ES2846748T3 - Regiones constantes de cadenas pesadas con unión reducida a receptores Fc gamma - Google Patents

Abstract

Una cadena pesada de inmunoglobulina IgG4 humana que comprende una región constante, en donde las posiciones 233-236 dentro de un dominio de bisagra son G, G, G y desocupada; G, G, desocupada y desocupada; G, desocupada, desocupada y desocupada; o todas desocupadas, con posiciones numeradas mediante la numeración de EU.

Description

DESCRIPCIÓN

Regiones constantes de cadenas pesadas con unión reducida a receptores Fc gamma

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería de proteínas recombinantes y se refiere a variantes de bisagra optimizadas de proteínas de inmunoglobulina (Ig), métodos de ingeniería tales como variantes de Ig e idoneidad de tales variantes de Ig en la práctica farmacéutica.

Antecedentes

Los anticuerpos de la clase IgG son agentes terapéuticos atractivos. Las IgG existen como cuatro subclases en seres humanos, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. La región constante de cadena pesada (CH; del inglés, Heavy Chain) comprende tres dominios, CH1, CH2, CH3 y una bisagra que une CH1 y CH2. Aunque el papel de cada subclase parece variar entre especies, el dominio constante de cadena pesada es responsable de diversas funciones efectoras biológicas. Las subclases de IgG humana median varias respuestas inmunitarias celulares a través de su interacción con F cy (FcyRs), tal como la destrucción celular (en inglés, cell killing), fagocitosis y opsonización. Tal interacción implica la unión de al menos los dominios CH2 y CH3 de una región constante de cadena pesada a un F cy sobre la superficie de una célula efectora, tal como un linfocito citolítico natural, un macrófago activado o similar. La lisis mediada por el complemento puede desencadenarse por la interacción de la región Fc con diversos componentes del complemento.

Las funciones efectoras son útiles en algunas terapias con anticuerpos, tales como el tratamiento de algunos cánceres o patógenos, en los que la función efectora es responsable principal o al menos parcialmente de destruir las células cancerosas o el patógeno. Sin embargo, otras terapias con anticuerpos están mediadas entera o predominantemente por mecanismos independientes de efectores, tales como inhibiendo una interacción receptor-ligando o agonizando un receptor. En tales terapias, las funciones efectoras de anticuerpos sirven poco o no tienen un fin útil, pero pueden dar como resultado una inflamación indeseada. En tales circunstancias, puede ser ventajoso diseñar las propiedades de unión del receptor Fc de un anticuerpo de manera que se inhiben algunos o todos los mecanismos efectores disponibles, sin afectar sustancialmente las propiedades farmacocinéticas del anticuerpo, inmunogenicidad y especificidad y afinidad de las regiones variables.

Las regiones constantes de cadenas pesadas de IgG se han mutado en diversas posiciones para probar el efecto de los aminoácidos en la interacción IgG/FcYR (véanse, por ejemplo, Canfield y Morrison, J Exp Med 73, 1483-1491 (1991); Chappel et al. JS C 268(33), 25124-31 (1993); y Armour et al., Eur. J . Immunol. 29, 2613-24 (1999)). Se han propuesto diversos restos de aminoácidos en la región bisagra y en el dominio CH2 de una región constante de cadena pesada como mediadores de la unión a receptores F cy (véase Sarmay et al., Mol Immunol 29, 633-9 (1992); Greenwood et al., Eur. J . Immunol, 23(5), 1098 (1993), Morgan et al., Immunology 86, 319 (1995), Stevenson, Chemical Immunology, 65, 57-72 (1997)). La glicosilación de un sitio (N297) en el dominio CH2 y las variaciones en la composición de sus carbohidratos también afectan fuertemente la interacción IgG/FcYR (Stevenson, Chemical Immunology, 65, 57-72 (1997); Siberil et al., Immunol. Ltrs. 106, 111-118 (2006)).

Los residuos de alanina normalmente han sido el sustituyente preferido para reemplazar un aminoácido natural por uno no natural para reducir la función, debido a que la alanina tiene una cadena lateral sin grupos funcionales. Por ejemplo, la técnica bien conocida de mutagénesis de exploración de alanina reemplaza sistemáticamente cada residuo natural en una proteína o dominio de proteínas con alanina para identificar qué residuos naturales contribuyen principalmente a la función. Reemplazar un aminoácido con un grupo funcional con alanina elimina el grupo funcional y su contribución a la unión a cualquier receptor, pero la presencia de la cadena lateral de alanina conserva sustancialmente la conformación, reduciendo el potencial de inmunogenicidad u otras complejidades debido a cambios conformacionales. Una estrategia alternativa reemplaza aminoácidos en la región bisagra de un isotipo IgG con los aminoácidos correspondientes del isotipo IgG2 humano, de manera que se reduce la unión de F cyR sin cambios conformacionales inaceptables e inmunogenicidad consecuente. Los anticuerpos resultantes que contienen Fc quiméricos incluyen una sustitución de EFLG en las posiciones 232-236 con PVA (véase el documento WO14/121087).

