JP2021531756A - CCR4を標的指向する改変Fc抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法 - Google Patents
CCR4を標的指向する改変Fc抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
CCケモカイン受容体4(CCR4)は、調節性T細胞およびTh2細胞上で発現し、胃癌、乳癌、結腸癌、および肺癌を含む、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方においてある役割を果たすと考えられている。ポテリジオ(登録商標)(モガムリズマブ)は、再発または難治性の成人T細胞白血病/リンパ腫の治療において使用されるCCR4を標的指向するヒト化抗体である。
本開示は、CCR4結合ドメインを少なくとも2つのFcドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新たな治療剤を生み出すための組成物および方法を特徴とする。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基からなるスペーサーである。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択され;CCR4結合ドメインは、scFvであり;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VLドメインをさらに含み;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3のセットを含み;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含み;CCR4結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、この場合においてVHドメインの配列およびVLドメインの配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択され;CCR4結合ドメインは、scFvであり;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VLドメインをさらに含み;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3のセットを含み;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含み;CCR4結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、この場合においてVHドメインの配列およびVLドメインの配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択されるアミノ酸配列から選択される。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸欠の失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、VHドメインまたはscFvは、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含み、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VHドメインは、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一であり、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列を含み、VHドメインまたはscFvは、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列のセットを含み、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセット由来のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列を含み、VHドメインまたはscFvメインは、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインとを含み、VHドメイン配列およびVLドメイン配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列と少なくとも95%または98%同一であり、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第5のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第5のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)第3のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第3のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第4のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、
g)第3のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第4のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4軽鎖結合ドメインと第3のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4軽鎖結合ドメインと第4のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成し、第3のCCR4軽鎖結合ドメインと第1のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第3のFabを形成し、第4のCCR4軽鎖結合ドメインと第2のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか3、またはそれからなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に置換を含み、EUのI253位の各アミノ酸置換は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に置換を含み、EUのR292位の各アミノ酸置換は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される置換を含み、各Fcドメイン単量体のヒンジは独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
本明細書に記載される場合、「Fcドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第2および第3の抗体定常ドメイン(CH2およびCH3)、またはそれらの機能性断片(例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、CH2ドメインまたはその機能性断片、およびCH3ドメインまたはその機能性断片)(例えば、(i)別のFcドメイン単量体と二量体形成してFcドメインを形成し、そして(ii)Fc受容体に結合することができる断片)を含むポリペプチド鎖を指す。好ましいFcドメイン単量体は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、IgG1ヒンジ、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインの少なくとも一部分を含む。したがって、Fcドメイン単量体、例えば、ヒトIgG1 Fcドメイン単量体は、E316〜G446もしくはK447、P317〜G446もしくはK447、K318〜G446もしくはK447、K318〜G446もしくはK447、S319〜G446もしくはK447、C320〜G446もしくはK447、D321〜G446もしくはK447、K322〜G446もしくはK447、T323〜G446もしくはK447、K323〜G446もしくはK447、H324〜G446もしくはK447、T325〜G446もしくはK447、またはC326〜G446もしくはK447にわたることができる。Fcドメイン単量体は、IgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である(例えば、IgG)。さらに、Fcドメイン単量体は、IgGサブタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4)であり得る(例えば、ヒトIgG1)。ヒトIgG1 Fcドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトIgG1の完全ヒンジドメインは、EUナンバリングE316〜P230またはL235にわたり、CH2ドメインは、A231またはG236〜K340にわたり、CH3ドメインは、G341〜K447にわたる。ヒンジドメインの最後のアミノ酸の位置については異なる見解がある。それは、P230またはL235のいずれかである。本明細書の多くの実施例において、CH3ドメインはK347を含まない。ゆえにCH3ドメインは、G341〜G446であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、E216〜L235を含み得る。これは、例えば、ヒンジがCH1ドメインまたはCCR4結合ドメインに対してカルボキシ末端である場合に当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどのいくつかの例では、EUナンバリング221のAspは、Glnに変異される。Fcドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域(CDR)として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Fcドメイン単量体は、野生型(例えば、ヒト)Fcドメイン単量体配列からの変更を10程度(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4のアミノ酸置換、付加、または欠失)含有することが可能であり、該変更は、FcドメインとFc受容体との間の相互作用を変える。Fcドメイン単量体は、野生型Fcドメイン単量体配列(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4のアミノ酸置換、付加または欠失)からの変更(例えば、単一アミノ酸置換)を10程度含有することが可能であり、当該変更は、Fcドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態では、以下のヒトIgG1 CH3ドメイン配列と比較して、CH3ドメイン上に、最大10、8、6または5つの単一アミノ酸置換が存在する:
。好適な変更の例は、この技術分野で既知である。
の配列を有する。
100×(分数であるA/B)
式中、Aは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは参照配列内のアミノ酸(または核酸)残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合のいくつかの実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性と等しくないはずである。
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC:antibody−dependent cytotoxicity)、抗体依存性細胞貪食(ADCP:antibody−dependent cellular phagocytosis)、および補体依存性細胞傷害(CDC:complement−dependent cytotoxicity)など、Fcドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。いくつかの事例では、本開示は、既知の単一Fcドメインを含有する治療剤、例えば、既知の治療用抗体などのCCR4結合ドメインを、少なくとも2つのFcドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療剤を生み出すことを企図する。いくつかの事例では、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば既知の治療用抗体などの既知のFcドメイン含有治療剤を超える生物活性を有する。少なくとも2つのFcドメインの存在により、エフェクター機能が増強され、ADCPおよび/またはCDCと組み合わせたADCCなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより、治療用分子の有効性が増加し得る。開示 一貫した生物学的機能を有する製品を生み出すために、Fcドメインの数を制御することが必須である。本開示は、Fcドメインをコードするペプチドのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド鎖から別個のサイズの分子を組み立てるFc改変ツールのセットを特徴とする。国際公開第WO/2015/168643号、同第WO2017/151971号、同第WO2017/205436号、および同第WO2017/205434号は、2つ以上のFcドメインを有する分子を組み立てるためのFc改変ツールおよび方法を開示しており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。改変ツールは、製造結果を著しく改善する構造特徴(例えば、グリシンリンカー)を含む。これらの構築体の特性により、実質的に均質な薬学的組成物の効率的な生成が可能となる。薬学的組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、薬学的組成物においてそのような均質性があることが望ましい。薬学的組成物に高度の均質性を持たせることにより、望ましくない物質(例えば、分解産物、および/または凝集産物または多量体)によって引き起こされる薬学的製品の凝集または分解の可能性も最小限に抑えられ、望ましくない物質によって引き起こされるオフターゲットおよび有害な副作用も制限される。
Fcドメイン単量体は、ヒンジドメイン、CH2抗体定常ドメイン、およびCH3抗体定常ドメインの少なくとも一部分(例えば、任意のアミノ酸置換を有するヒトIgG1ヒンジ、CH2抗体定常ドメイン、およびCH3抗体定常ドメイン)を含む。Fcドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプIgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDのものとすることが可能である。Fcドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)のものとしてもよい。Fcドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびIgG1からのCH2およびIgAからのCH3による複合型、または、ヒンジおよびIgG1からのCH2であるがIgG3からのCH3による複合型であってもよい。Fcドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばFcγRIIIaであるFc受容体と結合することが可能なFcドメイン(本明細書でさらに規定される)である。本開示では、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインが、CH3−CH3抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Fcドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、N末端またはC末端に付加するさらなる部分を含む。本開示では、Fcドメイン単量体は、例えばVH、VL、相補性決定領域(CDR)または超可変領域(HVR)である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。
本明細書で規定するように、Fcドメインは、CH3抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する2つのFcドメイン単量体を含む。Fcドメインは、Fc受容体、例えばFc−ガンマ受容体(すなわち、Fcγ受容体(FcγR))、Fc−アルファ受容体(すなわち、Fcα受容体(FcαR))、Fc−イプシロン受容体(すなわち、Fcε受容体(FcεR))および/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する最小限の構造を形成する。いくつかの実施形態では、本開示のFcドメインは、Fcγ受容体(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b))および/またはFcγRIVおよび/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する。
抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合する1つ以上のペプチドまたはポリペプチドを含む。CCR4結合ドメインは、抗体のCCR4結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、CCR4結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であり得る。CCR4結合ドメインは、フィブロネクチン系の結合タンパク質(例えば、FN3モノボディ)などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。
本開示において、二量体形成選択モジュールは、2つのFcドメイン単量体の好ましい対形成を促進してFcドメインを形成する、Fcドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択モジュールは、2つのFcドメイン単量体の相互作用するCH3抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、2つのCH3抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいFcドメインの最終形態は、二量体形成選択モジュールをもたないFcドメイン単量体で、または二量体形成選択モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつFcドメイン単量体で形成される他のFcドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、QuikChange(登録商標)mutagenesisなどのこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
改変された空洞および改変された突起の使用(すなわち、「ノブイントゥホール(knob−into−hole)」ストラテジー)は、Carterおよびその協同研究者(Ridgway et al.,Protein Eng.9:617−612,1996、Atwell et al.,J Mol Biol.270:26−35,1997、Merchant et al.,Nat Biotechnol.16:677−681,1998)によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第5,731,168号にも開示されている。
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール(knob−in−hole)技術と組み合わせて、例えば2つの異なるポリペプチド中のFcドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体形成されるFcドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Fcドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの1つを含ませることができる:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。例えば1つのFcドメイン単量体、例えば空洞(Y349C、T366S、L368AおよびY407V)を有するFcドメイン単量体も、K370D変異を含むことができ、そして他のFcドメイン単量体、例えば突起(S354CおよびT366W)を有するFcドメイン単量体もE357Kを含むことができる。
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第2014−0024111号に開示されている。
Fcドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、表3に含まれるが、それらに限定されない電荷残基対などの2つのFcドメイン単量体に異なるが適合性の変異を導入することによって促進され得る。いくつかの実施形態では、Fcドメイン単量体は、以下の正に荷電したアミノ酸置換および負に荷電したアミノ酸置換のうちの1つを含み得る。D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばD356KまたはE357Kを含有するFcドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばK370DまたはK370Eを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。別の実施例では、E357Kを含有するFcドメイン単量体と、K370Dを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。
注記:すべての残基はEUナンバリングスキームに従って番号付けされている(Edelman et al,Proc Natl Acad Sci USA,63:78−85,1969)
Fcドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Fcドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異(ホモ二量体形成選択モジュール)を導入することによって、促進することが可能である。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体が、CH3ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも2つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。2つのFcドメイン単量体内の残基の2以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したFcドメイン単量体は同じ変異の配列のFcドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではFcドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Fcドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表4Aおよび4Bに示すが、これらに限定されない。一実施形態では、Fcドメインは、二重逆電荷変異体(表4Aおよび表4B)、例えば、K409D/D399Kを各々含む、2つのFcドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Fcドメインは、四重逆電荷変異体(表4Aおよび表4B)、例えば、K409D/D399K/K370D/E357Kを各々含む、2つのFcドメイン単量体を含む。
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび/または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも2つのFcドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第1のFcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、第2のFcドメイン単量体のヒンジドメインのN末端に対して、2つのFcドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Fcドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、アルブミン結合ペプチドのN末端に付加させることが可能である。
本開示では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、3〜200のアミノ酸(例えば、3〜200、3〜180、3〜160、3〜140、3〜120、3〜100、3〜90、3〜80、3〜70、3〜60、3〜50、3〜45、3〜40、3〜35、3〜30、3〜25、3〜20、3〜15、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜200、5〜200、6〜200、7〜200、8〜200、9〜200、10〜200、15〜200、20〜200、25〜200、30〜200、35〜200、40〜200、45〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200または180〜200のアミノ酸)を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも12のアミノ酸、例えば、12〜200のアミノ酸(例えば、12〜200、12〜180、12〜160、12〜140、12〜120、12〜100、12〜90、12〜80、12〜70、12〜60、12〜50、12〜40、12〜30、12〜20、12〜19、12〜18、12〜17、12〜16、12〜15、12〜14または12〜13のアミノ酸)(例えば、14〜200、16〜200、18〜200、20〜200、30〜200、40〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200、180〜200または190〜200のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、12〜30のアミノ酸(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において既知であり、例えば、グリシンおよびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。ある実施形態では、スペーサーは、例えば
の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である、GSのモチーフを含む2〜12のアミノ酸を含有することが可能である。他のある実施形態では、スペーサーは、
である、GGSのモチーフを含む3〜12のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、
である、GGSG(配列番号2)のモチーフを含む4〜20のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、
である、GGGGS(配列番号1)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である。
と比較して、低減されたレベルのグリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−グリコシル化)(例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース(Fuc)および/またはガラクトース(Gal)などのグリカン(例えば、キシロース)による低減したレベルのO−グリコシル化)を有し得る。
と比較して、低減されたレベルのO−グリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−キシロシル化)を有し得る。
と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。
である、GGGG(配列番号19)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である、GGGGG(配列番号24)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である。
および
からなる12アミノ酸ペプチドスペーサーおよび20アミノ酸ペプチドスペーサーが直列に接続される。他の実施形態では、配列
からなる18アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するFc抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号37の配列と、少なくとも80%同一(例えば、80%、90%または100%同一)である配列を有する。
概して、本開示は、2〜10個のFcドメインと、1つ以上のCCR4結合ドメインとを付加されたFc抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Fc受容体の1つの野生型Fcドメイン(例えばFcγRIIIa)よりも高い結合アフィニティおよび/またはアビディティを有し得る。この開示は、Fcドメインの2つのFcドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する2つのCH3抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Fc抗原結合ドメイン構築体は、偶数のFcドメイン単量体を含み、Fcドメイン単量体の各対がFcドメインを形成する。Fc抗原結合ドメイン構築体は、最小で、4つのFcドメイン単量体の二量体から形成される2つの機能性Fcドメインと、1つのCCR4結合ドメインとを含む。CCR4結合ドメインは、例えばリンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合または化学的部分によって、Fcドメインに結合され得る。
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で既知の従来の技術(形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入など)によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、CHO(またはCHO誘導細胞株、例えばCHO−K1、CHO−DXB11 CHO−DG44)、マウス宿主細胞(例えば、NS0、Sp2/0)、VERY、HEK(例えば、HEK293)、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7O3OならびにHsS78Bstの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。
各は、Asn 297においてNグリコシル化部位を含む。グリカンは、所与の上で多数の異なる形態では存在し得る。本明細書に記載される抗体または抗原結合Fc構築体を含有する組成物において、グリカンは、非常に異種であり得、存在するグリカンの性質は、数ある中でも、抗体または抗原結合Fc構築体を産生するために使用される細胞の種類、細胞の増殖条件(増殖培地を含む)、および産生後の精製によって決まり得る。様々な例では、本明細書に記載の構築体またはポリペプチド複合体またはポリペプチドを含む組成物は、少なくともある程度脱フコシル化される。例えば、組成物中に存在するグリカン(例えば、Fcグリカン)の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%が、フコース残基を欠いている。したがって、グリカンの5%〜60%、5%〜50%、5%〜40%、10%〜50%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%、または20%〜40%が、フコース残基を欠いている。少なくともある程度まで脱フコシル化される組成物は、1,3,4−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−2−フルオロ−L−フコース阻害剤の存在下で抗体を産生する細胞を培養することによって産生され得る。本明細書に記載の構築体およびポリペプチドの比較的脱フコシル化された形態は、FUT8の発現が低減されたか、またはFUT8を発現しない細胞で発現させること(例えば、FUT8をノックアウトすることによって、またはRNAi(siRNA、miRNA、もしくはshRNAを用いて発現を低減することによって)、およびベータ−1,4−マンノシル−糖タンパク質4−ベータ−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(GnT−III)を過剰発現する細胞で発現させることを含む様々な他の方法を使用して産生され得る。
本開示は、本明細書に記載の1つ以上のFc抗原結合ドメイン構築体を含む薬学的組成物を特徴とする。一実施形態では、薬学的組成物は、構造が同一または実質的に同一であるFc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、薬学的組成物は、Fc抗原結合ドメイン構築体1〜42のいずれか1つの実質的に均質な群を含む。
構築体を使用して、癌、例えば、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を治療することができる。治療することができる癌は、とりわけ、再発または難治性の成人T細胞白血病/リンパ腫、成人T細胞白血病−リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、卵巣癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、乳癌、胃腺癌である。
本開示に記載されるFc抗原結合ドメイン構築体は、様々なFc受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の1つは、補体依存性細胞傷害(CDC)システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、そしてレクチン経路の3つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性を強化することもできる。ADCCは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ADCCには、抗体によるナチュラルキラー(NK)細胞の活性化が含まれる。NK細胞はFc受容体を発現し、これが例えばIgGおよびIgMなどの抗体のFc部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてNK細胞に結合し、活性化させる。NK細胞は、例えばIFN−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体形成する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。NK細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もADCCを介在することができる。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食(ADCP)活性を強化することもできる。ADCPは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン(PAMPS)によって活性化され、NF−κBの活性化へと繋がっていく。次いで例えばC3bと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Fcドメインは、そのFc受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果としてできたファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。
タンパク質発現
