JP2021531268A

JP2021531268A - 改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法

Info

Publication number: JP2021531268A
Application number: JP2021500915A
Authority: JP
Inventors: ジョナサンシー．ランシング; ダニエルオルティス
Original assignee: モメンタファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-11-18
Also published as: US20220267460A1; KR20210042326A; EP3820519A1; WO2020014486A1; CN113164591A; AU2019302740A1; CA3106212A1; BR112021000392A2; EP3820519A4; IL279998A; MX2021000287A

Abstract

本開示は、改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体の組成物および方法に関するものであり、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、少なくとも２個のＦｃドメインと少なくとも１個の抗原結合ドメインとを含む。【選択図】図１

Description

開示の背景
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、Ｆｃドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。治療用タンパク質の改善に対するニーズは未だ存在する。

開示の概要
本開示は、抗原結合ドメインの標的特異性と、少なくとも２個のＦｃドメインを組み合わせて、固有の生物活性を有する新たな治療法を生み出すための組成物および方法を特徴とする。本明細書に記載される組成物および方法は、複数のポリペプチド鎖からの複数の抗原結合ドメインおよび複数のＦｃドメインを有するタンパク質の構築体を可能にする。抗原結合ドメインの数および間隔は、標的抗原に対するタンパク質複合体の結合特性（例えば、結合力）を変えるように調整され得、Ｆｃドメインの数は、抗原結合細胞を死滅させるエフェクター機能の大きさを制御するように調整され得る。変異（すなわち、本明細書に記載されるヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体形成変異）がポリペプチドに導入されて、産生された望ましくない、あるいは組み立てられたタンパク質の数を低減する。一部の例では、ヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体形成変異がＦｃドメイン単量体に導入され、特異的に変異したＦｃドメイン単量体は、タンパク質に組み立てられる異なるポリペプチド鎖の間に配置されて、所望のタンパク質構造へのポリペプチド鎖の組み立てを制御する。これらの変異は、ある特定のＦｃドメイン単量体の所望の対形成を選択的に安定化し、他のＦｃドメイン単量体の望ましくない対形成を選択的に不安定化する。場合によっては、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、Ｆｃ単量体のうちの少なくとも２個が異なるヘテロ二量体形成変異を含有する（したがって、配列が互いに異なる）、複数のＦｃドメイン単量体を含有する第１のポリペプチド、例えば、異なるヘテロ二量体形成変異を伴う２つ以上のＦｃ単量体を有するより長いポリペプチド、ならびに追加のポリペプチドのＦｃ単量体が互いに異なるヘテロ二量体形成変異（およびしたがって、異なる配列）を含有する、各々が少なくとも１個のＦｃ単量体を含有する少なくとも２個の追加のポリペプチド、例えば、各々が異なるヘテロ二量体形成変異を伴う単一Ｆｃドメイン単量体を含有する、２個のより短いポリペプチドによって形成された「直交性」Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体である。追加のポリペプチドのヘテロ二量体形成変異は、第１のポリペプチドの少なくともＦｃ単量体のヘテロ二量体形成変異に適合する。

いくつかの例では、本開示は、Ｆｃドメイン、例えば、治療用抗体を含む治療用タンパク質の抗原結合ドメインを、少なくとも２個のＦｃドメインと組み合わせて、新規の治療用構築物を生成することを企図する。そのような構築体を作製するために、本開示は、少なくとも２個、例えば複数のＦｃドメインを有する構築体の組み立てるための様々な方法を提供するものであり、それにより、それらのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成が制御され、限られた数のポリペプチド鎖からの異なるサイズの分子の組み立てが行われ、そしてそれらポリペプチドもまた本開示の対象である。これらの構築体の特性により、実質的に均質な医薬組成物の効率的な生成が可能となる。医薬組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、医薬組成物においてそのような均質性があることが望ましい。一部の実施形態において、本明細書に記載される少なくとも２個のＦｃドメインを有する新規の治療用構築物は、単一Ｆｃドメインを有する治療用タンパク質よりも大きい生物活性を有する。

第１の態様において、本開示は、少なくとも１個の抗原結合ドメインと、リンカーにより第２のＦｃドメインに連結された第１のＦｃドメインとを含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合構築体は、強化されたエフェクター機能を含み、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、少なくとも１個の抗原結合ドメインと、リンカーにより第２のＦｃドメインに連結された第１のＦｃドメインとを含み、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、１つのＦｃドメインと抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている。

一態様において、本開示は、抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体；任意の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意の第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドに関し、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、少なくとも１個の他のＦｃドメイン単量体は、少なくとも１、２または３個の逆電荷変異を含む。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメイン、および任意でＣＨ１ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含む。

一部の実施形態において、第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、少なくとも２個の逆電荷変異を含む。

一部の実施形態において、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体の両方は各々、少なくとも２個の逆電荷変異を含む。

一部の実施形態において、逆電荷変異を含むポリペプチドのＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は各々、同一の逆電荷変異を有する。一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異を含むポリペプチドのＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む。一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異および少なくとも１個の逆電荷変異を含むポリペプチドのＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、逆電荷変異を含むが突起形成変異は含まないポリペプチドのＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体の逆電荷変異（複数可）とは異なる逆電荷変異を含む。

一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン内にある。一部の実施形態において、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位の両端を含む配列内にある。一部の実施形態において、変異は、単一アミノ酸変化である。

一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは、グリシンスペーサーである。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基からなる。

一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１個は、ＥＵのＩ２５３位で単一アミノ酸変異を含む。一部の実施形態において、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａである。

一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１個は、ＥＵのＲ２９２位で単一アミノ酸変異を含む。一部の実施形態において、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐである。

一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のヒンジは独立して、

および

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

を有する。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

を有し、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

を有する。

一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列

を含む。

一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む。

一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される。

一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体の各々は独立して、最大で１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換のうちの最大で６個は、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位の両端を含む配列内にある。

一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１個は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１個の逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除くＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除くＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ１抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる。

別の態様において、上記の実施形態のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに連結され、ポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ポリペプチドの第１、第２、または第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン、および第２のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結される。

一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、改変された空洞を形成する変異を含む。一部の実施形態において、改変された空洞を形成する変異は、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択される。一部の実施形態において、改変された空洞を形成する変異は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ７３である。一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１個の逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される。一部の実施形態において、少なくとも１個の逆電荷変異は、Ｋ３７０Ｄである。一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む。

一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、抗原結合ドメインをさらに含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除くＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である。一部の実施形態において、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除くＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ１抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる。

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドにさらに連結され、ポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、ポリペプチドの第１、第２、または第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン、および第３のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、第２および第３のポリペプチドは、ポリペプチドの異なるＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体に連結する。

一部の実施形態において、第３のポリペプチド単量体は、少なくとも２個の逆電荷変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される。

一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される少なくとも１個の逆電荷変異を含み、第３のポリペプチド単量体は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される少なくとも２個の逆電荷変異を含み、第２および第３のポリペプチド単量体は、異なる逆電荷変異を含む。

一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、最大で１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、最大で１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ポリペプチドは、２個のＦｃ単量体を含み、１個のＦｃ単量体は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含み、１個のＦｃ単量体は、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む。一部の実施形態において、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含むＦｃ単量体は、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む。

一部の実施形態において、ポリペプチドは、３個のＦｃ単量体を含み、１個のＦｃ単量体は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含み、２個のＦｃ単量体は、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む。一部の実施形態において、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含むＦｃ単量体は、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む。

一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｋ３７０Ｄ変異をさらに含む。一部の実施形態において、第３のポリペプチド単量体は、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む。一部の実施形態において、第２のポリペプチド単量体は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含み、第３のポリペプチド単量体は、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む。一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、単一Ｆｃドメインおよび少なくとも１個の抗原結合ドメインを有するポリペプチド複合体に対して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、増強されたエフェクター機能を含む。

別の態様において、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと、を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、当該第１のＦｃドメイン単量体および当該第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、当該第２のＦｃドメイン単量体および当該第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する。

一部の実施形態において、リンカーは、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＦｃドメイン単量体は、少なくとも２個の逆電荷変異を含む。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む。一部の実施形態において、変異は、単一アミノ酸変化である。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体の各々は独立して、最大で１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換のうちの最大で６個は、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位の両端を含む配列内にある。一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１個は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１個の逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＥ３５７Ｋ変異を含み、第２のＦｃドメイン単量体は、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む。一部の実施形態において、第３のＦｃドメイン単量体は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む。一部の実施形態において、第４のＦｃドメイン単量体は、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｖ_Ｌドメインをさらに含む。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、Ｖ_Ｌドメインを含む第４のポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｖ_Ｈドメインは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む。一部の実施形態において、Ｖ_Ｈドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む。一部の実施形態において、Ｖ_Ｈドメインは、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除くＶ_Ｈ配列は、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列に対し、少なくとも９５％同一である。一部の実施形態において、Ｖ_Ｈドメインは、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列を含む。

別の態様において、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、ならびにｉｖ）第２のＦｃドメイン単量体を第３のＦｃドメイン単量体に連結するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと、を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、第１のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、第３のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第３のＦｃドメインを形成する。

一部の実施形態において、リンカーは、

一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２および第３のＦｃドメイン単量体は各々、少なくとも２個の逆電荷変異を含む。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む。一部の実施形態において、変異は、単一アミノ酸変化である。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体の各々は独立して、最大で１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換のうちの最大で６個は、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位の両端を含む配列内にある。一部の実施形態において、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１個は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１個の逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＥ３５７Ｋ変異を含み、第２および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む。一部の実施形態において、第４のＦｃドメイン単量体は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む。一部の実施形態において、第５のＦｃドメイン単量体は、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む。

別の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法に関し、方法は、ａ）（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、（４）抗原結合ドメインと、を発現する宿主細胞を培養することであって、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、抗原結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに連結され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、ことと、ｂ）細胞培養上清からＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと、を含む。

一部の実施形態において、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％は、構造的に同一である。

別の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法に関し、方法は、ａ）（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、ｖ）第２のＦｃドメイン単量体を第３のＦｃドメイン単量体に連結するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、（２）第４のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、（４）抗原結合ドメインと、を発現する宿主細胞を培養することであって、第１のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、第３のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて第３のＦｃドメインを形成し、抗原結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドに連結され、それにより、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、ことと、ｂ）細胞培養上清からＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと、を含む。

本開示のすべての態様において、Ｆｃドメイン単量体の一部または全部（例えば、１０、８、６、または４個以下の単一アミノ酸置換（例えば、ＣＨ３ドメイン内のみ）を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＦｃドメイン単量体）は、他のアミノ酸置換または改変に加えて、Ｅ３４５ＫおよびＥ４３Ｇアミノ酸置換のうちの一方または両方を含むことができる。Ｅ３４５ＫおよびＥ４３Ｇアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン多量体形成を増加させることができる。

定義：
本明細書に記載される場合、「Ｆｃドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第２および第３の抗体定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）、またはそれらの機能性断片（例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、ＣＨ２ドメインまたはその機能性断片、およびＣＨ３ドメインまたはその機能性断片）（例えば、（ｉ）別のＦｃドメイン単量体と二量体形成してＦｃドメインを形成し、そして（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合することができる断片）を含むポリペプチド鎖を指す。好ましいＦｃドメイン単量体は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１ＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。したがって、Ｆｃドメイン単量体、例えば、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３１６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｐ３１７〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｓ３１９〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｃ３２０〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｄ３２１〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２２〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｈ３２４〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２５〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、またはＣ３２６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７にわたることができる。Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である（例えば、ＩｇＧ）。さらに、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る（例えば、ヒトＩｇＧ１）。ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトＩｇＧ１の完全ヒンジドメインは、ＥＵナンバリングＥ３１６〜Ｐ２３０またはＬ２３５にわたり、ＣＨ２ドメインは、Ａ２３１またはＧ２３６〜Ｋ３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｋ４４７にわたる。ヒンジドメインの最後のアミノ酸の位置については異なる見解がある。それは、Ｐ２３０またはＬ２３５のいずれかである。本明細書の多くの実施例において、ＣＨ３ドメインはＫ３４７を含まない。ゆえにＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｇ４４６であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、Ｅ２１６〜Ｌ２３５を含み得る。これは、例えば、ヒンジがＣＨ１ドメインまたはＣＤ３８結合ドメインに対してカルボキシ末端であるときに当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどの一部の例において、ＥＵナンバリング２２１のＡｓｐは、Ｇｌｎに変異される。Ｆｃドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Ｆｃドメイン単量体は、野生型（例えば、ヒト）Ｆｃドメイン単量体配列からの変更を１０程度（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加、または欠失）含有することが可能であり、該変更は、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用を変える。Ｆｃドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加または欠失）からの変更（例えば、単一アミノ酸置換）を１０程度含有することが可能であり、当該変更は、Ｆｃドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメイン配列：

と比較して、ＣＨ３ドメイン上に、最大で１０、８、６または５個の単一アミノ酸置換が存在する。好適な変更の例は、この技術分野で公知である。

ここで、「Ｆｃドメイン」という語は、Ｆｃ受容体を結合することが可能である２つのＦｃドメイン単量体による二量体を指す。野生型Ｆｃドメインでは、２つのＦｃドメイン単量体が２つのＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の相互作用、ならびに二量体形成している２つのＦｃドメイン単量体のヒンジドメイン間に形成される１つ以上のジスルフィド結合によって二量体形成する。

本開示において、「Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体」という用語は、本明細書に記載のＦｃドメインを少なくとも２個形成し、少なくとも１個の「抗原結合ドメイン」を含む会合したポリペプチド鎖を指す。本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、同一または異なる配列を有するＦｃドメイン単量体を含むことが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの２つがＩｇＧ１またはＩｇＧ１に由来するＦｃドメイン単量体を含み、３つ目がＩｇＧ２またはＩｇＧ２に由来するＦｃドメイン単量体を含む。別の非限定的な例において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３個のＦｃドメインを有することができ、そのうちの２個は、「空洞に突起が挿入された対」（「ノブイントゥホール対」としても既知）を含み、そのうちの第３のＦｃドメインは、「空洞に突起が挿入された対」を含まず、例えば、第３のＦｃドメインは、空洞に突起が挿入された対ではなく１つ以上の静電的ステアリング変異を含むか、または第３のＦｃドメインは、野生型配列を含む（すなわち、変異を含まない）。Ｆｃドメインは、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃγＲＩＶであるＦｃ受容体と結合する最小限の構造を形成する。場合によっては、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、複数のＦｃドメイン単量体を含有する第１のポリペプチド（ここで、Ｆｃ単量体のうちの少なくとも２個が、異なるヘテロ二量体形成変異を含有する（すなわち、Ｆｃ単量体の各々が、異なる突起形成変異を有するか、または各々が、異なる静電的ステアリング変異を有するか、または１個の単量体が、突起形成変異を有し、１個の単量体が、静電的ステアリング変異を有する））を、各々が少なくとも１個のＦｃ単量体を含有する少なくとも２個の追加のポリペプチド（ここで、追加のポリペプチドのＦｃ単量体が、互いとは異なるヘテロ二量体形成変異を含有する（すなわち、追加のポリペプチドのＦｃ単量体が、異なる突起形成変異を有するか、または異なる静電的ステアリング変異を有するか、または１個の単量体が、突起形成変異を有し、１個の単量体が、静電的ステアリング変異を有する））に連結することにより形成される、「直交性」Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体である。追加のポリペプチドのヘテロ二量体化変異は、第１のポリペプチドの少なくともＦｃ単量体のヘテロ二量体化変異に適合して関連する。

本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、標的分子に特異的に結合することができるペプチド、ポリペプチド、または会合したポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態では、「抗原結合ドメイン」は、抗体により結合される抗体に、特異性をもって結合する抗体の最小配列である。当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）または様々な免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ）を使用して、抗原に対する抗体の特異性を評価することができる。一部の実施形態において、「抗原結合ドメイン」は、抗体の可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）、例えば表１Ａおよび１Ｂに記載の抗体のＣＤＲを１つ以上、表２に記載される抗体のＣＤＲを１つ以上、または表２に記載される抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを、任意でＶＬドメインとともに含み得る。他の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体のＦａｂ断片またはｓｃＦｖである。抗原結合ドメインは、例えばフィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、フィブロネクチンのＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディなど）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。

本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在は抗原結合に必須である。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３、ならびにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより規定される場合の「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２４−３４残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０−５６残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および８９−９７残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５０−６５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９５−１０２残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「超可変ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｌｏｏｐ）」からのそれら残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２６−３２残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０−５２残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および９１−９６残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５３−５５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９６−１０１残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含んでもよい。一部の例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従い規定されるＣＤＲ領域と、超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。

「フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎｓ）」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外のそれら可変ドメイン残基である。各可変ドメインは通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として識別される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従い規定される場合、軽鎖ＦＲ残基はおよそ１−２３残基（ＬＣＦＲ１）、３５−４９残基（ＬＣＦＲ２）、５７−８８残基（ＬＣＦＲ３）、および９８−１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基中、およそ１−３０残基（ＨＣＦＲ１）、３６−４９残基（ＨＣＦＲ２）、６６−９４残基（ＨＣＦＲ３）、および１０３−１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。ＣＤＲが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中、およそ１−２５残基（ＬＣＦＲ１）、３３−４９残基（ＬＣＦＲ２）、５３−９０残基（ＬＣＦＲ３）、および９７−１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中、およそ１−２５残基（ＨＣＦＲ１）、３３−５２残基（ＨＣＦＲ２）、５６−９５残基（ＨＣＦＲ３）、および１０２−１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。一部の例では、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔに規定されるＣＤＲと、超可変ループの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基は、適切に調整されるであろう。

「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合の部位を含有する抗体断片である。この領域は、緊密に会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、例えばｓｃＦｖにおいては共有結合性であり得る。この構造において、各可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用して、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体表面上の抗原結合部位を規定する。

