ES2602439T3 - Anticuerpo modificado con bioactividad mejorada - Google Patents
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Abstract
Un método para mejorar una actividad efectora de un anticuerpo, en donde una o más estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana están enlazadas en tándem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo por una técnica de ingeniería genética, en donde la actividad efectora es actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), siempre y cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esté enlazada en tándem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de residuos de amino ácidos, en donde la unidad básica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoácidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de la IgG1 humana.
Description
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Anticuerpo modificado con bioactividad mejorada Campo tecnico
La presente invencion se refiere con metodos para mejorar la actividad efectora de anticuerpos, anticuerpos modificados con actividad efectora fuerte, y metodos para producir los anticuerpos. Mas especfficamente, la presente invencion se refiere a metodos para mejorar la actividad de ADCC, que es una actividad efectora principal, anticuerpos modificados que tienen una actividad de ADCC fuerte, y metodos para producir los anticuerpos.
Estado del arte
Los anticuerpos se utilizan actualmente comunmente como agentes terapeuticos (Documento 1 no de patente). Se han convertido en agentes terapeuticos aplicables unicamente debido al desarrollo de diversas tecnicas relacionadas con anticuerpos. El metodo para producir anticuerpos a gran escala se establecio basandose en la tecnica de fusion celular desarrollada por G. Kohler y C. Milstein (Documento 2 no de patente). Alternativamente, con el avance de tecnicas de recombinacion genetica, la produccion de anticuerpos a gran escala ha sido posible insertando genes de anticuerpo en vectores de expresion e introduciendolos en celulas huesped (Documento 3 no de patente).
Ademas, se han mejorado los anticuerpos para que se hagan mas cercanos a las moleculas de anticuerpos derivadas de humanos de forma que no tengan inmunogenicidad cuando se administran a seres humanos. Se han desarrollado, por ejemplo, anticuerpos quimericos que consisten en regiones variables de raton y regiones constantes humanas (Documento 4 no de patente) y anticuerpos humanizados que consisten en regiones hipervariables de raton, y regiones marco y constante humanas (Documento 5no de patente). Con el desarrollo de estas tecnicas, los anticuerpos se han puesto en uso practico como agentes terapeuticos para canceres, enfermedades autoinmunes, trombosis, inflamacion, infeccion, etc. Estan en curso ensayos clfnicos para muchos mas anticuerpos (Documento 6 no de patente).
Aunque las expectativas sobre los productos farmaceuticos de anticuerpo son altas, hay casos en los que, debido a la baja actividad del anticuerpo, no se pueden obtener suficientes efectos terapeuticos sobre canceres, enfermedades autoinmunes, inflamacion, infeccion y demas, y casos en los que una dosis mayor ha aumentado los costos para el paciente. En estas circunstancias, el aumento de la actividad terapeutica es un objetivo importante para los agentes terapeuticos de anticuerpos.
Los efectos de los productos farmaceuticos de anticuerpos incluyen efectos terapeuticos que se ejercen por la union de sus dos dominios Fab con moleculas de antfgeno asociadas a la enfermedad. Por ejemplo, los anticuerpos contra el factor de necrosis tumoral (TNF) inhiben la actividad del TNF uniendose al TNF, suprimen la inflamacion y ejercen por tanto un efecto terapeutico sobre la artritis reumatoide (Documento 7 no de patente). Ya que producen un efecto terapeutico por union a moleculas de antfgeno e inhiben la actividad de los antfgenos, cuanto mayor es la afinidad contra el antfgeno, mas se espera que los anticuerpos produzcan un efecto mas fuerte con una dosis pequena. El metodo de seleccion de clones que tienen alta afinidad con un mismo antfgeno de un numero de anticuerpos monoclonales se utiliza comunmente para mejorar la afinidad de union al antfgeno. En un posible metodo alternativo, se preparan anticuerpos modificados por recombinacion genetica y se seleccionan aquellos que presentan alta afinidad.
Por otra parte, cuando los productos farmaceuticos de anticuerpo apuntan al tratamiento de canceres, es importante que estos ejerzan efectos citotoxicos contra sus celulas cancerosas objetivo. Los anticuerpos unidos a antfgenos en la superficie de celulas objetivo se unen, a traves de su dominio Fc, a receptores Fc en la superficie de celulas efectoras tales como celulas NK y macrofagos, ejerciendo asf dano en celulas objetivo. Esto se denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (en lo sucesivo abreviado como ADCC). Alternativamente, los anticuerpos danan las celulas mediante la activacion de complementos a traves del dominio Fc. Esto se llama citotoxicidad dependiente del complemento (abreviado en lo sucesivo como CDC). Ademas de la actividad citotoxica, los anticuerpos que se unen a microorganismos infectantes tambien tienen la actividad de union a receptores Fc en celulas efectoras y que median fagocitosis o deterioro de los microorganismos infectantes por las celulas efectoras. Tales actividades de anticuerpos ejercidas a traves de los dominios Fc se denominan actividades efectoras.
Existen unas pocas especies moleculares diferentes de receptor Fc al que se une la IgG humana. FcyRIA esta presente en la superficie celular de macrofagos, monocitos, y demas, y exhibe alta afinidad por IgG humana. FcyRIIA esta presente en macrofagos, neutrofilos, y demas, y muestra una afinidad debil para IgG. FcyRIIB esta presente en linfocitos B, mastocitos, macrofagos, y demas, exhibe afinidad debil por IgG, y transduce la senal supresora. FcyRIIIA esta presente en las celulas asesinas naturales (NK), macrofagos, y asf sucesivamente, tiene afinidad debil por IgG, y desempena un papel importante en el ejercicio de la actividad de ADCC. FcyRIIIB esta
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presente en neutrofilos, y tiene el mismo dominio extracelular que FcyRIIIA, pero esta unido a la superficie celular a traves de un anclaje GPI. Ademas de estos, existe tambien FcRn que esta presente en el intestino delgado y placenta y esta implicado en el metabolismo de IgG. Estos receptores Fc se describen en una revision (Documento 8 no de patente).
Ha habido varios intentos para mejorar la funcion efectora de anticuerpos con el objetivo de potenciar su actividad terapeutica contra el cancer. R. L. Shields y colaboradores, han generado multiples anticuerpos IgG1 humanos modificados en los que los aminoacidos han sido sustituidos en los dominios CH2 y CH3, que constituyen el dominio Fc, y han medido su actividad de union al receptor Fc y la actividad de ADCC (Documento 9 no de patente). Como resultado, muchos anticuerpos modificados exhibieron actividades de union menores en comparacion con los anticuerpos IgG1 naturales; sin embargo, se observo una actividad ligeramente mejorada de ADCC para algunos de los anticuerpos modificados. Hay un informe sobre un intento de mejorar la actividad de la CDC sustituyendo los aminoacidos en el dominio CH2 al cual se unen los complementos; sin embargo, aunque la union del complemento C1q se mejoro, la actividad de la CDC fue bastante atenuada (Documento 10 no de patente).
Se sabe que una cadena de azucar esta unida a asparagina en la posicion 297 en el dominio Fc de anticuerpos IgG1 y que esta diferencia en la cadena de azucar influye en la actividad efectora de anticuerpos. R. L. Shields y colaboradores han reportado que la ausencia de a1,6-fucosa en la cadena de azucar de los anticuerpos IgG1 no tiene influencia significativa en la union a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y al complemento C1q, sino que aumenta la actividad de union a FcyRIIIA en 50 veces (Documento 11 no de patente). Existen variantes geneticas de FcyRIIIA, que son los tipos en los que el aminoacido en posicion 158 es valina (Val) o fenilalanina (Phe). Con ambas variantes, se aumento la actividad de union de anticuerpos IgG1 deficientes en a1,6-fucosa a FcyRIIIA. Ademas, tambien se informo que los anticuerpos deficientes en a1,6-fucosa exhiben actividad de ADCC mejorada (Documento 11 no de patente). T. Shinkawa y colaboradores tambien han reportado resultados similares (Documento 12 no de patente).
S. G. Telford afirma que los anticuerpos con multiples regiones Fc tienen una actividad mejorada de Fc (Documento 1 de Patente). Telford preparo anticuerpos modificados que comprenden Fab heterodivalente que consiste en Fab de anti-cadena p y anti-Fab CD19 y en los que dos regiones Fc estan unidas covalentemente en paralelo a traves de un enlazador sintetico y miden su actividad de ADCC. Sin embargo, cuando se considera que las celulas objetivo expresan tanto la cadena CD 19 como la cadena p en su superficie celular, se puede pensar que la mejora de la actividad de ADCC observada por Telford se debe no solo al efecto de la presencia de multiples regiones Fc sino tambien al efecto de la union eficiente de los anticuerpos modificados a las celulas objetivo a traves del Fab heterodivalente. Debido a que Telford no ha llevado a cabo ninguna evaluacion para descartar el efecto de Fab heterodivalente como causa de la actividad de ADCC mejorada, no esta claro si el aumento en las regiones Fc es una causa de la actividad mejorada de Fc. Por lo tanto, cuando se generan anticuerpos modificados que tienen multiples regiones Fc pero que tienen una estructura que difiere de la de los anticuerpos modificados de Telford, si estos anticuerpos modificados tienen una actividad mejorada de Fc o no es totalmente impredecible.
Mientras tanto, J. Greenwood genero anticuerpos modificados con porciones de Fc enlazadas en tandem y comparo sus actividades de CDC (Documento 13 no de patente). Contrariamente a lo que se esperaba, todos los anticuerpos modificados tuvieron una actividad de CDC disminuida. Greenwood no ha evaluado la actividad de ADCC de los diversos tipos de anticuerpos modificados.
En el Documento 2 de patente, se divulgan anticuerpos que presentan 2 dominios Fc en repeticion en Tandem en cada cadena pesada. El metodo para la produccion de dichos anticuerpos incluye la insercion de un fragmento que codifica dominios extra de bisagra CH2 y CH3 en un vector que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo. Sin embargo, se divulga una actividad no efectora tal como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) que es exhibida por dichos anticuerpos.
Como se ha descrito anteriormente, se han producido intentos continuos para mejorar las actividades efectoras de anticuerpos; sin embargo, ninguno de esos intentos ha proporcionado resultados satisfactorios.
[Documento 1 de patente] Patente japonesa No. 2907474, publicacion Kohyo de la patente japonesa No. (JP-A) H04-504147 (publicacion de la fase nacional japonesa no examinada correspondiente a una publicacion internacional no japonesa), WO90/04413.
[Documento 2 de patente] WO 2005/077981
[Documento 1 no de patente] Brekke OH. y colaboradores, Nature Review Drug Discovery, 2, 52 (2003).
[Documento 2 no de patente] Kohler G. y colaboradores, Nature, 256, 495 (1975) .
[Documento 3 no de patente] Carter P. y colaboradores, Nucleic Acid Research, 13, 4431 (1985).
[Documento 4 no de patente] Boulianne GL y colaboradores, Nature, 312, 643 (1984).
[Documento 5 no de patente] Jones PT. y colaboradores, Nature, 321, 522 (1986).
[Documento 6 no de patente] Reichert JM. y colaboradores, Nature Biotechnology, 23, 1073 (2005).
[Documento 7 no de patente] Lipsky PE. y colaboradores, New England Journal of Medicine, 343, 1594 (2000) .
5 [Documento 8 no de patente] Takai T. Nature Review Immunology, 2, 580 (2002).
[Documento 9 no de patente] Shields RL. y colaboradores, Journal of Biological Chemistry, 276, 6591(2001). [Documento 10 no de patente] Idusogie EE. y colaboradores, Journal of Immunology, 166, 2571 (2001).
[Documento 11 no de patente] Shields RL., y colaboradores, Journal of Biological Chemistry, 277, 26733 (2002). [Documento 12 no de patente] Shinkawa T., y colaboradores, Journal of Biological Chemistry, 278, 3466, (2003).
10 [Documento 13 no de patente] Greenwood J., y colaboradores, Therapeutic Immunology, 1, 247 (1994).
[Documento 14 no de patente 14] Oettgen HC. y colaboradores, Hybridoma, 2, 17 (1983).
[Documento 15 no de patente] Huhn D. y colaboradores, Blood , 98, 1326 (2001).
[Documento 16 no de patente] Press OW. y colaboradores, Blood , 69, 584, (1987).
Divulgacion de la invencion 15 [Problemas a resolver por la invencion]
La presente invencion se logro en vista de las circunstancias descritas anteriormente. Un objetivo de la presente invencion es proporcionar metodos para aumentar las actividades efectoras alterando la estructura de moleculas de anticuerpo, en particular metodos para mejorar la actividad de ADCC. Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar metodos para producir anticuerpos modificados con actividad mejorada, y tales anticuerpos 20 modificados.
[Medios para resolver los problemas]
Los presentes inventores realizaron estudios dedicados para lograr los objetivos descritos anteriormente. A pesar de los hallazgos anteriores, los presentes inventores generaron anticuerpos modificados con porciones de Fc ligadas en 25 tandem y evaluaron la actividad efectora de los anticuerpos modificados. Sorprendentemente, se confirmo que los anticuerpos modificados con porciones de Fc unidas en tandem tenfan una actividad de ADCC significativamente mejorada en comparacion con anticuerpos naturales. De acuerdo con los hallazgos anteriores, no se pudo descartar la posibilidad de que la actividad de ADCC mejorada de anticuerpos modificados con Fc unida paralelamente sea un efecto del Fab heterodivalente. Ademas, considerando que los anticuerpos modificados ligados en tandem tenfan 30 una actividad de CDC disminuida, el efecto de los anticuerpos modificados de la presente invencion fue inesperado. Ademas, los anticuerpos modificados que tienen tres regiones Fc exhibieron actividad de ADCC adicionalmente mejorada que los anticuerpos modificados con dos regiones Fc. Se deduce que la actividad de ADCC mejorada de los anticuerpos modificados de la presente invencion esta correlacionada con el numero de regiones Fc unidas en tandem. Los presentes inventores demostraron que la actividad efectora de anticuerpos podrfa mejorarse mediante 35 la union en tandem de los dominios Fc a anticuerpos, y de este modo completaron la presente invencion.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a metodos para aumentar la actividad efectora de anticuerpos mediante la union de dominios Fc en tandem. Mas especfficamente, la presente invencion proporciona lo siguiente:
[1] un metodo para mejorar una actividad efectora de un anticuerpo, en el que una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de la IgG1 humana estan unidos en tandem al extremo terminal C de una cadena 40 pesada de anticuerpo por una tecnica de ingenierfa genetica, en donde la actividad efectora es actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta unida en tandem al extremo terminal C de dicho cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/ serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, 45 cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana;
[2] un metodo para producir un anticuerpo modificado con actividad efectora mejorada, en el que una o mas estructuras
que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan unidas en tandem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo por una tecnica de ingenierfa genetica, en donde la actividad efectora es actividad de 5 citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta unida en tandem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos, en la que la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana;
10 [3] un metodo para producir un anticuerpo modificado con actividad efectora mejorada, en donde la actividad
efectora es
actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), que comprende las etapas de: (a) expresar una actividad polinucleotido que codifica una cadena ligera y un polinucleotido que codifica una cadena pesada alterada en donde una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan unidas en 15 tandem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta unida en tandem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible glicina/ serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana; y (b) recoger los productos de 20 expresion del polinucleotido;
[4] el metodo de cualquiera de [1] a [3], en donde las estructuras comprenden un polipeptido espaciador en el lado N-terminal del dominio Fc de la IgG1 humana;
[5] el metodo de cualquiera de [1] a [4], donde el numero de estructuras es dos;
[6] el metodo de [4] o [5], en donde el polipeptido espaciador de acuerdo con [4] se selecciona del grupo que 25 consiste en las SEQ ID Nos: 48, 49 y 50;
[7] un anticuerpo modificado, en donde una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan enlazadas en tandem al terminal C de una cadena pesada de anticuerpo, siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta unida en tandem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un
30 espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana;
[8] el anticuerpo modificado de [7], en donde las estructuras comprenden un polipeptido espaciador en el lado N- terminal del dominio Fc de IgG1 humana;
[9] el anticuerpo modificado de [7] u [8], en donde el numero de estructuras es dos;
35 [10] El anticuerpo modificado de cualquiera de [8] o [9], en donde el polipeptido espaciador de acuerdo con [8] se
selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 48, 49 y 50;
[11] el anticuerpo modificado de cualquiera de [7] a [10] para uso en medicina;
[12] el anticuerpo modificado de cualquiera de [7] a [10] para uso en un metodo para tratar el cancer;
[13] el metodo de cualquiera de [1] a [6] o el anticuerpo modificado de cualquiera de [7] a [10], en donde dicho 40 espaciador de 15 residuos de aminoacidos es GGGGSGGGGSGGGGS;
[14] el metodo de cualquiera de [1] a [6], en donde el anticuerpo es un anticuerpo contra el antfgeno CD20 de diferenciacion especffica de celulas B;
[15] el anticuerpo modificado de cualquiera de [7] a [10], que es un anticuerpo contra el antfgeno CD20 de diferenciacion especffica de celulas B.