Fc抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を増加させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御会合を最小限に抑え、実質的に均質な(例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、または99%均質な)薬学的使用のための組成物を生成するように設計される。これらの目標を念頭に、分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体7(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号ZZ1)および2コピーの短鎖Fc(配列番号ZZ2))と、2コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とを含む。長鎖Fcは、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列で連続してN末端で含有する(構築体7(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表4Aおよび4BAおよび4Bのアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
試料を、Laemmli試料緩衝液(4%SDS、Bio−Rad)中で、95℃で10分間変性させた。試料を、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad)上で泳動させた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行う。
タンパク質発現
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体13(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号ZZのうちのいずれか1つ)および2コピーの短鎖Fc(配列番号ZZ))と、2コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号ZZ)とを含む。長鎖Fcは、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)を、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体、ならびに抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)と直列に連続して、N末端で含有する(構築体13(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖および抗CCR4 VHおよびCH1は、モガムリズマブから取られる。CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。構築体13の他の型が抗CCR4重鎖とともに作製され得、各型は、長鎖Fcポリペプチド中のFcドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー(G4、G10、G15、またはG20リンカー)を保有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。以下の構築体の各々に対するアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体1(図1)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインと直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)(ヘテロ二量体形成を促進する)を導入することにより作製される、改変突起を有する。CCR4結合ドメインは、長鎖Fcと同じアミノ酸配列の一部として発現され得る(例えば、scFvを形成するため)。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)(ヘテロ二量体形成を促進する)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。本実施例では、かつFc抗原結合ドメイン構築体2〜42についての以下の実施例の各々では、細胞は、抗体可変軽鎖を発現する第3のプラスミドを含有し得る。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体2(図2)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体3(図3)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体4(図4)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体5(図5)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体6(図6)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体7(図7)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体8(図8)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体9(図9)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体10(図10)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体11(図11)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体12(図12)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体13(図13)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体14(図14)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体ともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体15(図15)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体16(図16)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体17(図17)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体18(図18)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端またはC末端Fcドメインのいずれにもない、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体19(図19)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体20(図20)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体21(図21)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
3つのアッセイを使用して、親mAbおよび様々なFc抗原結合ドメイン構築体による、CDC、ADCP、およびADCC経路の活性化を試験する。抗CD20モノクローナル抗体であるGazyva(オビヌツズマブ)由来のCDRを含有する4つの構築体を作製した。フコシル化mAbおよび脱フコシル化mAbの両方を作製し、S3Y(実施例2に記載の構築体13の構造、図13)およびSAI(実施例1に記載の構築体7の構造、図7)Fc抗原結合ドメイン構築体も作製した。CDCアッセイを以下のとおり行った。
1.抗CD20 CDCアッセイで使用される標的細胞は、Rajiリンパ芽球様ヒトB細胞株(ATCC CCL−86)である。Raji細胞を遠心分離により懸濁培養液から除去し、6×105細胞/mLでX−VIVO 15培地中に再懸濁した。
2.Raji細胞を、1ウェル当たり100μL(6×104細胞/ウェル)の体積で96ウェル平底アッセイプレートに移した。
3.抗CD20モノクローナル抗体(mAb)およびSIFボディを各々、X−VIVO 15培地中で3.33μMに希釈した。その後、連続1:3希釈を1.5mLのポリプロピレンチューブ内で抗CD20 mAbおよびSIFボディの各々を用いて行い、11点希釈系列を得た。
4.抗CD20 mAbおよびSIFボディの各希釈物を、50μL/ウェルでアッセイプレート中の適切なウェルに移した。
5.抗CD20 mAbおよびSIFボディを移した直後に、50μLの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。
6.アッセイプレートを37℃および5%CO2で2時間インキュベートした。
7.2時間インキュベーションした後、20μLのWST−1増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
8.プレートを37℃および5%CO2のインキュベーターに14時間戻した。
9.14時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で1分間振盪し、分光光度計を使用して、600nmの補正を用いて、450nmで直ちにウェルの吸光度を決定した。
標的細胞がRajiであるCDCアッセイ(図47、左のパネル)では、S3Y(構築体13(CD20))構築体は細胞傷害性を媒介することができたが、他の構築体は媒介することができなかった。
FcγRIIa−H ADCPレポーターバイオアッセイコンプリートキット(Promegaカタログ番号G9901)は、FcγRIIaに特異的に結合して活性化するFcドメインを有する抗体および他の生物学的物質の効力および安定性を測定するために使用され得る細胞ベースの生物発光アッセイである。このアッセイは、アミノ酸131位にヒスチジン(H)を含有する高親和性ヒトFcgRIIa−HバリアントおよびNFAT−応答要素(NFAT−RE)によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株からなる。標的細胞および関連抗体と共培養されると、FcγRIIa−Hエフェクター細胞はその抗体のFcドメインに結合し、FcγRIIaのシグナル伝達およびNFAT−RE媒介性ルシフェラーゼ活性がもたらされる。生体発光シグナルを検出し、Bio−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準蛍光度計を使用して定量化した。増加した濃度の抗CD20抗体および構築体7(CD20)または構築体13(CD20)をRaji(CD20+)標的細胞およびFcとインキュベートし、増加した濃度の抗CD20抗体および構築体を、図47の中央のパネル中の指示された濃度で、Raji(CD20+)標的細胞およびFcγRIIa−Hエフェクター細胞とインキュベートした(2:1のE:T比、およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)。37℃で6時間インキュベーションを継続した。Bio−Glo(商標)。試薬を添加し、発光をPHERAstar FS計器で測定した。データを、図47の中央のパネル中の指示された濃度でRIIa−Hエフェクター細胞(2:1のE:T比、およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)、GraphPad Prismソフトウェアを使用して4PL曲線に適合させた。37℃で6時間インキュベーションを継続した。Bio−Glo(商標)試薬を添加し、発光をPHERAstar FS計器で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを使用して4PL曲線に適合させた(図47、中央のパネル)。SAI構築体(構築体7(CD20))およびS3Y構築体(構築体13(CD20))の両方が、mAbと比較して100倍超増強された効力を示した。
ヒト初代NKエフェクター細胞(Hemacare)を解凍し、5×105/mLでリンパ球増殖培地−3(Lonza)中37℃で一晩静止させた。翌日、ヒトリンパ芽球様細胞株Raji標的細胞(ATCC CCL−86)を収集し、アッセイ培地(フェノールレッドフリーのRPMI、10%FBSΔ、GlutaMAX(商標))中に再懸濁し、様々な濃度の目的とする各プローブの存在下で、37℃で30分間プレーティングした。その後、静止させたNK細胞を収集し、アッセイ培地中に再懸濁し、抗CD20コーティングRaji細胞を含有するプレートに添加した。プレートを、最終比率5:1のエフェクター細胞:標的細胞(5×104NK細胞:1×104Raji細胞)で、37℃で6時間インキュベートした。
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−MS/MS
タンパク質を、6Mのグアニジン(Sigma)中で1μg/μLに希釈した。ジチオスレイトール(DTT)を濃度10mMまで加えて、65℃で30分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で1時間、30mMのヨードアセトアミド(IAM)とともにインキュベートして、遊離チオールをアルキル化(カルバミドメチル化(carbamidomethylate))した。その後タンパク質を、10−kDa膜を介して25mMの炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH7.8)中に透析し、IAM、DTTおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Barocycler(NEP 2320、Pressure Biosciences社)中で、トリプシンで消化した。圧力は、37℃で、20,000psiと周囲圧力との間を1時間に合計30サイクルで循環させた。ペプチドのLC−MS/MS分析は、Ultimate 3000(Dionex)クロマトグラフィーシステムとQ−Exactive(Thermo Fisher Scientific社)質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として0.1%FA水溶液および0.1%FAアセトニトリル溶液を用いて、BEH PepMap(Waters社)カラムで分離した。±1.5Daの四重極分離幅(isolation width)を有する二重荷電イオン(z=2)m/z 842.5に基づいて、単独でキシロシル化されたリンカーペプチドを標的とした。
タンパク質を、78.98%水、20%アセトニトリル、1%ギ酸(FA)、および0.02%トリフルオロ酢酸からなる泳動緩衝液(running buffer)中で2μg/μLの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離を、直列に2.1×350mm、合計カラム長700mmの2つのZenix−C SEC−300(Sepax Technologies,Newark,DE)上で行った。タンパク質を、80μL/分の流量で上述の泳動緩衝液を使用してSECカラムから溶出した。質量スペクトルを、ポジティブモードで動作させたQSTAR Elite(Applied Biosystems)Q−ToF質量分光計で取得した。個々のサイズ画分下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたるスペクトルを合計することによって、ベイズピークデコンボリューション(Bayesian peak deconvolution)を使用してデコンボリュートした。
サンプルを1mg/mLに希釈して、HTタンパク質発現変性緩衝液(HT Protein Express denaturing buffer)(パーキンエルマー(PerkinElmer)社)と混合した。混合物を40℃で20分間インキュベートした。サンプルを70μLの水で希釈して、96ウェルプレートに移した。サンプルは、HT Protein Express LabChip(パーキンエルマー社)を備えたCaliper GXII機器(パーキンエルマー社)で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
試料を、Laemmli試料緩衝液(4%SDS、Bio−Rad)中で、95℃で10分間変性させた。試料を、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad)上で泳動させた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
CDCを、Raji細胞(ATCC)が連続希釈されたリツキシマブ、Fc構築体4、またはIVIgでコーティングされた比色分析アッセイにより評価した。すべてのウェルにヒト血清補体(Quidel社)を25%v/vで添加し、37℃で2時間インキュベートした。細胞は、WST−1細胞増殖試薬(Roche Applied Science社)を添加した後で、37℃で12時間インキュベートした。プレートを振とう機に2分間移し、450nmの吸光度を測定した。
タンパク質発現
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体4(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fc(配列番号66)および3コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、3コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とを含む。長鎖Fcは、直列に連続して3つのFcドメイン単量体を含有し、各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異と、S354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)とを有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とをN末端で含有する(構築体4(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表7の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体8(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fc(配列番号69)および2コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとを含む。長鎖Fcは、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進するため)を有するFcドメイン単量体に直列に連続して、E357K電荷変異と、S354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)とを有するFcドメイン単量体を含有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とをN末端で含有する(構築体8(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表8の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体9(CCR4)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号54)および2コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとを含む。長鎖Fcは、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続してN末端で含有する(構築体9(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4重鎖とをN末端で含有する(構築体9(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖Fcおよび/または短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表9の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体10(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号71)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有し、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列で連続してN末端で含有する(構築体10(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表10の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体16(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号73)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、3コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とをそれぞれ含む。長鎖Fcは、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、2つのFcドメイン単量体(各々が、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有する)と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続して含有する(構築体10(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表11の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端またはC末端Fcドメインのいずれにもない、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体19(CCR4)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号75)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Fcは、E357Kの電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続してN末端で含有する(構築体19(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表12の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
CCRF−CEM細胞(ATCC)を標的細胞として使用して、10%の熱失活されたFBS(Hyclone)を含有するRPMI 1640培地中で培養した。50μlの細胞(100×103細胞/ml)を、10%の超低IgG FBSを含有するフェノールレッドを含まないRPMI中に再懸濁し、平底白色96ウェルプレート中に播種した。抗CCR4構築体を6nMから3倍希釈し、アッセイに必要とされる最終濃度の11倍の濃度で調製した。10μlの各構築体希釈物を標的細胞に添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートした後、エフェクター細胞に添加した。凍結保存されたNK細胞(Hemacare)をエフェクター細胞として使用して、組織培養処理フラスコ(Falcon)中のAIM−V培地中に24時間安置した。1ウェル当たり25000個のエフェクター細胞を添加し、エフェクター:標的(E:T)比5:1を得た。プレートを37℃で5時間インキュベートした後、50μLのCytoTox Glo試薬(Promega社)を添加し、続いて37℃で15分間インキュベートした。発光を、PHERAstar FS(BMG Labtech社)を使用して読み取った。結果を図25および表13に示す。
抗CD20および抗CCR4構築体を利用して、ホモ二量体形成変異、ヘテロ二量体形成変異、ポリペプチドリンカー、およびFabドメインの様々な組み合わせがFcガンマ受容体への結合に影響を及ぼしたかどうかを評価した。表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、CD64(Fcガンマ受容体I)への1:1結合を評価した。これらの構築体をチップ表面上に捕捉し、可溶性受容体への結合を測定して、1:1結合を確実にした。この形式では、結合価は、Fc機能の変化に最も敏感な読み取り値であり、速度定数および平衡定数は、Fcドメインのサブセットの変化に鈍感である。
DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。抗体を2つの異なるプラスミド(1つのプラスミドが重鎖をコードし、第2のプラスミドが軽鎖をコードした)から発現させた。SIFボディを3つの別個のプラスミド(多くの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、1つのプラスミドがアミノ末端Fcに結合したCH1−VH FAB部分を含むプラスミド長鎖Fcをコードし、第3のプラスミドが短鎖Fcをコードした)から発現させた。S3A SifボディおよびS3W Sifボディは例外であった。S3Wの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第2のプラスミドが2つのFcドメインを含む長鎖をコードし、第3のプラスミドがCH1−VH FAB部分を含む単一のFc鎖をコードした。S3Aの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第2のプラスミドがアミノ末端Fcに結合したCH1−VH FAB部分を含む長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドが同様にCH1−VH FAB部分を含む短鎖Fcをコードした。
発現したタンパク質を、Poros MabCapture Aカラムを用いて、プロテインA系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。装填後に捕捉したSIFボディ構築体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.0)で洗浄し、中間洗浄緩衝液である50mMのクエン酸緩衝液(pH5.5)でさらに洗浄して、追加のプロセス関連不純物を除去した。結合したSIFボディ物質を100mMのグリシン(pH3)で溶出し、溶出液を1M TRIS(pH7.4)の添加により素早く中和し、その後、遠心分離し、0.2μmのフィルターに通して滅菌濾過した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、ポストプロテインA、プールされたイオン交換画分、および精製された最終物質の純度評価に使用した。
結合実験を、CM3シリーズSセンサーチップを使用してBiacore T200計器(GE Healthcare)で行った。FcgR結合の結合価分析のために、天然プロテインAを直接アミン結合により固定化した。リガンドを泳動緩衝液中で希釈し、捕捉した。ヒト組換えCD32aまたはCD64(R&D Systems)の6点希釈系列を捕捉したリガンド上に流した。各リガンドの結合価を以下のように計算した。
リガンドの結合価=Rmax/[(MW分析物/MWリガンド)×リガンド捕捉レベル]
構築体の細胞表面CD32aへの相対的結合を、抗CD20構築体を使用して、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR−FRET)アッセイ(CisBio)で評価した。アッセイ試薬を製造業者の指示に従って調製した。Freedom EVOware 150自動液体ハンドラー(Tecan)を使用して試料毎に10点3倍連続希釈系列を生成し、これを、標識受容体を有する細胞に添加した。その後、標識競合抗体を添加し、プレートを室温でインキュベートした。PHERAstar蛍光リーダー(BMG Labtech GmbH)を使用して、アッセイプレートを665nmおよび620nmで読み取った。対数変換試料濃度を対応するHTRFシグナル比(665nm/620nm)に対してプロットした。4パラメータ非線形回帰分析(最小二乗適合)をXY−プロットに行って非標識試料のEC50を計算し、EC50はFcガンマ受容体に対する試料の親和性に反比例した。
抗原結合を、SPRを使用して評価した。組換え型、ヒスチジンタグ付きのCCR4(9049−B7 R&D Systems)タンパク質を、以前に固定化した抗6X His抗体を使用してセンサ上で捕捉した。同族抗体およびSIFボディの希釈系列をセンサに通過させ、これを分析物注入の合間に低pHグリシン溶液で再生させた。結合を、1:1ラングミュア相互作用モデルを使用して計算した。
Fc受容体結合の分析により、抗CCR4 Fc構築体13(実施例2、表6)がFc受容体に結合することがわかった。
この明細書中に記載したすべての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
CCケモカイン受容体4(CCR4)は、調節性T細胞およびTh2細胞上で発現し、胃癌、乳癌、結腸癌、および肺癌を含む、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方においてある役割を果たすと考えられている。ポテリジオ(登録商標)(モガムリズマブ)は、再発または難治性の成人T細胞白血病/リンパ腫の治療において使用されるCCR4を標的指向するヒト化抗体である。
本開示は、CCR4結合ドメインを少なくとも2つのFcドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新たな治療剤を生み出すための組成物および方法を特徴とする。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30(配列番号:77)、8〜30(配列番号:78)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30(配列番号:77)、8〜30(配列番号:78)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30(配列番号:77)、8〜30(配列番号:78)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなるスペーサーである。
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、4〜30(配列番号:77)、8〜30(配列番号:78)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなるスペーサーである。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30(配列番号:77)、4〜20(配列番号:80)、8〜30(配列番号:78)、8〜20(配列番号:81)、12〜20(配列番号:82)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択され;CCR4結合ドメインは、scFvであり;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VLドメインをさらに含み;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3のセットを含み;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含み;CCR4結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、この場合においてVHドメインの配列およびVLドメインの配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30(配列番号:77)、4〜20(配列番号:80)、8〜30(配列番号:78)、8〜20(配列番号:81)、12〜20(配列番号:82)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択され;CCR4結合ドメインは、scFvであり;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VLドメインをさらに含み;VHドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3のセットを含み;VHドメインは、表2に記載される抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;VHドメインは、表2に記載される抗体のVH配列を含み;CCR4結合ドメインは、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含み;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、この場合においてVHドメインの配列およびVLドメインの配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一であり;CCR4結合ドメインは、表2に記載される抗体のVH配列とVL配列のセットを含み;CCR4結合ドメインは、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含み;CCR4結合ドメインは、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合して、Fabを形成することができる。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30(配列番号:77)、4〜20(配列番号:80)、8〜30(配列番号:78)、8〜20(配列番号:81)、12〜20(配列番号:82)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択され、2つまたは4つの逆電荷変異は、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択されるアミノ酸配列から選択される。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは独立して、4〜30(配列番号:77)、4〜20(配列番号:80)、8〜30(配列番号:78)、8〜20(配列番号:81)、12〜20(配列番号:82)、または12〜30個(配列番号:79)のグリシン残基からなり、第2のリンカーおよび任意選択の第3のリンカーは、20個のグリシン残基(配列番号:23)からなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含み、EUのI253位の各アミノ酸変異は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、I253位の各アミノ酸変異は、I253Aであり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つは、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含み、EUのR292位の各アミノ酸変異は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、R292位の各アミノ酸変異は、R292Pであり、各Fcドメイン単量体は独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第1のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、第2のFcドメイン単量体および第3のFcドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列