「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインと定常ドメイン、および重鎖の可変ドメインと第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、一般的にヒンジシステインによりそのカルボキシ末端近傍で共有結合されるＦａｂ断片の対を含む。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖中に抗体のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインを含む。一般的に、ｓｃＦｖは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖは所望の抗原結合のための構造を形成することができるようになる。

ここで、「抗体定常ドメイン」という語は、抗体の定常領域ドメイン（例えば、Ｃ_Ｌ抗体定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１抗体定常ドメイン、Ｃ_Ｈ２抗体定常ドメイン、またはＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン）に相当するポリペプチドを指す。

ここで、「促進する」という語は、例えば他の別個のＦｃドメイン単量体に対するよりも、互いに高い結合親和性を有する２つのＦｃドメイン単量体でＦｃドメインを形成することを支持するといったように、促すことおよび支持することを意味する。本明細書に記載されるように、結合してＦｃドメインを形成する２つのＦｃドメイン単量体は、それらの各Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメインの界面において適合可能なアミノ酸改変（例えば、改変された突起および改変された空洞、ならびに／または静電的ステアリング変異）を有することが可能である。適合可能なアミノ酸改変は、こうしたアミノ酸改変を有さない、または適合しないアミノ酸改変をもつ他のＦｃドメイン単量体よりも、こうしたＦｃドメイン単量体同士での選択的な相互作用を促進するまたは支持する。これは、相互作用する２つのＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸改変に起因して、Ｆｃドメイン単量体が、アミノ酸改変を有さない他のＦｃドメイン単量体に対するよりも互いに対して高い親和性を有することを理由に起こる。

ここで「二量体形成選択モジュール」という語は、２つのＦｃドメイン単量体間の好都合な対形成を促進するＦｃドメイン単量体の配列を指す。「相補的」な二量体形成選択モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の互いに対する選択的な相互作用を促進するまたは支持する二量体形成選択モジュールである。相補的な二量体形成選択モジュールは、同一の配列または異なる配列を有することが可能である。例示的な相補的な二量体形成選択モジュールが本明細書に記載されており、表３の改変された突起形成および空洞形成変異、ならびに表４の静電的ステアリング変異から選択される相補的な変異を含むことができる。

ここで「改変された空洞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｃａｖｉｔｙ）」という語は、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、本来のアミノ酸残基よりも低分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の空洞を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。改変された空洞は、例えば、表３の空洞形成置換変異のうちの１つ以上によって形成され得る。

ここで「改変された突起（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」という語は、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、本来のアミノ酸残基よりも高分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の突起を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。改変された突起は、例えば、表３の突起形成置換変異のうちの１つ以上によって形成され得る。

「空洞に突起が挿入された対」という語は、第１のＦｃドメイン単量体がそのＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に改変された空洞を含む一方で、第２のＦｃドメイン単量体がそのＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に改変された突起を含むものである２つのＦｃドメイン単量体を含んだＦｃドメインを説明するものである。空洞に突起が挿入された対においては、第１のＦｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、該突起が第２のＦｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞と、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の界面における二量体の正常な会合を有意に邪魔することなく相互作用するように配置される。空洞に突起が挿入された対は、例えば、表３の任意の１つ以上の空洞形成置換変異および任意の１つ以上の突起形成置換変異の相補的な対を含むことができる。

ここで、「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該２つのＦｃドメイン単量体は、これら２つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷変異（例えば、表４の変異を参照）を含有する。

本明細書において使用される場合、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群に関連する「構造的に同一」という用語は、同じポリペプチド配列が同じ比率および構成で組み立てられた構築体を指し、例えばグリコシル化などのいずれの翻訳後修飾も指していない。

ここで「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該２つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。

ここで「ヘテロ二量体形成選択モジュール」という語は、適合するヘテロ二量体形成選択モジュールを有する２つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である、改変された突起、改変された空洞および特定の逆電荷アミノ酸置換を指す。ヘテロ二量体形成選択モジュールを含有するＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成し得る。ヘテロ二量体形成選択モジュールの例を、表３および４に示している。

ここで「ホモ二量体形成選択モジュール」という語は、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成するＣ_Ｈ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも２つの位置におけるＦｃドメイン単量体内の逆電荷変異を指す。例えば、ホモ二量体形成選択モジュールを形成する逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内にある、３５７、３７０、３９９、および／または４０９位（ＥＵナンバリングによる）からの少なくとも２個のアミノ酸内にあり得る。ホモ二量体形成選択モジュールの例を、表４および５に示している。

ここで、「連結された」という語は、化学的複合体化、組換え手段ならびに例えばペプチド結合、ジスルフィド結合およびアミド結合である化学結合を含む手段によって、２以上の成分、要素、成分または例えばポリペプチドであるタンパク質ドメインを組み合わせるまたは付加することを説明するために用いる。例えば、２つの単一ポリペプチドを連結して、化学的複合体化、化学結合、ペプチドリンカーまたはその他の共有結合手段を介して、１つの隣接し合うタンパク質構造を形成することが可能である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインとＦｃドメイン単量体の両方をコードする連続的な核酸配列から発現されることにより、Ｆｃドメイン単量体に連結される。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介してＦｃドメイン単量体に連結され、この場合において当該ペプチドリンカーのＮ末端は、例えばペプチド結合などの化学結合を介して、抗原結合ドメインのＣ末端に連結され、そしてペプチドリンカーのＣ末端は、例えばペプチド結合などの化学結合を介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端に連結される。

本明細書において使用される場合、「会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、ポリペプチド（または１つの単一ポリペプチド内の配列）が、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）を形成するように配置されるような、例えば水素結合、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などのポリペプチド（または１つの単一ポリペプチド内の配列）間の相互作用を記載するために使用される。例えば、一部の実施形態では、例えば２つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む２つのポリペプチドと、１つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む２つのポリペプチドの４つのポリペプチドが会合して、３つのＦｃドメインを有するＦｃ構築体が形成される（例えば、図５０および５１に図示するとおり）。４つのポリペプチドは、それらの各Ｆｃドメイン単量体を介して会合することが可能である。ポリペプチド間の会合は、共有結合相互作用を含まない。

ここで「リンカー」という語は、２つの要素間、例えばタンパク質ドメイン間の結合を指す。リンカーは、共有結合またはスペーサーとすることが可能である。「結合」という語は、化学結合、例えばアミド結合もしくはジスルフィド結合、または、例えば化学的複合体化である化学反応により形成される任意の種類の結合を指す。「スペーサー」という用語は、２つのポリペプチドもしくはポリペプチドドメインドメイン間に空間および／または柔軟性をもたらす２つのポリペプチドまたはポリペプチドドメイン間に生じる部分（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）またはアミノ酸配列（例えば３〜２００アミノ酸、３〜１５０アミノ酸、または３〜１００アミノ酸の配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部（例えば、ポリペプチド骨格を介して、離間したポリペプチドまたはポリペプチドドメインに連結されるような）である。例えばＦｃドメインを形成する２つのヒンジ領域または２つのＦｃドメイン単量体の間におけるジスルフィド結合の形成は、リンカーとは考えない。

ここで「グリシンスペーサー」という語は、２つのＦｃドメイン単量体を直列で連続して連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４、８、または１２個のグリシン（例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン、例えば、１２〜３０個、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のグリシン）を含有し得る。一部の実施形態において、グリシンスペーサーは、

の配列を有する。ここで、「アルブミン結合ペプチド」という語は、血清アルブミンに対する親和性および血清アルブミンを結合する機能を有する１２〜１６のアミノ酸のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えばヒト、マウスまたはラットである様々な起源のものとすることが可能である。本開示の一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドが、Ｆｃドメイン単量体のＣ末端に融合され、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の血清半減期が増加する。アルブミン結合ペプチドは、直接またはリンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端と融合することが可能である。

ここで、「精製用ペプチド」という語は、ポリペプチドの精製、単離または同定に用いることが可能である任意の長さのペプチドを指す。精製用ペプチドは、ポリペプチドに連結して、例えば細胞溶解混合物からの、ポリペプチドの精製および／またはポリペプチドの単離を支援し得る。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズ等の固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に連結され得るペプチドの精製例を、本明細書においてさらに詳細に記載する。

本明細書において使用される場合、「多量体」という用語は、本明細書に記載の会合したＦｃ構築体またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体を少なくとも２個含む分子を指す。

ここで「ポリヌクレオチド」という語は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、およびその断片または部分を指し、またゲノム由来もしくは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それは一本鎖または二本鎖であり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る。単一のポリヌクレオチドが、単一のポリペプチドに翻訳される。

ここで「ポリペプチド」という語は、モノマーがアミド結合を介して共に連結されるアミノ酸残基であるような単一のポリマーを説明している。ポリペプチドは、天然、組換えまたは合成的に産生されるかのいずれかである任意のアミノ酸配列を包含することを意図する。

ここで「アミノ酸位置」という語は、タンパク質またはタンパク質ドメイン内のアミノ酸の位置番号を指す。アミノ酸位置は、指示された場合（例えば、ＣＤＲおよびＦＲ領域について）、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ｅｄ５，１９９１））を使用して番号付け、そうでない場合は、ＥＵナンバリングを使用した。

図２４Ａ〜２４Ｄは、ＥＵナンバリングシステムを使用して番号付けされたヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを示す。

図７Ａ〜７Ｄは、ＥＵナンバリングシステムを使用して番号付けされたヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを示す。

本明細書において使用される場合、「アミノ酸改変」という語は、参照配列（例えば、野生型の、非変異の、または改変されていないＦｃ配列）と比較して、Ｆｃ構築体の薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）の性質、血中半減期、エフェクター機能（例えば、細胞溶解（例えば、抗体依存性細胞介在性障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞障害活性（ＣＤＣ））、貪食（例えば、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣＣ））、免疫活性化およびＴ細胞活性化）、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））、Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）、Ｆｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））に対するアフィニティ、補体カスケードに関与するタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に対するアフィニティ、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、シアリル化）、凝集性（例えば、二量体（例えば、ホモ二量体および／またはヘテロ二量体）および／または多量体を形成する能力）、および生物物理学的性質（例えば、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｌ間の相互作用を変える、安定性を変える、ならびに／または、温度および／もしくはｐＨに対する感度を変える）に対して効果を発揮し、そして免疫学的疾患および炎症性疾患の治療有効性の改善を促進し得る、Ｆｃドメインのポリペプチド配列の変更を指す。アミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む。一部の実施形態では、アミノ酸改変は、１つのアミノ酸の改変である。他の実施形態では、アミノ酸改変は、複数の（例えば２以上）アミノ酸の改変である。アミノ酸改変は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入の組み合わせを含み得る。アミノ酸改変の解説には、Ｆｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の点変異（例えば、１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換）、挿入および欠失（例えば１つまたは複数のヌクレオチドの付加および／または除去）などの、遺伝的（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）変更が含まれる。

特定の実施形態において、Ｆｃ構築体内またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体内の少なくとも１個（例えば、少なくとも１、２または３個）のＦｃドメイン単量体がアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。一部の例では、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体が、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０以下）のアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。

ここで「パーセント（％）同一性」という語は、候補配列、例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体の配列のアミノ酸（または核酸）残基であって、配列を整列させて、必要であれば最大のパーセント同一性を達成するようにしてギャップを導入した後で（すなわち、最適なアラインメントのために候補配列および参照配列の一方または両方においてギャップを導入することが可能であり、比較目的のために非相同の配列は無視することが可能である）、野生型のＦｃドメイン単量体の配列等の参照配列のアミノ酸（または核酸）残基に対して一致している、候補配列のアミノ酸（または核酸）残基の百分率を指すものである。パーセント同一性の決定のためのアラインメントは、この分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用可能であるコンピュータソフトウェアを用いて達成することが可能である。当業者は、比較している配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定することが可能である。一部の実施形態では、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、所与の候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性（あるいは、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、特定のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を有するまたは含む、所与の候補配列と表すことがある）は、以下のとおりに計算される：
１００×（Ａ／Ｂのフラクション）
式中、Ａは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは参照配列内のアミノ酸（または核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合の一部の実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性と等しくないはずである。一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）と、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％または９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３〜４８および５０〜５３のいずれか１個の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。特定の実施形態では、Ｆｃ構築体中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４８、５２および５３の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。

一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、本明細書にさらに記載されるＳＥＱＩＤＮＯ：１〜３６（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、１８、２６、および２７）のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも７５％同一（少なくとも７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、９９．５％または１００％同一）である配列を有し得る。

一部の実施形態において、Ｆｃ構築体中のＦｃドメイン単量体は、最大で１０個のアミノ酸、例えば、１、２、３，４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸によって、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２〜４８および５０〜５３のうちのいずれか１個の配列とは異なる配列を有し得る。一部の実施形態において、Ｆｃ構築体中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２〜４８および５０〜５３のうちのいずれか１個の配列に対して、最大で１０個のアミノ酸置換、例えば、１、２、３，４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を有する。

ここで「宿主細胞」という語は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は典型的に、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれる。宿主細胞は、例えば細菌細胞である原核細胞、または、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）である真核細胞とすることができる。本明細書において記載される場合、宿主細胞は、所望のドメインをコードするポリペプチドを１つ以上発現させるために使用され、それらポリペプチドはその後組み合わされて、所望のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成させることができる。

ここで「医薬組成物」という語は、活性成分のみならず、活性成分を投与方法に好適であるようにさせることが可能である、１つまたは複数の賦形剤および希釈剤を含有する薬用製剤または医薬製剤を指す。本開示の医薬組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と適合可能な薬学的に許容可能な成分を含む。該医薬組成物は典型的に、静脈投与または皮下投与のために水性形態である。

ここでポリペプチドまたはＦｃ構築体の「実質的に均質な群」は、組成物（例えば、細胞培養培地または医薬組成物）中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５０％が、非還元ＳＤＳゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーにより決定された場合に、同数のＦｃドメインを有する群である。ポリペプチド、またはＦｃ構築体の実質的に均質な群は、精製前、または、プロテインＡもしくはプロテインＧ精製後、または、任意のＦａｂもしくはＦｃ特異的なアフィニティクロマトグラフィー単独の後で、得ることができる。種々の実施形態では、組成物中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％が、同数のＦｃドメインを有する。他の実施形態では、組成物中のポリペプチドのまたはＦｃ構築体のうちの最大で８５％、９０％、９２％または９５％が、同数のＦｃドメインを有する。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、医薬組成物中の賦形剤または希釈剤を指す。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合可能でなければならず、そしてレシピエントに対し有害であってはならない。本開示において、薬学的に許容できる担体は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に対し、十分な薬学的安定性を与えなければならない。キャリアの性質は、投与形態によって異なる。例えば、経口投与では、固形キャリアが好ましく、静脈内投与では概して、水溶液キャリヤ（例えば、ＷＦＩおよび／または緩衝液）が用いられる。

ここで「治療効果量」は、例えば薬剤投与量である、対象もしくは患者において所望の生物学的な効果の誘導に、または、本明細書に記載の状態または障害を有する患者の治療に有効である量を指す。本明細書においては、「治療効果量」が、単回投与または任意の投薬もしくは経路での摂取、単独でまたは他の治療薬剤と組み合わせての摂取のいずれでも、所望の治療効果をもたらす量として解釈できるということも理解されたい。

