク質又はリガンドの測定方法
JP2002365296A (ja) 2001-06-05 2002-12-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定法用凝集促進剤
WO2002101389A1 (fr) 2001-06-12 2002-12-19 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Procede de dosage de l'acide hyaluronique

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55162059A (en) * 1979-06-05 1980-12-17 Mochida Pharmaceut Co Ltd Measuring method for antigen, antibody or their complex and measurement reagent kit
SE8605270D0 (sv) * 1986-12-08 1986-12-08 Pharmacia Ab Hyaluronsyrabestemningsmetod och reagenssats for anvendning vid metoden
CA1312277C (en) * 1987-12-18 1993-01-05 Richard C. Sutton Avidin- and biotin-immobilized reagents, analytical elements and methods of use
IE75720B1 (en) * 1990-10-08 1997-09-24 Akzo Nv Device for performing a rapid single manual assay
TW239881B (ja) * 1992-12-22 1995-02-01 Sienna Biotech Inc
US5863502A (en) * 1996-01-24 1999-01-26 Sarnoff Corporation Parallel reaction cassette and associated devices
JP3976848B2 (ja) * 1996-07-16 2007-09-19 生化学工業株式会社 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット
JP4124526B2 (ja) * 1998-10-07 2008-07-23 生化学工業株式会社 正常アグリカン測定法とその応用
JP2002202310A (ja) * 2000-10-27 2002-07-19 Morinaga Milk Ind Co Ltd 物質の検出試薬及び検出方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0541946A (ja) 1991-08-13 1993-02-23 Miyamura Tekkosho:Kk 生茶葉の蒸熱処理法
JPH08193999A (ja) 1995-01-13 1996-07-30 Sekisui Chem Co Ltd 免疫測定法
JPH1114628A (ja) 1997-06-24 1999-01-22 Mitsubishi Chem Corp タンパク質又はリガンドの測定方法
JP3424504B2 (ja) 1997-06-24 2003-07-07 三菱化学株式会社 ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法
JP2002365296A (ja) 2001-06-05 2002-12-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定法用凝集促進剤
WO2002101389A1 (fr) 2001-06-12 2002-12-19 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Procede de dosage de l'acide hyaluronique

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A Manual of Clinical Laboratory Method", KANEHARA & CO. , LTD., pages: 853 - 854
"A Manual of Clinical Laboratory Method", KANEHARA & CO., LTD., pages: 844 - 845
"A Manual of Clinical Laboratory Test", KANEHARA & CO., LTD., pages: 851 - 853
"Successive Course on Biochemical Experiment 5: Investigative Approach to Immunobiochemistry", TOKYO KAGAKU DOJIN CO., LTD., pages: 36 - 37
G. KOHLER; C. MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
MATSUHASHI, T. ET AL.: "Introduction to Experimental Immunology", 1981, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETIES PRESS

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009128448A1 (ja) * 2008-04-15 2009-10-22 和光純薬工業株式会社 新規なヒアルロン酸結合能を有するタンパク質及びこれを用いたヒアルロン酸の測定方法
US8034630B2 (en) 2008-04-15 2011-10-11 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Protein capable of binding to hyaluronic acid, and method for measurement of hyaluronic acid using the same
JP5477287B2 (ja) * 2008-04-15 2014-04-23 和光純薬工業株式会社 新規なヒアルロン酸結合能を有するタンパク質及びこれを用いたヒアルロン酸の測定方法

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