El documento WO 2014/121087 A1 se refiere a anticuerpos que comprenden dominios constantes quiméricos. Hezareh et al. 2001 (Journal of Virology 75.24: 12161-12168) se refiere a las actividades de la función efectora de un panel de mutantes de un anticuerpo ampliamente neutralizante contra el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1.

Sumario de la invención reivindicada

La invención proporciona una cadena pesada de inmunoglobulina IgG4 humana que comprende una región constante, en donde las posiciones 233-236 dentro de un dominio de bisagra son G, G, G y desocupada; G, G, desocupada y desocupada; G, desocupada, desocupada y desocupada; o todas desocupadas, con posiciones numeradas mediante la numeración de EU. Opcionalmente, las posiciones 226-229 son CPPC. Opcionalmente, a secuencia de aminoácidos del dominio de bisagra comprende CPPCPAPG G G -G PSVF (SEQ ID NO: 1), CPPCPAPG G--G PSVF (SEQ ID NO: 2), CPPCPA PG —G PSV F (SEQ ID NO: 3) o CPPCPAP-G PSVF (SEQ ID NO: 4). Opcionalmente, la región constante tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8 o una variante de las mismas que tiene hasta cinco deleciones, sustituciones o inserciones. Opcionalmente, la región constante comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8. Opcionalmente, la región constante consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8. Opcionalmente, la región constante tiene un dominio CH3 modificado para reducir la unión a la proteína A. Opcionalmente, la cadena pesada de inmunoglobulina puede unirse en el extremo N a una región variable de cadena pesada. Opcionalmente, la cadena pesada de inmunoglobulina se duplica con una cadena ligera de inmunoglobulina. Opcionalmente, la cadena pesada de inmunoglobulina se duplica con una cadena ligera de inmunoglobulina como un heterodímero que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras. Las dos cadenas pesadas pueden ser iguales o diferentes. Opcionalmente, la cadena pesada de inmunoglobulina se puede unir en el extremo N a un polipéptido de unión. Opcionalmente, la cadena pesada de inmunoglobulina se une a través de un enlazador al polipéptido de unión. Opcionalmente, el polipéptido de unión es un dominio extracelular.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la correspondencia de los esquemas de numeración en la región bisagra de las IgG1, IgG2 y IgG4 humanas.

Las Figs. 2-4 muestran las secuencias de tipo silvestre de las regiones constantes de cadenas pesadas de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 con delimitación en las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3.

La Fig. 5 es un esquema que muestra los formatos de reemplazo GGG-(233-236), GG--(233-236, G—(233-236) y no_G(233-236) de bisagra modificada ilustrativos comparados con una región constante de cadena pesada quimérica descrita anteriormente, todos del isotipo IgG4 humano.

Las Figs. 6-10 muestran la unión de diversos anticuerpos de bisagra modificada del isotipo IgG4 humano (y anticuerpo de isotipo IgG1 de tipo silvestre) a F cyRI, F cyRIIA, F cyRIIB, F cyRIIIA y FcRn humanos.

La Fig. 11A muestra los anticuerpos de bisagra modificada (como se recuperaron de los sobrenadantes de cultivos celulares) que son incapaces de reclutar linfocitos T humanos para lisar células U937, que portan F cyRI y F cyRIIA. La Fig. 11B muestra anticuerpos de bisagra modificada, que se han purificado completamente y que son incapaces de reclutar linfocitos T humanos para lisar células U937 que portan F cyRI y F cyRIIA.

Las Figs. 12A-D muestran que diversos anticuerpos de bisagra modificada no muestran activación significativa de las células Jurkat con un marcador de luciferasa cuando la activación depende del anclaje del anticuerpo a las células HEK transformadas con F cyRIIA (Fig. 12A, Fig. 12B) o RIIB (Fig. 12C, Fig. 12D). La activación por el anticuerpo de control positivo en la Fig. 12A y la Fig. 12C se reduce enormemente en competición con un anticuerpo bloqueante, como en la Fig. 12B y Fig. 12D.

La Fig. 13 muestra anticuerpos de bisagra modificada que activan células Jurkat con un marcador de luciferasa cuando los anticuerpos se anclan a una superficie de placa en lugar de mediante un intento de unión a un receptor F cyRIIA o RIIB sobre las células HEK.