を有し、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸欠の失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH2ドメインは同一であり、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、各Fcドメイン単量体のCH3ドメインは独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含み、単一アミノ酸置換は、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択され、Fcドメイン単量体は各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にあり、VHドメインまたはscFvは、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含み、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VHドメインは、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、VH配列は、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一であり、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列を含み、VHドメインまたはscFvは、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列のセットを含み、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセット由来のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列を含み、VHドメインまたはscFvメインは、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインとを含み、VHドメイン配列およびVLドメイン配列は、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列と少なくとも95%または98%同一であり、VHドメインまたはscFvは、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第4のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第5のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体、
iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第2のFcドメイン単量体と第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第4のFcドメイン単量体、
ii)第5のFcドメイン単量体、
iii)第6のFcドメイン単量体、
iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
v)第4のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
vi)第5のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第5のFcドメイン単量体と第8のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、第6のFcドメイン単量体と第10のFcドメイン単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第3のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
a)第1のポリペプチドであって、
i)第1のFcドメイン単量体、
ii)第2のFcドメイン単量体、
iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)第1のFcドメイン単量体と第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
b)第2のポリペプチドであって、
i)第3のFcドメイン単量体、
ii)第4のFcドメイン単量体、
iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
iv)第3のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
c)第5のFcドメイン単量体と第3のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
d)第6のFcドメイン単量体と第4のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、
g)第3のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
h)第4のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと、を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、第2のFcドメイン単量体と第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、第1のCCR4軽鎖結合ドメインと第3のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、第2のCCR4軽鎖結合ドメインと第4のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成し、第3のCCR4軽鎖結合ドメインと第1のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第3のFabを形成し、第4のCCR4軽鎖結合ドメインと第2のCCR4重鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、Fc抗原結合ドメイン構築体も記載される。
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか3、またはそれからなり、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に置換を含み、EUのI253位の各アミノ酸置換は独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択され、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に置換を含み、EUのR292位の各アミノ酸置換は独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択され、Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される置換を含み、各Fcドメイン単量体のヒンジは独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
本明細書に記載される場合、「Fcドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第2および第3の抗体定常ドメイン(CH2およびCH3)、またはそれらの機能性断片(例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、CH2ドメインまたはその機能性断片、およびCH3ドメインまたはその機能性断片)(例えば、(i)別のFcドメイン単量体と二量体形成してFcドメインを形成し、そして(ii)Fc受容体に結合することができる断片)を含むポリペプチド鎖を指す。好ましいFcドメイン単量体は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、IgG1ヒンジ、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインの少なくとも一部分を含む。したがって、Fcドメイン単量体、例えば、ヒトIgG1 Fcドメイン単量体は、E316〜G446もしくはK447、P317〜G446もしくはK447、K318〜G446もしくはK447、K318〜G446もしくはK447、S319〜G446もしくはK447、C320〜G446もしくはK447、D321〜G446もしくはK447、K322〜G446もしくはK447、T323〜G446もしくはK447、K323〜G446もしくはK447、H324〜G446もしくはK447、T325〜G446もしくはK447、またはC326〜G446もしくはK447にわたることができる。Fcドメイン単量体は、IgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である(例えば、IgG)。さらに、Fcドメイン単量体は、IgGサブタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4)であり得る(例えば、ヒトIgG1)。ヒトIgG1 Fcドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトIgG1の完全ヒンジドメインは、EUナンバリングE316〜P230またはL235にわたり、CH2ドメインは、A231またはG236〜K340にわたり、CH3ドメインは、G341〜K447にわたる。ヒンジドメインの最後のアミノ酸の位置については異なる見解がある。それは、P230またはL235のいずれかである。本明細書の多くの実施例において、CH3ドメインはK347を含まない。ゆえにCH3ドメインは、G341〜G446であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、E216〜L235を含み得る。これは、例えば、ヒンジがCH1ドメインまたはCCR4結合ドメインに対してカルボキシ末端である場合に当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどのいくつかの例では、EUナンバリング221のAspは、Glnに変異される。Fcドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域(CDR)として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Fcドメイン単量体は、野生型(例えば、ヒト)Fcドメイン単量体配列からの変更を10程度(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4のアミノ酸置換、付加、または欠失)含有することが可能であり、該変更は、FcドメインとFc受容体との間の相互作用を変える。Fcドメイン単量体は、野生型Fcドメイン単量体配列(例えば、1〜10、1〜8、1〜6、1〜4のアミノ酸置換、付加または欠失)からの変更(例えば、単一アミノ酸置換)を10程度含有することが可能であり、当該変更は、Fcドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態では、以下のヒトIgG1 CH3ドメイン配列と比較して、CH3ドメイン上に、最大10、8、6または5つの単一アミノ酸置換が存在する:
。好適な変更の例は、この技術分野で既知である。
の配列を有する。
100×(分数であるA/B)
式中、Aは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは参照配列内のアミノ酸(または核酸)残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合のいくつかの実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸(または核酸)配列同一性と等しくないはずである。
[本発明1001]
CCR4結合ドメインと、リンカーによって第2のFcドメインに結合された第1のFcドメインと、を含む、Fc抗原結合ドメイン構築体であって、
前記第1および第2のFcドメインの各々が、ヘテロ二量体形成選択性モジュールまたはホモ二量体形成選択性モジュールのいずれかを含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1002]
CCR4結合ドメインと、リンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも2つのFcドメイン単量体が、ヘテロ二量体形成選択性モジュールまたはホモ二量体形成選択性モジュールのいずれかを含む、
ポリペプチド。
[本発明1003]
前記CCR4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1004]
前記CCR4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1005]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1006]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1007]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1008]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1009]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1010]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1011]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1012]
改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、本発明1002〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、CH3ドメイン内にある、本発明1002〜1012のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1002〜1013のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1017]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1018]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1019]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1020]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1020のポリペプチド。
[本発明1022]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1023]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1022のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1025]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1026]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1002〜1025のいずれかのポリペプチド。
[本発明1027]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1028]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1029]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、
本発明1026のポリペプチド。
[本発明1030]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、
2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、
本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、
2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、
本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、
アミノ酸配列
を含む、
本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、本発明1030〜1037のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1041]
前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1042]
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1043]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、本発明1005、1006、および1009〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
前記CCR4結合ドメインが、scFvである、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
前記CCR4結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
前記VHドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
本発明1045のポリペプチド。
[本発明1050]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1051]
前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1052]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1053]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメインの配列および前記VLドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記VH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一である、
本発明1045のポリペプチド。
[本発明1054]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1055]
前記CCR4結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、本発明1002〜1043のポリペプチド。
[本発明1056]
前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつ
VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、
本発明1002〜1043のポリペプチド。
[本発明1057]
前記第1または第2のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドの2つのコピー
を含む、ポリペプチド複合体。
[本発明1058]
ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合されている、
ポリペプチド複合体。
[本発明1059]
前記第2のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、本発明1058のポリペプチド複合体。
[本発明1060]
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405Aからなる群から選択される、本発明1059のポリペプチド複合体。
[本発明1061]
前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1058〜1060のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1062]
CCR4結合ドメインと、リンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1063]
前記CCR4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1064]
前記CCR4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1065]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1066]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4BAおよび表4B中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1067]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1068]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1069]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1070]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1071]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1072]
表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、本発明1062〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメイン内にある、本発明1062〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1075]
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、本発明1062〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1076]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1072のポリペプチド。
[本発明1077]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1078]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1079]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1080]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1079のポリペプチド。
[本発明1081]
EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1080のポリペプチド。
[本発明1082]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1081のポリペプチド。
[本発明1083]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1084のポリペプチド。
[本発明1086]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1062〜1085のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1088]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1089]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有し、前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1090]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1091]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1092]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1093]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1094]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1095]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1096]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1097]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1098]
前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、本発明1090〜1097のいずれかのポリペプチド。
[本発明1099]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1100]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1101]
前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1102]
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1103]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、本発明1065、1066、および1069〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1104]
前記CCR4結合ドメインが、scFvである、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1105]
前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1106]
前記CCR4結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1107]
前記VHドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1108]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1109]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1110]
前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1111]
前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1112]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1113]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメインの配列および前記VLドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記VH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1114]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1115]
前記CCR4結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、本発明1062〜1103のポリペプチド。
[本発明1116]
前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつ
VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、
本発明1062〜1103のポリペプチド。
[本発明1117]
前記第1または第2のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドの2つのコピー
を含む、ポリペプチド複合体。
[本発明1118]
ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合されている、本発明1062〜1116のいずれかのポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合されている、
ポリペプチド複合体。
[本発明1119]
前記第2のポリペプチド単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異を含む、本発明1118のポリペプチド複合体。
[本発明1120]
前記第2のポリペプチド単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷変異を含み、かつ前記ポリペプチド内の表4Aおよび表4Bから選択される前記1、2、または3つの逆電荷変異に対して相補的である、本発明1119のポリペプチド複合体。
[本発明1121]
前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1118〜1120のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1122]
ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1123]
前記第1のIgG1単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1124]
前記第1のIgG1単量体のアミノ末端にscFvをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1125]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1126]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1127]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1128]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1129]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1130]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1131]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1132]
改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1133]
改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、前記CH3ドメイン内にある、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1134]
ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチド。
[本発明1135]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1136]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端にscFvをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1137]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表6中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1138]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1139]
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1140]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1141]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1142]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1143]
第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1144]
表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1145]
表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、前記CH3ドメイン内にある、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1146]
前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1147]
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1148]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1149]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1150]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1151]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1152]
EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1151のポリペプチド。
[本発明1153]
I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、本発明1152のポリペプチド。
[本発明1154]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1155]
EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1154のいずれかのポリペプチド。
[本発明1156]
R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、本発明1155のポリペプチド。
[本発明1157]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1158]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1159]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1160]
前記第1のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有し、前記第2のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1161]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1162]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1165]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1166]
各Fcドメイン単量体の前記CH2ドメインが同一であり、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1167]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1168]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1169]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1170]
