JPH1114628A - タンパク質又はリガンドの測定方法 - Google Patents
タンパク質又はリガンドの測定方法Info
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- JPH1114628A JPH1114628A JP16683397A JP16683397A JPH1114628A JP H1114628 A JPH1114628 A JP H1114628A JP 16683397 A JP16683397 A JP 16683397A JP 16683397 A JP16683397 A JP 16683397A JP H1114628 A JPH1114628 A JP H1114628A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質又はリガンドの簡便な検出方法を
提供する。 【解決手段】 タンパク質又はリガンドを担体粒子に担
持させ、この担持されたタンパク質又はリガンドと、試
料中のリガンド又はタンパク質とを反応せしめ、該反応
混合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変
化を検出することを特徴とする方法。
提供する。 【解決手段】 タンパク質又はリガンドを担体粒子に担
持させ、この担持されたタンパク質又はリガンドと、試
料中のリガンド又はタンパク質とを反応せしめ、該反応
混合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変
化を検出することを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はタンパク質又はリガ
ンドの測定方法及びそれに用いる試薬キットに関する。
ンドの測定方法及びそれに用いる試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】担体粒子を用いるイムノアッセイは周知
であり、イムノアッセイの市場の相当の部分を構成して
いる。これは、担体粒子を用いたイムノアッセイが非常
に用途が広く、単純な目視による検出を要する試験に
も、測定装置を用いた定量的な分析方法にも使用する事
ができるためである。この担体粒子を用いるイムノアッ
セイとしては、たとえば抗体又は抗原をラテックス粒子
に結合させ、それぞれ抗原又は抗体を検出するラテック
ス免疫凝集法が知られている。
であり、イムノアッセイの市場の相当の部分を構成して
いる。これは、担体粒子を用いたイムノアッセイが非常
に用途が広く、単純な目視による検出を要する試験に
も、測定装置を用いた定量的な分析方法にも使用する事
ができるためである。この担体粒子を用いるイムノアッ
セイとしては、たとえば抗体又は抗原をラテックス粒子
に結合させ、それぞれ抗原又は抗体を検出するラテック
ス免疫凝集法が知られている。
【０００３】このラテックス免疫凝集法及びそれに用い
る装置は、例えば、「実験免疫学ハンドブック」第１〜
４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック（１９８
７）、米国特許第3,088,875号、第3,857,931号、第3,99
2,517号、第4,080,264号、第4,174,952号、第4,203,724
号、第4,480,042号、第4,590,156号、第4,690,906号、
第4,716,123号、第4,772,550号、第4,851,329号及び第
5,100,805号、Grange,J. et al., J. Immunol. Method
18, 365, 1977、Hechemy, K. et al., Lab. Management
27, Jun-Jul, 1984、Looney, C., J. Clin. Immuassay
7, 90, 1984、Von Schulthes, G. et al., Mol. Immun
ol. 1, 81, 1980、Crain, J., Am. Biotech. Lab. 34,
May-Jun, 1987、Heveran, J., J. Forensic Sci. 470,
1977、Kuruma, H., J. Immunol. Method 38, 353, 1980
等に詳述されている。
る装置は、例えば、「実験免疫学ハンドブック」第１〜
４巻、ブラックウェル・サイエンティフィック（１９８
７）、米国特許第3,088,875号、第3,857,931号、第3,99
2,517号、第4,080,264号、第4,174,952号、第4,203,724
号、第4,480,042号、第4,590,156号、第4,690,906号、
第4,716,123号、第4,772,550号、第4,851,329号及び第
5,100,805号、Grange,J. et al., J. Immunol. Method
18, 365, 1977、Hechemy, K. et al., Lab. Management
27, Jun-Jul, 1984、Looney, C., J. Clin. Immuassay
7, 90, 1984、Von Schulthes, G. et al., Mol. Immun
ol. 1, 81, 1980、Crain, J., Am. Biotech. Lab. 34,
May-Jun, 1987、Heveran, J., J. Forensic Sci. 470,
1977、Kuruma, H., J. Immunol. Method 38, 353, 1980
等に詳述されている。
【０００４】上記の通り、担体粒子を用いるイムノアッ
セイは広く用いられている公知技術であるが、従来のラ
テックス凝集法は、本発明者等の知る限り、抗原−抗体
反応に由来したラテックスの免疫凝集反応によるものに
限られていた。ところで、ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンとグルクロン酸が交互にβ−１，４結合
により重合した酸性ムコ多糖類であり、皮下組織を接合
させる作用を有し、臍帯、関節腔の滑液および眼の硝子
体に含まれている。
セイは広く用いられている公知技術であるが、従来のラ
テックス凝集法は、本発明者等の知る限り、抗原−抗体
反応に由来したラテックスの免疫凝集反応によるものに
限られていた。ところで、ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンとグルクロン酸が交互にβ−１，４結合
により重合した酸性ムコ多糖類であり、皮下組織を接合
させる作用を有し、臍帯、関節腔の滑液および眼の硝子
体に含まれている。
【０００５】ヒアルロン酸は、肝疾患（A. E. Laurent
et al., Hepatology 5, 638-642, 1985）、リウマチ性
関節炎（T. C. Laurent et al., Ciba Foundation Symp
osium124, 9-29, 1986）などの繊維化をともなう疾患に
おいて上昇するとの報告があり、血中ヒアルロン酸濃度
の測定は、肝疾患及び慢性関節リウマチの病態把握に有
用である。すなわち、ヒアルロン酸は、肝臓の繊維化に
ともなう合成亢進と肝類洞内皮細胞の機能低下による分
解障害を反映するマーカーである。また、強皮症や癌な
どにおいてもその血中濃度変化と病態との相関が指摘さ
れている（B. Delpech et al., Anal. Biochem. 149, 5
55-565, 1985）。
et al., Hepatology 5, 638-642, 1985）、リウマチ性
関節炎（T. C. Laurent et al., Ciba Foundation Symp
osium124, 9-29, 1986）などの繊維化をともなう疾患に
おいて上昇するとの報告があり、血中ヒアルロン酸濃度
の測定は、肝疾患及び慢性関節リウマチの病態把握に有
用である。すなわち、ヒアルロン酸は、肝臓の繊維化に
ともなう合成亢進と肝類洞内皮細胞の機能低下による分
解障害を反映するマーカーである。また、強皮症や癌な
どにおいてもその血中濃度変化と病態との相関が指摘さ
れている（B. Delpech et al., Anal. Biochem. 149, 5
55-565, 1985）。
【０００６】従来、ヒアルロン酸の測定方法として、放
射性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合タンパク質を用
いる放射線分析法（RIA; U. B. G. Laurent et al., An
al.Biochem. 109, 386-394, 1980）、ヒアルロネクチン
を利用した酵素分析法（EIA; A. E. Laurent et al., H
epatology 5, 638-642, 1985）、あるいはパーオキシダ
ーゼで標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用いた
サンドイッチ法を基にした酵素免疫分析法の変法（ELIS
A; 特開昭６４−４６９号、近藤孝司ら、臨床病理 第３
６巻（５）、536-540、1991）が知られている。
射性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合タンパク質を用
いる放射線分析法（RIA; U. B. G. Laurent et al., An