La Fig. 14 muestra anticuerpos de bisagra modificada que tienen regiones variables que se unen a CD20 presentan una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC; del inglés, Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) reducida en presencia de células NK diseñadas para expresar el alelo V de mayor afinidad de FcYRIIIa y células Daudi que expresan CD20.

Definiciones

Los anticuerpos o las proteínas de fusión se proporcionan típicamente en forma aislada. Esto significa que un anticuerpo o proteína de fusión está normalmente al menos un 50% p/p puro(a) de proteínas interferentes y otros contaminantes que surgen de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que un anticuerpo o proteína de fusión se combine con un exceso de excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) u otro vehículo destinado a facilitar su uso. A veces, los anticuerpos o proteínas de fusión son al menos un 60, 70, 80, 90, 95 o 99% p/p puros de proteínas interferentes y contaminantes a partir de la producción o purificación. A menudo, un anticuerpo o proteína de fusión es la especie macromolecular predominante que queda después de su purificación.

Una unidad estructural básica de anticuerpo es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente unida a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal a veces se denomina región variable madura. Por tanto, por ejemplo, una región variable madura de cadena ligera significa una región variable de cadena ligera sin el péptido señal de cadena ligera. Sin embargo, una referencia a una región variable no significa que una secuencia señal esté necesariamente presente; y de hecho, las secuencias señal se escinden una vez los anticuerpos o proteínas de fusión descritos en el presente documento se han expresado y secretado. Un par de regiones variables de cadena ligera y pesada define una región de unión de un anticuerpo. La porción carboxilo terminal de las cadenas ligera y pesada define respectivamente las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas. La región constante de cadena pesada es la principal responsable de la función efectora. En los anticuerpos IgG, la región constante de cadena pesada se divide en las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3. En IgA, la región constante pesada se divide en CH1, CH2 y CH3. La región CH1 se une a la región constante de cadena ligera mediante enlaces disulfuro y no covalentes. La región bisagra proporciona flexibilidad entre las regiones de unión y efectoras de un anticuerpo y también proporciona sitios para el enlace disulfuro intermolecular entre las dos regiones constantes de las cadenas pesadas. Las regiones CH2 y CH3 son el sitio primario de las funciones efectoras y la unión de FcRn.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como y , mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por un segmento "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada un segmento "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Véase, en líneas generales, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, Nueva York, 1989), cap.

7).

Las regiones variables maduras de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión a anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión, es decir, es divalente. En anticuerpos naturales, los sitios de unión son los mismos. Sin embargo, pueden fabricarse anticuerpos biespecíficos en los que los dos sitios de unión son diferentes (véanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). Todas las regiones variables muestran la misma estructura general de regiones marco (FR ) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (secuencias de proteínas de interés biológico) (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, (1987 y 1991)) o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat también proporciona una convención de numeración ampliamente utilizada (numeración de Kabat) en la que se asigna el mismo número a los restos correspondientes entre diferentes regiones variables de la cadena pesada o entre diferentes regiones variables de la cadena ligera. Aunque la numeración de Kabat se puede utilizar para las regiones constantes de anticuerpos, se usa habitualmente el índice de EU, como es el caso de la presente solicitud.

Un anticuerpo o proteína de fusión descritos en el presente documento es monoespecífico si todas sus regiones de unión a antígeno (o ligando) tienen la misma especificidad. Un anticuerpo o proteína de fusión es multiespecífico si sus regiones de unión a antígeno incluyen al menos dos especificidades diferentes.

Una bisagra es una región de restos de aminoácidos consecutivos que conectan el extremo C del dominio C ^h1 al extremo N del dominio C ^h2 de una inmunoglobulina. En las IgG1, IgG2 y IgG4 humanas, la región bisagra va desde el resto 216 al 236 según la numeración de EU. Los restos 231-236 forman una bisagra inferior y los restos 216 a 230 forman una bisagra superior e intermedia (o núcleo). La demarcación entre superior y media varía según el isotipo. Las bisagras superior y media de IgG1, IgG2 e IgG4 son 12-15 aminoácidos consecutivos codificados por un exón de bisagra distinto. La bisagra inferior incluye diversos aminoácidos N-terminales del dominio C ^h2 (codificado por el exón C ^h2) (Brekke et al. Immunology Today 16(2): 85-90 (1995)). IgG3 comprende una región bisagra que consiste en cuatro segmentos: un segmento superior que se asemeja a la región bisagra de IgG1 y 3 segmentos que son repeticiones idénticas de aminoácidos exclusivas de IgG3.