本明細書において使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。

（同一のポリペプチド鎖を一緒に連結することにより形成される）２個のＦｃドメインを有するタンデム構築体、およびタンデムＦｃ配列のオフレジスター（ｏｆｆ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）会合により生成された結果として生じる種の一部を示す概略図である。Ｆａｂ部分（ＶＨ＋ＶＬ）の可変ドメインは、平行四辺形として示され、Ｆａｂ部分の定常ドメイン（ＣＨ１＋ＣＬ）は、矩形として示され、Ｆｃ部分のドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）は、楕円形として示され、ヒンジジスルフィドは、平行線の対として示される。（同一のポリペプチド鎖を一緒に連結することにより形成される）ペプチドリンカーにより接続される３個のＦｃドメインを有するタンデム構築体、およびタンデムＦｃ配列のオフレジスター会合により生成された結果として生じる種の一部を示す概略図である。Ｆａｂ部分（ＶＨ＋ＶＬ）の可変ドメインは、平行四辺形として示され、Ｆａｂ部分の定常ドメイン（ＣＨ１＋ＣＬ）は、矩形として示され、Ｆｃ部分のドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）は、楕円形として示され、ヒンジジスルフィドは、平行線の対として示される。図３Ａおよび３Ｂは、リンカーにより接続され、直交性ヘテロ二量体形成ドメインを使用して組み立てられた、２個のＦｃドメイン（図３Ａ）または３個のＦｃドメイン（図３Ｂ）を有するＦｃ構築体の概略図である。固有のポリペプチド鎖の各々は、異なる陰影が付けられている。Ｆａｂ部分（ＶＨ＋ＶＬ）の可変ドメインは、平行四辺形として示され、Ｆａｂ部分の定常ドメイン（ＣＨ１＋ＣＬ）は、矩形として示され、Ｆｃ部分のドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）は、楕円形として示され、リンカーは、破線として示され、ヒンジジスルフィドは、平行線の対として示される。ノブおよび空洞を示して、ノブイントゥホール対を示すために、突起を有するＣＨ３楕円形が示される。プラスおよび／またはマイナス印は、ＣＨ３ドメイン中の静電的ステアリング変異を示すために使用される。２個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインとを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第１のポリペプチド（４３０２）は、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換の第１のセット（４３０８）を有する１個のＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端においてＶ_Ｈドメイン（４３１０）を含有する抗原結合ドメインにスペーサーによって直列で連続して連結された、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換（複数可）の第２のセット（４３０６）を任意で有する突起形成アミノ酸置換を有する、１個のＦｃドメイン単量体とを含有する。第２のポリペプチド（４３１８）は、電荷をもつアミノ酸置換の第１のセット（４３０８）を有する第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との好ましい静電的相互作用を促進する、電荷をもつアミノ酸置換（複数可）のセットを有する１個のＦｃドメイン単量体を含有する。第３のポリペプチド（４３２０）は、Ｎ末端においてＶ_Ｈドメイン（４３１２）を含有する抗原結合ドメインに直列で連続して連結された、電荷をもつアミノ酸置換の第２のセット（４３０６）を有する第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との好ましい静電的相互作用を促進する、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換（複数可）のセット（４３１６）を任意で有する空洞形成アミノ酸置換を有する、１個のＦｃドメイン単量体を含有する。Ｖ_Ｌ含有ドメイン（４３０４および４３１４）は、各Ｖ_Ｈドメインに連結される。３個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインとを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第１のポリペプチド（４４０２）は、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換の第１のセット（４４１０および４４０８）を各々有する２個のＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端においてＶ_Ｈドメイン（４３１２）を含有する抗原結合ドメインにスペーサーによって直列で連続して連結された、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換（複数可）の第２のセット（４４０６）を任意で有する突起形成アミノ酸置換を有する、１個のＦｃドメイン単量体とを含有する。第２および第３のポリペプチド（４４２２および４４２０）は各々、電荷をもつアミノ酸置換の第１のセット（４４１０および４４０８）を有する第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との好ましい静電的相互作用を促進する、電荷をもつアミノ酸置換（複数可）のセットを有する、１個のＦｃドメイン単量体を含有する。第４のポリペプチド（４４２４）は、Ｎ末端においてＶ_Ｈドメイン（４４１４）を含有する抗原結合ドメインに直列で連続して連結された、電荷をもつアミノ酸置換の第２のセット（４４０６）を有する第１のポリペプチドのＦｃドメイン単量体との好ましい静電的相互作用を促進する、Ｃ_Ｈ３電荷をもつアミノ酸置換（複数可）のセット（４４１８）を任意で有する空洞形成アミノ酸置換を有する、１個のＦｃドメイン単量体を含有する。Ｖ_Ｌ含有ドメイン（４４０４および４４１６）は、各Ｖ_Ｈドメインに連結される。図６Ａ〜Ｃは、抗原結合ドメインがＦｃ構築体のＦｃドメインに連結され得る３つの例示的な方法の略図である。図６Ａは、抗原結合ドメインの重鎖構成要素を、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現され得ること、および軽鎖構成要素を、別個のポリペプチドとして発現され得ることを示す。図６Ｂは、長いＦｃ鎖の融合タンパク質として発現されるｓｃＦｖを示す。図６Ｃは、重鎖構成要素と軽鎖構成要素が別個に発現され、外因的に付加され、そして化学結合でＦｃ抗原結合ドメイン構築体に連結されることを示す。図７Ａは、ＥＵナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きである。図７Ｂは、ＥＵナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）を示す。両端を含むＥ２１６〜Ｃ２２０を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きであり、Ｋ４４７を欠く。図７Ｃは、ＥＵナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きであり、そして４４７Ｋを欠く。図７Ｄは、ＥＵナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）を示す。両端を含むＥ２１６〜Ｃ２２０を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きである。図８Ａ〜８Ｂは、直線状Ｆｃ構築体に組み立てられるポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞による増殖培地に分泌されるタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図８Ａのレーン１および２に見られる２００ｋＤａのバンドは、図４に示される構築体（構築体４３）の組み立てを示す。図８Ｂのレーン１〜３に見られる２５０ｋＤａのバンドは、図５に示される直線状三量体（構築体４４）の組み立てを示す。図９Ａ〜９Ｂは、図８Ａ〜８Ｂに示されるタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。直線状Ｆｃ構築体に組み立てられるポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞による増殖培地に分泌されるタンパク質を、プロテインＡおよび強カチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。次いで、１ｍｇの精製された直線状二量体（構築体４３）（Ａ）または直線状三量体（構築体４４）（Ｂ）を、ＳＥＣによりサイズに基づいて分離した。図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｄａｕｄｉ（図１０Ａ）またはＲａｊｉ（図１０Ｂ）細胞のいずれかを標的とする種々の抗ＣＤ２０構築体を用いた、ＣＤＣおよびＡＤＣＰアッセイを示す。図１０Ａは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、単量体抗体と比較して強化されたＣＤＣを介在することを示す。図１０Ｂは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、レポーターアッセイにおいて強化されたＡＤＣＰを介在することを示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、Ａ５４９ヒト肺癌細胞またはＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のいずれかを標的とする種々の抗ＰＤ−Ｌ１構築体を用いた、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰアッセイを示す。図１１Ａは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３を使用したレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、単量体抗体と比較して強化されたＡＤＣＣを介在することを示す。図１１Ｂは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、ＡＤＣＣＫＩＬＲアッセイにおいて、ヒト肺癌細胞の強化された死滅を介在することを示す。直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のＡＤＣＰを誘発する際に著しくより効率的である、図１１Ｃ。

詳細な説明
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、Ｆｃドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。一部の例では、本開示は、公知の単一Ｆｃドメインを含有する例えば公知の治療用抗体などの治療用抗体の抗原結合ドメインと、少なくとも２つのＦｃドメインを組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療用抗体を作製することを予期するものである。一部の例において、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば公知の治療用抗体などの公知のＦｃドメイン含有治療剤を越える生物活性を有する。少なくとも２個のＦｃドメインの存在により、エフェクター機能を強化することができ、そして例えばＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣと組み合わされたＡＤＣＣなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより治療用分子の有効性が上昇する。

本明細書に記載される方法および組成物は、複数の直交性ヘテロ二量体形成技術（例えば、表３および４から選択される変異の２つの異なるセット）を、一緒に連結して同じタンパク質を形成するポリペプチドに導入することにより、複数のＦｃドメインを有する抗原結合タンパク質の構築を可能にする。複数のヘテロ二量体形成変異を同じタンパク質に組み立てられるポリペプチドに導入する、本明細書に記載される設計原理は、例えば、タンデムＦｃドメインを有する抗体様タンパク質、対称分岐型タンパク質、および非対称分岐型タンパク質を含む、多種多様なタンパク質構成の作成を可能にする。

本明細書に記載される直交性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーにより一緒に連結すされる少なくとも１個の抗原結合ドメインと少なくとも２個のＦｃドメインとを含有し、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２個は、互いとは異なり、例えば、構築体の少なくとも１個のＦｃドメインは、抗原結合ドメインに連結され、構築体の少なくとも１個のＦｃドメインは、抗原結合ドメインに連結されないか、または構築体の２つのＦｃドメインは、異なる抗原結合ドメインに連結される。直交性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーにより分離された２つ以上のＦｃ単量体を含有する１つの長ペプチド鎖を発現し、長ペプチド鎖上の１つ以上の特定のＦｃ単量体に選択的に結合するように設計された単一Ｆｃ単量体を各々が含有する、２つ以上の異なる短ペプチド鎖を発現することにより製造される。任意の数のＦｃドメインをこの方法で直列に接続することができ、それにより、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＦｃドメインを有する構築体の作製が可能となった。

直交性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６８９、ならびに国際公開第ＷＯ／２０１５／１６８６４３号、同第ＷＯ２０１７／１５１９７１号、同第ＷＯ２０１７／２０５４３６号、および同第ＷＯ２０１７／２０５４３４号に記載される、２つ以上のＦｃドメインを有する分子を組み立てるためのＦｃ改変方法を使用して作られる。改変方法は、ヘテロ二量体形成選択モジュールの２つのセットを利用して、直交性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を正確に組み立てる（構築体４３および４４、図４および図５：（ｉ）異なる逆電荷変異を有するヘテロ二量体形成選択モジュール（表４）ならびに（ｉｉ）改変された空洞および突起を有するヘテロ二量体形成選択モジュール（表３））。任意のヘテロ二量体形成選択モジュールが、各Ｆｃ単量体ポリペプチドに特定のアミノ酸置換を導入することにより、構築体の特定のＦｃドメインに組み立てられるように設計されたＦｃ単量体の対に組み込まれ得る。ヘテロ二量体形成選択モジュールは、異なるヘテロ二量体形成選択モジュールの変位を有するＦｃ単量体との会合を好まない一方で、特定のヘテロ二量体形成選択モジュールの相補的なアミノ酸置換を有するＦｃ単量体間の会合を促すように設計されている。これらのヘテロ二量体形成変異は、より小さいまたはより大きい複合体の最小形成を伴う、構築体の異なるＦｃドメインの所望のタンデム構成への異なるＦｃ単量体ポリペプチドの組み立てを確実にする。これらの構築体の特性は、医薬組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするために望ましい、実質的に均質な医薬組成物の効率的な生成を可能にする。

一部の実施形態において、本明細書に記載される直交性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の組み立ては、本明細書に記載の２セットのヘテロ二量体形成変異の間で異なる静電的ステアリング変異を使用して実現され得る。直交性静電的ステアリング変異の一例は、Ｆｃ単量体の第１のノブのＥ３５７ＫおよびＦｃ単量体の第１のホールのＫ３７０Ｄ（これらのＦｃ単量体は会合して、第１のＦｃドメインを形成する）、ならびにＦｃ単量体の第２のノブのＤ３９９ＫおよびＦｃ単量体の第２のホールのＫ４０９Ｄ（これらのＦｃ単量体は会合して、第２のＦｃドメインを形成する）である。

一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、異なる結合特性、例えば、異なる結合親和性（同じもしくは異なる標的に対して）、または異なる標的分子に対する特異性を有する、少なくとも２個の抗原結合ドメイン（例えば、２、３、４、５、または６個の抗原結合ドメイン）を有する。二重特異性構築体は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のポリペプチドのうちの２つ以上が、異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、長鎖が、第１の特異性の１個の抗原結合ドメインを含み、短鎖が、第２の特性の異なる抗原結合ドメインを含む、上記のＦｃ骨格から生成され得る。異なる抗原結合ドメインは、異なる軽鎖を使用してもよく、または共通軽鎖を使用してもよく、またはｓｃＦｖドメインからなることもできる。

二重特異性および三重特性構築体は、２個の異なるセットのヘテロ二量体形成変異、すなわち、直交性ヘテロ二量体形成変異を使用することにより生成され得る。このようなヘテロ二量体形成配列は、他のヘテロ二量体形成配列との会合が不利となるように設計される必要がある。そのような設計は、本明細書に記載される、２セットのヘテロ二量体形成変異の間で異なる静電的ステアリング変異、および／または２セットのヘテロ二量体形成変異の間で異なる空洞に突起が挿入された変異を使用して実現され得る。直交性（直交性）の静電的ステアリング変異の一例は、第１のノブ（ｋｎｏｂ）Ｆｃ中のＥ３５７Ｋ、第１のホール（ｈｏｌｅ）Ｆｃ中のＫ３７０Ｄ、第２のノブＦｃ中のＤ３９９Ｋ、および第２のホールＦｃ中のＫ４０９Ｄである。

Ｉ．Ｆｃドメイン単量体
Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジドメイン、Ｃ_Ｈ２抗体定常ドメイン、およびＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの少なくとも一部分（例えば、任意のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ヒンジ、Ｃ_Ｈ２抗体定常ドメイン、およびＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン）を含む。Ｆｃドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものとすることが可能である。Ｆｃドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものとしてもよい。Ｆｃドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣ_Ｈ２およびＩｇＡからのＣ_Ｈ３による複合型、または、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣ_Ｈ２であるがＩｇＧ３からのＣ_Ｈ３による複合型であってもよい。Ｆｃドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃ受容体と結合することが可能なＦｃドメイン（本明細書でさらに規定される）である。本開示では、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインが、Ｃ_Ｈ３−Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、Ｎ末端またはＣ末端に付加するさらなる部分を含む。本開示では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。

一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３、４４、４６、４７、４８、および５０〜５３のいずれか１つの配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２〜５３のいずれか１つの配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。

ＩＩ．Ｆｃドメイン
本明細書で規定するように、Ｆｃドメインは、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する２つのＦｃドメイン単量体を含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えばＦｃ−ガンマ受容体（すなわち、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ））、Ｆｃ−アルファ受容体（すなわち、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ））、Ｆｃ−イプシロン受容体（すなわち、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ））および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する最小限の構造を形成する。一部の実施形態では、本開示のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））および／またはＦｃγＲＩＶおよび／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する。

ＩＩＩ．抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、特定の標的分子または標的分子のセットに結合する任意のタンパク質またはポリペプチドであり得る。抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合する１つ以上のペプチドまたはポリペプチドを含む。抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であってもよい。抗原結合ドメインは、例えばフィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、ＦＮ３モノボディ）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、リガンドまたは受容体であり得る。断片の抗原結合（Ｆａｂ）断片は、標的抗原に結合する抗体上の領域である。この領域は、重鎖および軽鎖それぞれの１つの定常ドメインと１つの可変ドメインから構成される。Ｆａｂ断片は、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインを含む。可変ドメインのＶ_ＨおよびＶ_Ｌはそれぞれ、単量体のアミノ末端で、相補性決定領域（ＣＤＲ）が３個の１セットを含有する。Ｆａｂ断片は、免疫グロブリン抗体アイソタイプのＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものであり得る。またＦａｂ断片単量体は、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものであってもよい。一部の実施形態において、Ｆａｂ断片は、免疫グロブリンのプロテアーゼ処置（例えばペプシン）後の第２の同一Ｆａｂ断片に共有結合的に付加され、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成してもよい。一部の実施形態において、Ｆａｂは、例えばドメイン間のリンカーを用いて融合される可変ドメインと定常ドメインの両方を含む単一ポリペプチドとして発現されてもよい。

一部の実施形態において、Ｆａｂ断片の一部のみが抗原結合ドメインとして使用される場合がある。一部の実施形態において、Ｆａｂの軽鎖構成要素（Ｖ_Ｌ＋Ｃ_Ｌ）のみ、またはＦａｂの重鎖構成要素（Ｖ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ）のみが使用される場合がある。一部の実施形態において、Ｆａｂ可変領域のＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖の融合タンパク質である一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が使用される場合がある。他の実施形態において、直列のＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）の対を含む直線状抗体が使用される場合があり、このセグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成する。

抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるＦｃ含有ポリペプチド内において種々の数で、かつ種々の位置に配置され得る。一部の実施形態において、１つ以上の抗原結合ドメインは、Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、および／またはＦｃドメイン間に配置され得る。一部の実施形態において、ポリペプチドまたはペプチドリンカーは、抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂドメインと、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃドメインとの間に配置され得る。一部の実施形態において、連続して連結される複数の抗原結合ドメイン（例えば、２、３、４、または５つ以上の抗原結合ドメイン）は、ポリペプチド鎖に沿った任意の位置に配置され得る（Ｗｕｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０−１２９７，２００７）。

一部の実施形態において、２つ以上の抗原結合ドメインは、Ｆｃドメイン含有ポリペプチド上、または多数のＦｃドメイン含有ポリペプチドから作られるタンパク質複合体上で、互いに対して種々の距離で配置され得る。一部の実施形態において、２つ以上の抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体にあるように、同じＦｃドメイン上で、互いに近く配置される。一部の実施形態において、２つ以上の抗原結合ドメインは、互いに対してさらに遠く離れて配置され、例えば、抗原結合ドメインは、タンパク質構造上の１、２、３、４、または５つ以上のＦｃドメインによって互いから分離している。

一部の実施形態において、本開示の抗原結合ドメインは、表１Ａおよび１Ｂに列記される標的または抗原に対して、以下の表１Ａおよび１Ｂにさらに詳細に提示されるように、当該列記される標的または抗原に関して表１Ａおよび１Ｂに列記されるＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてを含む。

（表１Ａ）

（表１Ｂ）可変ドメイン配列

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４３ｓの抗原結合ドメイン（図４の４３０４／４３１０および４３１２／４３１４）は、表１Ａおよび１Ｂに列記される抗体のいずれか１つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４４の抗原結合ドメイン（図５の４４０４／４４１２および４４１４／４４１６）は、表１Ａおよび１Ｂに列記される抗体のいずれか１つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。

一部の実施形態において、抗原結合ドメイン（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、表２または表１Ｂに列記される抗体のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む。一部の実施形態において、Ｆａｂは、表２または表１Ｂに列記される抗体のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖に含有されるＣＤＲを含む。一部の実施形態において、Ｆａｂは、表２に列記される抗体のＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖に含有されるＣＤＲを含み、Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列の残りは、表２の抗体のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。一部の実施形態において、Ｆａｂは、表１Ｂに列記される抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に含有されるＣＤＲを含み、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表１Ｂの抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。

（表２）

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４３の抗原結合ドメイン（図４の４３０４／４３１０および４３１２／４３１４）は、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含み得る。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４４の抗原結合ドメイン（図５の４４０４／４４１２および４４１４／４４１６）は、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含み得る。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４３の抗原結合ドメイン（図４の４３０４／４３１０および４３１２／４３１４）は、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４４の抗原結合ドメイン（図５の４４０４／４４１２および４４１４／４４１６）は、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４３の抗原結合ドメイン（図４の４３０４／４３１０および４３１２／４３１４）は、Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列の残りは、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか１つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４４の抗原結合ドメイン（図５の４４０４／４４１２および４４１４／４４１６）は、Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、Ｖ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列の残りは、表２または表１Ｂに列記される抗体のいずれか一つのＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。

ＩＶ．二量体形成選択モジュール
本開示において、二量体形成選択モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の好ましい対形成を促進してＦｃドメインを形成する、Ｆｃドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の相互作用するＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、２つのＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいＦｃドメインの最終形態は、二量体形成選択モジュールをもたないＦｃドメイン単量体で、または二量体形成選択モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつＦｃドメイン単量体で形成される他のＦｃドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ等のこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。

