JP5806939B2 - ホモジーニアス測定法および測定試薬 - Google Patents

Description

本発明は、不溶性担体粒子を用いるホモジーニアス測定法、特に抗体や抗原などを担持させた不溶性担体粒子を用いる凝集測定法において、測定試薬中にシリコーン系消泡剤を含有させることを特徴とし、検体由来のマトリクス効果を低減させるとともに、異なる仕様の自動分析装置間における測定精度差を改善した自動分析装置用の測定試薬に関する。

近年、自動分析装置を用いて行う臨床検査において、自動分析装置の分注機能の向上とそれに対応する臨床検査薬（以下、「検査試薬」ということがある）の開発により、自動分析時における測定試料（以下、「検体」ということがある）や検査試薬の少量化が実現されている。

これら臨床検査薬のうち、不溶性担体粒子を用いたホモジーニアス測定法、特に、ラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ）は、高感度であることより測定対象が拡大しているが、検査試薬の少量化にともなう課題があり、また同一の検査試薬を異なる仕様の複数の自動分析装置で共通に使用可能にするための課題も存在する。

検査試薬の少量化にともなう課題の一つは、血清などの被験者から採取した検体由来のマトリクス効果（ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔ）の低減である。マトリクス効果とは、例えば、精製された測定対象物を含む緩衝液を検体として測定した場合の感度に対して、該緩衝液検体と同濃度の測定対象物を含む同一容量の血清などの被験者から採取した検体を測定した場合の感度が増大したり減少したりする現象をいい、このような感度の増減が血清などの被験者から採取した検体中の成分（血清中の測定対象物以外の物質など）の存在に起因して生じることをいう。なお、本明細書において血清などの被験者から採取した検体を「生物検体」ということがある。

臨床検査における従来の測定対象物は、生物検体中における量が比較的多いため、生物検体を希釈してマトリクス効果を低減させたり、あるいは較正用基準（キャリブレーター）や検査試薬に生物検体由来成分等（例えば、血清やアルブミン）を含有させて測定時における生物検体と較正用基準の組成を近似させマトリクス効果を低減させる方法が採用されてきた。しかしながら、希釈によるマトリクス効果の低減方法は、生物検体中の測定対象物の量が測定系の感度と合致しない場合には採用できず、また、較正用基準や検査試薬への血清成分等の添加は、検査試薬の粘度上昇や発泡をもたらす場合があり、少量化を前提とした分注に悪影響を与える場合がある。

また、同一の検査試薬を異なる仕様の複数の自動分析装置で共通に使用可能にするための課題としては、同じ検査試薬を使用した場合であっても、自動分析装置の機種によって測定値の正確性や再現性（以下、総称して「測定精度」ということがある）に幅（以下、「性能低下」ということがある）を生じる場合（以下、この現象全体を「機種間差」ということがある）があることがあげられる。この性能低下現象は、特定の検査試薬を特定の自動分析装置に適用した場合に発生するため、流通している異なる仕様の全ての種類の自動分析装置を対象として網羅的に試薬性能を検証することが実質的に困難である検査試薬の開発段階では予測が困難であり、検査試薬が医療施設等で使用されるようになってから顕在化する場合が多く、大きな課題となっている。

以前より、臨床検査薬では、自動分析装置のいくつかの機種を対象に、検査試薬を使用する機種毎に推奨される測定条件（パラメーター）を例示することが行われているが、パラメーターの変更のみでは前記した機種間差は改善されない場合がある。また、ひとつの測定項目（検査項目）について、自動分析装置の機種毎に適合する処方の検査試薬が複数開発されている場合もあるが、自動分析装置の機種数は多く、特定の自動分析装置（機種）を対象として、個々に適合する処方の検査試薬を開発することは、作業量や経済効率の面等で問題がある。

現在まで、不溶性担体粒子を用いた自動分析用ホモジーニアス測定法試薬、特にＬＴＩＡ用試薬において、マトリクス効果の低減方法は十分に検討されておらず、また自動分析装置の機種間において生じる性能差の発生原因や改善方法は明らかになっていない。

ＬＴＩＡ用試薬については、増粘効果が知られているデキストラン硫酸と起泡効果が知られているアルブミンを同時に含有する試薬に、消泡剤を処方したＬＴＩＡ用試薬が知られている（特許文献１、２）。特許文献１には、１．２５％〜１．７５％のデキストラン硫酸ナトリウムおよび２．０％の脂肪酸非含有ヒト血清アルブミンを含有する試薬に、０．０１％の消泡剤１４１０（ダウ・コーニング社製）を処方した試薬を使用してＬＴＩＡ測定を行ったことが記載され、特許文献２には、１％のデキストラン硫酸ナトリウムおよび０．５％のウシ血清アルブミンを含有する試薬に、０．００５％の消泡剤（ダウ・コーニング社製：１４１０）を処方した試薬を使用してＬＴＩＡ測定を行ったことが記載されている。しかしながら、両文献とも、本出願時点での自動分析装置による測定における通常の総液量（検体と試薬（試液）の総液量：２００μＬ前後）よりも多量の３００μＬを総液量とする場合についての記載であるなど、検体及び試薬（試液）の少量化を前提としておらず、また、消泡剤のマトリクス効果低減への関与や自動分析装置の機種間差の発生原因や改善方法には一切言及されていない。なお、本明細書では、試薬が液状の場合、試薬液または単に試液ということがある。