al.Biochem. 109, 386-394, 1980）、ヒアルロネクチン
を利用した酵素分析法（EIA; A. E. Laurent et al., H
epatology 5, 638-642, 1985）、あるいはパーオキシダ
ーゼで標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用いた
サンドイッチ法を基にした酵素免疫分析法の変法（ELIS
A; 特開昭６４−４６９号、近藤孝司ら、臨床病理 第３
６巻（５）、536-540、1991）が知られている。
【０００７】しかしながら、ＲＩＡ及びＥＩＡはともに
競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測定感
度がせいぜい４０ｎｇとあまり高くない。またＲＩＡで
は放射性元素の使用、サンプルの不安定性、相当な試薬
の調製、高価な測定装置などいくつかの欠点を有し、臨
床検査に応用するのは容易ではない。さらにＥＩＡで
は、ヒト脳由来のヒアルロネクチンを使用しているため
試薬の調製に困難がともなう。また、測定に関しては全
工程を終了するのに１日以上を要するため、臨床検査へ
の応用は容易ではない。ＥＬＩＳＡでは、測定感度と特
異性の向上は認められるものの、供される試薬数が多く
操作も煩雑で、１回の測定に３時間強の時間を要するも
のである。
競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測定感
度がせいぜい４０ｎｇとあまり高くない。またＲＩＡで
は放射性元素の使用、サンプルの不安定性、相当な試薬
の調製、高価な測定装置などいくつかの欠点を有し、臨
床検査に応用するのは容易ではない。さらにＥＩＡで
は、ヒト脳由来のヒアルロネクチンを使用しているため
試薬の調製に困難がともなう。また、測定に関しては全
工程を終了するのに１日以上を要するため、臨床検査へ
の応用は容易ではない。ＥＬＩＳＡでは、測定感度と特
異性の向上は認められるものの、供される試薬数が多く
操作も煩雑で、１回の測定に３時間強の時間を要するも
のである。
【０００８】このため、従来よりも操作が簡便で、しか
も高感度かつ短時間で測定可能なヒアルロン酸の測定方
法が要望されていた。
も高感度かつ短時間で測定可能なヒアルロン酸の測定方
法が要望されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、感度及び特
異性が高く、操作が簡便であり、短時間で測定可能なタ
ンパク質又はリガンド等の特異的結合能を有する物質の
測定法の提供を目的としてなされたものである。
異性が高く、操作が簡便であり、短時間で測定可能なタ
ンパク質又はリガンド等の特異的結合能を有する物質の
測定法の提供を目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を達成すべく鋭意検討した結果、特異的結合能を有する
物質、例えばヒアルロン酸結合タンパク質を担体粒子に
担持し、これと試料中のヒアルロン酸とを反応せしめ、
反応混合物の吸光の変化を検出すれば、精度が高く且つ
簡便に試料中のヒアルロン酸が測定可能なことを見いだ
した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられ
たものである。
を達成すべく鋭意検討した結果、特異的結合能を有する
物質、例えばヒアルロン酸結合タンパク質を担体粒子に
担持し、これと試料中のヒアルロン酸とを反応せしめ、
反応混合物の吸光の変化を検出すれば、精度が高く且つ
簡便に試料中のヒアルロン酸が測定可能なことを見いだ
した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられ
たものである。
【００１１】即ち本発明は、タンパク質又はリガンドを
担体粒子に担持させ、この担持されたタンパク質又はリ
ガンドと、試料中のリガンド又はタンパク質とを反応せ
しめ、該反応混合物に光を照射して反応混合物の吸光又
は散乱光の変化を検出することを特徴とするタンパク質
又はリガンドの測定方法である。この発明の好ましい態
様によれば、タンパク質が、受容タンパク質又は結合タ
ンパク質である上記方法；受容タンパク質が生理活性因
子受容タンパク質、男性ホルモン受容タンパク質、女性
ホルモン受容タンパク質、下垂体ホルモン受容タンパク
質、細胞間接着因子受容タンパク質及び癌マーカー受容
タンパク質よりなる群からから選ばれる上記方法；結合
タンパク質が、補体系制御タンパク質、ステロイド結合
タンパク質及び生理活性物質結合タンパク質よりなる群
から選ばれる上記方法が提供される。
担体粒子に担持させ、この担持されたタンパク質又はリ
ガンドと、試料中のリガンド又はタンパク質とを反応せ
しめ、該反応混合物に光を照射して反応混合物の吸光又
は散乱光の変化を検出することを特徴とするタンパク質
又はリガンドの測定方法である。この発明の好ましい態
様によれば、タンパク質が、受容タンパク質又は結合タ
ンパク質である上記方法；受容タンパク質が生理活性因
子受容タンパク質、男性ホルモン受容タンパク質、女性
ホルモン受容タンパク質、下垂体ホルモン受容タンパク
質、細胞間接着因子受容タンパク質及び癌マーカー受容
タンパク質よりなる群からから選ばれる上記方法；結合
タンパク質が、補体系制御タンパク質、ステロイド結合
タンパク質及び生理活性物質結合タンパク質よりなる群
から選ばれる上記方法が提供される。
【００１２】また、この発明のより好ましい態様によれ
ば、タンパク質が、ヒアルロン酸結合タンパク質であ
り、リガンドがヒアルロン酸である上記方法；ヒアルロ
ン酸結合タンパク質が、プロテオグリカン、リンクプロ
テイン及びヒアルロネクチンよりなる群から選ばれる上
記方法が提供される。更に、本発明によれば、少なくと
も、タンパク質又はリガンドが担持された担体粒子より
なり、この担持されたタンパク質又はリガンドと、試料
中のリガンド又はタンパク質とを反応せしめ、該反応混
合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変化
を検出することを特徴とするタンパク質又はリガンドを
測定するために用いる試薬キットが提供される。
ば、タンパク質が、ヒアルロン酸結合タンパク質であ
り、リガンドがヒアルロン酸である上記方法；ヒアルロ
ン酸結合タンパク質が、プロテオグリカン、リンクプロ
テイン及びヒアルロネクチンよりなる群から選ばれる上
記方法が提供される。更に、本発明によれば、少なくと
も、タンパク質又はリガンドが担持された担体粒子より
なり、この担持されたタンパク質又はリガンドと、試料
中のリガンド又はタンパク質とを反応せしめ、該反応混
合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変化
を検出することを特徴とするタンパク質又はリガンドを
測定するために用いる試薬キットが提供される。
【００１３】この発明の好ましい態様によれば、タンパ
ク質又はリガンドが担持された担体粒子を含有する試薬
と、緩衝剤、塩化ナトリウム、多糖類及び血清アルブミ
ンを含有する試薬とからな上記試薬キットが提供され
る。
ク質又はリガンドが担持された担体粒子を含有する試薬
と、緩衝剤、塩化ナトリウム、多糖類及び血清アルブミ
ンを含有する試薬とからな上記試薬キットが提供され
る。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明は、上記の通り、抗原抗体反応によらずタン
パク質とリガンドとの特異的な結合能を利用した、タン
パク質とリガンドとの反応に基づく濁度の変化を吸光又
は散乱光の変化として検出するタンパク質又はリガンド
等の特異的結合能を有する物質の測定法である。
る。本発明は、上記の通り、抗原抗体反応によらずタン
パク質とリガンドとの特異的な結合能を利用した、タン
パク質とリガンドとの反応に基づく濁度の変化を吸光又
は散乱光の変化として検出するタンパク質又はリガンド
等の特異的結合能を有する物質の測定法である。
【００１５】本発明で測定対象となるタンパク質又はリ
ガンドとしては、各種の受容タンパク質及び結合タンパ
ク質並びにそれらタンパク質に特異的に結合する物質、
即ちリガンドが挙げられる。具体的には、例えば、生理
活性因子受容タンパク質として、上皮成長因子受容タン
パク質、繊維芽細胞成長因子受容タンパク質、顆粒球コ
ロニー刺激因子受容タンパク質、顆粒球−マクロファー
ジコロニー刺激因子受容タンパク質、神経成長因子受容
タンパク質、腫瘍壊死因子受容タンパク質、血小板由来
成長因子受容タンパク質が挙げられ、性ホルモン受容タ
ンパク質として、テストステロン受容タンパク質、アン
ドロステンジオン受容タンパク質、デヒドロエピステン
ジオン受容タンパク質、アドレノステロン受容タンパク
質、エストラジオール受容タンパク質、エストロン受容
タンパク質、エストリオール受容タンパク質、エキリン
受容タンパク質、エキリニン受容タンパク質が挙げら
れ、下垂体ホルモン受容タンパク質として、バソプレシ
ン受容タンパク質、成長ホルモン受容タンパク質、プロ
ラクチン受容タンパク質、甲状腺刺激ホルモン受容タン
パク質、黄体形成ホルモン受容タンパク質、卵胞刺激ホ
ルモン受容タンパク質、副腎皮質刺激ホルモン受容タン
パク質、サポトロピン受容タンパク質、γ−メラニン細
胞刺激ホルモン受容タンパク質が挙げられ、細胞間接着
因子受容タンパク質としてエラスチン受容タンパク質、