各Fcドメイン単量体の前記CH3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1171]
前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1172]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1173]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1174]
前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、本発明1173のポリペプチド。
[本発明1175]
改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1176]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1178]
前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1179]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1180]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1181]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1182]
前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1183]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセット由来のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1184]
前記VHドメインまたはscFvメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメイン配列および前記VLドメイン配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列と少なくとも95%または98%同一である、
本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1185]
前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1186]
IgG CL抗体定常ドメインと、IgG CH1抗体定常ドメインと、をさらに含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1187]
本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1188]
本発明1187の核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1189]
本発明1187の核酸分子を含む、宿主細胞。
[本発明1190]
本発明1188の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1191]
本発明1189または本発明1190の宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む、本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドを産生する方法。
[本発明1192]
抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1193]
抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1194]
抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1195]
抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1196]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1197]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1199]
前記IgG1 Fcドメイン単量体が、CH3ドメイン中に10、8、6、または4つ以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号42、43、45、および47のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1196または1197の宿主細胞。
[本発明1200]
本発明1002〜1186のいずれかのポリペプチドを含む、薬学的組成物。
[本発明1201]
前記ポリペプチドの40%、30%、20%、10%、5%、2%未満が、Fcドメイン単量体上に少なくとも1つのフコース修飾を有する、本発明1200の薬学的組成物。
[本発明1202]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
本発明1001のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1203]
前記単一Fcドメイン構築体が抗体である、本発明1001または1202のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1204]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1205]
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されているか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1206]
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1207]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1208]
前記生物活性が、Fc受容体媒介性エフェクター機能である、本発明1207のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1209]
前記Fc受容体媒介性エフェクター機能が、ADCCおよびADCPおよび/またはCDC活性である、本発明1208のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1210]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1211]
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されているか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1212]
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1213]
前記CCR4結合ドメインが、Fabである、本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1214]
前記CCR4結合ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、本発明1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1215]
前記CCR4結合ドメインが、scFvである、本発明1214のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1216]
前記CCR4結合ドメインが、V H ドメインおよびC H 1ドメインを含み、
前記V H ドメインおよびC H 1ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
本発明1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1217]
前記CCR4結合ドメインが、V L ドメインをさらに含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1218]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、前記V L ドメインを含む第4のポリペプチドを含む、本発明1217のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1219]
前記V H ドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1220]
前記V H ドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1221]
前記V H ドメインが、表2に記載の抗体のV H 配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記V H 配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のV H 配列と少なくとも95%同一である、
本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1222]
前記V H ドメインが、表2に記載の抗体のV H 配列を含む、本発明1216のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1223]
前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1224]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列およびV L 配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1225]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むV H ドメインと、表2に記載される抗体のV L 配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むV L ドメインと、を含み、
前記V H ドメインの配列および前記V L ドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記V H 配列およびV L 配列に対して少なくとも95%同一である、
本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1226]
前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のV H 配列およびV L 配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1227]
IgG C L 抗体定常ドメインおよびIgG C H 1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記IgG C H 1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドのN末端に結合している、
本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1228]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1202〜1227のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1229]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1202〜1228のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1230]
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、本発明1202〜1228のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1231]
前記二量体形成選択性モジュールが、前記Fcドメイン単量体の一方の前記C H 3ドメイン内に改変された空洞と、前記Fcドメイン単量体の他方の前記C H 3ドメイン内に改変された突起と、を含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Fcドメイン単量体の、空洞に突起が挿入された対(protuberance−into−cavity pair)を形成するように配置されている、
本発明1228または1229のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1232]
前記改変された突起が、S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F、およびF405Wからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含み、
前記改変された空洞が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A、およびT394Sからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含む、
本発明1231のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1233]
前記Fcドメイン単量体の一方がY407VおよびY349Cを含み、
前記Fcドメイン単量体の他方がT366WおよびS354Cを含む、
本発明1228または1229のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1234]
前記二量体形成選択性モジュールが、前記ドメイン単量体の一方の前記C H 3ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、前記Fcドメイン単量体の他方の前記C H 3ドメイン内に正に荷電したアミノ酸と、を含み、
前記負に荷電したアミノ酸および前記正に荷電したアミノ酸が、Fcドメインの形成を促進するように配置されている、
本発明1228または1229のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1235]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D399Kと、K409DまたはK409Eのいずれかと、を含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1236]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K392DおよびD399Kを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1237]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1238]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D356KおよびK439Dを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1239]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K392EおよびD399Kを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1240]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1241]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D356KおよびK439Eを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1242]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、S354CおよびT366Wを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、
本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1243]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、S354CおよびT366Wを含み、前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1244]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KまたはE357Rを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、K370DまたはK370Eを含む、
本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1245]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、K370DまたはK370Eを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、E357Kまたは357Rを含む、
本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1246]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、K409DまたはK409Eを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、D399KまたはD399Rを含む、
本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1247]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、D399KまたはD399Rを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、K409DまたはK409Eを含む、
本発明1234のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1248]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、結合である、本発明1001および1202〜1247のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1249]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、スペーサーである、本発明1001および1202〜1247のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1250]
前記スペーサーが、配列
を有するポリペプチドを含む、本発明1249のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1251]
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、本発明1249のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1252]
前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1251のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1253]
前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1252のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1254]
前記CCR4結合ドメインが、リンカーにより前記Fcドメイン単量体に結合されている、本発明1001および1202〜1212のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1255]
前記リンカーが、スペーサーである、本発明1254のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1256]
前記Fcドメインのうちの少なくとも1つが、I253位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001および1202〜1255のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1257]
I253位の前記アミノ酸修飾が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1256のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1258]
I253位の各アミノ酸修飾が、I253Aである、本発明1257のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1259]
前記Fcドメインのうちの少なくとも1つが、R292位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001および1202〜1258のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1260]
R292位の各アミノ酸修飾が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1259のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1261]
R292位の各アミノ酸修飾が、R292Pである、本発明1260のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1262]
前記Fcドメイン単量体のうちの1つ以上が、IgGヒンジドメイン、IgG C H 2抗体定常ドメイン、およびIgG C H 3抗体定常ドメインを含む、本発明1001および1202〜1261のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1263]
前記Fcドメイン単量体が各々、IgGヒンジドメイン、IgG C H 2抗体定常ドメイン、およびIgG C H 3抗体定常ドメインを含む、本発明1262のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1264]
前記IgGが、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4からなる群から選択されるサブタイプのものである、本発明1262または1263のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1265]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドの各々内のN末端Aspが、Glnに変異している、本発明1001および1202〜1264のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1266]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドのうちの1つ以上が、C末端リシンを欠いている、本発明1001および1202〜1265のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1267]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドが各々、C末端リシンを欠いている、本発明1266のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1268]
リンカーによって前記ポリペプチドのうちの1つ以上のN末端またはC末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、本発明1001および1202〜1267のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1269]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1270]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも75%が、前記第1のFcドメイン、前記第2のFcドメイン、および前記CCR4結合ドメインを含む、本発明1269の細胞培養培地。
[本発明1271]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一であり、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0.1mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。
[本発明1272]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも75%が、構造的に同一である、本発明1271の細胞培養培地。
[本発明1273]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1272のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1274]
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1273のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1275]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチド、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチド、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチド、および
(4)抗原結合ドメイン
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1276]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1277]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1276の組成物。
[本発明1278]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K370DおよびE357Kを含む、
本発明1277の組成物。
[本発明1279]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1280]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1279の組成物。
[本発明1281]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K370DおよびE357Kを含む、
本発明1280の組成物。
[本発明1282]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1283]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
本発明1282のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1284]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1285]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
本発明1284のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1286]
Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
組成物。
[本発明1287]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が各々、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1286のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1288]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1289]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1290]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1291]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1292]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(5)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1293]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1288、1289、1290、1291、または1292のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1294]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1295]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1296]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1297]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1298]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(5)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(6)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1299]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1294、1295、1296、1297、または1298の組成物。
[本発明1300]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1301]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1302]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1303]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1304]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1305]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
本発明1300、1301、1302、1303、または1304のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1306]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1307]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1308]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1309]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1310]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1311]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
本発明1306、1307、1308、1309、または1310のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1312]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vii)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1313]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1314]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1315]
Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1316]
Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(6)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(7)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1317]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が各々、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
本発明1312、1313、1314、1315、または1316のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1318]
先行する本発明のいずれかの構築体を含む組成物を投与することを含む、癌を治療する方法であって、前記癌が、CCR4を発現している、方法。
[本発明1319]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFc単量体と前記第6のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1320]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1319のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1321]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1319のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1322]