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Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1-1 muestra el procedimiento para construir el vector de expresion pCAGGSI-neoN-L/cadena L Anti-CD20 descrito en el Ejemplo 1.
La Fig. 1-2 es una continuacion de la Fig. 1-1.
La Fig. 2-1 muestra el procedimiento para construir el vector de expresion pCAGGS1-dhfrN-L/cadena H anti-CD20 descrito en el ejemplo 2.
La Fig. 2-2 es una continuacion de la Fig. 2-1.
La Fig. 3 muestra la estructura genica de la cadena H final descrita en el Ejemplo 2 y los correspondientes cebadores (SEQ ID NOs: 34 a 45). En (1) a (12) de esta figura, los subrayados sencillos indican sitios de la enzima de restriccion y los subrayados dobles indican secuencias espaciadoras.
La Fig. 4 es un diagrama esquematico de los anticuerpos generados en el Ejemplo 3.
La Fig. 5 muestra cromatogramas de filtracion en gel despues de purificacion por afinidad con Protefna A, descritos en el Ejemplo 4. Estos son cromatogramas obtenidos por filtracion en gel de los productos M, RTX (Rituximab), D0, D1, D2, D3, T0, T1, T2 y T3.
La Fig. 6 muestra un resultado del analisis PAGE de anticuerpos despues de la filtracion en gel descrita en el Ejemplo 5. El resultado se obtuvo llevando a cabo una SDS-PAGE en condiciones reductoras y transferencia tipo Western con anticuerpo anti-IgG humano (H+L) de cabra marcado con peroxidasa de rabano picante o anticuerpo de anti-cadena k humana de cabra.
La Fig. 7 muestra los resultados del analisis por HPLC de anticuerpos despues de la filtracion en gel descrito en el Ejemplo 5. Se muestran los HPLC (filtraciones en gel) de M, RTX, D0, D1, D2, D3, T0, T1, T2 y T3 purificados.
La Fig. 8 muestra los resultados del ensayo de union a CD20 de anticuerpos mediante citometrfa de flujo descrita en el Ejemplo 6. (1): M, Trastuzumab como control negativo y RTX como control positivo. (2): D0, D1, D2 y D3. (3): T0, T1, T2 y T3.
La Fig. 9-1 muestra un resultado del ensayo de union al receptor mediante ELISA utilizando el FcyRIA recombinante descrito en el Ejemplo 7.
La Fig. 9-2 muestra un resultado del ensayo de union al receptor mediante ELISA usando FcyRIIA recombinante descrito en el Ejemplo 7.
La Fig. 9-3 muestra un resultado del ensayo de union al receptor mediante ELISA usando FcyRIIB recombinante descrito en el Ejemplo 7.
La Fig. 9-4 muestra un resultado del ensayo de union al receptor mediante ELISA usando FcyRIIIA recombinante (tipo Val158) descrito en el Ejemplo 7.
La Fig. 9 - 5 muestra un resultado del ensayo de union al receptor mediante ELISA usando FcyRIIIA recombinante (tipo Phe158) descrito en el Ejemplo 7.
La Fig. 10 muestra un resultado del ensayo de actividad de ADCC descrito en el Ejemplo 8.
La Fig. 11 muestra un resultado del ensayo de actividad de CDC descrito en el Ejemplo 9.
Mejor forma para llevar a cabo la invencion
Como un nuevo metodo para aumentar la actividad efectora de anticuerpos, la presente invencion proporciona un "metodo para aumentar la actividad efectora de anticuerpos, que comprende enlazar en tandem una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IGg1 humana al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo". El metodo de la presente invencion permite obtener anticuerpos modificados con actividad efectora mejorada en donde la actividad efectora es actividad de ADCC comparada con los anticuerpos originales (en adelante tambien denominada "anticuerpos modificados de la presente invencion"), mientras que la afinidad de los anticuerpos originales contra los antfgenos se mantiene.
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El origen de los anticuerpos de la presente invencion no esta particularmente limitado. Los anticuerpos pueden derivarse, por ejemplo, de cualquiera de: primates tales como humanos, monos y chimpances; roedores tales como raton, rata y cobaya; mamfferos tales como conejo, caballo, oveja, burro, ganado, cabra, perro y gato; o pollo. Sin embargo, se derivan preferiblemente de humanos. Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser anticuerpos anticuerpo o anticuerpos en los que se han introducido algunas mutaciones artificiales. Ademas, tambien pueden denominarse anticuerpos quimericos o anticuerpos humanizados. Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser inmunoglobulinas pertenecientes a cualquier clase o cualquier subclase. Sin embargo, son preferiblemente de la clase IgG, y mas preferiblemente de la subclase IgG1.
La "estructura que comprende un dominio Fc" de la presente invencion (en lo sucesivo tambien denominada como la "estructura de la presente invencion") puede ser el propio dominio Fc de un anticuerpo, o un oligopeptido apropiado puede estar unido como un espaciador en el extremo terminal N del dominio Fc.
En general, el dominio Fc de un anticuerpo es un fragmento que se obtiene despues de digerir una molecula de inmunoglobulina con papafna. Un dominio Fc esta constituido, a partir del extremo terminal N de la region constante de la cadena pesada, por la region bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. Las dos cadenas pesadas estan unidas entre si por enlaces S-S en la region bisagra. Los anticuerpos pueden doblarse en la region bisagra. Las dos cadenas pesadas de IgG1 estan unidas entre si a traves de enlaces no covalentes en los dominios CH3 y enlaces disulfuro en las regiones bisagra. Los dominios Fc tienen cadenas de azucar; sin embargo, las cadenas de azucar pueden contener mutaciones siempre y cuando los dominios Fc tengan la capacidad de aumentar la actividad efectora cuando estan unidos al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden carecer de a1,6-fucosa en las cadenas de azucar.
El origen de los dominios Fc en la estructura de la presente invencion puede ser el mismo o diferente del anticuerpo al que se va a unir la estructura de la presente invencion. Sin embargo, desde el punto de vista de la inmunogenicidad, el origen es preferiblemente el mismo que el del anticuerpo al que se va a unir la estructura de la presente invencion, cuando el anticuerpo se usa como un producto farmaceutico de anticuerpo. Por ejemplo, cuando un anticuerpo al que esta unida la estructura de la presente invencion es un anticuerpo derivado de un ser humano o un anticuerpo humanizado, el dominio Fc en la estructura de la presente invencion es preferiblemente un dominio Fc humano. Muchas secuencias de cadena pesada de anticuerpo (cadena H) se han registrado en bases de datos publicas como genes para cadenas H de IgG1 que incluyen regiones V. Los ejemplos incluyen el numero de acceso BC019337 del GenBank (una secuencia de ADN de region constante humana). La secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de IgG1 (region V derivada de CD20 de la secuencia gufa (secuencia de aminoacidos con acceso No. AAL27650)-CH1-bisagra-CH2-CH3) usada en los Ejemplos se muestra en la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO. 4. La secuencia de nucleotidos que codifica al dominio Fc humano corresponde a la posicion 721 a 1413 en la SEQ ID NO: 3. Los ADNc del dominio Fc pueden prepararse por metodos conocidos por aquellos expertos en la tecnica. Los ADNc de dominio Fc se pueden preparar, por ejemplo, mediante metodos conocidos de amplificacion de acidos nucleicos usando cebadores disenados con base en la secuencia desde la posicion 721 a 1413 en la SEQ ID NO: 3 y, como plantilla, los ARNm preparados a partir de celulas que expresan anticuerpos. Alternativamente, pueden prepararse mediante el uso como sonda de una porcion de la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y seleccionar las secuencias que hibridan con la sonda a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de celulas que expresan anticuerpos.
Ademas, los dominios Fc en la estructura de la presente invencion pueden comprender mutaciones espontaneas o artificiales siempre que tengan actividad de union al receptor Fc. Por ejemplo, polipeptidos codificados por secuencias que hibridan bajo condiciones rigurosas con la cadena complementaria de la secuencia de nucleotidos desde la posicion 721 a 1413 en la SEQ ID NO: 3, y polipeptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos con sustitucion, supresion, adicion y/o insercion de uno o mas aminoacidos en la secuencia desde la posicion 241 a la 471 en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 tambien se incluyen en el dominio Fc de las estructuras de la presente invencion, siempre y cuando tengan actividad de union al receptor Fc. Tales variantes del dominio Fc tambien pueden prepararse por metodos conocidos por aquellos expertos en la tecnica.
Los expertos en la tecnica pueden seleccionar apropiadamente las condiciones de hibridacion rigurosas anteriores. Por ejemplo, se lleva a cabo una hibridacion previa en una solucion de hibridacion que contiene formamida al 25%, o formamida al 50% bajo condiciones mas rigurosas, y 4x SSC, Hepes 50 mM (pH 7,0), solucion de Denhardt 10x y 20 pg /mL de ADN desnaturalizado de esperma de salmon a 42°C durante la noche. Las sondas marcadas se anaden luego y la hibridacion se lleva a cabo por incubacion a 42°C durante la noche. Se llevan a cabo lavados posteriores a la hibridacion con diferentes niveles de rigurosidad, incluyendo condiciones de rigurosidad moderada "1x SSC, SDS al 0,1%, 37°C", rigurosidad alta "0,5x SSC, SDS al 0,1%, 42°C" y la rigurosidad mas alta "0.2x SSC, SDS al 0,1%, 65°C". A medida que aumenta la rigurosidad de los lavados posteriores a la hibridacion, se espera aislar polinucleotidos con mayor homologfa con la secuencia de la sonda. Las combinaciones anteriormente descritas de SSC, SDS y condiciones de temperatura son simples ejemplos. Los expertos en la tecnica pueden alcanzar las mismas restricciones que aquellas descritas anteriormente mediante la combinacion apropiada de los factores anteriores o de otros (tal como concentracion de la sonda, longitud de la sonda o perfodo de hibridacion) que afectan la rigurosidad de la hibridacion.
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Los polipeptidos codificados por polinucleotidos aislados usando tales tecnicas de hibridacion usualmente comprenderan secuencias de aminoacidos con alta homologfa con los dominios Fc descritos anteriormente. "Alta homologfa" se refiere a homologfa de secuencia de al menos 40% o mas, preferiblemente 60% o mas, mas preferiblemente 80% o mas, mas preferiblemente 90% o mas, mas preferiblemente al menos 95% o mas y mas preferiblemente al menos 97% o mas (por ejemplo, 98% a 99%). La identidad de secuencia de aminoacidos puede determinarse, por ejemplo, utilizando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87, 2264-2268, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873 - 5877). Se ha desarrollado un programa denominado BLASTX basado en este algoritmo (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-4l0). Cuando se utiliza BLASTX para analizar secuencias de aminoacidos, los parametros son, por ejemplo, una puntuacion de 50 y una longitud de palabra de 3. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parametros por defecto para cada programa. La metodologfa especffica para estos metodos de analisis es bien conocida (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Ademas, las tecnicas para preparar artificialmente variantes del dominio Fc mediante introduccion artificial de mutaciones en los dominios Fc tambien son conocidas por los expertos en la tecnica. Tales variantes del dominio Fc pueden ser preparadas artificialmente, por ejemplo, mediante la introduccion de mutaciones especfficas del sitio o aleatorias en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 por metodos de modificacion genetica, tales como mutagenesis basada en PCR o mutagenesis de casete. Alternativamente, las secuencias con mutaciones introducidas en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 pueden ser sintetizadas usando sintetizadores de acidos nucleicos comercialmente disponibles.
Las estructuras comprendidas por el anticuerpo modificado de la presente invencion pueden no tener ningun oligopeptido espaciador. Sin embargo, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta unida en tandem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos en donde la unidad basica consiste de cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana. Ademas las estructuras contienen preferiblemente oligopeptidos espaciadores. Las combinaciones de glicina y serina se usan a menudo como el espaciador (Journal of Immunology, 162, 6589 (1999)). Como se describe en los Ejemplos, un espaciador que tiene una combinacion de cuatro glicinas y una serina (SEQ ID NO: 48), o un espaciador en el que la secuencia anterior esta unida dos veces (SEQ ID NO: 49) o tres veces (SEQ ID NO: 50) puede ser usado como el espaciador de la presente invencion. Sin embargo, el espaciador no esta limitado a estas secuencias. El espaciador puede tener cualquier estructura siempre y cuando permita el doblado de la region bisagra donde se une el espaciador. Preferiblemente, un espaciador es una secuencia peptfdica que no es facilmente escindida por proteasas o peptidasas. Con respecto a tales secuencias, se puede obtener una secuencia peptfdica deseada, por ejemplo, introduciendo diversas condiciones tales como longitud de secuencia en LINKER (Xue F, Gu Z, y Feng JA, LINKER: un servidor web para generar secuencias peptfdicas con conformacion extendida, Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1; 32 (publicada en el servidor web): W562-5), un programa que ayuda a disenar secuencias de enlazadores. Se puede acceder a LINKER en
http://astro.temple.edu/~feng/Servers/BioinformaticServers.htm.
Cuando se enlazan entre sf multiples secuencias de nucleotidos mediante tecnicas de ingenierfa genetica, uno o varios residuos en la secuencia de aminoacidos en la union a menudo son sustituidos, suprimidos, anadidos y/o insertados, por ejemplo, debido a las secuencias de los sitios de las enzimas de restriccion. Dichas mutaciones son conocidas por aquellos expertos en la tecnica. Tales mutaciones tambien pueden ocurrir cuando las estructuras de la presente invencion son construidas o cuando se enlazan a anticuerpos. Tales mutaciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las uniones entre las regiones V y C, y las uniones entre el extremo terminal C de Fc y el extremo terminal N de las estructuras de la presente invencion (el extremo terminal N de Fc o espaciador). Incluso con tales mutaciones, se incluyen en las estructuras o anticuerpos modificados de la presente invencion siempre y cuando tengan una actividad de union al receptor Fc.