エンドセリン受容タンパク質、フィブロネクチン受容タ
ンパク質、ラミニン受容タンパク質が挙げられ、癌マー
カー及びその他の生理活性物質受容タンパク質として、
α−フェトプロテイン受容タンパク質、アンギオテンシ
ン受容タンパク質、ドーパミン受容タンパク質、エプス
タイン−バールウィルス特異的抗原受容タンパク質、エ
リスロポエチン受容タンパク質、ＩｇＥ受容タンパク
質、インターロイキン受容タンパク質、インスリン受容
タンパク質、インターフェロン受容タンパク質、血小板
膜糖タンパク質受容タンパク質、トランスフェリン受容
タンパク質、ウロキナーゼ受容タンパク質、ビタミンＤ
受容タンパク質、ボンベシン受容タンパク質、低密度リ
ポタンパク質受容タンパク質、フォンウィルブランド因
子受容タンパク質等の受容タンパク質及びそれら受容タ
ンパク質に対応するリガンドが挙げられる。
ガンドとしては、各種の受容タンパク質及び結合タンパ
ク質並びにそれらタンパク質に特異的に結合する物質、
即ちリガンドが挙げられる。具体的には、例えば、生理
活性因子受容タンパク質として、上皮成長因子受容タン
パク質、繊維芽細胞成長因子受容タンパク質、顆粒球コ
ロニー刺激因子受容タンパク質、顆粒球−マクロファー
ジコロニー刺激因子受容タンパク質、神経成長因子受容
タンパク質、腫瘍壊死因子受容タンパク質、血小板由来
成長因子受容タンパク質が挙げられ、性ホルモン受容タ
ンパク質として、テストステロン受容タンパク質、アン
ドロステンジオン受容タンパク質、デヒドロエピステン
ジオン受容タンパク質、アドレノステロン受容タンパク
質、エストラジオール受容タンパク質、エストロン受容
タンパク質、エストリオール受容タンパク質、エキリン
受容タンパク質、エキリニン受容タンパク質が挙げら
れ、下垂体ホルモン受容タンパク質として、バソプレシ
ン受容タンパク質、成長ホルモン受容タンパク質、プロ
ラクチン受容タンパク質、甲状腺刺激ホルモン受容タン
パク質、黄体形成ホルモン受容タンパク質、卵胞刺激ホ
ルモン受容タンパク質、副腎皮質刺激ホルモン受容タン
パク質、サポトロピン受容タンパク質、γ−メラニン細
胞刺激ホルモン受容タンパク質が挙げられ、細胞間接着
因子受容タンパク質としてエラスチン受容タンパク質、
エンドセリン受容タンパク質、フィブロネクチン受容タ
ンパク質、ラミニン受容タンパク質が挙げられ、癌マー
カー及びその他の生理活性物質受容タンパク質として、
α−フェトプロテイン受容タンパク質、アンギオテンシ
ン受容タンパク質、ドーパミン受容タンパク質、エプス
タイン−バールウィルス特異的抗原受容タンパク質、エ
リスロポエチン受容タンパク質、ＩｇＥ受容タンパク
質、インターロイキン受容タンパク質、インスリン受容
タンパク質、インターフェロン受容タンパク質、血小板
膜糖タンパク質受容タンパク質、トランスフェリン受容
タンパク質、ウロキナーゼ受容タンパク質、ビタミンＤ
受容タンパク質、ボンベシン受容タンパク質、低密度リ
ポタンパク質受容タンパク質、フォンウィルブランド因
子受容タンパク質等の受容タンパク質及びそれら受容タ
ンパク質に対応するリガンドが挙げられる。
【００１６】さらに、補体系制御タンパク質として、Ｃ
１イナクチベーター、Ｃ３ｂイナクチベーター、プロテ
インＣ、プロテインＳ、アナフィラトキシンイナクチベ
ーターが挙げられ、ステロイド結合タンパク質として、
コルチコステロイド結合グロブリン、テストステロン結
合グロブリン、エストラジオール結合グロブリン、プロ
ゲステロン結合タンパク質、アンドロゲン結合タンパク
質が挙げられ、生理活性物質結合タンパク質として、ア
ンギオテンシン受容体結合タンパク質、葉酸結合タンパ
ク質、インスリン様成長因子結合タンパク質、脂肪酸結
合タンパク質、レチノール結合タンパク質、ヒアルロン
酸結合タンパク質等の結合タンパク質及びそれら結合タ
ンパク質に対応するリガンドが挙げられる。ここに例示
した受容タンパク質及びそれらのタンパク質に対応する
リガンドと、結合タンパク質及びそれらの結合タンパク
質に対応するリガンドはいずれも市販されており、容易
に入手することができる。
１イナクチベーター、Ｃ３ｂイナクチベーター、プロテ
インＣ、プロテインＳ、アナフィラトキシンイナクチベ
ーターが挙げられ、ステロイド結合タンパク質として、
コルチコステロイド結合グロブリン、テストステロン結
合グロブリン、エストラジオール結合グロブリン、プロ
ゲステロン結合タンパク質、アンドロゲン結合タンパク
質が挙げられ、生理活性物質結合タンパク質として、ア
ンギオテンシン受容体結合タンパク質、葉酸結合タンパ
ク質、インスリン様成長因子結合タンパク質、脂肪酸結
合タンパク質、レチノール結合タンパク質、ヒアルロン
酸結合タンパク質等の結合タンパク質及びそれら結合タ
ンパク質に対応するリガンドが挙げられる。ここに例示
した受容タンパク質及びそれらのタンパク質に対応する
リガンドと、結合タンパク質及びそれらの結合タンパク
質に対応するリガンドはいずれも市販されており、容易
に入手することができる。
【００１７】それらの中で、タンパク質としてヒアルロ
ン酸結合タンパク質、リガンドとしてヒアルロン酸の組
み合わせで、ヒアルロン酸を測定対象とするのが最も好
ましい。ここで、ヒアルロン酸結合タンパク質として
は、ローレント（A. E. Laurent）らにより精製された
プロテオグリカン、リンクプロテイン（Analytical Bio
chemistry 109, 386-394, 1980）や、ヒアルロネクチン
（Hepatology 5, 638-642, 1985）などが挙げられる。
ン酸結合タンパク質、リガンドとしてヒアルロン酸の組
み合わせで、ヒアルロン酸を測定対象とするのが最も好
ましい。ここで、ヒアルロン酸結合タンパク質として
は、ローレント（A. E. Laurent）らにより精製された
プロテオグリカン、リンクプロテイン（Analytical Bio
chemistry 109, 386-394, 1980）や、ヒアルロネクチン
（Hepatology 5, 638-642, 1985）などが挙げられる。
【００１８】測定に際しては、上記タンパク質又はリガ
ンドのどちらか一方を担体粒子に担持して用いられる。
即ち、測定対象物がタンパク質である場合はリガンド
を、測定対象物がリガンドである場合はタンパク質を、
それぞれ担体粒子に担持して用いる。上記担体粒子とし
ては、タンパク質又はリガンドを担持しうるものであれ
ば特に制限はなく如何なるものも使用できるが、通常、
試料溶液に不溶性の有機高分子物質又は無機物質の微粒
子が使用される。かかる微粒子としては、ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エ
ステル、ポリメタクリル酸エステルなどの合成有機高分
子物質よりなるラテックス粒子；赤血球、バクテリア、
細胞片等の天然有機高分子物質；ガラス、シリカ、アル
ミナ、シリカ−アルミナ、活性炭、カーボン等の無機物
質等が例示できる。
ンドのどちらか一方を担体粒子に担持して用いられる。
即ち、測定対象物がタンパク質である場合はリガンド
を、測定対象物がリガンドである場合はタンパク質を、
それぞれ担体粒子に担持して用いる。上記担体粒子とし
ては、タンパク質又はリガンドを担持しうるものであれ
ば特に制限はなく如何なるものも使用できるが、通常、
試料溶液に不溶性の有機高分子物質又は無機物質の微粒
子が使用される。かかる微粒子としては、ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エ
ステル、ポリメタクリル酸エステルなどの合成有機高分
子物質よりなるラテックス粒子；赤血球、バクテリア、
細胞片等の天然有機高分子物質；ガラス、シリカ、アル
ミナ、シリカ−アルミナ、活性炭、カーボン等の無機物
質等が例示できる。
【００１９】担体粒子の粒径及び該粒子へのタンパク質
又はリガンドの担持量等は、特に制限されないが、例え
ば、担体粒子がラテックス粒子である場合、平均粒径
０．０５〜１．０μｍのものを使用し、０．１〜１重量
％ラテックスに対してタンパク質又はリガンドを０．１
〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で担持させればよい。また、担持
は、担体粒子へタンパク質又はリガンドを物理的に吸
着、又はそれ自体既知の通常用いられる方法により化学
的に結合させれば良い。
又はリガンドの担持量等は、特に制限されないが、例え
ば、担体粒子がラテックス粒子である場合、平均粒径
０．０５〜１．０μｍのものを使用し、０．１〜１重量
％ラテックスに対してタンパク質又はリガンドを０．１
〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で担持させればよい。また、担持
は、担体粒子へタンパク質又はリガンドを物理的に吸
着、又はそれ自体既知の通常用いられる方法により化学
的に結合させれば良い。
【００２０】担体粒子として、表面にカルボキシレート
基を有するラテックス粒子を用いる場合、０．１〜０．
６μｍの直径および８〜３５平方オングストロームの表
面カルボキシレート占有領域を有するものが適してい
る。ここで、使用する「表面カルボキシレート占有領域
（Surface carboxylate parking area）」という用
語は、平方オングストロームで測定したラテックス粒子
の表面積を、その表面上のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）お