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、本発明1319のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1323]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1319のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1324]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1319〜1323のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1325]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1319〜1323のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1326]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1319〜1323のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1327]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1324〜1326のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1328]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1319〜1323のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1329]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1319〜1323のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1330]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1328のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1331]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1329のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1332]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFc単量体と前記第6のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1333]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
第2のFc単量体と第4のFc単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、
第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1334]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1333のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1335]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1333のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1336]
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、本発明1333のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1337]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1333のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1338]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1339]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1340]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1341]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1342]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1343]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1333〜1337のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1344]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1342のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1345]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1343のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1346]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第5のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1347]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1346のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1348]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1346のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1349]
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、本発明1346のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1350]
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、本発明1346のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1351]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1346のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1352]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1353]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1354]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1355]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1356]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1357]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1346〜1351のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1358]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1357のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1359]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1358のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1360]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第5のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1361]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第5のFc単量体と前記第8のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1362]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1361のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1363]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1361のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1364]
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、本発明1361のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1365]
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、本発明1361のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1366]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1361のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1367]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1368]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1369]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1370]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1371]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1372]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第5のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が、前記第5のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1361〜1366のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1373]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1371のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1374]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1372のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1375]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第5のFc単量体と前記第8のFc単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1376]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1377]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1202のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1378]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1202のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1379]
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、本発明1202のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1380]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1202のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1381]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1382]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1383]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1384]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1385]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1386]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1376〜1380のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1387]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1385のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1388]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1386のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1389]
Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第3のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第4のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、
(g)第3のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第4のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第4のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第3のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第4のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成し、
前記第3のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第1のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第3のFabを形成し、
前記第4のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第2のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1390]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、本発明1389のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1391]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、本発明1389のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1392]
前記第5のポリペプチド、前記第6のポリペプチド、前記第7のポリペプチド、および前記第8のポリペプチドの配列が同一である、本発明1389のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1393]
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチド、前記第6のポリペプチド、前記第7のポリペプチド、および前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
本発明1389のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1394]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1395]
前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1396]
前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1397]
前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン単量体。
[本発明1398]
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1399]
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
本発明1389〜1393のいずれかのFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1400]
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、本発明1398のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1401]
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、本発明1399のFc抗原ドメイン構築体。
[本発明1402]
各リンカーが、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか3、またはそれからなる、
本発明1319〜1401のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1403]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に置換を含む、本発明1319〜1401のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1404]
EUのI253位の各アミノ酸置換が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、本発明1403のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1405]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に置換を含む、本発明1319〜1401のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1406]
EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、本発明1045のFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1405]
前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される置換を含む、本発明1319〜1401のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1407]
各Fcドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
および
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、
本発明1319〜1401のいずれかのFc抗原結合ドメイン構築体。
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC:antibody−dependent cytotoxicity)、抗体依存性細胞貪食(ADCP:antibody−dependent cellular phagocytosis)、および補体依存性細胞傷害(CDC:complement−dependent cytotoxicity)など、Fcドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。いくつかの事例では、本開示は、既知の単一Fcドメインを含有する治療剤、例えば、既知の治療用抗体などのCCR4結合ドメインを、少なくとも2つのFcドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療剤を生み出すことを企図する。いくつかの事例では、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば既知の治療用抗体などの既知のFcドメイン含有治療剤を超える生物活性を有する。少なくとも2つのFcドメインの存在により、エフェクター機能が増強され、ADCPおよび/またはCDCと組み合わせたADCCなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより、治療用分子の有効性が増加し得る。開示 一貫した生物学的機能を有する製品を生み出すために、Fcドメインの数を制御することが必須である。本開示は、Fcドメインをコードするペプチドのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド鎖から別個のサイズの分子を組み立てるFc改変ツールのセットを特徴とする。国際公開第WO/2015/168643号、同第WO2017/151971号、同第WO2017/205436号、および同第WO2017/205434号は、2つ以上のFcドメインを有する分子を組み立てるためのFc改変ツールおよび方法を開示しており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。改変ツールは、製造結果を著しく改善する構造特徴(例えば、グリシンリンカー)を含む。これらの構築体の特性により、実質的に均質な薬学的組成物の効率的な生成が可能となる。薬学的組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、薬学的組成物においてそのような均質性があることが望ましい。薬学的組成物に高度の均質性を持たせることにより、望ましくない物質(例えば、分解産物、および/または凝集産物または多量体)によって引き起こされる薬学的製品の凝集または分解の可能性も最小限に抑えられ、望ましくない物質によって引き起こされるオフターゲットおよび有害な副作用も制限される。
Fcドメイン単量体は、ヒンジドメイン、CH2抗体定常ドメイン、およびCH3抗体定常ドメインの少なくとも一部分(例えば、任意のアミノ酸置換を有するヒトIgG1ヒンジ、CH2抗体定常ドメイン、およびCH3抗体定常ドメイン)を含む。Fcドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプIgG、IgE、IgM、IgAまたはIgDのものとすることが可能である。Fcドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)のものとしてもよい。Fcドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびIgG1からのCH2およびIgAからのCH3による複合型、または、ヒンジおよびIgG1からのCH2であるがIgG3からのCH3による複合型であってもよい。Fcドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばFcγRIIIaであるFc受容体と結合することが可能なFcドメイン(本明細書でさらに規定される)である。本開示では、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインが、CH3−CH3抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Fcドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、N末端またはC末端に付加するさらなる部分を含む。本開示では、Fcドメイン単量体は、例えばVH、VL、相補性決定領域(CDR)または超可変領域(HVR)である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。
本明細書で規定するように、Fcドメインは、CH3抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する2つのFcドメイン単量体を含む。Fcドメインは、Fc受容体、例えばFc−ガンマ受容体(すなわち、Fcγ受容体(FcγR))、Fc−アルファ受容体(すなわち、Fcα受容体(FcαR))、Fc−イプシロン受容体(すなわち、Fcε受容体(FcεR))および/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する最小限の構造を形成する。いくつかの実施形態では、本開示のFcドメインは、Fcγ受容体(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRIIIb(CD16b))および/またはFcγRIVおよび/または胎児性Fc受容体(FcRn)に結合する。
抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合する1つ以上のペプチドまたはポリペプチドを含む。CCR4結合ドメインは、抗体のCCR4結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、CCR4結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であり得る。CCR4結合ドメインは、フィブロネクチン系の結合タンパク質(例えば、FN3モノボディ)などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。
本開示において、二量体形成選択モジュールは、2つのFcドメイン単量体の好ましい対形成を促進してFcドメインを形成する、Fcドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択モジュールは、2つのFcドメイン単量体の相互作用するCH3抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、2つのCH3抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいFcドメインの最終形態は、二量体形成選択モジュールをもたないFcドメイン単量体で、または二量体形成選択モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつFcドメイン単量体で形成される他のFcドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、QuikChange(登録商標)mutagenesisなどのこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
改変された空洞および改変された突起の使用(すなわち、「ノブイントゥホール(knob−into−hole)」ストラテジー)は、Carterおよびその協同研究者(Ridgway et al.,Protein Eng.9:617−612,1996、Atwell et al.,J Mol Biol.270:26−35,1997、Merchant et al.,Nat Biotechnol.16:677−681,1998)によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第5,731,168号にも開示されている。
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール(knob−in−hole)技術と組み合わせて、例えば2つの異なるポリペプチド中のFcドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体形成されるFcドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Fcドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの1つを含ませることができる:D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。例えば1つのFcドメイン単量体、例えば空洞(Y349C、T366S、L368AおよびY407V)を有するFcドメイン単量体も、K370D変異を含むことができ、そして他のFcドメイン単量体、例えば突起(S354CおよびT366W)を有するFcドメイン単量体もE357Kを含むことができる。
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第2014−0024111号に開示されている。
Fcドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、表3に含まれるが、それらに限定されない電荷残基対などの2つのFcドメイン単量体に異なるが適合性の変異を導入することによって促進され得る。いくつかの実施形態では、Fcドメイン単量体は、以下の正に荷電したアミノ酸置換および負に荷電したアミノ酸置換のうちの1つを含み得る。D356K、D356R、E357K、E357R、K370D、K370E、K392D、K392E、D399K、K409D、K409E、K439DおよびK439E。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばD356KまたはE357Kを含有するFcドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばK370DまたはK370Eを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。別の実施例では、E357Kを含有するFcドメイン単量体と、K370Dを含有するFcドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てFcドメインを形成する。
注記:すべての残基はEUナンバリングスキームに従って番号付けされている(Edelman et al,Proc Natl Acad Sci USA,63:78−85,1969)
Fcドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Fcドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異(ホモ二量体形成選択モジュール)を導入することによって、促進することが可能である。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体が、CH3ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも2つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。2つのFcドメイン単量体内の残基の2以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したFcドメイン単量体は同じ変異の配列のFcドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではFcドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Fcドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表4Aおよび4Bに示すが、これらに限定されない。一実施形態では、Fcドメインは、二重逆電荷変異体(表4Aおよび表4B)、例えば、K409D/D399Kを各々含む、2つのFcドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Fcドメインは、四重逆電荷変異体(表4Aおよび表4B)、例えば、K409D/D399K/K370D/E357Kを各々含む、2つのFcドメイン単量体を含む。
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび/または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも2つのFcドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第1のFcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、第2のFcドメイン単量体のヒンジドメインのN末端に対して、2つのFcドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Fcドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Fcドメイン単量体のCH3抗体定常ドメインのC末端を、アルブミン結合ペプチドのN末端に付加させることが可能である。
本開示では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、3〜200のアミノ酸(例えば、3〜200、3〜180、3〜160、3〜140、3〜120、3〜100、3〜90、3〜80、3〜70、3〜60、3〜50、3〜45、3〜40、3〜35、3〜30、3〜25、3〜20、3〜15、3〜10、3〜9、3〜8、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4、4〜200、5〜200、6〜200、7〜200、8〜200、9〜200、10〜200、15〜200、20〜200、25〜200、30〜200、35〜200、40〜200、45〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200または180〜200のアミノ酸)を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも12のアミノ酸、例えば、12〜200のアミノ酸(例えば、12〜200、12〜180、12〜160、12〜140、12〜120、12〜100、12〜90、12〜80、12〜70、12〜60、12〜50、12〜40、12〜30、12〜20、12〜19、12〜18、12〜17、12〜16、12〜15、12〜14または12〜13のアミノ酸)(例えば、14〜200、16〜200、18〜200、20〜200、30〜200、40〜200、50〜200、60〜200、70〜200、80〜200、90〜200、100〜200、120〜200、140〜200、160〜200、180〜200または190〜200のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、2つのFcドメイン単量体間のリンカーは、12〜30のアミノ酸(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30のアミノ酸)を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において既知であり、例えば、グリシンおよびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。ある実施形態では、スペーサーは、例えば
の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である、GSのモチーフを含む2〜12のアミノ酸を含有することが可能である。他のある実施形態では、スペーサーは、