Las estructuras comprendidas por el anticuerpo modificado de la presente invencion pueden mejorar la actividad efectora de un anticuerpo cuando se enlazan al extremo terminal C de la cadena pesada del anticuerpo, en donde la actividad efectora es actividad de ADCC. Un numero arbitrario de estructuras de la presente invencion, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco estructuras, pueden ser enlazadas, sin embargo, se enlazan preferiblemente una o dos estructuras. Por lo tanto, los anticuerpos modificados sobre los cuales se han unido las estructuras de la presente invencion pueden comprender dos o mas dominios Fc arbitrarios, y el numero de dominios Fc en un anticuerpo modificado es dos o tres. En los ejemplos, se confirmo que los anticuerpos modificados en los cuales se han unido dos estructuras de la presente invencion muestran una actividad de ADCC mas fuerte que los anticuerpos modificados en los que se ha unido una estructura de la presente invencion.
No existe limitacion en el tipo de antfgeno que es reconocido por el anticuerpo al cual se unen las estructuras de la presente invencion. El antfgeno puede ser cualquier antfgeno, especfficamente, la region variable de un anticuerpo modificado de la presente invencion puede reconocer cualquier antfgeno. Las regiones variables de cadena H y de cadena L de los anticuerpos modificados usados en los Ejemplos descritos a continuacion son las regiones variables de 1F5, que es un anticuerpo monoclonal de raton contra CD20, un antfgeno de diferenciacion de linfocitos B
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humanos (Documento 14 no de patente). CD20 es una protefna de 297 aminoacidos, y su peso molecular es de 33 a 37 kDa. CD20 esta altamente expresada en linfocitos B. Rituximab, un anticuerpo quimerico contra CD20, es ampliamente utilizado como un agente terapeutico efectivo para linfoma no Hodgkin (Documento 15 no de patente). Los anticuerpos anti-CD20 conocidos incluyen anticuerpos monoclonales de raton B1 y 2H7, ademas de Rituximab y 1F5 (Documento 16 no de patente). Sin embargo, las regiones variables de los anticuerpos modificados de la presente invencion no se limitan a las regiones variables de 1F5. Los dominios Fc estan ffsicamente distantes de los dominios Fab; por lo tanto, se piensa que el tipo de dominio Fab no tiene casi influencia sobre la actividad del dominio Fc. Por lo tanto, las regiones variables de cualquier anticuerpo diferentes a 1F5 pueden ser utilizadas como las regiones variables de los anticuerpos modificados de la presente invencion, y las regiones variables de los anticuerpos dirigidos a cualquier antfgeno diferente de CD20 pueden ser utilizadas como las regiones variables de los anticuerpos modificados de la presente invencion.
Independientemente de la actividad de union al antfgeno, los metodos de la presente invencion pueden aumentar el efecto terapeutico de un anticuerpo mejorando la actividad efectora exhibida por el dominio Fc del anticuerpo. La mejora de la actividad de union a los receptores Fc es requerida para aumentar la actividad efectora, en donde la actividad efectora es actividad de ADCC, de un anticuerpo. En general, la intensidad de la union entre dos moleculas se considera que es como sigue. La intensidad de union entre una molecula de anticuerpo y una molecula del receptor Fc esta representada por: afinidad x valencia de union = avidez. Los anticuerpos IgG naturales tienen un Fc; por lo tanto, la valencia de union es 1 incluso cuando existen muchos receptores Fc en la superficie de las celulas efectoras. Sin embargo, cuando los anticuerpos y antfgenos forman complejos, los complejos inmunes se unen a las celulas efectoras de una forma multivalente. La valencia de union varfa dependiendo de la estructura de los complejos inmunes. Las celulas cancerosas tienen muchos antfgenos en la superficie de la celula; por lo tanto, los anticuerpos se unen a estos antfgenos y se unen a los receptores Fc sobre las celulas efectoras de una forma multivalente. Sin embargo, la densidad de antfgenos en celulas cancerosas es a menudo baja; por lo tanto, los anticuerpos unidos a los antfgenos se unen con menor valencia a los receptores Fc. Por esta razon, la actividad de ADCC no puede ser suficientemente ejercida y el efecto terapeutico es tambien insuficiente (Golay, J. y colaboradores, Blood, 95, 3900, (2000)). Sin embargo, mediante la union en tandem de multiples dominios Fc a una molecula de anticuerpo, es posible la union a receptores Fc de una forma multivalente. Esto mejora la actividad de union entre un anticuerpo y receptores Fc, es decir, la avidez. Ademas, se aumenta la actividad efectora.
La presente invencion tambien proporciona metodos para producir anticuerpos modificados con actividad efectora mejorada. Los metodos de la presente invencion no solamente mejoran la actividad efectora de anticuerpos obtenidos en forma natural y los anticuerpos quimericos existentes, sino que tambien permiten la produccion de nuevos anticuerpos quimericos alterados a partir de una combinacion novedosa de regiones variable y constante del anticuerpo de orfgenes diferentes. Ademas, los anticuerpos modificados tambien pueden comprender una region constante novedosa a partir de la combinacion del dominio CH1 y dos o mas variantes del dominio Fc descritas anteriormente. La secuencia de nucleotidos del dominio CH1 humano se muestra en las posiciones 430 a 720 en la secuencia de nucleotidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3.
Los metodos de la presente invencion pueden llevarse a cabo utilizando una combinacion apropiada de metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por lo tanto, el enlazamiento de las estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana con el extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo se realiza mediante una tecnica de ingenierfa genetica. Un ejemplo de expresion de los anticuerpos modificados de la presente invencion se describe a continuacion, en el que los ADN para las regiones variable y constante de cadena pesada (cadena H) y cadena ligera (cadena L) se preparan y enlazan usando tecnicas de ingenierfa genetica.
Las secuencias de la region variable pueden prepararse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se genera una biblioteca de ADNc a partir de hibridomas que expresan el anticuerpo de interes o celulas introducidas con el gen del anticuerpo, y se clona ADN para la region variable de interes. Una secuencia gufa del anticuerpo L se enlaza secuencia arriba de la region variable de cadena H, VH, y la variable de cadena L, VL, para construir las estructuras de ADN [LVH] y [LVL].
Para la region constante del anticuerpo, primero, se genera una biblioteca de ADNc a partir de celulas de mieloma humano o tejidos linfaticos humanos tales como de amfgdala. Se obtienen fragmentos de ADNc para la region constante de cadena H [CH1-Fc] y para la region constante de cadena L [CL] por amplificacion mediante metodos conocidos de amplificacion de acidos nucleicos tales como reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores disenados con base en las secuencias parciales de los extremos 5' y 3' de las regiones constantes de cadena H y de cadena L. Los fragmentos se insertan luego en vectores y se clonan.
Para la cadena L, se construye la estructura de ADN [LVL-CL] en la cual se enlazan LVL y CL. Como ejemplo, se muestra la secuencia de ADN de la estructura de ADN [LVL-CL] (secuencia gufa, region V de 1F5 y region C de cadena Lk humana) preparada en los Ejemplos en la SEQ ID NO: 1, mientras que la secuencia de aminoacidos codificada por la estructura de ADN se muestra en la SEQ ID NO:2. La cadena H enlazada con una estructura de la presente invencion (cadena H alterada) y la cadena H sin una estructura enlazada de la presente invencion se construyen mediante el procedimiento descrito a continuacion. (i) Se puede construir la estructura de ADN de
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cadena H que tiene una sola Fc (cadena H enlazada sin una estructura de la presente invencion) enlazando la estructura de ADN [LVH] y la estructura del ADN [codon de terminacion del dominio Fc de CH1]. La secuencia de ADN de la estructura de ADN para la cadena H con una sola Fc preparada en los Ejemplos se muestra en la SEQ ID NO: 3, mientras que la secuencia de aminoacidos codificada por la estructura de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 4. (ii) La estructura de ADN de cadena H que tiene dos Fc enlazadas en tandem (cadena H enlazada con una estructura de la presente invencion) puede construirse enlazando entre si la estructura de ADN [LVH], la estructura de ADN [CH1-Fc (sin codon de terminacion)], y la estructura de ADN [espaciador-Fc-codon de terminacion]. Las secuencias de ADN de las estructuras de ADN para la cadena H que tiene dos Fc enlazadas en tandem preparadas en los Ejemplos se muestran en las SEQ ID NOs: 5 (sin espaciador), 7 (con un solo espaciador: GGGGS (representada como G4S; SEQ ID NO: 48)), 9 (con dos G4S como espaciador) y 11 (con tres G4S como espaciador). Las secuencias de aminoacidos codificadas por estas estructuras de ADN se muestran en las SEQ ID NOs: 6 (sin espaciador), 8 (con un G4S como espaciador), 10 (con dos G4S como espaciador) y 12 (con tres G4S como espaciador). (iii) La estructura de ADN de cadena H que tiene tres Fc enlazadas en tandem (cadena H enlazada con dos estructuras de la presente invencion), puede ser construida por enlazamiento de la estructura de ADN [LVH], estructura de ADN [CH1-Fc (sin codon de terminacion)], la estructura de ADN [espaciador-Fc-(sin codon de terminacion)], y la estructura de ADN [espaciador-Fc-codon de terminacion]. Las secuencias de ADN de las estructuras de ADN para la cadena H que tiene tres Fc enlazadas en tandem preparadas en los Ejemplos se muestran en las SEQ ID NOs: 13 (sin espaciador), 15 (con un G4S como espaciador), 17 (con dos G4S como espaciador), y 19 (con tres G4S como espaciador). Las secuencias de aminoacidos codificadas por estas estructuras de ADN se muestran en las SEQ ID NOs: 14 (sin espaciador), 16 (con un G4S como espaciador), 18 (con dos G4S como espaciador), y 20 (con tres G4S como espaciador). (iv) Los constructos de ADN de cadena H que tienen cuatro o mas Fc enlazados en tandem pueden prepararse de forma similar como en el caso con tres Fc, aumentando el numero de la estructura de ADN [espaciador-Fc-(sin codon de terminacion)].
La estructura de ADN de cadena L y la estructura de ADN de alterada de cadena H preparadas como se describio anteriormente se clonan y luego, junto con las regiones reguladoras tales como el promotor y el reforzador, se insertan en vectores de expresion. Alternativamente, se pueden insertar en vectores de expresion que ya tienen regiones reguladoras. Los vectores de expresion que pueden usarse incluyen vectores que tienen el promotor CAG (Gene, 108, 193 (1991)) y el vector pcADN (Immunology and Cell Biology, 75, 515 (1997)). Cualesquiera de los vectores de expresion pueden ser usados siempre y cuando sean compatibles con las celulas huesped que se vayan a utilizar.
Las celulas huesped pueden seleccionarse apropiadamente de aquellas que pueden expresar glicoprotefnas. Tales celulas huesped pueden seleccionarse, por ejemplo, a partir de celulas animales, celulas de insecto, levaduras, y similares. Ejemplos especfficos incluyen celulas CH-DG44 (Cytotechnology, 9, 237 (1992)), celulas COS-1, celulas COS-7, celulas NS0 de mieloma de raton y celulas YB2/0 de mieloma de rata que pueden producir moleculas de anticuerpo que tienen cadenas de azucar que carecen de fucosa, pero las celulas no estan limitadas a las mismas.
Las celulas huesped recombinantes se cultivan y los anticuerpos modificados se purifican a partir de los sobrenadantes del cultivo. Se pueden usar diversos tipos de medios de cultivo para cultivo; sin embargo, los medios libres de suero son convenientes para purificar anticuerpos. Los anticuerpos modificados de interes se purifican a partir de los sobrenadantes de cultivo eliminando fragmentos y agregados de los anticuerpos modificados, y protefnas distintas de los anticuerpos modificados con metodos de purificacion conocidos, tales como cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa hidrofoba, cromatograffa de filtracion en gel, cromatograffa de afinidad con protefna A inmovilizada que tiene actividad de union selectiva a anticuerpos o similares, y cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC).
Si los anticuerpos modificados obtenidos como se ha descrito anteriormente tienen una actividad efectora mejorada, se pueden evaluar por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. La actividad de union a diversos receptores Fc se puede determinar, por ejemplo, mediante tecnicas de anticuerpo enzimatico utilizando los dominios extracelulares de receptores Fc recombinantes. A continuacion se describe un ejemplo especffico. En primer lugar, se producen los dominios extracelulares de FcyRIA, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA como receptores para IgG humana. Las secuencias de estos receptores son conocidas y estan disponibles en GenBank bajo los siguientes Numeros de Acceso: FcyRIA humano: NM_000566, FcyRIIA humano: NM_021642, FcyRIIB humano: NM_001002273, FcyRIIIA humano: NM_000569. Estos receptores se inmovilizan en placas de 96 pozos para tecnicas de anticuerpos enzimaticos. Los anticuerpos modificados con concentraciones variables se hacen reaccionar, y los anticuerpos anti-IgG humanos marcados o similares se hacen reaccionar como un anticuerpo secundario. Las cantidades de anticuerpos modificados unidos a los receptores se miden con base en la senal de la etiqueta. Se conocen variantes geneticas de FcyRIIIA (Journal of Clinical Investigation, 100, 1059 (1997)), y los receptores en los que el aminoacido en posicion 158 es valina o fenilalanina se usan en los Ejemplos de la presente invencion.
La actividad de ADCC de anticuerpos modificados se puede medir utilizando celulas efectoras y objetivo. Por ejemplo, se pueden usar monocitos separados de sangre periferica de individuos sanos como celulas efectoras. Las celulas que expresan el antfgeno CD20, tales como celulas Ramos y celulas Raji, se pueden utilizar como celulas
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objetivo. Despues de que las celulas objetivo se hacen reaccionar con anticuerpos modificados diluidos en forma serial, se anaden las celulas efectoras. La proporcion del numero de celulas efectoras respecto al numero de celulas objetivo puede estar en un intervalo de 10:1 a 100:1 y la proporcion es preferiblemente de 25:1. Cuando las celulas objetivo estan danadas por la actividad de ADCC de los anticuerpos modificados, la lactato deshidrogenasa (LDH) en las celulas se libera en el sobrenadante del cultivo. Por lo tanto, la actividad de ADCC se puede determinar recogiendo la LDH liberada y midiendo su actividad enzimatica. Ya que el anticuerpo modificado de la presente invencion mejora la actividad de ADCC, se usa este ensayo cuando se evalua si el anticuerpo modificado tiene actividad efectora modificada.
En cuanto a la actividad de CDC, se puede evaluar la actividad citotoxica, por ejemplo, haciendo reaccionar las celulas objetivo con anticuerpos modificados diluidos en forma serial y luego anadiendo suero fresco de conejo bebe como fuente de complementos, como se describe en los Ejemplos. Dado que se utiliza suero que contiene LDH, la actividad citotoxica se evalua midiendo el numero de celulas viables usando Alamar Blue o metodos similares.
