TW202033547A - 異二聚體fc融合蛋白 - Google Patents

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尚 瑪利 奇里拉特
埃斯雅 葛林柏格
艾娃 古鐵雷斯
威廉 哈尼
尼可萊 維格曼
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美商蜻蜓醫療公司
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Abstract

本發明提供Fc融合蛋白構築體，其作為單價二聚體相較於原生/天然分子具有較高血清半衰期，且因此有利於達成蛋白質在生產期間之較高效價、在儲存期間之較高穩定性及用作治療劑時之改良功效。亦提供在Fc區具有降低效應功能之突變的Fc融合蛋白構築體，其對抑制腫瘤生長之活性增加且因此有利於用作癌症療法。

Description

異二聚體FC融合蛋白
本發明大體上係關於異二聚體Fc融合蛋白及包含此類蛋白質之醫藥組合物，以及用於治療人類患者之疾病或病症的方法。
生理學活性蛋白大多具有活體內半衰期短之缺點。為了克服此缺點，已嘗試使其結合至PEG (聚乙二醇)或其類似者，或使其與抗體Fc (可結晶片段)區融合。由兩個或更多個不同次單元(其中該兩個或更多個不同次單元形成蛋白複合物以展現生理學活性)構成之蛋白質可與野生型Fc域融合以製備Fc融合蛋白形式，從而由於Fc之均二聚性質而形成均二聚體。由兩個或更多個不同次單元(其中該兩個或更多個不同次單元形成蛋白複合物以展現生理學活性)構成之蛋白質亦可與不僅源自IgG1而且源自其他同型抗體(諸如IgG2、IgG3及IgG4)之異二聚體Fc區融合，以形成異二聚體Fc融合蛋白。因此，由兩個或更多個不同次單元構成且其中兩個或更多個次單元藉由形成蛋白複合物展現生理學活性的蛋白質之一或多個次單元可與異二聚體Fc變異區之末端融合，以形成改良Fc融合蛋白形式。
Fc異二聚化為如下技術，其藉由基因工程改造誘導Fc之兩個不同CH3域中之突變，使得兩個Fc片段形成在具有完全類似於天然存在之抗體之結構的三級結構時具有最小序列變化的異二聚體(參見例如美國專利第7,695,936號)。
本發明中所描述之發明提供藉由在Fc之CH2及CH3域中引入不同長度之連接子及突變來改良Fc融合蛋白形式之設計，其中異二聚體蛋白之兩個次單元連接到具有不同異二聚化域之兩個Fc域。
本發明大體上係關於異二聚體Fc融合蛋白及包含此類蛋白質之醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，該第一多肽包含第一抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第一次單元；及第二多肽，該第二多肽包含第二抗體Fc域多肽及該多重次單元蛋白之第二不同次單元，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低該Fc之效應功能的突變，且其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
在一些實施例中，該效應功能包含Fc域多肽誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類抗體Fc域多肽。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE Fc域多肽(例如人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE Fc域多肽)。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置233、234、235、236、237、297、318、320、322及/或329處的突變。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白經岩藻糖基化。
在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG1 Fc域多肽。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置234、235、237、329、330及/或331處的突變。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L234A、L235A、L235E、G237A、P329A、A330S及P331S之突變。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A及L235A。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235A及P329A。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變C220S。
在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG4 Fc域多肽。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置235及/或329處的突變。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L235E及P329A之突變。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E及P329A。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變S228P。
在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含含有第一抗體Fc域多肽之第一多肽及含有第二不同抗體Fc域多肽之第二多肽，其中該第一多肽進一步包含多重次單元蛋白之次單元，其中該蛋白質序列係藉由包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)之連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，其中X表示L或E；該多重次單元蛋白之額外次單元與第二不同抗體Fc域多肽融合，且該多重次單元蛋白之該等次單元彼此結合，該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽各自含有促進異二聚化之不同突變，且該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽彼此結合。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含含有第一抗體Fc域多肽之第一多肽及含有第二不同抗體Fc域多肽之第二多肽，其中該第一多肽進一步包含多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列，其中該蛋白質序列係藉由連接子與該第一抗體Fc域多肽融合；且該第二多肽進一步包含多重次單元蛋白之額外次單元之蛋白質序列，其中該蛋白質序列係藉由連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。將多重次單元蛋白之額外次單元之蛋白質序列連接至該第二不同抗體Fc域多肽的該連接子可包括G4S、(G4S)2 或(G4S)3 。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，使該蛋白質序列與該第一抗體Fc域多肽融合的該連接子由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)組成。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，使該蛋白質序列與該第一抗體Fc域多肽融合之該連接子由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG(SEQ ID NO: 4)組成。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽；及第二多肽，其包含第二不同抗體Fc域多肽，其中該第一多肽進一步包含多重次單元蛋白之蛋白質序列，其中該蛋白質序列係藉由包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)之連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G；且該多重次單元蛋白之額外次單元與該第二不同抗體Fc域多肽融合，且該多重次單元蛋白之該等次單元彼此結合，且其中當X1 表示L及/或X2 表示L時，該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽中之至少一者包含促進異二聚化之Q347R突變，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽彼此結合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSS DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)。在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，使該蛋白質序列與該第一抗體Fc域多肽融合之該連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSS DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)組成。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)。在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)組成。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將該蛋白質序列連接至該第一抗體Fc域多肽之該連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)。在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，使該蛋白質序列與該第一抗體Fc域多肽融合之該連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)組成。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67 )或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之該額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)組成之連接子與該第二不同抗體Fc域多肽融合。
本文所描述之一些異二聚體Fc融合蛋白包括各自經突變以彼此促進異二聚化的第一IgG4抗體Fc域多肽及第二不同IgG4抗體Fc域多肽。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽包括一或多個選自K370E及R409W之突變，且該第二不同IgG4抗體Fc域多肽包括一或多個選自E357N、D399V及F405T之突變。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽包括一或多個選自E357N、D399V及F405T之突變，且該第二不同IgG4抗體Fc域多肽包括一或多個選自K370E及R409W之突變。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽包括突變K370E及R409W，且該第二不同IgG4抗體Fc域多肽包括突變E357N、D399V及F405T。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽包括突變E357N、D399V及F405T，且該第二不同IgG4抗體Fc域多肽包括突變K370E及R409W。在一些實施例中，該第一IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及R409W之突變，且該第二不同IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變。在一些實施例中，該第一IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變，且該第二不同IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及R409W之突變。在一些實施例中，該第一IgG4 Fc域多肽包括突變K360E及R409W，且該第二不同IgG4 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T。在一些實施例中，該第一IgG4 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T，且該第二不同IgG4 Fc域多肽包括突變K360E及R409W。
本文揭示之一些異二聚體Fc融合蛋白包括各自經突變以彼此促進異二聚化的第一IgG1抗體Fc域多肽及該第二不同IgG1抗體Fc域多肽。在一些實施例中，該第一IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及K409W之突變，且該第二不同IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變。在一些實施例中，該第一IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變，且該第二不同IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及K409W之突變。在一些實施例中，該第一IgG1抗體Fc域多肽包括突變K360E及K409W，且該第二不同IgG1抗體Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T。在一些實施例中，該第一IgG1抗體Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T，且該第二不同IgG1抗體Fc域多肽包括突變K360E及K409W。
在一些實施例中，本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白包含進一步突變以降低效應功能之IgG4或IgG1 Fc域多肽。在一些實施例中，該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽各自含有突變P329G或P329A。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽及該第二不同IgG4抗體Fc域多肽各自含有突變P329G或P329A。在一些實施例中，該第一IgG1抗體Fc域多肽及該第二不同IgG1抗體Fc域多肽各自含有突變P329G或P329A。在一些實施例中，該第一IgG4抗體Fc域多肽及該第二不同IgG4抗體Fc域多肽各自含有突變P329A。在一些實施例中，該第一IgG1抗體Fc域多肽及該第二不同IgG1抗體Fc域多肽各自含有突變P329A。
在一些實施例中，本文所描述之異二聚體Fc基融合物併有各自含有選自A330S及P331S之突變的第一IgG1抗體Fc域多肽及第二不同IgG1抗體Fc域多肽。在一些實施例中，本文所描述之異二聚體Fc基融合物併有各自含有突變A330S及P331S的第一IgG1抗體Fc域多肽及第二不同IgG1抗體Fc域多肽。
在一些實施例中，本文所描述之異二聚體Fc基蛋白併有進一步突變以引入鏈間二硫橋鍵的IgG4或IgG1 Fc域多肽。在一些實施例中，該第一IgG4或IgG1 Fc域多肽包括突變Y349C，且該第二不同IgG4或IgG1 Fc域多肽包括突變S354C。在一些實施例中，該第一IgG4或IgG1 Fc域多肽包括突變S354C，且該第二不同IgG4或IgG1 Fc域多肽包括突變Y349C。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之該次單元與該多重次單元蛋白之額外次單元之間的原生S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括IL-12之p35次單元與p40次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之C74與p40之C177之間的原生S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之該次單元與該多重次單元蛋白之額外次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括IL-12之p35次單元與p40次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之V185C與p40之Y292C之間的人工或經工程改造S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之該次單元與該多重次單元蛋白之額外次單元之間的原生S-S橋鍵，及多重次單元蛋白之該次單元與該多重次單元蛋白之額外次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括：IL-12之p35次單元與IL-12之p40次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵，及IL-12之p35次單元與IL-12之p40次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之C74與p40之C177之間的原生S-S橋鍵，及p35之V185C與p40之Y292C之間的人工或經工程改造S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白經工程改造以移除原生S-S橋鍵，且隨後經非原生人工或經工程改造S-S橋鍵取代。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括：IL-12之p35，其中該原生C74突變成絲胺酸；及IL-12之p40，其中該原生C177突變成絲胺酸，從而移除IL-12之p35次單元與p40次單元之間的原生S-S橋鍵。將兩個新突變引入至此突變IL-12，亦即p35上之V185C及p40上之Y292C，從而引入非原生人工或經工程改造S-S鍵。
在本發明之異二聚體Fc融合蛋白內，第一多肽及第二不同多肽分別包含多重次單元細胞介素之第一次單元及第二不同次單元。在本發明之異二聚體Fc融合蛋白內，第一多肽及第二不同多肽分別包含多重次單元細胞介素之第二不同次單元及第一次單元。在一例示性實施例中，該細胞介素為IL-12 (例如人類IL-12)。亦提供含有本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白中之任一者的調配物、含有一或多個表現異二聚體Fc融合蛋白之核酸的細胞及使用異二聚體Fc融合蛋白促進腫瘤細胞死亡之方法。在一些實施例中，本發明提供一種調配物，其包括本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含至少一個抗體可變域(例如抗體重鏈可變域)。在某些實施例中，該至少一個抗體重鏈可變域結合於抗體輕鏈可變區以形成Fab，且該Fab之重鏈可變域或輕鏈可變域於第一抗體Fc域多肽及/或第二不同抗體Fc域多肽之N端處融合。
在某些實施例中，本發明之包含至少一個抗體可變域的該異二聚體Fc融合蛋白具有多重次單元蛋白之次單元及多重次單元蛋白之額外次單元之蛋白質序列，該等次單元分別連接到第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽之C端。
在某些實施例中，本發明之包含至少一個抗體可變域的該異二聚體Fc融合蛋白具有多重次單元蛋白之次單元及該多重次單元蛋白之額外次單元之蛋白質序列，該等次單元分別連接到第二不同抗體Fc域多肽及第一抗體Fc域多肽之C端。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含位於該第一多肽之該第一抗體Fc域多肽之該C端的抗體重鏈可變域。在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含位於該第二多肽之該第二不同抗體Fc域多肽之C端的抗體重鏈可變域。在某些實施例中，該抗體重鏈可變區結合於抗體輕鏈可變區以形成scFv。在某些實施例中，多重次單元蛋白之次單元及多重次單元蛋白之額外次單元的該蛋白質序列分別連接到該第一抗體Fc域多肽及該第二不同抗體Fc域多肽之該N端。在某些實施例中，多重次單元蛋白之次單元及該多重次單元蛋白之額外次單元之該蛋白質序列分別連接到該第二不同抗體Fc域多肽及該第一抗體Fc域多肽之該N端。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白不包含抗體可變域。舉例而言，在一些實施例中，該異二聚體Fc融合蛋白由多重次單元蛋白(例如IL-12蛋白)之次單元之蛋白質序列、視情況包含間隔肽之連接子及第一抗體Fc域多肽，以及多重次單元蛋白(例如IL-12蛋白)之額外次單元之蛋白質序列、視情況包含間隔肽之連接子及第二抗體Fc域多肽組成或基本上由以上各者組成。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含蛋白聚糖結合域。在一些實施例中，該蛋白聚糖結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中之蛋白聚糖。在一些實施例中，該蛋白聚糖結合域結合一或多種選自以下之蛋白聚糖：多配體蛋白聚糖(syndecan)、絲甘蛋白聚糖(serglycin)、CSPG4、β蛋白聚糖(betaglycan)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)、珍珠素(perlecan)、多功能蛋白聚糖(versican)、短蛋白聚糖(brevican)及富含白胺酸之小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan；SLRP)。在一些實施例中，該等SLRP係選自核心蛋白聚糖(decorin)、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)、無孢蛋白聚糖(asporin)、纖調蛋白聚糖(fibrodulin)及基膜聚糖(lumican)。在一些實施例中，該蛋白聚糖結合域係連接至該第一抗體Fc域多肽之該C端。在一些實施例中，該蛋白聚糖結合域係連接至該第二抗體Fc域多肽之該C端。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含膠原蛋白結合域。在一些實施例中，該膠原蛋白結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中之膠原蛋白。在一些實施例中，該膠原蛋白結合域係連接至該第一抗體Fc域多肽之該C端。在一些實施例中，該膠原蛋白結合域係連接至該第二抗體Fc域多肽之該C端。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含玻尿酸結合域。在一些實施例中，該玻尿酸結合域係連接至該第一抗體Fc域多肽之該C端。在一些實施例中，該玻尿酸結合域係連接至該第二抗體Fc域多肽之該C端。
本發明之另一態樣提供一種治療患者之癌症的方法。該方法包含向患者(例如有需要之患者)投與有效量之本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白或本文所描述之包括有效量之多重特異性結合蛋白的調配物。舉例而言，在一些實施例中，該治療癌症之方法包括向患者(例如需要治療之患者)投與包括有效量之本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的調配物。
在某些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含向患者僅投與單一劑量之異二聚體IL12-Fc融合蛋白。在某些實施例中，該單一劑量係足以誘導對該癌症之完全反應的量。在某些實施例中，該單一劑量係足以延遲或阻止該癌症復發之量。
在某些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含向患者僅投與單一劑量之異二聚體IL12-Fc融合蛋白或包含該異二聚體IL12-Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的調配物，該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。在某些實施例中，異二聚體IL12-Fc融合蛋白或包含該異二聚體IL12-Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的調配物之單一劑量係足以誘導對該癌症之完全反應的量，該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。在某些實施例中，該單一劑量係足以延遲或阻止該癌症復發之量。
本發明之另一態樣提供一種治療急性輻射症候群之方法，其中該方法包含向患者投與本文所揭示之異二聚體Fc融合蛋白或調配物。在一些實施例中，該急性輻射症候群包含一或多個選自以下之症候群：造血性輻射症候群、胃腸性輻射症候群、神經血管性輻射症候群及皮膚輻射症候群。在一些實施例中，該急性輻射症候群包含選自由以下組成之群的症候群：造血性輻射症候群、胃腸性輻射症候群、神經血管性輻射症候群及皮膚輻射症候群。
總而言之，本發明提供多重次單元蛋白之異二聚體Fc融合蛋白構築體。此等融合蛋白構築體相較於原生/天然多重次單元蛋白可帶來較高血清半衰期，改良蛋白質在生產期間之產率，增強儲存期間之穩定性及/或改良用作治療劑時之功效。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年10月23日申請之美國臨時專利申請案第62/749,489號；2018年12月19日申請之美國臨時專利申請案第62/781,898號；2019年1月4日申請之美國臨時專利申請案第62/788,499號；2019年4月1日申請之美國臨時專利申請案第62/827,347號；及2019年9月4日申請之美國臨時專利申請案第62/895,889號之利益及優先權，該等申請案之揭示內容出於所有目的全文以引用之方式併入本文中。 序列清單
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用的方式併入本文中。2019年10月22日創建之該ASCII複本命名為DFY-063WO_SL.txt且大小為947,581個位元組。
本發明提供對異二聚體Fc融合蛋白、包含此類蛋白質之醫藥組合物及使用此類蛋白質及醫藥組合物之治療方法(包括用於治療癌症之方法)的改良。
為促進對本發明之理解，下文定義多個術語及片語。
除非上下文不適當，否則如本文所用之術語「一(a及an)」意謂「一或多個」且包括複數個。
如本文所用，術語「個體」及「患者」係指藉由本文所描述之方法及組合物治療的生物體。此類生物體較佳包括(但不限於)哺乳動物(例如鼠類、猿猴、馬類、牛類、豬類、犬類、貓類及其類似物)，且最佳包括人類。
如本文所用，術語「有效量」係指化合物(例如本發明化合物)足以實現有益或所需結果(例如所需預防治療作用)之量。有效量可以一或多次投與、施藥或給藥來投與且意欲限於特定調配物或投與途徑。如本文所用，術語「治療」包括引起病況、疾病、病症及其類似者改善或其症狀減緩的任何作用，例如減輕、減少、調節、減緩或消除。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，此組合使得該組合物特別適合於活體內或離體診斷或治療用途。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指任一種標準醫藥學載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如諸如油/水或水/油乳液)，及各種類型的潤濕劑。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見例如Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之任何醫藥學上可接受之鹽(例如酸或鹼)，其在向個體投與時能夠得到本發明化合物或其活性代謝物或殘餘物。如熟習此項技術者所知，本發明化合物之「鹽」可衍生自無機酸及鹼或有機酸及鹼。例示性酸包括(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、甲苯對磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸及其類似物。諸如草酸之其他酸儘管本身為醫藥學上不可接受的，但可用於製備適用作中間物的鹽以獲得本發明化合物及其醫藥學上可接受之酸加成鹽。
例示性鹼包括(但不限於)鹼金屬(例如鈉)氫氧化物、鹼土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨及式NW4 + 化合物，其中W為C1-4 烷基，及其類似物。
例示性鹽包括(但不限於)：乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、氟庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽及其類似物。鹽之其他實例包括本發明化合物之陰離子與適合陽離子(諸如Na+ 、NH4 + 及NW4 + (其中W為C1-4 烷基))之化合物，及其類似物。
對於治療用途而言，預期本發明化合物之鹽為醫藥學上可接受的。然而，醫藥學上不可接受之酸及鹼之鹽亦可用於例如醫藥學上可接受之化合物之製備或純化。
在通篇說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外預期存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成的本發明之組合物，且存在基本上由所列處理步驟組成或由所列處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。
一般而言，除非另有規定，否則指定百分比之組合物以重量計。此外，若變數未附定義，則隨後以該變數之先前定義為準。 I.   蛋白質
本發明提供包含多重次單元蛋白之胺基酸序列的Fc融合蛋白構築體。此等融合蛋白構築體相較於原生/天然多重次單元蛋白可帶來較高血清半衰期，改良蛋白質在生產期間之產率，增強儲存期間之穩定性及/或改良用作治療劑時之功效。 IgG4 Fc 融合蛋白
在一個態樣中，本發明提供對多重次單元蛋白之改良。在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體IgG4 Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，該第一多肽包含第一抗體IgG4 Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含第二不同抗體IgG4 Fc域多肽，其中該第一多肽進一步包含多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列，其中蛋白質序列藉由包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)之連接子與第一抗體IgG4 Fc域多肽融合，其中X表示L或E；且多重次單元蛋白之額外次單元與第二不同抗體IgG4 Fc域多肽融合，且多重次單元蛋白之次單元彼此結合，第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體IgG4 Fc域多肽各自含有促進異二聚化之不同突變，且第一抗體IgG4 Fc域多肽及第二不同抗體IgG4 Fc域多肽彼此結合。
在一些實施例中，在異二聚體IgG4 Fc融合蛋白內，將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)組成，其中X表示L或E。
在某些實施例中，將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子進一步包含間隔肽。在某些實施例中，連接子包含序列SEQ ID NO: 1及間隔肽。
在某些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合，該連接子包含序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)及間隔肽，其中X表示L或E。在某些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合，其中X表示L或E。在某些實施例中，將多重次單元蛋白之額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽的連接子之胺基酸序列與將多重次單元蛋白之第一次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽的連接子之胺基酸序列一致。
可採用以標題「間隔肽」描述之任何間隔肽。舉例而言，在某些實施例中，間隔肽包含SEQ ID NO: 107至120中之任一者中所列之胺基酸序列。在某些實施例中，間隔肽由SEQ ID NO: 107至120中之任一者中所列之胺基酸序列組成。在某些實施例中，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽的連接子由本文所揭示之間隔肽及SEQ ID NO: 1組成或基本上由其組成。在某些實施例中，連接子由本文所揭示之間隔肽及SEQ ID NO: 1組成或基本上由其組成。在某些實施例中，間隔肽為第一連接子及/或第二連接子之N端。
在一些實施例中，在該異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，使蛋白質序列與第一抗體Fc域多肽融合的連接子由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)組成。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，使蛋白質序列與第一抗體Fc域多肽融合之連接子由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG(SEQ ID NO: 4)組成。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在某些實施例中，Fc域多肽為IgG4 Fc之Fc域多肽。IgG4為可經歷Fab臂交換且與體內之其他IgG4抗體配對的不穩定二聚體。在某些實施例中，將S228P突變引入增加鉸鏈區之穩定性且降低Fab臂交換之機率的鉸鏈(其在本發明中為將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一IgG4抗體Fc域多肽之連接子或將額外次單元連接至第二不同IgG4抗體Fc域多肽之連接子的部分或整體)內。在某些實施例中，在Fc單體之間引入額外S-S橋鍵，其改良異二聚體之穩定性。在一例示性實施例中，與連接至第一抗體Fc域多肽之次單元連接的Fc域包括CH3域中之Y349C取代，其與S354C取代形成二硫鍵，該S354C取代處於與連接至第二不同抗體Fc域多肽之額外次單元連接的Fc上。或者，與連接至第一抗體Fc域多肽之次單元連接的Fc域包括CH3域中之S354C取代，其與Y349C取代形成二硫鍵，該Y349C取代處於與連接至第二不同抗體Fc域多肽之額外次單元融合的Fc上。
在一些實施例中，本發明之蛋白質包括第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽，其皆為彼此促進異二聚化之突變IgG4 Fc域多肽。
在一些實施例中，第一抗體IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自K360E、K370E及R409W之突變，且第二不同抗體IgG4 Fc域多肽包括一或多個選自E357N、Q347R、D399V及F405T之突變。在一些實施例中，第一抗體IgG4 Fc域多肽包括突變K370E及R409W，且第二不同抗體IgG4 Fc域多肽包括突變E357N、D399V及F405T。在一些實施例中，第一抗體IgG4 Fc域多肽包括突變E357N、D399V及F405T，且第二不同抗體IgG4 Fc域多肽包括突變K370E及R409W。在一些實施例中，第一抗體IgG4 Fc域多肽包括突變K360E及R409W，且第二不同抗體IgG4 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T。在一些實施例中，第一抗體IgG4 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T，且第二不同抗體IgG4 Fc域多肽包括突變K360E及R409W。
在一些實施例中，具有IgG4 Fc的本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與FcγR (例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或補體組分(例如C1q)之結合的突變。此類突變適用於降低效應功能。舉例而言，本發明之蛋白質包括SPLE (S228P及L235E)突變、SPLEPA (S228P、L235E及P329A)突變或SPLEPG (S228P、L235E及P329G)突變。
表2中提供之IgG4抗體Fc域多肽中之任一者可與表1中提供之IgG4鉸鏈序列(其在本發明中為將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一IgG4抗體Fc域多肽的連接子或將額外次單元連接至第二不同IgG4抗體Fc域多肽的連接子之部分或整體)中之任一者組合使用。例示性IgG4鉸鏈Fc域多肽提供於表3中。在某些實施例中，Fc融合蛋白之第一及第二多肽分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 205及205；SEQ ID NO: 206及207；SEQ ID NO: 208及209；SEQ ID NO: 210及211；SEQ ID NO: 207及206；SEQ ID NO: 209及208；或SEQ ID NO: 211及210。在某些實施例中，Fc融合蛋白之第一及第二多肽分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 219及219；SEQ ID NO: 220及221；SEQ ID NO: 222及223；SEQ ID NO: 224及225；SEQ ID NO: 226及227；SEQ ID NO: 221及220；SEQ ID NO: 223及222；SEQ ID NO: 225及224；或SEQ ID NO: 227及226。 IgG1 Fc 融合蛋白
在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體IgG1 Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，其包含第一抗體IgG1 Fc域多肽；及第二多肽，其包含第二不同抗體IgG1 Fc域多肽，其中該第一多肽進一步包含多重次單元蛋白之蛋白質序列，其中該蛋白質序列係藉由包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)之連接子與第一抗體Fc域多肽融合，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G；且多重次單元蛋白之額外次單元係與第二不同抗體Fc域多肽融合，且多重次單元蛋白之次單元彼此結合，且其中當X1 表示L及/或X2 表示L時，第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽中之至少一者包含促進異二聚化之Q347R突變，其中第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽彼此結合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)組成，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G。
在某些實施例中，將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子進一步包含間隔肽。在某些實施例中，連接子包含序列SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 237及間隔肽。
在某些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合，該連接子包含序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)及間隔肽，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G。在某些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合，該連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)組成，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G。在某些實施例中，將多重次單元蛋白之額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽的連接子之胺基酸序列與將多重次單元蛋白之第一次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽的連接子之胺基酸序列一致。
可採用以標題「間隔肽」描述之任何間隔肽。舉例而言，在某些實施例中，間隔肽包含SEQ ID NO: 107至120中之任一者中所列之胺基酸序列。在某些實施例中，間隔肽由SEQ ID NO: 107至120中之任一者中所列之胺基酸序列組成。在某些實施例中，將多重次單元蛋白之第一次單元之蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽的連接子由本文所揭示之間隔肽及SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 237組成或基本上由其組成。在某些實施例中，將多重次單元蛋白之額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽的連接子由本文所揭示之間隔肽及SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 237組成或基本上由其組成。在某些實施例中，間隔肽為連接子之任一者或兩者的N端。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)。在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，使蛋白質序列與第一抗體Fc域多肽融合之連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)組成。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)。在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)組成。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，該多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，將蛋白質序列連接至第一抗體Fc域多肽之連接子包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)。在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，使蛋白質序列與第一抗體Fc域多肽融合之連接子由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)組成。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在一些實施例中，在異二聚體Fc融合蛋白內，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係藉由由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)組成之連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
在某些實施例中，Fc域多肽為IgG1 Fc之Fc域多肽。在一些實施例中，本發明之蛋白質包括第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽，其皆為彼此促進異二聚化之突變IgG1 Fc域多肽。舉例而言，若Fc域來源於人類IgG1之Fc，則Fc域可包含與人類IgG1抗體之胺基酸234至332至少90%一致的胺基酸序列，且在一或多個選自由以下組成之群的位置不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。
在一些實施例中，抗體恆定域可包含與人類IgG1抗體之胺基酸234至332至少90%一致的胺基酸序列，且因一或多個選自由以下組成之群的取代而不同：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。本文所揭示之Fc域或鉸鏈區中的所有胺基酸位置係根據EU編號來編號的。
在一些實施例中，第一抗體IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及K409W之突變，且第二不同抗體IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變。在一些實施例中，第一抗體IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自Q347R、D399V及F405T之突變，且第二不同抗體IgG1 Fc域多肽包括一或多個選自K360E及K409W之突變。在一些實施例中，該第一抗體IgG1 Fc域多肽包括突變K360E及K409W，且第二不同抗體IgG1 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T。在一些實施例中，第一抗體IgG1 Fc域多肽包括突變Q347R、D399V及F405T，且第二不同抗體IgG1 Fc域多肽包括突變K360E及K409W。
在一些實施例中，具有IgG1 Fc的本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與FcγR (例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或)或補體組分(例如C1q)之結合的突變。此類突變適用於降低效應功能。舉例而言，本發明之蛋白質包括LALA (L234A及L235A)突變、LALAPA (L234A、L235A及P329A)突變、LALAPG (L234A、L235A及P329G)突變或LALEGAASPS (L234A、L235E、G237A、A330S及P331S)突變。
在一些實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括第一抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽及第二不同抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽，其各自含有突變P329G或P329A。在特定實施例中根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含第一抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽及第二不同抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽，其各自包含突變P329A。
在一些實施例中，第一IgG1抗體Fc域多肽及第二不同IgG1抗體Fc域多肽各自含有選自A330S及P331S之突變。在一些實施例中，第一IgG1抗體Fc域多肽及第二不同IgG1抗體Fc域多肽各自含有突變A330S及P331S。
在某些實施例中，在IgG1 Fc單體之間引入額外S-S橋鍵，其改良異二聚體之穩定性。在一例示性實施例中，與多重次單元蛋白之次單元融合的Fc域包括CH3域中之Y349C取代，其與S354C取代形成二硫鍵，該S354C取代處於與多重次單元蛋白之額外次單元融合的Fc上。或者，與多重次單元蛋白之次單元融合的Fc域包括CH3域中之S354C取代，其與Y349C取代形成二硫鍵，該Y349C取代處於與多重次單元蛋白之額外次單元融合的Fc上。