一部の実施形態では、二量体形成選択モジュールは、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に改変された空洞（本明細書でさらに説明する）を含む。他の実施形態では、二量体形成選択モジュールは、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に改変された突起（本明細書でさらに説明する）を含む。選択的にＦｃドメインを形成するために、適合可能な二量体形成選択モジュールをもつ２つのＦｃドメイン単量体、例えば改変された空洞を含む一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインと、改変された突起を含むもう一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインとを結合して、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成する。改変された突起および改変された空洞は、ヘテロ二量体形成選択モジュールの例であり、それらは、適合するヘテロ二量体形成選択モジュールを有する２つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である。

他の実施形態では、正電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択モジュールをもつＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択モジュールをもつＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリング（本明細書においてさらに説明する）を経てＦｃドメインを形成することができる。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの１つ以上を含み得る：Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。一部の実施形態では、逆電荷アミノ酸置換を、ヘテロ二量体形成選択モジュールとして用い得るものであって、異なるが適合する逆電荷アミノ酸置換を含有する２つのＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。特定の二量体形成選択モジュールを、さらに以下に説明される表３および４にさらに列記しているが、これらに限定されない。

他の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体が、Ｃ_Ｈ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも２つの位置において、同一の逆電荷変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。ホモ二量体形成選択モジュールは、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成する、逆電荷アミノ酸置換である。２つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重変異体である、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０ＤまたはＤ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅを含むＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅである二重変異体の任意の対を結合した四重変異体を含むＦｃドメイン単量体を含む。ホモ二量体形成選択モジュールの例を、表５および６にさらに示している。ホモ二量体形成Ｆｃドメインを使用して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体上に対称分岐点を作ることができる。一実施形態において、本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、１個のホモ二量体形成Ｆｃドメインを有する。一実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、２つ以上のホモ二量体形成Ｆｃドメイン、例えば、２、３、４、または５つ以上のホモ二量体形成ドメインを有する。一実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３個のホモ二量体形成Ｆｃドメインを有する。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、１個のホモ二量体形成選択モジュールを有する。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、２つ以上のホモ二量体形成選択モジュール、例えば、２、３、４、または５つ以上のホモ二量体形成選択モジュールを有する。

さらなる実施形態では、（ｉ）少なくとも１つの逆電荷変異と、（ｉｉ）少なくとも１つの改変された空洞または少なくとも１つの改変された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を、（ｉ）少なくとも１つの逆電荷変異と、（ｉｉ）少なくとも１つの改変された突起または少なくとも１つの改変された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。例えば、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成する。

こうしたＦｃドメインの形成は、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の適合するアミノ酸置換によって促される。Ｃ_Ｈ３−Ｃ_Ｈ３界面において、２つの二量体形成選択モジュールが適合しないアミノ酸置換を含有する場合、例えば、改変された空洞を両方が含有する、改変された突起を両方が含有する、または、同じ電荷をもつアミノ酸を両方が含有する場合は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成は促されない。

ヘテロ二量体形成Ｆｃドメインの複数の対を使用して、複数の非対称分岐点、複数の非分岐点、または非対称分岐点および非分岐点の両方を有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体を作ることができる。複数の異なるヘテロ二量体形成技術（例えば、表３および４を参照）が異なるＦｃドメインに組み込まれて、これらのＦｃドメイン含有構築体を組み立てる。ヘテロ二量体形成技術は、望ましくないＦｃ単量体の対形成に対して最小の会合（直交性）を有する。２つの異なるＦｃヘテロ二量体形成方法、例えば、ノブイントゥホール（表３）および静電的ステアリング（表４）を異なるＦｃドメインで使用して、所望の構築体へのポリペプチド鎖の組み立てを制御することができる。あるいは、ノブイントゥホールの２つの異なるバリアント（例えば、表３から選択される変異の２つの異なるセット）、または静電的ステアリングの２つの異なるバリアント（例えば、表４から選択される変異の２つの異なるセット）を異なるＦｃドメインで使用して、所望の構築体へのポリペプチド鎖の組み立てを制御することができる。非対称分岐は、異なるポリペプチド鎖、複数のＦｃドメインを有するポリペプチド鎖上にヘテロ二量体形成ＦｃドメインのＦｃドメイン単量体を配置することにより作られ得る。非分岐点は、複数のＦｃドメインを有するポリペプチド鎖上にヘテロ二量体形成Ｆｃドメインの一方のＦｃドメイン単量体、および単一Ｆｃドメインを有するポリペプチド鎖上にヘテロ二量体形成Ｆｃドメインのもう一方のＦｃドメイン単量体を配置することにより作られ得る。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、直線状である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、分岐点を有しない。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、少なくとも２個のＦｃドメイン単量体が異なる（すなわち、異なるヘテロ二量体形成変異を有する）、２つ以上のＦｃドメイン単量体を有する１つの大きいペプチド、および各々が異なる単一Ｆｃドメイン単量体を有する２つ以上のより小さいペプチド（すなわち、異なるヘテロ二量体形成変異を有するＦｃドメイン単量体を有する２つ以上の小さいペプチド）から組み立てられ得る。本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、より小さい各ペプチドのＦｃドメイン単量体が、大きいペプチド上のその適合するＦｃドメイン単量体（複数可）と会合するように、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の適切な形成を促進するかまたは容易にする、互いに適合しない２つ以上の二量体形成選択モジュール、例えば、表３および／または４から選択される少なくとも２個の適合しない二量体形成選択モジュールを有することができる。一部の実施形態において、長いペプチド上の第１のＦｃドメイン単量体またはＦｃドメイン単量体の第１のサブセットは、第１の短いペプチドのＦｃドメイン単量体におけるアミノ酸置換により形成される第１の二量体形成選択モジュールの一部に適合する、第１の二量体形成選択モジュールの一部を形成するアミノ酸置換を含む。長いペプチド上の第２のＦｃドメイン単量体またはＦｃドメイン単量体の第２のサブセットは、第２の短いペプチドのＦｃドメイン単量体におけるアミノ酸置換により形成される第２の二量体形成選択モジュールの一部に適合する、第２の二量体形成選択モジュールの一部を形成するアミノ酸置換を含む。第１の二量体形成選択モジュールは、第１のＦｃドメイン単量体と第２の短いペプチドのＦｃドメイン単量体との間の結合を好まない一方で、第１の短いペプチドのＦｃドメイン単量体への長いペプチド上の第１のＦｃドメイン単量体（またはＦｃドメイン単量体の第１のサブセット）の結合を好む。同様に、第２の二量体形成選択モジュールは、第２のＦｃドメイン単量体と第１の短いペプチドのＦｃドメイン単量体との間の結合を好まない一方で、第２の短いペプチドのＦｃドメイン単量体への長いペプチド上の第２のＦｃドメイン単量体（またはＦｃドメイン単量体の第２のサブセット）の結合を好む。

特定の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、第１の二量体形成選択モジュールを有する第１のＦｃドメインと、第２の二量体形成選択モジュールを有する第２のＦｃドメインとを有することができる。一部の実施形態において、第１のＦｃドメインは、表３から選択される少なくとも１個の突起形成変異、および／または表４から選択される少なくとも１個の逆電荷変異を有する１個のＦｃ単量体（例えば、Ｆｃ単量体は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異ならびにＥ３５７Ｋ逆電荷変異を有することができる）、ならびに表３から選択される少なくとも１個の空洞形成変異、および／または表４から選択される少なくとも１個の逆電荷変異を有する１個のＦｃ単量体（例えば、Ｆｃ単量体は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異、ならびにＫ３７０Ｄ逆電荷変異を有することができる）から組み立てられる。一部の実施形態において、第２のＦｃドメインは、表３から選択される少なくとも１個の突起形成変異、および／または表４から選択される少なくとも１個の逆電荷変異を有する１個のＦｃ単量体（例えば、Ｆｃ単量体は、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ逆電荷変異を有することができる）、ならびに表３から選択される少なくとも１個の空洞形成変異、および／または表４から選択される少なくとも１個の逆電荷変異を有する１個のＦｃ単量体（例えば、Ｆｃ単量体は、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ逆電荷変異を有することができる）から組み立てられる。

さらに、画成されたＦｃドメイン単量体によるＦｃドメインの形成を促進するために用いる他の方法には、ヘテロ二量体の形成を可能にする、ロイシンジッパーの単量体α−へリックスのＦｃドメイン単量体それぞれに対するＣ末端融合を含むＬＵＺ−Ｙアプローチ（米国特許出願公開公報第ＷＯ２０１１０３４６０５号）のみならず、ＩｇＡおよびＩｇＧＣ_Ｈ３配列の交互セグメントをそれぞれが含むヘテロ二量体のＦｃドメイン単量体によりＦｃドメインを生成する、ストランド交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｄｏｍａｉｎ））体のアプローチ（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．２３：１９５−２０２，２０１０）が含まれるが、これらに限定されない。

Ｖ．改変された空洞および改変された突起
改変された空洞および改変された突起の使用（すなわち、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」ストラテジー）は、Ｃａｒｔｅｒおよびその協同研究者（Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６、Ａｔｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第５，７３１，１６８号にも開示されている。

本開示では、改変された空洞および改変された突起は、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体の調製に使用される。改変された空洞は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より低分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される空隙である。改変された突起は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より高分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される突起である。詳細には、置換されようとするアミノ酸は、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内にあり、２つのＦｃドメイン単量体の二量体形成に関与する。一部の実施形態では、一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された突起を収納するように形成されるため、両Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメインが、２つのＦｃドメイン単量体の二量体形成を促進するまたは支持する二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記に記載した）として機能する。他の実施形態では、一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸をより良好に収納するように形成されている。さらに他の実施形態では、一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、もう一方のＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸とのさらなる相互作用を形成するように形成されている。

改変された空洞は、チロシンまたはトリプトファン等のより長い側鎖を含有するアミノ酸を、アラニン、バリンまたはトレオニン等のより短い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記でさらに記載した）は、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内にＹ４０７Ｖ変異等の改変された空洞を含有する。同様に、改変された突起は、より短い側鎖を含有するアミノ酸を、より長い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記でさらに記載した）は、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内にＴ３６６Ｗ変異等の改変された突起を含有する。本開示では、改変された空洞および改変された突起はまた、ヘテロ二量体形成を促進する、Ｃ_Ｈ３ドメイン間のジスルフィド結合改変と組み合わされる。一実施例では、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含有するＦｃドメイン単量体は、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。別の実施例では、Ｙ３４９Ｃを追加することで改変された空洞を含有するＦｃドメイン単量体と、Ｓ３５４Ｃを追加することで改変された突起を含有するＦｃドメイン単量体が選択的に組み合わされて、Ｆｃドメインを形成してもよい。ジスルフィド結合改変または構造的計算のいずれかと組み合わせた（ＨＡ−ＴＦ混合）、他の改変された空洞および改変された突起を表３に示すが、これらに限定されない。

（表３）Ｆｃヘテロ二量体形成方法（ノブイントゥホール）

注記：すべての残基はＥＵナンバリングスキームに従って番号付けされている（Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，６３：７８−８５，１９６９）

Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することは、本来のアミノ酸残基をコードする核酸を変更することによって達成することが可能である。置換することが可能である本来のアミノ酸残基の数の上限は、界面における十分な相互作用を維持したままにすることを考えれば、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメインの界面における残基の総数である。

改変された空洞と改変された突起を、静電的ステアリングを用いて組み合わせる
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、例えば２つの異なるポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体形成されるＦｃドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Ｆｃドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの１つを含ませることができる：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。例えば１つのＦｃドメイン単量体、例えば空洞（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）を有するＦｃドメイン単量体も、Ｋ３７０Ｄ変異を含むことができ、そして他のＦｃドメイン単量体、例えば突起（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を有するＦｃドメイン単量体もＥ３５７Ｋを含むことができる。

より一般的には、以下の空洞変異のいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ：Ｙ３４９Ｃ、およびＳ３３６４Ｈ：Ｆ４０５を、表４の変異と組み合わせることができる。そして以下の突起変異のいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｓ３５４Ｃ、およびＹ３４９Ｔ：Ｔ３９４Ｆを、表４の変異と組み合わせることができ、これを空洞変異（または変異の組み合わせ）と組み合わせて使用される表４の変異と対形成させる。

ＶＩ．静電的ステアリング
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第２０１４−００２４１１１号に開示されている。

本開示では、静電的ステアリングを用いて、Ｆｃドメイン単量体の二量体形成およびＦｃ抗原結合ドメイン構築体の形成を制御する。特に、静電的ステアリングを用いてＦｃドメイン単量体の二量体形成を制御することは、Ｃ_Ｈ３−Ｃ_Ｈ３界面を形成する１つまたは複数のアミノ酸残基が、正電荷をもつかまたは負電荷をもつアミノ酸残基で置換されるため、導入された特定の電荷をもつアミノ酸に応じて、相互作用は静電的に好ましくなるかまたは好ましくないものとなる。一部の実施形態では、リシン、アルギニンまたはヒスチジン等、界面の正電荷をもつアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸等の負電荷をもつアミノ酸で置換される。他の実施形態では、界面の負電荷をもつアミノ酸が、正電荷をもつアミノ酸で置換される。電荷をもつアミノ酸は、相互作用するＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの一方または両方に導入され得る。相互作用するＣ_Ｈ３抗体定常ドメインに電荷をもつアミノ酸を導入することによって、二量体形成選択モジュール（上記においてさらに説明した）が形成されるが、それは電荷をもつアミノ酸間の相互作用の結果としての静電的ステアリング効果で制御されるとおりに、Ｆｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である。

一部の実施形態では、静電的ステアリング効果で制御されるとおりにＦｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である、反転した電荷を含む二量体形成選択モジュールを形成するために、２つのＦｃドメイン単量体は、ヘテロ二量体形成またはホモ二量体形成を経て選択的に形成され得る。

Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、限定するものではないが表４に含むような電荷残基対などである、２つのＦｃドメイン単量体内に異なるものであるが適合する変異を導入することによって促進することが可能である。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅ（例えば、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅのうちの１、２、３、４、または５つ以上）の正電荷をもつアミノ酸置換および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの１つ以上を含み得る。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。

「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該２つのＦｃドメイン単量体は、これら２つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷変異（ヘテロ二量体形成選択モジュール）（例えば、表４の変異を参照）を含有する。一例において、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体では、３つのうち２つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果によって促進されるように、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成され得る。

（表４）Ｆｃヘテロ二量体形成方法（静電的ステアリング）

Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Ｆｃドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異（ホモ二量体形成選択モジュール）を導入することによって、促進することが可能である。一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体が、Ｃ_Ｈ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも２つの位置において、同一の逆電荷変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。２つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Ｆｃドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表５および６に示しているが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋである二重の逆電荷の変異体（表５）をそれぞれ含む、２つのＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ３７０Ｄ／Ｅ３５７Ｋである四重の逆電荷の変異体（表６）をそれぞれ含む、２つのＦｃドメイン単量体を含む。

例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、３つのうち１つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果により促進される場合、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成され得る。「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該２つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。３つのＦｃドメイン、すなわち１つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、２つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、カルボキシ末端の「幹」Ｆｃドメインは、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）となり得る。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、二重変異体Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋをそれぞれ含有する２つのＦｃドメイン単量体によって形成され得る。

（表５）Ｆｃホモ二量体形成（２つの変異を伴う静電的ステアリング）

（表６）Ｆｃホモ二量体形成（静電的ステアリング、４つの変異）

他のヘテロ二量体形成方法
多くの他のヘテロ二量体形成技術が記載されている。これらの技術のうちの任意の１つ以上（表７）が、本明細書に記載される任意のノブイントゥホールおよび／または静電的ステアリングヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体形成技術と組み合わされて、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製することができる。

（表７）他のＦｃヘテロ二量体形成方法

ＶＩＩ．リンカー
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび／または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２つのＦｃドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第１のＦｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に対して、２つのＦｃドメイン単量体が互いに直列で連続して連結されるように、接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Ｆｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインのＣ末端を、アルブミン結合ペプチドのＮ末端に付加させることが可能である。

リンカーは、例えばペプチド結合である単純な共有結合、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである合成ポリマー、または、例えば化学的複合体化である化学反応で形成した任意の種類の結合とすることが可能である。リンカーがペプチド結合である場合は、一方のタンパク質ドメインのＣ末端におけるカルボン酸基が、縮合反応でもう一方のタンパク質ドメインのＮ末端におけるアミノ酸と反応して、ペプチド結合を形成することが可能である。詳細には、ペプチド結合は、この技術分野で周知の従来の有機化学反応を経る合成手段により、または、宿主細胞からの自然な産生により形成することが可能であるものであって、例えば２つのＦｃドメイン単量体である、直列で連続したタンパク質両方のＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、宿主細胞内の、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびリボソームである、必要な分子機械（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって両方のタンパク質をコードする隣接し合うポリペプチドへと直接転写または翻訳されることが可能である。

リンカーが合成ポリマー、例えばＰＥＧポリマーである場合においては、該ポリマーは、各端部が反応性の化学官能基で官能化されて、２つのタンパク質の接続端にある末端アミノ酸と反応することが可能である。

リンカー（上記に示したペプチド結合は除く）が化学反応により形成される場合においては、例えばアミン、カルボン酸、エステル、アジドまたはこの技術分野で通常用いられる他の官能基である化学官能基が、一方のタンパク質のＣ末端と、もう一方のタンパク質のＮ末端とのそれぞれに対して合成的に付加することが可能である。この２つの官能基はその後、合成化学手段を経て反応して化学結合を形成することによって、２つのタンパク質をひとつに接続することが可能である。こうした化学的複合体化の手順は、当業者にとってルーチンである。

スペーサー
本開示では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、３〜２００のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００または１８０〜２００のアミノ酸）を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも１２のアミノ酸、例えば、１２〜２００のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４または１２〜１３のアミノ酸）（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００または１９０〜２００のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、１２〜３０のアミノ酸（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において公知であり、例えば、グリシンおよびセリン等のフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。ある実施形態では、スペーサーは、例えば

の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＳのモチーフを含む２〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。他のある実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＧＳのモチーフを含む３〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＧＳＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のモチーフを含む４〜２０のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、