である、GGSのモチーフを含む3〜12のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、
である、GGSG(配列番号2)のモチーフを含む4〜20のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、
である、GGGGS(配列番号1)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である。
と比較して、低減されたレベルのグリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−グリコシル化)(例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース(Fuc)および/またはガラクトース(Gal)などのグリカン(例えば、キシロース)による低減したレベルのO−グリコシル化)を有し得る。
と比較して、低減されたレベルのO−グリコシル化(例えば、低減されたレベルのO−キシロシル化)を有し得る。
と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。
である、GGGG(配列番号19)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である、GGGGG(配列番号24)のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、
である。
および
からなる12アミノ酸ペプチドスペーサーおよび20アミノ酸ペプチドスペーサーが直列に接続される。他の実施形態では、配列
からなる18アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するFc抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号37の配列と、少なくとも80%同一(例えば、80%、90%または100%同一)である配列を有する。
概して、本開示は、2〜10個のFcドメインと、1つ以上のCCR4結合ドメインとを付加されたFc抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Fc受容体の1つの野生型Fcドメイン(例えばFcγRIIIa)よりも高い結合アフィニティおよび/またはアビディティを有し得る。この開示は、Fcドメインの2つのFcドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する2つのCH3抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Fc抗原結合ドメイン構築体は、偶数のFcドメイン単量体を含み、Fcドメイン単量体の各対がFcドメインを形成する。Fc抗原結合ドメイン構築体は、最小で、4つのFcドメイン単量体の二量体から形成される2つの機能性Fcドメインと、1つのCCR4結合ドメインとを含む。CCR4結合ドメインは、例えばリンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合または化学的部分によって、Fcドメインに結合され得る。
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で既知の従来の技術(形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入など)によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、CHO(またはCHO誘導細胞株、例えばCHO−K1、CHO−DXB11 CHO−DG44)、マウス宿主細胞(例えば、NS0、Sp2/0)、VERY、HEK(例えば、HEK293)、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7O3OならびにHsS78Bstの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。
各は、Asn 297においてNグリコシル化部位を含む。グリカンは、所与の上で多数の異なる形態では存在し得る。本明細書に記載される抗体または抗原結合Fc構築体を含有する組成物において、グリカンは、非常に異種であり得、存在するグリカンの性質は、数ある中でも、抗体または抗原結合Fc構築体を産生するために使用される細胞の種類、細胞の増殖条件(増殖培地を含む)、および産生後の精製によって決まり得る。様々な例では、本明細書に記載の構築体またはポリペプチド複合体またはポリペプチドを含む組成物は、少なくともある程度脱フコシル化される。例えば、組成物中に存在するグリカン(例えば、Fcグリカン)の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%が、フコース残基を欠いている。したがって、グリカンの5%〜60%、5%〜50%、5%〜40%、10%〜50%、10%〜50%、10%〜40%、20%〜50%、または20%〜40%が、フコース残基を欠いている。少なくともある程度まで脱フコシル化される組成物は、1,3,4−トリ−O−アセチル−2−デオキシ−2−フルオロ−L−フコース阻害剤の存在下で抗体を産生する細胞を培養することによって産生され得る。本明細書に記載の構築体およびポリペプチドの比較的脱フコシル化された形態は、FUT8の発現が低減されたか、またはFUT8を発現しない細胞で発現させること(例えば、FUT8をノックアウトすることによって、またはRNAi(siRNA、miRNA、もしくはshRNAを用いて発現を低減することによって)、およびベータ−1,4−マンノシル−糖タンパク質4−ベータ−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(GnT−III)を過剰発現する細胞で発現させることを含む様々な他の方法を使用して産生され得る。
本開示は、本明細書に記載の1つ以上のFc抗原結合ドメイン構築体を含む薬学的組成物を特徴とする。一実施形態では、薬学的組成物は、構造が同一または実質的に同一であるFc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、薬学的組成物は、Fc抗原結合ドメイン構築体1〜42のいずれか1つの実質的に均質な群を含む。
構築体を使用して、癌、例えば、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を治療することができる。治療することができる癌は、とりわけ、再発または難治性の成人T細胞白血病/リンパ腫、成人T細胞白血病−リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、卵巣癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、乳癌、胃腺癌である。
本開示に記載されるFc抗原結合ドメイン構築体は、様々なFc受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の1つは、補体依存性細胞傷害(CDC)システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、そしてレクチン経路の3つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性を強化することもできる。ADCCは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ADCCには、抗体によるナチュラルキラー(NK)細胞の活性化が含まれる。NK細胞はFc受容体を発現し、これが例えばIgGおよびIgMなどの抗体のFc部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてNK細胞に結合し、活性化させる。NK細胞は、例えばIFN−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体形成する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。NK細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もADCCを介在することができる。
本開示のFc抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食(ADCP)活性を強化することもできる。ADCPは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン(PAMPS)によって活性化され、NF−κBの活性化へと繋がっていく。次いで例えばC3bと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Fcドメインは、そのFc受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果としてできたファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。
タンパク質発現
Fc抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を増加させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御会合を最小限に抑え、実質的に均質な(例えば、少なくとも85%、90%、95%、98%、または99%均質な)薬学的使用のための組成物を生成するように設計される。これらの目標を念頭に、分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体7(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号ZZ1)および2コピーの短鎖Fc(配列番号ZZ2))と、2コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とを含む。長鎖Fcは、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列で連続してN末端で含有する(構築体7(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。表4Aおよび4BAおよび4Bのアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされた。
試料を、Laemmli試料緩衝液(4%SDS、Bio−Rad)中で、95℃で10分間変性させた。試料を、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad)上で泳動させた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行う。
タンパク質発現
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体13(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号ZZのうちのいずれか1つ)および2コピーの短鎖Fc(配列番号ZZ))と、2コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号ZZ)とを含む。長鎖Fcは、電荷変異(K409D/D399K変異)Fcドメイン単量体(ホモ二量体形成を促進する)を、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体、ならびに抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)と直列に連続して、N末端で含有する(構築体13(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖および抗CCR4 VHおよびCH1は、モガムリズマブから取られる。CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。構築体13の他の型が抗CCR4重鎖とともに作製され得、各型は、長鎖Fcポリペプチド中のFcドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー(G4(配列番号:19)、G10(配列番号:25)、G15(配列番号:26)、またはG20(配列番号:23)リンカー)を保有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。以下の構築体の各々に対するアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体1(図1)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインと直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)(ヘテロ二量体形成を促進する)を導入することにより作製される、改変突起を有する。CCR4結合ドメインは、長鎖Fcと同じアミノ酸配列の一部として発現され得る(例えば、scFvを形成するため)。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)(ヘテロ二量体形成を促進する)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。本実施例では、かつFc抗原結合ドメイン構築体2〜42についての以下の実施例の各々では、細胞は、抗体可変軽鎖を発現する第3のプラスミドを含有し得る。
非対称直列Fcドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Fc抗原結合ドメイン構築体2(図2)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体3(図3)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体4(図4)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体5(図5)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体6(図6)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcおよび短鎖Fcの3つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、3つのFcドメイン単量体を、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体7(図7)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体8(図8)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体9(図9)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体10(図10)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体11(図11)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体12(図12)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有し、この場合において各Fcドメイン単量体は、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される、改変突起を有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体13(図13)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体14(図14)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体ともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体15(図15)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの2つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体16(図16)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体17(図17)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体18(図18)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体を、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を各々有する2つのFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がN末端またはC末端Fcドメインのいずれにもない、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体19(図19)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体を含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体20(図20)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体とともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体21(図21)は、2つの別個の含有ポリペプチド(長鎖Fcの2つのコピーおよび短鎖Fcの4つのコピー)および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有するFcドメイン単量体を、表4Aおよび4Bまたは表4Aおよび4BAおよび4Bから選択される逆電荷変異(例えば、K409D/D399K変異)を有するFcドメイン単量体と、表3から選択される少なくとも1つの突起形成変異(例えば、S354CおよびT366W変異)ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、E357K)を導入することにより作製される改変突起を有する別のFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとともに直列に連続してN末端で含有する。短鎖Fcは、表3から選択される少なくとも1つの空洞形成変異(例えば、Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異)、ならびに任意選択的に表4Aおよび4Bから選択される1つ以上の逆電荷変異(例えば、K370D)を導入することにより作製される改変空洞を有するFcドメイン単量体と、CCR4結合ドメインとをN末端で含有する。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。短鎖Fcおよび長鎖Fcのアミノ酸配列は、2つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例3にあるように精製される。
3つのアッセイを使用して、親mAbおよび様々なFc抗原結合ドメイン構築体による、CDC、ADCP、およびADCC経路の活性化を試験する。抗CD20モノクローナル抗体であるGazyva(オビヌツズマブ)由来のCDRを含有する4つの構築体を作製した。フコシル化mAbおよび脱フコシル化mAbの両方を作製し、S3Y(実施例2に記載の構築体13の構造、図13)およびSAI(実施例1に記載の構築体7の構造、図7)Fc抗原結合ドメイン構築体も作製した。CDCアッセイを以下のとおり行った。
1.抗CD20 CDCアッセイで使用される標的細胞は、Rajiリンパ芽球様ヒトB細胞株(ATCC CCL−86)である。Raji細胞を遠心分離により懸濁培養液から除去し、6×105細胞/mLでX−VIVO 15培地中に再懸濁した。
2.Raji細胞を、1ウェル当たり100μL(6×104細胞/ウェル)の体積で96ウェル平底アッセイプレートに移した。
3.抗CD20モノクローナル抗体(mAb)およびSIFボディを各々、X−VIVO 15培地中で3.33μMに希釈した。その後、連続1:3希釈を1.5mLのポリプロピレンチューブ内で抗CD20 mAbおよびSIFボディの各々を用いて行い、11点希釈系列を得た。
4.抗CD20 mAbおよびSIFボディの各希釈物を、50μL/ウェルでアッセイプレート中の適切なウェルに移した。
5.抗CD20 mAbおよびSIFボディを移した直後に、50μLの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。
6.アッセイプレートを37℃および5%CO2で2時間インキュベートした。
7.2時間インキュベーションした後、20μLのWST−1増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
8.プレートを37℃および5%CO2のインキュベーターに14時間戻した。
9.14時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で1分間振盪し、分光光度計を使用して、600nmの補正を用いて、450nmで直ちにウェルの吸光度を決定した。
標的細胞がRajiであるCDCアッセイ(図47、左のパネル)では、S3Y(構築体13(CD20))構築体は細胞傷害性を媒介することができたが、他の構築体は媒介することができなかった。
FcγRIIa−H ADCPレポーターバイオアッセイコンプリートキット(Promegaカタログ番号G9901)は、FcγRIIaに特異的に結合して活性化するFcドメインを有する抗体および他の生物学的物質の効力および安定性を測定するために使用され得る細胞ベースの生物発光アッセイである。このアッセイは、アミノ酸131位にヒスチジン(H)を含有する高親和性ヒトFcgRIIa−HバリアントおよびNFAT−応答要素(NFAT−RE)によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株からなる。標的細胞および関連抗体と共培養されると、FcγRIIa−Hエフェクター細胞はその抗体のFcドメインに結合し、FcγRIIaのシグナル伝達およびNFAT−RE媒介性ルシフェラーゼ活性がもたらされる。生体発光シグナルを検出し、Bio−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準蛍光度計を使用して定量化した。増加した濃度の抗CD20抗体および構築体7(CD20)または構築体13(CD20)をRaji(CD20+)標的細胞およびFcとインキュベートし、増加した濃度の抗CD20抗体および構築体を、図47の中央のパネル中の指示された濃度で、Raji(CD20+)標的細胞およびFcγRIIa−Hエフェクター細胞とインキュベートした(2:1のE:T比、およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)。37℃で6時間インキュベーションを継続した。Bio−Glo(商標)。試薬を添加し、発光をPHERAstar FS計器で測定した。データを、図47の中央のパネル中の指示された濃度でRIIa−Hエフェクター細胞(2:1のE:T比、およそ35,000個のエフェクター細胞:15,000個の標的細胞)、GraphPad Prismソフトウェアを使用して4PL曲線に適合させた。37℃で6時間インキュベーションを継続した。Bio−Glo(商標)試薬を添加し、発光をPHERAstar FS計器で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを使用して4PL曲線に適合させた(図47、中央のパネル)。SAI構築体(構築体7(CD20))およびS3Y構築体(構築体13(CD20))の両方が、mAbと比較して100倍超増強された効力を示した。
ヒト初代NKエフェクター細胞(Hemacare)を解凍し、5×105/mLでリンパ球増殖培地−3(Lonza)中37℃で一晩静止させた。翌日、ヒトリンパ芽球様細胞株Raji標的細胞(ATCC CCL−86)を収集し、アッセイ培地(フェノールレッドフリーのRPMI、10%FBSΔ、GlutaMAX(商標))中に再懸濁し、様々な濃度の目的とする各プローブの存在下で、37℃で30分間プレーティングした。その後、静止させたNK細胞を収集し、アッセイ培地中に再懸濁し、抗CD20コーティングRaji細胞を含有するプレートに添加した。プレートを、最終比率5:1のエフェクター細胞:標的細胞(5×104NK細胞:1×104Raji細胞)で、37℃で6時間インキュベートした。
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−MS/MS
タンパク質を、6Mのグアニジン(Sigma)中で1μg/μLに希釈した。ジチオスレイトール(DTT)を濃度10mMまで加えて、65℃で30分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で1時間、30mMのヨードアセトアミド(IAM)とともにインキュベートして、遊離チオールをアルキル化(カルバミドメチル化(carbamidomethylate))した。その後タンパク質を、10−kDa膜を介して25mMの炭酸水素アンモニウム緩衝液(pH7.8)中に透析し、IAM、DTTおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Barocycler(NEP 2320、Pressure Biosciences社)中で、トリプシンで消化した。圧力は、37℃で、20,000psiと周囲圧力との間を1時間に合計30サイクルで循環させた。ペプチドのLC−MS/MS分析は、Ultimate 3000(Dionex)クロマトグラフィーシステムとQ−Exactive(Thermo Fisher Scientific社)質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として0.1%FA水溶液および0.1%FAアセトニトリル溶液を用いて、BEH PepMap(Waters社)カラムで分離した。±1.5Daの四重極分離幅(isolation width)を有する二重荷電イオン(z=2)m/z 842.5に基づいて、単独でキシロシル化されたリンカーペプチドを標的とした。
タンパク質を、78.98%水、20%アセトニトリル、1%ギ酸(FA)、および0.02%トリフルオロ酢酸からなる泳動緩衝液(running buffer)中で2μg/μLの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離を、直列に2.1×350mm、合計カラム長700mmの2つのZenix−C SEC−300(Sepax Technologies,Newark,DE)上で行った。タンパク質を、80μL/分の流量で上述の泳動緩衝液を使用してSECカラムから溶出した。質量スペクトルを、ポジティブモードで動作させたQSTAR Elite(Applied Biosystems)Q−ToF質量分光計で取得した。個々のサイズ画分下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたるスペクトルを合計することによって、ベイズピークデコンボリューション(Bayesian peak deconvolution)を使用してデコンボリュートした。
サンプルを1mg/mLに希釈して、HTタンパク質発現変性緩衝液(HT Protein Express denaturing buffer)(パーキンエルマー(PerkinElmer)社)と混合した。混合物を40℃で20分間インキュベートした。サンプルを70μLの水で希釈して、96ウェルプレートに移した。サンプルは、HT Protein Express LabChip(パーキンエルマー社)を備えたCaliper GXII機器(パーキンエルマー社)で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
試料を、Laemmli試料緩衝液(4%SDS、Bio−Rad)中で、95℃で10分間変性させた。試料を、Criterion TGX stain−freeゲル(4〜15%ポリアクリルアミド、Bio−Rad)上で泳動させた。タンパク質のバンドは、UV照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ChemiDoc MPイメージングシステム(Bio−Rad社)でゲルを画像化した。Imagelab 4.0.1ソフトウェア(Bio−Rad社)を用いて、バンドの定量化を行った。
CDCを、Raji細胞(ATCC)が連続希釈されたリツキシマブ、Fc構築体4、またはIVIgでコーティングされた比色分析アッセイにより評価した。すべてのウェルにヒト血清補体(Quidel社)を25%v/vで添加し、37℃で2時間インキュベートした。細胞は、WST−1細胞増殖試薬(Roche Applied Science社)を添加した後で、37℃で12時間インキュベートした。プレートを振とう機に2分間移し、450nmの吸光度を測定した。
タンパク質発現
非対称直列Fcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体4(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(長鎖Fc(配列番号66)および3コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、3コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とを含む。長鎖Fcは、直列に連続して3つのFcドメイン単量体を含有し、各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異と、S354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)とを有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とをN末端で含有する(構築体4(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表7の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体8(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの長鎖Fc(配列番号69)および2コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとを含む。長鎖Fcは、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進するため)を有するFcドメイン単量体に直列に連続して、E357K電荷変異と、S354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)とを有するFcドメイン単量体を含有する。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とをN末端で含有する(構築体8(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表8の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体9(CCR4)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号54)および2コピーの抗CCR4短鎖Fc(配列番号68))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとを含む。長鎖Fcは、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続してN末端で含有する(構築体9(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407Vの空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4重鎖とをN末端で含有する(構築体9(CCR4))。CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖Fcおよび/または短鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表9の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fc(抗CCR4)をコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体10(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号71)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Fcは、2つのFcドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Fcドメイン単量体は、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有し、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列で連続してN末端で含有する(構築体10(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表10の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がC末端Fcドメインにある、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体16(CCR4)は、各々、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号73)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、3コピーの抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)とをそれぞれ含む。長鎖Fcは、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、2つのFcドメイン単量体(各々が、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有する)と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続して含有する(構築体10(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表11の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
タンパク質発現
分岐点がN末端またはC末端Fcドメインのいずれにもない、単独分岐したFcドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Fc抗原結合ドメイン構築体19(CCR4)は、2つの別個のFcドメイン単量体含有ポリペプチド(2コピーの抗CCR4長鎖Fc(配列番号75)および4コピーの短鎖Fc(配列番号63))と、抗CCR4軽鎖ポリペプチド(配列番号49)のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Fcは、E357Kの電荷変異ならびにS354CおよびT366Wの突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体を、逆電荷変異K409DおよびD399K(ホモ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体とともに直列に連続して、E357K電荷変異ならびにS354CおよびT366W突起形成変異(ヘテロ二量体形成を促進する)を有するFcドメイン単量体と、抗CCR4 VHおよびCH1ドメイン(EUの1〜220位)とともに直列に連続してN末端で含有する(構築体19(CCR4))。短鎖Fcは、K370D電荷変異、ならびにY349C、T366S、L368A、およびY407V空洞形成変異(ヘテロ二量体形成を促進するため)を含有する。抗CCR4軽鎖も、scFvの一部として長鎖FcのN末端に融合されて発現され得る。DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされる。表12の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、3つの別個のプラスミド(1つのプラスミドは軽鎖(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは長鎖Fc(抗CCR4)をコードし、1つのプラスミドは短鎖Fcをコードする)によりコードされる。