Los anticuerpos modificados obtenidos por los metodos de la presente invencion no solo mejoran la actividad efectora in vitro descrita anteriormente sino que tambien ejercen el efecto reforzador de la inmunidad celular in vivo con base en una actividad efectora mejorada. Por lo tanto, se piensa que los anticuerpos contribuyen al tratamiento de enfermedades que se puede esperar que sean mejoradas por inmunidad celular. Los anticuerpos modificados de la presente invencion pueden administrarse en una forma de dosificacion apropiada mediante una via de administracion apropiada, dependiendo del tipo de enfermedad, edad del paciente, sfntomas y otros. Ademas, los anticuerpos modificados de la presente invencion pueden formularse mediante metodos de formulacion conocidos y suministrarse como productos farmaceuticos junto con instrucciones que indican la eficacia y los efectos, las precauciones para el uso, y asf sucesivamente. Cuando se formulan, se pueden anadir apropiadamente aditivos adecuados, tales como excipientes, estabilizadores, conservantes, tampones, agentes de suspension, emulsionantes y agentes solubilizantes farmaceuticamente aceptables dependiendo del proposito, para asegurar sus propiedades y calidad. Por ejemplo, los anticuerpos pueden combinarse con Polisorbato 80, cloruro sodico, citrato sodico, acido cftrico anhidro, o como cuando se formulan como inyecciones, preparados con solucion salina fisiologica o solucion de glucosa para inyeccion en el momento del uso, y se administran por infusion intravenosa de goteo o un metodo similar. La dosis se puede ajustar dependiendo de la edad y el peso del paciente, y factores similares. Una dosis unica en dicha infusion intravenosa por goteo es, por ejemplo, de 10 a 10000 mg/m2, preferiblemente de 50 a 5000 mg/m2, y mas preferiblemente de 100 a 1000 mg/m2, pero se limita a estos valores.
Todas las referencias de la tecnica anterior citadas aquf se incorporan por referencia en esta descripcion.
Ejemplos
A continuacion, la presente invencion se describe especfficamente en el contexto de los Ejemplos; sin embargo, no se debe interpretar como limitada a los mismos.
[Ejemplo 1] Construccion del vector de expresion pCAGGS1-neoN-L/anti-CD20 LC (cadena ligera) 1-1. Preparacion del vector pEGFP-N1/VL (Fig. 1-1- A)
El gen de la region VL de IgG2a anti-CD20 de raton se clono mediante el siguiente procedimiento. El hibridoma de raton 1F5 se cultivo usando RPMI-1640 que contiene suero fetal bovino inactivado al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 pg mL estreptomicina (Sigma Aldrich) a 37°C bajo CO2 al 5%, y luego se extrajo el ARN total de las celulas utilizando ISoGeN (NIPPON GENE CO.). Se anadieron 10 pmol de cebador oligo dT (5'- CGAGCTCGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3') (SEQ ID NO: 21)) a 10 pg del ARN total y se ajusto el volumen total a 12 pL anadiendo agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). Despues de dos minutos de incubacion a 72°C para destruir su estructura de orden superior, el ARN se transfirio rapidamente sobre hielo y se incubo durante tres minutos. Se anadio el ARN con 2 pL del regulador de reaccion 10x adjunto (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 pL de DTT 100 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 pL de dNTP 20 mM (Wako Pure Chemical Industries , Ltd.) y 1 pL de 20 U/pL del inhibidor de RNasa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Se ajusto el volumen total a 19 pL con agua tratada con DEPC. Despues de calentar hasta 42°C, se anadio 1 pL de 200 U/pL de ReverscriptII (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y se incubo la mezcla resultante a 42°C durante 50 minutos sin tratamiento adicional. Despues de la reaccion, se anadieron 80 pL de TE (EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)). La mezcla resultante de 100 pL se uso como solucion de ADNc.
Se combinaron sobre hielo 7,8 pL de agua MilliQ esteril, 4 pL del regulador 5x anexo, 2pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 pM (5'TCGTCTAGGCTAGCATTGTTCTCTCCCAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 22) que tiene un sitio NheI (subrayado)), 2 pL de cebador inverso 10 mM (5'-GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTCCcAgCACCGAA- 3' (SEQ ID NO: 23) que tiene un sitio XhoI (subrayado)), 2 pL de ADNc derivado de 1F5 como plantilla, y 0,2 pL de 5 U/pL del Sistema pCr Expand High FidelityPLUS (Roche). La PCR se llevo a cabo bajo las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La solucion de reaccion se sometio a electroforesis utilizando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% (Solana) y se recogio una banda de aproximadamente 0,31 kpb utilizando
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RECOCHIP (TaKaRa Bio Inc.). El fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. El fragmento de ADN se trato con NheI (TOYOBO) y XhoI (TaKaRa Bio Inc.) a las concentraciones finales de 0,8 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente, y se ligo con 50 ng de pEGFP-N1 (BD Biosciences) tratados en la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 (Promega) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a, que habfan sido preparadas por el procedimiento de cloruro de potasio, a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Estas descansaron durante dos minutos sobre hielo, despues de lo cual se anadio 1 mL de medio SOC (Bacto triptona al 2% (BD Biosciences), extracto de levadura Bacto al 0,5% (BD Biosciences), y cloruro de sodio al 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). La mezcla resultante se transfirio a un tubo de ensayo y las bacterias se cultivaron con agitacion a 37°C durante dos horas. Despues de agitar, se sembraron 100 pL de la suspension bacteriana sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de kanamicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado el gen de la region VL, y el vector se denomino pEGFP-N1/VL.
1-2. Preparacion del vector pEGFP-N1/LVL (Fig. 1-1- B)
Se anadio una secuencia grna al gen de VL mediante el siguiente procedimiento. Se combinaron sobre hielo 4 pL del regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 mM (5'- GAGTTT GCTAGCGCCGCCAT GGA
TTTT CAAGT GCAGATTTT CAGCTTCCTGCTAATCAGT GCTTCAGTCATAAT GTCCAGAGGACAAATT GTT CTCTCC CAGTCTCCAGCA-3' (SEQ ID NO: 24) que tiene un sitio NheI (subrayado), la secuencia grna corresponde a las posiciones 13 a 57 en la SeQ ID NO: 24, 2 pL de cebador inverso 10 pM (5'- GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTCCCAGCACCGA A-3' (SEQ ID NO: 25) que tiene un sitio XhoI (subrayado)), 100 ng de pEGFP-N1/VL como plantilla, que ha sido preparado como se describe en (1), y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema PCR Expand High FidelityPLUS. El volumen total se ajusto a 20 pL anadiendo agua MilliQ esteril. La PCR se llevo a cabo bajo las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. Se sometio la disolucion de reaccion a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1%. Se recogio una banda de aproximadamente 0,38 kpb utilizando RECOCHIP. El fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico.
El fragmento de ADN se trato con NheI y XhoI a concentraciones finales de 0,8 y 0,5 U/pL, respectivamente, y se ligo con 50 ng de pEGFP-N1 tratado de la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. A continuacion se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo, despues de lo cual se anadio 1 mL de medio SOC. La mezcla resultante se transfirio a un tubo de ensayo y las bacterias se cultivaron con agitacion a 37°C durante dos horas. Despues de agitar, se sembraron 100 pL de la suspension bacteriana sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de kanamicina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un ADN que tiene el gen de la region VL con una secuencia grna anadida y el vector se denomino pEGFP-N1/LVL.
1-3. Preparacion del vector pEGFP-N1/CL (Fig. 1-1-C)
El gen de la region C de cadena k humana se clono mediante el siguiente procedimiento. El mieloma humano RPMI8226 se cultivo usando RPMI1640 que contema suero fetal bovino inactivado al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina a 37°C bajo CO2 al 5% y luego se extrajo el ARN total de las celulas utilizando ISOGEN. Se anadieron 10 pmol de cebador oligo dT a 10 pg del ARN total y el volumen total se ajusto a 12 pL anadiendo agua tratada con DEPC. Despues de dos minutos de incubacion a 72°C, el ARN se transfirio rapidamente sobre hielo y se incubo durante tres minutos. Se anadio el ARN con 2 pL del regulador de reaccion 10x anexo, 1 pL de DTT 100 mM, 1 pL de dNTP 20 mM y 1 pL de 20 U/pL de inhibidor de RNasa y el volumen total se ajusto a 19 pL con agua tratada con DEPC. Despues de calentar hasta 42°C, se anadio 1 pL de 200 U/pL de ReverscriptII y la mezcla resultante se incubo a 42°C durante 50 minutos sin tratamiento adicional. Despues de la reaccion, se anadieron 80 pL de TE. La mezcla resultante de 100 pL se uso como una solucion de ADNc. Se combinaron sobre hielo 4 pL del regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 pM (5'- ACCTCTAACTCGAGACTGTGGCTGCACCATCTGT-3' (SEQ ID NO: 26) que tiene un sitio XhoI (subrayado)), 2 pL de cebador inverso 10 pM (5'-ACTTGAATTCCTAACACTCT CCCCTGTTGA-3' (SEQ ID NO: 27) que tiene un sitio EcoRI (subrayado)), 2 pL de ADNc derivado de RPMI8226 como plantilla y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema PCR Expand High FidelityPLU . El volumen total se ajusto a 20 pL anadiendo agua MilliQ esteril. La PCR se llevo a cabo bajo las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 30 segundos. La solucion de reaccion se sometio a electroforesis usando y se recogio una banda de aproximadamente 0,32 kpb utilizando RECOCHIP. El fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Esto se trato entonces con XhoI y EcoRI (TOYOBO), ambos a una concentracion final de 0,5 U/pL, y se ligo con 50 ng de pEGFP-
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N1 tratados de la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4a temperature ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se anadio 1 mL de medio SOC. La mezcla resultante se transfirio a un tubo de ensayo y las bacterias se cultivaron con agitacion a 37°C durante dos horas. Despues de agitar, se sembraron 100 pL de la suspension bacteriana sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de kanamicina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado el gen de la region CL y el vector se denomino pEGFP-N1/CL.
1-4. Preparacion del vector pEGFP-N1/Anti-CD20 LC (Fig. 1-1-D)
El gen de cadena L anti-CD20 quimerico de raton/humano (la secuencia de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 2) se construyo mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,7 pg de pEGFP-N1/CL con XhoI y EcoRI, ambos a una concentracion final de 0,5 U/pL. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometio a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% se recogio el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 0,32 kpb utilizando RECOCHIP con considerable cuidado para no contaminarlo con fragmentos del vector. Por separado, se trato el vector pEGFP-N1/LVL con XhoI y EcoRI en las mismas condiciones. Ambos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pEGFP-N1/LVL tratados con las enzimas de restriccion y se ligaron con el gen de la region CL humana extirpada. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se combino con 1 mL de medio SOC. La mezcla resultante se transfirio a un tubo de ensayo y las bacterias se cultivaron con agitacion a 37°C durante dos horas. Despues de agitar, se sembraron 100 pL de la suspension bacteriana sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de kanamicina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un ADN para el gen de la region VL anadido con la secuencia gufa y el gen de la region CL humana, y el vector se denomino pEGFP-N1/Anti-CD20 LC.
1-5. Preparacion del vector pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 LC (Fig. 1-2-E)
El gen de la cadena L anti-CD20 quimerico de raton/humano se transfirio del vector pEGFP-N1 a pcADN3.1/Zeo mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,5 pg de cadena L de pEGFP-N1/Anti-CD20 con NheI y EcoRI a concentraciones finales de 0,8 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 0,70 kpb se recogio utilizando RECOCHIP con considerable cuidado para no contaminarlo con fragmentos de vector. Por separado, el vector pcADN3.1/Zeo (Invitrogen) se trato con NheI y EcoRI bajo las mismas condiciones. Ambos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pcADN3.1/Zeo tratado con las enzimas de restriccion y se ligaron con el gen LC anti-CD20 extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina (Sigma Aldrich). La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un ADN para el gen LC anti - CD20, y el vector se denomino pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 LC.
1-6. Preparacion de pCAGGS1-neoN-L (Fig. 1-2-F)
Se inserto un espaciador en el vector de expresion pCAGGS1-neoN que contenfa el promotor CAG y el gen de resistencia a la neomicina mediante el siguiente procedimiento. PCAGGS1-neoN se trato con SalI a una concentracion final de 0,5 U/mL. El fragmento de ADN resultante se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Por separado, se sintetizaron dos cadenas de ADN (ADN sentido: GTCGACGCTAGCAAGG ATCCTTGAATT CCTTAAGG (SEQ ID NO: 28); ADN antisentido: GTCGACCTTAAGGAATTCAAGGATCCTTGCTAGCG (SEQ ID NO: 29)). Estos ADN se mezclaron juntos a una concentracion final de 1 pM, y el volumen total se ajusto a 10 pL con agua MilliQ. Despues de cinco minutos de calentamiento a 75°C, la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente para enfriarla gradualmente. Se mezclaron 1 pL de esta solucion y se ligo con 50 ng de pCAGGS1-neoN tratado con SalI. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. Se selecciono un vector pCAGGS1-neoN con un espaciador insertado de entre las colonias formadas. El vector resultante se denomino pCAGGS1-neoN-L. Como resultado de la insercion del
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espaciador, se generaron nuevamente dos sitios SalI en pCAGGSI-neoN, y la secuencia de los sitios de la enzima de restriccion se convirtio en 5'-SalI-NheI-BamHI-EcoRI-AflII-SalI-3'.
1- 7. Preparacion del vector pCAGGS1-neoN-L/Anti-CD20 LC (Fig. 1-2-G)
El gen de la cadena L anti-CD20 quimerico de raton/humano se transfirio del vector pcADN3.1/Zeo al vector pCAGGS1-neoN-L mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,5 pg de pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 LC con NheI y AflII (New England Biolabs) a concentraciones finales de 0,8 U/pL y 1,0 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1%, el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 0,70 kpb se recogio utilizando RECOCHIP con considerable cuidado para no contaminarlo con fragmentos del vector. Por separado, pCAGGS1-neoN-L se trato con NheI y AflII bajo las mismas condiciones. Ambos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pCAGGS1-neoN-L tratado con las enzimas de restriccion y se ligo con el gen de la cadena L anti-CD20 extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un ADN para el gen LC anti-CD20, y el vector se denomino pCAGGS1-neoN-L/Anti-CD20 LC.
[Ejemplo 2] Construccion del vector de expresion pCAGGS1-dhfrN-L/anti-CD20 HC (cadena pesada)
2- 1. Preparacion del vector pBluescriptII /VH (Fig. 2-1-A)
El gen de la region VH de IgG2a anti-CD20 de raton se clono mediante el siguiente procedimiento. Se combinaron sobre hielo 7,8 pL de agua Milli-Q esteril, 4 pL del Regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 pM (5'-CACGCGTCGACGCCGCCATGGCCCAGGTGCAACTG-3' (SEQ ID NO: 30) que tiene un sitio SalI (subrayado)), 2 pL del cebador inverso 10 pM (5'-GCGGCCAAGCTTAGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3' (SEQ ID NO: 31) con un sitio HindIII (subrayado)), 2 pL de ADNc derivado de 1F5 como plantilla y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema pCr Expand High FidelityPLU . La PCR se llevo a cabo bajo las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La mezcla de reaccion se sometio a electroforesis utilizando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% y se recogio una banda de aproximadamente 0,36 kpb utilizando RECOCHIP. Este fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. El fragmento de ADN se trato con SalI (TOYOBO) y HindIII (New England Biolabs) a concentraciones finales de 0,5 U/pL y 1,0 U/pL, respectivamente. El fragmento se ligo con 50 ng de pBluescriptII tratado de la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo, se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un ADN para el gen de la region VH y el vector se denomino pBluescriptI I/VH.