また、抗体や抗原などを担持させた不溶性担体を用いる結合アッセイを原理とする各種の測定法において、非特異的な反応の抑制を目的として、測定試薬の構成試薬の一部、例えば洗浄液や反応緩衝液などに界面活性剤が含まれていることが多いが、界面活性剤が存在するとその性質上、反応液の攪拌・混和などの際に起泡しやすくなり、測定精度に影響を与えるため、特許文献３に記載のヘテロジーニアス酵素免疫測定法のように、消泡剤の添加によって界面活性剤による起泡を抑制する方法が報告されている。さらに特許文献４に記載のポリヌクレオチドの増幅ならびに検出試薬においては、マイクロメーターサイズの微細な試薬（試液）流路を特徴とするマイクロ流体デバイスへの適用を考慮して消泡剤の添加が提案されている。

また、自動分析装置に関しては、例えば特許文献５において自動分析装置洗浄用洗剤に含まれる界面活性剤による気泡の発生を消泡剤によって解消する提案がなされているものの、これは装置の洗浄における課題、すなわち機器の保守に伴う課題の解決手段であって、検体測定における使用は意図されておらず、当然、測定精度に与える効果については言及されていない。さらに言えば、そもそもホモジーニアス測定法には洗浄操作がないため、洗浄により洗剤が反応系に混入するような事態は発生しえない。

前記特許文献１〜５にみるように、現在まで、不溶性担体粒子を用いた自動分析装置用ホモジーニアス測定法試薬、特にＬＴＩＡ用試薬において、マトリクス効果の低減、自動分析装置の機種間差の改善を目的として消泡剤が使用されることはなかった。

特開平０７−３０１６３２号公報 特開平１１−０１４６２８号公報 特開平０９−０６８５２９号公報 特表２００６-５０７００２号公報 特開２００８−８２７７７号公報

本発明は、不溶性担体粒子を用いるホモジーニアス測定法、特に抗体や抗原などを担持させた不溶性担体粒子を用いる凝集測定法、より具体的にはＬＴＩＡにおいて、生物検体由来のマトリクス効果を低減させるとともに、異なる仕様の自動分析装置間における測定精度差を改善した測定方法および自動分析装置用の測定試薬の提供を課題とする。

本発明者らは、不溶性担体粒子を用いたホモジーニアス測定法、特に抗体や抗原などを担持させた不溶性担体粒子を用いる凝集測定法、より具体的にはＬＴＩＡにおける自動分析装置用測定試薬における上記課題を解決するため、さまざまな視点から検証を試みたところ、測定試薬にシリコーン系消泡剤を添加処方することにより、生物検体由来のマトリクス効果を低減させるとともに、測定試薬の基本的な性能を変動させることなく、異なる仕様の自動分析装置間における測定精度の幅を改善することができることを見出し、本発明の測定試薬を完成した。

本発明は、以下の構成を有する。
（１）不溶性担体粒子を用いる自動分析装置用ホモジーニアス測定法試薬であって、構成試薬中にシリコーン系消泡剤を含有することを特徴とする測定試薬。ただし、該構成試薬中のタンパク質濃度は２ｗ／ｖ％未満であり、自動分析装置により分取される検体および試薬液の総液量が３００μＬ未満かつ不溶性担体粒子を含有する試薬液量が総液量の２０ｖ／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下の場合に用いられるものである。
（２）前記不溶性担体粒子が、測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質を担持させた不溶性担体粒子である前記（１）に記載の測定試薬。
（３）シリコーン系消泡剤が、オイル型、オイルコンパウンド型、溶液型、自己乳化型、エマルジョン型およびそれらの混合物からなる群より選択される前記（１）または（２）に記載の測定試薬。
（４）構成試薬中のシリコーン系消泡剤の濃度が０．０００１〜０．１％である前記（１）乃至（３）のいずれか一に記載の測定試薬。
（５）自動分析装置が攪拌及び／又は混和機能を有し、当該機能の仕様が、直接型または非接触型である前記（１）乃至（４）のいずれか一に記載の測定試薬。
（６）自動分析装置を使用したホモジーニアス測定法であって、
以下の工程を含む測定法：
１）測定対象物質を含む検体及び試薬を分取する工程、
ここで、該試薬は1又は複数の構成試薬を含み、
該構成試薬の少なくとも一つが不溶性担体粒子を含み、
かつ、
構成試薬中のタンパク質濃度が２ｗ/ｖ％未満である；
２）シリコーン系消泡剤の存在下で、検体及び試薬の総液量が３００μＬ未満、かつ、不溶性担体粒子を含有する試薬液量が総液量の２０ｖ/ｖ％以上５０ｖ/ｖ％以下となるように混和する工程；および
３）該測定対象物質を検出する工程。
さらに、本発明は以下の態様も有する。
（７）不溶性担体粒子が、測定対象物質に対する高親和性物質、あるいは測定対象物質様物質を担持させた不溶性担体粒子である、前記（６）に記載の測定法。
（８）シリコーン系消泡剤が、オイル型、オイルコンパウンド型、溶液型、自己乳化型、エマルジョン型およびそれらの混合物からなる群より選択される前記（６）または（７）に記載の測定法。
（９）構成試薬中のシリコーン系消泡剤の濃度が０．０００１〜０．１％である前記（６）乃至（８）のいずれかに記載の測定法。
（１０）自動分析装置が攪拌及び／又は混和機能を有しており当該機能の仕様が、直接型または非接触型である前記（６）乃至（９）のいずれかに記載の測定法。