表2中提供之IgG1抗體Fc域多肽中之任一者可與表1中提供之IgG1鉸鏈序列(其在本發明中為將多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一IgG1抗體Fc域多肽的連接子或將額外次單元連接至第二不同IgG1抗體Fc域多肽的連接子之部分或整體)中之任一者組合使用。例示性IgG1鉸鏈Fc域多肽提供於表3中。在某些實施例中，Fc融合蛋白之第一及第二多肽分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 212及212；SEQ ID NO: 213及214；SEQ ID NO: 215及216；SEQ ID NO: 217及218；SEQ ID NO: 214及213；SEQ ID NO: 216及215；或SEQ ID NO: 218及217。在某些實施例中，Fc融合蛋白之第一及第二多肽分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 228及228；SEQ ID NO: 229及230；SEQ ID NO: 231及232；SEQ ID NO: 233及234；SEQ ID NO: 235及236；SEQ ID NO: 230及229；SEQ ID NO: 232及231；SEQ ID NO: 234及233；SEQ ID NO: 236及235；SEQ ID NO: 228及250；SEQ ID NO: 250及228；SEQ ID NO: 250及250；SEQ ID NO: 229及252；SEQ ID NO: 252及229；SEQ ID NO: 251及230；SEQ ID NO: 230及251；SEQ ID NO: 253及232；SEQ ID NO: 232及253；SEQ ID NO: 231及254；SEQ ID NO: 254及231；SEQ ID NO: 255及234；SEQ ID NO: 234及255；SEQ ID NO: 233及256；SEQ ID NO: 256及233；SEQ ID NO: 257及236；SEQ ID NO: 236及257；SEQ ID NO: 258及235；或SEQ ID NO: 235及258。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之次單元與多重次單元蛋白之額外次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括IL-12之p35次單元與p40次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之C74與p40之C177之間的原生S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之次單元與多重次單元蛋白之額外次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括IL-12之p35次單元與p40次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之V185C與p40之Y292C之間的人工或經工程改造S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括多重次單元蛋白之次單元與多重次單元蛋白之額外次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵，及多重次單元蛋白之次單元與多重次單元蛋白之額外次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。舉例而言，在一例示性實施例中，IL-12之p35次單元與IL-12之p40次單元之間的原生異二聚體S-S橋鍵，且包括IL-12之p35次單元與IL-12之p40次單元之間的人工或經工程改造異二聚體S-S橋鍵。此蛋白質包括p35之C74與p40之C177之間的原生S-S橋鍵，及p35之V185C與p40之Y292C之間的人工或經工程改造S-S橋鍵。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白經工程改造，以移除原生S-S橋鍵，且改用非原生人工或經工程改造S-S橋鍵取代。舉例而言，在一例示性實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括：IL-12之p35，其中該原生C74突變成絲胺酸；及IL-12之p40，其中該原生C177突變成絲胺酸，從而移除IL-12之p35次單元與p40次單元之間的原生S-S橋鍵。將兩個新突變引入至此突變IL-12，亦即p35上之V185C及p40上之Y292C，從而引入非原生人工或經工程改造S-S鍵。
因此，本發明提供多重次單元蛋白之異二聚體Fc融合蛋白構築體。此等融合蛋白構築體相較於原生/天然多重次單元蛋白可帶來較高血清半衰期，改良蛋白質在生產期間之產率，增強儲存期間之穩定性及/或改良用作治療劑時之功效。
表4及5列舉本發明之例示性蛋白構築體之胺基酸序列。Fc中之所有突變/取代係根據EU編號系統編號的。p35次單元及p40次單元中之突變自此等次單元之N端胺基酸開始編號。
下表2中提供之IgG1抗體Fc變異域多肽中之任一者可與下表1中提供之IgG1鉸鏈序列中之任一者組合使用。例示性IgG1鉸鏈Fc域多肽提供於下表3中。 表1：連接子變異體
鉸鏈 胺基酸序列
IgG4鉸鏈共同序列 RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG 其中X為L或E (SEQ ID NO:1)
IgG4鉸鏈S228P RVESKYGPPCPP CPAPEFLGG (SEQ ID NO:2)
IgG4鉸鏈S228P/ L235E RVESKYGPPCPP CPAPEFE GG (SEQ ID NO:4)
IgG1鉸鏈共同序列 EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 其中X1 為L或A；X2 為L、E或A；且X3 為A或G (SEQ ID NO:6)
IgG1鉸鏈C220S EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7)
IgG1鉸鏈C220S/ L234A/ L235A EPKSS DKTHTCPPCPAPEAA GG (SEQ ID NO:9)
IgG1鉸鏈C220S/ L234A/ L235E/ G237A EPKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA (SEQ ID NO:11)
IgG1鉸鏈ΔE216 PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 其中X1 為L或A；X2 為L、E或A；且X3 為A或G (SEQ ID NO:237)
IgG1鉸鏈ΔE216/C220S PKSS DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238)
IgG1鉸鏈ΔE216/C220S/ L234A/ L235A PKSS DKTHTCPPCPAPEAA GG (SEQ ID NO:239)
IgG1鉸鏈ΔE216/C220S/ L234A/ L235E/ G237A PKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA (SEQ ID NO:240)
表2：IgG4 Fc及IgG1 Fc野生型序列；及例示性IgG4抗體Fc變異序列及IgG1抗體Fc變異序列(指示胺基酸取代)
Fc 域 胺基酸序列*
IgG4 Fc野生型 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:205)
IgG4 Fc Y349C/ K370E/ R409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTKNQVSLTCVE GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:206)
IgG4 Fc S354C/ E357N/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC QEN MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:207)
IgG4 Fc Y349C/ K360E/ R409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:208)
IgG4 Fc Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:209)
IgG4 Fc P329A/ Y349C/ K360E/ R409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLA SSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:210)
IgG4 Fc P329A/ S354C/ Q347R/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLA SSIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:211)
IgG1 Fc野生型 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:212)
IgG1 Fc Y349C/ K360E/ K409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:213)
IgG1 Fc Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:214)
IgG1 Fc P329A/ Y349C/ K360E/ K409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:215)
IgG1 Fc P329A/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:216)
IgG1 Fc A330S/ P331S/ Y349C/ K360E/ K409W PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:217)
IgG1 Fc A330S/ P331S/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:218)
*胺基酸序列可進一步包含C端處之離胺酸(K)。 表3：S228P突變IgG4鉸鏈-Fc (野生型)；例示性S228P突變IgG4鉸鏈-Fc變異體或鉸鏈部分-Fc變異體；C220S突變IgG1鉸鏈-Fc (野生型)；例示性C220S突變IgG1鉸鏈-Fc變異體或鉸鏈部分-Fc變異體
連接子-Fc 胺基酸序列*
IgG4鉸鏈-Fc S228P RVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:219)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ Y349C/ K370E/ R409W RVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVE GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:220)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ S354C/ E357N/ D399V/ F405T RVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC QEN MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:221)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ Y349C/ K360E/ R409W RVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:222)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T RVESKYGPPCPP CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:223)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ L235E/ Y349C/ K360E/ R409W RVESKYGPPCPP CPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:224)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ L235E/ S354C/ Q347R/ D399V/ F405T RVESKYGPPCPP CPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:225)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ L235E/ P329A/ Y349C/ K360E/ R409W RVESKYGPPCPP CPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLA SSIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSQEEMTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:226)
IgG4鉸鏈-Fc S228P/ L235E/ P329A/ S354C/ Q347R/ D399V/ F405T RVESKYGPPCPP CPAPEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLA SSIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:227)
IgG1鉸鏈-Fc C220S EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:228)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S PKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:250)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ Y349C/ K360E/ K409W EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:229)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ Y349C/ K360E/ K409W PKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:251)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T EPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:230)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:252)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235A/ Y349C/ K360E/ K409W EPKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:231)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235A/ Y349C/ K360E/ K409W PKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:253)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235A/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T EPKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:232)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235A/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:254)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235A/ P329A/ Y349C/ K360E/ K409W EPKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:233)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235A/ P329A/ Y349C/ K360E/ K409W PKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:255)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235A/ P329A/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T EPKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:234)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235A/ P329A/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PKSS DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:256)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235E/ G237A/ A330S/ P331S/ Y349C/ K360E/ K409W EPKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:235)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235E/ G237A/ A330S/ P331S/ Y349C/ K360E/ K409W PKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:257)
IgG1鉸鏈-Fc C220S/ L234A/ L235E/ G237A/ A330S/ P331S/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T EPKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:236)
IgG1鉸鏈-Fc ΔE216/C220S/ L234A/ L235E/ G237A/ A330S/ P331S/ Q347R/ S354C/ D399V/ F405T PKSS DKTHTCPPCPAPEAE GA PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS IEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:258)
*胺基酸序列可進一步包含C端處之離胺酸(K)。表 4 ：例示性異二聚體 Fc 融合多肽構築體
連接子序列 異二聚體 Fc 融合蛋白之序列 *(*C 端離胺酸 (K) 可在產生階段移除 ) IgG (IL-12 次單元 ) 之類型 ； 突變 / 取代
構築體101
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:129) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P      
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:130)    RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC QENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35)    異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體102
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:131) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:132) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體103
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:133) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:134) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體104
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:135) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:136) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體106
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:137) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK   或 (SEQ ID NO:259)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKSS DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK       IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:138) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GS EPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK          IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體107
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:139) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或 (SEQ ID NO:260)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKSS DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcSilent (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:140) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1FcSilent (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
構築體108
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:141) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或 (SEQ ID NO:261)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKSS DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcSilent (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A, P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:142) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK       IgG1FcSilent (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A, P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體110
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:240) (SEQ ID NO:143) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 或 (SEQ ID NO:262) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKSS DKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcEWS (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:144) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1FcEWS    (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S
構築體111
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:145) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:146) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRVMSYLNASRVESKYGPPCPPC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQENMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體112
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:147) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:148) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC QENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK    IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體113
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:149) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:150) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCQENMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK             IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體114
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:151) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:263)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:152) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASEPKSSDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK    IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體115
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:153) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:264)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:154) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK       IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體116
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:155) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或 (SEQ ID NO:265)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:156) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRVMSYLNASGGG GSGGGGSEPK SSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPRV YTLPPCRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL VSDGSFTLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體117   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8)    或 GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:241) (SEQ ID NO:157) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTENQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSWLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    或 (SEQ ID NO:266)    RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSPKSS DKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTENQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSWLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1_EWRVT-Flipped (IL-12 p35) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:158) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPRVY TLPPCRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT-Flipped (IL-12 p40) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體118
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15)    或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:242) (SEQ ID NO:159) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSGGGG SEPKSSDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK    或    (SEQ ID NO:267)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSGGGGSPKSS DKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:160) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNAS GGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體119
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) 或 GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:242) (SEQ ID NO:161) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS GGGG SEPKSSDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK 或 (SEQ ID NO:268) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS GGGGSPKSS DKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W    p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)   
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:162) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGGGSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：C74S V185C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)   
構築體119-1
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:163) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K370E/R409W p40取代：C177S, Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:164) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPCQENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體119-2
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:165) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:166) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK       IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體119-3
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:167) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:168) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體119-4
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:169) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:170) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體119-5
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:171) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 或 (SEQ ID NO:269) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:172) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體119-6
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:173) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 或 (SEQ ID NO:270) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:174) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    p35取代： C74S V185C    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體119-7   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:175) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 或 (SEQ ID NO:271) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:176) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S、V185C    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體119-8
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:240) (SEQ ID NO:177) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 或 (SEQ ID NO:272) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失) 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:178) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S、V185C    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S 上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體120
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:179) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:180) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPCQENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK    IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T    p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體120-1
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:181) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:182) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPCQEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK       IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體120-2
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:183) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:184) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體120-3
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:185) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:186) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體120-4
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:238) (SEQ ID NO:187) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或 (SEQ ID NO:273) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:188) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體120-5
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:189) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或 (SEQ ID NO:274) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:190) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體120-6   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:191) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:275)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:192) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體120-7   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:240) (SEQ ID NO:193) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:276)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:194) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體121
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:195) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:277)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A p40中之額外突變：Y292C，以引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:196) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A p35中之額外突變：V185C，以引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體122
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)    或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:239) (SEQ ID NO:197) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEWASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:278)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSH EDPEVKFNW YVDGVEVHN AKTKPREEQ YNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A    額外突變Y292C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:198) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A    額外突變V185C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體123
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) 或 PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:240) (SEQ ID NO:199) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    或    (SEQ ID NO:279)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSPKS S DKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    額外突變Y292C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:200) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    額外突變V185C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
表 5 ： 例示性二聚體 Fc 融合蛋白
連接子序列 異二聚體 Fc 融合蛋白之序列 *(*C 端離胺酸 (K) 可在產生階段移除 ) IgG (IL-12 次單元 ) 之類型 ； 突變 / 取代
構築體1
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO:17) IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P      
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:18)    RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC QENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35)    異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體2