よびカルボキシレート（−ＣＯＯ-）官能基の総数で除
した値を示す。また、「カルボキシレート基」とは、−
ＣＯＯＨ及び−ＣＯＯ-両方の官能基を表す。
基を有するラテックス粒子を用いる場合、０．１〜０．
６μｍの直径および８〜３５平方オングストロームの表
面カルボキシレート占有領域を有するものが適してい
る。ここで、使用する「表面カルボキシレート占有領域
（Surface carboxylate parking area）」という用
語は、平方オングストロームで測定したラテックス粒子
の表面積を、その表面上のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）お
よびカルボキシレート（−ＣＯＯ-）官能基の総数で除
した値を示す。また、「カルボキシレート基」とは、−
ＣＯＯＨ及び−ＣＯＯ-両方の官能基を表す。
【００２１】表面にカルボキシレート基を有するラテッ
クス粒子としては、乳化重合、核剤を使用した乳化重
合、および好ましくは懸濁重合等を含む当業界で一般的
に知られたいずれの技術によっても製造することができ
るカルボキシレート基を有する重合体又は共重合体から
なる粒子を示す。また、製造に際しては、架橋剤を用い
ても用いなくてもよい。さらに、ここでいうラテックス
粒子として、コア−シェル型の粒子も含む。表面に十分
なカルボキシレート基を有するものであれば、いずれの
重合体粒子を使用することができる。特に有用なコア粒
子としては、既にカルボキシレート基を有するＣ1〜Ｃ6
−、好ましくはＣ1〜Ｃ2−（メタ）アクリレート、カル
ボキシレート基を導入したポリスチレン、およびアクリ
ル酸とスチレン単量体との混合物から製造されるものが
挙げられる。
クス粒子としては、乳化重合、核剤を使用した乳化重
合、および好ましくは懸濁重合等を含む当業界で一般的
に知られたいずれの技術によっても製造することができ
るカルボキシレート基を有する重合体又は共重合体から
なる粒子を示す。また、製造に際しては、架橋剤を用い
ても用いなくてもよい。さらに、ここでいうラテックス
粒子として、コア−シェル型の粒子も含む。表面に十分
なカルボキシレート基を有するものであれば、いずれの
重合体粒子を使用することができる。特に有用なコア粒
子としては、既にカルボキシレート基を有するＣ1〜Ｃ6
−、好ましくはＣ1〜Ｃ2−（メタ）アクリレート、カル
ボキシレート基を導入したポリスチレン、およびアクリ
ル酸とスチレン単量体との混合物から製造されるものが
挙げられる。
【００２２】タンパク質又はリガンドを担体粒子に担持
させる際、該担体粒子の表面上には、さらにタンパク質
またはリガンド等の他の分子種が固着しうる表面部分が
存在し、測定すべき試料を添加した際に試料中に含まれ
る測定対象物やその他の血中成分などが固着するおそれ
がある。このため、担持の際にタンパク質又はリガンド
が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。
本発明においては、上記のようにして得られたタンパク
質又はリガンドが担持された担体粒子の保存安定性をさ
らに向上させ、測定の精度を向上させるために、上記担
体粒子、例えばラテックス粒子をブロッキング剤で処理
するのが好ましい。ブロッキング剤としては、通常、ウ
シなどから容易に入手できる血清アルブミン、γ−グロ
ブリン、フィブリノーゲン、血清等；合成ペプチド類等
が使用できる。ブロッキング剤の濃度は、通常０．０１
〜２％、好ましくは０．１〜０．５％が適当である。
させる際、該担体粒子の表面上には、さらにタンパク質
またはリガンド等の他の分子種が固着しうる表面部分が
存在し、測定すべき試料を添加した際に試料中に含まれ
る測定対象物やその他の血中成分などが固着するおそれ
がある。このため、担持の際にタンパク質又はリガンド
が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。
本発明においては、上記のようにして得られたタンパク
質又はリガンドが担持された担体粒子の保存安定性をさ
らに向上させ、測定の精度を向上させるために、上記担
体粒子、例えばラテックス粒子をブロッキング剤で処理
するのが好ましい。ブロッキング剤としては、通常、ウ
シなどから容易に入手できる血清アルブミン、γ−グロ
ブリン、フィブリノーゲン、血清等；合成ペプチド類等
が使用できる。ブロッキング剤の濃度は、通常０．０１
〜２％、好ましくは０．１〜０．５％が適当である。
【００２３】ブロッキング剤による処理は、例えば、タ
ンパク質又はリガンドが担持されたラテックス粒子浮遊
液を遠心分離して上清を除き、得られる沈殿物を上記ブ
ロッキング剤で、通常、数分間から数時間程度攪拌下に
処理する。ついで遠心分離し、上清を除き、得られたラ
テックス粒子を緩衝液に浮遊させて、目的とするラテッ
クス試薬（浮遊液）を得る。この際に用いられる緩衝液
としては特に制限がなく、例えばｐＨ５〜１０程度のリ
ン酸、ホウ酸系等の緩衝液が挙げられる。
ンパク質又はリガンドが担持されたラテックス粒子浮遊
液を遠心分離して上清を除き、得られる沈殿物を上記ブ
ロッキング剤で、通常、数分間から数時間程度攪拌下に
処理する。ついで遠心分離し、上清を除き、得られたラ
テックス粒子を緩衝液に浮遊させて、目的とするラテッ
クス試薬（浮遊液）を得る。この際に用いられる緩衝液
としては特に制限がなく、例えばｐＨ５〜１０程度のリ
ン酸、ホウ酸系等の緩衝液が挙げられる。
【００２４】かくして得られるタンパク質又はリガンド
を担持させた担体粒子と、血液や体液等の試料溶液とを
混合し、試料中のタンパク質又はリガンドとを反応せし
め、該反応混合物に光を照射して凝集反応に基づく吸光
又は散乱光の変化を検出し、試料中のタンパク質又はリ
ガンドの存在又は濃度を測定する。上記反応は、好まし
くは水を基材とし、塩化ナトリウムを含有するｐＨ４．
５〜１０、好ましくはｐＨ５．５〜９．５の緩衝液中で
行われる。緩衝液中に存在する塩化ナトリウムの量は
１．０〜５．０重量％、好ましくは１．５〜４．５重量
％、最も好ましくは２．０〜４．０重量％である。ま
た、本発明で用いる緩衝液としては、それ自体既知の通
常用いられるｐＨ緩衝剤が挙げられる。尚、ここで「緩
衝剤」という用語は、酸またはアルカリを添加した際に
水素イオン濃度の変化に抵抗する単一の物質または複数
の物質の組み合わせを意味する。そのような緩衝剤の例
としては、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン、リン酸緩衝剤、ピアスの「免疫技術カタログおよび
ハンドブック」等に列記されたもの等が含まれる。尚、
前記および後記の緩衝液中の各成分の重量％は、緩衝液
の全重量を基準としたものである。
を担持させた担体粒子と、血液や体液等の試料溶液とを
混合し、試料中のタンパク質又はリガンドとを反応せし
め、該反応混合物に光を照射して凝集反応に基づく吸光
又は散乱光の変化を検出し、試料中のタンパク質又はリ
ガンドの存在又は濃度を測定する。上記反応は、好まし
くは水を基材とし、塩化ナトリウムを含有するｐＨ４．
５〜１０、好ましくはｐＨ５．５〜９．５の緩衝液中で
行われる。緩衝液中に存在する塩化ナトリウムの量は
１．０〜５．０重量％、好ましくは１．５〜４．５重量
％、最も好ましくは２．０〜４．０重量％である。ま
た、本発明で用いる緩衝液としては、それ自体既知の通
常用いられるｐＨ緩衝剤が挙げられる。尚、ここで「緩
衝剤」という用語は、酸またはアルカリを添加した際に
水素イオン濃度の変化に抵抗する単一の物質または複数
の物質の組み合わせを意味する。そのような緩衝剤の例
としては、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン、リン酸緩衝剤、ピアスの「免疫技術カタログおよび
ハンドブック」等に列記されたもの等が含まれる。尚、
前記および後記の緩衝液中の各成分の重量％は、緩衝液
の全重量を基準としたものである。
【００２５】本発明で用いる緩衝液は、デキストラン硫
酸ナトリウム、メチルセルロース等の少なくとも１つの
多糖類をも含むことが好ましい。その他、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン等の多糖類を含有してい
てもよい。緩衝液中に含有する多糖類の量、例えば、デ
キストラン硫酸ナトリウムの量は、好ましくは０．２〜
３．０重量％、より好ましくは０．６〜２．０重量％、
最も好ましくは１．０〜１．８重量％、メチルセルロー
スの量は、好ましくは０．０５〜１．０重量％、より好
ましくは０．１〜０．４重量％、最も好ましくは０．１
５〜０．３重量％程度が適当である。
酸ナトリウム、メチルセルロース等の少なくとも１つの
多糖類をも含むことが好ましい。その他、カルボキシメ
チルセルロース、デキストラン等の多糖類を含有してい
てもよい。緩衝液中に含有する多糖類の量、例えば、デ
キストラン硫酸ナトリウムの量は、好ましくは０．２〜
３．０重量％、より好ましくは０．６〜２．０重量％、
最も好ましくは１．０〜１．８重量％、メチルセルロー
スの量は、好ましくは０．０５〜１．０重量％、より好
ましくは０．１〜０．４重量％、最も好ましくは０．１
５〜０．３重量％程度が適当である。
【００２６】さらに、上記緩衝液には、血清アルブミ
ン、好ましくは脂肪酸を実質的に含有しない脂肪酸非含
有血清アルブミンを含有するのが好ましい。脂肪酸非含
有血清アルブミンは、例えば、R. J. Chen, Biol. Che