本発明により、生物検体由来のマトリクス効果を受けることなく、また、自動分析装置の仕様に関わらず高精度に測定が可能な、不溶性担体粒子を用いたホモジーニアス測定法に基づく自動分析装置用の凝集測定試薬を提供することが可能になった。

対照試薬１及び本発明試薬１を使用し、３種のパラメータ（条件Ａ〜Ｃ）で血清検体ＡおよびＢをそれぞれ５回連続測定したときの測定値の変動を示すグラフである。（実施例２）

（ホモジーニアス測定法）
本発明においてホモジーニアス測定法とは、検体と試液の混和溶液（反応液）中で測定対象物質により進行する反応をＢ／Ｆ（結合／非結合）分離を行うことなく特異的に検出する測定法を指し、Ｂ／Ｆ分離操作によって測定反応に関与しなかった余剰成分を完全に洗浄・除去した後、主反応を進行させて検出するヘテロジーニアス測定法と対比して呼称される測定法のことをいう。

（自動分析装置）
本発明において自動分析装置とは、主に臨床検査における使用を目的として各社より製造・販売されているものを指す。具体的な例として、日立ハイテクノロジーズ社製の自動分析装置シリーズ、東芝メディカルシステムズ社製のＴＢＡシリーズ、日本電子社製のＢＭシリーズ、ベックマン・コールター・バイオメディカル社製、積水メディカル社製などのいわゆる汎用試薬型自動分析装置や、近赤外測定装置ＬＰＩＡ（登録商標）（三菱化学メディエンス社製）、散乱光強度測定装置（デイド・ベーリング社製）などのいわゆる専用試薬型自動分析装置、さらに光学的測定が可能な血液凝固測定装置などを挙げることができ、機種の名称や大きさ（いわゆる大型機・小型機）を問わない。

これら自動分析装置は、通常、以下のような動作によって検体の測定を行う。本発明に好適な、２つの構成試薬からなる検査試薬（二試液系試薬）を使用する場合を例として、測定工程にそって説明する。先ず検体および第１試薬を順次分取のうえ吸光度測定用のセルを兼ねる反応槽に分注して混和する。次に第２試薬を分取、反応槽に分注して混和した後、一定時間内の光学的変化を測定する。このような工程に対応する機能・仕様を臨床検査用として流通している多くの自動分析装置は共通して備えている。

その一方で、検体や試薬の分取・分注や溶液の攪拌・混和など、各工程における機能や仕様の詳細は自動分析装置間で異なっており、例えば攪拌・混和工程に関しては、検体量、試薬量の少量化と同時に多様化が進んでおり、各種形状のプローブを反応液中で回転させて攪拌し、反応液を混和する方式（日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ７１８０など）、ピエゾ素子振動プローブが発生する振動を利用して、反応液を混和する方式（東芝メディカルシステムズ社製のＴＢＡ１２０ＦＲなど）といった直接型（接触型）に加え、反応槽中の反応液を超音波により振動させて反応液を混和する方式（日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ９０００など）、検体や試薬を分注するプローブからの溶液吐出力を利用し反応液を混和する方式、反応槽自体を振とうして反応液を混和する方式（いずれも積水メディカル社製のＣＰ２０００など）といった非接触型（間接型）が普及しはじめている。なお、本明細書中、自動分析装置が有する機能である攪拌・混和とは当該装置が「攪拌」のみの機能を有する場合、「混和」のみの場合、または「攪拌および混和」の両機能を有する場合のいずれをも含む意味で用いられる。

これらの撹拌・混和における機器の仕様は、それぞれ基本原理が異なっていることから攪拌・混和の能力に差を与えることが考えられ、最近の自動分析装置を用いた臨床検査においては、攪拌・混和能力の差に起因して反応が不均一になっていることが顕在化している可能性が考えられる。さらにいえば直接的な比較が困難な溶液（検体や試液）の分取・分注の機構や、各部品の材質の違いなどを考慮すると、測定試薬におよぼす物理的な影響は自動分析装置ごとに全く異なっているものと考えられる。本発明は、このような、撹拌・混和の際に機器の仕様差に起因することが考えられる自動分析装置における機種間差が生じる場合に、好適に使用することができる。

(シリコーン系消泡剤)
発泡は気相液相間の界面現象であり、液体が薄い膜となって空気を包みこむことにより気泡が形成される。気泡の生成には表面張力、粘度（粘性）などが影響しており、界面活性剤や高分子化合物が発泡因子として知られている。気泡の表面では界面活性物質が疎水基を気相に向けて規則正しく配列しているものと考えられているが、本発明において消泡とは、界面活性物質の規則的な構造配列の形成や保持に対して干渉することにより、気泡の発生を抑制する抑泡作用および気泡を破壊する破泡作用、さらには気泡同士をくっつけて液面に上昇させる脱気作用を意味し、本発明において使用されるシリコーン系消泡剤は上記のいずれかの作用を有していればよいが、複数の作用を併せ持つ成分が好適である。