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO:19) IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3)  (SEQ ID NO:20) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體3
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:21) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:22) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體4
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:23) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:24) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體5
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:25) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLGS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:26) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLGSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
構築體6
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7)    (SEQ ID NO:27) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:28) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK          IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體7
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)       (SEQ ID NO:29) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcSilent (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:30) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1FcSilent (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體8
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)       (SEQ ID NO:31) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcSilent (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:32) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK          IgG1FcSilent (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體9
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9)       (SEQ ID NO:33) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALG APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcSilent (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A/L235A/P329G    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:34) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1FcSilent (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329G 上部鉸鏈中之C220突變成S      
構築體10
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:35) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1FcEWS (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:36) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1FcEWS    (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S
構築體11
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:37) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:38) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRVMSYLNASRVESKYGPPCPPC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQENMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK    IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體12
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2)  (SEQ ID NO:39) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:40) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC QENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體13   
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:41) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:14) (SEQ ID NO:42) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCQENMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK       IgG4_SP_EWNVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體14   
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:43) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:44) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASEPKSSDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK    IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體15   
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:45) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15)    (SEQ ID NO:46) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGGGSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體16
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:47) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:48) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRVMSYLNASGGG GSGGGGSEPK SSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPRV YTLPPCRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL VSDGSFTLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK IgG1_EWRVT (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體17   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8)       (SEQ ID NO:49) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTENQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSWLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1_EWRVT-Flipped (IL-12 p35) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S      
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:50) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPRVY TLPPCRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLV SDGSFTLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1_EWRVT-Flipped (IL-12 p40) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體18
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:51) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCSGGGG SEPKSSDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:52) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNAS GGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體19
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:53) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS GGGG SEPKSSDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTENQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSWLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W    p40取代：C177S, Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)   
GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPE LLGG (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:54) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGGGSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：C74S V185C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)   
構築體19-1
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:69) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K370E/R409W p40取代：C177S, Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:70) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPCQENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK    IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
構築體19-2
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:71) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S, Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:72) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK       IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體19-3
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:73) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS RVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S, Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:74) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體19-4
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:75) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK    IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:76) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體19-5
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:77) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLGS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:78) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLGSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
構築體19-6
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:79) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:80) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C    上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體19-7
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:81) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:82) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    p35取代： C74S V185C    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體19-8   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:83) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:84) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S、V185C    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體19-9
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:85) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失)    用於減少FcγR結合之取代：L234A/L235A/P329G    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:86) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S V185C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329G    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體19-10
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:87) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：C177S、Y292C    (次單元之間的原生S-S橋鍵缺失) 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:88) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代： C74S、V185C    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S 上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體20
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:55) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVE GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K370E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:56) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPCQENMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：E357N/D399V/F405T    p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體20-1
RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:89) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P   
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:90) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPCQEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK          IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P
構築體20-2
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:91) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:92) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P及L235E
構築體20-3
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:93) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLAS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:94) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLASSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329A
構築體20-4
RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:95) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLGS SIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSQEEMTE NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSWL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK IgG4 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/R409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:96) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSRVESKYGP PCPPCPAPEF EGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLGSSIEK TISKAKGQPR EPRVYTLPPC QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLVSDGSF TLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS LGK IgG4 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於防止Fab臂交換及改良熱穩定性之取代：S228P 用於減少FcγR結合之取代：S228P、L235E、P329G
構築體20-5
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:97) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:98) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGSFTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體20-6
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:99) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:100) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T    p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
構築體20-7   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:101) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:102) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK    IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A 上部鉸鏈中之C220突變成S      
構築體20-8   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:103) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALG APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40)    異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329G 上部鉸鏈中之C220突變成S      
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:104) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGGGSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK       IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329G 上部鉸鏈中之C220突變成S   
構築體20-9   
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:105) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK    IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W p40取代：Y292C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留) 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:106) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK             IgG1 (IL-12 p35)    異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T p35取代：V185C (次單元之間的原生S-S橋鍵保留)    用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體21
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:57) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSW LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C    用於減少FcγR結合之取代：L234A, L235A p40中之額外突變：Y292C，以引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:58) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPPCRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A p35中之額外突變：V185C，以引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體22
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:59) IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEWASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALA APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELTENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A    額外突變Y292C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S   
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:60) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALAAPIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR結合之取代：L234A、L235A、P329A    額外突變V185C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
構築體23
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:61)    IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCSEPKS SDKTHTCPPC PAPEAEGAPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALP SSIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSRDELT ENQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSWLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK IgG1 (IL-12 p40) 異二聚化突變：K360E/K409W 用於S-S穩定化橋鍵之取代：Y349C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    額外突變Y292C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO:62) RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNASGGG GSGGGGSGGG GSEPKSSDKT HTCPPCPAPE AEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPSSIE KTISKAKGQP REPRVYTLPP CRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLVSDGS FTLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK IgG1 (IL-12 p35) 異二聚化突變：Q347R/D399V/F405T 用於S-S穩定化橋鍵之取代：S354C 用於減少FcγR及C1q結合之取代：L234A、L235E、G237A、A330S、P331S    額外突變V185C引入IL-12穩定化S-S橋鍵    上部鉸鏈中之C220突變成S
IL-12 次單元
IL-12為包括p40次單元及p35次單元之多重次單元蛋白。成熟野生型IL-12 p40之胺基酸序列為下文SEQ ID NO: 127中所列之GenBank寄存編號NP_002178.2之胺基酸23至328。成熟野生型IL-12 p35之胺基酸序列為下文SEQ ID NO: 128中所列之GenBank寄存編號NP_000873.2之胺基酸57至253。p40及p35之胺基酸殘基之編號對應於成熟野生型蛋白序列。如本文所用，IL-12 p40次單元包含與SEQ ID NO: 127至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。如本文所用，IL-12 p35次單元包含與SEQ ID NO: 128至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的胺基酸序列。
在前述態樣中之任一者之某些實施例中，IL-12之p40及p35次單元分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 121及122；SEQ ID NO: 127及128；SEQ ID NO: 201及202；SEQ ID NO: 203及204；SEQ ID NO: 123及124；或SEQ ID NO: 125及126。在某些實施例中，第一多肽包含IL-12之p40次單元之胺基酸序列，且第二多肽包含IL-12之p35次單元之胺基酸序列。在某些實施例中，第一多肽包含IL-12之p35次單元之胺基酸序列，且第二多肽包含IL-12之p40次單元之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明包括一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，該第一多肽包含第一抗體Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含第二不同抗體Fc域多肽，其中第一多肽進一步包含藉由連接子與第一抗體Fc域多肽融合的IL-12之第一次單元之蛋白質序列；且IL-12之第二不同次單元與第二不同抗體Fc域多肽融合，其中IL-12之第一及第二不同次單元彼此結合，其中第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有促進異二聚化之不同突變，其中第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽彼此結合，且其中IL-12之第一次單元為具有Y292C取代之p40次單元，且IL-12之第二不同次單元為具有V185C取代之p35次單元。在某些實施例中，IL-12之第一及第二不同次單元分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 125及126。
IL-12之第一及第二不同次單元可經由本文所揭示之任何連接子與抗體Fc域多肽中之任一者融合，該等連接子包括(但不限於)如表4中所描述之構築體120、120-1、120-2、120-3、120-4、120-5、120-6及120-7，以及如表5中所描述之構築體20、20-1、20-2、20-3、20-4、20-5、20-6、20-7、20-8及20-9。
在某些實施例中，IL-12之p40次單元進一步包含C177之置換，且IL-12之p35次單元進一步包含C74之置換。在某些實施例中，IL-12之p40次單元中之C177經S置換，且IL-12之p35次單元中之C74經S置換。在某些實施例中，IL-12之p40及p35次單元分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 123及124。
IL-12之第一及第二不同次單元可經由本文所揭示之任何連接子與抗體Fc域多肽中之任一者融合，該等連接子包括(但不限於)如表4中所描述之構築體119、119-1、119-2、119-3、119-4、119-5、119-6、119-7及119-8，以及如表5中所描述之構築體19、19-1、19-2、19-3、19-4、19-5、19-6、19-7、19-8、19-9及19-10。表 6 ： 人類 IL-12 p40 及 p35 胺基酸序列
IL-12 p40 IL-12 p35
人類IL-12 p40野生型 IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS (SEQ ID NO:127) 人類IL-12 p35野生型 RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (SEQ ID NO:128)
人類IL-12 p40 C177S Y292C IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS (SEQ ID NO:201) 人類IL-12 p35 C74S V185C RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNAS (SEQ ID NO:202)
人類IL-12 p40 Y292C IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS (SEQ ID NO:203) 人類IL-12 p35 V185C RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNAS (SEQ ID NO:204)
人類IL-12 p40 Q56R IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCS (SEQ ID NO:121) 人類IL-12 p35 E50V RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNAS (SEQ ID NO:122)
人類IL-12 p40 Q56R C177S Y292C IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSASPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS (SEQ ID NO:123) 人類IL-12 p35 E50V C74S V185C RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESSLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNAS (SEQ ID NO:124)
人類IL-12 p40 Q56R Y292C IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIRVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RCYSSSWSEW ASVPCS (SEQ ID NO:125) 人類IL-12 p35 E50V V185C RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHV DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRACTIDRV MSYLNAS (SEQ ID NO:126)
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。在某些實施例中，包含SEQ ID NO: 290及SEQ ID NO: 291的本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含第一抗體Fc域多肽之CH3域中的Y349C突變及第二不同抗體Fc域多肽之CH3域中的S354C突變。在某些實施例中，包含SEQ ID NO: 290及SEQ ID NO: 291的本發明之異二聚體Fc融合蛋白在各別Fc域多肽序列中包含促進Fc域之間的異二聚化的不同突變。
在某些實施例中，第一多肽序列包含第一抗體Fc域多肽(人類IgG1)序列，其包含K360E及K409W取代。在某些實施例中，第二多肽序列包含第二不同抗體Fc域多肽(人類IgG1 Fc)序列，其包含Q347R、D399V及F405T取代。在某些實施例中，第一多肽及第二多肽胺基酸序列包含一或多個用於降低效應功能之突變。在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白包含LALAPA (L234A、L235A及P329A)突變。
在某些實施例中，在本發明之異二聚體Fc融合蛋白之第一多肽( SEQ ID NO: 290)中，人類IL-12之p40次單元係藉由包含第一胺基酸序列之第一連接子與第一抗體Fc域多肽融合，且在本發明之異二聚體Fc融合蛋白之第二多肽(SEQ ID NO: 291)中，人類IL-12之p35次單元係藉由包含第二胺基酸序列之第二連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合。
SEQ ID NO: 290為與人類IgG1 Fc域融合的人類IL-12之p40次單元之序列(加底線之胺基酸)。突變以粗體展示。
Figure 02_image001
SEQ ID NO: 291為與人類IgG1 Fc域融合的人類IL-12之p35次單元之序列(加底線之胺基酸)。突變以粗體展示。
Figure 02_image003
Figure 02_image005
分別由胺基酸序列SEQ ID NO: 290及SEQ ID NO: 291表示之第一及第二多肽歸因於SEQ ID NO: 290中的第一抗體Fc域多肽序列(人類IgG1)之CH3域中之Y349C突變(加粗且加底線)及SEQ ID NO: 291中的第二不同抗體Fc域多肽序列(人類IgG1)之CH3域中之S354C突變(加粗且加底線)而形成二硫鍵，從而賦予異二聚體Fc融合蛋白穩定性(Fc編號係根據EU系統)。
為促進異二聚體Fc融合蛋白之兩個Fc域之間的異二聚化，SEQ ID NO: 290中之第一抗體Fc域多肽序列(人類IgG1)包括CH3域中之K360E及K409W取代，且SEQ ID NO: 291中之第二不同Fc域多肽序列(人類IgG1)包括CH3域中之Q347R、D399V及F405T取代(Fc編號係根據EU系統)。
SEQ ID NO: 290及SEQ ID NO: 291中之第一抗體Fc域多肽序列及第二不同Fc域多肽序列(人類IgG1)亦包括用於降低效應功能之L234A、L235A及P329A (LALAPA)突變。 間隔肽
例示性間隔肽序列提供於表7中，且例示性全長連接子序列提供於表4及表5中。
在本發明之第一多肽內，多重次單元蛋白之第一次單元係經由連接子沿胺基至羧基方向與第一抗體Fc域序列(例如IgG4抗體Fc變異序列或IgG1抗體Fc變異序列，如表2所揭示)融合。且在本發明之第二多肽內，包含多重次單元蛋白之額外次單元的蛋白質序列係經由連接子沿胺基至羧基方向與第二不同抗體Fc域多肽(例如IgG4抗體Fc變異序列或IgG1抗體Fc變異序列，如表2所揭示)融合。
在一些實施例中，本發明之多重次單元蛋白之第一次單元係經由連接子與第一抗體Fc域序列融合，其中連接子包含間隔肽L1 及胺基酸序列SEQ ID NO: 1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240或由其組成。在一些實施例中，多重次單元蛋白之額外次單元係經由連接子與第二不同抗體Fc域多肽融合，其中連接子包含間隔肽L2 及胺基酸序列SEQ ID NO: 1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240或由其組成。
在某些實施例中，L1 及L2 為肽連接子，例如L1 及/或L2 包括4至50個胺基酸殘基。在某些實施例中，L1 由4至50個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，L1 由4至20個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，L2 由4至50個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，L2 由約4至20個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，L1 及L2 各自獨立地由約4至50個胺基酸殘基組成。在某些實施例中，L1 及L2 各自獨立地由4至20個胺基酸殘基組成。
在一些實施例中，L1 及L2 具有最佳長度及/或胺基酸組成。在一些實施例中，L1 及L2 具有相同長度且具有相同胺基酸組成。在其他實施例中，L1 與L2 不同。
在某些實施例中，L1 與L2 具有相等數目之胺基酸；在某些實施例中，L1 比L2 長(亦即，胺基酸之數目較多)；在某些實施例中L1 比L2 短(亦即，胺基酸之數目較少)。
在某些實施例中，L1 及/或L2 「短」，例如由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基組成。因此，在某些情況下，間隔肽由約12個或更少胺基酸殘基組成。在0個胺基酸殘基之情況下，間隔肽為肽鍵。在某些實施例中，L1 及/或L2 「長」，例如由15、20或25個胺基酸殘基組成。在一些實施例中，間隔肽由約3至約15個，例如8、9或10個鄰接胺基酸殘基組成。關於L1 及L2 之胺基酸組成，肽經選擇具有賦予本發明之蛋白質之第一及第二多肽可撓性的特性，不干擾第一與第二不同次單元彼此結合，且抵抗蛋白酶之裂解。舉例而言，甘胺酸及絲胺酸殘基通常提供蛋白酶抗性。適合於將多重次單元蛋白之次單元連接至胺基酸序列SEQ ID NO: 1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240及/或適合於將多重次單元蛋白之額外次單元連接至胺基酸序列SEQ ID NO: 1、2、4、6、7、9、11、237、238、239或240的間隔肽可包括(GS)n 、(GGS)n 、(GGGS)n 、(GGSG)n 、(GGSGG)n 及(GGGGS)n 序列作為連接子之部分，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施例中，L1 及/或L2 獨立地包括(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 107)或(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 108)序列作為連接子之部分。在其他實施例中，L1 及/或L2 獨立地包括如選自以下之序列中所列的肽序列作為連接子之部分：SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119及SEQ ID NO: 120，如表 7 中所列舉。在一些實施例中，L1 及/或L2 獨立地為(GGGGS)n=3 (SEQ ID NO: 108)、(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)或(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)。表 7
SEQ ID 胺基酸序列
SEQ ID NO:111 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
SEQ ID NO:112 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS
SEQ ID NO:113 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:114 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO:115 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO:116 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:117 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:118 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:119 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:120 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
在某些實施例中，L1 包括序列(GGGGS)n=3 (SEQ ID NO: 108)序列作為連接子之部分，且L2 包括(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)或(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)序列作為連接子之部分。在某些實施例中，L2 包括序列(GGGGS)n=3 (SEQ ID NO: 108)序列作為連接子之部分，且L1 包括(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)或(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)序列作為連接子之部分。在某些實施例中，作為連接子之部分，L1 不包括如下中所列之序列：SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119或SEQ ID NO: 120。
在某些實施例中，作為連接子之部分，僅L2 包括如下中所列之序列：SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119或SEQ ID NO: 120。在某些實施例中，作為連接子序列之部分，L1 及L2 皆不包括如下中所列之序列：SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119或SEQ ID NO: 120。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至第一抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子將額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元係藉由不包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中不包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中第二不同次單元係藉由包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 118；(G4S)3 )之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至第一抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子將額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子，其將多重次單元蛋白之次單元連接至第一抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽，且將多重次單元蛋白之第二不同次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中第二不同次單元係藉由不包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中不包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元藉由包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至第一抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子將額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。
本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包括包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子，其將多重次單元蛋白之次單元連接至第一抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽，且將多重次單元蛋白之第二不同次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽，例如IgG4抗體之Fc域多肽或IgG1抗體之Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元藉由不包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中不包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元藉由包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元藉由包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，本發明之一些異二聚體Fc融合蛋白包含：第一多肽，該第一多肽包含多重次單元蛋白之次單元及第一抗體Fc域多肽，其中包含(GGGGS)n=2 (SEQ ID NO: 109)之連接子將多重次單元蛋白之次單元連接至Fc域多肽；及第二多肽，該第二多肽包含多重次單元蛋白之額外次單元及第二不同抗體Fc域多肽，其中額外次單元藉由包含(GGGGS)n=1 (SEQ ID NO: 110)之連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。 Fc 域 及用於促進異二聚化之取代
本發明之蛋白質之組裝可藉由將第一多肽及第二多肽表現於相同細胞中來實現，從而促成根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白之組裝，該第一多肽包含與第一抗體Fc域多肽(例如IgG4抗體Fc變異序列或IgG1抗體Fc變異序列，如表2所揭示)融合的多重次單元蛋白序列之次單元，該第二多肽包含與第二不同抗體Fc域多肽(例如IgG4抗體Fc變異序列或IgG1抗體Fc變異序列，如表2所揭示)融合的多重次單元蛋白序列之第二不同次單元。組裝之蛋白質具有異二聚體Fc域多肽，其中第一抗體Fc域多肽與第二不同抗體Fc域多肽彼此結合。促進Fc之異二聚體之優先組裝可藉由將不同突變併入各抗體重鏈恆定區之CH3域中來實現，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480及US14/830336中所示。舉例而言，可基於人類IgG1及在第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽內併有允許該兩個鏈選擇性地彼此異二聚化的不同胺基酸取代對在CH3域中進行突變。下文所說明之胺基酸取代位置皆根據如Kabat中之EU索引編號。
在一種情形下，第一抗體Fc域多肽中之胺基酸取代用選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)之較大胺基酸置換原始胺基酸，且第二不同抗體Fc域多肽中之至少一個胺基酸取代用選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)之較小胺基酸置換原始胺基酸，使得較大胺基酸取代(突起)適合較小胺基酸取代(凹穴)之表面。舉例而言，一個抗體Fc域多肽可併有T366W取代，且另一抗體Fc域多肽可併有三個取代，包括T366S、L368A及Y407V。
本發明的包含多重次單元蛋白序列之次單元的第一多肽或包含多重次單元蛋白序列之第二不同次單元的第二多肽可視情況與如下胺基酸序列偶合，該胺基酸序列與抗體恆定區(諸如IgG恆定區，包括鉸鏈、CH2及CH3域，含有或不含CH1域)至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。在一些實施例中，恆定區之胺基酸序列與人類抗體恆定區(諸如人類IgG1恆定區、IgG2恆定區、IgG3恆定區或IgG4恆定區)至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。在一些其他實施例中，恆定區之胺基酸序列與來自另一哺乳動物(諸如兔、狗、貓、小鼠或馬)之抗體恆定區至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致。相較於人類IgG1恆定區，可在該恆定區中併入一或多個突變，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及/或K439併入。例示性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。
在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之CH1中的突變可處於胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171及/或V173。在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之Cκ中的突變可處於胺基酸E123、F116、S176、V163、S174及/或T164。
胺基酸取代可選自表8中所示之以下取代組。
表8      
   第一多肽 第二多肽
組1 S364E/F405A Y349K/T394F
組2 S364H/D401K Y349T/T411E
組3 S364H/T394F Y349T/F405A
組4 S364E/T394F Y349K/F405A
組5 S364E/T411E Y349K/D401K
組6 S364D/T394F Y349K/F405A
組7 S364H/F405A Y349T/T394F
組8 S364K/E357Q L368D/K370S
組9 L368D/K370S S364K
組10 L368E/K370S S364K
組11 K360E/Q362E D401K
組12 L368D/K370S S364K/E357L
組13 K370S S364K/E357Q
組14 F405L K409R
組15 K409R F405L
或者，胺基酸取代可選自表9中所示之以下取代組。
表9      
   第一多肽 第二多肽
組1 K409W D399V/F405T
組2 Y349S E357W
組3 K360E Q347R
組4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
組5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
組6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
或者，胺基酸取代可選自表10中所示之以下取代組。
表10      
   第一多肽 第二多肽
組1 T366K/L351K L351D/L368E
組2 T366K/L351K L351D/Y349E
組3 T366K/L351K L351D/Y349D
組4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
組5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
組6 E356K/D399K K392D/K409D
或者，各多肽鏈中之至少一個胺基酸取代可選自表11。
表11   
第一多肽 第二多肽
L351Y、D399R、D399K、S400K、S400R、Y407A、Y407I、Y407V T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F K392D、K392E、K409F、K409W、T411D及T411E
或者，至少一個胺基酸取代可選自表12中之以下取代組，其中第一多肽欄中指示之位置經任何已知帶負電胺基酸置換，且第二多肽欄中指示之位置經任何已知帶正電胺基酸置換。
表12   
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
或者，至少一個胺基酸取代可選自表13中之以下組，其中第一多肽欄中指示之位置經任何已知帶正電胺基酸置換，且第二多肽欄中指示之位置經任何已知帶負電胺基酸置換。
表13   
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
或者，胺基酸取代可選自表14中之以下組。
表14
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A及Y407V T350V、T366L、K392L及T394W
或者或另外，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白之結構穩定性可藉由在第一或第二多肽鏈中之任一者上引入S354C及在相對多肽鏈上引入Y349C來提高，S354C及Y349C在兩個多肽之界面內形成人工二硫橋鍵。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在位置T366處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自T366、L368及Y407之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自T366、L368及Y407之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在位置T366處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自以下之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列：E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在選自以下之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列：Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自以下之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列：Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自以下之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列：E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自L351、D399、S400及Y407之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自T366、N390、K392、K409及T411之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自T366、N390、K392、K409及T411之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自L351、D399、S400及Y407之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Q347、Y349、K360及K409之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Q347、E357、D399及F405之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Q347、E357、D399及F405之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Y349、K360、Q347及K409之位置不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自K370、K392、K409及K439之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自D356、E357及D399之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自D356、E357及D399之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自K370、K392、K409及K439之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自L351、E356、T366及D399之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Y349、L351、L368、K392及K409之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自Y349、L351、L368、K392及K409之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列在一或多個選自L351、E356、T366及D399之位置處不同於IgG1恆定區之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於S354C取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於S354C取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於K360E及K409W取代，且抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於O347R、D399V及F405T取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於O347R、D399V及F405T取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於K360E及K409W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366W取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代，且抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代。
熟習此項技術者將瞭解，在蛋白質之產生及/或儲存期間，N端麩胺酸酯(E)或麩醯胺酸(Q)可經環化形成內醯胺(例如自發地或藉由產生及/或儲存期間存在之酶催化)。因此，在其中多肽之胺基酸序列之N端殘基為E或Q的一些實施例中，本文亦涵蓋E或Q經焦麩胺酸根置換的對應胺基酸序列。
熟習此項技術者亦將瞭解，在蛋白質產生及/或儲存期間，蛋白質之C端離胺酸(K)可移除(例如自發地或藉由產生及/或儲存期間存在之酶催化)。在其C端包含Fc域之蛋白質通常觀測到K之此移除。因此，在其中多肽之胺基酸序列(例如Fc域序列)之C端殘基為K的一些實施例中，本文亦涵蓋K經移除的對應胺基酸序列。 用於降低效應功能之突變
在一個態樣中，本發明提供一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含：(a)第一多肽，該第一多肽包含第一抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第一次單元；及(b)第二多肽，該第二多肽包含第二抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第二不同次單元，其中第一抗體Fc域多肽及第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變，其中第一及/或第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低Fc之效應功能的突變，且其中多重次單元蛋白之第一及第二不同次單元彼此結合。在某些實施例中，包含一或多個降低Fc之效應功能之突變的本文所揭示之異二聚體Fc融合蛋白抑制腫瘤生長之活性相比於不具有降低效應功能之Fc突變的其對應物增加。本文中涵蓋之突變包括胺基酸殘基之取代、插入及缺失。本文所揭示之Fc域或鉸鏈區中的所有胺基酸位置係根據EU編號來編號的。
在某些實施例中，第一及/或第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低Fc域多肽誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之能力的突變。ADCC及ADCP通常由Fc受體介導。舉例而言，在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為人類IgG (例如人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4)抗體序列。人類IgG之Fc受體亦稱作Fcγ受體(FcγR)，包括(但不限於)活化Fcγ受體FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIIA (CD16或CD16A)及FcγRIIIB (CD16B)，以及抑制Fcγ受體FcγRIIB (CD32B)。因此，在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與活化FcγR (例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA或FcγRIIIB)之結合的突變。在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個增加與抑制性FcγR (例如FcγRIIB)之結合的突變。
降低與活化FcγR之結合及/或增加與抑制性FcγR之結合的Fc突變為此項技術中已知的。舉例而言，在鉸鏈及Fc區內，CD16結合係由鉸鏈區及CH2域介導。舉例而言，在人類IgG1內，與CD16之相互作用主要集中於胺基酸殘基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239及CH2域中之碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡糖胺(參見Sondermann等人, Nature, 406 (6793):267-273)。基於已知域，可選擇增強或降低針對CD16之結合親和力的突變，諸如藉由使用噬菌體呈現文庫或酵母表面呈現cDNA文庫來選擇，或可基於相互作用之已知三維結構來設計突變。
如Want等人Protein Cell (2018) 9(1):63-73中所綜述，根據人類IgG1 Fc之晶體結構的活化FcγR結合涉及包括胺基酸位置232-239、265-270、296-299及325-332之區域。Wang等人亦揭示人類IgG4之L235E及F234A/L235A突變、人類IgG1之L234A/L235A突變及IgG抗體之N297突變(例如N297A、N297Q、N297G或N297D)減少了活化FcγR結合。如美國專利第8,969,526號中所揭示，位置329處之突變(例如P329A、P329G或P329R)亦減少活化FcγR結合。活化FcγR結合涉及之額外胺基酸位置及突變(例如E233P突變)揭示於美國專利第7,943,743號及Isaacs等人, J. Immunol. (1998) 161:3862-69中。
因此，在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自233、234、235、297及329之位置處的突變(例如相對於野生型人類IgG1之取代)。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含以下突變之人類IgG1抗體Fc域多肽：E233P；L234A (人類IgG1)或F234A (人類IgG4)；L235A或L235E；N297A、N297Q、N297G或N297D；及/或P329A、P329G或P329R。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變L234A及L235A之人類IgG1抗體Fc域多肽。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變L234A、L235A及P329A之人類IgG1抗體Fc域多肽。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變L235E之人類IgG4抗體Fc域多肽。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變L235E及P329A之人類IgG1抗體Fc域多肽。
在某些實施例中，第一及/或第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低Fc域多肽誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)之能力的突變。CDC通常由補體組分(例如C1q)介導。因此，在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與補體組分(例如C1q)之結合的突變。
減少與C1q之結合的Fc突變為此項技術中已知的。舉例而言，如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號所揭示，C1q結合涉及位置234、235、236、237、297、318、320及322處之Fc之胺基酸殘基。如Tao等人, J. Exp. Med. (1993) 178:661-667及Brekke等人, Eur. J. Immunol. (1994) 24:2542-47所揭示，C1q結合涉及位置331處之殘基Pro。如Idusogie等人, J. Immunol. (2000) 164:4178-84所揭示，位置270 (例如D270A、322 (K322A)、329 (例如P329A)及331 (例如P331A、P331S或P331G)處之Fc之突變減少C1q結合。
因此，在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自以下之位置處的突變(例如相對於野生型人類IgG1之取代)：234、235、236、237、270、297、318、320、322、329及331。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變G237A、A330S、P331S及/或P329A之人類IgG1抗體Fc域多肽。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變G237A、A330S及P331S之人類IgG1抗體Fc域多肽。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽為包含突變P329A之人類IgG1抗體Fc域多肽。
可組合降低ADCC及/或ADCP之突變及降低CDC之突變。在某些實施例中，第一及/或第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低Fc域多肽誘導ADCC及/或ADCP之能力的突變且進一步包含一或多個降低Fc域多肽誘導CDC之能力的突變。在某些實施例中，第一及第二抗體Fc域多肽各自包含一或多個降低Fc域多肽誘導ADCC及/或ADCP之能力的突變且進一步包含一或多個降低Fc域多肽誘導CDC之能力的突變。
在一些實施例中，具有IgG4 Fc的本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與FcγR (例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或補體組分(例如C1q)之結合的突變。此類突變適用於降低效應功能。舉例而言，本發明之蛋白質可包括SPLE (S228P及L235E)突變、SPLEPA (S228P、L235E及P329A)突變或SPLEPG (S228P、L235E及P329G)突變。
在一些實施例中，具有IgG1 Fc的本發明之異二聚體Fc融合蛋白在第一及/或第二多肽中包括一或多個減少與FcγR (例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或)或補體組分(例如C1q)之結合的突變。此類突變適用於降低效應功能。舉例而言，本發明之蛋白質可包括LALA (L234A及L235A)突變、LALAPA (L234A、L235A及P329A)突變、LALAPG (L234A、L235A及P329G)突變或LALEGAASPS (L234A、L235E、G237A、A330S及P331S)突變。
在一些實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白包括第一抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽及第二不同抗體IgG4或IgG1 Fc域多肽，其各自含有突變P329G或P329A。
在一些實施例中，第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有選自A330S及P331S之突變。
在一些實施例中，第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有突變A330S及P331S。
在某些實施例中，在本發明之異二聚體Fc融合蛋白之第一多肽中，多重次單元蛋白之第一次單元係藉由第一連接子與第一抗體Fc域多肽融合。在某些實施例中，在本發明之異二聚體Fc融合蛋白之第二多肽中，多重次單元蛋白之第二不同次單元係藉由第二連接子與第二抗體Fc域多肽融合。適合於此用途之連接子之胺基酸序列以標題「IgG4構築體」及「IgG1構築體」予以描述。適合用於第一及/或第二多肽中之額外連接子序列包括(但不限於)野生型IgG (例如人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4)鉸鏈序列及其突變形式。舉例而言，在某些實施例中，第一及第二連接子各自包含：胺基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO:280)，其中X為L或E；或SKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 281)，其中X為L或E。在某些實施例中，第一及第二連接子各自包含胺基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 282)或SKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 283)。在某些實施例中，第一及第二連接子各自包含胺基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 284)或SKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 285)。 血清半衰期
根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白具有適合於治療用途之藥物動力學特性。舉例而言，在某些實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白之血清半衰期為至少約50小時。在某些實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白之血清半衰期為至少約100小時。
在某些實施例中，在向個體靜脈內投與後50小時，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白之血清濃度為在向該個體投與後1小時本發明之蛋白質之血清濃度的至少10%。
在某些實施例中，根據本發明之異二聚體Fc融合蛋白的血清半衰期比不與Fc域多肽融合之多重次單元蛋白長至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在某些實施例中，根據本發明的包含多重次單元蛋白之蛋白質序列之異二聚體Fc融合蛋白的血清半衰期比不與Fc域多肽融合之多重次單元蛋白長至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。 腫瘤滯留
本發明之異二聚體Fc融合蛋白可視情況併有增強蛋白質在腫瘤位點之滯留的額外特徵。舉例而言，在本發明之某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白進一步包含蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域及/或玻尿酸結合域。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白進一步包含結合一或多種存在於腫瘤中(例如腫瘤細胞表面上、腫瘤中之細胞周圍基質中或腫瘤中之細胞外基質中)之蛋白聚糖(例如此項技術中已知之蛋白聚糖，例如如Lozzo等人, Matrix Bio (2015) 42:11-55；及Nikitovic等人, Frontiers in Endocrinology (2018) 9:69所揭示)。在某些實施例中，膠原蛋白結合域結合一或多種存在於腫瘤中(例如腫瘤細胞之表面上、腫瘤中之細胞周圍基質中或腫瘤中之細胞外基質中)的膠原蛋白。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白進一步包含結合於存在於腫瘤中之一或多種玻尿酸的玻尿酸結合域。此類異二聚體Fc融合蛋白增強腫瘤中之滯留且可以較低劑量及/或頻率向個體瘤內投與。
在某些實施例中，包含於異二聚體Fc融合蛋白中之蛋白聚糖結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中(例如腫瘤細胞之表面上、腫瘤中之細胞周圍基質中或腫瘤中之細胞外基質中)的蛋白聚糖。在某些實施例中，包含於異二聚體Fc融合蛋白中之膠原蛋白結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中(例如腫瘤細胞之表面上、腫瘤中之細胞周圍基質中或腫瘤中之細胞外基質中)的膠原蛋白。此類異二聚體Fc融合蛋白可在投與(例如靜脈內、皮下或經肺投與)之後於腫瘤中富集且具有增強之腫瘤滯留，從而允許以較低劑量及/或頻率投與。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含結合一或多中選自以下之蛋白聚糖的蛋白聚糖結合域：多配體蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖4 (CSPG4)、β蛋白聚糖、磷酸聚糖(phosphacan)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖、珍珠素、聚集蛋白(agrin)、膠原蛋白(例如膠原蛋白IX、XII、XV或XVIII)、透凝蛋白聚糖(hyalectan)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、多功能蛋白聚糖、神經蛋白聚糖(neurocan)、短蛋白聚糖及富含白胺酸之小蛋白聚糖(SLRP)。癌症中涉及之蛋白聚糖包括(但不限於)膠原蛋白、多配體蛋白聚糖(例如多配體蛋白聚糖-1或多配體蛋白聚糖-2)、絲甘蛋白聚糖、CSPG4、β蛋白聚糖、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(例如磷脂醯肌醇蛋白聚糖-1或磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3)、珍珠素、多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖及SLPR (例如核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、無孢蛋白聚糖、纖調蛋白聚糖及基膜聚糖)。因此，在某些實施例中，包含於異二聚體Fc融合蛋白中之蛋白聚糖結合域結合一或多種選自以下之蛋白聚糖：多配體蛋白聚糖(例如多配體蛋白聚糖-1或多配體蛋白聚糖-2)、絲甘蛋白聚糖、CSPG4、β蛋白聚糖、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(例如磷脂醯肌醇蛋白聚糖-1或磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3)、珍珠素、多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖及SLPR。在某些實施例中，包含於異二聚體Fc融合蛋白中之蛋白聚糖結合域結合一或多種選自核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、無孢蛋白聚糖、纖調蛋白聚糖及基膜聚糖之SLPR。
包含於異二聚體Fc融合蛋白中之蛋白聚糖結合域可為蛋白質(例如抗體或其抗原結合片段)、肽(例如蛋白聚糖結合蛋白或其變異體之一部分)、適體、小分子或其組合。蛋白聚糖結合域亦為此項技術中已知的。舉例而言，多配體蛋白聚糖結合域揭示於美國專利第6,566,489號、第8,647,828號及第10,124,038號；美國專利申請公開案第2009/0297479號；及PCT專利申請公開案第WO2018199176A1號中。CSPG4結合域揭示於美國專利第9,801,928號及第10,093,745號；及美國專利申請公開案第2016/0032007號、第2017/0342151號及第2018/0072811號中。β-聚糖結合域揭示於美國專利第7,455,839號中。磷脂醯肌醇蛋白聚糖結合域揭示於美國專利第7,919,086號、第7,776,329號、第8,680,247號、第8,388,937號、第9,260,492號、第9,394,364號、第9,790,267號、第9,522,940號及第9,409,994號；美國專利申請公開案第2004/0236080號、第2011/0123998號、第2018/0244805號、第2018/0230230號及第2018/0346592號；歐洲專利第2270509號；以及PCT專利申請公開案第WO2017053619A1號、第WO2018026533A1號、第WO2018165344A1號及第WO2018199318A1號中。珍珠素結合域揭示於美國專利第10,166,304號中。核心蛋白聚糖結合域揭示於美國專利第6,517,838號以及PCT專利申請公開案第WO2000021989A1號、第WO2000077041A2號及第WO2000078800A2號中。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含膠原蛋白結合域。膠原蛋白為具有至少28個在脊椎動物中鑑別之不同類型的一類蛋白質。各類型之膠原蛋白具有其唯一結構特徵及分佈模式，如Fang等人, Tumor Biol. (2014) 35:2871-82及Xiong等人, J. Cancer Metasta. Treat. (2016) 2:357-64中所揭示。癌症中涉及各種類型的膠原蛋白，包括(但不限於)Col3A1、Col5A2、Col6、Col7A1、Col15A1、Col19A1及Col22A1。膠原蛋白結合域可為蛋白質(例如抗體或其抗原結合片段)、肽(例如膠原蛋白結合蛋白或其變異體之一部分)、適體、小分子或其組合。膠原蛋白結合域為此項技術中已知的，且揭示於例如美國專利第5,788,966號、第5,587,360號、第5,851,794號、第5,741,670號、第5,849,701號、第6,288,214號、第6,387,663號、第6,908,994號、第7,169,902號、第7,488,792號、第7,820,401號、第8,956,612號、第8,642,728號及第8,906,649號，以及美國專利申請公開案第2007/0161062號、第2009/0142345號及第2012/0100106號中。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白進一步包含玻尿酸結合域。玻尿酸結合域可為蛋白質(例如抗體或其抗原結合片段)、肽(例如玻尿酸結合蛋白或其變異體之一部分)、適體、小分子或其組合。玻尿酸結合域為此項技術中已知的，且揭示於例如美國專利第6,864,235號、第8,192,744號、第8,044,022號、第8,163,498號、第8,034,630號、第9,217,016號、第9,795,686號及第9,751,919號，以及美國專利申請公開案第2002/0055488號及第2007/0259380號中。
蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域及/或玻尿酸結合域(若存在)可處於異二聚體Fc融合蛋白之任何位置。舉例而言，在其中IL-12次單元位於抗體Fc域多肽之N端的某些實施例中，如本文所揭示之蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域及/或玻尿酸結合域可與第一抗體Fc域多肽之C端及/或第二抗體Fc域多肽之C端融合。在其中IL-12次單元位於抗體Fc域多肽之C端的某些實施例中，如本文所揭示之蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域及/或玻尿酸結合域可與第一抗體Fc域多肽之N端及/或第二抗體Fc域多肽之N端融合。
蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域及/或玻尿酸結合域(若存在)可經由連接子與異二聚體Fc融合蛋白之其餘部分融合。在某些實施例中，蛋白聚糖結合域經由肽連接子與異二聚體Fc融合蛋白之其餘部分融合。在某些實施例中，肽連接子包括本文所揭示之間隔肽。II. 製備方法
本發明之蛋白質可使用熟習此項技術者熟知之重組DNA技術製備。舉例而言，可將編碼第一多肽之第一核酸序列選殖至第一表現載體中，該第一多肽包含與第一抗體Fc域多肽融合之多重次單元蛋白之次單元；可將編碼第二多肽之第二核酸序列選殖至第二表現載體中，該第二多肽包含與第二不同抗體Fc域多肽融合之多次單元之第二不同次單元；且第一及第二表現載體可一起穩定轉染至宿主細胞中以產生多聚體蛋白。
為達成蛋白質之最高產率，可探索第一及第二表現載體之不同比率以確定轉染至宿主細胞中之最佳比率。轉染後，可使用此項技術中已知之方法(諸如有限稀釋法、ELISA、FACS、顯微法或Clonepix)分離出單一純系以供用於細胞庫產生。
可在適合於生物反應器的條件下培養純系，按比例擴大且維持本發明蛋白質之表現。蛋白質可使用此項技術中已知之方法分離及純化，該等方法包括離心、深度過濾、細胞溶解、均質化、冷凍-解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用交換層析及混合模式層析。 III.     醫藥組合物
本發明之特徵亦在於含有有效量之本文所描述之蛋白質的醫藥組合物。組合物可經調配用於各種藥物遞送系統。為適當調配，組合物中亦可包括一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑。適用於本發明中之調配物見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.,第17版, 1985中。藥物遞送方法之簡要綜述參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。
本發明之靜脈內藥物遞送調配物可含於袋、筆或注射器中。在某些實施例中，袋可連接至包含管及/或針之通道。在某些實施例中，調配物可為凍乾調配物或液體調配物。在某些實施例中，調配物可經冷凍乾燥(凍乾)且含於約12至60個小瓶中。在某些實施例中，調配物可經冷凍乾燥且可在一個小瓶中含有約45 mg冷凍乾燥調配物。在某些實施例中，在一個小瓶中可含有約40 mg至約100 mg冷凍乾燥調配物。在某些實施例中，將來自12、27或45個小瓶的冷凍乾燥之調配物合併以在靜脈內藥物調配物中獲得治療劑量之蛋白質。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且儲存為約250毫克/小瓶至約1000毫克/小瓶。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且儲存為約600毫克/小瓶。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且儲存為約250毫克/小瓶。
本發明之異二聚體Fc融合蛋白可以液體水性醫藥調配物存在，該調配物包括含有效量之蛋白質的形成調配物之緩衝溶液。
此等組合物可藉由習知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可經封裝以按原樣使用，或經凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常將介於3與11之間，更佳介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳介於7與8之間，諸如7至7.5。呈固體形式之所得組合物可以多個單一劑量單元封裝，各單元含有固定量之一或多種上文所提及之藥劑。呈固體形式之組合物亦可以靈活的數量封裝於容器中。
在某些實施例中，本發明提供一種具有延長儲存期限之調配物，其包括本發明之異二聚體Fc融合蛋白與甘露糖醇、單水合檸檬酸、檸檬酸鈉、二水合磷酸二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水及氫氧化鈉之組合。
在某些實施例中，製備水性調配物，其包括含有本發明之異二聚體Fc融合蛋白之pH緩衝溶液。本發明之緩衝液可具有範圍為約4至約8，例如約4.5至約6.0或約4.8至約5.5之pH或可具有約5.0至約5.2之pH。預期在上述pH值中間之範圍亦為本發明之一部分。舉例而言，預期包括使用任何上述值之組合作為上限及/或下限之值範圍。將pH控制在此範圍內之緩衝液之實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、丁二酸鹽(諸如丁二酸鈉)、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。
在某些實施例中，調配物包括含有檸檬酸鹽及磷酸鹽以將pH維持於約4至約8之範圍內的緩衝液系統。在某些實施例中，pH範圍可為約4.5至約6.0，或約pH 4.8至約5.5，或在約5.0至約5.2之pH範圍內。在某些實施例中，該緩衝液系統包括單水合檸檬酸、檸檬酸鈉、二水合磷酸二鈉及/或二水合磷酸二氫鈉。在某些實施例中，該緩衝液系統包括約1.3 mg/mL檸檬酸(例如1.305 mg/mL)、約0.3 mg/mL檸檬酸鈉(例如0.305 mg/mL)、約1.5 mg/mL二水合磷酸二鈉(例如1.53 mg/mL)、約0.9 mg/mL二水合磷酸二氫鈉(例如0.86)及約6.2 mg/mL氯化鈉(例如6.165 mg/mL)。在某些實施例中，該緩衝液系統包括1至1.5 mg/mL檸檬酸、0.25至0.5 mg/mL檸檬酸鈉、1.25至1.75 mg/mL二水合磷酸二鈉、0.7至1.1 mg/mL二水合磷酸二氫鈉及6.0至6.4 mg/mL氯化鈉。在某些實施例中，調配物之pH係用氫氧化鈉調整。
調配物中亦可包括充當張力劑且可使抗體穩定的多元醇。添加至調配物中的多元醇之量可根據調配物之所需等張性而改變。在某些實施例中，水性調配物可具有等張性。多元醇添加量亦可根據多元醇之分子量來改變。舉例而言，相較於雙醣(諸如海藻糖)，可添加較低量之單醣(例如甘露糖醇)。在某些實施例中，可作為張力劑用於調配物中之多元醇為甘露糖醇。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約5至約20 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約7.5至15 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇之濃度可為約10至14 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇之濃度可為約12 mg/mL。在某些實施例中，調配物中可包括多元醇山梨糖醇。
亦可將清潔劑或界面活性劑添加至調配物中。例示性清潔劑包括非離子清潔劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。清潔劑之添加量使得其減少所調配之抗體之聚集及/或使在調配物中顆粒之形成減到最少及/或減少吸附。在某些實施例中，調配物可包括界面活性劑，其為聚山梨醇酯。在某些實施例中，調配物可含有清潔劑聚山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80為用於描述聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸酯(參見Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf,第4版, 1996)。在某些實施例中，調配物可含有約0.1 mg/mL與約10 mg/mL之間，或在約0.5 mg/mL與約5 mg/mL之間的聚山梨醇酯80。在某些實施例中，調配物中可添加約0.1%聚山梨醇酯80。