2-2. Preparacion del vector pBluescriptII/LVH (Fig. 2-1-B)
Se anadio una secuencia gufa al gen VH mediante el siguiente procedimiento. Se combinaron sobre hielo 4 pL del regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 pM (5'-
CACGCGTCGACGCCGCCATGGGAT
GGAGCTGTATCATCTTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAACTGCGGCAGCCTGGG -3' (SEQ ID NO: 32) que tiene un sitio SalI (subrayado)), 2 pL de cebador inverso 10 pM (5'- GCGGCCAAGCTTAGAGG AGACTGTGAGAGTGGTGC-3' (SEQ ID NO: 33) que tiene un sitio HindIII (subrayado)), 100 ng de pBluescriptII/VH como plantilla y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema PCR Expand High FidelityPLU . El volumen total se ajusto a 20 pL anadiendo agua MilliQ esteril. La PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 12 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La mezcla de reaccion se sometio a electroforesis utilizando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% y se recogio una banda de aproximadamente 0,43 kpb utilizando RECOCHIP. Este fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. El fragmento de ADN se trato con SalI y HindIII a concentraciones finales de 0,5 U/pL y 1,0 U/pL, respectivamente, y se ligo con 50 ng de pBluescriptII tratado de la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues de reposar durante dos minutos sobre hielo, se sembro en placa la mezcla completa sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a
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2- 3. Preparacion del vector pBluescriptII/CH1-CH2-CH3-T (Fig. 2-1-C)
Se clono el gen para la region C de IgG1 humana, a saber, dominio CH1 al dominio CH3 hasta el codon de terminacion (-T), mediante el siguiente procedimiento. El ARN total se extrajo de las celulas de las amfgdalas de un ser humano sano utilizando ISOGEN. Se anadieron 10 pmol de cebador oligo dT a 5 pg del ARN total. El volumen total se ajusto a 12 pL anadiendo agua tratada con DEPC. Despues de dos minutos de incubacion a 72°C, el ARN se transfirio rapidamente sobre hielo y se incubo durante tres minutos. Se anadieron 2 pL del regulador de reaccion 10x adjunto, 1 pL de DTT 100 mM, 1 pL de dNTP 20 mM y 1 pL de inhibidor de RNasa de 20 U/pL y el volumen total se ajusto a 19 pL con agua tratada con DEPC. Despues de calentar hasta 42°C, se anadio 1 pL de 200 U/pL de ReverscriptII y la mezcla resultante se incubo a 42°C durante 50 minutos sin tratamiento adicional. Despues de la reaccion, se anadieron 30 pL de TE. La mezcla resultante de 50 pL se uso como una solucion de ADNc. Se combinaron sobre hielo 4 pL del regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL de cebador directo 10 pM (figura
3- (1)), 2 pL de cebador inverso 10 pM (figura 3-(2)), 2 pL de ADNc derivado de celulas de amfgdalas humanas como plantilla, y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema PCR Expand High FidelityPLUS. Despues de ajustar el volumen total a 20 pL anadiendo agua MilliQ esteril, la PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La mezcla de reaccion se sometio a electroforesis utilizando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% y se recogio una banda de aproximadamente 0,99 kpb utilizando RECOCHIP. Este fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. El fragmento de ADN se trato con HindIII y NotI (New England Biolabs) a concentraciones finales de 1,0 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente, y se ligo con 50 ng de pBluescriptII tratado de la misma . La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro en placa la mezcla completa sobre una placa de medio LB que contenfa 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado el gen de la region C de la IgG1 humana y el vector se denomino pBluescriptII/CH1-CH2-CH3-T.
2-4. Preparacion del vector pBluescriptII/CH1-CH2-CH3 (Fig. 2-1-D), vector pBluescriptII/SP-CH2-CH3-T (Fig. 2-1-E y 2-1-F) y vector pBluescriptII/SP-CH2-CH3 (Fig. 2-1-G)
El gen que cubre el dominio CH1 al dominio CH3 sin el codon de terminacion, el gen que cubre del dominio CH2 al dominio CH3 que contiene el codon bisagra y de terminacion y el gen que cubre del dominio CH2 al dominio CH3 que contiene el codon bisagra pero no de terminacion, que se derivaron de la region C de la IgG1 humana, se clonaron mediante el siguiente procedimiento. Se combinaron sobre hielo 4 pL del regulador 5x adjunto, 2 pL de dNTP 2,5 mM, 2 pL cada uno de cebadores directo e inverso 10 pM, 0,1 pg de pBluescriptII/CH1-CH2-CH3-T como plantilla y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema PCR Expand High FidelityPL S. El volumen total se ajusto a 20 pL anadiendo agua MilliQ esteril. Los trece pares de cebadores utilizados fueron: cebadores mostrados en la Fig. 3-(1) y (7) para amplificar CH1-CH2-CH3; aquellos mostrados en la Fig. 3-(3) a (6) y (2), o (8) a (11) y (2), para amplificar SP-CH2- CH3-T; y aquellos mostrados en la Fig. (3) a (6) y (12) para amplificar SP-CH2-CH3. Los espaciadores utilizados en este estudio fueron espaciadores flexibles de glicina/serina de 0, 5, 10 o 15 residuos de aminoacidos (a.a.), en los que la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total. Sin embargo, el tipo de espaciador no esta particularmente limitado. Se pueden usar cualquiera de los espaciadores peptfdicos convencionales (SP). Tales SP convencionales incluyen, por ejemplo, A (EAAAK) nA (SEQ ID NO: 63), la secuencia en el parentesis es una secuencia de repeticion y n representa el numero de repeticiones; Arai R. y colaboradores, Protein Engineering 14, 529-532 (2001)). La PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: tratamiento termico a 95°C durante diez minutos, seguido de 12 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. Despues de someter la mezcla de reaccion a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% se recogieron los fragmentos de ADN de aproximadamente 0,99 y 0,74 kpb, que cubren del dominio CH1 al dominio CH3 y del dominio CH2 al dominio CH3 que contiene la secuencia peptfdica del espaciador, respectivamente, de las bandas utilizando RECOCHIP. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Los fragmentos de ADN se trataron con las correspondientes enzimas de restriccion (concentraciones finales de 1,0 U/pL de HindIII, 0,75 U/pL de BamHI (TaKaRa Bio Inc.), 0,75 U/pL de XbaI (TaKaRa Bio Inc.) y 0,5 U/pL de NotI), y se ligaron con 50 ng de pBluescriptII tratados de la misma forma. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado un gen de interes de region C y los vectores se denominaron pBluescriptII/CH1-CH2-CH3, pBluescriptII/SP-CH2-CH3-T y pBluescriptII/SP-CH2- CH3.
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2-5. Preparacion del vector pBluescriptll/ Anti-CD20 HC Fc monomero (Fig. 2-1-H)
El gen monomerico de cadena H de Fc anti-CD20 quimerico de raton/humano (la secuencia de ADN se muestra en la SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 4) se construyo mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,5 pg de pBluescriptII/LVH (Fig. 2-1-B) con Sail y Hindlll a concentraciones finales de 0,5 y 1,0 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1%, el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 0,43 kpb se recogio utilizando RECOCHlP con considerable cuidado para no contaminarla con fragmentos del vector. Por separado, el vector pBluescriptll/CH1-CH2-CH3-T (Figura 2-1-C) fue tratado con Sail y Hindlll bajo las mismas condiciones. Ambos fragmentos de ADN fueron purificados mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pBluescriptll/CH1-CH2-CH3-T tratado con las enzimas de restriccion y se ligo con el gen LVH extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo, se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/ mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas dentro de las cuales se ha insertado un ADN para el gen de la region VH con una secuencia gufa anadida y el gen de la region CH1-CH2-CH3-T de cadena H de lgG1 humana, y el vector se denomino pBluescriptll/Anti-CD20 HC Fc monomero.
2-6. Preparacion del vector pBluescriptll/LVH-CH1-CH2-CH3 (Figura 2-1 -l)
Se trataron 0,5 pg de pBluescriptII/LVH (Figura 2-1-B) con Sail y Hindlll a concentraciones finales de 0,5 U/pL y 1,0 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1%, el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 0,43 kpb se recogio utilizando RECOCHlP con considerable cuidado para no contaminarlo con fragmentos del vector. Por separado, el vector pBluescriptll/CH1-CH2-CH3 (Figura 2-1-D) se trato con Sail y Hindlll en las mismas condiciones. Ambos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pBluescriptll/CH1-CH2-CH3 tratado con las enzimas de restriccion y se ligo con el gen LVH extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo, se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellos en los que se ha insertado un ADN para el gen de la region VH con una secuencia gufa anadida y el gen de la region CH1-CH2-CH3 de la cadena H de la lgG1 humana, y el vector se denomino pBluescriptll/LVH- CH1- CH2- CH3.
2-7. Preparacion de un vector pBluescriptll/Anti-CD20 HC Fc dfmero (Fig. 2-2-J)
Se trataron 0,5 pg de pBluescriptII/LVH-CH1-CH2-CH3 (Figura 2-1-l) con Sail y BamHl a concentraciones finales de 0,5 U/pL y 0,75 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis utilizando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% se recogio el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 1,42 kpb utilizando RECOCHlP con considerable cuidado para no contaminarlo con fragmentos del vector. Por separado, se trataron cuatro tipos de vectores pBluescriptll/SP-CH2-CH3-T que son diferentes en la longitud de espaciador de glicina/ serina (Figura 2-1-E) con Sail y BamHl bajo las mismas condiciones. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se combinaron 50 ng de pBluescriptll/SP-CH2-CH3-T tratado con las enzimas de restriccion y se ligaron con el gen LVH-CH1-CH2- CH3 extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. Se selecciono un vector que portaba un ADN insertado que tenia todo el gen de la region VL anadido con la secuencia gufa y los genes para la region CH1-CH2-CH3 de cadena H lgG1 humana y la region CH2-CH3-T que contema el espaciador peptfdico de las colonias formadas. El vector resultante se denomino pBluescriptll/Anti-CD20 HC Fc dfmero. Las secuencias de ADN de la region CH1-CH2-CH3 de la cadena H de lgG1 humana unidas a la region CH2-CH3-T se muestran en las SEQ lD NOs: 5 (0 espaciador), 7 (un espaciador), 9 (dos espaciadores) y 11 (tres espaciadores). Ademas, las secuencias de aminoacidos correspondientes se muestran en las SEQ lD NOs: 6, 8, 10 y 12.
2-8. Preparacion del vector pBluescriptll/SP-CH2-CH3-SP-CH2-CH3-T (Fig. 2-1-K)
Se trataron 0,5 pg de cada uno de los cuatro tipos de vectores pBluescriptII/SP-CH2-CH3-T que son diferentes en la longitud del espaciador de glicina/serina (Fig. 2-1-F) con Xbal y Notl a concentraciones finales de 0,75 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel
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STANDARD 01 de agarosa al 1% se recogio el fragmento del inserto de ADN de aproximadamente 0,74 kpb utilizando RECOCHIP con considerable cuidado para no contaminarla con fragmentos del vector. Por separado, se trataron cuatro tipos de vectores pBluescriptII/ P-CH2-CH3 que son diferentes en la longitud de espaciador de glicina/serina (Fig. 2-1-G) con XbaI y NotI bajo las mismas condiciones. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/ cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pBluescriptII/SP-CH2-CH3 tratado con las enzimas de restriccion y se ligaron con el gen SP-CH2-CH3 extirpado que tenia un espaciador peptidico de la misma longitud. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/ mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se han insertado dos unidades del gen CH2- CH3 que contiene el espaciador peptidico y el vector se denomino pBluescriptII/ SP-CH2-CH3-SP-CH2-CH3-T.
2-9. Preparacion del vector pBluescriptII/Anti-CD20 Cadena H Fc trfmero (Fig. 2-2-L)
Se trataron 0,5 pg de pBluescriptII/LVH-CH1-CH2-CH3 (Figura 2-1-I) con SalI y BamHI a concentraciones finales de 0,5 U/pL y 0,75 U/pL, respectivamente. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis utilizando de agarosa al 1%, STANDARD 01 se recogio el fragmento de inserto de ADN de aproximadamente 1,42 kpb utilizando RECOCHIP con considerable cuidado para no contaminarla con fragmentos del vector. Por separado, se trataron cuatro tipos de vectores pBluescriptII/ SP-CH2-CH3-SP-CH2-CH3-T que son diferentes en la longitud del espaciador de glicina/ serina (Figura 2-1-K) con SalI y BamHI bajo la misma condiciones. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pBluescriptII/SP-CH2-CH3-SP-CH2-CH3-T tratadas con las enzimas de restriccion y se ligaron con el gen LVH- CH1-CH2-CH3 extirpado. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembro toda la mezcla sobre una placa de medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. Se selecciono un vector que portaba un inserto de ADN que tiene el gen de la region VH al cual se le anadio la secuencia gufa, el gen de la region CH1-CH2-CH3 de cadena H de IgG1 humana y dos unidades del gen de la region CH2-CH3 que contema el espaciador peptidico. El vector resultante se denomino pBluescriptII/Anti-CD20 HC Fc trfmero. Las secuencias de ADN de la region CH1-CH2-CH3 de cadena H de IgG1 humana unida a dos unidades de las regiones CH2-CH3-T se muestran en las SEQ ID NOs: 13 (0 espaciador), 15 (un espaciador), 17 (dos espaciadores) y 19 (tres espaciadores). Ademas, las secuencias de aminoacidos correspondientes se muestran en las SEQ ID NOs: 14, 16, 18 y 20.
2-10. Preparacion del vector pcADN3.1/Anti-CD20 HC (Fig. 2-2-M, 2-2-N y 2-2-O)
Se transfirio el gen de la cadena H anti-CD20 quimerico de raton/humano desde el vector pBluescriptII hasta el vector pcADN3.1/Zeo mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,5 pg de cada uno de pBluescriptI I/Anti- CD20 Hc Fc monomero (Fig. 2-1-H), pBluescriptII/Anti-CD20 HC Fc dfmero (Fig. 2-2-J) y pBluescriptII/Anti-CD20 HC Fc trfmero (Fig. 2-2-L) con SalI y NotI, ambos a una concentracion final de 0,5 U/pL. Despues de que toda la mezcla de reaccion se sometiera a electroforesis usando gel de agarosa al 1% SATANDARD 01, se recogieron los fragmentos del inserto de ADN de aproximadamente 1,42 kpb, 2,16 kpb y 2,90 kpb, que cubren al gen Anti-CD20 HC Fc monomero, al gen Anti-CD20 HC Fc dfmero, y al Anti-CD20 He Fc trfmero, respectivamente utilizando RECOCHIP. Por separado, se trato al vector pcADN3.1/Zeo con XhoI y Notl, ambos a una concentracion final de 0,5 U/pL. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pcADN3.1/Zeo tratado con las enzimas de restriccion y se ligaron con los genes Anti-CD20 HC extirpados. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa t4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a las mezclas de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembraron todas las mezclas sobre placas de medio lB que conteman 100 pg/mL de ampicilina. Las placas se incubaron a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado el gen anti-CD20 HC, y los vectores se denominaron pcADN3.1/ Zeo/ Anti-CD20 HC Fc monomero, pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 HC Fc dfmero, y pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 HC Fc trfmero.