である。

一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも４つのグリシン残基（例えば、４〜２００、４〜１８０、４〜１６０、４〜１４０、４〜４０、４〜１００、４〜９０、４〜８０、４〜７０、４〜６０、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６または４〜５のグリシン残基）（例えば、４〜２００、６〜２００、８〜２００、１０〜２００、１２〜２００、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、または１９０〜２００のグリシン残基）を含有する。ある実施形態では、スペーサーは、４〜３０のグリシン残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のグリシン残基）を有する。一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、または、例えば１つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、

）と比較して、低減されたレベルのグリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−グリコシル化）（例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース（Ｆｕｃ）および／またはガラクトース（Ｇａｌ）等のグリカン（例えば、キシロース）による低減したレベルのＯ−グリコシル化）を有し得る。

一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、Ｏ−グリコシル化（例えば、Ｏ−キシロシル化）されていないものであり得るか、または、例えば１つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、

）と比較して、低減されたレベルのＯ−グリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−キシロシル化）を有し得る。

一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、タンパク質分解を受けないものであり得るか、または、例えば１つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、

）と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。

ある実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＧＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、例えば

である、ＧＧＧＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、

である。

他の実施形態では、スペーサーはまた、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含有すること、例えば

を含有することも可能である。

本開示におけるある実施形態では、それぞれ配列

からなる１２アミノ酸ペプチドスペーサーまたは２０アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて、２つのＦｃドメイン単量体が直列で連続して接続される。他の実施形態では、配列

からなる１８アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。

一部の実施形態において、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、上述のＳＥＱＩＤＮＯ：１〜３６のいずれか１つの配列に対し、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、１８、２６、および２７のいずれか１つの配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８または２７の配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％）である配列を有し得る。

特定の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のヒンジのアミノ末端と、同じポリペプチド内にあるＦｃ単量体のカルボキシ末端との間のリンカー（すなわち、リンカーは、第１のＦｃドメイン単量体のＣ_Ｈ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に接続し、これにより、２個のＦｃドメイン単量体は、互いに直列で連続して連結される）は、共有結合ではなく３つ以上のアミノ酸（例えば、３〜２００個のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、もしくは１８０〜２００個のアミノ酸）を有するスペーサー、または１２〜２００個のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、もしくは１２〜１３個のアミノ酸）など、少なくとも１２個のアミノ酸（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、もしくは１９０〜２００個のアミノ酸））を含有するアミノ酸スペーサーである。

スペーサーはまた、Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端と、ＣＤ３８結合ドメイン（例えば、ＣＤ３８重鎖結合ドメインのＣＨ１ドメインまたはＣＤ３８軽鎖結合ドメインのＣＬドメイン）のカルボキシ末端との間に存在してもよく、これにより、ドメインは、３つ以上のアミノ酸（例えば、３〜２００個のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、もしくは１８０〜２００個のアミノ酸）のスペーサー、または１２〜２００個のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、もしくは１２〜１３個のアミノ酸）など、少なくとも１２個のアミノ酸（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、もしくは１９０〜２００個のアミノ酸））を含有するアミノ酸スペーサーによって連結される。

ＶＩＩ．血清タンパク質結合ペプチド
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。

一例として、ここに記載の方法および組成物に用いることが可能であるアルブミン結合ペプチドは、概して、この技術分野において公知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列

を含む。一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７の配列と、少なくとも８０％同一（例えば、８０％、９０％または１００％同一）である配列を有する。

本開示では、アルブミン結合ペプチドは、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体内の特定のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、抗原結合ドメインを含有するＦｃ構築体中の１つまたは複数のポリペプチドのＣ末端に付加され得る。別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、抗原結合ドメインを含有するＦｃ構築体中で直列で連続して連結された２つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチドのＣ末端に融合されることが可能である。さらに別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、直列で連続して接続した２つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチド内の第２のＦｃドメイン単量体と連結されたＦｃドメイン単量体Ｃ末端（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１１４および１１６、図２のＦｃドメイン単量体２１４および２１６）に付加することが可能である。アルブミン結合ペプチドは、例えば化学的複合体化である化学的手段を介して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と遺伝的に融合、または、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に付加されることが可能である。所望であれば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体とアルブミン結合ペプチドとの間にスペーサーを挿入することが可能である。学説には拘束されないが、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中にアルブミン結合ペプチドが含まれることで、血清アルブミンと治療用タンパク質との結合を介して、治療用タンパク質の滞留延長がもたらされ得ることが期待される。

ＶＩＩＩ．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体
概して、本開示は、２〜１０個のＦｃドメインと、１個または複数の抗原結合ドメインが付加されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Ｆｃ受容体の１つの野生型Ｆｃドメイン（例えばＦｃγＲＩＩＩａ）よりも高い結合アフィニティおよび／またはアビディティを有し得る。この開示は、Ｆｃドメインの２つのＦｃドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する２つのＣ_Ｈ３抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、偶数のＦｃドメイン単量体を含み、Ｆｃドメイン単量体の各対がＦｃドメインを形成する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は最小で２つの機能性Ｆｃドメインと１つの抗原結合ドメインを含み、Ｆｃドメインは、４つのＦｃドメイン単量体の二量体から形成される。抗原結合ドメインは、例えばリンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合または化学的部分で、Ｆｃドメインに連結され得る。一部の実施形態において、本開示は、Ｆｃドメインの２個のＦｃドメイン単量体の第１の対が、互いと二量体を選択的に形成し、Ｆｃドメインの２個のＦｃドメイン単量体の第２の対が、互いと二量体を選択的に形成し、したがって、望ましくない多量体または凝集の形成を回避するように、２個の相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインの第１の対の界面において、表３および４から選択されるアミノ酸置換の１つのセットを改変し、かつ２個の相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインの第２の対の界面において、アミノ酸置換の第１のセットとは異なる、表３および４から選択されるアミノ酸置換の第２のセットを改変する方法に関する。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、多くの方法で組み立てることができる。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、非対称に直列したＦｃドメインから組み立てることができる。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインである。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインである。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｎ末端ＦｃドメインでもＣ末端Ｆｃドメインでもない。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を、異なる抗原結合ドメイン配列を有する長鎖と短鎖を使用して組み立てて、二特異性構築体を形成させることができる。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を、異なるヘテロ二量体形成変異のセットと、異なる抗原結合ドメイン配列を有する鎖を使用して組み立てて、二特異性および三特異性の構築体を形成させることができる。二特異性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、２つの異なる抗原結合ドメインを含む。三特異性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３つの異なる抗原結合ドメインを含む。

抗原結合ドメインは、多くの方法でＦｃ抗原結合ドメイン構築体に連結されることができる。抗原結合ドメインは、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現されることができる。抗原の重鎖構成要素は、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現されることができ、そして軽鎖構成要素は、別個のポリペプチドとして発現されることができる（図６Ａ）。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、抗原結合ドメインとして使用される。ｓｃＦｖは、長鎖Ｆｃの融合タンパク質として発現され得る（図６Ｂ）。一部の実施形態において、長鎖構成要素と軽鎖構成要素は、別個に発現され、そしてＦｃ抗原結合ドメイン構築体に外因的に付加される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、別個に発現され、後に化学結合を用いてＦｃ抗原結合ドメイン構築体に連結される（図６Ｃ）。

一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リシン残基を欠く。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のすべてのＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リシン残基を欠く。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のＦｃポリペプチドのＣ末端リシンの非存在は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）の群の均質性を向上させ得る。例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の均質性を有する３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメインポリペプチドのうちの１つ以上におけるＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異され得る。

本明細書の実施例に記載される例示的Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、それぞれ、ノブおよびホールサブユニットにおいて、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄの電荷対を含有し得る。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２９〜４２は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄの対が含有され得る直交性の静電的ステアリング変異を使用することができ、そして追加のステアリング変異を含む場合もある。直交性のノブアンドホール（ｋｎｏｂｓａｎｄｈｏｌｅｓ）を有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体２９〜４２について、静電的ステアリング変異は、１つを除くすべての直交性の対に必要であり、そしてすべての直交性の対に含まれ得る。

一部の実施形態において、２つの直交性のノブアンドホールが必要とされる場合、ノブ１に対する静電的ステアリング変異はＥ３５７Ｋであってもよく、ホール１に対する静電的ステアリング変異はＫ３７０Ｄであってもよく、そしてノブ２に対する静電的ステアリング変異はＫ３７０Ｄであってもよく、ホール２に対する静電的ステアリング変異は、Ｅ３５７Ｋであってもよい。第３の直交性のノブアンドホールが必要な場合（例えば三特異性抗体）、静電的ステアリング変異のＥ３５７ＫとＤ３９９Ｋがノブ３に付加されて、静電的ステアリング変異のＫ３７０ＤとＫ４０９Ｄがホール３に付加されてもよく、または静電的ステアリング変異のＫ３７０ＤとＫ４０９Ｄがノブ３に付加されて、静電的ステアリング変異のＥ３５７ＫとＤ３９９Ｋがホール３に付加されてもよい。

本明細書に記載される例示的Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えばＦｃ抗原結合ドメイン構築体１〜４２）のいずれか１つは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、１つのＦｃドメインと抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能を強化することができ、または１つのＦｃドメインと抗原結合ドメインを有する構築体には呈されない生物活性を含むことができる。

ＩＸ．宿主細胞およびタンパク質の産生
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ（またはＣＨＯ誘導細胞株、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１ＣＨＯ−ＤＧ４４）、マウス宿主細胞（例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ＶＥＲＹ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７Ｏ３ＯならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。

タンパク質産物の、それらの対応するＤＮＡプラスミド構築体からの発現および分泌のために、宿主細胞が、プロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および選択可能な標識を含む、この技術分野で公知である適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで、トランスフェクトまたは形質転換され得る。治療用タンパク質の発現方法は、この技術分野で公知である。例えば、ＰａｕｌｉｎａＢａｌｂａｓ，ＡｒｇｅｌｉａＬｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＲｅｖｉｅｗｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ；２ｎｄｅｄ．２００４ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ２０，２００４）、ＶｌａｄｉｍｉｒＶｏｙｎｏｖａｎｄＪｕｓｔｉｎＡ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ；２ｎｄｅｄ．２０１２ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ２８，２０１２）を参照されたい。

一部の実施形態において、例えば、細胞培養上清中で、Ｆｃ構築体に組み立てられるポリペプチドをコードするＤＮＡプラスミド構築体でトランスフェクトされた宿主細胞により産生されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体のうちの少なくとも５０％が、（モル基準で）構造的に同一であり、例えば、Ｆｃ構築体の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％が構造的に同一である。

Ｘ．脱フコシル化
各Ｆｃ単量体は、Ａｓｎ２９７においてＮグリコシル化部位を含む。グリカンは、所与のＦｃ単量体上で多数の異なる形態において存在し得る。本明細書に記載される抗体または抗原結合Ｆｃ構築体を含有する組成物において、グリカンは、非常に異種であり得、存在するグリカンの性質は、数ある中でも、抗体または抗原結合Ｆｃ構築体を産生するために使用される細胞の種類、細胞の増殖条件（増殖培地を含む）、および産生後の精製によって決まり得る。種々の場合において、本明細書に記載される構築体を含有する組成物は、少なくともある程度まで脱フコシル化される。例えば、組成物中に存在するグリカン（例えば、Ｆｃグリカン）の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、フコース残基を欠いている。したがって、グリカンの５％〜６０％、５％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜５０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％、または２０％〜４０％が、フコース残基を欠いている。少なくともある程度まで脱フコシル化される組成物は、１，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース阻害剤の存在下で抗体を産生する細胞を培養することによって産生され得る。本明細書に記載される構築体およびポリペプチドの比較的脱フコシル化された形態は、ＦＵＴ８の発現が低減されたか、または発現しない細胞で発現すること、およびベータ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞で発現することを含む、種々の他の方法を使用して産生され得る。

ＸＩ．精製
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、タンパク質精製分野において公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ（例えばプロテインＡアフィニティ）およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製に関するその他の標準技術によって、精製することが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、プロテインＡカラム等のアフィニティカラムを、適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、ろ過、限外ろ過、塩析および透析手順と組み合わせることとによって、単離および精製することが可能である（例えば、ＰｒｏｃｅｓｓＳｃａｌｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＵｗｅＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９、およびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＶｏｌｕｍｅＩ−ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ／ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００４）を参照）。

一部の例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、１つまたは複数の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の精製および単離を促進することが可能である。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズ等の固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に連結され得る精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジンペプチド、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチドおよび赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジンペプチド（ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティカラムと結合する。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）を含む。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）を含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）を含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により機能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂またはアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡペプチドを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することができる。

Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、精製方法としてプロテインＡカラムクロマトグラフィーを採用することができる。プロテインＡリガンドは、Ｆｃ領域を介してＦｃ抗原結合ドメイン構築体と相互作用する。このために、プロテインＡクロマトグラフィーは、大半の宿主細胞タンパク質を除去することができる高度に選択的な捕捉方法となる。本開示では、実施例２〜３に記載されるようにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製してもよい。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体形成ドメインの使用は、６０％以上の純度を有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の調製を可能にし、すなわち、細胞中で産生されるタンパク質構築体物質の６０％以上が、所望のＦｃ構築体構造を有し、例えば、調製物中のタンパク質構築体物質の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、所望のＦｃ構築体構造を有する。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の調製物中のタンパク質構築体物質の３０％未満が、望ましくないＦｃ構築体構造（例えば、実施例１に記載される構築体の高次種）を有し、例えば、調製物中のタンパク質構築体物質の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下が、望ましくないＦｃ構築体構造を有する。一部の実施形態において、１つ以上の既知の精製方法（例えば、プロテインＡアフィニティ精製）を使用したさらなる精製後の、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の最終純度は、８０％以上であり得、すなわち、精製されたタンパク質構築体物質の８０％以上が、所望のＦｃ構築体構造を有し、例えば、調製物中のタンパク質構築体物質の８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、所望のＦｃ構築体構造を有する。一部の実施形態において、１つ以上の既知の精製方法（例えば、プロテインＡアフィニティ精製）を使用してさらに精製されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体の調製物中のタンパク質構築体物質の１５％未満が、望ましくないＦｃ構築体構造（例えば、実施例１に記載される構築体の高次種）を有し、例えば、調製物中のタンパク質構築体物質の１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下が、望ましくないＦｃ構築体構造を有する。

ＸＩＩ．医薬組成物／製剤
本開示は、本明細書に記載の１つまたは複数のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態において、医薬組成物は、構造が同一または実質的に同一であるＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、医薬組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜４２のいずれか１つの実質的に均質な群を含む。

例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）などの本開示の治療用タンパク質構築体を、医薬組成物内に組み込むことが可能である。治療用タンパク質を含む医薬組成物は、当業者に公知である方法によって調製することが可能である。医薬組成物は、水または他の薬学的に許容できる液体の滅菌溶液または懸濁液を含む注射製剤で非経口投与することが可能である。例えば医薬組成物は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、サーファクタント、安定剤、希釈剤、結合剤、賦形剤等の薬学的に許容できる担体または溶媒とＦｃ抗原結合ドメイン構築体とを好適に組み合わせて、次いで通常許容される薬務で求められる単位用量形態で混合することによって、調製することが可能である。医薬製剤に含まれる活性成分の量は、指定される範囲内で好適な用量が与えられるようなものとする。

注射用の滅菌組成物は、従来の薬務に従って、担体として注射用蒸留水を用いて調製することが可能である。例えば、グルコースと、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の他の添加とを含有する生理食塩水または等張液を、任意に、好適な可溶化剤、例えばこの技術分野で通常知られる、エタノール等のアルコールおよびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のポリアルコール、およびポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤と組み合わせて、注射用水溶液として用いることができる。治療用タンパク質産物の調製方法は、この技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（２ｄｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆ＦｒａｎｃｉｓＧｒｏｕｐ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ（２００６）を参照されたい。

ＸＩＩＩ．治療方法および投与量
本明細書に記載される構築体を使用して、抗原結合ドメインが由来する抗体によって治療される障害を治療することができる。例えば、構築体がＣＤ３８を認識する抗原結合ドメインを有する場合、構築体を使用して、種々の癌（例えば、血液悪性腫瘍および固形腫瘍）ならびに自己免疫疾患を治療することができる。癌は、治療用抗ＣＤ３８モノクローナル抗体治療に耐性を示すものである可能性がある。癌は、胃癌、乳癌、結腸癌、肺癌、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ＮＫ細胞白血病、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、形質細胞白血病、および複数の骨髄腫から選択され得る。構築体を使用して、アミロイド軽鎖アミロイドーシス、キャッスルマン病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、意義不明の二クローン性ガンマグロブリン血症、Ｈ鎖病、孤立性形質細胞腫（Ｓｏｌｉｔａｒｙｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍｅ）、髄外性形質細胞腫を治療することもできる。場合によっては、構築体を使用して、免疫複合体を介した予防的および／または治療的ワクチン効果の誘発により、癌細胞に対する免疫調整機能を増強することができる。ＣＤ３８標的化構築体を使用して、形質細胞疾患または単クローン性ガンマグロブリン血症、例えば、軽鎖沈着症、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＧＲＳ）、自己免疫溶血性貧血、Ｔｅｍｐｉ症候群（毛細管拡張症−赤血球増加−単クローン性ガンマグロブリン血症液体貯留−肺内シャント）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発ニューロパチー−臓器肥大−内分泌障害−単クローン性形質増殖障害−皮膚）、および原発性マクログロブリン血症を治療することもできる。

構築体を使用して、自己抗体媒介性疾患、例えば、重症筋無力症（ＭＧ）、ＭｕＳＫ−ＭＧ、心筋炎、ランバートイートン筋無力症候群、神経ミオトニー、視神経脊髄炎、ナルコレプシー、急性運動性軸索型ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、フィッシャー症候群、急性感覚失調性ニューロパチー、傍腫瘍性スティッフパーソン症候群、慢性ニューロパチー、末梢性ニューロパチー、急性散在性脳脊髄炎、多発性硬化症、グッドパスチャー症候群、膜性腎症、糸球体腎炎、肺胞蛋白症、ＣＩＰＤ、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、妊娠性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、新生児エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、グレーブス病、アジソン病、卵巣不全、自己免疫性精巣炎、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、関節リウマチ、ＳＬＥ、ドライアイ病、血管炎（急性）、心臓炎、および抗体関連型拒絶反応を治療することができる。