在某些實施例中，本發明之蛋白產物經調配為液體調配物。液體調配物可以10 mg/mL濃度提供於USP/Ph Eur I型50R小瓶中，該小瓶用橡膠塞封閉且用鋁褶密封蓋密封。該橡膠塞可由符合USP及Ph Eur之彈性體製成。在某些實施例中，小瓶可填充有61.2 mL蛋白產物溶液以便能萃取出60 mL體積。在某些實施例中，液體調配物可用0.9%鹽水溶液稀釋。
在某些實施例中，本發明之液體調配物可與穩定含量之糖組合製備為10 mg/mL濃度溶液。在某些實施例中，液體調配物可在水性載劑中製備。在某些實施例中，穩定劑可以不超過可引起非靜脈內投與所需或不適合靜脈內投與之黏度的量添加。在某些實施例中，糖可為雙醣，例如蔗糖。在某些實施例中，液體調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑及防腐劑中之一或多者。
在某些實施例中，液體調配物之pH可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，鹼可為氫氧化鈉。
除聚集之外，去醯胺化為肽及蛋白質在醱酵、收穫/細胞澄清、純化、原料藥/藥品儲存期間及在樣本分析期間可能產生的常見產物變異體。去醯胺化為蛋白質損失NH3 ，從而形成可經歷水解的丁二醯亞胺中間物。丁二醯亞胺中間物引起親本肽質量減少17道爾頓(dalton)。後續水解引起質量增加18道爾頓。丁二醯亞胺中間物因在水性條件下不穩定而難以分離。因此，去醯胺化通常可偵測為質量增加1道爾頓。天冬醯胺之去醯胺化產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響去醯胺化速率之參數包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構形及三級結構。與肽鏈中之Asn相鄰之胺基酸殘基影響去醯胺化速率。蛋白質序列中在Asn之後的Gly及Ser使得更易於去醯胺化。
在某些實施例中，本發明之液體調配物可在防止蛋白產物去胺基的pH及濕度條件下保存。
本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受(例如對於向人類投與而言安全且無毒)且適用於製備液體調配物的水性載劑。說明性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之產生。
在特定情況下，諸如當患者移植之後在醫院經由IV途徑接受所有藥物時，靜脈內(IV)調配物可為較佳投與途徑。在某些實施例中，液體調配物在投與之前用0.9%氯化鈉溶液稀釋。在某些實施例中，用於注射之經稀釋藥品具有等張性且適合於藉由靜脈內輸注來投與。
在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM至200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液為醫藥學上可接受的，且衍生自各種已知酸(無機及有機酸)與「形成鹼」之金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下，鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之產生。
本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受(例如對於向人類投與而言安全且無毒)且適用於製備液體調配物的水性載劑。說明性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
本發明之蛋白質可存在於包括蛋白質及凍乾保護劑之凍乾調配物中。凍乾保護劑可為糖，例如雙醣。在某些實施例中，凍乾保護劑可為蔗糖或麥芽糖。凍乾調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑、增積劑及/或防腐劑中之一或多者。
適用於穩定凍乾藥品的蔗糖或麥芽糖之量可為至少1:2之重量比的蛋白質比蔗糖或麥芽糖。在某些實施例中，蛋白質與蔗糖或麥芽糖之重量比可為1:2至1:5。
在某些實施例中，調配物在凍乾之前的pH可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，醫藥學上可接受之鹼可為氫氧化鈉。
在凍乾之前，含有本發明之蛋白質之溶液的pH可在6至約8之間調整。在某些實施例中，凍乾藥品之pH範圍可為7至8。
在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM至200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液為醫藥學上可接受的，且衍生自各種已知酸(無機及有機酸)與「形成鹼」之金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下，鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。
在某些實施例中，可添加「增積劑」。「增積劑」為使凍乾混合物的質量增加且促成凍乾塊之物理結構(例如有助於產生維持開放式孔隙結構的基本上均一之凍乾塊)的化合物。說明性增積劑包括甘露糖醇、甘胺酸、聚乙二醇及山梨糖醇。本發明之凍乾調配物可含有此類增積劑。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之產生。
在某些實施例中，凍乾藥品可由水性載劑構成。本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受(例如對於向人類投與而言安全且無毒)且適用於在凍乾之後製備液體調配物的水性載劑。說明性稀釋劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
在某些實施例中，本發明之凍乾藥品係用無菌注射用水、USP (SWFI)或USP級0.9%氯化鈉注射液復原。在復原期間，將凍乾粉末溶解成溶液。
在某些實施例中，本發明之凍乾蛋白產物用約4.5 mL注射用水復原且用0.9%鹽水溶液(氯化鈉溶液)稀釋。
可改變本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水準以便獲得一定量之活性成分，該量之活性成分對於特定患者、組合物及投與模式有效地達成所需治療反應，而對患者無毒。
對於各患者而言，特定劑量可為均一劑量，例如50至5000 mg蛋白質。或者，可根據患者之大致體重或表面積定製患者之劑量。確定適當劑量之其他因素可包括待治療或預防之疾病或病況、疾病之嚴重程度、投與途徑以及患者之年齡、性別及醫學病況。熟習此項技術者依常規方式，尤其根據劑量資訊及本文所揭示之分析，進一步優化為確定適當治療劑量所必需的計算。亦可經由使用用於確定劑量的已知分析，結合使用適當的劑量-反應資料來確定劑量。可在監測疾病進展時調整個別患者的劑量。可量測患者中之可靶向構築體或複合物之血液含量以瞭解是否需要調整劑量以達到或維持有效濃度。藥物基因組學可用於確定哪些可靶向之構築體及/或複合物及其劑量最可能對給定個體有效(Schmitz等人,Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001；Steimer等人,Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。
一般而言，基於體重之劑量為每公斤體重約0.01 μg至約100 mg，諸如每公斤體重約0.01 μg至約100 mg、每公斤體重約0.01 μg至約50 mg、每公斤體重約0.01 μg至約10 mg、每公斤體重約0.01 μg至約1 mg、每公斤體重約0.01 μg至約100 μg、每公斤體重約0.01 μg至約50 μg、每公斤體重約0.01 μg至約10 μg、每公斤體重約0.01 μg至約1 μg、每公斤體重約0.01 μg至約0.1 μg、每公斤體重約0.1 μg至約100 mg、每公斤體重約0.1 μg至約50 mg、每公斤體重約0.1 μg至約10 mg、每公斤體重約0.1 μg至約1 mg、每公斤體重約0.1 μg至約100 μg、每公斤體重約0.1 μg至約10 μg、每公斤體重約0.1 μg至約1 μg、每公斤體重約1 μg至約100 mg、每公斤體重約1 μg至約50 mg、每公斤體重約1 μg至約10 mg、每公斤體重約1 μg至約1 mg、每公斤體重約1 μg至約100 μg、每公斤體重約1 μg至約50 μg、每公斤體重約1 μg至約10 μg、每公斤體重約10 μg至約100 mg、每公斤體重約10 μg至約50 mg、每公斤體重約10 μg至約10 mg、每公斤體重約10 μg至約1 mg、每公斤體重約10 μg至約100 μg、每公斤體重約10 μg至約50 μg、每公斤體重約50 μg至約100 mg、每公斤體重約50 μg至約50 mg、每公斤體重約50 μg至約10 mg、每公斤體重約50 μg至約1 mg、每公斤體重約50 μg至約100 μg、每公斤體重約100 μg至約100 mg、每公斤體重約100 μg至約50 mg、每公斤體重約100 μg至約10 mg、每公斤體重約100 μg至約1 mg、每公斤體重約1 mg至約100 mg、每公斤體重約1 mg至約50 mg、每公斤體重約1 mg至約10 mg、每公斤體重約10 mg至約100 mg、每公斤體重約10 mg至約50 mg、每公斤體重約50 mg至約100 mg。
劑量可每日、每週、每月或每年給與一次或多於一次或甚至每2年至20年給與一次。一般熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中之可靶向構築體或複合物之滯留時間及濃度量測值估計給藥之重複率。本發明之投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內、經由導管灌注或直接病灶內注射。此可每日投與一次或多於一次、每週投與一次或多於一次、每月投與一次或多於一次及每年投與一次或多於一次。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係瘤內投與。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以比全身性投與時低之劑量或頻率瘤內投與。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係在投與局部麻醉劑後瘤內投與。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係根據直接觸診腫瘤塊瘤內投與。 IV. 治療性應用
本發明提供使用本文所描述之異二聚體Fc融合結合蛋白及/或本文所描述之醫藥組合物治療癌症的方法。方法可用於藉由向有需要之患者投與有效量的本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白來治療各種癌症。在一些實施例中，藉由本文揭示之方法治療的癌症為局部晚期惡性腫瘤。在一些實施例中，局部晚期惡性腫瘤可完全切除。在一些實施例中，局部晚期惡性腫瘤已完全切除，且在切除後提供治療。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)用於以單一療法形式治療晚期惡性腫瘤。在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係用作用於嚴重感染性疾病之有效免疫療法的佐劑。在一些實施例中，用於治療的本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係用作用於預防性疫苗接種之佐劑。在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白係用於在放射線療法後治療骨髓抑制。
本發明亦提供一種降低造血毒性之方法。造血毒性可由遺傳、感染或環境原因(包括但不限於輻射及化學療法)引起。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種治療與輻射(例如電離輻射、α輻射、β輻射、γ輻射、X輻射或中子輻射)相關之疾病或病症的方法。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種在放射線療法後治療骨髓抑制的方法，該方法包含向有需要之患者投與有效量的本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白或調配物。在某些實施例中，放射線療法之劑量為至少1、5、10、15或20 Gy。在某些實施例中，放射線療法引起選自由以下組成之群的系統、器官或組織之損傷：骨髓、淋巴系統、免疫系統、黏膜組織、黏膜免疫系統、胃腸系統、心血管系統、神經系統、生殖器官、前列腺、卵巢、肺、腎臟、皮膚及大腦。在某些實施例中，本發明之方法減少損傷。
本文所提供之方法適用於治療由輻射引起之骨髓抑制。因此，在某些實施例中，本發明提供一種治療在意外暴露於輻射之情形下發生之骨髓抑制的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量的本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白或調配物。
在某些實施例中，本發明提供一種治療急性輻射症候群(ARS)之方法，該方法包含向有需要之患者投與有效量的本文所描述之異二聚體Fc融合蛋白或調配物。ARS包括(但不限於)造血性輻射症候群、胃腸性輻射症候群、神經血管性輻射症候群及皮膚輻射症候群。舉例而言，造血性輻射症候群至少部分由造血幹細胞池之耗盡引起，且顯示淋巴球減少症及粒細胞減少症之病徵。胃腸性症候群至少部分由位於腺管中之幹細胞及祖細胞損傷且無法替換絨毛表面之細胞而引起，且顯示水瀉、脫水、電解質損耗、胃腸出血及穿孔之病徵。在某些實施例中，本文提供之治療方法係在ARS之初期進行。初期為急性疾病之初始階段，其特徵在於通常在暴露於輻射後1至3天內出現噁心、嘔吐、食慾不振、發熱、頭痛及/或早期皮膚紅斑之症狀。在某些實施例中，本文提供之治療方法係在ARS之潛伏期進行。潛伏期為特徵在於在實驗室測試中症狀改善但展現淋巴球減少症及粒細胞減少症，且可視暴露劑量持續數小時至數周的階段。初期或潛伏期之治療可減緩受影響系統、器官及/或組織中之症候群之發展。在某些實施例中，本文提供之治療方法係在ARS之明顯疾病期進行。此階段之治療仍可促進自ARS之恢復。
本發明亦提供一種增加免疫細胞之存活率、增殖、分化及/或活性的方法，該方法包含使免疫細胞與本文所揭示之異二聚體Fc融合蛋白或調配物接觸。在某些實施例中，免疫細胞為T細胞(例如CD4+ T細胞)。在某些實施例中，免疫細胞為NK細胞。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係用於治療經診斷患有癌症之個體。在某些實施例中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、間皮瘤、黑素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、胰臟癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腦癌、肉瘤、神經母細胞瘤或頭頸部癌細胞鱗狀細胞癌。在某些實施例中，癌症為結腸癌。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以單一療法形式向經診斷患有結腸癌之個體投與。在某些實施例中，癌症為黑素瘤。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以單一療法形式向經診斷患有黑素瘤之個體投與。在某些實施例中，癌症為乳癌。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以單一療法形式向經診斷患有乳癌之個體投與。
在某些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含向患者僅投與單一劑量之異二聚體IL12-Fc融合蛋白。在某些實施例中，該單一劑量係足以誘導對癌症之完全反應的量。在某些實施例中，該單一劑量係足以延遲或阻止癌症復發之量。
在某些實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含向患者僅投與單一劑量之異二聚體IL12-Fc融合蛋白或包含該異二聚體IL12-Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的調配物，該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。
在某些實施例中，異二聚體IL12-Fc融合蛋白或包含該異二聚體IL12-Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的調配物之單一劑量係足以誘導對癌症之完全反應的量，該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。在某些實施例中，該單一劑量係足以延遲或阻止癌症復發之量。在某些實施例中，完全治療之癌症(亦即，在用本發明之IL-12-Fc融合蛋白治療後完全反應)之復發經延遲或預防6個月至72個月或更多個月(例如6個月、12個月、24個月、36個月、48個月、60個月、72個月、84個月或96個月)。 V.  組合療法
本發明之另一態樣提供組合療法。本文所描述之多重特異性結合蛋白可與額外治療劑組合使用以治療癌症。
在某些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係以組合療法形式投與，以治療經診斷患有癌症之個體。在某些實施例中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、間皮瘤、黑素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、胰臟癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腦癌、肉瘤、神經母細胞瘤或頭頸部癌細胞鱗狀細胞癌。在某些實施例中，癌症為結腸癌。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以組合療法形式向經診斷患有結腸癌之個體投與。在某些實施例中，癌症為黑素瘤。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以組合療法形式向經診斷患有黑素瘤之個體投與。在某些實施例中，癌症為乳癌。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係以組合療法形式向經診斷患有乳癌之個體投與。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係與選自以下之另一治療劑組合用於治療晚期惡性腫瘤：細胞毒性化學療法；放射線療法；靶向參與抗腫瘤免疫反應之分子(諸如CTLA-4、PD-1、PD-L1或TGF-β)之抗體；藉由對腫瘤相關抗原之ADCC而起作用之抗體；結合NKG2D、CD16及腫瘤相關抗原之多重特異性抗體，其視情況與靶向PD-1或PD-L1之抗體組合投與；個體化癌症疫苗；溶瘤癌症疫苗；及與靶向PD-1或PD-L1之抗體組合投與的個體化疫苗。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)係與包括(但不限於)以下之另一療法組合用於治療惡性腫瘤(例如晚期惡性腫瘤)：NK靶向療法(例如CAR-NK療法)、抗體療法、檢查點抑制劑療法、額外細胞介素療法、先天性免疫系統促效劑療法、化學療法、目標藥劑療法、放射線療法、授受性NK療法、幹細胞移植(SCT)療法、促效抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法、T細胞受體(TCR)工程改造療法、多重特異性結合蛋白(TriNKET)、誘導細胞老化之藥劑及疫苗及/或溶瘤病毒療法。在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白係與兩個或更多個選自以下之額外療法組合用於治療惡性腫瘤(例如晚期惡性腫瘤)：NK靶向療法(例如CAR-NK療法)、抗體療法、檢查點抑制劑療法、額外細胞介素療法、先天性免疫系統促效劑療法、化學療法、目標藥劑療法、放射線療法、授受性NK療法、幹細胞移植(SCT)療法、促效抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法、T細胞受體(TCR)工程改造療法、多重特異性結合蛋白(TriNKET)、誘導細胞老化之藥劑及疫苗及/或溶瘤病毒療法。
在一些實施例中，本發明之異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12之異二聚體Fc融合蛋白)係與癌症疫苗或靶向PD-1或PD-L1之抗體組合用於治療可完全切除之局部晚期惡性腫瘤。
本發明之蛋白質亦可用作手術移除原發病灶的佐劑。
可選擇多重特異性結合蛋白及額外治療劑之量及相對投與時序以便達成所需的組合治療作用。舉例而言，當向需要此類投與之患者投與組合療法時，組合或包含治療劑之醫藥組合物或組合物中的治療劑可以任何次序(諸如依序、並行、一起、同時及其類似方式)投與。此外，舉例而言，可在額外治療劑發揮其預防或治療作用的時間期間投與多重特異性結合蛋白，或反之亦然。
如本文所揭示，本發明之方法包括共投與異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)與額外治療劑之組合。如本文所揭示，本發明之方法包括共投與包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白與額外治療劑之組合。
共投與涵蓋其中同時給與異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)及額外治療劑的方法，其中依序給與異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑的方法，及其中間歇性地或連續地或者以如下任意之組合給與異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑中之任一者或兩者的方法：同時、依序、間歇性及/或連續地。熟習此項技術者將認識到，間歇投與不一定與依序相同，因為間歇亦包括首先投與一藥劑及隨後在稍後之時間再次投與完全相同之藥劑。此外，熟習此項技術者應理解，在一些實施例中，間歇投與亦涵蓋依序投與，因為間歇投與確實包括第一次投與一藥劑與在再次投與第一藥劑之前投與不同藥劑之間的間斷。此外，熟習此項技術者亦將瞭解，連續投與可藉由包括靜脈內滴液(靜脈內輸注)或饋送管等多種途徑實現。
此外，且以更通用方式，術語「共投與」涵蓋在任何時間框期間使對個體的異二聚體Fc融合蛋白之個別投與及額外治療劑之個別投與重疊的任何及所有方法。
向個體投與異二聚體Fc融合蛋白或額外治療劑之頻率在此項技術中稱為Qnd或qnd，其中n為相繼投與彼藥劑之數天中的頻率。舉例而言，Q3d將為每三(3)天投與一次藥劑。在某些實施例中，該方法包含如下向個體投與異二聚體Fc融合蛋白及/或額外治療劑中之任一者或兩者或其任何組合：Qld、Q2d、Q3d、Q4d、Q5d、Q6d、Q7d、Q8d、Q9d、Ql0d、Q14d、Q21d、Q28d、Q30d、Q90d、Q120d、Q240d或Q365d。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及/或額外治療劑中之任一者或兩者係間歇性地投與。在某些實施例中，該方法包括以如下方式向個體投與異二聚體Fc融合蛋白或額外治療劑中之任一者或兩者：投與之間延遲至少十(10)分鐘、十五(15)分鐘、二十(20)分鐘、三十(30)分鐘、四十(40)分鐘、六十(60)分鐘、兩(2)個小時、三(3)個小時、四(4)個小時、六(6)個小時、八(8)個小時、十(10)個小時、十二(12)個小時、十四(14)個小時、十八(18)個小時、二十四(24)個小時、三十六(36)個小時、四十八(48)個小時、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天、七(7)天、八(8)天、九(9)天、十(10)天、十一(11)天、十二(12)天、十三(13)天、十四(14)天、三(3)週或四(4)週。在某些實施例中，具有延遲之投與遵循如下模式，其中連續地投與異二聚體Fc融合蛋白及/或額外治療劑中之一者或兩者或其任何組合達約十(10)分鐘至約三百六十五(365)天之給定時間段，隨後不投與達約十(10)分鐘至約三十(30)天之給定時間段。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及/或額外治療劑中之任一者或兩者係間歇性地投與，而另一者連續地給與。在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白與第二有效量之額外治療劑之組合係依序投與的。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑係同時投與。在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白與第二有效量之額外治療劑之組合係依序投與的。在此類實施例中，該組合亦稱為「共投與」，因為該術語包括個體暴露於組合中之兩種組分的任何及所有方法。然而，此類實施例不限於僅以一種調配物或組合物給出之組合。可能某些濃度之異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑更有利於以某些時間間隔遞送，因而，第一有效量及第二有效量可根據所投與之調配物而改變。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑係同時或依序投與。在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在第二有效量之額外治療劑之後依序投與。在某些實施例中，第二有效量之額外治療劑係在第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白之後依序投與。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白(例如包含IL-12次單元之異二聚體Fc融合蛋白)及額外治療劑之組合係於一種調配物中投與。在某些實施例中，該組合係在兩(2)種組合物中投與，其中第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在與第二有效量之額外治療劑之調配物分開的調配物中投與。在某些實施例中，該組合係在兩(2)種組合物中投與，其中第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在與第二有效量之額外治療劑之調配物分開的調配物中投與。在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在第二有效量之額外治療劑之後依序投與。在某些實施例中，第二有效量之額外治療劑係在第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白之後依序投與。在某些實施例中，投與異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑；且隨後持續至少二十四(24)個小時間歇性地投與異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑兩者。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑係以不重疊之每隔一天時程投與。
在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在第二有效量之額外治療劑之後不少於四(4)小時投與。在某些實施例中，第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白係在第二有效量之額外治療劑之後不少於十(10)分鐘、不少於十五(15)分鐘、不少於二十(20)分鐘、不少於三十(30)分鐘、不少於四十(40)分鐘、不少於六十(60)分鐘、不少於一(1)個小時、不少於兩(2)個小時、不少於四(4)個小時、不少於六(6)個小時、不少於八(8)個小時、不少於十(10)個小時、不少於十二(12)個小時、不少於二十四(24)個小時、不少於兩(2)天、不少於四(4)天、不少於六(6)天、不少於八(8)天、不少於十(10)天、不少於十二(12)天、不少於十四(14)天、不少於二十一(21)天或不少於三十(30)天投與。在某些實施例中，第二有效量之額外治療劑係在第一有效量之異二聚體Fc融合蛋白之後不少於十(10)分鐘、不少於十五(15)分鐘、不少於二十(20)分鐘、不少於三十(30)分鐘、不少於四十(40)分鐘、不少於六十(60)分鐘、不少於一(1)個小時、不少於兩(2)個小時、不少於四(4)個小時、不少於六(6)個小時、不少於八(8)個小時、不少於十(10)個小時、不少於十二(12)個小時、不少於二十四(24)個小時、不少於兩(2)天、不少於四(4)天、不少於六(6)天、不少於八(8)天、不少於十(10)天、不少於十二(12)天、不少於十四(14)天、不少於二十一(21)天或不少於三十(30)天投與。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白及/或額外治療劑中之任一者或兩者係藉由選自由以下組成之群的途徑投與：靜脈內、皮下、皮膚、經口、肌肉內及腹膜內。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白、及/或額外治療劑中之任一者或兩者係藉由靜脈內投與。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白、及/或額外治療劑中之任一者或兩者或其任何組合係經口投與。
熟習此項技術者應理解，本發明之單位劑型可以相同或不同物理形式，亦即經由膠囊或錠劑經口及/或藉由液體經由靜脈內輸注等等投與。此外，用於各投與之單位劑型可因特定投與途徑而不同。異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑中之任一者或兩者、組合可存在若干不同劑型。由於不同醫學病況可使得不同投與途徑顯得適當，故本文所描述之組合之相同組分可在組成及實體形式方面完全類似，但可能需要以不同方式且可能在不同時間給與以緩解病況。舉例而言，諸如持續性噁心，尤其伴隨嘔吐之病況可使得難以使用口服劑型，且在此情況下，可能有必要投與另一單位劑型，可能是甚至與先前或後來替代地或同樣地藉由吸入、經頰、舌下或栓劑途徑使用之其他劑型相同的劑型。特定劑型可為異二聚體Fc融合蛋白及額外治療劑之某些組合所需，因為可能存在關於如化學穩定性或藥物動力學之各種因素的問題。
以上說明描述本發明之多個態樣及實施例。本專利申請案特別涵蓋態樣及實施例之所有組合及排列。NK 靶向療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與NK靶向療法組合。舉例而言，在一實施例中，異二聚體Fc融合蛋白與靶向NKp46之治療劑共投與。在某些實施例中，靶向NKp46之治療劑亦結合CD16、一或多種腫瘤相關抗原或其組合。靶向NKp46之例示性治療劑更詳細地描述於出於所有目的以引用之方式併入本文中的美國申請案第US20170198038A1號中。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法與二特異性及三特異性殺手接合子(BiKE及TriKE)療法(包括靶向NK細胞之BiKE及TriKE療法)組合。BiKE及TriKE由所關注之各抗體之可變區的單一重(VH)鏈及輕(VL)鏈構築。VH及VL域係藉由短可撓性多肽連接子接合以防止解離。BiKE及TriKE更詳細地描述於出於所有目的以引用之方式併入本文中的美國申請案第US20180282386A1號及第US20180258396A1號中。BiKE及TriKE可含有對NK細胞具有特異性之結合域。
在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有高危骨髓發育不良症候群、急性骨髓白血病、全身性肥大細胞增多症或肥大細胞白血病的個體。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以具有3個每週治療區塊之單一療程投與。在某些實施例中，治療區塊包含4次相連之24小時連續輸注(大致96小時)繼之以72小時之中斷。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以5微克/公斤/天、10微克/公斤/天、25微克/公斤/天、50微克/公斤/天、100微克/公斤/天、或200微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少5微克/公斤/天、至少10微克/公斤/天、至少25微克/公斤/天、至少50微克/公斤/天、至少100微克/公斤/天或至少200微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少1微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少5微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少200微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少500微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以至少1000微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以200微克/公斤/天或更低之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以500微克/公斤/天或更低之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以1000微克/公斤/天或更低之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以1至200微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以5至200微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以1至500微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以1至1000微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以5至500微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以5至1000微克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以最大耐受劑量投與。在某些實施例中，BiKE及TriKE療法係以小於最大耐受之劑量投與。多重特異性結合蛋白 ( 「 TriNKET 」 ) 療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與包含多重特異性結合蛋白之療法組合以治療已知或懷疑患有癌症之個體，該多重特異性結合蛋白包含：(a)結合NKG2D之第一抗原結合位點；(b)結合腫瘤相關抗原之第二抗原結合位點；及(c)抗體Fc域或其足以結合CD16之部分，或結合CD16之第三抗原結合位點(「TriNKET」)(例如，包含國際公開案第WO 2019/157332號中所描述之各種NKG2D結合子及腫瘤相關抗原結合位點的多重特異性結合蛋白，該公開案與其中描述之多重特異性結合蛋白相關之內容以引用之方式併入本文中)。例示性腫瘤相關抗原包括(但不限於)HER2、CD20、CD33、B細胞成熟抗原(BCMA)、EpCAM、CD2、CD19、CD25、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、CLL1/CLEC12A、FLT3、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4、HLA-E及PD-L1。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與包含基於體重之一劑量的多重特異性結合蛋白的療法組合。舉例而言，多重特異性結合蛋白基於體重之劑量為每公斤體重約0.01 μg至約100 mg，諸如每公斤體重約0.01 μg至約100 mg、每公斤體重約0.01 μg至約50 mg、每公斤體重約0.01 μg至約10 mg、每公斤體重約0.01 μg至約1 mg、每公斤體重約0.01 μg至約100 μg、每公斤體重約0.01 μg至約50 μg、每公斤體重約0.01 μg至約10 μg、每公斤體重約0.01 μg至約1 μg、每公斤體重約0.01 μg至約0.1 μg、每公斤體重約0.1 μg至約100 mg、每公斤體重約0.1 μg至約50 mg、每公斤體重約0.1 μg至約10 mg、每公斤體重約0.1 μg至約1 mg、每公斤體重約0.1 μg至約100 μg、每公斤體重約0.1 μg至約10 μg、每公斤體重約0.1 μg至約1 μg、每公斤體重約1 μg至約100 mg、每公斤體重約1 μg至約50 mg、每公斤體重約1 μg至約10 mg、每公斤體重約1 μg至約1 mg、每公斤體重約1 μg至約100 μg、每公斤體重約1 μg至約50 μg、每公斤體重約1 μg至約10 μg、每公斤體重約10 μg至約100 mg、每公斤體重約10 μg至約50 mg、每公斤體重約10 μg至約10 mg、每公斤體重約10 μg至約1 mg、每公斤體重約10 μg至約100 μg、每公斤體重約10 μg至約50 μg、每公斤體重約50 μg至約100 mg、每公斤體重約50 μg至約50 mg、每公斤體重約50 μg至約10 mg、每公斤體重約50 μg至約1 mg、每公斤體重約50 μg至約100 μg、每公斤體重約100 μg至約100 mg、每公斤體重約100 μg至約50 mg、每公斤體重約100 μg至約10 mg、每公斤體重約100 μg至約1 mg、每公斤體重約1 mg至約100 mg、每公斤體重約1 mg至約50 mg、每公斤體重約1 mg至約10 mg、每公斤體重約10 mg至約100 mg、每公斤體重約10 mg至約50 mg、每公斤體重約50 mg至約100 mg。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法與包含每日、每週、每月或每年給與一次或多於一次或甚至每2至20年給與一次的各劑量之多重特異性結合蛋白的療法組合。一般熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中之可靶向構築體或複合物之滯留時間及濃度量測值估計給藥之重複率。多重特異性結合蛋白之投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內、經由導管灌注或直接病灶內注射。此可每日投與一次或多於一次、每週投與一次或多於一次、每月投與一次或多於一次及每年投與一次或多於一次。嵌合抗原受體 (CAR) 療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與CAR療法組合。術語「嵌合抗原受體」或替代地「CAR」係指一種重組多肽構築體，其至少包含胞外抗原結合域、跨膜域及包含來源於刺激分子之功能信號傳導域的胞內信號傳導域(在本文中亦稱作「初始信號傳導域」)。
相應地，在某些實施例中，CAR包含結合腫瘤相關抗原之胞外抗原結合位點、跨膜域及包含初始信號傳導域之胞內信號傳導域。在某些實施例中，CAR進一步包含一或多個來源於至少一個共刺激分子之功能信號傳導域(亦稱作「共刺激信號傳導域」)。
在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含作為胞外抗原結合域的包含重鏈可變域及輕鏈可變域的腫瘤相關抗原結合域(例如腫瘤相關抗原結合scFv域)、跨膜域及包含初始信號傳導域之胞內信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含作為胞外抗原結合域的包含重鏈可變域及輕鏈可變域的腫瘤相關抗原結合域(例如腫瘤相關抗原結合scFv域)、跨膜域以及包含共刺激信號傳導域及初始信號傳導域的胞內信號傳導域。在某些實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含作為胞外抗原結合域的包含重鏈可變域及輕鏈可變域的腫瘤相關抗原結合域(例如腫瘤相關抗原結合scFv域)、跨膜域以及包含兩個共刺激信號傳導域及一初始信號傳導域的胞內信號傳導域。在一個實施例中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含作為胞外抗原結合域的包含重鏈可變域及輕鏈可變域的腫瘤相關抗原結合域、跨膜域以及包含至少兩個共刺激信號傳導域及一初始信號傳導域之胞內信號傳導域。
就跨膜域而言，在各種實施例中，CAR經設計包含與CAR之胞外域融合的跨膜域。在一個實施例中，跨膜域為與CAR中之一個域天然締合的域。在一些情況下，跨膜域可藉由胺基酸取代選擇或修飾以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，從而將與受體複合物之其他成員的相互作用減至最少。在另一個實施例中，跨膜域能夠與另一CAR在CAR T細胞表面上發生均二聚化。在另一個實施例中，跨膜域之胺基酸序列可經修飾或經取代以便將與同一CAR T細胞中存在之原生結合搭配物之結合域的相互作用減至最少。
跨膜域可來源於天然存在的任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個實施例中，每當CAR已結合至目標時，跨膜區能夠向胞內域傳導信號。在一些實施例中，跨膜域包含一或多種選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜區：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一些實施例中，跨膜域包含一或多種選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D及NKG2C。
胞外腫瘤相關抗原結合域(例如腫瘤相關抗原結合scFv域)可藉由鉸鏈區連接至跨膜域。可使用各種鉸鏈，包括(但不限於)人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、Gly-Ser連接子、(G4 S)4 連接子、KIR2DS2鉸鏈及CD8α鉸鏈。
CAR中之胞內信號傳導域負責活化其中已置有CAR之免疫細胞的至少一種特殊功能(例如T細胞的溶胞活性或輔助活性，包括分泌細胞介素)。因此，如本文所用，術語「胞內信號傳導域」係指蛋白質的一部分，其轉導效應功能信號且導引細胞執行特殊功能。雖然通常可使用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，無需使用整條鏈。就使用胞內信號傳導域之截短部分而言，此類截短部分只要轉導效應功能信號即可用於替代完整鏈。術語胞內信號傳導域因此意欲包括任何足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域的截短部分。
CAR之胞內信號傳導域包含初始信號傳導域(亦即，來源於刺激分子之功能信號傳導域)及一或多個共刺激信號傳導域(亦即，來源於至少一種共刺激分子之功能信號傳導域)。
如本文所用，術語「刺激分子」係指由免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、B細胞)表現之分子，該分子提供的細胞質信號傳導序列以刺激方式調控免疫細胞之活化以用於免疫細胞信號傳導路徑之至少一些態樣。在一個實施例中，信號為初始信號，其起始於例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子的結合，且引起T細胞反應的介導，包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似者。
以刺激方式起作用之初始信號傳導域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。含有特別適用於本發明中之細胞質信號傳導序列的ITAM之實例包括來源於CD3 ζ、共同FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12的彼等ITAM。在一個實施例中，任一或多種CAR中的初始信號傳導域包含來源於CD3-ζ的細胞質信號傳導序列。
在一些實施例中，初始信號傳導域為TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、4-1BB及/或CD3-ζ之功能信號傳導域。在一實施例中，胞內信號傳導域包含CD3 ζ、共同FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及/或DAP12之功能信號傳導域。在一特定實施例中，初始信號傳導域為與T細胞受體複合物締合之ζ鏈的功能信號傳導域。
如本文所用，術語「共刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物，其與共刺激配體特異性結合，從而介導T細胞產生共刺激反應，諸如(但不限於)增殖。共刺激分子為淋巴球對抗原有效反應所必需之除抗原受體或其配體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1，CD11a/CD18)、CD2、CD7、CD258 (LIGHT)、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配體，及其類似物。此類共刺激分子之其他實例包括CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp及與CD83特異性結合之配體。在一些實施例中，CAR之共刺激信號傳導域為本文所描述之共刺激分子之功能信號傳導域，該共刺激分子例如OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、結合於CD83之配體、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS及4-1BB (CD137)或其任何組合。
如本文所用，術語「信號傳導域」係指蛋白質之功能部分，其作用為經由所定義信號傳導路徑在細胞內傳遞調控細胞活性的資訊，該等信號傳導路徑為產生第二信使或藉由回應於此類信使而充當效應子。
CAR之細胞質信號傳導部分內之細胞質信號傳導序列可以隨機或指定次序彼此連接。視情況，長度為例如2至10個胺基酸的短寡肽或多肽連接子可形成鍵聯。抗體療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與抗體療法組合以治療已知或懷疑患有癌症之個體。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係與如下療法組合，該療法包含抗HER2結合域，諸如抗HER2抗體或抗HER2抗體平台(例如包含抗HER2結合域之雙特異性或三特異性抗體、抗HER2抗體-藥物結合物或抗HER2 CAR)。抗HER2抗體包括(但不限於)曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®-Roche/Genentech；Kanjinti-Amgen)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(PERJETA®-Roche/Genentech)及MGAH22 (詳細地描述於出於所有目的以引用之方式併入本文中的美國專利第8,802,093號中)。抗HER2抗體平台包括(但不限於)鄂托默單抗(REXOMUN®-Creative Biolabs)及曲妥珠單抗美坦新(曲妥珠單抗-美坦新偶聯物/T-DM1；KADCYLA®-Roche/Genentech)。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合以治療已知或懷疑患有癌症之個體。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係藉由IV輸注投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以1毫克/公斤/天、2毫克/公斤/天、3毫克/公斤/天、4毫克/公斤/天、5毫克/公斤/天、6毫克/公斤/天、7毫克/公斤/天、8毫克/公斤/天、9毫克/公斤/天、10毫克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以至少1毫克/公斤/天、至少2毫克/公斤/天、至少3毫克/公斤/天、至少4毫克/公斤/天、至少5毫克/公斤/天、至少6毫克/公斤/天、至少7毫克/公斤/天、至少8毫克/公斤/天、至少9毫克/公斤/天、至少10毫克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以小於1毫克/公斤/天之劑量投與。