本発明の測定試薬におけるシリコーン系消泡剤は、ホモジーニアス測定法の成分として利用可能であれば特に制限はないが、シリコーン系消泡剤としてはポリアルキルシロキサンを含有することを特徴とするシリコーン系消泡剤が挙げられる。

本発明に使用されるポリアルキルシロキサンは、下記化学式１で示される構造を有する。

（化学式１）
ここで、Ｒは水素原子、アルキル基、置換アルキル基、芳香族基などの官能基であればよく、具体的には下記化学式２で示される基が挙げられる。

（化学式２）

前記Ｒは、より好ましくはメチル基あるいはフェニル基である。また、前記化学式１において、Ｒは全て同一であってもよいし、Ｒが異なる２種以上の基であってもよい。前記Ｒが異なる２種以上の基である場合には、そのポリアルキルシロキサンは、単独重合体であってもよいし、下記化学式３で示されるブロック共重合体であってもよい。
本実施の形態において、重合度、すなわち、前記化学式１におけるｎ、あるいは下記化学式３におけるｎ＋ｍの値は、５０以下とすることができるが、好ましくは、重合度は１〜２０である。重合度が、この範囲を上回ると、常温で粘性が非常に高くなり、均一な分散が困難となる。

（化学式３）

上記ポリアルキルシロキサンとして、具体的には、重合度１ないし２０ のジメチルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルエポキプロピルシロキサンなどが挙げられる。

ポリアルキルシロキサンの市販品（製品）の例としては、ＴＳＦ４５１，ＴＨＦ４５０，ＦＱＦ５０１，ＹＳＡ６４０３，ＴＳＡ７２０，ＹＳＡ０２，ＴＳＡ７５０，ＴＳＡ７５０Ｓ，ＹＳＡ６４０６，ＴＳＡ７８０，ＴＳＡ７３４１，ＴＳＡ７３９，ＴＳＡ７３２，ＴＳＡ７３２Ａ，ＴＳＡ７７２，ＴＳＡ７３０，ＴＳＡ７７０，ＴＳＡ７７５，ＹＭＡ６５０９，ＴＳＡ７３７Ｂ，ＴＳＡ７３７Ｓ，ＴＳＡ７３７Ｆ（以上ＧＥ東芝シリコーン社製），ＫＭ−７３，ＫＭ−７３Ａ，ＫＭ−７３Ｅ，ＫＭ−７０，ＫＭ−７１，ＫＭ−７５，ＫＭ−８５，ＫＭ−７２，ＫＭ−７２Ｆ，ＫＭ−７２Ｓ，ＫＭ−７２ＦＳ，ＫＭ−８９，ＫＭ−９０，ＫＭ−９８，ＫＭ−６８−１Ｆ，ＫＳ−５０８，ＫＳ−５３０，ＫＳ−５３１，ＫＳ−５３７，ＫＳ−５３８，ＫＳ−６６，ＫＳ−６９，ＫＦ−９６，ＫＳ−６０４，ＫＳ−６７０２，ＦＡ−６３０，ＫＳ−６０２Ａ，ＫＳ−６０３，ＦＡ−６００，ＫＭ−８８Ｐ，ＫＭ−９１Ｐ，ＫＭ−６０１Ｓ（以上、信越シリコーン社製），ＳＨ２００，ＳＨ２０３，ＦＳ１２６５，ＳＨ５５００，ＳＣ５５４０，ＢＹ２８−５０３，ＳＨ７ＰＡ，ＳＨ５５１０，ＳＨ５５６１，ＳＨ５５０７，ＳＨ８７３０，ＳＭ５５１１，ＳＭ５５７１，ＳＭ５５１５，ＳＭ５５１２，ＤＣ２００，ＦＳ１２６５，ＤＣ７１，ＤＣ７４，ＤＢ−１００，Ｆ−１６，ＤＣ７５，１２６６，１２８３，ＤＫＱ１−１１８３，ＤＫＱ１−１０８６，ＤＫＱ１−０７１，８０，５４４，ＥＰＬ，０２５，１２２４，１２３３，ＤＫＱ１−１２４７，０１３Ａ，１２７７，ＣＥ，Ｃ−Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，ＡＦＥ，９２，９３，ＤＢ−１１０Ｎ，ＤＣ２−４２４８Ｓ（東レ・ダウコーニング社製）が挙げられる。また、前述した各種のポリアルキルシロキサンは単独、あるいは２種類以上混合して使用してもよい。

また本発明の測定試薬にシリコーン系消泡剤として、ジメチルポリシロキサンに反応基を導入した変性シリコーン、メチルポリシロキサンからなる疎水基とポリアルキレンオキサイドからなる親水基より構成され、界面活性剤様の構造を持つシリコーン界面活性剤、ならびにシリコーンレジンからなる群の中から、消泡作用を有するものを選択して含有させることもでき、これらの混合物は本発明のシリコーン系消泡剤に含まれる。