CCRF−CEM細胞(ATCC)を標的細胞として使用して、10%の熱失活されたFBS(Hyclone)を含有するRPMI 1640培地中で培養した。50μlの細胞(100×103細胞/ml)を、10%の超低IgG FBSを含有するフェノールレッドを含まないRPMI中に再懸濁し、平底白色96ウェルプレート中に播種した。抗CCR4構築体を6nMから3倍希釈し、アッセイに必要とされる最終濃度の11倍の濃度で調製した。10μlの各構築体希釈物を標的細胞に添加し、室温で少なくとも15分間インキュベートした後、エフェクター細胞に添加した。凍結保存されたNK細胞(Hemacare)をエフェクター細胞として使用して、組織培養処理フラスコ(Falcon)中のAIM−V培地中に24時間安置した。1ウェル当たり25000個のエフェクター細胞を添加し、エフェクター:標的(E:T)比5:1を得た。プレートを37℃で5時間インキュベートした後、50μLのCytoTox Glo試薬(Promega社)を添加し、続いて37℃で15分間インキュベートした。発光を、PHERAstar FS(BMG Labtech社)を使用して読み取った。結果を図25および表13に示す。
抗CD20および抗CCR4構築体を利用して、ホモ二量体形成変異、ヘテロ二量体形成変異、ポリペプチドリンカー、およびFabドメインの様々な組み合わせがFcガンマ受容体への結合に影響を及ぼしたかどうかを評価した。表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、CD64(Fcガンマ受容体I)への1:1結合を評価した。これらの構築体をチップ表面上に捕捉し、可溶性受容体への結合を測定して、1:1結合を確実にした。この形式では、結合価は、Fc機能の変化に最も敏感な読み取り値であり、速度定数および平衡定数は、Fcドメインのサブセットの変化に鈍感である。
DNA配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、pcDNA3.4哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。DNAプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎(HEK)293細胞にトランスフェクトされた。抗体を2つの異なるプラスミド(1つのプラスミドが重鎖をコードし、第2のプラスミドが軽鎖をコードした)から発現させた。SIFボディを3つの別個のプラスミド(多くの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、1つのプラスミドがアミノ末端Fcに結合したCH1−VH FAB部分を含むプラスミド長鎖Fcをコードし、第3のプラスミドが短鎖Fcをコードした)から発現させた。S3A SifボディおよびS3W Sifボディは例外であった。S3Wの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第2のプラスミドが2つのFcドメインを含む長鎖をコードし、第3のプラスミドがCH1−VH FAB部分を含む単一のFc鎖をコードした。S3Aの場合、1つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第2のプラスミドがアミノ末端Fcに結合したCH1−VH FAB部分を含む長鎖Fcをコードし、1つのプラスミドが同様にCH1−VH FAB部分を含む短鎖Fcをコードした。
発現したタンパク質を、Poros MabCapture Aカラムを用いて、プロテインA系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。装填後に捕捉したSIFボディ構築体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.0)で洗浄し、中間洗浄緩衝液である50mMのクエン酸緩衝液(pH5.5)でさらに洗浄して、追加のプロセス関連不純物を除去した。結合したSIFボディ物質を100mMのグリシン(pH3)で溶出し、溶出液を1M TRIS(pH7.4)の添加により素早く中和し、その後、遠心分離し、0.2μmのフィルターに通して滅菌濾過した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、ポストプロテインA、プールされたイオン交換画分、および精製された最終物質の純度評価に使用した。
結合実験を、CM3シリーズSセンサーチップを使用してBiacore T200計器(GE Healthcare)で行った。FcgR結合の結合価分析のために、天然プロテインAを直接アミン結合により固定化した。リガンドを泳動緩衝液中で希釈し、捕捉した。ヒト組換えCD32aまたはCD64(R&D Systems)の6点希釈系列を捕捉したリガンド上に流した。各リガンドの結合価を以下のように計算した。
リガンドの結合価=Rmax/[(MW分析物/MWリガンド)×リガンド捕捉レベル]
構築体の細胞表面CD32aへの相対的結合を、抗CD20構築体を使用して、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR−FRET)アッセイ(CisBio)で評価した。アッセイ試薬を製造業者の指示に従って調製した。Freedom EVOware 150自動液体ハンドラー(Tecan)を使用して試料毎に10点3倍連続希釈系列を生成し、これを、標識受容体を有する細胞に添加した。その後、標識競合抗体を添加し、プレートを室温でインキュベートした。PHERAstar蛍光リーダー(BMG Labtech GmbH)を使用して、アッセイプレートを665nmおよび620nmで読み取った。対数変換試料濃度を対応するHTRFシグナル比(665nm/620nm)に対してプロットした。4パラメータ非線形回帰分析(最小二乗適合)をXY−プロットに行って非標識試料のEC50を計算し、EC50はFcガンマ受容体に対する試料の親和性に反比例した。
抗原結合を、SPRを使用して評価した。組換え型、ヒスチジンタグ付きのCCR4(9049−B7 R&D Systems)タンパク質を、以前に固定化した抗6X His(配列番号:141)抗体を使用してセンサ上で捕捉した。同族抗体およびSIFボディの希釈系列をセンサに通過させ、これを分析物注入の合間に低pHグリシン溶液で再生させた。結合を、1:1ラングミュア相互作用モデルを使用して計算した。
Fc受容体結合の分析により、抗CCR4 Fc構築体13(実施例2、表6)がFc受容体に結合することがわかった。
この明細書中に記載したすべての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
Claims (404)
- CCR4結合ドメインと、リンカーによって第2のFcドメインに結合された第1のFcドメインと、を含む、Fc抗原結合ドメイン構築体であって、
前記第1および第2のFcドメインの各々が、ヘテロ二量体形成選択性モジュールまたはホモ二量体形成選択性モジュールのいずれかを含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - CCR4結合ドメインと、リンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも2つのFcドメイン単量体が、ヘテロ二量体形成選択性モジュールまたはホモ二量体形成選択性モジュールのいずれかを含む、
ポリペプチド。 - 前記CCR4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、請求項2〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、CH3ドメイン内にある、請求項2〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項13に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項2〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、請求項2〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項20に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項21に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、請求項2〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項23に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項24に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、請求項30〜37のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項2〜29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項39に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項39に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、請求項5、6、および9〜29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、scFvである、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、請求項2〜43のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項43に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
請求項45に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメインの配列および前記VLドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記VH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一である、
請求項45に記載のポリペプチド。 - 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項45に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、請求項2〜43に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつ
VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、
請求項2〜43に記載のポリペプチド。 - 前記第1または第2のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドの2つのコピー
を含む、ポリペプチド複合体。 - ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合されている、
ポリペプチド複合体。 - 前記第2のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項58に記載のポリペプチド複合体。
- 前記改変された空洞を形成する前記変異が、Y407T、Y407A、F405A、T394S、T394W/Y407A、T366W/T394S、T366S/L368A/Y407V/Y349C、S364H/F405Aからなる群から選択される、請求項59に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項58〜60のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- CCR4結合ドメインと、リンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記CCR4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Aおよび表4BAおよび表4B中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項62に記載のポリペプチド。
- 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項62に記載のポリペプチド。 - 表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、請求項62〜71のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、CH3ドメイン内にある、請求項62〜72のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項73に記載のポリペプチド。
- 前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項62〜73のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、請求項62〜79に記載のポリペプチド。
- EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項80に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項81に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、請求項62〜82のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項83に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項84に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、請求項90〜97のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項62〜89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異である、請求項99に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項99に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項62に記載のポリペプチド。
- 前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、請求項65、66、および69〜89のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、scFvである、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含む、請求項62〜103のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項103に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
請求項105に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメインの配列および前記VLドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記VH配列およびVL配列に対して少なくとも95%または98%同一である、
請求項105に記載のポリペプチド。 - 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項105に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインを含む、請求項62〜103に記載のポリペプチド。
- 前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、かつ
VLドメインおよびCLドメインを含むポリペプチドに結合してFabを形成することができる、
請求項62〜103に記載のポリペプチド。 - 前記第1または第2のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合されている、請求項2〜56のいずれか一項に記載のポリペプチドの2つのコピー
を含む、ポリペプチド複合体。 - ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むIgG1 Fcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合されている、請求項62〜116のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のIgG1 Fcドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合されている、
ポリペプチド複合体。 - 前記第2のポリペプチド単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異を含む、請求項118に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第2のポリペプチド単量体が、表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷変異を含み、かつ前記ポリペプチド内の表4Aおよび表4Bから選択される前記1、2、または3つの逆電荷変異に対して相補的である、請求項119に記載のポリペプチド複合体。
- 前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項118〜120のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
- ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。 - 前記第1のIgG1単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1単量体のアミノ末端にscFvをさらに含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項122に記載のポリペプチド。
- 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項2に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
請求項122に記載のポリペプチド。 - 改変された突起を形成する変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、請求項122〜131のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異および前記逆電荷変異が、前記CH3ドメイン内にある、請求項122〜131のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第1のIgG1 Fcドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む第2のIgG1 Fcドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む任意選択の第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、
少なくとも1つのFcドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびCH1ドメインをさらに含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体のアミノ末端にscFvをさらに含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表6中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG定常ドメイン単量体の両方が、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項134に記載のポリペプチド。
- 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体、前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体、および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が各々、表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第1のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第2のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 第3のリンカーと、第3のIgG1 Fcドメイン単量体と、を含み、
前記第2のIgG1 Fcドメイン単量体および前記第3のIgG1 Fcドメイン単量体の両方が各々、表4Aまたは表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、
前記第1のIgG1ドメイン単量体が、表4A中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4B中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項134に記載のポリペプチド。 - 表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記IgG1 Fcドメイン単量体が、同一のCH3ドメインを有する、請求項134〜143のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 表4Aおよび表4Bから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、前記CH3ドメイン内にある、請求項134〜143のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に単一アミノ酸変異を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EUのI253位の各アミノ酸変異が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項151に記載のポリペプチド。
- I253位の各アミノ酸変異が、I253Aである、請求項152に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に単一アミノ酸変異を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項154のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- R292位の各アミノ酸変異が、R292Pである、請求項155に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記CH3ドメイン内の逆電荷変異である、請求項99に記載のポリペプチド。
- 前記単一アミノ酸置換が、EUのG341位〜EUのK447位(両端を含む)の配列内にある、請求項173に記載のポリペプチド。
- 改変された突起を形成する前記変異のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、S354C、Y349T、およびT394Fからなる群から選択される、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記2つまたは4つの逆電荷変異が、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rから選択される、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%または98%同一である、
請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列のセットを含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセット由来のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3配列を含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記VHドメインまたはscFvメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載の抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメイン配列および前記VLドメイン配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列と少なくとも95%または98%同一である、
請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 前記VHドメインまたはscFvが、表2に記載の抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項123、124、135、および136のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- IgG CL抗体定常ドメインと、IgG CH1抗体定常ドメインと、をさらに含む、請求項122〜145のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項2〜187のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 請求項187に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項187に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
- 請求項188に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項189または請求項190に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む、請求項2〜187のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法。
- 抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 抗体VLドメインおよび抗体CLドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項189に記載の宿主細胞。
- 10個以下の単一アミノ酸変異を有するIgG1 Fcドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項190に記載の宿主細胞。
- 前記IgG1 Fcドメイン単量体が、CH3ドメイン中に10、8、6、または4つ以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号42、43、45、および47のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項196または197に記載の宿主細胞。
- 請求項2〜186のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドの40%、30%、20%、10%、5%、2%未満が、Fcドメイン単量体上に少なくとも1つのフコース修飾を有する、請求項200に記載の薬学的組成物。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
請求項1に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記単一Fcドメイン構築体が抗体である、請求項1または202に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されているか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合されている、請求項204に記載の組成物。
- 前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合されている、請求項204に記載の組成物。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記生物活性が、Fc受容体媒介性エフェクター機能である、請求項207に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc受容体媒介性エフェクター機能が、ADCCおよびADCPおよび/またはCDC活性である、請求項208に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されているか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合されている、請求項202、207、または210に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合されている、請求項202、207、または210に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、Fabである、請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、scFvである、請求項214に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、VHドメインおよびCH1ドメインを含み、
前記VHドメインおよびCH1ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
請求項202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記CCR4結合ドメインが、VLドメインをさらに含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、前記VLドメインを含む第4のポリペプチドを含む、請求項217に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表1に記載のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列のセットを含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むVHドメインのCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、
前記VH配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3配列を除き、表2に記載の抗体のVH配列と少なくとも95%同一である、
請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記VHドメインが、表2に記載の抗体のVH配列を含む、請求項216に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、表1に記載されるCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列のセットを含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットからのCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含むVHドメインと、表2に記載される抗体のVL配列のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含むVLドメインと、を含み、
前記VHドメインの配列および前記VLドメインの配列が、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3の配列を除き、表2に記載される抗体の前記VH配列およびVL配列に対して少なくとも95%同一である、
請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記CCR4結合ドメインが、表2に記載される抗体のVH配列およびVL配列のセットを含む、請求項1および202〜215のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- IgG CL抗体定常ドメインおよびIgG CH1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記IgG CH1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドのN末端に結合している、
請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項202〜227のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項202〜228のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、請求項202〜228のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記二量体形成選択性モジュールが、前記Fcドメイン単量体の一方の前記CH3ドメイン内に改変された空洞と、前記Fcドメイン単量体の他方の前記CH3ドメイン内に改変された突起と、を含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Fcドメイン単量体の、空洞に突起が挿入された対(protuberance−into−cavity pair)を形成するように配置されている、
請求項228または229に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記改変された突起が、S354C、T366W、T366Y、T394W、T394F、およびF405Wからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含み、
前記改変された空洞が、Y349C、T366S、L368A、Y407V、Y407T、Y407A、F405A、およびT394Sからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含む、
請求項231に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の一方がY407VおよびY349Cを含み、
前記Fcドメイン単量体の他方がT366WおよびS354Cを含む、
請求項228または229に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記二量体形成選択性モジュールが、前記ドメイン単量体の一方の前記CH3ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、前記Fcドメイン単量体の他方の前記CH3ドメイン内に正に荷電したアミノ酸と、を含み、
前記負に荷電したアミノ酸および前記正に荷電したアミノ酸が、Fcドメインの形成を促進するように配置されている、