2-11. Preparacion del vector pCAGGS1-dhfrN-L (Fig. 2-2-P)
Se inserto un espaciador en pCAGGS1-dhfrN, un vector de expresion que porta al promotor CAG y al gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr), mediante el siguiente procedimiento. Se trato PCAGGS1-dhfrN con SalI a una concentracion final de 0,5 U/mL. Este fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Por separado, se sintetizaron dos cadenas de ADN (ADN sentido: GTCGACGCTAGCAAGGATCCTTGAATTCCTTAAGG (SEQ ID NO: 46), ADN antisentido:
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GTCGACCTTAAGGAATT CAAGGATCCTTGCTAGCG (SEQ ID NO: 47)) y se combinaron a una concentracion final de 1 pM. El volumen total se ajusto a 10 pL con agua MilliQ. Despues de cinco minutos de calentamiento a 75°C, la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente para enfriarla gradualmente. Se mezclo 1 pL de esta solucion y se ligo con 50 ng de pCAGGSI-dhfrN tratado con Sail. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la mezcla de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a un choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues de reposar durante dos minutos sobre hielo, la mezcla completa se sembro en una placa con medio LB que contema 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. Se selecciono un vector pCAGGSI-dhfrN que contema el espaciador como un inserto a partir de las colonias formadas. El vector resultante se denomino pCAGGS1-dhfrN-L. Como resultado de la insercion del espaciador, se generaron recientemente dos sitios Sail en pCAGGS1-dhfrN, y la secuencia de los sitios de enzima de restriccion se convirtio en 5'-SalI-NheI-BamHI-EcoRI-AflII-SalI-3'.
2- 12. Preparacion del vector pCAGGS1 -dhfrN-L/Anti-CD20 HC (Fig. 2-2-Q, 2-2-R y 2-2-S)
Se transfirio el gen de la cadena H anti-CD20 quimerico de raton/humano desde el vector pcADN3.1/Zeo hasta el vector pCAGGS1-dhfrN-L mediante el siguiente procedimiento. Se trataron 0,5 pg de cada uno de pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 HC Fc monomero, pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 HC Fc dfmero, y pcADN3.1/Zeo/Anti-CD20 HC Fc trfmero con NheI y EcoRI a concentraciones finales de 0,8 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente. Despues de que todas las mezclas de reaccion se sometieran a electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1%, se recogieron los fragmentos del inserto de ADN aproximadamente de 1,42, 2,16 y 2,90 kpb, que cubrfan el gen anti- CD20 HC Fc monomero, el gen anti-CD20 HC Fc dfmero y el gen Anti -CD20 HC Fc trfmero, respectivamente, utilizando RECOCHIP. Por separado, se trato el vector pCAGGS1-dhfrN-L con NheI y EcoRI bajo las mismas condiciones. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se mezclaron 50 ng de pCAGGS1-dhfrN-L tratado con las enzimas de restriccion y se ligaron con los genes Anti-CD20 HC extirpados. La ligacion se llevo a cabo utilizando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a las mezclas de reaccion. Despues de reaccionar durante 30 minutos sobre hielo, las celulas se sometieron a choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues se dejo reposar durante dos minutos sobre hielo y se sembraron todas las mezclas sobre placas de medio lB que conteman 100 pg/mL de ampicilina. Las placas se incubaron a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se habfa insertado el gen anti-CD20 HC, y los vectores se denominaron pCAGGS1-dhfrN-L/Anti-CD20 HC Fc monomero (Fig. 2-2-Q), pCAGGS1-dhfrN - L/Anti-CD20 HC Fc dfmero (Fig. 2-2-R) y pCAGGS1-dhfrN-L/ Anti-CD20 HC Fc trfmero (Fig. 2-2-S).
[Ejemplo 3] Seleccion de clones de celulas que expresan un anticuerpo modificado de celulas resistentes a G418 y MTX
3- 1. Produccion de transformantes
El plasmido pCAGGS1-neoN-L/Anti-CD20 LC preparado como se describe en el Ejemplo 1 y el plasmido pCAGGS1- dhfrN-L/Anti-CD20 HC, preparado como se describe en el Ejemplo 2, fueron linealizados usando PvuI (TOYOBO) a una final concentracion de 1,0 U/pL. Las celulas de la lfnea cHo DG44 se sembraron en placa a razon de 3x105 celulas/ pozo en una placa multiple de 6 pozos (FALCON353046) usando IMDM (Sigma Aldrich) suplementado con suero fetal bovino al 10%, hipoxantina 0,1 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Timidina 0,016 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina. Las celulas se cultivaron a 37°C bajo CO2 al 5% durante 24 horas. Se transfectaron nueve lotes de celulas de la lrnea CHO DG44 con 1,35 pg del vector de expresion de cadena L y 1,35 pg de cada uno de los nueve tipos de vectores de expresion de cadena H usando el reactivo de transfeccion Trans Fast (Promega). Las celulas se cultivaron a 37°C bajo CO2 al 5% durante 48 horas. Los nueve tipos de anticuerpos producidos como resultado de la introduccion de estos plasmidos y formas alteradas de los anticuerpos se ilustran esquematicamente en la Fig. 4, donde M, D y T son diagramas esquematicos para Fc monomero, dfmero y trfmero, respectivamente. D y T tambien incluyen formas alteradas que se produjeron para tener diferentes cantidades de espaciadores. Se produjeron D y T que tienen cero, una (SEQ ID NO: 48), dos (SEQ ID NO: 49) o tres (SEQ ID NO: 50) unidades del espaciador, donde la secuencia de glicina- glicina-glicina-glicina-serina (GGGGS) se definio como el espaciador unitario. Los productos respectivos se denominaron D0, D1, D2, D3, T0, T1, T2 y T3 (en lo sucesivo se utilizan las abreviaturas para los nueve tipos de anticuerpos y sus formas alteradas). Despues de que los sobrenadantes de cultivo de las celulas transformadas se desecharan, las celulas se lavaron con PBS y luego se anadio 1 mL de Solucion de Tripsina-EDTA (Sigma Aldrich). Las celulas se incubaron a 37°C durante tres minutos. Despues de confirmar el desprendimiento celular de la placa y la forma esferica, las celulas se suspendieron en medio de seleccion IMDM suplementado con suero fetal bovino al 10%, G418 0,8 mg/mL, metotrexato 500 nM, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina. Las celulas de cada transformante se sembraron en placas y se cultivaron en dos placas multiples de 96 pozos de fondo plano (FALCON353072) a razon de 3x103 celulas/pozo (volumen de medio: 100 pL/ pozo).
3-2. Anti-CD20 y determinacion de las concentraciones
Las concentraciones de anticuerpo en sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante inmunoensayo enzimatico (ELISA). Se diluyo un anticuerpo anti-cadena y humano de cabra (Biosource) a 0,5 pg/mL con PBS. Se tomaron alfcuotas de 50 pL del anticuerpo inmovilizado en una placa de 96 pozos (FALCON353912) y se incubaron a 4° C durante la noche. Se desecho la solucion de anticuerpo y se bloqueo la placa anadiendo 150 pL de solucion 5 de PBS que contenfa BSA al 0,1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e incubando a 37°C durante dos horas. La solucion de bloqueo se descarto y los sobrenadantes del cultivo celular diez veces diluidos con PBS se dividieron en alfcuotas (100 pL) en los pozos correspondientes. La placa se incubo entonces a 37°C durante dos horas. Despues de descartar los medios de cultivo diluidos, los pozos se lavaron tres veces con 100 pL de solucion de PBS que contenfa 0,05% de Tween20 (MP Biomedicals) (PBST). Se diluyo un anticuerpo anti-cadena y humano de cabra 10 marcado con peroxidasa (Sigma Aldrich) hasta 0,5 pg/mL con PBS que contenfa BSA al 0,1%, y luego se dividio en alfcuotas (50 pL) en cada pozo. La placa se incubo a 37°C durante una hora. Despues de descartar la solucion y de lavar los pozos tres veces con PBSt, se anadieron 50 pL de solucion de sustrato (regulador de citrato sodico (pH 5,0) que contenfa dihidrocloruro de o-fenilendiamina al 0,4% (Sigma Aldrich) y 0,003% de H2O2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) se dividio en alfcuotas y se midio A450 con un lector de microplacas (BIO-RAD Modelo 15 550).
3-3. Clonacion celular
Cuatro dfas despues de que los transformantes se sembraron en placas de 96 pozos, se anadieron 100 pL de un medio de seleccion. Una semana despues de la adicion del medio, se determinaron las concentraciones de anticuerpo en sobrenadantes de cultivo mediante el metodo descrito en el Ejemplo 3-2. De 192 pozos, se 20 seleccionaron doce pozos que presentaban altos valores A450 para cada transformante. Estas celulas se tripsinizaron, y luego se combinaron utilizando el medio de seleccion. De nuevo, las celulas se sembraron en placas sobre una placa multiple de 96 pozos a razon de 3 celulas/pozo y dos placas multiples de 96 pozos a razon de 1 celula/pozo, en total tres placas de 96 pozos. Las celulas se cultivaron a 37°C bajo CO2 al 5% (volumen del medio: 100 pL/pozo). Dieciseis dfas despues de la siembra en placa, se seleccionaron pozos con una sola colonia y se 25 determinaron las concentraciones de anticuerpo en los sobrenadantes del cultivo. Se seleccionaron 12 pozos que presentaban un alto valor A450 y se trataron con tripsina. A continuacion, las celulas se sembraron en placas sobre placas multiples de 24 pozos usando el medio de seleccion (volumen de medio: 1 mL pozo). De nuevo, se determinaron las concentraciones del anticuerpo en los sobrenadantes del cultivo cuando las celulas se hicieron crecer hasta confluencia. Se seleccionaron seis pozos que exhibfan un alto valor de A450 y se trataron con tripsina. 30 A continuacion, las celulas se sembraron en placas sobre una placa multiple de 6 pozos (volumen de medio: 4 mL/pozo). De nuevo, se determinaron las concentraciones del anticuerpo en los sobrenadantes del cultivo cuando las celulas crecieron hasta confluencia. Se seleccionaron tres pozos que presentaban un alto valor de A450 y se trataron con tripsina. A continuacion, las celulas se sembraron por separado en placas de 10 cm (FALCON353003) (volumen del medio: 10 mL). De estos, se acondiciono un clon para un medio libre de suero, y los otros dos clones 35 se congelaron y se almacenaron.
3- 4. Acondicionamiento del medio libre de suero
Las celulas cultivadas hasta confluencia en placas de 10 cm se tripsinizaron, y luego se suspendieron 2x106 celulas en 10 mL de un medio mixto que consistfa en 2,5 mL de medio CD CHO (GIBCO) y 7,5 mL de IMMD suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina. Las celulas se sembraron en 40 placas de 10 cm (relacion de mezcla: 25%: 75%). Se asumio que las celulas estaban acondicionadas al medio mixto cuando crecieron hasta confluencia. Posteriormente, se pasaron las celulas mientras se variaba la relacion de mezcla entre el medio CD CHO y el IMDM suplementado con suero fetal bovino al 10% al 50%:50%, 75%:25% y 90%:10% en sucesion.
[Ejemplo 4] Cultivo a gran escala de celulas productoras de anticuerpos y purificacion de anticuerpos expresados
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4- 1. Cultivo a gran escala de celulas productoras de anticuerpos
Las placas que expresan el anticuerpo preparadas como se describe en el Ejemplo 3 se sembraron sobre un total de siete placas de 15 cm a razon de 106 celulas/placa (volumen de medio: 20 mL) usando un medio mixto donde la relacion de mezcla entre medio CD CHO y IMDM suplementado con suero fetal bovino al 10% fue de 90% a 10%. 50 Cuando las celulas se crecieron hasta confluencia, el medio se descarto y se lavaron las celulas tres veces con 20 mL de PBS. A continuacion, se anadieron 30 mL de medio CD CHO y las celulas se cultivaron a 37°C con CO2 al 8% durante diez dfas.
4-2Purificacion de anticuerpos de sobrenadantes de cultivo usando agarosa de protefna A
Los sobrenadantes de cultivo de celulas que expresan anticuerpos se recogieron en cuatro tubos conicos de 50 mL 55 y luego se centrifugaron a 3.000 g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se recogieron en un matraz Erlenmeyer con cuidado de no contaminarlos con los sedimentos. Se equilibro una columna llena con 1 mL de agarosa de
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protefna A (Santa Cruz) con 5 mL de PBS. El sobrenadante del cultivo completo se cargo luego en la columna. La columna se lavo con 5 mL de PBS para eliminar materiales adsorbidos no especfficamente, y despues se eluyo con 3 mL solucion de elucion de glicina 0,1 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)/acido clorhfdrico (pH 2,7). Se recogieron fracciones de 300 pL. Inmediatamente, se anadieron 30 pL de solucion neutralizante (pH 9,0) que consistfa de Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y acido clorhfdrico a las fracciones recolectadas y se mezclaron las soluciones combinadas mediante inversion. Despues de la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y tincion con CBB (BIO-RAD, BIO-Safe Coomassie), la cuantificacion se realizo utilizando Image J (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.), un programa analftico para electroforesis. El resultado mostro que los rendimientos de los nueve tipos de anticuerpos fueron de 2 a 4 pg/mL de medio.
4-3. Etapa de purificacion secundaria usando cromatograffa de filtracion en gel
Los anticuerpos se sometieron a purificacion secundaria utilizando un sistema HPLC (JASCO CO.) con una columna de Protein Pak 300SW (Waters). El caudal de la solucion de elucion (regulador de fosfato 0,1 M (pH 7,0) que contiene cloruro de sodio 0,15 M) fue de 1 mL/min. Una prueba cualitativa de Rituxan (RTX, peso molecular, 145 kDa, Chugai Pharmaceutical Co.) mostro un tiempo de retencion de 7,5 minutos. Con base en este resultado, se inyectaron 100 pL de cada uno de los nueve tipos de anticuerpos (100 pg/mL) por cuadruplicado y se recogieron los picos de las fracciones: M (154 kDa) a un tiempo de retencion de 7,8 min, D0 (208 kDa) a 7,0 min, D1 (154 KDa) a 7,7 min, D2 (154 KDa) a 7,5 min D3 (208 kDa) a 6,7 min, T0 (262 KDa) a 6,5 min, T1 (262 kDa) a 6,3 min, T2 (262 KDa) a 6,2 min, y T3 (262 kDa) a 6,2 min. El volumen de cada anticuerpo recogido fue de aproximadamente 4 mL. Los cromatogramas se muestran en la Fig. 5.
4- 4. Concentracion usando ultrafi ltracion
Se vierte 1 mL de Tween 20 al 5% en unidades de filtro de Amicon Ultra-4 (Millipore) cuyo corte molecular es de 50 KDa. Las unidades se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora. La solucion acuosa de Tween20 se desecho y las unidades de filtro se lavaron tres veces con 1 mL de agua MilliQ. Se cargaron 4 mL de cada una de las soluciones recogidas en la etapa de purificacion secundaria usando filtracion en gel sobre las unidades de filtro. Las unidades se centrifugaron a 3.000 g y 25°C durante 25 minutos. Se recogieron las soluciones que se concentraron hasta aproximadamente 100 pL. Las concentraciones se determinaron mediante HPLC cuantitativa usando RTX como sustancia estandar.