m., 242, 173 (1967)に記載された方法によって調製す
ることができ、また、シグマ社およびマイルス社から種
々の分子種および等級で購入することができる。また、
ヒト、ウシ、ウサギ、ヒツジ等の血清アルブミンも使用
することができる。このうち脂肪酸非含有ウシ血清アル
ブミンが最も好ましい。また、脂肪酸を含有せずグロブ
リンを含有しない血清アルブミンも好適である。緩衝液
中の血清アルブミンの量は、緩衝液の全容量を基準とし
て５〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜６０ｍｇ
／ｍＬ、最も好ましくは１０〜４０ｍｇ／ｍＬ程度が適
当である。
ン、好ましくは脂肪酸を実質的に含有しない脂肪酸非含
有血清アルブミンを含有するのが好ましい。脂肪酸非含
有血清アルブミンは、例えば、R. J. Chen, Biol. Che
m., 242, 173 (1967)に記載された方法によって調製す
ることができ、また、シグマ社およびマイルス社から種
々の分子種および等級で購入することができる。また、
ヒト、ウシ、ウサギ、ヒツジ等の血清アルブミンも使用
することができる。このうち脂肪酸非含有ウシ血清アル
ブミンが最も好ましい。また、脂肪酸を含有せずグロブ
リンを含有しない血清アルブミンも好適である。緩衝液
中の血清アルブミンの量は、緩衝液の全容量を基準とし
て５〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜６０ｍｇ
／ｍＬ、最も好ましくは１０〜４０ｍｇ／ｍＬ程度が適
当である。
【００２７】前記凝集反応は、通常、プラスッチック又
はガラスセル内で行い、セル外部より波長４４０〜１０
００ｎｍから選ばれる適当な波長の光又は白色光を照射
し、吸光度の変化又は散乱光の強度を測定することによ
り、予め作成した検量線から試料溶液内のタンパク質又
はリガンド量が算出できる。次に、本発明の方法の一例
として、試料中のヒアルロン酸濃度の測定方法について
説明する。
はガラスセル内で行い、セル外部より波長４４０〜１０
００ｎｍから選ばれる適当な波長の光又は白色光を照射
し、吸光度の変化又は散乱光の強度を測定することによ
り、予め作成した検量線から試料溶液内のタンパク質又
はリガンド量が算出できる。次に、本発明の方法の一例
として、試料中のヒアルロン酸濃度の測定方法について
説明する。
【００２８】まず、それ自体既知通常用いられる方法に
より、ヒアルロン酸結合タンパク質を精製し、該タンパ
ク質を担体粒子の表面に結合する。ヒアルロン酸結合タ
ンパク質は、担体粒子あたり８００から１，５００個と
なるように適当な緩衝液、例えば０．０１〜０．５Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）等に溶解し、当量のラテック
ス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と室温で１時間攪拌
し、ラテックス粒子上に担持する。
より、ヒアルロン酸結合タンパク質を精製し、該タンパ
ク質を担体粒子の表面に結合する。ヒアルロン酸結合タ
ンパク質は、担体粒子あたり８００から１，５００個と
なるように適当な緩衝液、例えば０．０１〜０．５Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）等に溶解し、当量のラテック
ス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と室温で１時間攪拌
し、ラテックス粒子上に担持する。
【００２９】次いで、反応容器内に分注した前記の反応
用緩衝液に、試料を添加する。この際、試料はヒアルロ
ン酸が抽出分離されている必要はなく、人体などの血液
や体液をそのまま使用できる。あるいは適当な試料希釈
用緩衝液や希釈血清で試料を溶解したものを、上記の操
作に供する事もできる。その後、上記ヒアルロン酸結合
タンパク質が担持されたラテックス試薬（浮遊液）を反
応容器内に分注する。
用緩衝液に、試料を添加する。この際、試料はヒアルロ
ン酸が抽出分離されている必要はなく、人体などの血液
や体液をそのまま使用できる。あるいは適当な試料希釈
用緩衝液や希釈血清で試料を溶解したものを、上記の操
作に供する事もできる。その後、上記ヒアルロン酸結合
タンパク質が担持されたラテックス試薬（浮遊液）を反
応容器内に分注する。
【００３０】次に、ラテックス試薬（浮遊液）分注後、
担持されたヒアルロン酸結合タンパク質と試料中のヒア
ルロン酸との間の結合反応（凝集反応）の速度を吸光の
増加として測定し、この結合反応の速度からヒアルロン
酸を定量する。この際、反応容器内におけるラテックス
試薬の凝集は、測定対象物であるヒアルロン酸のみに起
因しており、生化学的もしくは物理的な要因を問わず断
片化された成分すなわちヒアルロン酸結合タンパク質に
対して複数の結合サイトを持たないものはラテックス粒
子の凝集の原因とはなりえない。
担持されたヒアルロン酸結合タンパク質と試料中のヒア
ルロン酸との間の結合反応（凝集反応）の速度を吸光の
増加として測定し、この結合反応の速度からヒアルロン
酸を定量する。この際、反応容器内におけるラテックス
試薬の凝集は、測定対象物であるヒアルロン酸のみに起
因しており、生化学的もしくは物理的な要因を問わず断
片化された成分すなわちヒアルロン酸結合タンパク質に
対して複数の結合サイトを持たないものはラテックス粒
子の凝集の原因とはなりえない。
【００３１】従って、担持されたヒアルロン酸結合タン
パク質と試料中のヒアルロン酸とに起因するラテックス
粒子の凝集による吸光の増加を測定することで、上記ラ
テックス粒子の凝集に関与しうる試料中ヒアルロン酸の
みが定量される。本発明の方法では、あらかじめ使用す
る測定対象物のヒアルロン酸について、既知濃度の試料
を用意し、吸光の増加速度と該既知濃度の関係について
検量線を作成しておき、測定値を校正可能とすることが
好ましい。
パク質と試料中のヒアルロン酸とに起因するラテックス
粒子の凝集による吸光の増加を測定することで、上記ラ
テックス粒子の凝集に関与しうる試料中ヒアルロン酸の
みが定量される。本発明の方法では、あらかじめ使用す
る測定対象物のヒアルロン酸について、既知濃度の試料
を用意し、吸光の増加速度と該既知濃度の関係について
検量線を作成しておき、測定値を校正可能とすることが
好ましい。
【００３２】上記反応及び測定工程等を含むタンパク質
またはリガンドの存在または濃度を測定するために用い
る試薬キットは、それ自体既知の通常用いられる方法に
より調製できる。このようなキットは、通常の免疫凝集
反応を利用した試薬キットと同様の構成によって提供さ
れる。すなわち、これらの試薬には、前記したタンパク
質またはリガンドが担持された担体粒子と、緩衝剤、塩
化ナトリウム、血清アルブミン、デキストラン硫酸ナト
リウムまたはメチルセルロースのような多糖類を含む緩
衝液が含まれる。
またはリガンドの存在または濃度を測定するために用い
る試薬キットは、それ自体既知の通常用いられる方法に
より調製できる。このようなキットは、通常の免疫凝集
反応を利用した試薬キットと同様の構成によって提供さ
れる。すなわち、これらの試薬には、前記したタンパク
質またはリガンドが担持された担体粒子と、緩衝剤、塩
化ナトリウム、血清アルブミン、デキストラン硫酸ナト
リウムまたはメチルセルロースのような多糖類を含む緩
衝液が含まれる。
【００３３】また、本発明では、一方に前記したタンパ
ク質又はリガンドが担持された担体粒子を含有し、他方
に緩衝剤を含有する２つの収容手段を備えるキットも提
供される。収容手段としては、あらゆる手段を使用する
ことができ、これには、例えばバイアル、ジャー、チュ
ーブ、ボトル、ホイルパック等が含まれる。また開閉可
能なように封止した容器および封止していない容器のい
ずれをも使用することができる。収容手段および封止手
段は、ガラス、プラスチック、金属、複合材料等のあら
ゆる材料から製造することができる。
ク質又はリガンドが担持された担体粒子を含有し、他方
に緩衝剤を含有する２つの収容手段を備えるキットも提
供される。収容手段としては、あらゆる手段を使用する
ことができ、これには、例えばバイアル、ジャー、チュ
ーブ、ボトル、ホイルパック等が含まれる。また開閉可
能なように封止した容器および封止していない容器のい
ずれをも使用することができる。収容手段および封止手
段は、ガラス、プラスチック、金属、複合材料等のあら
ゆる材料から製造することができる。
【００３４】すなわち、本発明のキットは、好ましくは
タンパク質またはリガンドが担持された担体粒子と、専
用に調製された緩衝剤、塩化ナトリウム、多糖類及び血
清アルブミンを含有する反応用緩衝液とからなる２試薬
で構成され、さらに任意の要素として、試料希釈液、洗
浄液、標準物質（タンパク質またはリガンド）、防腐
剤、消泡剤等を含む試薬により構成される。
タンパク質またはリガンドが担持された担体粒子と、専
用に調製された緩衝剤、塩化ナトリウム、多糖類及び血
清アルブミンを含有する反応用緩衝液とからなる２試薬
で構成され、さらに任意の要素として、試料希釈液、洗
浄液、標準物質（タンパク質またはリガンド）、防腐
剤、消泡剤等を含む試薬により構成される。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により、さらに本発明を詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるも
のではない。 参考例１ ヒアルロン酸結合タンパク質の精製 ローレントら（A. E. Laurent et al., Anal. Biochem.
109, 386-394, 1980）に記載の方法に従って、以下通
りヒアルロン酸結合タンパク質を抽出、精製した。
説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるも
のではない。 参考例１ ヒアルロン酸結合タンパク質の精製 ローレントら（A. E. Laurent et al., Anal. Biochem.
109, 386-394, 1980）に記載の方法に従って、以下通
りヒアルロン酸結合タンパク質を抽出、精製した。
【００３６】まず、牛の鼻中隔軟骨３００ｇ（三菱化学
（株）中標津事業所より入手）をハサミ及びナタによっ
て小片に切断し、あらかじめ４℃に保持された塩酸グア
ニジン４Ｍを含む酢酸ナトリウム０．５Ｍ溶液（ｐＨ
５．８）（以下これを「緩衝液Ａ」と称する）に投入し
て４℃に保持したまま一夜攪拌抽出した。次いで、１
３，０００Ｇ、４℃にて４５分間遠心分離した後、上清
液を分離採取した。上清液を精製水に透析させた後、凍
結乾燥し、得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を得
た。
（株）中標津事業所より入手）をハサミ及びナタによっ
て小片に切断し、あらかじめ４℃に保持された塩酸グア
ニジン４Ｍを含む酢酸ナトリウム０．５Ｍ溶液（ｐＨ
５．８）（以下これを「緩衝液Ａ」と称する）に投入し
て４℃に保持したまま一夜攪拌抽出した。次いで、１
３，０００Ｇ、４℃にて４５分間遠心分離した後、上清
液を分離採取した。上清液を精製水に透析させた後、凍
結乾燥し、得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を得
た。
【００３７】粗抽出粉末１．６ｇとトリプシン（シグマ
社製）０．８ｍｇとを酢酸ナトリウム０．１Ｍを含む
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）２５ｍｌ
中に加え、３７℃にて２時間、トリプシン処理した。次
いで、大豆トリプシン阻害剤１ｍｇ（シグマ社製）を加
え、さらに０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加えて総容
量を５０ｍＬとした。
社製）０．８ｍｇとを酢酸ナトリウム０．１Ｍを含む
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）２５ｍｌ
中に加え、３７℃にて２時間、トリプシン処理した。次
いで、大豆トリプシン阻害剤１ｍｇ（シグマ社製）を加
え、さらに０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加えて総容
量を５０ｍＬとした。
【００３８】得られたトリプシン処理ヒアルロン酸結合
タンパク質含有溶液から、アフィニティークロマトグラ
フィーを用いて、次のようにしてヒアルロン酸結合タン
パク質を精製した。先ず、ヒアルロン酸ナトリウム６０
０ｍｇ（生化学工業）、ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）７５ｍＬおよび精製水２００ｍＬの混合液
に、水溶性カルボジイミド（Ｄｏｊｉｎ）１．４ｇを溶
解した精製水５ｍＬを５回に分けて添加した後、室温に
て２４時間放置した。この反応液に酢酸１０ｍＬを加え
て反応を停止させた。得られたゲルを取り出し、それぞ
れ１Ｌの１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）、
０．０５Ｍギ酸水溶液（ｐＨ３．１）、精製水および
０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．７）により、
順次、ゲルを洗浄してヒアルロン酸結合セファロースゲ
ルを得た。
タンパク質含有溶液から、アフィニティークロマトグラ
フィーを用いて、次のようにしてヒアルロン酸結合タン
パク質を精製した。先ず、ヒアルロン酸ナトリウム６０
０ｍｇ（生化学工業）、ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）７５ｍＬおよび精製水２００ｍＬの混合液
に、水溶性カルボジイミド（Ｄｏｊｉｎ）１．４ｇを溶
解した精製水５ｍＬを５回に分けて添加した後、室温に
て２４時間放置した。この反応液に酢酸１０ｍＬを加え
て反応を停止させた。得られたゲルを取り出し、それぞ
れ１Ｌの１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）、
０．０５Ｍギ酸水溶液（ｐＨ３．１）、精製水および
０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．７）により、
順次、ゲルを洗浄してヒアルロン酸結合セファロースゲ
ルを得た。
【００３９】次に、トリプシン処理ヒアルロン酸結合タ
ンパク質含有溶液５０ｍＬに、上記ヒアルロン酸結合セ
ファロースゲル５０ｍＬを加えて混合し、直ちに透析膜
の中に入れた後、４℃に冷却した２０倍量の精製水中で
一夜透析させた。透析後、ゲル全量を内径３．２ｃｍの
カラムに充填した後、１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗
浄し、未吸着分を除去した。さらに１〜３Ｍの塩化ナト
リウム水溶液で順次洗浄して不要なタンパク質を除去し
た後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。回収画
分を４℃に冷却した精製水中にて一夜透析した後、凍結
乾燥した。得られた粉末を緩衝液Ａに溶解して全量を４
ｍＬとし、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ−
ＣＬカラム（φ１．６ｘ８３ｃｍ）を通過させた。第２
および第３ピークを示す成分を回収し、それぞれ、ＤＩ
ＡＦＬＯ ＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮し、ヒア
ルロン酸結合タンパク質を得た。
ンパク質含有溶液５０ｍＬに、上記ヒアルロン酸結合セ
ファロースゲル５０ｍＬを加えて混合し、直ちに透析膜
の中に入れた後、４℃に冷却した２０倍量の精製水中で
一夜透析させた。透析後、ゲル全量を内径３．２ｃｍの
カラムに充填した後、１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗
浄し、未吸着分を除去した。さらに１〜３Ｍの塩化ナト
リウム水溶液で順次洗浄して不要なタンパク質を除去し
た後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。回収画
分を４℃に冷却した精製水中にて一夜透析した後、凍結
乾燥した。得られた粉末を緩衝液Ａに溶解して全量を４
ｍＬとし、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ−
ＣＬカラム（φ１．６ｘ８３ｃｍ）を通過させた。第２
および第３ピークを示す成分を回収し、それぞれ、ＤＩ
ＡＦＬＯ ＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮し、ヒア
ルロン酸結合タンパク質を得た。
【００４０】ここで得られたヒアルロン酸結合タンパク
質は、ハーディンガム（Hardingham）らによって同定さ
れたプロテオグリカンと同等であり、ヒアルロン酸との
結合能を持つコアタンパク質（分子量約９万）とリンク
タンパク質（分子量約４．４万）とからなる複合体であ
る。コアタンパク質はヒアルロン酸と〜１μＭの結合能
を持つ。
質は、ハーディンガム（Hardingham）らによって同定さ
れたプロテオグリカンと同等であり、ヒアルロン酸との
結合能を持つコアタンパク質（分子量約９万）とリンク
タンパク質（分子量約４．４万）とからなる複合体であ
る。コアタンパク質はヒアルロン酸と〜１μＭの結合能
を持つ。
【００４１】実施例１ 表面にカルボキシレート基を有するラテックス粒子浮遊
液（固体重量：１０ｗｔ％、直径：０．３６８μｍ、カ
ルボキシレート基量：０．３３ｍｅｑ／ｇ、セラダイン
社製）１００ｍＬに対し、２ｇのイオン交換樹脂（Bior
ad社：ＡＧ５０１−Ｘ８）を添加し、緩く撹拌しながら
室温で２時間静置した。その後ガラス繊維フィルターを
使用して浮遊液を濾過し樹脂を除去した。これによって
ラテックス粒子をタンパク質又はリガンドと結合しうる
状態とした。５ｍＬのポリカーボネート製遠心チューブ
に対し、１ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）および１００μＬの前記洗浄した１０％固体ラテッ
クス浮遊液を添加し、撹拌しながら室温で１０分間イン
キュベートした後、反応させた。１０ｍｇ／ｍＬの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、新たに水に溶解したもの）を
混合物に５０μＬ添加し、ラテックス表面のカルボキシ
ル残基を１０分間活性化した。活性化の後に、１ｍｇ／
ｍＬの前記精製したヒアルロン酸結合タンパク質を激し
く撹拌しながら４００μＬ添加し、１時間インキュベー