医薬組成物は、投与形態と互換性のある手法で、治療効果があるような量で投与されて、症状の改善または治療をもたらす。医薬組成物は、例えば静脈内投与形態、皮下投与形態、摂取可能な溶液、薬剤放出カプセル等の経口投与形態である、種々の投与形態で投与される。個々の対象に適切な用量は、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。概して、組換えタンパク質は、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜１００ｍｇ／ｋｇで投与される。したがって、最適な治療効果を得るために求められるとおりに、医療提供者が、用量を誂えて、決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を調整することが必要となる。

ＸＩＶ．補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）
本開示に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、様々なＦｃ受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の１つは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、そしてレクチン経路の３つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。

古典的補体経路では、ＩｇＧまたはＩｇＭが補体活性化のトリガーを引く。抗原に抗体が結合した後、それら抗体にＣ１ｑタンパク質が結合し、Ｃ１複合体を形成させる。この複合体がＣ１ｓエステラーゼを生成し、これがＣ４およびＣ２タンパク質を、Ｃ４ａとＣ４ｂ、およびＣ２ａとＣ２ｂに切断して、活性化する。次いで、Ｃ２ａ断片とＣ４ｂ断片が、Ｃ３転換酵素と呼ばれるタンパク質複合体を形成し、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断して、シグナルを増幅させ、細胞膜障害複合体を形成させる。

本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系によるＣＤＣ活性を強化することができる。

ＣＤＣは比色分析アッセイを使用して評価されてもよく、このアッセイでは、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）が連続希釈された抗体、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体、またはＩＶＩｇでコーティングされる。すべてのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートしてもよい。細胞を、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートしてもよい。次いでプレートを振とう機に２分間置き、４５０ｎｍの吸光度を測定してもよい。

ＸＶ．抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＣは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ＡＤＣＣには、抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化が含まれる。ＮＫ細胞はＦｃ受容体を発現し、これが例えばＩｇＧおよびＩｇＭなどの抗体のＦｃ部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてＮＫ細胞に結合し、活性化させる。ＮＫ細胞は、例えばＩＦＮ−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体形成する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。ＮＫ細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もＡＤＣＣを介在することができる。

ＡＤＣＣは、発光アッセイを使用して評価してもよい。ヒト初代ＮＫエフェクター細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ社）を溶解させ、５ｘ１０^５／ｍＬで、リンパ球増殖培地−３（Ｌｏｎｚａ社）中、３７℃で一晩、そのままの状態にさせておく。次の日、ヒトリンパ芽球様細胞株のＲａｊｉ標的細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−８６）を回収し、アッセイ培地（フェノールレッドフリーのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳΔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））中に再懸濁させ、様々な濃度の対象の各プローブの存在下で３０分間、３７℃で播種する。次いで休ませたＮＫ細胞を回収し、アッセイ培地中に再懸濁させ、抗ＣＤ２０をコートしたＲａｊｉ細胞を含有するプレートに添加する。エフェクター細胞と標的細胞の最終比率を５：１（５ｘ１０^４ＮＫ細胞：１ｘ１０^４Ｒａｊｉ細胞）として、３７℃で６時間、プレートをインキュベートする。

ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞障害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＡＤＣＣ活性を決定する。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）アッセイは、発光性ペプチド基質を使用して、膜の完全性が失われた細胞、例えば溶解したＲａｊｉ細胞によって放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。６時間のインキュベーション期間後、調製された試薬（基質）をプレートの各ウェルに加え、室温で１５分間オービタルプレート振盪機上に置く。発光は、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦ５プレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ社）を使用して測定される。データは、対照条件（ＮＫ細胞＋Ｒａｊｉのみ）からの読取値を、試験条件からの読み取り値から差し引いて、バックグラウンドを除去した後に分析される。

ＸＶＩ．抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＰは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）によって活性化され、ＮＦ−ｋＢの活性化へと繋がっていく。次いで例えばＣ３ｂと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Ｆｃドメインは、そのＦｃ受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果として出来たファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。

ＡＤＣＰは、生物発光アッセイを使用して評価してもよい。抗体依存性細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）は、治療用抗体の重要な作用機序である。ＡＤＣＰは、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞により介在されることができる。３つすべての受容体が、ＡＤＣＰを生じさせる抗体認識、免疫受容体のクラスタリングおよびシグナル伝達事象に関与し得る。しかし、阻害実験から、ＦｃγＲＩＩａがこのプロセスに関与する主要Ｆｃγ受容体であることが示唆されている。

ＦｃγＲＩＩａ−ＨＡＤＣＰレポーターバイオアッセイは、生物発光細胞系アッセイであり、これを使用して、ＦｃγＲＩＩａに特異的に結合および活性化する抗体、ならびにＦｃドメインを有する他の生物物質の有効性と安定性を測定することができる。アッセイは、アミノ酸１３１位でヒスチジン（Ｈ）を含有する、高アフィニティヒトＦｃγＲＩＩａ−Ｈバリアント、およびＮＦＡＴ−応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変ＪｕｒｋａｔＴ細胞株からなる。

標的細胞と関連抗体を共培養したとき、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞が抗体のＦｃドメインに結合し、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達とＮＦＡＴ−ＲＥ−介在性ルシフェラーゼ活性が生じる。生物発光シグナルを検出し、ルシフェラーゼアッセイおよび標準光度計を用いて定量する。

以下の実施例は、本明細書において特許請求される方法および化合物をどのように実施するか、作製するか、そして評価するかについて、当分野の当業者に完全な開示と解説を提供する目的で提示されており、本発明者らが、その開示とみなす範囲を限定する意図はない。

実施例１直線状Ｆｃ抗原ドメイン含有ポリペプチドの組み立てを制御するための直交性ヘテロ二量体形成ドメインの使用
Ｆｃドメイン間のペプチドリンカーの有無にかかわらないタンデムＦｃ構築体の産生におけるものを含む、Ｆｃドメインを抗体のＣ末端に付加するための種々のアプローチが記載されている（例えば、Ｎａｇａｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，４５：２７５２−６３，２００８、およびＷａｎｇｅｔａｌ．ＭＡｂｓ，９：３９３−４０３，２０１７を参照）。しかしながら、複数のＦｃドメインを有する抗体構築体を作製するための科学文献に記載されている方法は、これらの方法が多数の望ましくない種のＦｃドメイン含有タンパク質の産生をもたらすため、それらの有効性が限られている。これらの種は、分子量のはしごをもたらす生成物産生中のポリペプチド鎖の制御されないオフレジスター会合に起因する、異なる分子量を有する（例えば、Ｎａｇａｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，４５：２７５２−６３，２００８、およびＷａｎｇｅｔａｌ．ＭＡｂｓ，９：３９３−４０３，２０１７を参照）。図１および図２は、２個のタンデムＦｃ単量体（図１）または３個のタンデムＦｃ単量体（図２）を含有するポリペプチドのオフレジスター会合によって産生され得る、種々の分子量の複数のＦｃドメインを有するタンパク質種のいくつかの例を概略的に示す。これらの既存のアプローチを使用して定義された分子量を有する複数のＦｃドメインを有する所望のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を一貫して達成することは、より大きい分子量を有する高次種（ＨＯＳ）の除去を必要とし、これは、所望の構築体の収率を大幅に低減する。

直交性ヘテロ二量体形成ドメインの使用は、大量の高次種（ＨＯＳ）も同様に生成することなく、タンデムＦｃ伸長を伴う抗体様構造の産生を可能にした。図３Ａおよび３Ｂは、複数のＦｃドメイン単量体を有する１個の長いポリペプチドを、各々が単一Ｆｃ単量体を有する２個の異なる短いポリペプチドに連結することによって産生される、２個のＦｃドメイン（図３Ａ）または３個のＦｃドメイン（図３Ｂ）を有する直交性直線状Ｆｃ抗原ドメイン結合構築体の例を示す。これらの例では、各構築体の１個のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＣＨ３−ＣＨ３界面における逆電荷変異、および１個の他のＦｃドメイン（図３Ａ）または２個の他のＦｃドメイン（図３Ｂ）のいずれかのＣＨ３−ＣＨ３界面における２個の逆電荷変異と組み合わせて、ノブイントゥホール変異を含む。２個の逆電荷変異を有するＦｃ単量体を有する短いポリペプチド鎖は、突起形成変異および単一逆電荷変異を有する長鎖Ｆｃ単量体に対してより低い親和性を有し、２個の適合する逆電荷変異を有する長鎖Ｆｃ単量体（複数可）に結合する可能性がはるかに高い。逆電荷変異と組み合わせて空洞形成変異を有するＦｃ単量体を有する短いポリペプチド鎖は、適合する逆電荷変異と組み合わせて突起形成変異を有する長鎖Ｆｃ単量体に結合する可能性がはるかに高い。

実施例２および３は、図３Ａおよび３Ｂの概略図に示される構造に対応する直交性直線状Ｆｃ抗原ドメイン結合構築体の産生を記載する。抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１ドメインのいずれかの有する構築体４３および構築体４４を、最小限の望ましくない高次種を伴って産生し、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、およびＡＤＣＣアッセイを使用して機能性について試験した。

実施例２抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体４３の設計および精製
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を上昇させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御的な会合を最小化させるよう設計され、そして実質的に均質な（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％均質な）医薬用途用組成物が作製されるように設計される。これらの目的を踏まえて、タンデムＦｃドメイン（図４）から形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製された。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４３（ＣＤ２０）および構築体４３（ＰＤ−Ｌ１）は各々、３個の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３４）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３５）のいずれか；第１の短鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３６）のコピー；および抗ＣＤ２０短鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）または抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ短鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）である第２の短鎖Ｆｃのコピー）：および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）のいずれかの２個のコピーをそれぞれ含む。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を直列で連続して含有し、各々は、Ｎ末端における抗原結合ドメインと直列で連続して、表３から選択される異なる突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）、および／または表４から選択される異なる逆電荷変異を有する。第１の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異および／または表４から選択される１つ以上の逆電荷変異の第１のセット（変異は、第２の短鎖Ｆｃにおける変異とは異なる）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。第２の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異および／または表４から選択される１つ以上の逆電荷変異の第２のセット（変異は、第１の短鎖Ｆｃにおける変異の第１のセットとは異なる）、ならびにＮ末端における抗原結合ドメインを有する、Ｆｃドメイン単量体を含有する。

この場合、長鎖Ｆｃは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異を有するＦｃドメイン単量体と直列で連続したＤ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ電荷変異とＥ３５７Ｋ電荷変異とを有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端で抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４３（ＣＤ２０））またはＮ末端で抗ＰＤ−Ｌ１ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４３（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。第１の短鎖Ｆｃは、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ電荷変異を有するＦｃドメイン単量体を含有する。第２の短鎖Ｆｃは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異ならびにＫ３７０Ｄ電荷変異を有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端で抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４３（ＣＤ２０））またはＮ末端で抗ＰＤ−Ｌ１ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４３（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。

（表８）構築体４３（ＣＤ２０）および構築体４３（ＰＤ−Ｌ１）の配列

細胞培養
ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列を複数のプラスミドによってコードした。

タンパク質精製
発現されたタンパク質を、ＰｏｒｏｓＭａｂＣａｐｔｕｒｅＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉したＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、ロードした後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で洗浄し、中間洗浄緩衝液の５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）でさらに洗浄して、さらなるプロセスに関する不純物を除去した。結合したＦｃ構築体物質を、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離し、１ＭのＴＲＩＳｐＨ７．４を添加することによって溶離液をすばやく中和し、次いで遠心分離して、０．２μｍのフィルターを通して減菌ろ過した。

ＰｏｒｏｓＸＳ樹脂（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化して、サンプルは、ロードのために平衡用緩衝液で希釈した（１：３）。溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ（１００％Ａ）から、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（１００％Ｂ）の１２〜１５ＣＶの線形勾配を使用して、サンプルを溶離した。溶離中に収集したすべての画分を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、標的の画分をプールして、精製されたＦｃ構築体物質を精製した。

イオン交換の後、標的の画分を、接線流ろ過システム上で、３０ｋＤａカットオフポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、１Ｘ−ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換した。サンプルをおよそ１０〜１５ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。

非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、ＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＧＸｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。

実施例３抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体４４の設計および精製
タンデムＦｃドメイン（図５）から形成された非分岐構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４４（ＣＤ２０）および構築体４４（ＰＤ−Ｌ１）は各々、３個の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３７）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３８）のいずれか；第１の短鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３６）の２個のコピー；および抗ＣＤ２０短鎖Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）または抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ短鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）である第２の短鎖Ｆｃのコピー）：および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）のいずれかの２個のコピーをそれぞれ含む。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を含有し、各々は、Ｎ末端における抗原結合ドメインと直列で連続して、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）、および任意で表４から選択される１つ以上の逆電荷変異のセットを有する（第３のＦｃドメイン単量体は、最初の２つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する）。第１の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異、および任意で表４から選択される１つ以上の逆電荷変異の第１のセット（変異は、第２の短鎖Ｆｃにおける変異の第２のセットとは異なる）を有する、Ｆｃドメイン単量体を含有する。第２の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異、および任意で表４から選択される１つ以上の逆電荷変異の第２のセット（変異は、第１の短鎖Ｆｃにおける変異の第１のセットとは異なる）、ならびにＮ末端における抗原結合ドメインを有する、Ｆｃドメイン単量体を含有する。

この場合、長鎖Ｆｃは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異を有するＦｃドメイン単量体と直列で連続したＤ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ電荷変異とＥ３５７Ｋ電荷変異とを各々が有する、２個のＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端で抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４４（ＣＤ２０））またはＮ末端で抗ＰＤ−Ｌ１ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４４（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。第１の短鎖Ｆｃは、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ電荷変異を有するＦｃドメイン単量体を含有する。第２の短鎖Ｆｃは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異ならびにＫ３７０Ｄ電荷変異を有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端で抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４４（ＣＤ２０））またはＮ末端で抗ＰＤ−Ｌ１ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４４（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。

（表９）構築体４４（ＣＤ２０）および構築体４４（ＰＤ−Ｌ１）の配列

実施例４Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴解析するために使用される実験的アッセイ
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ
タンパク質（Ｆｃ構築体）を、６Ｍのグアニジン（Ｓｉｇｍａ社）中で１μｇ／μＬに希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を濃度１０ｍＭまで加えて、６５℃で３０分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で１時間、３０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と共にインキュベートして、遊離チオールをアルキル化（カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅ））した。その後タンパク質を、１０−ｋＤａ膜を介して２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に透析し、ＩＡＭ、ＤＴＴおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（ＮＥＰ２３２０、ＰｒｅｓｓｕｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で、トリプシンで消化した。圧力は、３７℃で、２０，０００ｐｓｉと周囲圧力との間を１時間に合計３０サイクルで循環させた。ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）クロマトグラフィーシステムとＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として０．１％ＦＡ水溶液および０．１％ＦＡアセトニトリル溶液を用いて、ＢＥＨＰｅｐＭａｐ（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムで分離した。

インタクト質量分析
５０μｇのタンパク質（Ｆｃ構築体）を、１μｇ／μＬの濃度まで、１０ｋＤａスピンフィルター（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．８）に緩衝液交換した。３０単位のＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をサンプルに添加し、３７℃で５時間インキュベートした。水中０．１％ＦＡおよびアセトニトリル中０．１％ＦＡを移動相として使用して、ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＣ４ＢＥＨカラム（１ｘ１００ｍｍ、粒径１．７ｕｍ、孔径３００Ａ）上で分離を行った。Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）クロマトグラフィーシステムおよびＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計上でＬＣ−ＭＳを行った。ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒのデフォルトのＲｅＳｐｅｃｔ方法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、スペクトルをデコンボリュートした。

キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイ
サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈して、ＨＴタンパク質発現変性緩衝液（ＨＴＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社）と混合した。混合物を４０℃で２０分間インキュベートした。サンプルを７０μＬの水で希釈して、９６ウェルプレートに移した。サンプルは、ＨＴＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＬａｂＣｈｉｐ（パーキンエルマー社）を備えたＣａｌｉｐｅｒＧＸＩＩ機器（パーキンエルマー社）で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。

非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させる。サンプルを、ＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＧＸｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかける。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクマシーブルー染色で可視化する。ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化する。Ｉｍａｇｅｌａｂ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行う。

相補依存細胞毒性（ＣＤＣ）
ＣＤＣは、連続希釈されたリツキシマブ、Ｆｃ構築体またはＩＶＩｇでＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）がコーティングした比色分析アッセイで評価した。すべてのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートした。プレートを振とう機に２分間移し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

実施例５抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体による補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性化
抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるオビヌツズマブと比較して、ＣＤＣ活性を強化する度合いを検証するためのＣＤＣアッセイを開発した。オビヌツズマブのＦａｂ配列（ＶＬ＋ＣＬ、ＶＨ＋ＣＨ１）を有する抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体４３および４４を、実施例２および３に記載されるように産生した。それぞれの抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体、およびオビヌツズマブモノクローナル抗体は、以下のように実施されるＣＤＣアッセイにおいて検証された：