請求項228または229に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D399Kと、K409DまたはK409Eのいずれかと、を含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K392DおよびD399Kを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D356KおよびK439Dを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K392EおよびD399Kを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、D356KおよびK439Eを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、S354CおよびT366Wを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、
請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、S354CおよびT366Wを含み、前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KまたはE357Rを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、K370DまたはK370Eを含む、
請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、K370DまたはK370Eを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、E357Kまたは357Rを含む、
請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、K409DまたはK409Eを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、D399KまたはD399Rを含む、
請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、D399KまたはD399Rを含み、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、K409DまたはK409Eを含む、
請求項234に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、結合である、請求項1および202〜247のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、スペーサーである、請求項1および202〜247のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、請求項249に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、請求項251に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、請求項252に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記CCR4結合ドメインが、リンカーにより前記Fcドメイン単量体に結合されている、請求項1および202〜212のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記リンカーが、スペーサーである、請求項254に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメインのうちの少なくとも1つが、I253位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、請求項1および202〜255のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- I253位の前記アミノ酸修飾が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項256に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- I253位の各アミノ酸修飾が、I253Aである、請求項257に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメインのうちの少なくとも1つが、R292位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、請求項1および202〜258のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- R292位の各アミノ酸修飾が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項259に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- R292位の各アミノ酸修飾が、R292Pである、請求項260に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの1つ以上が、IgGヒンジドメイン、IgG CH2抗体定常ドメイン、およびIgG CH3抗体定常ドメインを含む、請求項1および202〜261のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々、IgGヒンジドメイン、IgG CH2抗体定常ドメイン、およびIgG CH3抗体定常ドメインを含む、請求項262に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記IgGが、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4からなる群から選択されるサブタイプのものである、請求項262または263に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドの各々内のN末端Aspが、Glnに変異している、請求項1および202〜264のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドのうちの1つ以上が、C末端リシンを欠いている、請求項1および202〜265のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドが各々、C末端リシンを欠いている、請求項266に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- リンカーによって前記ポリペプチドのうちの1つ以上のN末端またはC末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項1および202〜267のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - 前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも75%が、前記第1のFcドメイン、前記第2のFcドメイン、および前記CCR4結合ドメインを含む、請求項269に記載の細胞培養培地。
- Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一であり、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0.1mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。 - 前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも75%が、構造的に同一である、請求項271に記載の細胞培養培地。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項269〜272のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
- 前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100mg/Lの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項269〜273のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
- Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチド、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチド、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチド、および
(4)抗原結合ドメイン
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項276に記載の組成物。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K370DおよびE357Kを含む、
請求項277に記載の組成物。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項279に記載の組成物。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、E357KおよびK370Dを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、K370DおよびE357Kを含む、
請求項280に記載の組成物。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
請求項282に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
請求項284に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
組成物。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が各々、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項286に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(5)前記第2のポリペプチドおよび/または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項288、289、290、291、または292に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(c)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(e)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(f)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第3のFcドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
(3)第4のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
(5)前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
(6)前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を発現する、宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記CCR4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりFc抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項294、295、296、297、または298に記載の組成物。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
請求項300、301、302、303、または304に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、および
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(iv)第3のFcドメイン単量体、
(v)第4のFcドメイン単量体、および
(vi)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
請求項306、307、308、309、または310に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vii)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ、抗体依存性細胞貪食(ADCP)アッセイ、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいて強化されたエフェクター機能を有する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
前記Fc抗原結合ドメイン構築体が、単一Fcドメインと前記CCR4結合ドメインとを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
(ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成する、
細胞培養培地。 - Fc抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
(1)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合する第1のスペーサー、および
(v)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合する第2のスペーサー、を含む、第1のポリペプチドと、
(2)第2のポリペプチドであって、
(vi)第4のFcドメイン単量体、
(vii)第5のFcドメイン単量体、
(viii)第6のFcドメイン単量体、
ix)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合する第3のスペーサー、および
(x)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合する第4のスペーサー、を含む、第2のポリペプチドと、
(3)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(4)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(5)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(6)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(7)前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が組み合わさって第1のFcドメインを形成し、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が組み合わさって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が組み合わさって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が組み合わさって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体が組み合わさって第5のFcドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Fc抗原結合ドメイン構築体の、モル基準で少なくとも50%が、構造的に同一である、工程;および
(b)前記細胞培養上清から前記Fc抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。 - 前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が各々、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が各々、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が各々、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が各々、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が各々、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、
請求項312、313、314、315、または316に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の構築体を含む組成物を投与することを含む、癌を治療する方法であって、前記癌が、CCR4を発現している、方法。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFc単量体と前記第6のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項319に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項319に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、請求項319に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
請求項319に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項319〜323のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項319〜323のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項319〜323のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項324〜326のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第3のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項319〜323のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項319〜323のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項328に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項329に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第4のFc単量体と前記第6のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1および第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3および第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
第1のFcドメイン単量体と第5のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
第3のFcドメイン単量体と第6のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
第2のFc単量体と第4のFc単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
第1のCCR4重鎖結合ドメインと第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、
第2のCCR4重鎖結合ドメインと第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項333に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項333に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、請求項333に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
請求項333に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項333〜337のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項342に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項343に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第5のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項346に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項346に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、請求項346に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、請求項346に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
請求項346に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第4のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が、前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項346〜351のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項357に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項358に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第4のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第5のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
(g)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第5のFc単量体と前記第8のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体が、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体が、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項361に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項361に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、請求項361に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、請求項361に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第7のポリペプチドおよび前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
請求項361に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第7のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第5のFcドメイン単量体および前記第8のFcドメイン単量体が、前記第5のFcドメイン単量体と前記第8のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第9のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第6のFcドメイン単量体および前記第10のFcドメイン単量体が、前記第6のFcドメイン単量体と前記第10のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項361〜366のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項371に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項372に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第3のFcドメイン単量体、
(iv)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第2のFcドメイン単量体と前記第3のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第4のFcドメイン単量体、
(ii)第5のFcドメイン単量体、
(iii)第6のFcドメイン単量体、
(iv)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、
(v)前記第4のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体を結合するリンカー、および
(vi)前記第5のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第7のFcドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
(d)第8のFcドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
(e)第9のFcドメイン単量体と第1のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第5のポリペプチドと、
(f)第10のFcドメイン単量体と第2のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体は、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第7のFcドメイン単量体は、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第5のFc単量体と前記第8のFc単量体は、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第9のFcドメイン単量体は、一緒になって第4のFcドメインを形成し、
前記第6のFc単量体と前記第10のFc単量体は、一緒になって第5のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインは、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第1のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第2のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4重鎖結合ドメインと前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4重鎖結合ドメインと前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項202に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項202に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、請求項202に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチドおよび前記第6のポリペプチドの配列が同一である、
請求項202に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項376〜380のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項385に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項386に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- Fc抗原結合ドメイン構築体であって、以下:
(a)第1のポリペプチドであって、
(i)第1のFcドメイン単量体、
(ii)第2のFcドメイン単量体、
(iii)第1のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第1のFcドメイン単量体と前記第2のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第1のポリペプチドと、
(b)第2のポリペプチドであって、
(i)第3のFcドメイン単量体、
(ii)第4のFcドメイン単量体、
(iii)第2のCCR4重鎖結合ドメイン、および
(iv)前記第3のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体を結合するリンカー、を含む、第2のポリペプチドと、
(c)第5のFcドメイン単量体と第3のCCR4重鎖結合ドメインとを含む第3のポリペプチドと、
(d)第6のFcドメイン単量体と第4のCCR4軽鎖結合ドメインとを含む第4のポリペプチドと、
(e)第1のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第5のポリペプチドと、
(f)第2のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第6のポリペプチドと、
(g)第3のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第7のポリペプチドと、
(h)第4のCCR4軽鎖結合ドメインを含む第8のポリペプチドと
を含み、
前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体が、一緒になって第1のFcドメインを形成し、
前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体が、一緒になって第2のFcドメインを形成し、
前記第2のFc単量体と前記第4のFc単量体が、一緒になって第3のFcドメインを形成し、
前記第1のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第3のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第1のFabを形成し、
前記第2のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第4のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成し、
前記第3のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第1のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第3のFabを形成し、
前記第4のCCR4軽鎖結合ドメインと前記第2のCCR4重鎖結合ドメインが、一緒になって第2のFabを形成する、
Fc抗原結合ドメイン構築体。 - 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一である、請求項389に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一である、請求項389に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第5のポリペプチド、前記第6のポリペプチド、前記第7のポリペプチド、および前記第8のポリペプチドの配列が同一である、請求項389に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドの配列が同一であり、
前記第5のポリペプチド、前記第6のポリペプチド、前記第7のポリペプチド、および前記第8のポリペプチドの配列が同一である、
請求項389に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体の各々の前記CH3ドメインが、ヒトIgG1のアミノ酸配列と比較して、最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体が各々独立して、最大10、8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記単一アミノ酸置換が、前記CH3ドメイン内のみにある、請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン単量体。
- 前記第2のFcドメイン単量体および前記第4のFcドメイン単量体が、前記第2のFcドメイン単量体と前記第4のFcドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記第1のFcドメイン単量体および前記第5のFcドメイン単量体が、前記第1のFcドメイン単量体と前記第5のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含み、
前記第3のFcドメイン単量体および前記第6のFcドメイン単量体が、前記第3のFcドメイン単量体と前記第6のFcドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大8、7、6、5、4、3、2、または1つの単一アミノ酸置換を含む、
請求項389〜393のいずれか一項に記載のFc抗原ドメイン構築体。 - ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表4Aおよび表4B中の置換から選択される、請求項398に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表3中の置換から選択される、請求項399に記載のFc抗原ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのI253位に置換を含む、請求項319〜401のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- EUのI253位の各アミノ酸置換が独立して、I253A、I253C、I253D、I253E、I253F、I253G、I253H、I253I、I253K、I253L、I253M、I253N、I253P、I253Q、I253R、I253S、I253T、I253V、I253W、およびI253Yからなる群から選択される、請求項403に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、EUのR292位に置換を含む、請求項319〜401のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- EUのR292位の各アミノ酸変異が独立して、R292D、R292E、R292L、R292P、R292Q、R292R、R292T、およびR292Yからなる群から選択される、請求項45に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
- 前記Fcドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、T366Y、T366W、T394W、T394Y、F405W、F405A、Y407A、S354C、Y349T、T394F、K409D、K409E、K392D、K392E、K370D、K370E、D399K、D399R、E357K、E357R、D356K、およびD356Rからなる群から選択される置換を含む、請求項319〜401のいずれか一項に記載のFc抗原結合ドメイン構築体。
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