在某些實施例中，抗HER2結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有乳癌之個體，例如經診斷患有轉移性HER2過度表現乳癌之個體。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以4毫克/公斤/天之劑量投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以4毫克/公斤/天藉由IV輸注經90分鐘投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以2毫克/公斤/天投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以2毫克/公斤/天藉由IV輸注經30分鐘投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以4毫克/公斤/天之初始劑量投與，隨後相繼地以2毫克/公斤/天每週投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以4毫克/公斤/天之初始劑量投與，隨後相繼地以2毫克/公斤/天每週投與，持續52週。
在某些實施例中，抗HER2結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有胃癌之個體，例如經診斷患有轉移性HER2過度表現胃癌之個體。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以8毫克/公斤/天投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以8毫克/公斤/天藉由IV輸注經90分鐘投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以6毫克/公斤/天投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以6毫克/公斤/天藉由IV輸注經30至90分鐘投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以8毫克/公斤/天之初始劑量投與，隨後相繼地以6毫克/公斤/天每週投與。在某些實施例中，抗HER2結合域療法係以8毫克/公斤/天之初始劑量投與，隨後相繼地以6毫克/公斤/天每週投與，持續52週。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白係與如下療法組合，該療法包含抗CD20結合域，諸如抗CD20抗體或抗CD20抗體平台(例如包含抗CD20結合域之雙特異性或三特異性抗體、抗CD20抗體-藥物結合物或抗CD20 CAR)。抗CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗(rituximab) (RITUXAN®-Roche/Genentech)、奧克珠單抗(ocrelizumab) (OCREVUS®-Roche/Genentech)、奧比珠單抗(obinutuzumab) (GAZYVA®-Roche/Genentech)、奧伐木單抗(ofatumumab) (ARZERRA®-Novartis)及維托珠單抗(veltuzumab)。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合以治療已知或懷疑患有癌症之個體。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係以100 mg/m2 、200 mg/m2 、300 mg/m2 、400 mg/m2 、500 mg/m2 、600 mg/m2 、700 mg/m2 、800 mg/m2 、900 mg/m2 或1000 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係以375 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係以至少100 mg/m2 、至少200 mg/m2 、至少300 mg/m2 、至少400 mg/m2 、至少500 mg/m2 、至少600 mg/m2 、至少700 mg/m2 、至少800 mg/m2 、至少900 mg/m2 或至少1000 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係以小於400 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係以小於375 mg/m2 之劑量投與。
在某些實施例中，抗CD20結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之個體。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注以375 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注以小於375 mg/m2 之劑量投與。
在某些實施例中，抗CD20結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有慢性淋巴球性白血病(CLL)之個體。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注於第一循環中以375 mg/m2 之劑量投與，且藉由IV輸注於額外2至6個循環之每一循環以500 mg/m2 之劑量投與。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注以小於375 mg/m2 之劑量投與。抗CD20結合域及異二聚體Fc融合蛋白組合療法可與氟達拉濱(fludarabine)及環磷醯胺(FC)組合使用。
在某些實施例中，抗CD20結合域療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有類風濕性關節炎(RA)之個體。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注以1000 mg之兩個劑量投與，該等劑量間隔2週。在某些實施例中，抗CD20結合域療法係藉由IV輸注以1000 mg之兩個劑量投與，劑量之間間隔2週，持續最長24週。在某些實施例中，抗CD20結合域及異二聚體Fc融合蛋白組合療法係與甲胺喋呤共投與。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與包含含有促效劑抗體之抗體療法的療法組合。在某些實施例中，促效劑抗體為抗4-1BB抗體、抗CD137抗體、抗FAP抗體、抗OX40抗體、抗CD40抗體、抗GITR抗體或抗CD27抗體。在某些實施例中，促效劑抗體為雙特異性抗體。在某些實施例中，促效劑抗體為選自以下的包含兩個或更多個抗原結合域之多重特異性抗體(例如雙特異性抗體)：抗4-1BB抗體、抗CD137抗體、抗FAP抗體、抗OX40抗體、抗CD40抗體、抗GITR抗體或抗CD27抗體。說明性實例為靶向4-1BB及CD137之雙特異性促效劑抗體，諸如烏圖木單抗(utomilumab)(Pfizer)。檢查點抑制劑療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法可與檢查點抑制劑療法組合。可靶向以阻斷或抑制之說明性免疫檢查點分子包括(但不限於) CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬於CD2家族之分子且表現於所有NK、γδ及記憶CD8+ (αβ) T細胞上)、CD160 (亦稱作BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括其結合且阻斷或抑制以下中之一或多者之活性的抗體或其抗原結合片段、或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括納武單抗(nivolumamb) (抗PD-1；OPDIVO®-BMS)、AMP224 (抗PD-1；NCI)、派立珠單抗(pembrolizumab) (抗PD-1；MK-3475/KEYTRUDA®-Merck)、皮立珠單抗(pidilizumab) (抗PD-1抗體；CT-011-Teva/CureTech)、阿特珠單抗(atezolizumab) (抗PD-L1；TECENTRIQ®-Roche/Genentech)、德瓦魯單抗(durvalumab) (抗PD-L1；MEDI4736/IMFINZI®-Medimmune/AstraZeneca)、阿維魯單抗(avelumab) (抗PD-L1；BAVENCIO®-Pfizer)、BMS-936559 (抗PD-L1-BMS)、伊匹單抗(ipilimumab) (抗CTLA-4；YERVOY®-BMS)、曲美單抗(tremelimumab) (抗CTLA-4；Medimmune/AstraZeneca)、利瑞路單抗(lirilumab) (抗KIR；BMS)、莫納珠單抗(monalizumab) (抗NKG2A；Innate Pharma/AstraZeneca)、BY55 (抗CD160)、抗OX40、抗TIM3及抗LAG3。
在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有癌症之個體。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係藉由IV輸注投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係藉由IV輸注經30分鐘投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係每3週進行投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係以100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg或1000 mg之劑量投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係以200 mg之劑量投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係以至少100 mg、至少200 mg、至少300 mg、至少400 mg、至少500 mg、至少600 mg、至少700 mg、至少800 mg、至少900 mg或至少1000 mg之劑量投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係以小於200 mg之劑量投與。在某些實施例中，檢查點抑制劑療法係與異二聚體Fc融合蛋白療法組合使用以治療已知或懷疑患有以下之個體：黑素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)、原發縱隔大B細胞淋巴瘤(Primary Mediastinal Large B-Cell Lymphoma；PMBCL)、尿道上皮癌、高度微衛星體不穩定性癌症(Microsatellite Instability-High Cancer)、胃癌、子宮頸癌、肝細胞癌(HCC)、默克麥克氏細胞癌(Merkel Cell Carcinoma；MCC)、腎細胞癌(RCC)。額外細胞介素療法
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種額外細胞介素療法、一或多種趨化細胞素療法或其組合組合。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種額外細胞介素療法組合。在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種趨化細胞素療法組合。在一些實施例中，細胞介素療法包含促炎性細胞介素、Th1細胞介素或Th2細胞介素。在一些實施例中，細胞介素療法包含重組人類細胞介素或趨化細胞素。
在一些實施例中，細胞介素療法包括為介白素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21及IL-22)之細胞介素。在一些實施例中，細胞介素療法包括為生長因子(例如腫瘤壞死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之細胞介素。在一些實施例中，細胞介素療法包含抗炎性細胞介素(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13及TGF)。
在一些實施例中，趨化細胞素療法包括促炎性趨化細胞素(例如GRO-α、GRO-b、LIX、GCP-2、MIG、IP10、I-TAC及MCP-1、RANTES、伊紅趨素(Eotaxin)、SDF-1及MIP3a)。在一些實施例中，趨化細胞素療法包括趨化細胞素受體。在一些實施例中，趨化細胞素療法包括CXC趨化細胞素受體(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6及CXCR7)、CC趨化細胞素受體(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10及CCR11)、CX3C趨化細胞素受體(例如CX3C11)或XC趨化細胞素受體(例如XCR1)。在一些實施例中，趨化細胞素療法包含G蛋白連接跨膜受體。
在一些實施例中，細胞介素療法包含與IL-12信號傳導協同作用之細胞介素療法。在一些實施例中，細胞介素療法包含IL-2細胞介素或其衍生物。在一些實施例中，IL-2療法為阿地介白素(aldesleukin)(Proleukin-Prometheus Therapeutics)。在一些實施例中，IL-2療法及/或阿地介白素係靜脈內投與的。在一些實施例中，細胞介素療法包含IL-15細胞介素或其衍生物。在一些實施例中，IL-15療法為ALT-803 (Altor BioScience)或NKTR-255 (Nektar)。在一些實施例中，IL-15療法、NKTR-255及/或ALT-803係皮下投與的。在一些實施例中，趨化細胞素療法包含CXCL9趨化細胞素、CXCL10趨化細胞素或其衍生物。
在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括向個體投與細胞介素或趨化細胞素。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括向個體投與重組細胞介素或趨化細胞素。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括離體、活體外或活體內對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素。
在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括使用基於病毒載體之遞送平台對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素，該遞送平台諸如牛痘；禽痘；自我複製α病毒；馬拉巴病毒(marabavirus)；腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)；慢病毒，包括(但不限於)第二代、第三代或雜合第二/第三代慢病毒及經設計以靶向特定細胞類型或受體之任一代重組慢病毒(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61、Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18、Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690、Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)；或腺相關病毒(「AAV」)載體，如美國專利第5,173,414號、Tratschin等人, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)、Tratschin等人, Mol. Cell, Biol. 4:2072-2081 (1984)、Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:64666470 (1984)及Samuiski等人, J. Virol. 63:03822-3828 (1989))中更詳細地描述。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括使用LNP、脂質體或外泌體對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括使用如下基因組編輯對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素，諸如使用基於核酸酶之基因組編輯系統(例如成簇規律間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；CRISPR)家族、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)及基於歸巢核酸內切酶(HE)之基因組編輯系統或其衍生物)。在一些實施例中，細胞介素或趨化細胞素療法包括使用電穿孔對細胞進行工程改造以產生細胞介素或趨化細胞素。先天免疫系統促效劑療法
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種先天免疫系統促效劑組合。
在一些實施例中，先天免疫系統促效劑包含鐸樣受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑包含TLR1/2、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR7/8或TLR9促效劑。在一些實施例中，TLR2/6促效劑包含脂蛋白，諸如細菌脂蛋白或衍生物，諸如Pam2CSK4。在一些實施例中，TLR1/2促效劑包含脂蛋白。在一些實施例中，TLR3促效劑包含dsRNA類似物，諸如瑞他立德(rintatolimod) (AMPLIGEN®-Hemispherx Biopharma)或聚IC-LC (例如HILTONOL®)。在一些實施例中，TLR4促效劑包含脂多醣(LPS，亦稱作內毒素)或衍生物，諸如脂質A。在一些實施例中，TLR7促效劑包含ssRNA或衍生物，或咪唑并喹啉衍生物，包括(但不限於)雷西莫特(resiquimod)(亦稱作R848)、咪喹莫特(imiquimod)(ZYCLARA®，Aldara-Medicis)及嘎德莫特(gardiquimod)。在一些實施例中，TLR7促效劑亦為TLR8促效劑，諸如咪喹莫特或Medi-9197 (AstraZeneca/MedImmune)。在一些實施例中，TLR9促效劑包含含CpG寡去氧核苷酸(CpG-ODN)或SD-101 (Dynavax)。
在一些實施例中，先天免疫系統促效劑包含干擾素基因刺激因子(STING)促效劑。在一些實施例中，STING促效劑包含環二核苷酸(CDN)。在一些實施例中，CDN包含環二AMP、環二GMP或環GMP-AMP (cGAMP)。在一些實施例中，STING促效劑包含刺激cGAS之核酸(例如DNA或RNA)。在一些實施例中，STING促效劑為ADU-S100 (亦稱作MIW815-Aduro/Novartis)。化學療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種化學療法組合。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種化學療法組合以治療經診斷患有癌症之個體。化學治療劑之實例包括阿地介白素、奧爾沃昔布(alvocidib)、抗新普拉通AS2-1 (antineoplaston AS2-1)、抗新普拉通A10、抗胸腺細胞球蛋白、阿米福汀(amifostine trihydrate)、胺基喜樹鹼(aminocamptothecin)、三氧化二砷、β阿立辛(beta alethine)、Bcl-2家族蛋白抑制劑ABT-263、ABT-199、BMS-345541、硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®)、苔蘚抑素1、硫酸布他卡因、卡鉑、坎帕斯-1H (campath-1H)、CC-5103、卡莫司汀(carmustine)、乙酸卡泊芬淨(caspofungin acetate)、氯法拉濱(clofarabine)、順鉑、克拉屈濱(Cladribine)(LEUSTARIN®)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)(LEUKERAN®)、薑黃素(Curcumin)、環孢靈(cyclosporine)、環磷醯胺(科洛仙(Cyloxan)、癌得星(Endoxan)、癌得仙(Endoxana)、科洛斯汀(Cyclostin))、阿糖胞苷、地尼介白素(denileukin diftitox)、地塞米松(dexamethasone)、DT PACE、多西他賽(docetaxel)、海兔毒素10、小紅莓(Doxorubicin)(ADRIAMYCIN®、ADRIBLASTINE®)、鹽酸小紅莓、恩紮妥林(enzastaurin)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(Everolimus)(RAD001)、非瑞替尼(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、美法侖(melphalan)、美司鈉(mesna)、夫拉平度(Flavopiridol)、氟達拉濱(FLUDARA®)、格爾德黴素(Geldanamycin)(17-AAG)、異環磷醯胺、鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)、伊沙匹隆(ixabepilone)、來那度胺(Lenalidomide)(REVLIMID®，CC-5013)、淋巴活素活化殺手細胞(lymphokine-activated killer cell)、美法侖、甲胺喋呤、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)、莫特沙芬釓(motexafin gadolinium)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)、奈拉濱(nelarabine)、奧利默森(oblimersen)(GENASENSE®)、奧布托克(Obatoclax)(GX15-070)、奧利默森、乙酸奧曲肽(octreotide acetate)、Ω-3脂肪酸、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、PD0332991、聚乙二醇化脂質體鹽酸小紅莓、派非格司亭(pegfilgrastim)、噴司他汀(Pentstatin)(NIPENT®)、哌立福新(perifosine)、潑尼松龍(Prednisolone)、潑尼松(Prednisone)、R-羅斯維汀(R-roscovitine)(SELICILIB®，CYC202)、重組干擾素α、重組介白素-12、重組介白素-11、重組flt3配體、重組人類血小板生成素、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、檸檬酸西地那非(sildenafil citrate)、辛伐他汀(simvastatin)、西羅莫司(sirolimus)、苯乙烯碸、他克莫司(tacrolimus)、坦螺旋黴素(tanespimycin)、坦西莫司(Temsirolimus)(CC1-779)、沙立度胺(Thalidomide)、治療性同種異體淋巴球、噻替派(thiotepa)、替吡法尼(tipifarnib)、VELCADE® (BORTEZOMIB®或PS-341)、長春新鹼(Vincristine)(ONCOVIN®)、硫酸長春新鹼、酒石酸雙長春瑞賓、伏立諾他(Vorinostat)(SAHA)及FR (氟達拉濱、利妥昔單抗)、CHOP (環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、潑尼松)、CVP (環磷醯胺、長春新鹼及潑尼松)、FCM (氟達拉濱、環磷醯胺、米托蒽醌)、FCR (氟達拉濱、環磷醯胺、利妥昔單抗)、hyperCVAD (超分次環磷醯胺、長春新鹼、小紅莓、地塞米松、甲胺喋呤、阿糖胞苷)、ICE (異環磷醯胺、卡鉑及依託泊苷)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥及潑尼松龍)、R-CHOP (利妥昔單抗加CHOP)、R-CVP (利妥昔單抗加CVP)、R-FCM (利妥昔單抗加FCM)、R-ICE (利妥昔單抗-ICE)及R-MCP (R-MCP)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種化學療法組合以治療經診斷患有結腸癌、直腸癌或結腸直腸癌(CRC)之個體。在某些實施例中，化學療法包含FOLFOX (5-FU，甲醯四氫葉酸及奧沙利鉑/樂沙定(Eloxatin))、FOLFIRI (甲醯四氫葉酸、5-FU及伊立替康/開普拓(Camptosar))、FOLFOXIRI (甲醯四氫葉酸、5-FU、奧沙利鉑及伊立替康)、CapeOx (卡培他濱及奧沙利鉑)、與甲醯四氫葉酸共投與之5-FU、單獨的卡培他濱(XELODA®)或曲氟尿苷(Trifluridine)及替吡嘧啶(tipiracil)(LONSURF®)。在某些實施例中，化學療法包含VEGF靶向劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN®)、阿柏西普(ziv-aflibercept)(ZALTRAP®)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)(CYRAMZA®)或瑞戈非尼(Regorafenib)(STIVARGA®)；或EGFR靶向劑，諸如西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)或帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX®)。在某些實施例中，化學療法係與選自以下之化學療法共投與：FOLFOX、FOLFIRI、FOLFOXIRI、CapeOx、與甲醯四氫葉酸共投與之5-FU、單獨的卡培他濱及與VEGF靶向劑或EGFR靶向劑一起之曲氟尿苷/替吡嘧啶。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種化學療法組合以治療經診斷患有乳癌之個體。在某些實施例中，化學療法包含小紅莓(ADRIAMYCIN®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓、表柔比星(epirubicin)(ELLENCE®)、太平洋紫杉醇(Taxol)、多西他賽(TAXOTERE®)、白蛋白結合太平洋紫杉醇(ABRAXANE®)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、環磷醯胺(CYTOXAN®)、卡鉑(PARAPLATIN®)、順鉑、長春瑞賓(NAVELBINE®)、卡培他濱(XELODA)、吉西他濱(GEMZAR®)、伊沙匹隆(ixabepilone)(IXEMPRA®)或艾瑞布林(eribulin)(HALAVEN)。在某些實施例中，化學療法包含選自以下之兩種或更多種化學療法之組合：小紅莓(ADRIAMYCIN®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓、表柔比星(ELLENCE®)、太平洋紫杉醇(Taxol)、多西他賽(TAXOTERE®)、白蛋白結合太平洋紫杉醇(ABRAXANE®)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、環磷醯胺(CYTOXAN®)、卡鉑(PARAPLATIN®)、順鉑、長春瑞賓(NAVELBINE®)、卡培他濱(XELODA®)、吉西他濱(GEMZAR®)、伊沙匹隆(IXEMPRA®)及艾瑞布林(HALAVEN®)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種化學療法組合以治療經診斷患有黑素瘤/皮膚癌之個體。在某些實施例中，化學療法包含達卡巴嗪(dacarbazine)(亦稱作DTIC)、替莫唑胺temozolomide)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇、順鉑、卡鉑或長春鹼。靶向劑療法
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種靶向劑組合。一般而言，靶向劑作用域特定分子目標，諸如與癌症相關之目標。靶向劑與標準化學療法之區別在於標準化學療法作用於所有迅速分化之正常細胞及癌細胞。靶向劑包括(但不限於)激素療法、信號轉導抑制劑、基因表現調節劑、細胞凋亡誘導劑、血管生成抑制劑、免疫療法、毒素遞送分子(例如抗體藥物結合物)及激酶抑制劑。在某些實施例中，靶向劑包含受體促效劑或配體。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種靶向劑組合以治療經診斷患有結腸癌、直腸癌或結腸直腸癌(CRC)之個體。在某些實施例中，靶向劑包含西妥昔單抗(ERBITUX®)、帕尼單抗(VECTIBIX®)、貝伐單抗(AVASTIN®)、阿柏西普(ZALTRAP®)、瑞戈非尼(STIVARGA®)、雷莫蘆單抗(CYRAMZA®)、納武單抗(OPDIVO®)或伊匹單抗(YERVOY®)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種靶向劑組合以治療經診斷患有乳癌之個體。在某些實施例中，靶向劑包含(AFINITOR®)、他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON®)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®)、氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®)、阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX®)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN®)、拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB®)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®)、帕妥珠單抗(PERJETA®)、曲妥珠單抗美坦新(KADCYLA®)、帕泊昔布(palbociclib)(IBRANCE®)、瑞博西尼(ribociclib)(KISQALI®)、順丁烯二酸來那替尼(neratinib maleate)(NERLYNX™)、玻瑪西尼(abemaciclib)(VERZENIO™)、奧拉帕尼(olaparib)(LYNPARZA™)、阿特珠單抗(atezolizumab)(TECENTRIQ®)或艾培昔布(alpelisib)(PIQRAY®)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種靶向劑組合以治療經診斷患有黑素瘤/皮膚癌之個體。在某些實施例中，靶向劑包含維莫德吉(Vismodegib)(ERIVEDGE®)、索尼得吉(sonidegib)(ODOMZO®)、伊匹單抗(YERVOY®)、維羅非尼(vemurafenib)(ZELBORAF®)、曲美替尼(trametinib)(MEKINIST®)、達拉非尼(dabrafenib)(TAFINLAR®)、派立珠單抗(KEYTRUDA®)、納武單抗(OPDIVO®)、考比替尼(cobimetinib)(COTELLIC™)、亞利崔托寧(alitretinoin)(PANRETIN®)、阿維魯單抗(BAVENCIO®)、恩拉菲尼(恩拉菲尼)(BRAFTOVI™)、畢尼替尼(binimetinib)(MEKTOVI®)或賽咪單抗-rwlc (cemiplimab-rwlc)(LIBTAYO®)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與受體促效劑或配體療法組合。在某些實施例中，受體促效劑或配體療法包含促效劑抗體。在某些實施例中，受體促效劑或配體療法包含受體配體，諸如4-1BBL或CD40L。放射線療法
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與放射線療法組合。在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與放射性同位素粒子(諸如銦In-111、釔Y-90或碘I-131)組合。組合療法之實例包括(但不限於)碘-131托西莫單抗(tositumomab)(BEXXAR® )、釔-90替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN® )及BEXXAR® 與CHOP。在某些實施例中，放射線療法包含體外放射線療法(external-beam radiation therapy；EBRT)、體內放射線療法(internal radiation therapy)(近接療法)、腔內放射線療法(endocavitary radiation therapy)、間質近接療法(interstitial brachytherapy)、放射栓塞治療(radioembolization)、低分次放射線療法(hypofractionated radiation therapy)、術中放射線療法(intraoperative radiation therapy；IORT)、3D順形放射線療法(3D-conformal radiotherapy)、立體定位放射手術(stereotactic radiosurgery；SRS)或軀體立體定位放射線療法(stereotactic body radiation therapy；SBRT)。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種放射線療法組合以治療經診斷患有結腸癌、直腸癌或結腸直腸癌(CRC)之個體。在某些實施例中，放射線療法包含體外放射線療法(EBRT)、體內放射線療法(近接療法)、腔內放射線療法、間質近接療法或放射栓塞治療。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種放射線療法組合以治療經診斷患有乳癌之個體。在某些實施例中，放射線療法包含體外放射線療法、低分次放射線療法、術中放射線療法(IORT)或3D順形放射線療法。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種放射線療法組合以治療經診斷患有黑素瘤/皮膚癌之個體。在某些實施例中，放射線療法包含立體定位放射手術(SRS；例如使用γ刀或線性加速器)或軀體立體定位放射線療法(SBRT)。疫苗及溶瘤病毒療法
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與一或多種能夠提高特異性免疫反應(例如腫瘤特異性免疫反應)之免疫原性組成物組合，例如疫苗組合物或溶瘤病毒。
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與疫苗組合物組合。疫苗組合物通常包含對待靶向之腫瘤具有特異性之多種抗原及/或新抗原。疫苗組合物亦可稱作疫苗。
在一些實施例中，疫苗組合物進一步包含佐劑及/或載劑。在一些實施例中，疫苗組合物與載劑締合，該載劑諸如蛋白質或抗原呈遞細胞，諸如能夠將肽呈遞至T細胞之樹突狀細胞(DC)。在一些實施例中，載劑為抗原或新抗原能夠與其締合之骨架結構，例如多肽或多醣。
一般而言，佐劑為混雜至疫苗組合物中增加或以其他方式調節對抗原或新抗原之免疫反應的任何物質。視情況，佐劑為共價或非共價結合的。佐劑提高對抗原之免疫反應的能力通常顯現為免疫介導性反應之顯著或實質性增加或疾病症狀之減少。舉例而言，體液免疫性的增強通常顯現為針對抗原所產生之抗體效價的顯著增加，且T細胞活性的增強通常顯現為細胞增殖或細胞性細胞毒性或細胞介素分泌的增加。佐劑亦可改變免疫反應，例如藉由將主要體液或Th反應變為主要細胞或Th反應。適合之佐劑包括(但不限於) 1018 ISS、礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel載體系統、PLG微粒、雷西莫特、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣粒子、YF-17D、VEGF捕獲劑、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila之來源於皂素之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)、分支桿菌萃取物及合成細菌細胞壁模擬物，及其他專用佐劑，諸如Ribi之Detox. Quil或Superfos。諸如弗氏(Freund's)不完全佐劑或GM-CSF之佐劑適用。先前已描述對樹突狀細胞具有特異性之若干免疫佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。亦可使用細胞介素。若干細胞介素已直接關聯於：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加速樹突狀細胞成熟變為T淋巴球之有效抗原呈遞細胞(例如GM-CSF、IL-1及IL-4) (美國專利第5,849,589號，其特別以全文引用之方式併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I,等人, J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。在一些實施例中，佐劑包含CpG免疫刺激性寡核苷酸。在一些實施例中，佐劑包含TLR促效劑。
適用佐劑之其他實例包括(但不限於)經化學修飾之CpG (例如CpR、Idera)、聚(I:C) (例如聚i:CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗體，諸如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗、曲美單抗及SC58175，其可起治療作用及/或充當佐劑。佐劑及添加劑之量及濃度可容易由熟習此項技術者確定而無需過度實驗。額外佐劑包括群落刺激因子，諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
在一些實施例中，疫苗組合物包含超過一種不同的佐劑。在一些實施例中，疫苗組合物包含任何佐劑物質，包括以上中之任一者或其組合。亦設想，疫苗及佐劑可一起或以任何適當的順序分開投與。
在一些實施例中，載劑(或賦形劑)獨立於佐劑存在。在一些實施例中，載劑之功能在於增加分子量，增加活性或免疫原性，賦予穩定性，增加生物活性或增加血清半衰期。在一些實施例中，載劑有助於將肽呈遞至T細胞。在一些實施例中，載劑包含熟習此項技術者已知之任何適合載劑，例如蛋白質或抗原呈遞細胞。載劑蛋白之實例包括(但不限於)匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清蛋白(諸如運鐵蛋白)、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，諸如胰島素或棕櫚酸。為用於人類免疫接種，載劑一般為生理學上可接受之載劑，其為人類可接受的且為安全的。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素為適合之載劑。或者，載劑可為葡聚糖，例如瓊脂糖。
在一些實施例中，疫苗包含基於病毒載體之疫苗平台，諸如牛痘；禽痘；自我複製α病毒；馬拉巴病毒；腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)；或慢病毒，包括(但不限於)第二代、第三代或雜合第二/第三代慢病毒及經設計靶向特定細胞類型或受體之任一代重組慢病毒(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61、Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J. (2012) 443(3):603-18、Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690、Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)。一般而言，在引入至宿主中之後，經感染細胞表現抗原或新抗原且藉此引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。
視上文所提及的基於病毒載體之疫苗平台之封裝容量而定，在一些實施例中，疫苗組成物包含一或多種病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含側接未突變序列、由連接子分隔開或在一或多個靶向亞細胞區室的序列之前的序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8、Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41、Lu等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res. (2014) 20(13):3401-10)。適用於免疫接種方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為BCG (Bacille Calmette Guerin)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文之描述，適用於新抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
在一些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與溶瘤病毒療法組合。一般而言，溶瘤病毒為經工程改造以主要感染及殺死癌細胞的病毒。在一些實施例中，除殺死癌細胞之溶瘤病毒以外，溶瘤病毒誘導對癌細胞之免疫反應。
在某些實施例中，異二聚體Fc融合蛋白療法係與溶瘤病毒療法組合以治療經診斷患有黑素瘤/皮膚癌之個體。在某些實施例中，溶瘤病毒包含塔里穆尼拉赫帕雷普韋克(talimogene laherparepvec)(IMLYGIC®)，亦稱作T-VEC。在一些實施例中，包含IL-12之次單元的異二聚體Fc融合蛋白與溶瘤病毒(例如，塔里穆尼拉赫帕雷普韋克(IMLYGIC® )或T-VEC)組合用於治療癌症(例如晚期惡性腫瘤)。 實例
現已大體描述了本發明，將參考以下實例更容易地理解本發明，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的包括在內且不意欲限制本發明。 實例1-製備方法
本發明之蛋白質通常使用重組DNA技術製備。在一個例示性實施例中，將編碼第一多肽之第一核酸序列選殖至第一表現載體(pET-pSURE-Puro)中，該第一多肽包含與第一抗體Fc域多肽融合之多重次單元蛋白序列之次單元(人類IL-12之p40次單元)；將編碼第二多肽之第二核酸序列選殖至第二表現載體(pET-pSURE-Puro)中，該第二多肽包含與第二不同抗體Fc域多肽融合之多重次單元之第二不同次單元(人類IL-12之p35次單元)；且第一及第二表現載體一起穩定轉染至宿主細胞中以產生異二聚體Fc融合蛋白。
由第一表現載體編碼之例示性胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 292中。第一表現載體編碼第一多肽，該第一多肽包含與包含Y349C突變之人類IgG1 Fc序列融合的人類IL-12之p40次單元。第一多肽亦包括促進異二聚化的K360E及K409W突變，以及降低效應功能的LALAPA (L234A、L235A及P329A)突變。SEQ ID NO: 292中，前導序列以斜體展示，人類IL-12之p40次單元序列加底線，且突變以粗體展示。
Figure 02_image007
由第二表現載體編碼之例示性胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 293中。第二表現載體編碼第二多肽，該第二多肽包含與包含S354C突變之人類IgG1 Fc序列融合的人類IL-12之p35次單元。第二多肽亦包括促進異二聚化的Q347R、D399V及F405T突變，以及降低效應功能的LALAPA (L234A、L235A及P329A)突變。SEQ ID NO: 293中，前導序列以斜體展示，人類IL-12之p35次單元序列加底線，且突變以粗體展示。
Figure 02_image009
為達成蛋白質之最高產率，探索第一及第二表現載體之不同比率以確定轉染至宿主細胞中之最佳比率。轉染後，使用此項技術中已知之方法(諸如有限稀釋法、ELISA、FACS、顯微法或Clonepix)分離出單一純系以供用於細胞庫產生。
可在適合於生物反應器的條件下培養純系，按比例擴大且維持蛋白質之表現。蛋白質使用此項技術中已知之方法分離及純化，該等方法包括離心、深度過濾、細胞溶解、均質化、冷凍-解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用交換層析及混合模式層析。 實例2-CT26腫瘤模型中藉由與靜默Fc域多肽融合之IL-12的腫瘤抑制
此實例描述重組鼠類IL-12 (「rmIL12」)之兩個IL-12-Fc融合構築體在小鼠結腸癌模型中控制腫瘤進展方面之相對能力。用於此實例之兩個IL-12-Fc融合變異體為mIL-12-Fc野生型(「DF-mIL12-Fc wt」)，其包括與野生型鼠類IgG2a Fc域多肽之N端融合的野生型鼠類IL-12 p40及p35次單元；以及mIL-12-Fc靜默型(「DF-mIL12-Fc si」)，其包括與具有突變L234A、L235A及P329G的鼠類IgG2a Fc域多肽之N端融合的野生型鼠類IL-12 p40及p35次單元。該蛋白質之胺基酸序列展示如下： mIL-12-p40-mIgG2A-EW (DF-mIL12-Fc wt 之第一鏈 )
Figure 02_image011
mIL-12-p35-mIgG2A-RVT (DF-mIL12-Fc wt 之第二鏈 )
Figure 02_image013
mIL-12-p40-mIgG2A-EW-LALAPG (DF-mIL12-Fc si 之第一鏈 )
Figure 02_image015
mIL-12-p35-mIgG2A-RVT-LALAPG (DF-mIL12-Fc si 之第二鏈 )
Figure 02_image017
簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用1 µg之rmIL12、1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc wt、1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週腹膜內處理一次。評定腫瘤生長60天。
如圖5A至圖5C中所示，儘管rmIL12 (圖5A)及DF-mIL12-Fc wt (圖5B)在控制腫瘤進展方面對一些小鼠有效，但僅DF-mIL12-Fc si誘導穩固腫瘤消退且得到100%完全腫瘤消退(圖5C)。此外，總存活期藉由DF-mIL12-Fc si療法之處理顯著延長-100%之經處理小鼠在第60天仍存活，而用同型對照DF-mIL12-Fc wt及rmIL12處理之小鼠之中值存活時間分別為27天、33天及46天(圖6)。
接下來，比較控制腫瘤進展之DF-mIL12-Fc wt及DF-mIL12-Fc si之不同劑量。簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到300 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用1 µg或0.1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc wt或者1 µg或0.1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si一週腹膜內處理一次。評定腫瘤生長55天。
如圖7A至圖7D中所示，用DF-mIL12-Fc wt處理使得一些小鼠的腫瘤進展減少，且在1 µg rmIL12莫耳當量劑量下之兩個小鼠完全消退(圖7A)，但0.1 µg rmIL12莫耳當量劑量下未觀測到腫瘤抑制(圖7C)。相比之下，1 µg rmIL12莫耳當量劑量之DF-mIL12-Fc si處理得到100%完全腫瘤消退(圖7B)且0.1 µg rmIL12莫耳當量之較低劑量下誘導腫瘤生長之穩固延遲(圖7D)。用1 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt處理的小鼠之中值存活期為32天，類似於用0.1 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc si處理的小鼠之中值存活期34天，表明DF-mIL12-Fc si之效力比其野生型變異體高10倍(圖8)。DF-mIL12-Fc wt在0.1 µg rmIL12莫耳當量之劑量下不太有效，且顯示與同型處理組相同的中值存活期24天。