本発明のシリコーン系消泡剤として用いられるシリコーン製品の剤型（形状、性状からの分類）の例としては、オイル型、オイルコンパウンド型、溶液型、自己乳化型、エマルジョン型などが挙げられる。一般に、オイル型はシリコーンオイル単体で用いるものを指し、溶液型はシリコーンオイルを有機溶剤に希釈したものを指す。コンパウンド型はシリコーンオイルに微粉末シリカなどを配合したものを指し、エマルジョン型はシリコーンオイルを非イオン性界面活性剤などで乳化したものを指す。自己乳化型はシリコーンオイルの構造中にアルキレンオキシ基などを導入したものを指し、変性シリコーンオイルなどとも呼ばれるものを含む。粉末型はシリコーンオイルを吸油性の粉末に吸着させて粉体化したものである。これらのうち、自己乳化型およびエマルジョン型のシリコーン系消泡剤が本発明の測定試薬中に乳化して安定に分散しやすく好ましく使用することができる。なお、本明細書において「シリコーン」の語と「シリコーンオイル」の語は、特に断らない限り、慣用的に用いている。

本発明のシリコーン系消泡剤の組成を例示すると、ジメチルシリコーン、変性シリコーン、シリコーンオイル＋溶剤、シリコーンオイル＋シリカ、水溶性シリコーン／水溶性有機物、シリコーンコンパウンド・乳化剤・水などが挙げられる。

本発明の測定試薬においてシリコーン系消泡剤として用いられるシリコーン製品は、例えばモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社、東レ・ダウコーニングシリコーン株式会社、信越化学工業株式会社、ビックケミー・ジャパン株式会社などより市販されている（なお本明細書では、製造会社と販売会社を特に区別していない）、消泡作用を持つシリコーン製品の中から、測定試薬の主反応への影響や、試液の安定性を検証したうえで、最適なものを選択し適宜利用することができる。なお本発明におけるシリコーンはシリコンと称されることもある。

上記したシリコーン系消泡剤の市販品うち、ＧＥ東芝シリコーン社あるいはモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社より入手可能なＹＳＡ６４０６（自己乳化するオイルコンパウンド型シリコーン系消泡剤：アルキル変性シリコーンオイル、ポリエーテル変性シリコーン、シリカ、乳化剤ほかを含有する）やＴＳＡ７３４１（エマルジョン型消泡剤：ポリアルキルシロキサン、シリカほかを含有する）、ＴＳＡ７７５（エマルジョン型消泡剤：ポリアルキルポリシロキサン、ポリエーテル変性シリコーンオイル、シリカ、乳化剤ほかを含有する）を好適な例として挙げることができる。

上記シリコーン製品は、多くの場合、工業用や食品添加用といったように、用途によって分類されているものの、臨床検査試薬用というカテゴリーは存在せず適用のための指標も存在しない。そこで本発明では、まず適用したい測定試薬において各種シリコーン系消泡剤添加時の測定感度の変動を確認し、影響が小さい成分を選択することが望ましい。

本発明の測定試薬に含まれるシリコーン系消泡剤の量は、抗原−抗体反応などの主反応に強い影響を及ぼさず、また試液の安定性に影響を与えないことを限度として制限はない。シリコーン系消泡剤の添加濃度に関しては、消泡効果などを指標としながら実験的に好適な量を決めることができる。消泡効果は、例えば、該試液を激しく振とうしたときに液面や器壁に持続性の気泡を生じないことや、該試液と起泡性溶液とを混和すると気泡の発生が抑制されるようになることなどを指標として容易に確認できる。シリコーン系消泡剤の一般的な含量としては０．０００１〜０．１％が適当であり、望ましくは０．００１％〜０．０１％である。

（凝集測定試薬）
本発明の測定試薬において、不溶性担体に、測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質を担持させた場合を特に凝集測定試薬という。本発明の凝集測定試薬において、不溶性担体粒子に担持される物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低および天然、合成といった由来に特に制限はないが、測定対象物質の濃度に比例して凝集が増大するいわゆる凝集法においては、測定対象物質に対する高親和性物質としてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組み換え型抗体および各抗体の機能性断片を含む）や、天然型および組み換え型抗原の利用が一般的であり、測定対象物質の濃度に比例して凝集が減少する凝集阻止法においては、測定対象物質およびその類縁体ならびにそれらの断片の利用が一般的である。各物質の担持の方法については物理吸着、化学結合、親和性による結合などいずれも利用することができる。なお、本明細書において、前記した「測定対象物質およびその類縁体ならびにそれらの断片」を総称して「測定対象物質様物質」ということがある。

（不溶性担体粒子）
本発明の測定試薬において、不溶性担体粒子として用いられる素材は、検査試薬の成分として利用可能な物質であれば特に制限はないが、具体的にはラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボンなどが挙げられる。不溶性担体粒子のサイズは、本発明の粒子凝集測定法及び試薬の検出原理に応じて０．０５〜１μｍまで適宜選択できるが、自動分析装置における光学的測定においては平均粒子径０．１〜０．４μｍが汎用されており、好ましくは０．１〜０．２μｍである。不溶性担体粒子の平均粒子径は粒度分布計や透過型電子顕微鏡像などで確認することができる。