トした。１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン水溶液を３
００μＬ添加することにより反応を停止し、ラテックス
表面上のヒアルロン酸結合タンパク質が結合（担持）さ
れていない領域を被覆した。さらに１０分間インキュベ
ートして反応を停止させた。
液（固体重量：１０ｗｔ％、直径：０．３６８μｍ、カ
ルボキシレート基量：０．３３ｍｅｑ／ｇ、セラダイン
社製）１００ｍＬに対し、２ｇのイオン交換樹脂（Bior
ad社：ＡＧ５０１−Ｘ８）を添加し、緩く撹拌しながら
室温で２時間静置した。その後ガラス繊維フィルターを
使用して浮遊液を濾過し樹脂を除去した。これによって
ラテックス粒子をタンパク質又はリガンドと結合しうる
状態とした。５ｍＬのポリカーボネート製遠心チューブ
に対し、１ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）および１００μＬの前記洗浄した１０％固体ラテッ
クス浮遊液を添加し、撹拌しながら室温で１０分間イン
キュベートした後、反応させた。１０ｍｇ／ｍＬの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、新たに水に溶解したもの）を
混合物に５０μＬ添加し、ラテックス表面のカルボキシ
ル残基を１０分間活性化した。活性化の後に、１ｍｇ／
ｍＬの前記精製したヒアルロン酸結合タンパク質を激し
く撹拌しながら４００μＬ添加し、１時間インキュベー
トした。１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン水溶液を３
００μＬ添加することにより反応を停止し、ラテックス
表面上のヒアルロン酸結合タンパク質が結合（担持）さ
れていない領域を被覆した。さらに１０分間インキュベ
ートして反応を停止させた。
【００４２】次いで、ヒアルロン酸結合タンパク質が担
持されたラテックス粒子浮遊液を２５，０００Ｇで１０
分間遠心分離した。上清を除去し、容器底部のペレット
に２ｍＬの水を添加した。その後激しく撹拌しながらペ
レットを再浮遊させ、同様の洗浄操作を４回繰り返し
た。ただし、最後の再浮遊では、０．０５％のアジ化ナ
トリウム水溶液を保存液として使用した。最後に、ラテ
ックス浮遊液を超音波処理する事によって完全に浮遊さ
せた後、直ちに使用できる濃度（通常は、０．１〜０．
４ｗ／ｖ％）に希釈した。
持されたラテックス粒子浮遊液を２５，０００Ｇで１０
分間遠心分離した。上清を除去し、容器底部のペレット
に２ｍＬの水を添加した。その後激しく撹拌しながらペ
レットを再浮遊させ、同様の洗浄操作を４回繰り返し
た。ただし、最後の再浮遊では、０．０５％のアジ化ナ
トリウム水溶液を保存液として使用した。最後に、ラテ
ックス浮遊液を超音波処理する事によって完全に浮遊さ
せた後、直ちに使用できる濃度（通常は、０．１〜０．
４ｗ／ｖ％）に希釈した。
【００４３】上記で調製したヒアルロン酸結合タンパク
質が担持されたラテックス試薬を用いて 、ヒアルロン
酸標準品の濃度を０、２０、６０、２００、６００ｎｇ
／ｍｌとした場合についてそれぞれ試料を作成し、全自
動免疫診断システム（ＬＰＩＡ−Ｓ５００：三菱化学
（株）製）による測定に供した。検体溶液１０μＬを反
応容器に分注し、さらに専用に調製された反応用緩衝液
（２００ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン、０．９％のＮａＣｌ、１％のデキストラン硫酸
ナトリウム、０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５
％のアジ化ナトリウム、０．００５％の消泡剤（ダウ・
コ−ニング社製：１４１０）を水に溶解し、塩酸でｐＨ
を８．２に調製し作成）１８０μＬと精製水７０μＬを
加え全体を２６０μＬとする。上記で得られたラテック
ス試薬（浮遊液）は、上記装置で自動的に４０μＬ
（０．２％ラテックス浮遊液）供され、合計３００μＬ
のラテックス浮遊液の生化学的に特異な結合反応による
吸光度の変化を経時的に測定した。その変化量（反応速
度）に応じて、既知濃度の標準品で検量線を作成した。
質が担持されたラテックス試薬を用いて 、ヒアルロン
酸標準品の濃度を０、２０、６０、２００、６００ｎｇ
／ｍｌとした場合についてそれぞれ試料を作成し、全自
動免疫診断システム（ＬＰＩＡ−Ｓ５００：三菱化学
（株）製）による測定に供した。検体溶液１０μＬを反
応容器に分注し、さらに専用に調製された反応用緩衝液
（２００ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン、０．９％のＮａＣｌ、１％のデキストラン硫酸
ナトリウム、０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５
％のアジ化ナトリウム、０．００５％の消泡剤（ダウ・
コ−ニング社製：１４１０）を水に溶解し、塩酸でｐＨ
を８．２に調製し作成）１８０μＬと精製水７０μＬを
加え全体を２６０μＬとする。上記で得られたラテック
ス試薬（浮遊液）は、上記装置で自動的に４０μＬ
（０．２％ラテックス浮遊液）供され、合計３００μＬ
のラテックス浮遊液の生化学的に特異な結合反応による
吸光度の変化を経時的に測定した。その変化量（反応速
度）に応じて、既知濃度の標準品で検量線を作成した。
【００４４】得られた結果を図１に示す。これより、本
発明の測定方法によれば１０ｎｇのオーダーのヒアルロ
ン酸の検出および測定が可能であることがわかる。 実施例２ 従来法の標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用い
たサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）による高値検体（中外
製薬（株）社製キットを用いて測定）を用いて、実施例
１の方法によりヒアルロン酸濃度の測定を行った。得ら
れた結果を図２に示す。これにより、本発明の測定方法
によれば高値検体についても従来法と矛盾することのな
い結果が得られることがわかった。
発明の測定方法によれば１０ｎｇのオーダーのヒアルロ
ン酸の検出および測定が可能であることがわかる。 実施例２ 従来法の標識されたヒアルロン酸結合タンパク質を用い
たサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）による高値検体（中外
製薬（株）社製キットを用いて測定）を用いて、実施例
１の方法によりヒアルロン酸濃度の測定を行った。得ら
れた結果を図２に示す。これにより、本発明の測定方法
によれば高値検体についても従来法と矛盾することのな
い結果が得られることがわかった。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、免疫反応（抗原抗体反
応）によらず、タンパク質又はリガンドを、感度及び特
異性が高く、操作が簡便で、短時間で測定できる。特
に、本発明の方法により、競合反応を用いずとも精度高
くヒアルロン酸が測定可能である。即ち、予め精製した
ヒアルロン酸を必要とせず、しかも操作が簡便であり、
１０ｎｇという極めて微量のヒアルロン酸の検出および
定量が可能である。また、本発明の方法は、サンプルの
予備処理の必要がなく、かつ予め調製された２試薬によ
って構成されるので臨床化学の分野で使用される市販の
自動分析装置にも適合するものである。
応）によらず、タンパク質又はリガンドを、感度及び特
異性が高く、操作が簡便で、短時間で測定できる。特
に、本発明の方法により、競合反応を用いずとも精度高
くヒアルロン酸が測定可能である。即ち、予め精製した
ヒアルロン酸を必要とせず、しかも操作が簡便であり、
１０ｎｇという極めて微量のヒアルロン酸の検出および
定量が可能である。また、本発明の方法は、サンプルの
予備処理の必要がなく、かつ予め調製された２試薬によ
って構成されるので臨床化学の分野で使用される市販の
自動分析装置にも適合するものである。
【図１】本発明のヒアルロン酸の測定方法により得られ
たヒアルロン酸濃度と反応速度との関係を示す図（検量
線）である。
たヒアルロン酸濃度と反応速度との関係を示す図（検量
線）である。
【図２】従来法である標識されたヒアルロン酸結合タン
パク質を用いたサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）との、高
値検体における相関を示すグラフである。
パク質を用いたサンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）との、高
値検体における相関を示すグラフである。
Claims (8)
- 【請求項１】 タンパク質又はリガンドを担体粒子に担
持させ、この担持されたタンパク質又はリガンドと、試
料中のリガンド又はタンパク質とを反応せしめ、該反応
混合物に光を照射して反応混合物の吸光又は散乱光の変
化を検出することを特徴とするタンパク質又はリガンド
の測定方法。 - 【請求項２】 タンパク質が、受容タンパク質又は結合
タンパク質である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 受容タンパク質が生理活性因子受容タン
パク質、性ホルモン受容タンパク質、下垂体ホルモン受
容タンパク質、細胞間接着因子受容タンパク質及び癌マ
ーカー受容タンパク質よりなる群からから選ばれる請求