接下來，將單一劑量投與DF-mIL12-Fc si處理與前述每週處理進行比較。簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或莫耳當量之mIgG2a同型以單次注射形式腹膜內處理。評定腫瘤生長60天。亦評定體重。
如圖21A中所示，單一投與DF-mIL12-Fc si得到穩固腫瘤消退且在70%之小鼠中得到完全腫瘤消退，與每週投與(圖5C)具有可比性。如圖21B中所示，單一投與DF-mIL12-Fc si耐受良好，未觀測到毒性，如藉由體重所評定。
另外，用5×105 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞在相對側腹處對完全反應者(CR)再攻毒，且將腫瘤進展與以相同腫瘤劑量攻毒之原生小鼠進行比較。如圖21C中所示，雖然原生小鼠中之腫瘤生長，但100%之完全反應者在再攻毒後保持無腫瘤。相應地，單一投與DF-mIL12-Fc si在小鼠群體中展現完全、持久之反應。
接下來，比較投與DF-mIL12-Fc si之不同途徑的活體內功效。簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或莫耳當量之mIgG2a同型對照一週腹膜內或皮下處理一次。經60天評定腫瘤生長。
如圖22A至圖22B中所示，腹膜內(圖22A)及皮下(圖22B)投與DF-mIL12-Fc si皆誘導穩固腫瘤消退且得到100%完全腫瘤消退。因此，使用各種投與途徑之DF-mIL12-Fc si處理皆展現功效。 實例3-B16F10腫瘤模型中藉由與靜默Fc域多肽融合之IL-12的腫瘤抑制
此實例描述DF-mIL12-Fc wt及DF-mIL12-Fc si在小鼠黑素瘤模型中控制腫瘤進展方面的相對能力。簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠中。在腫瘤接種後第8天，當腫瘤體積達到250 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10)且用0.5 µg之rmIL12、0.5 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc wt、0.5 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或0.5 µg mIgG2a同型對照一週處理一次。評定腫瘤生長32天。
如圖9A至圖9C中所示，儘管所測試的IL12-Fc構築體中之每一者均延遲腫瘤進展，但DF-mIL12-Fc si在控制腫瘤生長方面最有效。用DF-mIL12-Fc si處理的小鼠之中值存活時間為29天，其比分別為16天、26天及22天的用同型對照、DF-mIL12-Fc wt及rmIL12處理的小鼠之中值存活時間長(圖10)。
接下來，比較控制腫瘤進展之DF-mIL12-Fc wt及DF-mIL12-Fc si之不同劑量。簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第8天，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用0.5 µg或0.1 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt或者0.5 µg或0.1 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc si一週腹膜內處理一次。評定腫瘤生長30天。
如圖11A至圖11D中所示，在兩種劑量下，DF-mIL12-Fc si在抑制腫瘤生長方面均優於DF-mIL12-Fc wt。此外，在各劑量下，用DF-mIL12-Fc wt處理之小鼠之中值存活期為20天。相比之下，用0.1 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc si處理的小鼠之中值存活期為21天，且用0.5 µg rmIL12莫耳當量之DF-mIL12-Fc si處理的小鼠之中值存活期為28天(圖12)。此等結果表明，相較於其野生型對應物或同型對照，高劑量(0.5 µg rmIL12莫耳當量)之DF-mIL12-Fc si顯著增加小鼠之存活期。
接下來，將單一劑量投與DF-mIL12-Fc si處理與前述每週處理進行比較。簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠中。在腫瘤接種後第8天，當腫瘤體積達到200 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10)且用0.5 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或莫耳當量之mIgG2a同型對照一週處理一次。評定腫瘤生長39天。
如圖23中所示，單次投與DF-mIL12-Fc si使得100%之小鼠的腫瘤過度生長減少，但腫瘤過度生長相較於每週投與而言出現得更早(圖9C)。另外，小鼠展現短暫重量減輕，但僅在第一劑量之後(資料未展示)。相應地，單一投與DF-mIL12-Fc si在難治性腫瘤模型中展現初步功效，但連續每週投與在此模型中在延遲腫瘤過度生長方面更佳。
接下來，比較投與DF-mIL12-Fc si之不同途徑的活體內功效。簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠中。在腫瘤接種後第7天，當腫瘤體積達到260 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10)且用1 µg rmIL12之莫耳劑量當量之DF-mIL12-Fc si或莫耳當量之mIgG2a同型對照一週腹膜內或皮下處理一次。評定腫瘤生長40天。
如圖24A至圖24B中所示，腹膜內(圖24A)及皮下(圖24B)投與DF-mIL12-Fc si皆誘導100%之小鼠的腫瘤消退。因此，使用各種投與途徑之DF-mIL12-Fc si處理皆展現功效。 實例4-DF-hIL12-Fc wt及rhIL-12之活體外效力
使用活體外生物分析評定DF-hIL12-Fc si相較於rhIL-12之效力。
使用HEK-Blue IL-12報導子分析評定IL-12效力。自培養物收穫IL-12R+HEK-Blue報導子細胞(InvivoGen)且在培養基中調整至1x×106 個細胞/毫升。在培養基中稀釋DF-hIL12-Fc si(DF IL12-Fc)及重組人類IL-12 (rhIL-12；PeproTech)。將100 µL之PBMC懸浮液與100 µL之經稀釋測試物品混合且培育48小時。收穫上清液，且藉由根據製造商說明書量測自細胞分泌之胚胎鹼性磷酸酶來偵測IL-12受體及由報導子細胞穩定表現之信號傳導組分的接合。簡言之，將25 µL之樣本上清液與200 µL之QUANTI-Blue試劑混合，且在暗處於RT下培育10分鐘。隨後用SpectraMax i3x盤讀取器在620 nM下讀取培養盤，且報導光密度以表示相對IL-12活性。
如圖13A中所示，藉由IL-12R+HEK報導子細胞進行的SEAP之產生隨著DF-hIL12-Fc si或rhIL-12之濃度增加而增加。在檢查之濃度下，HEK-Blue報導子分析中量測之IL-12反應在DF-hIL12-Fc si與rhIL-12之間具有可比性。
接下來，藉由定量來自人類PBMC之IFNγ產生評定IL-12效力。使用密度梯度離心自人類周邊血液白血球層分離出PBMC，且在培養基中調整至1×106 個細胞/毫升。在培養基中稀釋DF-hIL12-Fc si及重組人類IL-12 (rhIL-12)。將100 µL之PBMC懸浮液與100 µL之經稀釋測試物品混合且培育48小時。收穫上清液，且使用人類IFN-γELISA MAX套組(BioLegend)定量。在IFNγ ELISA盤顯影後，使用SpectraMax i3x儀器在450 nm下進行讀取，其中在540 nm下進行背景減除。藉由自分析標準曲線內插樣本讀數來粗略估計樣本槽中之IFNγ含量。
如圖13B中所示，當將人類PBMC與DF-hIL-12-Fc si或rhIL-12一起培養，同時用5 µg/ml之PHA處理以放大IFNγ反應之量級時，IFNγ產生增加。在檢查之濃度下，IL-12刺激後之IFN-γ產生在DF-hIL12-Fc si與rhIL-12之間具有可比性。
因此，儘管兩種細胞類型及刺激條件之EC50值相差超過一個數量級，但兩個分析展現DF-hIL12-Fc si及rhIL-12之活性具有可比性，表明DF-hIL12-Fc si構築體與原生重組人類IL-12展現類似效力。 實例5-IV輸注DF-hIL12-Fc si或rhIL-12後，猴血漿中之IL-12、DF-hIL12-Fc si及IFNγ濃度
評定IV輸注DF-hIL12-Fc si或rhIL-12後，食蟹獼猴中之藥力學(PD)及藥物動力學(PK)。
藉由IV輸注以10 µg/kg向食蟹獼猴投與DF-hIL12-Fc si及重組人類IL-12。
使用免疫分析基於Quantikine ELISA人類IL-12 p70免疫分析套組偵測DF-hIL12-Fc si及人類IL12：此分析採用定量夾心酶免疫分析技術。將對人類IL-12 p70具有特異性之單株抗體用作固相捕捉，且使用抗體HRP標記報導子實現偵測。將外加rhIL-12或DF-hIL12-Fc si參考標準之標準物及QC以及測試樣本吸入微量滴定盤之孔中，且使樣本中存在之任何IL-12 p70與固定在固相上之抗體結合。洗滌去掉未結合物質，且將對人類IL-12 p70具有特異性之酶聯多株抗體添加至孔中。洗滌去掉未結合抗體-酶試劑，且將TMB受質添加至各孔中。所得酶反應產生在添加酸停止溶液時變為黃色的藍色產物。各孔中量測之色彩強度與初始步驟中結合之rhIL-12或DF-hIL12-Fc si之量成正比。在450 nm下以540 nm之參考在具有資料收集軟體SoftMax Pro Enterprise 4.6版之SpectraMax微量盤讀取器上讀取培養盤。將資料轉換成文字檔案且在Watson LIMS v.7.2.0.02中導入/處理。使用與加權因子1擬合之Logistic(Auto Estimate)曲線執行回歸。
亦使用免疫分析(meso scale discovery(MSD)-一種ELISA類免疫分析)偵測DF-hIL12-Fc si，其包含用猴吸附山羊抗人類IgG塗佈未處理MSD微量滴定盤且在室溫下培育。將培養盤以及測試樣品洗滌、阻斷、洗滌且與外加DF-hIL12-Fc si參考標準之標準曲線及品質對照樣本一起培育。此培育後，洗滌培養盤，且將生物素抗人類IL-12/IL-23 p40作為初級偵測抗體添加至培養盤。另一洗滌步驟後，添加鏈黴親和素結合磺基標籤作為二級偵測抗體。最後一次洗滌培養盤，將MSD讀取緩衝液T添加至培養盤，且使用MSD Sector Imager S600讀取培養盤。將原始MSD資料導出為文字檔案，其隨後使用程式化Excel試算表轉換成Watson LIMS相容檔案，該試算表在Envigo經定製設計。將資料導入Watson LIMS軟體v.7.2.0.02中且進行回歸。
針對食蟹獼猴血漿中之NHP促炎性生物標記之相對定量量測而執行meso scale discovery方法。該方法將夾心免疫分析程序用於食蟹獼猴K2 EDTA血漿(稱作猴血漿)中之促炎性小組1生物標記之相對定量量測：IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6 IL-8及IL-10。該方法係基於用於V-PLEX及V-PLEX Plus之MSD非人類靈長類動物(NHP)套組，目錄號K15056D-1、K15056D-2、K15056D-4、K15056D-6、K15056G-1、K15056G-2、K15056G-4、K15056G-6。該方法採用與食蟹獼猴反應之人類捕捉及偵測抗體。套組提供在96孔多斑點培養盤之各孔中之獨立的界限分明之斑點上預塗捕捉抗體之培養盤。將培養盤與猴血漿樣本一起培育，洗滌，隨後與偵測抗體(對各分析物具有特異性)一起培育，該偵測抗體與電化學發光(ECL)標記(MSD SULFO-TAG)結合。樣本中之分析物結合於固定在工作電極表面上之捕捉抗體；藉由結合之分析物募集偵測抗體來使夾層完整。洗滌培養盤，且添加MSD讀取緩衝液以創建適用於電化學發光(ECL)之化學環境。將培養盤裝載至MSD Sector Imager 600 (SI600)儀器中，其中將電壓施加至培養盤電極，使得所捕捉標記發光。儀器依據相對光單位(RLU)量測所發射光之強度，得到樣本中分析物之相對定量量度。將原始RLU資料導出為文字檔案，其隨後使用程式化Excel試算表轉換成Watson LIMS相容檔案，該試算表在Envigo經定製設計。隨後將資料導入Watson LIMS軟體v.7.2.0.02中且進行回歸。
圖14展示DF-hIL12-Fc si及重組人類IL-12在IV投與之後隨時間推移之相對血漿濃度。資料指示，如所預期，DF-hIL12-Fc si及rhIL-12之濃度隨時間推移而降低。然而，相較於rhIL-12，DF-hIL12-Fc si在時程內展現延長之半衰期及更大總暴露量。
圖14亦展示IV投與之後猴血漿中的IFNγ(PD)之相對濃度。資料指示如藉由IFNγ產生所評定在IV投與後均展現活性的DF-hIL12-Fc si及rhIL-12之藥力學。然而，相較於rhIL-12，DF-hIL12-Fc si展現較高峰活性及較長持續時間。 實例6-小鼠替代DF-mIL12-Fc si之藥理學表徵
檢查命名為DF-mIL12-Fc si的半衰期延長之鼠類IL-12變異體之血清半衰期及活體內藥力學。
將對應於1 µg rmIL12的等效莫耳量之DF-mIL12-Fc si靜脈內注射於未攜帶腫瘤之Balb/c小鼠中，且將PK/PD特徵與rmIL12進行比較。用1 µg DF-mIL12-Fc si與rmIL12 (1 µg rmIL12之莫耳當量)靜脈內注射原生Balb/c (n=6)。在注射後0.017、0.5、3、6、24、48、72、96、144及219小時對血液進行取樣。如先前所描述藉由ELISA分析血清中之IL12及IFNγ含量。
如圖15A及圖15B中所示以及表15中定量，DF-mIL12-Fc si顯示大約30小時之延長血清半衰期(圖15B，DF-mIL12-Fc si T1/2=29.85小時)，其比rmIL12之血清半衰期長5倍(圖15A；rmIL12 T1/2=6.05小時)。除半衰期延長以外，DF-mIL12-Fc si介導之IFNγ產生(AUC=916654)相較於rmIL12 (AUC=20304)亦持久。
接下來，比較投與DF-mIL12-Fc si之不同途徑的PK/PD特性。將對應於1 µg rmIL12的等效莫耳量之DF-mIL12-Fc si以單一劑量形式藉由靜脈內、腹膜內或皮下投與注射於未攜帶腫瘤之Balb/c小鼠中，且如所描述評定PK/PD特徵。
如圖15C至圖15E中所示以及表16中定量，不同投與途徑當中，靜脈內(圖15C)、腹膜內(圖15D)或皮下(圖15E)投與皆得到具有可比性之DF-mIL12-Fc si介導之IFNγ產生。值得注意的是，皮下投與得到較低IL-12 Cmax。相應地，DF-mIL12-Fc si投與之藥物動力學特性(IL-12濃度)視投與途徑而變化，而藥力學特性(IFNγ產生)仍然持久且在不同途徑之間相對具有可比性。表 15-DF-mIL12-Fc si 及 rmIL12 之藥理學特徵
IL12 IFNγ
T1/2 跨度 Tmax Cmax AUC AUC
rmIL12 6.05 9.15 0.13 358.65 999.81 20304
DF-mIL12-Fc 29.85 6.92 0.19 258.20 5636.49 916654
表 16- 經由 IV 、 IP 及 SC 之 DF-mIL12-Fc si 之藥理學特徵
   T1/2 跨度 Tmax Cmax AUC
靜脈內 31.5 6.4 0.2 257.2 5985.6
腹膜內 34.70 5.19 N/A 75.09 3964.21
皮下 37.5 4.1 36.0 23.1 1938.1
實例7-B16F10小鼠模型中DF-mIL12-Fc si及PD-1阻斷之組合
進行DF-mIL12-Fc si及PD-1阻斷之組合療法以分析抗腫瘤免疫反應在已形成B16F10腫瘤中是否可放大。
用106 個B16F10黑素瘤細胞對C57BL/6小鼠進行注射，皮下注射至小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第8天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。當腫瘤平均體積達到約245 mm3 時，用0.5 µg同型對照、0.5 µg DF-mIL12-Fc si、200 µg抗PD-1純系RMP1-14或組合DF-mIL12-Fc si/抗PD-1腹膜內處理小鼠。用DF-mIL12-Fc si對動物一週注射一次且用抗PD-1對動物每週注射兩次。評定腫瘤生長60天，且監測存活期及體重。
如圖16A至圖16C中所示，雖然投與單獨的DF-mIL12-Fc si延遲了腫瘤消退(圖16A)且單獨的PD-1對腫瘤生長之作用最小(圖16B)，但DF-mIL12-Fc si與PD-1阻斷之組合進一步延遲腫瘤生長(圖16C)，表明抗PD-1處理進一步放大DF-mIL12-Fc si處理之抗腫瘤反應。
如圖17A及圖17B中所示，使用DF-mIL12-Fc si療法及與PD-1阻斷之組合的總存活期延長，相較於同型處理小鼠之15天及200 µg抗PD-1處理小鼠之17.5天，顯示了29天(DF-mIL12-Fc si單一療法)及36天(組合)之中值存活期(圖17A)。值得注意的是，儘管反應率高，但攜帶B16F10腫瘤之小鼠似乎對DF-mIL12-Fc si及組合療法之方案具有良好耐受性(圖17B)。
相應地，DF-mIL12-Fc si與PD-1阻斷之組合療法展現相較於單獨的任一處理改良之功效。 實例8-B16F10小鼠模型中DF-mIL12-Fc si與mcFAE-C26.99 TriNKET之組合
進行DF-mIL12-Fc si與mcFAE-C26.99 TriNKET之組合療法以分析抗腫瘤免疫反應在已形成B16F10腫瘤中是否可放大。
用106 個B16F10黑素瘤細胞對C57BL/6小鼠進行注射，皮下注射至小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。當腫瘤平均體積達到200 mm3 時，用150 µg同型對照或0.5 µg DF-mIL12-Fc si、150 µg TriNKET或組合DF-mIL12-Fc si/TriNKET腹膜內處理小鼠。評定腫瘤生長60天，且監測存活期及體重。
如圖18A中所示，用DF-mIL12-Fc si之單一療法使得腫瘤生長減少。在200 mm3 之起始腫瘤體積下用mcFAE-C26.99 TriNKET作為單一藥劑處理並未使腫瘤進展延遲(圖16B)。相比之下，相較於單獨的DF-mIL12-Fc si，DF-mIL12-Fc si與mcFAE-C26.99之組合進一步增強抗腫瘤反應(圖18C)且產生30%完全反應者(CR) (n=3)，表明TriNKET處理進一步放大DF-mIL12-Fc si處理之抗腫瘤反應。
如圖19A中所示，使用DF-mIL12-Fc si療法及與mcFAE-C26.99 TriNKET之組合的總存活期延長，相較於同型處理小鼠之16天及TriNKET處理小鼠之17天，顯示29天(DF-mIL12-Fc si單一療法)及60天(TriNKET組合)之中值存活期。值得注意的是，儘管反應率高，但攜帶B16F10腫瘤之小鼠似乎對DF-mIL12-Fc si及組合療法之方案具有良好耐受性(圖19B)。
在第一腫瘤接種後72天，用2×106 個B16F10黑素瘤細胞再攻毒三個完全反應者(來自上文所描述之實驗的CR及圖18C中的呈現之資料)。將年齡匹配之原生C57BL/6小鼠用作對照組。初始DF-mIL12-Fc si TriNKET組合處理組中的三分之一的小鼠仍無腫瘤，另一小鼠在第95天開始顯示腫瘤形成，且第三小鼠之腫瘤進展類似於年齡匹配對照組(圖20)，表明藉由組合療法形成了免疫記憶。
相應地，DF-mIL12-Fc si與TriNKETs之組合療法展現相較於單獨的任一處理改良之功效，包括在小鼠群體中展現完全、持久之反應。 實例9-用DF-mIL12-Fc si之處理在CT26腫瘤模型中促進完全恢復
此實例顯示用DF-mIL12-Fc si之處理促進攜帶CT26腫瘤之小鼠的恢復。
簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組且一週腹膜內注射一次等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照。評定腫瘤生長60天。在第一腫瘤接種後72天，用106 個CT26細胞再攻毒完全反應者。將年齡匹配之原生Balb/C小鼠用作對照組。
圖 21A 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與單一劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。圖 21B 為用CT26腫瘤細胞接種且投與每週劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之體重之圖表。圖 21C 為展示藉由接種CT26腫瘤細胞再攻毒之個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
如圖 21A 至圖 21B 中所示，相較於mIgG2a同型，投與DF-mIL12-Fc si產生穩固之腫瘤消退，且無影響處理動物之體重的可觀測毒性。如圖 21C 中所示，初始DF-mIL12-Fc si處理之小鼠仍無腫瘤，表明藉由DF-mIL12-Fc si處理形成了免疫記憶。 實例10-腹膜內或皮下遞送之DF mIL12-Fc si有效減小CT26腫瘤模型中之腫瘤體積
此實例顯示DF-mIL12-Fc si之腹膜內或皮下投與確保攜帶CT26腫瘤之小鼠的100%完全恢復。
簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組且用等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週腹膜內注射一次，或用等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週皮下注射一次。評定腫瘤生長60天以上。
圖 22A 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與腹膜內遞送的每週劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。圖 22B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與皮下遞送的每週劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
如圖 22A 至圖 22B 中所示，腹膜內或皮下遞送DF-mIL12-Fc si有效減小CT26腫瘤體積。 實例11-單一劑量投與DF-mIL12-Fc si有效減小B16F10小鼠模型中之腫瘤體積
此實例顯示單一劑量之DF-mIL12-Fc si有效減小攜帶B16F10黑素瘤之小鼠的腫瘤體積。
簡言之，用106 個B16F10黑素瘤細胞對C57BL/6小鼠進行注射，皮下注射至小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組。當腫瘤平均體積達到200 mm3 時，用單一劑量之同型對照或1 µg DF-mIL12-Fc si腹膜內處理小鼠。評定腫瘤生長50天。
如圖 23 中所示，單一投與1 µg DF-mIL12-Fc si有效減小攜帶B16F10腫瘤之小鼠的腫瘤體積。實例 12- 腹膜內或皮下遞送之 DF-mIL12-Fc si 有效減小 B16F10 小鼠模型中之腫瘤體積
此實例顯示DF-mIL12-Fc si之腹膜內或皮下投與促成攜帶B16F10黑素瘤之小鼠的100%完全恢復。
簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組。當腫瘤平均體積達到200 mm3 時，將小鼠用等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週腹膜內注射一次，或用等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週皮下注射一次。評定腫瘤生長40天。
如圖 24A 至圖 24B 中所示，相較於同型對照，腹膜內或皮下遞送DF-mIL12-Fc si有效減小B16F10腫瘤體積。 實例13-單一劑量形式之DF-mIL12-Fc si係有效的
此實例顯示DF-mIL12-Fc si在呈單一劑量形式投與時有效減小CT26腫瘤體積，但在經由重複給藥投與時更加有效。
簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第14天，當腫瘤體積達到270 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組且用單一劑量的等效於0.1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1.0 µg mIgG2a同型對照一週腹膜內注射一次，或用等效於1 µg rmIL12之莫耳劑量的1 µg DF-mIL12-Fc si或1 µg mIgG2a同型對照一週腹膜內注射一次。評定腫瘤生長60天以上。
圖 25A 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與單一劑量1 μg之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 25B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與每週劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
如圖 25A 中所示，相較於mIgG2a同型，單一投與1 µg DF-mIL12-Fc si促成攜帶腫瘤之小鼠之穩固的70%完全恢復。然而，如圖 25B 中所示，相較於mIgG2a同型，重複每週給藥1 µg DF-mIL12-Fc si確保攜帶腫瘤之小鼠的100%完全恢復。 實例14-DF-mIL12-Fc si對於較大腫瘤體積係有效的
此實例顯示，包括與具有突變L234A、L235A及P329G之鼠類IgG2a Fc域多肽之N端融合的野生型鼠類IL-12 p40及p35次單元的DF-mIL12-Fc si(實例2中所論述)對於較大腫瘤體積係有效的。
簡言之，將106 個CT26-Tyrp1結腸癌細胞皮下注射至Balb/c小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第18天，當腫瘤體積達到800 mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組(n=10/組)且用等效於1 µg或2 µg rmIL12之莫耳劑量的DF-mIL12-Fc si或莫耳當量之mIgG2a同型一週腹膜內處理一次。評定腫瘤生長47天。
圖 26A 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與每週劑量之1 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。圖 26B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與每週劑量之2 μg DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
如圖 26A 至圖 26B 中所示，相較於mIgG2a同型，一週投與一次DF-mIL12-Fc si促成穩固腫瘤消退。因此，DF-mIL12-Fc si處理對於較大腫瘤體積展現功效。 實例15-DF mIL12-Fc si處理促成持久的血清與瘤內IFNγ及趨化細胞素表現
此實例顯示DF-mIL12-Fc si處理使得攜帶B16F10腫瘤之C57BL/6小鼠之血液及腫瘤中的IFNγ、CXCL9及CXCL10之含量升高。
簡言之，將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組。當腫瘤平均體積達到200 mm3 時，用單一劑量的等效於0.5 µg rmIL12之莫耳劑量的DF-mIL12-Fc si、0.5 µg rmIL12或0.5 µg mIgG2a同型對照腹膜內注射小鼠。
圖 27A 、圖 27B 及圖 27C 為分別展示IFNγ、CXCL9及CXCL10之血液及瘤內含量的圖表。
如圖 27A 至圖 27C 中所示，相較於rmIL-12及mIgG2a同型對照，單一投與0.5 µg DF-mIL12-Fc si使得IFNγ、CXCL9及CXCL10含量升高。CCL2及CCL5之含量在DF-mIL12-Fc處理動物中亦升高(資料未展示)。 以引用之方式併入
本文所提及之專利文獻及科學論文各自之完整揭示內容出於所有目的以引用之方式併入。 等效物
本發明可在不偏離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式體現。因此，前述實施例應在所有方面中視為說明而不限制本文所描述的本發明。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍而非前述描述指示，且本文意欲涵蓋申請專利範圍等效物之含義及範圍內出現之所有變化。
圖 1A 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其包含藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之次單元及藉由連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之額外次單元。該第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有不同促進異二聚化之突變，且該等Fc域多肽之間的二硫鍵使異二聚體穩定。將額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽之連接子可包括(G4S)3 序列。
圖 1B 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其類似於圖1A中所示之蛋白質，而且該Fc域多肽中包括減少FcγR結合之突變。
圖 1C 說明為圖1A中所示之蛋白質之鏡像的一例示性蛋白質，其中多重次單元蛋白之額外次單元係藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽，且多重次單元蛋白之另一次單元係藉由另一連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
圖 1D 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其類似於圖1C中所示之蛋白質，而且在Fc域多肽中包括減少FcγR結合之突變。
圖 1E 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其類似於圖1B中所示之蛋白質，不同之處在於多重次單元蛋白之額外次單元位於第二多肽中之第二不同抗體Fc域多肽之C端。
圖 1F 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其類似於圖1E中所示之蛋白質，不同之處在於多重次單元蛋白之額外次單元位於第一多肽中之第一抗體Fc域多肽之C端。
圖 2A 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其包含藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之次單元及藉由另一連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之額外次單元，其中該等次單元係藉由兩個二硫鍵連接。第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有不同促進異二聚化之突變，且該等Fc域多肽之間的二硫鍵使異二聚體穩定。所說明蛋白質亦包括Fc域多肽中減少FcγR結合之突變。
圖 2B 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其包含藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之次單元及藉由另一連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之額外次單元，其中該等次單元係藉由一個非原生二硫鍵連接。在所示例示性蛋白質中，原生S-S橋鍵已移除且經人工S-S橋鍵置換。舉例而言，IL-12構築體可併入突變p35-V185C/C74S及p40-Y292C/C177S。第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有不同促進異二聚化之突變，且該等Fc域多肽之間的二硫鍵使異二聚體穩定。該蛋白質亦包括Fc域多肽中減少FcγR結合之突變。
圖 3A 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其包含藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之次單元及藉由具有相同胺基酸序列之另一連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之額外次單元。第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有不同促進異二聚化之突變，且該等Fc域多肽之間的二硫鍵使異二聚體穩定。
圖 3B 說明一例示性異二聚體Fc融合蛋白，其包含藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之次單元及藉由連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽的多重次單元蛋白之額外次單元。第一抗體Fc域多肽及第二不同抗體Fc域多肽各自含有不同促進異二聚化之突變，且該等Fc域多肽之間的二硫鍵使異二聚體穩定。將額外次單元連接至第二不同抗體Fc域多肽之連接子可包括(G4S)2 或G4S序列。
圖 4A 至圖 4L 說明例示性IL-12-scFv融合異二聚體Fc融合蛋白構築體(圖4A至圖4H)及IL-12-mAb融合異二聚體Fc融合蛋白構築體(圖4I至圖4L)，其中多重次單元蛋白之次單元係藉由連接子連接至第一抗體Fc域多肽，且多重次單元蛋白之額外次單元係藉由另一連接子連接至第二不同抗體Fc域多肽。
圖 4A 至圖 4D 說明例示性Fc融合蛋白，其包括連接至第一抗體Fc域多肽之C端的第一scFv及連接至第二抗體Fc域多肽之C端的第二scFv。第一scFv及第二scFv可相同或不同(例如結合於不同抗原或單一抗原上之不同抗原決定基)。圖4A及圖4C中所示之例示性Fc融合蛋白包含不同異二聚化Fc變異體對。圖4B及圖4D中所示之例示性Fc融合蛋白包含不同異二聚化Fc變異體對。舉例而言，在異二聚化突變包括「臼包杵」突變之情況下，圖4A及圖4D說明其中第一多肽包含「臼」突變且第二多肽包含「杵」突變的例示性Fc融合蛋白；圖4B及圖4C說明其中第一多肽包含「杵」突變且第二多肽包含「臼」突變之例示性Fc融合蛋白。圖4A及圖4B說明其中多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一多肽的例示性Fc融合蛋白；圖4C及圖4D說明其中多重次單元蛋白之額外次單元連接至第一多肽的例示性Fc融合蛋白。類似地涵蓋具有其他類型之異二聚化突變的異二聚體Fc融合蛋白。
圖 4E 及圖 4G 說明包括連接至第一抗體Fc域多肽之C端之scFv的例示性Fc融合蛋白。圖 4F 及圖 4H 說明包括連接至第二不同抗體Fc域多肽之C端之scFv的例示性Fc融合蛋白。
圖 4I 至圖 4L 說明包括連接至第一抗體Fc域多肽之N端之第一Fab及連接至第二不同抗體Fc域多肽之N端之第二Fab的例示性Fc融合蛋白。圖4I及圖4K說明其中多重次單元蛋白之次單元之蛋白質序列連接至第一多肽的例示性Fc融合蛋白；圖4J及圖4L說明其中多重次單元蛋白之額外次單元連接至第一多肽的例示性Fc融合蛋白。圖4K與圖4I之不同之處在於具有連接抗體Fc域多肽與多重次單元蛋白之次單元的較長胺基酸序列(例如本文所揭示之間隔肽)；圖4J與圖4L之不同之處在於具有連接抗體Fc域多肽與多重次單元蛋白之次單元的較長胺基酸序列(例如本文所揭示之間隔肽)。
圖 5A 至圖 5C 展示用CT26腫瘤細胞接種且用rmIL12 (圖5A)、DF-mIL12-Fc wt (圖5B)、DF-mIL12-Fc si (圖5C)或mIgG2a同型對照一週處理一次的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 6 為展示用CT26腫瘤細胞接種且用rmIL12、DF-mIL12-Fc wt、DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型對照一週處理一次的小鼠之Kaplan-Meier存活曲線的圖表。
圖 7A 至圖 7D 為展示用CT26腫瘤細胞接種且用1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt(圖7A)、1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si(圖7B)、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt(圖7C)、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si(圖7D)或mIgG2a同型對照一週處理一次的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 8 為展示用CT26腫瘤細胞接種且用1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt、1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型對照一週處理一次的小鼠之Kaplan-Meier存活曲線的圖表。
圖 9A 至圖 9C 展示用B16F10黑素瘤細胞接種且用rmIL12 (圖9A)、DF-mIL12-Fc wt (圖9B)、DF-mIL12-Fc si (圖9C)或mIgG2a同型對照一週處理一次的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 10 為展示用B16F10黑素瘤細胞接種且用rmIL12、DF-mIL12-Fc wt、DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型對照一週處理一次的小鼠之Kaplan-Meier存活曲線的圖表。
圖 11A 至圖 11D 為展示用B16F10黑素瘤細胞接種且用0.5 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt(圖11A)、0.5 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si(圖11B)、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt(圖11C)、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si(圖11D)或mIgG2a同型對照一週處理一次的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 12 為展示用B16F10黑素瘤細胞接種且用0.5 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt、0.5 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc wt、0.1 µg rmIL12之莫耳當量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型對照一週處理一次的小鼠之Kaplan-Meier存活曲線的圖表。
圖 13A 為使用HEK-Blue IL-12報導子分析展示關於用DF-hIL12-Fc si (DF IL12-Fc)及重組人類IL-12 (rhIL-12)處理之IL-12反應的圖表。
圖 13B 為展示回應於用DF-hIL12-Fc si (DF IL12-Fc)及重組人類IL-12 (rhIL-12)處理而藉由PBMC之IFNγ產生的圖表。
圖 14 為展示在以10 µg/kg次IV投藥等莫耳量之DF-hIL12-Fc si或野生型IL12之後，食蟹獼猴K2 EDTA血漿中DF-hIL12-Fc si、重組人類IL-12及IFNγ之相對血漿濃度的圖表。
圖 15A 至 15B 為展示原生Balb/c小鼠中之DF-mIL12-Fc之PK/PD特徵曲線的圖表。圖15B展示原生Balb/c小鼠中之DF-mIL12-Fc si之PK/PD特徵曲線，且圖15A展示原生Balb/c小鼠中之rmIL12之PK/PD特徵曲線。藉由ELISA分析血清中之IL12及IFNγ含量。圖 15C 為展示原生Balb/c小鼠中靜脈內投與之DF-mIL12-Fc si之PK/PD特徵曲線的圖表。圖15D 為展示原生Balb/c小鼠中腹膜內投與之DF-mIL12-Fc si之PK/PD特徵曲線的圖表。圖 15E 為展示原生Balb/c小鼠中皮下投與之DF-mIL12-Fc si之PK/PD特徵曲線的圖表。平均血清含量表示平均值+SEM。
圖 16A 至圖 16C 為展示用DF-mIL12-Fc si及抗PD-1處理的攜帶B16F10腫瘤之小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第8天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。用(圖16A)0.5 µg同型對照或0.5 µg DF-mIL12-Fc si (圖16B)同型對照或抗PD-1及(圖16C)同型對照或DF-mIL12-Fc si/抗PD-1腹膜內處理小鼠。如上文所指示，用DF-mIL12-Fc si對動物一週注射一次且用抗PD-1對動物每週注射兩次。評定腫瘤生長60天。圖表展示個別小鼠之腫瘤生長曲線。
圖 17A 至圖 17B 為展示用DF-mIL12-Fc si及抗PD-1處理的攜帶B16F10腫瘤之小鼠之存活率及體重的圖表。將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第8天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。用同型、DF-mIL12-Fc si、抗PD-1或DF-mIL12-Fc si及抗PD-1之組合處理小鼠。用0.5 µg DF-mIL12-Fc si對動物一週注射一次且用200 µg抗PD-1或同型對動物每週注射兩次。圖17A展示Kaplan-Meier存活曲線。圖17B展示呈平均值+SD形式的小鼠體重。
圖 18A 至圖 18C 為展示用DF-mIL12-Fc si及mcFAE-C26.99 TriNKET處理的攜帶B16F10腫瘤之小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。用(圖18A) 150 µg同型對照或0.5 µg DF-mIL12-Fc si、(圖18B)同型對照或150 µg TriNKET及(圖18C)同型對照或DF-mIL12-Fc si/TriNKET腹膜內處理小鼠。如上文所指示，用DF-mIL12-Fc si對動物一週注射一次且用TriNKET對動物每週注射三次。評定腫瘤生長72天。圖表展示個別小鼠之腫瘤生長曲線。
圖 19A 至圖 19B 為展示用DF-mIL12-Fc si及mcFAE-C26.99 TriNKET處理的攜帶B16F10腫瘤之小鼠之存活率及體重的圖表。將106 個B16F10黑素瘤細胞皮下注射至C57BL/6小鼠之側腹中。在腫瘤接種後第7天，將小鼠隨機分組(n=10/組)。用同型、DF-mIL12-Fc si、TriNKET或DF-mIL12-Fc si及TriNKET之組合處理小鼠。用0.5 µg DF-mIL12-Fc si對動物一週注射一次且用150 µg TriNKET或同型對動物每週注射三次。圖19A展示Kaplan-Meier存活曲線。圖19B展示呈平均值+SD形式的小鼠體重。
圖 20 為展示B16F10腫瘤模型中經再攻毒之完全反應者(CR)之腫瘤生長曲線的圖表。來自初始DF-mIL12-Fc si/TriNKET組合療法之完全反應者(CR) (n=3)及經老化匹配對照(n=4)接枝有2×105 個B16F10黑素瘤細胞。不施加處理。展示個別腫瘤體積。
圖 21A 為展示用CT26腫瘤細胞接種且投與單一劑量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 21B 為用CT26腫瘤細胞接種且投與單一劑量之DF-mIL12-Fc si、mIgG2a同型、重組鼠類IL-12 (「rmIL12」)的小鼠體重之圖表。
圖 21C 為展示原生的或在CT26腫瘤模型中先前已投與單一劑量之DF-mIL12-Fc si時為完全反應者(CR)的再攻毒個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 22A 至圖 22B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且腹膜內(圖22A)或皮下(圖22B)投與週劑量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。圖式中使用縮寫：IP-腹膜內；SC-皮下。
圖 23 為展示用B16F10黑素瘤細胞接種且投與單一劑量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 24A 至圖 24B 展示用B16F10黑素瘤細胞接種且腹膜內(圖24A)或皮下(圖24B)投與週劑量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2a同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。圖式中使用縮寫：IP-腹膜內；SC-皮下。
圖 25A 至圖 25B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且以1 µg重組小鼠IL-12 (rmIL-12)之莫耳當量腹膜內投與單一劑量(圖25A)或每週一次(圖25B)劑量之DF-mIL12-Fc si或mIgG2A同型的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 26A 至圖 26B 為展示用CT26腫瘤細胞接種且以1 µg rmIL12之莫耳當量(圖26A)或2 µg rmIL12之莫耳當量(圖26B)皮下投與每週一次劑量之DF-mIL12-Fc si的個別小鼠之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 27A 至圖 27C 為展示單一劑量之DF-mIL12-Fc si後72小時，攜帶B16F10腫瘤之C57BL/6小鼠之血液(左)及腫瘤(右)樣本中的IFNγ (圖27A)、CXCL9 (圖27B)及CXCL10 (圖27C)含量的圖表。
圖 28A 至圖 28C 為展示食蟹獼猴中以1 µg/kg (圖28A)、2 µg/kg (圖28B)或4 µg/kg (圖28C)皮下給藥後DF-hIL12-Fc si之生物可用性的線性圖表。
圖 29A 至圖 29C 為展示以1 µg/kg (圖29A)、2 µg/kg (圖29B)或4 µg/kg (圖29C)之劑量用DF-hIL12-Fc si皮下治療之食蟹獼猴中的IFNγ (左側欄)及IP10/CXCL10 (右側欄)之濃度的線性圖表。
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Claims (210)

  1. 一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含： (a)第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及該多重次單元蛋白之第二不同次單元， 其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低該Fc之效應功能之突變，且 其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  2. 如請求項1之異二聚體Fc融合蛋白，其中該效應功能包含Fc域多肽誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力。
  3. 如請求項1或2之異二聚體Fc融合蛋白，其中該異二聚體Fc融合蛋白經岩藻糖基化。
  4. 如請求項1至3中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類抗體Fc域多肽。