１０％の熱非働化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させたＤａｕｄｉ細胞を沈殿させ、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬ当たり１．０ｘ１０^６個の生細胞の濃度で、０．１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させた。この細胞懸濁液５０マイクロリットルを、９６ウェルプレートのすべてのウェル（プレートの端を除く）に加えた。プレートは、すべての添加が行われるまで氷上に保持された。被験物質を、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＢＳＡ中で、４５０ｎＭの開始濃度から４倍連続希釈した。各被験物質に対し、総数で１０の濃度を検証した。播種されたＤａｕｄｉ細胞に対し、それぞれ５０マイクロリットルを加えた。正常またはＣ１ｑ枯渇ヒト補体血清（Ｑｕｉｄｅｌ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＢＳＡ中、１：５に希釈した。播種されたＤａｕｄｉ細胞に対し、それぞれ５０マイクロリットルを加えた。６個の正常血清対照ウェルには、細胞、培地のみ（処置無し）、および１／５正常血清（正常バックグラウンド）を入れた。これらウェルのうち３個には、１６．５μＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）（正常溶解対照）も入れた。Ｃ１ｑ枯渇バックグラウンドおよび溶解対照も同様に調製した。ＰＢＳをすべてのプレート端のウェルに入れた。２時間、３７℃でプレートをインキュベートした。２時間後、予め温めたＡｌａｍａｒブルー（Ｔｈｅｒｍｏ社、マサチューセッツ州ウォルサム）５０μＬを全ウェルに加えた（プレート端を除く）。プレートをインキュベーターに一晩戻した（１８時間、３７℃）。１８時間後、蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で測定した。プレートは、５４４／５９０Ｅｘ／Ｅｍフィルターおよび自動カットオフを使用して最高点を読み取った。正常なバックグラウンド、正常な溶解対照、Ｃ１ｑ枯渇バックグラウンド、およびＣ１ｑ枯渇溶解対照のウェルに対し、平均値が算出された。細胞溶解の百分率を以下のように計算した：
細胞溶解％＝（ＲＦＵ試験−ＲＦＵバックグラウンド）／（ＲＦＵ溶解対照−ＲＦＵバックグラウンド）×１００。各構築体に対して、ＥＣ５０（ｎＭ）が決定された。

表１０に示されるように、抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体は、Ｄａｕｄｉ細胞においてＣＤＣを誘導し、より低いＥＣ５０値によって証されるように、オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較して細胞傷害を強化する能力がより高いことを示した。

（表１０）Ｄａｕｄｉ細胞における、ＣＤＣを誘導する抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体の能力

^１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。

実施例６抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性化
ＡＤＣＰレポーターアッセイ
抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオビヌツズマブと比較して、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を活性化し、それによりＡＤＣＰ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＰレポーターアッセイを開発した。オビヌツズマブのＣＤＲを有する抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体４３および４４を、実施例２および３に記載されるように産生した。各抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：

Ｒａｊｉ標的細胞（１．５ｘ１０^４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（３．５ｘ１０^４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ_２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

表１１に示されるように、抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＰレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導し、低いＥＣ５０値によって明らかであるように、フコシル化オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較し、ＡＤＣＰ活性の増強において高い能力を示した。構築体４４はまた、脱フコシル化オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＰアッセイにおいてより大きい効力を示した。

（表１１）ＡＤＣＰレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導する能力

実施例７抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性化
ＡＤＣＰレポーターアッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体が、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンシオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））と比較して、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を活性化し、それによりＡＤＣＰ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＰレポーターアッセイを開発した。アベルマブのＦａｂ配列（ＶＬ＋ＣＬ、ＶＨ＋ＣＨ１）を有する抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体４３および４４を、実施例２および３に記載されるように産生した。各抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：

標的ＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞（１．５ｘ１０^４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（３．５ｘ１０^４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

表１２に提示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＰレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導した。

（表１２）ＡＤＣＰレポーターアッセイにおける、抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導する能力

^１すべての構築体は、特に記載がない限りＧ２０リンカーを含んでいた。
^２構築体は、アッセイ条件下で測定可能なＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導しなかった。

実施例８抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性化
ＡＤＣＣレポーターアッセイ
抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオビヌツズマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導し、ＡＤＣＣ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＣレポーターアッセイを開発した。オビヌツズマブのＦａｂ配列（ＶＬ＋ＣＬ、ＶＨ＋ＣＨ１）を有する抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体４３および４４を、実施例２および３に記載されるように産生した。各抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：

Ｒａｊｉ標的細胞（１．２５ｘ１０^４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（７．４５ｘ１０４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

表１３に示されるように、抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導した。

（表１３）ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導する能力

実施例９抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性化
ＡＤＣＣレポーターアッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体が、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンシオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導し、ＡＤＣＣ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＣレポーターアッセイを開発した。アベルマブのＦａｂ配列（ＶＬ＋ＣＬ、ＶＨ＋ＣＨ１）を有する抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体４３および４４を、実施例２および３に記載されるように産生した。各抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：

標的ＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞（１．２５ｘ１０^４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（７．４５ｘ１０^４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＰＤ−Ｌ１構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

表１４に示されるように、Ｆｃ構築体４３は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導した。ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達の誘導は、このアッセイを使用して、Ｆｃ構築体４４および脱フコシル化モノクローナル抗体について決定することができなかった。

（表１４）ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、抗ＰＤ−Ｌ１Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導する能力

^１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
^２データは、４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）曲線に確実にはフィットすることができなかった。

実施例１０：抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ２０Ｆｃ構築体の活性
図８Ａ〜８Ｂは、直線状Ｆｃ構築体に組み立てられるポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞による増殖培地に分泌されるタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図８Ａのレーン１および２に見られる２００ｋＤａのバンドは、図４に示される構築体（構築体４３）の組み立てを示す。図８Ｂのレーン１〜３に見られる２５０ｋＤａのバンドは、図５に示される直線状三量体（構築体４４）の組み立てを示す。

図９Ａ〜９Ｂは、図８Ａ〜８Ｂに示されるタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。直線状Ｆｃ構築体に組み立てられるポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞による増殖培地に分泌されるタンパク質を、プロテインＡおよび強カチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。次いで、１ｍｇの精製された直線状二量体（構築体４３）（Ａ）または直線状三量体（構築体４４）（Ｂ）を、ＳＥＣによりサイズに基づいて分離した。

図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｄａｕｄｉ（図１０Ａ）またはＲａｊｉ（図１０Ｂ）細胞のいずれかを標的とする種々の抗ＣＤ２０構築体を用いた、ＣＤＣおよびＡＤＣＰアッセイを示す。図１０Ａは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、単量体抗体と比較して強化されたＣＤＣを介在することを示す。図１０Ｂは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、レポーターアッセイにおいて強化されたＡＤＣＰを介在することを示す。

図１１Ａ〜１１Ｃは、Ａ５４９ヒト肺癌細胞またはＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のいずれかを標的とする種々の抗ＰＤ−Ｌ１構築体を用いた、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰアッセイを示す。図１１Ａは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３を使用したレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、単量体抗体と比較して強化されたＡＤＣＣを介在することを示す。図１１Ｂは、直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、ＡＤＣＣＫＩＬＲアッセイにおいて、ヒト肺癌細胞の強化された死滅を介在することを示す。直線状Ｓ２ＬおよびＳ３Ｌ構築体が、レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のＡＤＣＰを誘発する際に著しくより効率的である、図１１Ｃ。

実施例１０に記載される研究において以下の方法を使用した。

ＳＤＳＰＡＧＥ：培地上清および精製されたＦｃ構築体を、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で、９５℃で１０分間変性させた。製造業者の説明書に従って、Ｂｉｏ−ＲａｄＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル電気泳動垂直セルを使用して、４％〜１５％ＴＧＸステインフリーアクリルアミドプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でサンプルを分離した。迅速蛍光検出またはクマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のいずれかによって、タンパク質を可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ撮像システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、画像を取得した。

分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：１５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を泳動用緩衝液として用いた０．３５ｍＬ／分のアイソクラチック流速のＺｅｎｉｘ−Ｃ４．６ｃ３００ｍｍ３ｍｉｈ粒径カラム（ＳｅｐａｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）、および３０℃に恒温したカラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００システム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）上で、１ｍｇ／ｍＬの濃度においてサンプルを分析した。合計実行時間は、２８０ｎｍのＵＶ検出で約１２〜１５分であった。約４分で体積が完全に除外された。

ＣＤＣアッセイ：抗ＣＤ２０ＣＤＣアッセイにおいて使用された標的細胞は、Ｄａｕｄｉリンパ芽球様ヒトＢ細胞株である。Ｄａｕｄｉ細胞を遠心により懸濁培養液から取り出し、６ｘ１０５細胞／ｍＬでＸ−ＶＩＶＯ１５培地中に再懸濁した。Ｄａｕｄｉ細胞を、ウェル当たり１００ｍＬ（６×１０４細胞／ウェル）の体積で、９６ウェルプレート平底アッセイプレートに移した。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびＳＩＦボディをＸＶＩＶＯ１５培地中で３．３３ｍＭに希釈した。次いで、１．５ｍＬポリプロピレンチューブ中で、抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＳＩＦボディの各々を用いて、連続１：３希釈を行い、１１点の希釈シリーズを得た。抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＳＩＦボディの各希釈を、アッセイプレート中の適切なウェルに、５０ｍＬ／ウェルで移した。抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＳＩＦボディを移した後ただちに、５０ｍＬの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。２時間インキュベーションした後、２０ｍＬのＷＳＴ−１増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターへと１４時間戻した。１４時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で１分間振盪し、分光光度計を使用して、６００ｎｍの補正を用いて、４５０ｎｍで直ちにウェルの吸光度を決定した。

抗体依存性細胞障害レポーター（ＡＤＣＰ）：Ｊｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（３．５×１０４細胞／ウェル）およびＲａｊｉ（ＣＤ２０について）またはＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１（Ｃｒｏｗｎ−Ｂｉｏ、ＰＤ−Ｌ１についてトランスフェクトされた）細胞を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０またはＰＤ−Ｌ１構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

抗体依存性細胞障害レポーター（ＡＤＣＣ）：Ｊｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（７．４５×１０４細胞／ウェル）およびＲａｊｉ（ＣＤ２０について）またはＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１（Ｃｒｏｗｎ−Ｂｉｏ、ＰＤ−Ｌ１についてトランスフェクトされた）細胞を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ照度計（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。

抗体依存性細胞障害（ＫＩＬＲＡＤＣＣ）：Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を取得し、Ｆ−１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および２ｍＭｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。実験の２４時間前、１５０，０００細胞／ｍＬのＡ５４９細胞を、ＰＤ−Ｌ１発現を刺激するために５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを添加した増殖培地中で培養した。このアッセイにおいてＨｅｍａｃａｒｅＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用し、非組織培養処理フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内に一晩置いた。次いで、Ａ５４９細胞を、３ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて５分間採取した。細胞を０．２×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬのＡ５４９細胞を、９６ウェル組織培養処理白色平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに添加した。いかなるインキュベート時間もなく、１０μＬの構築体を各ウェルに添加した。直後に、１×１０＾６細胞／ｍＬの５０μＬのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で５時間インキュベートした。次いで、５０μＬのＣｙｔｏｔｏｘｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、続いて３７℃で１５分間インキュベートした。発光を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ社）を使用して読み取った。

他の実施形態
この明細書中に記載したすべての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。

この開示について、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変形が可能であることと、この出願は、概してこの開示の原則に従い、かつ、この開示が関係する技術分野の範囲内で公知または通例である範囲にあり、先に述べた本質的な特徴に応用することができるような、この開示からの逸脱を含んだ、この開示の任意のバリエーション、使用または適応を網羅することを意図し、請求項の範囲に従うものであることとが理解されるであろう。

他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内とする。

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは、グリシンスペーサーである。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは独立して、４〜３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４）、４〜２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６５）、８〜３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６６）、８〜２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６７）、１２〜２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６８）、または１２〜３０個（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９）のグリシン残基からなる。一部の実施形態において、第２のリンカーおよび任意の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）からなる。

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４０）および

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４１）を有する。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４２）を有する。一部の実施形態において、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４２）を有し、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４２）を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４１）を有する。

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４３）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４３）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４３）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４３）を含む。

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４４）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４４）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４４）を含む。一部の実施形態において、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４４）を含む。

一部の実施形態において、リンカーは、

一部の実施形態において、リンカーは、

（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４４）と比較して、ＣＨ３ドメイン上に、最大で１０、８、６または５個の単一アミノ酸置換が存在する。好適な変更の例は、この技術分野で公知である。

ここで「グリシンスペーサー」という語は、２つのＦｃドメイン単量体を直列で連続して連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）、８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）、または１２個（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）のグリシン（例えば、４〜３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４）、８〜３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６６）、または１２〜３０個（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９）のグリシン、例えば、１２〜３０個（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４）のグリシン）を含有し得る。一部の実施形態において、グリシンスペーサーは、

本明細書において使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。
[本発明1001]
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む第1のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体；第2のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む第2のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第3のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含む任意選択の第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも1つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
少なくとも1つの他のＦｃドメイン単量体が、少なくとも1個、2個、または3個の逆電荷変異を含む、ポリペプチド。
[本発明1002]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメイン、および任意選択でＣＨ1ドメインを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
前記第1のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、少なくとも2個の逆電荷変異を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
第3のリンカーおよび第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体を含み、前記第1のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1006]
第3のリンカーおよび第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体を含み、前記第1のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、少なくとも2個の逆電荷変異を含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1007]
逆電荷変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、同一の逆電荷変異を有する、本発明1001〜1006のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
改変された突起を形成する変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、少なくとも1個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
改変された突起を形成する変異および少なくとも1個の逆電荷変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体が、逆電荷変異を含むが突起形成変異は含まない前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体の前記逆電荷変異（複数可）とは異なる逆電荷変異を含む、本発明1008のポリペプチド。
[本発明1010]
改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1001〜1009のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
前記変異が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1010のポリペプチド。
[本発明1012]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1001〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1014]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1015]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1016]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1017]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1個が、ＥＵのＩ253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1001〜1016のポリペプチド。
[本発明1018]
ＥＵのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1017のポリペプチド。
[本発明1019]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1018のポリペプチド。
[本発明1020]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1個が、ＥＵのＲ292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
ＥＵのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1020のポリペプチド。
[本発明1022]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1023]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、