[Ejemplo 5] Analisis estructural de los anticuerpos
5- 1. Analisis SDS-PAGE
Se preparo gel de poliacrilamida al 10% con la siguiente composicion. El gel de separacion se preparo mezclando 1,9 mL de agua MilliQ, 1,7 mL de acrilamida al 30% (acrilamida al 29% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), N, N'- metilen bis acrilamida al 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), 1,3 mL de regulador Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8), 50 pL de SDS al 10% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 50 pL de APS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 3 pL de TEMED (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Esto se vertio inmediatamente en una placa de gel teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Se coloco 0,5 mL de agua MilliQ en la parte superior, y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de la polimerizacion, se desecho el agua Milli-Q colocada. El gel de concentracion se preparo mezclando 1,4 mL de agua MilliQ, 0,25 mL de acrilamida al 30%, 0,33 mL de regulador Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 20 pL de SDS al 10%, 20 pL de APS y 2 pL de TEMED, y esto se vertio en la placa de gel. Se coloco un peine y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos para dejar que el gel se polimerizara. Se ajustaron 300 ng de cada anticuerpo a 10 pL con la solucion de elucion utilizada para HPLC y luego se ajustaron a 20 pL anadiendo regulador de muestra de Laemmli (BIO-RAD) que contenfa 2-mercaptoetanol al 10% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) al mismo. Despues de agitacion tipo vortice, las muestras se trataron termicamente a 95°C durante cinco minutos y se aplicaron en los pozos del gel de acrilamida al 10%. La SDS-PAGE se llevo a cabo a una corriente constante de 0,02 A segun el metodo de Laemmli. La membrana de PVDF (Pall Corporation) se remojo completamente en metanol, y luego se anadio regulador de transferencia (Tris al 0,78%, glicina al 3,6%) de forma que el contenido de metanol fue 20%. El gel despues de la electroforesis se coloco en la parte superior y se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se colocaron dos laminas de papel de filtro embebidas con el regulador de transferencia sobre la celda de transferencia semiseca SD Trans-Blot (BIO-RAD), y la membrana de PVDF y el gel se colocaron sobre el mismo en este orden. Se colocaron otras dos hojas de papel de filtro empapadas con el regulador de transferencia y se llevo a cabo la transferencia tipo Western a una corriente constante de 0,2 A durante 30 minutos. Despues de la transferencia, la membrana de PVDF se sumergio en una solucion de PBST que contenfa leche desnatada al 5% (Snow Brand) y se bloqueo a 4°C durante la noche. La membrana de PVDF se intercalo entre hojas de vinilo y se sumergio en 1 mL de solucion de bloqueo que contenfa 0,13 pg/mL de anti-IgG (H+L) humana de cabra marcada con HRP (Chemicon) y 0,33 pg/mL de anti-cadena Kappa humana de cabra marcada con HPR (Sigma Aldrich) con agitacion a temperatura ambiente durante dos horas. Se retiro la membrana de PVDF de las laminas de vinilo y se agito en PBST durante cinco minutos. Este tratamiento de lavado de la membrana de PVDF se repitio tres veces. La membrana de PVDF se intercalo entre hojas de vinilo y se anadio 1 mL de "reactivos de deteccion Western Blot de ECL y sistema de analisis" (Amersham Biosciences). Una
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pelfcula de rayos X (Kodak) se expuso durante un minuto en una habitacion oscura. La pelfcula se sumergio en solucion RENDOL (Fujifilm) hasta que las bandas pudieron confirmarse, y luego se enjuago con agua del grifo y se fijo con solucion RENFIX (Fujifilm). El resultado se muestra en la figura. 6.
5-2. Analisis por HPLC
Las moleculas de anticuerpo se analizaron por HPLC usando Protein Pak 300SW. Se utilizo una solucion de elucion (regulador fosfato 0,1 M (pH 7,0) que contenfa cloruro de sodio 0,15 M) a una velocidad de 1 mL/min. Se obtuvieron cromatogramas despues de inyectar aproximadamente 600 ng de cada anticuerpo (Figura 7). Los resultados de los analisis de SDS-PAGE y HPLC demostraron que los productos purificados de D0 y D3 tenfan dos de la porcion de bisagra y el dominio Fc enlazados en tandem, mientras que los componentes principales de D1 y D2 eran moleculas con solamente uno de ellos. Mientras tanto, T0 contenfa tres de la porcion de bisagra y el dominio Fc en tandem, mientras que T1, T2 y T3 eran mezclas de moleculas que tenfan tres de estos en tandem y moleculas que solo tenfan dos de estos.
[Ejemplo 6] Ensayo de union de CD20 de anticuerpos usando citometrfa de flujo
Las celulas Ramos de linfoma de Burkitt humano positivas para CD20 se cultivaron usando RPMI1640 que contenfa suero fetal bovino inactivado por calor al 10%, piruvato sodico 1 mM (Wako), 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina a 37°C bajo CO2 al 5%. La solucion de cultivo de celulas Ramos se centrifugo a 600 g durante cinco minutos. Despues de retirar el medio, las celulas se suspendieron en un volumen apropiado de medio. Despues de otra centrifugacion a 600 g durante cinco minutos, se retiro el medio. Se anadieron 5 mL de regulador FACs (PBS que contenfa BSA al 0,1% y NaN3 al 0,02%) para suspender las celulas, y esta se dejo sobre hielo y se bloqueo durante 30 minutos. El sobrenadante se retiro despues de centrifugacion a 600 g durante cinco minutos, se suspendieron las celulas a razon de 5 x 106 celulas/mL en regulador FACS y se tomaron alfcuotas de 100 pL por tubo de 1,5 mL. El anticuerpo anti-CD20 preparado y RTX se anadieron a una concentracion final de 50 nM. Ademas, se anadio Herceptina (HER) (Trastuzumab, 148 kDa, Chugai Pharmaceutical Co.) a una concentracion final de 30 nM, se dejo reposar sobre hielo durante 30 minutos para dejar que los anticuerpos reaccionaran con las celulas, y luego se centrifugo a 600 g durante cinco minutos. Se eliminaron los sobrenadantes y se lavaron las celulas anadiendo 500 pL de regulador FACS. Este proceso se repitio dos veces para eliminar completamente los anticuerpos no reaccionados. Las celulas se suspendieron en 100 pL de regulador FACS que conterna 20 pg/mL de anticuerpo anti-cadena Kappa humana de cabra marcado con FITC (Biosource International) y se dejo reposar sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las celulas se lavaron con el metodo descrito anteriormente, suspendidas en 100 pL de regulador FACS, se filtraron a traves de una malla con un tamano de orificio de 59 pm y se transfirieron a tubos FACS. La actividad de union de CD20 de cada anticuerpo se analizo mediante medicion de fluorescencia utilizando FACScan (Becton Dickinson) (Figura 8).
Todos estos anticuerpos, que comprenden la region variable del anticuerpo anti-CD20 monoclonal de raton 1F5 y una region constante humana, se unen a celulas Ramos. La cantidad de T0, T1, T2, T3, D1, D2 y D3 unidos fue ligeramente mayor que aquella de D0. La cantidad de M unida fue ligeramente inferior a la de D0.
[Ejemplo 7] Ensayo de union de receptor por ELISA usando FcyR recombinante
7-1. Preparacion de FcyR recombinante
(i) Construccion del vector pBluescriptII/Gly-His6-GST
Se inserto una secuencia del gen GST en pBluescriptII mediante el siguiente procedimiento: se combinaron sobre hielo 4 pL del Regulador 5x adjunto, 1,6 pL de dNTP 2,5 mM, 1 pL de cebador directo 10 pM (5'- ATCTATCTAGAGGCC ATCACCATCACCATCACATGTCCCCTATACTAGGTTATTG-3' (SEQ ID NO : 51) que tiene un sitio XbaI (subrayado) y una secuencia Gly-His6 (posiciones 12 a 32 en la SEQ ID NO: 51)) y 1 pL del cebador inverso 10 pM (5'-ATTAAT CAGCGGCCGCTCACGGGGATCCAACAGAT-3' SEQ ID NO: 52) con un sitio NotI (subrayado)) para amplificar la secuencia GST, 100 ng de pGEX-2TK como plantilla y 0,2 pL de 5 U/pL del sistema de PCR Expand High FidelityPLUS. El volumen total se ajusto a 20 pL anadiendo agua MilliQ. La PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95°C durante 2 minutos, seguido de 10 ciclos de tres pasos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La solucion de reaccion se sometio a electroforesis usando un gel STANDARD 01 de agarosa al 1%. Se recogio una banda de aproximadamente 0,70 kpb utilizando RECOCHIP. Este fragmento de ADN se purifico mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. El fragmento de ADN se trato con XbaI y NotI a concentraciones finales de 0,75 U/pL y 0,5 U/pL, respectivamente, y se ligo con 50 ng de pBluescriptII tratado de forma similar a temperatura ambiente durante 30 minutos usando 1,5 U de ADN ligasa T4. Se anadieron 100 pL de celulas competentes de E. coli DH5a a la solucion de reaccion, esta se dejo en hielo durante 30 minutos y se sometio a choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues de dos minutos de incubacion sobre hielo, la cantidad total se coloco sobre una placa de cultivo LB que conterna 100 pg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias
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formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado la secuencia de Gly-His6-GST, y este vector se denomino pBluescriptII/Gly-His6-GST.
(ii) Construccion del vector pBluescriptII/FcYR/Gly-His6-GST
Las secuencias genicas para los dominios extracelulares de cuatro tipos de FcyR, a saber FcyRIA, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, se insertaron en pBluescriptII/Gly-His6-GST mediante el siguiente procedimiento: se combinaron sobre hielo 4 |jL del regulador 5x adjunto, 1,6 ML de dNTP 2,5 mM, 1 jL de cebador directo 10 jM (FcyRIA: 5'- CCCCAAGCTTGCCG CCATGTGGTTCTTGACAACTC-3' (SEQ ID NO: 53) que tiene un sitio HindIII (subrayado), FcyRIIA: 5'-AACAAAAGC JJGCCGCCATGGAGACCCAAATGTCT-3 '(SEQ ID NO: 54) que tiene un sitio HindIII (subrayado); FcyRIIB: 5'-CCCC AAGCTTGCCGCCATGGGAATCCTGTCATTCT-3' (SEQ ID NO: 55) que tiene un sitio HindIII (subrayado); y FcyRIIIA:
5'-ATATGAATTCGCCGCCATGTGGCAGCTGCTC-3' (SEQ ID NO: 56) que tiene un sitio EcoRI (subrayado)) y 1 jL de cebador inverso 10 jM (FcyRIA: 5'-GCGAATCTAGAATGAAACCAGACAGGAG-3' (SEQ ID NO: 57) que tiene un sitio XbaI (subrayado); FcyRIIA: 5'-ACGATTCTAGACATTGGTGAAGAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 58) que tiene un sitio XbaI (subrayado); FcyRIIB: 5'-ACGATTCTAGACATCGGTGAAGAGCTGGG-3' (SEQ ID NO: 59) que tiene un sitio XbaI (subrayado); y FcyRIIIA: 5'-CGGCATCTAGATTGGTACCCAGGTGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 60) que tiene un sitio XbaI (subrayado)) para amplificar la secuencia del dominio extracelular de FcyR, 100 ng de un vector en el cual se ha insertado el gen FcyR de longitud completa como una plantilla, y 0,2 jL de 5 U/jL sistema de PCR Expand High FidelityPLUS El volumen total se ajusto a 20 jL anadiendo agua MilliQ. La PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95°C durante 2 minutos, seguido de 10 ciclos de tres pasos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. La solucion de reaccion se sometio a electroforesis usando un gel STANDARD 01 de agarosa al 1%. Se recogieron bandas de aproximadamente 0,88 kpb, 0,65 kpb, 0,65 kpb y 0,73 kpb para FcyRIA, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA usando RECOCHIP, respectivamente. Estos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/cloroformo y precipitacion con isopropanol. Los fragmentos de ADN para FcyRIA, FcyRIIA y FcyRIIB se trataron con HindIII y XbaI a concentraciones finales de 1,0 U/jL y 0,75 U/jL, respectivamente, mientras que FcyRIIIA se trato con EcoRI y XbaI a concentraciones finales de 0,5 U/jL y 0,75 U/jL, respectivamente, y se ligaron con 50 ng de pBluescriptII/Gly-His6-GST tratado similarmente a temperatura ambiente durante 30 minutos usando 1,5 U de ADN ligasa T4. Se anadieron 100 jL de celulas competentes de E. coli DH5a a la solucion de reaccion, esta se dejo en hielo durante 30 minutos y se sometio a choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues de dos minutos de incubacion sobre hielo, la cantidad total se coloco sobre una placa de cultivo LB que contema 100 jg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se ha insertado el gen para el dominio extracelular de FcyR y el vector se denomino pBluescriptII/FcYR/ Gly-His6-GST.
(iii) Construccion del vector pcADN3.1/Zeo/FcYR/Gly-His6-GST
La secuencia de FcYR/Gly-His6-GST se transfirio desde el vector pBluescriptII al vector pcADN3.1/Zeo mediante el siguiente procedimiento: se trataron 0,5 jg de pBluescriptII/FcYR/Gly-His6-GST con ApaI y NotI, ambos a una concentracion final de 0,5 U/mL. Despues de la electroforesis usando gel STANDARD 01 de agarosa al 1% se recogieron bandas de aproximadamente 1,58 kpb, 1,35 kpb, 1,35 kpb y 1,43 kpb para FcyRIA, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA usando RECOCHIP, respectivamente. Por separado, el vector pcADN3.1/Zeo se trato con ApaI y NotI, ambos a una concentracion final de 0,5 U/jL. Ambos fragmentos de ADN se purificaron mediante extraccion con fenol/ cloroformo y precipitacion con alcohol isopropflico. Se combinaron 50 ng de pcADN3.1/Zeo tratado con enzima de restriccion con el gen de FcYR/Gly-His6-GST extirpado y se llevo a cabo la ligacion usando 1,5 U de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 jL de celulas competentes de E. coli DH5a a la solucion de reaccion, esta se dejo en hielo durante 30 minutos y se sometio a choque termico a 42°C durante 45 segundos. Despues de dos minutos de incubacion sobre hielo, la cantidad total se coloco sobre una placa de cultivo LB que contema 100 jg/mL de ampicilina. La placa se incubo a 37°C durante la noche. A partir de las colonias formadas, se seleccionaron aquellas en las que se habfa insertado el gen FcYR/Gly-His6-GST, y el vector se denomino pcADN3.1/ Zeo/FcYR/Gly-His6-GST.