（ホモジーニアス測定法のその他の試薬成分）
本発明のホモジーニアス測定試薬は、反応の主成分の他に、試料のｐＨ、イオン強度、浸透圧などを緩衝する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液やそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩など、あるいはＮａＣｌ、ＫＣｌなどの無機塩を含んでいてもよい。また不溶性担体粒子の凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでもよい。また、凝集の形成をコントロールする成分として、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組み合わせて含んでもよい。本発明の測定試薬においては、起泡性を有する成分に関しても問題なく適用することができる。なお、上記のいずれかの場合であっても本発明の測定試薬を構成する各試薬中に添加されているタンパク質の濃度は２ｗ／ｖ％未満であり、自動分析装置による測定時（検体と試液の総液量中）における終濃度は１ｗ／ｖ％未満である。
上記タンパク質の濃度に関する記載は、反応の主成分以外の成分に関する記載であり、不溶性担体粒子に担持されているタンパク質（測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質）及びブロッキングのために被覆されているタンパク質は、上記濃度には含まれない。

（測定試料および測定対象）
本発明の凝集測定試薬は種々の生物由来試料を測定試料とすることができ特に限定されない。例えば、血液、血清、血漿、尿などの体液を好適な例としてあげることができる。測定対象としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。

（測定試薬の構成および使用方法）
本発明の自動分析装置用測定試薬は、一または二以上の構成試薬により構成される。そのうち一の構成試薬は前述した不溶性担体粒子を含み、当該構成試薬と同一の構成試薬または異なる構成試薬はシリコーン系消泡剤を含む。ここでシリコーン系消泡剤は全ての構成試薬に含まれていてもよいし、測定時の混液状態で消泡効果を発揮できれば、構成試薬のいずれかに選択的に含まれてもよい。構成試液の一部に選択的にシリコーン系消泡剤が含まれる場合には、シリコーン系消泡剤を含む構成試液とその他の構成試液を検体測定時と同一の液量比で混和した後、該混液を激しく振とうし、液面や器壁に持続性の気泡を生じないことを指標として、その消泡効果を容易に確認できる。また上記したように本発明測定試薬を構成する各構成試薬中のタンパク質濃度は２ｗ／ｖ％未満であり、自動分析装置による測定時（検体と試液の総液量中）における終濃度は１ｗ／ｖ％未満になるよう設計されている。

（測定試薬の使用方法）
本発明の測定試薬が第１試薬および第２試薬の二つの構成試薬から成り、不溶性担体がいずれか一方の試薬に含有されている場合、測定に使用する際の第１試薬と第２試薬の液量比は、４：１〜１：１が好ましい。自動分析装置により分取される検体および試液の総液量は、３００μＬ未満であり、不溶性担体粒子を含有する試液量が総液量の２０ｖ／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下である。ここで測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質を担持させた不溶性担体粒子の自動分析装置による測定時（検体と試液の総液量中）の濃度は、０．０５〜０．３ｗ／ｖ％である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１〕マトリクス効果の低減
本発明によるマトリクス効果の低減を確認した。
（１）試薬：ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス（積水メディカル社製）
（１−１）第１試薬
（i）対照試薬１
ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス 緩衝液第１液
（ii）本発明試薬１
対照試薬１に、シリコーン系消泡剤ＹＳＡ６４０６（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製）を最終濃度０．００１％となるように添加し本発明試薬１とした。
（１−２）第２試薬
ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス ラテックス試液第２液
なお、本第２試薬中のタンパク質濃度は、０．３ｗ／ｖ％程度であった。
（１−３）キャリブレーター
ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス キャリブレーター
（２）自動分析装置：ＴＢＡ１２０ＦＲ（東芝メディカルシステムズ社製）
パラメータ条件
（i）液量：検体−第１試薬（対照試薬１または本発明試薬１）−第２試薬
条件Ａ：３μＬ−２１０μＬ−７０μＬ、
条件Ｂ：２．５μＬ−１７５μＬ−５８μＬ、
条件Ｃ：２μＬ−１４０μＬ−４７μＬ
（ii）分析法：レート法（測光ポイント１９−２８）
（iii）測定波長：６０４ｎｍ
（iv）キャリブレーション：スプライン
（３）測定試料
血清検体：ＣＲＰ濃度０．５ｍｇ／ｄＬ
模擬検体：ＣＲＰ濃度０．５ｍｇ／ｄＬ、０．１％ＢＳＡを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、血清成分を含まない。
（４）測定方法
２種類の第一試薬（対照試薬１、本発明試薬１）を使用し、検体および試薬の量比を固定して反応時の総液量のみを変動させた３種のパラメータ（条件Ａ〜Ｃ）で２種類の検体（血清検体、模擬検体）をそれぞれ５回連続測定して平均値および変動係数を算出し、正確性と再現性を確認した。