および

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、本発明1001〜1022のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1025]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1026]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有し、前記第2のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1027]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1028]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1029]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1030]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、アミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
前記単一アミノ酸置換が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される、本発明1028〜1035のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6個が、ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1039]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1037のポリペプチド。
[本発明1040]
前記改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つは、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1041]
少なくとも1個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1001〜1040のいずれかのポリペプチド。
[本発明1042]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1001〜1041のいずれかのポリペプチド。
[本発明1043]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1001〜1041のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1045]
前記ＶＨドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1046]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除く前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1048]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1049]
前記抗原結合ドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1050]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1051]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、ならびに表2に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除く前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1052]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1053]
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1001〜1041のポリペプチド。
[本発明1054]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、本発明1001〜1041のいずれかのポリペプチド。
[本発明1055]
ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメインおよびＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに連結された、本発明1001〜1054のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドは、前記ポリペプチドの第1、第2、または第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第2のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結されている、ポリペプチド複合体。
[本発明1056]
前記第2のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、本発明1055のポリペプチド複合体。
[本発明1057]
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｙ407Ｔ、Ｙ407Ａ、Ｆ405Ａ、Ｔ394Ｓ、Ｔ394Ｗ／Ｙ407Ａ、Ｔ366Ｗ／Ｔ394Ｓ、Ｔ366Ｓ／Ｌ368Ａ／Ｙ407Ｖ／Ｙ349Ｃ、Ｓ364Ｈ／Ｆ405Ａからなる群から選択される、本発明1056のポリペプチド複合体。
[本発明1058]
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｔ366Ｓ／Ｌ368Ａ／Ｙ407Ｖ／Ｙ349Ｃ73である、本発明1057のポリペプチド複合体。
[本発明1059]
前記第2のポリペプチド単量体が、少なくとも1個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1056のポリペプチド複合体。
[本発明1060]
前記少なくとも1個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1059のポリペプチド複合体。
[本発明1061]
前記少なくとも1個の逆電荷変異が、Ｋ370Ｄである、本発明1060のポリペプチド複合体。
[本発明1062]
前記第2のポリペプチド単量体が、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、Ｙ349Ｃ、およびＫ370Ｄ変異を含む、本発明1055〜1061のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1063]
前記第2のポリペプチド単量体が、抗原結合ドメインをさらに含む、本発明1055〜1062のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1064]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1065]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1066]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1067]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1068]
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1069]
前記ＶＨドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1070]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1071]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除く前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体の前記ＶＨ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1072]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1073]
前記抗原結合ドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1074]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1075]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、ならびに表2に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除く前記ＶＨドメイン配列および前記ＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体の前記ＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1076]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1067のポリペプチド複合体。
[本発明1077]
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1078]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、本発明1063のポリペプチド複合体。
[本発明1079]
前記ポリペプチド複合体が、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドにさらに連結され、前記ポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内、および前記第3のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、前記第2および第3のポリペプチドが、前記ポリペプチドの異なるＩｇＧ1 Ｆｃドメイン単量体に連結している、本発明1055〜1078のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1080]
前記第3のポリペプチド単量体が、少なくとも2個の逆電荷変異を含む、本発明1079のポリペプチド複合体。
[本発明1081]
前記少なくとも2個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1080のポリペプチド複合体。
[本発明1082]
前記第2のポリペプチド単量体が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される少なくとも1個の逆電荷変異を含み、前記第3のポリペプチド単量体が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される少なくとも2個の逆電荷変異を含み、前記第2および第3のポリペプチド単量体が、異なる逆電荷変異を含む、本発明1079のポリペプチド。
[本発明1083]
前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1055〜1082のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1084]
前記第3のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1079〜1083のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1085]
前記ポリペプチドが、2個のＦｃ単量体を含み、1個のＦｃ単量体が、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗ変異を含み、1個のＦｃ単量体が、Ｄ356ＫおよびＤ399Ｋ変異を含む、本発明1055〜1084のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1086]
Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗ変異を含む前記Ｆｃ単量体が、Ｅ357Ｋ変異をさらに含む、本発明1085のポリペプチド複合体。
[本発明1087]
前記ポリペプチドが、3個のＦｃ単量体を含み、1個のＦｃ単量体が、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗ変異を含み、2個のＦｃ単量体が各々、Ｄ356ＫおよびＤ399Ｋ変異を含む、本発明1055〜1084のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1088]
Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗ変異を含む前記Ｆｃ単量体が、Ｅ357Ｋ変異をさらに含む、本発明1087のポリペプチド複合体。
[本発明1089]
前記第2のポリペプチド単量体が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、およびＹ407Ｖ変異を含む、本発明1079〜1088のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1090]
前記第2のポリペプチドが、Ｋ370Ｄ変異をさらに含む、本発明1089のポリペプチド複合体。
[本発明1091]
前記第3のポリペプチド単量体が、Ｋ392ＤおよびＫ409Ｄ変異を含む、本発明1079〜1088のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1092]
前記第2のポリペプチド単量体が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、およびＫ370Ｄ変異を含み、前記第3のポリペプチド単量体が、Ｋ392ＤおよびＫ409Ｄ変異を含む、本発明1087または1088のポリペプチド複合体。
[本発明1093]
単一Ｆｃドメインおよび少なくとも1個の抗原結合ドメインを有するポリペプチド複合体に対して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、増強されたエフェクター機能を含む、本発明1005〜1092のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1094]
ａ）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、ならびに
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1095]
前記リンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1094のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1096]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＦｃドメイン単量体が、少なくとも2個の逆電荷変異を含む、本発明1094のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1097]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、少なくとも1個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1094のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1098]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1096または1097のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1100]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1096または1097のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1101]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6個が、前記ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1100のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1102]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1101のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1103]
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1個が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1096または1097のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1104]
少なくとも1個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1096または1097のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1105]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｗ、およびＥ357Ｋ変異を含み、前記第2のＦｃドメイン単量体が、Ｄ356ＫおよびＤ399Ｋ変異を含む、本発明1096〜1104のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1106]
前記第3のＦｃドメイン単量体が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、およびＫ370Ｄ変異を含む、本発明1096〜1105のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1107]
前記第4のＦｃドメイン単量体が、Ｋ392ＤおよびＫ409Ｄ変異を含む、本発明1096〜1106のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1108]
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、本発明1094〜1107のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1109]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1094〜1107のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1110]
前記抗原結合ドメインが、Ｖ _ＨドメインおよびＣ _Ｈ 1ドメインを含む、本発明1094〜1107のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1111]
前記抗原結合ドメインが、Ｖ _Ｌドメインをさらに含む、本発明1110のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1112]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、Ｖ _Ｌドメインを含む第4のポリペプチドを含む、本発明1111のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1113]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1110のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1114]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1110のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1115]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除く前記Ｖ _Ｈ配列が、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列に対し、少なくとも95％同一である、本発明1110のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1116]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列を含む、本発明1110のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1117]
ａ）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、ならびに
ｉｖ）前記第2のＦｃドメイン単量体を前記第3のＦｃドメイン単量体に連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成し、
前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第3のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1118]
前記リンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1117のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1119]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2および第3のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、少なくとも2個の逆電荷変異を含む、本発明1117のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1120]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、少なくとも1個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1119のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1121]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1119および1120のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1122]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1119および1120のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1123]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6個が、前記ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1122のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1124]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1123のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1125]
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1個が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1119および1120のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1126]
少なくとも1個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1119および1120のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1127]
前記第1のＦｃドメイン単量体が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｗ、およびＥ357Ｋ変異を含み、前記第2および第3のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｄ356ＫおよびＤ399Ｋ変異を含む、本発明1119〜1126のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1128]
前記第4のＦｃドメイン単量体が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、およびＫ370Ｄ変異を含む、本発明1119〜1127のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1129]
前記第5のＦｃドメイン単量体が、Ｋ392ＤおよびＫ409Ｄ変異を含む、本発明1119〜1128のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1130]
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、本発明1117〜1129のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1131]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1117〜1129のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1132]
前記抗原結合ドメインが、Ｖ _ＨドメインおよびＣ _Ｈ 1ドメインを含む、本発明1117〜1129のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1133]
前記抗原結合ドメインが、Ｖ _Ｌドメインをさらに含む、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1134]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、Ｖ _Ｌドメインを含む第4のポリペプチドを含む、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1135]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表1Ａおよび1Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1136]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1137]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除く前記Ｖ _Ｈ配列が、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列に対し、少なくとも95％同一である、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1138]
前記Ｖ _Ｈドメインが、表2に記載される抗体のＶ _Ｈ配列を含む、本発明1132のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1139]
以下を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法：
ａ）（1）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
（3）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドに連結され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、こと、ならびに
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製すること。
[本発明1140]
前記細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、構造的に同一である、本発明1139の方法。
[本発明1141]
以下を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法：
ａ）（1）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、
ｖ）前記第2のＦｃドメイン単量体を前記第3のＦｃドメイン単量体に連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第4のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
（3）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第3のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドに連結され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、こと、ならびに
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製すること。
[本発明1142]
前記細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、構造的に同一である、本発明1141の方法。
[本発明1143]
ａ）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第1の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第1および第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチド、
ｂ）ｉ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第2の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第3および第4のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第2のポリペプチド、
ｃ）第1の軽鎖結合ドメインを含む第3のポリペプチド、
ｄ）第2の軽鎖結合ドメインを含む第4のポリペプチド、
ｅ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第5のポリペプチド
を含み、
前記第1および第4のＦｃドメイン単量体が一緒に、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2および第3のＦｃドメイン単量体が一緒に、第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の重鎖結合ドメインおよび第1の軽鎖結合ドメインが一緒に、第1のＦａｂを形成し、前記第2の重鎖結合ドメインおよび第2の軽鎖結合ドメインが一緒に、第2のＦａｂを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1144]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を含む、本発明1143のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1145]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ3ドメインが、ヒトＩｇＧ1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を含む、本発明1143のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1146]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1143のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1147]
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ3ドメイン内のみである、本発明1143のＦｃ抗原ドメイン単量体。
[本発明1148]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Ａおよび4Ｂの置換から選択される、本発明1143のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1149]
各軽鎖結合ドメインが、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、各重鎖結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1143のＦｃ抗原構築体。
[本発明1150]
前記第1および第2の軽鎖結合ドメインが、配列について同一であり、前記第1および第2の重鎖結合ドメインが、配列について同一である、本発明1143の抗原構築体。
[本発明1151]
ａ）ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第1の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第1および第2のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、
ｖ）前記第2および第3のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）ｉ）第6のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第2の重鎖結合ドメイン
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）第1の軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
ｆ）第2の軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1および第4のＦｃドメイン単量体が一緒に、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2および第5のＦｃドメイン単量体が一緒に、第2のＦｃドメインを形成し、前記第3および第6のＦｃドメイン単量体が一緒に、第3のＦｃドメインを形成し、前記第1の重鎖結合ドメインおよび第1の軽鎖結合ドメインが一緒に、第1のＦａｂを形成し、前記第2の重鎖結合ドメインおよび第2の軽鎖結合ドメインが一緒に、第2のＦａｂを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1152]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を含む、本発明1151のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1153]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ3ドメインが、ヒトＩｇＧ1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を含む、本発明1151のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1154]
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1151のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1155]
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ3ドメイン内のみである、本発明1151のＦｃ抗原ドメイン単量体。
[本発明1156]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Ａおよび4Ｂの置換から選択される、本発明1151のＦｃ抗原ドメイン構築体。
[本発明1157]
各軽鎖結合ドメインが、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、各重鎖結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1151のＦｃ抗原構築体。
[本発明1158]
前記第1および第2の軽鎖結合ドメインが、配列について同一であり、前記第1および第2の重鎖結合ドメインが、配列について同一である、本発明1151の抗原構築体。

（表１Ａ）

（表１Ｂ）可変ドメイン配列

一部の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも４つのグリシン残基（例えば、４〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７０）、４〜１８０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７１）、４〜１６０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７２）、４〜１４０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７３）、４〜４０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７４）、４〜１００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７５）、４〜９０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７６）、４〜８０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７）、４〜７０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７８）、４〜６０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７９）、４〜５０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８０）、４〜４０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７４）、４〜３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４）、４〜２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６５）、４〜１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８１）、４〜１８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８２）、４〜１７（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８３）、４〜１６（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８４）、４〜１５（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８５）、４〜１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８６）、４〜１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８７）、４〜１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８８）、４〜１１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８９）、４〜１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９０）、４〜９（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９１）、４〜８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９２）、４〜７（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９３）、４〜６（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９４）または４〜５（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９５）のグリシン残基）（例えば、４〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７０）、６〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９６）、８〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９７）、１０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９８）、１２〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９９）、１４〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３００）、１６〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０１）、１８〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２）、２０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３）、３０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０４）、４０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０５）、５０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０６）、６０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０７）、７０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０８）、８０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０９）、９０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１０）、１００〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１１）、１２０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１２）、１４０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１３）、１６０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１４）、１８０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１５）、または１９０〜２００（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１６）のグリシン残基）を含有する。ある実施形態では、スペーサーは、４〜３０のグリシン残基（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４）（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のグリシン残基（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６４））を有する。一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、または、例えば１つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、

一部の例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、１つまたは複数の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の精製および単離を促進することが可能である。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズ等の固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に連結され得る精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジンペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチドおよび赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジンペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）（ＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティカラムと結合する。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）を含む。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６１）を含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）を含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６２）を含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）を含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、直列で連続した、整数倍にした配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６３）を含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により機能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂またはアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡペプチドを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することができる。

^１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）リンカーを含んだ。

^１すべての構築体は、特に記載がない限りＧ２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）リンカーを含んでいた。
^２構築体は、アッセイ条件下で測定可能なＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導しなかった。

^１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）リンカーを含んだ。
^２データは、４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）曲線に確実にはフィットすることができなかった。

Claims

抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
少なくとも１つの他のＦｃドメイン単量体が、少なくとも１個、２個、または３個の逆電荷変異を含む、ポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメイン、および任意選択でＣＨ１ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
前記第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、少なくとも２個の逆電荷変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含み、前記第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含み、前記第１のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、少なくとも２個の逆電荷変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
逆電荷変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、同一の逆電荷変異を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
改変された突起を形成する変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
改変された突起を形成する変異および少なくとも１個の逆電荷変異を含む前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体が、逆電荷変異を含むが突起形成変異は含まない前記ポリペプチドの前記ＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体の前記逆電荷変異（複数可）とは異なる逆電荷変異を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１０に記載のポリペプチド。
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項１に記載のポリペプチド。
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１個が、ＥＵのＩ２５３位で単一アミノ酸変異を含む、請求項１〜１６に記載のポリペプチド。
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項１８に記載のポリペプチド。
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１個が、ＥＵのＲ２９２位で単一アミノ酸変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２１に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、

および

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、請求項２３に記載のポリペプチド。
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、請求項２３に記載のポリペプチド。
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有し、前記第２のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、請求項２３に記載のポリペプチド。
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列

を有する、請求項２３に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸欠失または置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴うアミノ酸配列

を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記単一アミノ酸置換が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６個が、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項３７に記載のポリペプチド。
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項３７に記載のポリペプチド。
前記改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも１つは、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
少なくとも１個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記ＶＨドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除く前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除く前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項１〜４１に記載のポリペプチド。
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに連結された、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、前記ポリペプチドと前記第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドの第１、第２、または第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第２のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結されている、ポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項５５に記載のポリペプチド複合体。
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択される、請求項５６に記載のポリペプチド複合体。
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ７３である、請求項５７に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む、請求項５６に記載のポリペプチド複合体。
前記少なくとも１個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項５９に記載のポリペプチド複合体。
前記少なくとも１個の逆電荷変異が、Ｋ３７０Ｄである、請求項６０に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、抗原結合ドメインをさらに含む、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記ＶＨドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除く前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体の前記ＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除く前記ＶＨドメイン配列および前記ＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体の前記ＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項６７に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、請求項６３に記載のポリペプチド複合体。
前記ポリペプチド複合体が、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドにさらに連結され、前記ポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第１、第２、または第３のＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内、および前記第３のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、前記第２および第３のポリペプチドが、前記ポリペプチドの異なるＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体に連結している、請求項５５〜７８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記第３のポリペプチド単量体が、少なくとも２個の逆電荷変異を含む、請求項７９に記載のポリペプチド複合体。
前記少なくとも２個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項８０に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される少なくとも１個の逆電荷変異を含み、前記第３のポリペプチド単量体が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される少なくとも２個の逆電荷変異を含み、前記第２および第３のポリペプチド単量体が、異なる逆電荷変異を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
前記第２のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項５５〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記第３のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項７９〜８３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記ポリペプチドが、２個のＦｃ単量体を含み、１個のＦｃ単量体が、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含み、１個のＦｃ単量体が、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項５５〜８４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含む前記Ｆｃ単量体が、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む、請求項８５に記載のポリペプチド複合体。
前記ポリペプチドが、３個のＦｃ単量体を含み、１個のＦｃ単量体が、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含み、２個のＦｃ単量体が各々、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項５５〜８４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を含む前記Ｆｃ単量体が、Ｅ３５７Ｋ変異をさらに含む、請求項８７に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチドが、Ｋ３７０Ｄ変異をさらに含む、請求項８９に記載のポリペプチド複合体。
前記第３のポリペプチド単量体が、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
前記第２のポリペプチド単量体が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含み、前記第３のポリペプチド単量体が、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む、請求項８７または８８に記載のポリペプチド複合体。
単一Ｆｃドメインおよび少なくとも１個の抗原結合ドメインを有するポリペプチド複合体に対して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、増強されたエフェクター機能を含む、請求項５〜９２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびに
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記リンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項９４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＦｃドメイン単量体が、少なくとも２個の逆電荷変異を含む、請求項９４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む、請求項９４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項９６または９７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６個が、前記ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項１００に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１０１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも１個が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項９６または９７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
少なくとも１個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項９６または９７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＥ３５７Ｋ変異を含み、前記第２のＦｃドメイン単量体が、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項９６〜１０４のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第３のＦｃドメイン単量体が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む、請求項９６〜１０５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む、請求項９６〜１０６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項９４〜１０７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項９４〜１０７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含む、請求項９４〜１０７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｖ_Ｌドメインをさらに含む、請求項１１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、Ｖ_Ｌドメインを含む第４のポリペプチドを含む、請求項１１１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項１１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除く前記Ｖ_Ｈ配列が、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列を含む、請求項１１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、ならびに
ｉｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体を前記第３のＦｃドメイン単量体に連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドに連結された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第３のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記リンカーが、

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１１７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２および第３のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、少なくとも２個の逆電荷変異を含む、請求項１１７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、少なくとも１個の逆電荷変異をさらに含む、請求項１１９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項１１９および１２０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１１９および１２０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６個が、前記ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項１２２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１２３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも１個が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項１１９および１２０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
少なくとも１個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項１１９および１２０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第１のＦｃドメイン単量体が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＥ３５７Ｋ変異を含み、前記第２および第３のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｄ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項１１９〜１２６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＫ３７０Ｄ変異を含む、請求項１１９〜１２７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記第５のＦｃドメイン単量体が、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異を含む、請求項１１９〜１２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１１７〜１２９のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１１７〜１２９のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含む、請求項１１７〜１２９のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記抗原結合ドメインが、Ｖ_Ｌドメインをさらに含む、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、Ｖ_Ｌドメインを含む第４のポリペプチドを含む、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表１Ａおよび１Ｂに記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除く前記Ｖ_Ｈ配列が、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｖ_Ｈドメインが、表２に記載される抗体のＶ_Ｈ配列を含む、請求項１３２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
以下を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法：
ａ）（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドに連結され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、こと、ならびに
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製すること。
前記細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、請求項１３９に記載の方法。
以下を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法：
ａ）（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体を前記第３のＦｃドメイン単量体に連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第４のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第３のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドに連結され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成する、こと、ならびに
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製すること。
前記細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、請求項１４１に記載の方法。
ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第１の軽鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチド、
ｄ）第２の軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチド、
ｅ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチド
を含み、
前記第１および第４のＦｃドメイン単量体が一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２および第３のＦｃドメイン単量体が一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の重鎖結合ドメインおよび第１の軽鎖結合ドメインが一緒に、第１のＦａｂを形成し、前記第２の重鎖結合ドメインおよび第２の軽鎖結合ドメインが一緒に、第２のＦａｂを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を含む、請求項１４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を含む、請求項１４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみである、請求項１４３に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび４Ｂの置換から選択される、請求項１４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
各軽鎖結合ドメインが、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、各重鎖結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項１４３に記載のＦｃ抗原構築体。
前記第１および第２の軽鎖結合ドメインが、配列について同一であり、前記第１および第２の重鎖結合ドメインが、配列について同一である、請求項１４３に記載の抗原構築体。
ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１の重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー、
ｖ）前記第２および第３のＦｃドメイン単量体を連結するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）ｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２の重鎖結合ドメイン
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１の軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２の軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
前記第１および第４のＦｃドメイン単量体が一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２および第５のＦｃドメイン単量体が一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、前記第３および第６のＦｃドメイン単量体が一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、前記第１の重鎖結合ドメインおよび第１の軽鎖結合ドメインが一緒に、第１のＦａｂを形成し、前記第２の重鎖結合ドメインおよび第２の軽鎖結合ドメインが一緒に、第２のＦａｂを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を含む、請求項１５１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を含む、請求項１５１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記Ｆｃドメイン単量体の各々が独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１個の単一アミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１５１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみである、請求項１５１に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび４Ｂの置換から選択される、請求項１５１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
各軽鎖結合ドメインが、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、各重鎖結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項１５１に記載のＦｃ抗原構築体。
前記第１および第２の軽鎖結合ドメインが、配列について同一であり、前記第１および第２の重鎖結合ドメインが、配列について同一である、請求項１５１に記載の抗原構築体。