  5. 如請求項1至4中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE Fc域多肽。
  6. 如請求項5之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置233、234、235、236、237、297、318、320、322及/或329處的突變。
  7. 如請求項1至6中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG1 Fc域多肽。
  8. 如請求項7之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置234、235、237、329、330及/或331處的突變。
  9. 如請求項8之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L234A、L235A、L235E、G237A、P329A、A330S及P331S之突變。
  10. 如請求項9之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235A及P329A。
  11. 如請求項9之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A及L235A。
  12. 如請求項9之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
  13. 如請求項7至12中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變C220S。
  14. 如請求項1至6中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG4 Fc域多肽。
  15. 如請求項14之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置235及/或329處的突變。
  16. 如請求項15之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L235E及P329A之突變。
  17. 如請求項16之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E。
  18. 如請求項16之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E及P329A。
  19. 如請求項14至18中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變S228P。
  20. 一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含： (a)第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及該多重次單元蛋白之第二不同次單元， 其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中該多重次單元蛋白之該第一次單元係藉由第一連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，其中該第一連接子包含第一胺基酸序列，其中該第一胺基酸序列包含EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G，且 其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  21. 如請求項20之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)。
  22. 如請求項21之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)組成。
  23. 如請求項21或22之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，且其中該第二胺基酸序列包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)。
  24. 如請求項23之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)組成。
  25. 如請求項21或22之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，且其中該第二胺基酸序列包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)。
  26. 如請求項25之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)組成。
  27. 如請求項21或22之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)。
  28. 如請求項27之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)組成。
  29. 如請求項20之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)。
  30. 如請求項29之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)組成。
  31. 如請求項29或30之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)。
  32. 如請求項31之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)組成。
  33. 如請求項29或30之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)。
  34. 如請求項33之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)組成。
  35. 如請求項29或30之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)。
  36. 如請求項35之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)組成。
  37. 如請求項20之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)。
  38. 如請求項37之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)組成。
  39. 如請求項37或38之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)。
  40. 如請求項39之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)組成。
  41. 如請求項37或38之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)。
  42. 如請求項41之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)組成。
  43. 如請求項37或38之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)。
  44. 如請求項43之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)組成。
  45. 一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含： (a)第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽及多重次單元蛋白之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及該多重次單元蛋白之第二不同次單元， 其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中該多重次單元蛋白之該第一次單元係藉由第一連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，該第一連接子包含第一胺基酸序列，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)，其中X表示L或E，且 其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  46. 如請求項45之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)。
  47. 如請求項46之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)組成。
  48. 如請求項46或47之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)。
  49. 如請求項48之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)組成。
  50. 如請求項46或47之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)。
  51. 如請求項50之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)組成。
  52. 如請求項46或47之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)。
  53. 如請求項52之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)組成。
  54. 如請求項45之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)。
  55. 如請求項54之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)組成。
  56. 如請求項54或55之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)。
  57. 如請求項56之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)組成。
  58. 如請求項54或55之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:63)。
  59. 如請求項58之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)組成。
  60. 如請求項54或55之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)。
  61. 如請求項60之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)組成。
  62. 如請求項20至61中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低該Fc之效應功能的突變。
  63. 如請求項62之異二聚體Fc融合蛋白，其中該效應功能包含Fc域多肽誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力。
  64. 如請求項62或63之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG1 Fc域多肽。
  65. 如請求項64之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含一或多個選自L234A、L235A或L235E、G237A、P329A、A330S及P331S之突變。
  66. 如請求項64之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235A及P329A。
  67. 如請求項64之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A及L235A。
  68. 如請求項64之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
  69. 如請求項64至68中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變C220S。
  70. 如請求項62或63之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG4 Fc域多肽。
  71. 如請求項70之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含一或多個選自L235E及P329A之突變。
  72. 如請求項70之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E。
  73. 如請求項70之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E及P329A。
  74. 如請求項70至73中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變S228P。
  75. 如請求項7至13、20至44及64至69中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K360E、K409W及其組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由Q347R、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變。
  76. 如請求項75之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變K360E及K409W，且該第二抗體Fc域多肽包含突變Q347R、D399V及F405T。
  77. 如請求項7至13、20至44及64至69中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由Q347R、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K360E、K409W及其組合組成之群的突變。
  78. 如請求項77之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變Q347R、D399V及F405T，且該第二抗體Fc域多肽包含突變K360E及K409W。
  79. 如請求項14至19、45至61及70至74中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K370E、R409W及其組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由E357N、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變。
  80. 如請求項79之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變K370E及R409W，且該第二抗體Fc域多肽包含突變E357N、D399V及F405T。
  81. 如請求項14至19、45至61及70至74中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由E357N、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K370E、R409W及其組合組成之群的突變。
  82. 如請求項81之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變E357N、D399V及F405T，且該第二抗體Fc域多肽包含突變K370E及R409W。
  83. 如請求項14至19、45至61及70至74中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K360E、R409W及其組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由Q347R、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變。
  84. 如請求項83之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變K360E及R409W，且該第二抗體Fc域多肽包含突變Q347R、D399V及F405T。
  85. 如請求項14至19、45至61及70至74中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含一或多個選自由Q347R、D399V、F405T及其任何組合組成之群的突變，且該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自由K360E、R409W及其組合組成之群的突變。
  86. 如請求項85之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變Q347R、D399V及F405T，且該第二抗體Fc域多肽包含突變K360E及R409W。
  87. 如請求項1至86中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽進一步突變，以引入鏈間二硫橋鍵。
  88. 如請求項87之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變Y349C，且該第二抗體Fc域多肽包含突變S354C。
  89. 如請求項87之異二聚體Fc融合蛋白，其中該第一抗體Fc域多肽包含突變S354C，且該第二抗體Fc域多肽包含突變Y349C。
  90. 如請求項1至89中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白為多重次單元細胞介素。
  91. 如請求項90之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元細胞介素為IL-12。
  92. 如請求項91之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元細胞介素之該第一次單元為人類IL-12之p40次單元，且該多重次單元細胞介素之該第二不同次單元為人類IL-12之p35次單元。
  93. 如請求項91之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元細胞介素之該第一次單元為人類IL-12之p35次單元，且該多重次單元細胞介素之該第二不同次單元為人類IL-12之p40次單元。
  94. 如請求項92或93之異二聚體Fc融合蛋白，其中對應於野生型p35序列之C74經絲胺酸取代，對應於野生型p40序列之C177經絲胺酸取代，其中該等取代移除於人類IL-12之野生型p35次單元與野生型p40次單元之間所形成的原生S-S橋鍵。
  95. 如請求項94之異二聚體Fc融合蛋白，其中該p35包含V185C取代，且p40包含Y292C取代，其形成非原生人工或經工程改造S-S鍵。
  96. 如請求項1至95中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其進一步包含抗體可變域。
  97. 如請求項96之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體可變域包含抗體重鏈可變域。
  98. 如請求項97之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體重鏈可變域與該第一抗體Fc域多肽或該第二抗體Fc域多肽之N端融合。
  99. 如請求項98之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體重鏈可變域結合抗體輕鏈可變域，以形成Fab。
  100. 如請求項98之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體重鏈可變域進一步與抗體輕鏈可變域融合，以形成scFv。
  101. 如請求項98至100中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元分別與該第一抗體Fc域多肽之C端及該第二抗體Fc域多肽之C端融合。
  102. 如請求項97之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體重鏈可變域與該第一抗體Fc域多肽或該第二抗體Fc域多肽之該C端融合。
  103. 如請求項102之異二聚體Fc融合蛋白，其中該抗體重鏈可變域進一步與抗體輕鏈可變域融合，以形成scFv。
  104. 如請求項102或103之異二聚體Fc融合蛋白，其中該多重次單元蛋白之該等不同的第一及第二次單元分別與該第一抗體Fc域多肽之該N端及該第二抗體Fc域多肽之該N端融合。
  105. 如請求項1至95中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其不包含抗體可變域。
  106. 如請求項1至95及105中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其進一步包含蛋白聚糖結合域。
  107. 如請求項106之異二聚體Fc融合蛋白，其中該蛋白聚糖結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中之蛋白聚糖。
  108. 如請求項107之異二聚體Fc融合蛋白，其中該蛋白聚糖結合域結合一或多種選自以下之蛋白聚糖：多配體蛋白聚糖(syndecan)、絲甘蛋白聚糖(serglycin)、CSPG4、β蛋白聚糖(betaglycan)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)、珍珠素(perlecan)、多功能蛋白聚糖(versican)、短蛋白聚糖(brevican)及富含白胺酸之小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan；SLRP)。
  109. 如請求項108之異二聚體Fc融合蛋白，其中該等SLRP係選自核心蛋白聚糖(decorin)、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)、無孢蛋白聚糖(asporin)、纖調蛋白聚糖(fibrodulin)及基膜聚糖(lumican)。
  110. 如請求項1至95及105至109中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其進一步包含膠原蛋白結合域。
  111. 如請求項110之異二聚體Fc融合蛋白，其中該膠原蛋白結合域結合一或多種特異性表現於腫瘤中之膠原蛋白。
  112. 如請求項1至95及105至111中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其進一步包含玻尿酸結合域。
  113. 如請求項106至112中任一項之異二聚體Fc融合蛋白，其中該蛋白聚糖結合域、膠原蛋白結合域或玻尿酸結合域與該第一抗體Fc域多肽或該第二抗體Fc域多肽之該C端融合。
  114. 一種異二聚體Fc融合蛋白，其包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二多肽。
  115. 一種調配物，其包含如前述請求項中任一項之異二聚體Fc融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  116. 一種細胞，其包含一或多個編碼如請求項1至114中任一項之異二聚體Fc融合蛋白的核酸。
  117. 一種治療癌症之方法，該方法包含向患者投與如請求項1至114中任一項之異二聚體Fc融合蛋白或如請求項115之調配物。
  118. 一種治療急性輻射症候群之方法，該方法包含向患者投與如請求項1至114中任一項之異二聚體Fc融合蛋白或如請求項115之調配物。
  119. 如請求項118之方法，其中該急性輻射症候群包含一或多個選自以下之症候群：造血性輻射症候群、胃腸性輻射症候群、神經血管性輻射症候群、皮膚輻射症候群及其任何組合。
  120. 如請求項117之方法，其進一步包含向該患者投與選自以下之第二治療劑：檢查點阻斷劑、細胞介素、TLR促效劑、STING促效劑、化學治療劑、癌症靶向劑、溶瘤病毒、疫苗、輻射、授受性NK療法、幹細胞移植(SCT)療法、促效抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法、多重特異性結合蛋白(TriNKET)及誘導細胞老化之藥劑。
  121. 如請求項120之方法，其中該檢查點阻斷劑係選自：抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗KIR抗體、抗NKG2A抗體、抗LAG3抗體及抗TIM3抗體。
  122. 如請求項120之方法，其中該TLR促效劑係選自TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR7/8促效劑、TLR9促效劑、TLR4促效劑及TLR3促效劑。
  123. 如請求項120之方法，其中該STING促效劑為ADU-S100。
  124. 如請求項120之方法，其中該化學治療劑為太平洋紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)、小紅莓(doxorubicin)、吉西他濱(gemcitabine)或環磷醯胺。
  125. 如請求項120之方法，其中該檢查點阻斷劑係選自：納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)、利瑞路單抗(lirilumab)及莫納珠單抗(monalizumab)。
  126. 如請求項120之方法，其中該TLR促效劑係選自：R848/雷西莫特(resiquimod)、VTX-2337、咪喹莫特(imiquimod)及CpG寡去氧核苷酸。
  127. 如請求項120之方法，其中該促效抗體係選自抗4-IBB/CD137抗體、抗OX40抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體、抗GITR抗體及抗CD27抗體。
  128. 如請求項120之方法，其中該細胞介素係選自IL-2、IL-15、CXCL9及CXCL10。
  129. 如請求項120之方法，其中該多重特異性結合蛋白(TriNKET)包含： (a)    結合NKG2D的第一抗原結合位點； (b)    結合腫瘤相關抗原之第二抗原結合位點；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點； 其中該腫瘤相關抗原係選自由以下組成之群：EpCAM、CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4及PD-L1。
  130. 如請求項117或120至129中任一項之方法，其中向該患者瘤內投與如請求項1至111中任一項之異二聚體Fc融合蛋白或如請求項112之調配物。
  131. 如請求項117或120至130中任一項之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：急性骨髓白血病、急性骨髓單核球性白血病、B細胞淋巴瘤、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃腸癌、胃腸道基質瘤(gastrointestinal stromal tumor)、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、黑素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、腎細胞癌、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌、神經內分泌腫瘤、卵巢癌及胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、小細胞肺癌、T細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、泌尿上皮癌、骨髓衍生之抑制細胞浸潤癌、細胞外基質沈積相關癌症、高含量之反應性基質相關癌症及血管新生相關癌症。
  132. 一種治療癌症之方法，該方法包含向患者僅投與單一劑量之異二聚體IL12-Fc融合蛋白。
  133. 如請求項132之方法，其中該單一劑量係足以誘導對該癌症之完全反應的量。
  134. 如請求項133之方法，其中該單一劑量係足以延遲或阻止該癌症復發之量。
  135. 如請求項132至134中任一項之方法，其中該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含：(a)第一多肽，該第一多肽包含第一抗體Fc域多肽及IL-12之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及IL-12之第二不同次單元，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中該IL-12之該第一次單元係藉由第一連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，其中該第一連接子包含第一胺基酸序列，其中該第一胺基酸序列包含EPKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 6)或PKSSDKTHTCPPCPAPEX1 X2 GX3 (SEQ ID NO: 237)，其中X1 表示L或A，X2 表示L、E或A，且X3 表示A或G，且 其中IL-12之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  136. 如請求項135之方法，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)。
  137. 如請求項136之方法，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 7)或PKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 238)組成。
  138. 如請求項136或137之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，且其中該第二胺基酸序列包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)。
  139. 如請求項138之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 8)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 241)組成。
  140. 如請求項136或137之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，且其中該第二胺基酸序列包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)。
  141. 如請求項140之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 15)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 242)組成。
  142. 如請求項136或137之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)。
  143. 如請求項142之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 16)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 243)組成。
  144. 如請求項135之方法，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)。
  145. 如請求項144之方法，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 9)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 239)組成。
  146. 如請求項144或145之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)。
  147. 如請求項146之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 10)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 244)組成。
  148. 如請求項144或145之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)。
  149. 如請求項148之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 65)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 245)組成。
  150. 如請求項144或145之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)。
  151. 如請求項150之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 66)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG (SEQ ID NO: 246)組成。
  152. 如請求項135之方法，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)。
  153. 如請求項152之方法，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 11)或PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 240)組成。
  154. 如請求項152或153之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)。
  155. 如請求項154之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 12)或GGGGSGGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 247)組成。
  156. 如請求項152或153之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)。
  157. 如請求項156之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO:67)或GGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 248)組成。
  158. 如請求項152或153之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)。
  159. 如請求項158之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 68)或GGGGSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGA (SEQ ID NO: 249)組成。
  160. 如請求項132至134中任一項之方法，其中該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含： (a)第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽及IL-12之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及IL-12之第二不同次單元， 其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中IL-12之該第一次單元係藉由第一連接子與該第一抗體Fc域多肽融合，該第一連接子包含第一胺基酸序列，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFXGG (SEQ ID NO: 1)，其中X表示L或E，且 其中IL-12之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  161. 如請求項160之方法，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)。
  162. 如請求項161之方法，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 2)組成。
  163. 如請求項161或162之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)。
  164. 如請求項163之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 3)組成。
  165. 如請求項161或162之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)。
  166. 如請求項165之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 13)組成。
  167. 如請求項161或162之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)。
  168. 如請求項167之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 14)組成。
  169. 如請求項160之方法，其中該第一胺基酸序列包含胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)。
  170. 如請求項169之方法，其中該第一胺基酸序列由胺基酸序列RVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 4)組成。
  171. 如請求項169或170之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)。
  172. 如請求項171之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 5)組成。
  173. 如請求項169或170之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO:63)。
  174. 如請求項173之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 63)組成。
  175. 如請求項169或170之方法，其中IL-12之該第二不同次單元係藉由第二連接子與該第二抗體Fc域多肽融合，該第二連接子包含第二胺基酸序列，其中該第二胺基酸包含胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)。
  176. 如請求項175之方法，其中該第二胺基酸序列由胺基酸序列GGGGSGGGGSRVESKYGPPCPPCPAPEFEGG (SEQ ID NO: 64)組成。
  177. 如請求項132至134中任一項之方法，其中該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含： (a)第一多肽，其包含第一抗體Fc域多肽及IL-12之第一次單元；及 (b)第二多肽，其包含第二抗體Fc域多肽及IL-12之第二不同次單元， 其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含促進異二聚化之不同突變， 其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個降低該Fc之效應功能之突變，且 其中IL-12之該等不同的第一及第二次單元彼此結合。
  178. 如請求項137之方法，其中該效應功能包含Fc域多肽誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力。
  179. 如請求項177或178之方法，其中該異二聚體Fc融合蛋白經岩藻糖基化。
  180. 如請求項177至179中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類抗體Fc域多肽。
  181. 如請求項177至180中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE Fc域多肽。
  182. 如請求項181之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置233、234、235、236、237、297、318、320、322及/或329處的突變。
  183. 如請求項177至182中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG1 Fc域多肽。
  184. 如請求項183之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置234、235、237、329、330及/或331處的突變。
  185. 如請求項184之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L234A、L235A、L235E、G237A、P329A、A330S及P331S之突變。
  186. 如請求項185之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235A及P329A。
  187. 如請求項185之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A及L235A。
  188. 如請求項185之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
  189. 如請求項183至188中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變C220S。
  190. 如請求項177至182中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽為人類IgG4 Fc域多肽。
  191. 如請求項190之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個在EU編號之位置235及/或329處的突變。
  192. 如請求項191之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及/或該第二抗體Fc域多肽包含一或多個選自L235E及P329A之突變。
  193. 如請求項192之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E。
  194. 如請求項192之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變L235E及P329A。
  195. 如請求項190至194中任一項之方法，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽各自包含突變S228P。
  196. 如請求項132至195中任一項之方法，其中該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第二不同多肽。
  197. 如請求項132至195中任一項之方法，其中該異二聚體IL12-Fc融合蛋白包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 291之第一多肽及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 290之第二不同多肽。
  198. 如請求項132至197中任一項之方法，其中向該患者瘤內或靜脈內投與該異二聚體IL-12-Fc融合蛋白。
  199. 如請求項198之方法，其中向該患者瘤內投與該異二聚體IL-12-Fc融合蛋白。
  200. 如請求項132至199中任一項之方法，其進一步包含向該患者投與選自以下之第二治療劑：檢查點阻斷劑、細胞介素、TLR促效劑、STING促效劑、化學治療劑、癌症靶向劑、溶瘤病毒、疫苗、輻射、授受性NK療法、幹細胞移植(SCT)療法、促效抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法、多重特異性結合蛋白(TriNKET)及誘導細胞老化之藥劑。
  201. 如請求項200之方法，其中該檢查點阻斷劑係選自：抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗KIR抗體、抗NKG2A抗體、抗LAG3抗體及抗TIM3抗體。
  202. 如請求項200之方法，其中該TLR促效劑係選自TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR7/8促效劑、TLR9促效劑、TLR4促效劑及TLR3促效劑。
  203. 如請求項200之方法，其中該STING促效劑為ADU-S100。
  204. 如請求項200之方法，其中該化學治療劑為太平洋紫杉醇、白蛋白結合型太平洋紫杉醇、小紅莓、吉西他濱或環磷醯胺。
  205. 如請求項200之方法，其中該檢查點阻斷劑係選自：納武單抗、派立珠單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、曲美單抗、利瑞路單抗及莫納珠單抗。
  206. 如請求項200之方法，其中該TLR促效劑係選自：R848/雷西莫特、VTX-2337、咪喹莫特及CpG寡去氧核苷酸。
  207. 如請求項200之方法，其中該促效抗體係選自抗4-IBB/CD137抗體、抗OX40抗體、抗CD40抗體、抗CD40L抗體、抗GITR抗體及抗CD27抗體。
  208. 如請求項200之方法，其中該細胞介素係選自IL-2、IL-15、CXCL9及CXCL10。
  209. 如請求項200之方法，其中該多重特異性結合蛋白(TriNKET)包含： (a)    結合NKG2D的第一抗原結合位點； (b)    結合腫瘤相關抗原之第二抗原結合位點；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點； 其中該腫瘤相關抗原係選自由以下組成之群：EpCAM、CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4及PD-L1。
  210. 如請求項132至209中任一項之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：急性骨髓白血病、急性骨髓單核球性白血病、B細胞淋巴瘤、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃腸癌、胃腸道基質瘤、神經膠母細胞瘤、頭頸癌、黑素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、腎細胞癌、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌、神經內分泌腫瘤、卵巢癌及胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、小細胞肺癌、T細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、泌尿上皮癌、骨髓衍生之抑制細胞浸潤癌、細胞外基質沈積相關癌症、高含量之反應性基質相關癌症及血管新生相關癌症。
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