項２に記載の方法。 - 【請求項４】 結合タンパク質が、補体系制御タンパク
質、ステロイド結合タンパク質及び生理活性物質結合タ
ンパク質よりなる群から選ばれる請求項２に記載の方
法。 - 【請求項５】 タンパク質が、ヒアルロン酸結合タンパ
ク質であり、リガンドがヒアルロン酸である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項６】 ヒアルロン酸結合タンパク質が、プロテ
オグリカン、リンクプロテイン及びヒアルロネクチンよ
りなる群から選ばれる請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 少なくとも、タンパク質又はリガンドが
担持された担体粒子よりなり、この担持されたタンパク
質又はリガンドと、試料中のリガンド又はタンパク質と
を反応せしめ、該反応混合物に光を照射して反応混合物
の吸光又は散乱光の変化を検出することを特徴とするタ
ンパク質又はリガンドを測定するために用いる試薬キッ
ト。 - 【請求項８】 タンパク質又はリガンドが担持された担
体粒子を含有する試薬と、緩衝剤、塩化ナトリウム、多
糖類及び血清アルブミンを含有する試薬とからなる請求
項７に記載の試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16683397A JP3424504B2 (ja) | 1997-06-24 | 1997-06-24 | ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16683397A JP3424504B2 (ja) | 1997-06-24 | 1997-06-24 | ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1114628A true JPH1114628A (ja) | 1999-01-22 |
| JP3424504B2 JP3424504B2 (ja) | 2003-07-07 |
Family
ID=15838509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16683397A Expired - Lifetime JP3424504B2 (ja) | 1997-06-24 | 1997-06-24 | ヒアルロン酸結合タンパク質又はヒアルロン酸の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3424504B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005114186A1 (ja) | 2004-05-20 | 2005-12-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 |
| WO2011065573A1 (ja) * | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 積水メディカル株式会社 | ホモジーニアス測定法および測定試薬 |
| WO2011125912A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | 積水メディカル株式会社 | 測定系外成分による干渉を低減させる方法 |
| CN106093373A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定透明质酸的试剂盒 |
| CN106198994A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-12-07 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种透明质酸的测定试剂及其制备方法 |
| WO2017006431A1 (ja) * | 2015-07-07 | 2017-01-12 | 有限会社ガッテン | バイオマーカーの検出方法及び検出キット |
| CN108362686A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-08-03 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5477287B2 (ja) | 2008-04-15 | 2014-04-23 | 和光純薬工業株式会社 | 新規なヒアルロン酸結合能を有するタンパク質及びこれを用いたヒアルロン酸の測定方法 |
-
1997
- 1997-06-24 JP JP16683397A patent/JP3424504B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (17)
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|---|---|---|---|---|
| WO2005114186A1 (ja) | 2004-05-20 | 2005-12-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 |
| JPWO2005114186A1 (ja) * | 2004-05-20 | 2008-03-27 | 和光純薬工業株式会社 | ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 |
| JP2011090004A (ja) * | 2004-05-20 | 2011-05-06 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫凝集法用ヒアルロン酸測定試薬キット |
| JP4730304B2 (ja) * | 2004-05-20 | 2011-07-20 | 和光純薬工業株式会社 | ヒアルロン酸バインディングプロテインを用いたヒアルロン酸の測定方法 |
| WO2011065573A1 (ja) * | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 積水メディカル株式会社 | ホモジーニアス測定法および測定試薬 |
| JP5806939B2 (ja) * | 2009-11-30 | 2015-11-10 | 積水メディカル株式会社 | ホモジーニアス測定法および測定試薬 |
| CN102687014A (zh) * | 2009-11-30 | 2012-09-19 | 积水医疗株式会社 | 均相测量方法和测量试剂 |
| CN103038641A (zh) * | 2010-03-31 | 2013-04-10 | 积水医疗株式会社 | 减少来自测量系统外部的成分的干扰的方法 |
| EP2554991A1 (en) * | 2010-03-31 | 2013-02-06 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for reducing interference by component outside assay system |
| EP2554991A4 (en) * | 2010-03-31 | 2013-08-14 | Sekisui Medical Co Ltd | PROCESS FOR INTERFERENCE SUPPRESSION BY COMPONENTS OUTSIDE OF AN ASSAY SYSTEM |
| WO2011125912A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | 積水メディカル株式会社 | 測定系外成分による干渉を低減させる方法 |
| JP5823377B2 (ja) * | 2010-03-31 | 2015-11-25 | 積水メディカル株式会社 | 測定系外成分による干渉を低減させる方法 |
| US10267789B2 (en) | 2010-03-31 | 2019-04-23 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of reducing interference from component outside of measurement system |
| WO2017006431A1 (ja) * | 2015-07-07 | 2017-01-12 | 有限会社ガッテン | バイオマーカーの検出方法及び検出キット |
| CN106093373A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定透明质酸的试剂盒 |
| CN106198994A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-12-07 | 浙江达美生物技术有限公司 | 一种透明质酸的测定试剂及其制备方法 |
| CN108362686A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-08-03 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定透明质酸的试剂盒及其制备使用方法 |
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