(iv) Construccion del vector pcADN3.1/Zeo/FcYRIIIA(F)/Gly-His6-GST
El vector pcADN3.1/Zeo/FcYRIIIA/Gly-His6-GST construido en (iii) era un FcyRIIIA de tipo V. El vector pcADN3.1/Zeo/ FcYRIIIA(F)/Gly-His6-GST se preparo por mutagenesis dirigida al sitio utilizando el siguiente procedimiento: se combinaron sobre hielo 2 jL del regulador 10x adjunto, 1,6 jL de dNTP 2,5 mM, 0,5 jL de sentido 10 jM (5'-TCTGC AGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAT-3' (SEQ ID NO: 61) y 0,5 jL de cebador antisentido 10 jM (5'-ATTTTTACTCCCAA AAAGCCCCCTGCAGA-3' (SEQ ID NO: 62)) para mutagenesis, 10 ng de pcADN3.1/ Zeo/FcYRIIIA (157V)/ Gly-His6-GST como plantilla, y 0,4 jL de 2,5 U/jL de Pfu polimerasa. El volumen total se ajusto a 20 jL anadiendo agua MilliQ. La PCR se llevo a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95°C durante 2 minutos, seguido por 14 ciclos de tres pasos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 68°C durante 8 minutos. Despues de la reaccion, se anadieron 0,3 jL de 20 U/jL de DpnI a la solucion de reaccion, y esta se incubo a 37°C durante una hora. Se anadieron 100 jL de celulas competentes de E. coli DH5a a la solucion de reaccion, esta se dejo en hielo durante 30 minutos y se sometio a choque termico a 42°C durante 45
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(v) Transferencia de genes a 293T y cultivo
Se sembraron en placa 1 x 107 celulas de 293T sobre un placa de cultivo de celulas de 150 mm y se cultivaron a 37°C bajo CO2 al 5% durante 24 horas. Las celulas se transfectaron con 48 pg de pcADN3.1/Zeo/FcYR/Gly-His6- GST utilizando reactivo de transfeccion TransFast y se cultivaron a 37°C bajo CO2 al 5% durante 24 horas. El medio se descarto. Las celulas tripsinizadas se suspendieron en 120 mL de medio de seleccion DMDM que contema suero fetal bovino al 10%, 50 pg/mL de zeocina, 10o U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina y se sembraron en placas de cultivo de celulas de 150 mm. Las celulas se cultivaron despues a 37°C bajo CO2 al 5% durante siete dfas.
(vi) Purificacion del receptor Fcy
Los sobrenadantes del cultivo se recogieron en tubos conicos de 50 mL, se centrifugaron a 3000 g durante 20 minutos y se recogieron en un matraz Erlenmeyer teniendo cuidado de no recoger los sedimentos. Se equilibro una columna empacada con 1 mL de agarosa de Ni-NTA cargando 5 mL de regulador de union Native, despues se cargo el sobrenadante de cultivo total. La columna se lavo cargando 5 mL de regulador de lavado Native para eliminar los materiales no adsorbidos especfficamente. A continuacion, se cargo el regulador de elucion Native y se recogieron 400 pL por fraccion. Despues de SDS-PAGE, se realizaron tinciones con BIO-Safe Coomassie y cuantificacion usando Image J, un programa de analisis electroforetico.
7-2. Medicion de la union al receptor Fc
El FcyR preparado (FcyRIA, FcyRIIA, FcyRIIB, FcYRIIIAVal y FcYRIIIAPhe) se ajusto a 4 pg/mL con PBS, se dividio en alfcuotas en placas de 96 pozos a 50 pL por pozo y se dejo en reposo a 4°C durante la noche. Despues se desecharon las soluciones y se anadieron a cada pozo 180 pL de regulador de ensayo de ELISA (BSA al 0,5%, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0,05%, TBS 25 mM (pH 7,4)). Las placas se dejaron reposar y se bloquearon a 37°C durante 2 horas. Se desecharon las soluciones, se anadieron 50 pL de soluciones de anticuerpo diluidas en serie con regulador de ensayo de ELISA a cada pozo y se dejo reaccionar a 37°C durante dos horas. Las soluciones de anticuerpo se descartaron y los pozos se lavaron tres veces con 150 pL de regulador de ensayo de ELISA. 50 pL de regulador de ensayo de ELISA que contema 0,33 pg/mL de anticuerpo de anti-cadena Kappa humana de cabra marcado con HRP en cada pozo y se dejo reposar a 37°C durante una hora. Despues de retirar la solucion de anticuerpo, los pozos se lavaron tres veces con 150 pL de regulador de ensayo de ELISA. Se tomaron alfcuotas de 50 pL de una solucion de sustrato (regulador de citrato de sodio (pH 5,0) que contema diclorhidrato de o- fenilendiamina al o,4% y H2O2 al 0,003%) se dejo reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante diez minutos. A continuacion, se llevaron a cabo mediciones a A450 utilizando un lector de microplacas (Figura 9).
Como se muestra en la Fig. 9-1, todos los anticuerpos teman afinidad comparable por FcyRIA. Ab50, la concentracion de anticuerpo que muestra el 50% del valor maximo de union del anticuerpo, estaba en el intervalo de 0,1 nM a 0,3 nM para todos los anticuerpos modificados.
Como se muestra en la Fig. 9-2, con respecto a FcyRIIA, la intensidad de union de los anticuerpos modificados estaba en el siguiente orden: T1, T2, T3>T0, D3>D0>D1, D2>M. Los trfmeros eran los mas fuertes, los dfmeros eran los siguientes, y M fue el mas debil. El Ab50 de los trfmeros difirio de aquel de M por alrededor de 100 veces. El Ab50 de D3 fue tambien aproximadamente 60 veces menor que aquel de M. Cuando se compararon los trfmeros, se encontro que la actividad de union de T1, T2 y T3, que tienen espaciadores, era mas fuerte que la de T0, que no tiene espaciador. Con los dfmeros tambien, la actividad de D3 fue mas fuerte que aquella de D0. La razon por la que D1 y D2 eran mas debiles es probablemente debida a que habfa mas monomeros que dfmeros contenidos en las muestras.
Como se muestra en la Fig. 9-3, igualmente con respecto a FcyRIIB, las actividades de union al receptor de los anticuerpos modificados estaban en el siguiente orden: trfmeros> dfmeros> M. Con este receptor tambien, T1, T2 y T3, que tienen espaciadores, eran mas fuertes que T0, que no tiene espaciador. No hubo diferencias entre D3 y D0. El Ab50 de T1, T2 y T3 fue de aproximadamente 0,5 nM, mientras que el de D3 fue de aproximadamente 5 nM y aquel de M fue de aproximadamente 50 nM.
Existen variantes geneticas de FcyRIIIA, que son los tipos en los que el aminoacido en la posicion 158 es valina o fenilalanina. Como se muestra en la Fig. 9-4, igualmente con respecto a FcyRIIIAVal, la intensidad de union mostrada fue la siguiente: T1, T2, T3>T0, D3, D0>D2, D1, M (Figura 9-4). El Ab50 de T1, T2 y T3 fue aproximadamente de 0,5 nM; el Ab50 de T0, D3 y D0 fue aproximadamente de 2 nM; y el Ab50 de D1, D2 y M fue aproximadamente de 30
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[Ejemplo 8] Ensayo de actividad ADCC
8-1. Preparacion de celulas efectoras PBMC
Se preparo una suspension de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) como celulas efectoras mediante el siguiente procedimiento: se recogieron 100 mL de sangre de adultos sanos. Se anadieron 80 mL de Dextrano 200000 al 3,5% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y solucion acuosa al 0,9% de cloruro de sodio a 100 mL de la sangre, se mezclo por inversion y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos de modo que la mayor parte de los eritrocitos se precipitaron. Se transfirieron 25 mL del sobrenadante a un tubo conico de 50 mL y se anadio a este 25 mL del medio RPMI1640. La centrifugacion se llevo a cabo a 400 g durante 10 minutos para sedimentar las celulas, despues se desecho el sobrenadante. Se anadieron 20 mL de medio RPMI1640 para resuspender las celulas. La centrifugacion a 400 g durante diez minutos se llevo a cabo nuevamente para sedimentar las celulas, despues se desecho el sobrenadante. Las celulas se suspendieron en 30 mL de medio RPMI1640 y se colocaron sobre 15 mL de Ficoll-Paque Plus (Amersham) teniendo cuidado de no perturbar la interfase. Despues de la centrifugacion a 400 g durante 30 minutos, la capa opaca en forma de banda blanca formada entre el plasma y la solucion de separacion se transfirio a un tubo conico diferente de 50 mL. Se anadieron 20 mL de medio RPMI1640 y se centrifugo a 400 g durante 10 minutos. Despues de confirmar el sedimento, el sobrenadante se desecho. Se anadieron 15 mL de regulador de ensayo de ADCC (RPMI 1640 que no contenfa rojo fenol, suero fetal bovino al 1%, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM (pH 7,2), 100 U/mL penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina), y se repitio la centrifugacion a 400 g durante diez minutos. El sedimento se confirmo y se suspendio a razon de 5 x 106 celulas/mL en regulador de ensayo de ADCC, y se uso como suspension de PBMC.
8-2. Medicion de la actividad de ADCC
Como celulas objetivo, se suspendieron celulas Ramos a razon de 2 x 105 celulas/mL en regulador de ensayo de ADCC, y se dividio en alfcuotas de 50 pL por pozo en placas multiples de 96 pozos de fondo redondo (FALCON 353077) (104 celulas/pozo). Cada anticuerpo se diluyo en serie con regulador de ensayo de ADCC, se anadieron 50 pL a las placas y se incubo a 37°C bajo CO2 al 5% durante 30 minutos. Se anadieron a cada pozo 50 pL de la suspension de PBMC preparada en (1), y se incubo a 37°C con CO2 al 5% durante cuatro horas (2,5 x 105 A 5 celulas/pozo, efector: objetivo = 25:1). La centrifugacion se llevo a cabo a 300 g durante 10 minutos y se transfirieron 50 pL del sobrenadante a una placa de 96 pozos. Se preparo una solucion de reaccion del kit de deteccion citotoxica (Roche) y se dividio en alfcuotas de 50 pL en la placa de 96 pozos. Despues de dejar que reaccionara durante 30 minutos a temperatura ambiente, se midio la absorbancia a 450 nm. Basandose en la A450 obtenida, el calculo se llevo a cabo utilizando la siguiente formula: "citotoxicidad (%) = 100 x (muestra de ensayo - control objetivo - control efector)/(control de Tween al 2% - control objetivo)". El control objetivo es una muestra a la que se le anadio regulador de ensayo de ADCC en lugar de la etapa de adicion de las celulas efectoras. El control efector es una muestra a la que se le anadio regulador de ensayo de ADCC en lugar de la etapa de adicion de las celulas objetivo.
Como se muestra en la Fig. 10, T1, T2 y T3 exhibieron la actividad mas fuerte de ADCC, y T0 y D3 vinieron a continuacion. D1, D2 y M exhibieron solo una actividad debil de muerte celular, incluso a la concentracion de anticuerpos mas alta. El Trastuzumab, que no se une a las celulas objetivo, no mostro citotoxicidad.
[Ejemplo 9] Ensayo de actividad de CDC
Para usar como celulas objetivo, se cultivaron celulas Ramos de linfoma de Burkitt humano positivas para CD20 en RPMI1640 que contenfa suero fetal bovino al 10% inactivado por calor, piruvato sodico 1 mM, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina a 37°C bajo CO2 al 5%. Las celulas Ramos se lavaron con regulador RHB (RPMI 1640 (Sigma Aldrich) que no contenfa rojo fenol, HEPES 20 mM (pH 7,2) (Dojindo Laboratories)), L-glutamina 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), BSA al 0,1% 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina), ajustado a 106 celulas/mL y se dividio en alfcuotas de 50 pL sobre una placa multiple de 96 pozos de fondo plano (5 x 104 celulas/pozo). Se anadieron 50 pL de anticuerpos diluidos en serie con regulador RHB y 50 pL de suero fresco de conejo bebe (Cedarlane Laboratories) 12 veces diluido tambien con regulador RHB y se incubaron a 37°C bajo CO2 al 5% durante dos horas. Se anadieron 50 pL de Alamar Blue (AccuMed International) a cada pozo y se incubo a 37°C bajo CO2 al 5% durante la noche. Al dfa siguiente, se retiro la cubierta de la placa y, utilizando un lector de placa de fluorescencia (CYTOFLUOR Series 4000, PerSeptive Biosystems), se irradio una luz de excitacion de 530 nm y se midio la fluorescencia a 590 nm. A partir de los datos obtenidos como RFU (Unidad Relativa de Fluorescencia), los calculos se llevaron a cabo de acuerdo con la siguiente formula: citotoxicidad (%) = 100 x (RFU de fondo - RFU de la muestra de prueba)/RFU de fondo. La RFU de fondo corresponde la RFU obtenida a partir de un pozo en el cual se anadio regulador RHB en lugar de anticuerpos en la etapa de adicion de los anticuerpos.
Claims (10)
- I. Un metodo para mejorar una actividad efectora de un anticuerpo, en donde una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan enlazadas en tandem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo por una tecnica de ingenierfa genetica, en donde la actividad efectora es actividad de5 citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), siempre y cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana este enlazada en tandem al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de amino acidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de la IgG1 humana.10 2. Un metodo para producir un anticuerpo modificado con actividad efectora mejorada, en donde una o masestructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan enlazadas en tandem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo por una Tecnica de ingenierfa genetica, en donde la actividad efectora es actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), con la condicion de que cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana este enlazada en tandem al extremo del terminal C 15 de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana.
- 3. Un metodo para producir un anticuerpo modificado con actividad efectora mejorada, en donde la actividad efectora es actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad de ADCC), que comprende las 20 tapas de:(a) expresar un polinucleotido que codifica una cadena ligera y un polinucleotido que codifica una cadena pesada alterada en donde una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humana estan enlazadas en tandem al extremo del terminal C de una cadena pesada de anticuerpo,siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta enlazada en tandem 25 al extremo terminal C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste en cuatro glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana; y(b) recoger los productos de expresion de los polinucleotidos.30 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las estructuras comprenden un polipeptidoespaciador en el lado N-terminal del dominio Fc de la IgG1 humana.
- 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el numero de estructuras es dos.
- 6. El metodo de la reivindicacion 4 o 5, en donde el polipeptido espaciador de acuerdo con la reivindicacion 4 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 48, 49 y 50.35 7. Un anticuerpo modificado, en donde una o mas estructuras que comprenden un dominio Fc de IgG1 humanaestan enlazadas en tandem al extremo terminal C de una cadena pesada de anticuerpo, siempre y cuando, cuando una estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana esta enlazada en tandem al extremo C de dicha cadena pesada de anticuerpo, dicha estructura que comprende un dominio Fc de IgG1 humana comprende un espaciador flexible de glicina/serina de 15 residuos de aminoacidos, en donde la unidad basica consiste de cuatro 40 glicinas y una serina, cinco aminoacidos en total, en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana.
- 8. El anticuerpo modificado de la reivindicacion 7, en donde las estructuras comprenden un polipeptido espaciador en el lado N-terminal del dominio Fc de IgG1 humana.
- 9. El anticuerpo modificado de la reivindicacion 7 u 8, en donde el numero de estructuras es dos.
- 10. El anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde el polipeptido espaciador de 45 acuerdo con la reivindicacion 8 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 48, 49 y 50.II. El anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para uso en medicina
- 12. El anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para uso en un metodo para tratar cancer.
- 13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicho espaciador de 15 residuos de aminoacidos es GGGGSGGGGSGGGGS.
- 14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo contra el antfgeno CD20 de diferenciacion especffico de celulas B.5 15. El anticuerpo modificado de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es un anticuerpo contra el antfgenoCD20 de diferenciacion especffico de celulas B.
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