表１に測定結果を示した。対照試薬１における２種の検体の測定精度を比較すると、条件Ａ〜Ｃのいずれにおいても血清検体と模擬検体の測定再現性に差が見られ、血清成分を含まない模擬検体の再現性は変動係数５％前後と著しく不良であった。また血清検体の測定再現性は条件Ａ〜Ｃのいずれにおいても良好であったが、総液量を減量させた条件Ｃにおいて模擬検体と比較すると、測定値が１０％以上低下しており正確性の不良が認められた。以上の結果より、対照試薬１の測定精度は、検体由来のマトリクス成分により大きな影響を受けているものと考えられた。一方、本発明試薬１における２種の検体の測定精度を比較すると、条件Ａ〜Ｃのいずれにおいても、検体種を問わず、測定値の正確性、再現性はほぼ同等であって対照試薬１で見られた血清検体と模擬検体（血清成分を含まない）の測定値の差は縮小していた。特に、条件Ｃにおける血清検体と模擬検体の測定値の差は３％となり、本発明試薬１による差の縮小は顕著であった。以上より、対照試薬１においては、検体中の成分によって反応の再現性が異なっているのみならず、総液量の条件によっては測定値自体が変化してしまい、マトリクスの影響が大であるのに対し、本発明試薬１においては試料の成分にかかわらず同等の性能が維持されていることが確認された。

〔実施例２〕総液量変動による影響の低減
本発明によるマトリクス効果の改善を確認した。
（１）試薬および自動分析装置
測定試料として、血清検体ＡおよびＢを使用する以外は、実施例１に記載の第１試薬（（i）対照試薬１、（ii）本発明試薬１）、第２試薬、キャリブレーター、自動分析装置、パラメータ条件を使用した。
なお、パラメータ条件のうち、液量のみ再掲する。
（i）液量：検体−第１試薬（対照試薬１または本発明試薬１）−第２試薬
条件Ａ：３μＬ−２１０μＬ−７０μＬ（総液量：２８３μＬ）、
条件Ｂ：２．５μＬ−１７５μＬ−５８μＬ（総液量：２３５．５μＬ）、
条件Ｃ：２μＬ−１４０μＬ−４７μＬ（総液量：１８９μＬ）
（２）測定方法
２種類の第一試薬（対照試薬１、本発明試薬１）を使用し、検体および試薬の量比を固定して反応時の総液量のみを変動させた３種のパラメータ（条件Ａ〜Ｃ）で血清検体ＡおよびＢをそれぞれ５回連続測定した。

図１に測定結果を示した。対照試薬１においては、２種の検体とも総液量の減量にともない測定値が変動（本実施例では低下）しており、対照試薬１は、総液量の影響を受けているものと考えられた。一方、本発明試薬１においては、条件Ａ〜Ｃのいずれにおいても血清検体ＡおよびＢの測定値はほぼ一定であった。以上より、対照試薬1は正確な測定値を算出するのにあるレベル以上の総液量を要するのに対し、本発明試薬１は、総液量の条件によらず正確な測定値を示すことが確認された。

〔実施例３〕自動分析装置の攪拌装置による影響の低減（１）
ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス（積水メディカル社製）を用い、９０００シリーズ日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製。反応槽中の反応液を超音波により振動させて、反応液を混和する方式の撹拌・混和機能を搭載。）における測定で、本発明による精度向上を確認した。
（１）試薬：ＳＳタイプ ピュアオート（登録商標）Ｓ ＣＲＰラテックス
（１−１）第１試薬
（i）対照試薬１
実施例１に記載の対照試薬１
（ii）本発明試薬
対照試薬１に、シリコーン系消泡剤ＹＳＡ６４０６またはＴＳＡ７３４１（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製）をそれぞれ、最終濃度０．００１％となるように添加し、それぞれ本発明試薬1、２とした。
（１−２）第２試薬
実施例１に記載の第２試薬
（１−３）キャリブレーター
実施例１に記載のキャリブレーター
（２）自動分析装置：日立自動分析装置９０００
超音波による振動を利用した非接触方式により、反応槽中の混液攪拌をおこなう。
パラメータ条件
（i）液量：検体−第1試薬−第２試薬：３μＬ−１５０μＬ−５０μＬ
（ii）分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント３８−７０）
（iii）測定波長：主波長５７０ｎｍ／副波長８００ｎｍ
（iv）キャリブレーション：スプライン
（３）測定試料
血清検体１、２
（４）測定方法
第１試薬に対照試薬１、本発明試薬１または２を用い、９０００シリーズ日立自動分析装置で検体５回連続測定時の同時再現性を比較した。

表２に示すように血清検体１、２の測定再現性は、対照試薬における変動係数（％）３．９０、１．４３に対して、本発明試薬１ではそれぞれ１．７３、０．６８、本発明試薬２ではそれぞれ２．５２、０．５４と、いずれにおいても再現性の向上が認められた。

〔実施例４〕自動分析装置の攪拌装置による影響の低減（２）
実施例３記載の本発明試薬１および２を用い、自動分析装置コアプレスタ２０００（積水メディカル社製。検体、試薬を分注するプローブからの溶液吐出力を利用し、反応液を混和する方式および反応槽自体を振とうして反応液を混和する方式の撹拌・混和機能を搭載。）の測定における精度向上を確認した。
（１）試薬：実施例1に同じ。
（２）自動分析装置：コアプレスタ２０００
反応槽を直接振とうして混液攪拌をおこなうモードを利用した。
パラメータ条件
（i）液量：検体−第1試薬−第２試薬：３μＬ−１５０μＬ−５０μＬ
（ii）分析法：エンド法（測光ポイント４−３３）
（iii）測定波長：５７０ｎｍ
（iv）キャリブレーション：スプライン
（３）測定試料：実施例３に同じ。
（４）測定方法
本発明試薬１および２と対照試薬を用い、コアプレスタ２０００で検体５回連続測定時の同時再現性を比較した。

表３に示すように血清検体１、２の測定再現性は、対照試薬における変動係数（％）１．４７、１．１９に対して、本発明試薬１ではそれぞれ０．９２、０．８４、本発明試薬２ではそれぞれ０．６７、１．１７と、いずれも再現性の向上が認められた。
本結果より、攪拌・混和の仕様が異なる自動分析装置においても、本発明の試薬による測定精度の向上が確認された。

以上の結果よりシリコーン系消泡剤を含有する本発明の測定試薬は、非接触型の攪拌機構を採用した自動分析装置において、従来の測定試薬よりも再現性や正確性といった測定精度が向上していることが確認された。

本発明により、検体由来のマトリクス効果を受けることなく、また、自動分析装置の仕様に関わらず高精度に測定が可能な、不溶性担体粒子を用いたホモジーニアス測定法に基づく自動分析装置用の凝集測定試薬を提供することが可能になった。

Claims (13)

1. 不溶性担体粒子を用いる自動分析装置用ホモジーニアス測定法に基づく免疫凝集測定試薬であって、前記不溶性担体粒子が、測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質を担持させた不溶性担体粒子であり、構成試薬中にシリコーン系消泡剤を含有することを特徴とする前記測定試薬。
   ただし、該構成試薬中のタンパク質濃度は２ｗ／ｖ％未満であり、自動分析装置により分取される検体および試薬液の総液量が３００μＬ未満かつ不溶性担体粒子を含有する試薬液量が総液量の２０ｖ／ｖ％以上５０ｖ／ｖ％以下の場合に用いられるものである。
2. シリコーン系消泡剤が、オイル型、オイルコンパウンド型、溶液型、自己乳化型、エマルジョン型およびそれらの混合物からなる群より選択される請求項１に記載の測定試薬。
3. 構成試薬中のシリコーン系消泡剤の濃度が０．０００１〜０．１％である請求項１又は２に記載の測定試薬。
4. 自動分析装置が攪拌及び／又は混和機能を有し、当該機能の仕様が、直接型または非接触型である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の測定試薬。
5. 不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ及びカーボンからなる群から選ばれる1以上である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の測定試薬。
6. 直接型の撹拌及び／又は混和機能の仕様が、
   プローブを反応液中で回転させて攪拌し反応液を混和する方式、又は、ピエゾ素子振動プローブが発生する振動を利用して反応液を混和する方式であり、
   非接触型の撹拌及び／又は混和機能の仕様が、
   反応槽中の反応液を超音波により振動させて反応液を混和する方式、検体や試薬を分注するプローブからの溶液吐出力を利用し反応液を混和する方式、又は、反応槽自体を振とうして反応液を混和する方式である、
   請求項４に記載の測定試薬。
7. 自動分析装置が、日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、東芝メディカルシステムズ社製のＴＢＡ１２０ＦＲ、日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ９０００又は積水メディカル社製のＣＰ２０００である請求項１〜６のいずれかに記載の測定試薬。
8. 自動分析装置を使用したホモジーニアス測定法に基づく免疫凝集測定法であって、以下の工程を含む前記測定法：
   （1）測定対象物質を含む検体及び試薬を分取する工程、
   ここで、該試薬は1又は複数の構成試薬を含み、該構成試薬の少なくとも一つが不溶性担体粒子を含み、かつ、構成試薬中のタンパク質濃度が２ｗ/ｖ％未満であり、前記不溶性担体粒子が、測定対象物質に対する高親和性物質あるいは測定対象物質様物質を担持させた不溶性担体粒子であり、該構成試薬の少なくとも１つがシリコーン系消泡剤を含む；
   （2）検体及び試薬の総液量が３００μＬ未満、かつ、不溶性担体粒子を含有する試薬液量が総液量の２０ｖ/ｖ％以上５０ｖ/ｖ％以下となるように混和する工程；および
   （3）該測定対象物質を検出する工程。
9. シリコーン系消泡剤が、オイル型、オイルコンパウンド型、溶液型、自己乳化型、エマルジョン型およびそれらの混合物からなる群より選択される請求項８に記載の測定法。
10. 自動分析装置が攪拌及び／又は混和機能を有し、当該機能の仕様が、直接型または非接触型である請求項８または９に記載の測定法。
11. 不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ及びカーボンからなる群から選ばれる1以上である、請求項８〜１０のいずれかに記載の測定法。
12. 直接型の撹拌及び／又は混和機能の仕様が、
    プローブを反応液中で回転させて攪拌し反応液を混和する方式、又は、ピエゾ素子振動プローブが発生する振動を利用して反応液を混和する方式であり、
    非接触型の撹拌及び／又は混和機能の仕様が、
    反応槽中の反応液を超音波により振動させて反応液を混和する方式、検体や試薬を分注するプローブからの溶液吐出力を利用し反応液を混和する方式、又は、反応槽自体を振とうして反応液を混和する方式である、
    請求項１０に記載の測定法。
13. 自動分析装置が、日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、東芝メディカルシステムズ社製のＴＢＡ１２０ＦＲ、日立ハイテクノロジーズ社製のＨＩＴＡＣＨＩ９０００又は積水メディカル社製のＣＰ２０００である請求項８〜１２に記載の測定法。

Images