El término "anticuerpo" incluye cualquier forma de anticuerpo con al menos una región de unión que incluye fragmentos monovalentes, unidades tetraméricas divalentes de dos cadenas pesadas y cadenas ligeras y complejos de orden superior de cualquiera de estas. Un anticuerpo puede ser monoespecífico, en cuyo caso todas las regiones de unión tienen la misma especificidad o son multiespecíficas en las que los sitios de unión tienen al menos dos especificidades. Los fragmentos de anticuerpos normalmente incluyen una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada y pueden incluir también una región variable de cadena ligera. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede incluir desde el extremo N al extremo C una región variable de cadena ligera, un espaciador peptídico, una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada descritas en el presente documento. Otro fragmento incluye una región variable de cadena pesada (la región de unión) y una región constante de cadena pesada y sin cadena ligera (es decir, un Dab o nanocuerpo). Asimismo, una proteína de fusión incluye una unidad de proteína de fusión monomérica o dimérica o complejos de orden superior.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo resultante de la propagación de un solo clon que consiste esencialmente en las mismas moléculas de anticuerpo. Pueden existir diferencias menores resultantes de mutaciones espontáneas que surgen en el cultivo o el procesamiento postraduccional. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única por un epítopo particular. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo monoclonal de ratón o murino" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de unión única que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal murina o de ratón.

Un anticuerpo multiespecífico comprende normalmente múltiples dominios variables diferentes (dos en el caso de un anticuerpo biespecífico), en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente sobre el mismo antígeno. Los formatos biespecíficos ilustrativos que se pueden usar con regiones constantes desveladas incluyen, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, "botón en ojal" (en inglés, knobs-into-holes), cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al., 2012, "mAbs" 4:6, 1-11 y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde los aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal se utilizan para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que a continuación, se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al. 2013, J . Am. Chem. Soc. 9; 135(1):340-6 [Epub: 21 de diciembre, 2012]). Otro formato multiespecífico ilustrativo que puede utilizarse con las regiones constantes desveladas incluye un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una molécula diana y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una proteína efectora de interiorización, en donde tales segundos dominios de unión a antígeno son capaces de activar e interiorizar la proteína efectora, por ejemplo, un receptor. (Véase el documento US 2013/0243775A1).

La unión se refiere a una interacción entre un mínimo de dos entidades o estructuras moleculares, tales como una interacción anticuerpo-antígeno o una proteína que contiene Fc para un F cyR (en donde la proteína que contiene Fc es un anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína de fusión de Fc, por ejemplo, fusión de receptor-Fc). Por ejemplo, la afinidad de unión corresponde normalmente a un valor K^d de aproximadamente 10'7 M o inferior, tal como aproximadamente 10'8 M o inferior, tal como aproximadamente 10'9 M o inferior cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR ) en un instrumento BIAcore 3000 que utiliza el antígeno o FcR como ligando y anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína que contiene Fc como analito (o antiligando). Por consiguiente, un anticuerpo u otra proteína de fusión se une al antígeno o receptor diana predeterminado con una afinidad correspondiente a un valor K^d que es al menos diez veces inferior, tal como al menos 100 veces inferior, por ejemplo al menos 1.000 veces inferior, tal como al menos 10.000 veces inferior, por ejemplo, al menos 100.000 veces inferior que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína). Existe una relación inversa entre K^d y afinidad de unión, por tanto, cuanto menor es el valor K^d, mayor es la afinidad. Por tanto, la expresión "menor afinidad" se refiere a una menor capacidad para formar una interacción y por tanto, a un mayor valor de K^d .

Un epítopo es un determinante antigénico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie tales como cadenas laterales de aminoácidos o de azúcares y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero, pero no al segundo, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender restos de aminoácidos directamente implicados en la unión (también llamado componente inmunodominante del epítopo) y otros restos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como restos de aminoácidos que se bloquean eficazmente mediante la unión del péptido de unión a antígeno específico (en otras palabras, el resto de aminoácido está dentro de la huella del péptido de unión a antígeno específico).

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado genéticamente en el que las CDR de un anticuerpo "donante" no humano se injertan en secuencias de anticuerpo "aceptor" humano (véase, por ejemplo, Queen, documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter, documento US 5.225.539, Carter, documento Us 6.407.213, Adair, documentos US 5.859.205 6.881.557, Foote, documento US 6.881.557). Las secuencias de anticuerpos aceptores pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpos humanos maduros, un compuesto de dichas secuencias, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos o una secuencia de región de la línea germinal. Por tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene algunas o todas las CDR total o sustancialmente de un anticuerpo donante y secuencias marco de región variable y regiones constantes, si está presente, total o sustancialmente a partir de secuencias de anticuerpos humanos. De manera similar, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y normalmente las tres c Dr total o sustancialmente de una cadena pesada de anticuerpo donante, y una secuencia marco de la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada, si está presente, sustancialmente de un marco de la región variable de cadena pesada humana y secuencias de la región constante. De manera similar, una cadena ligera humanizada tiene al menos una, dos y normalmente las tres CDR total o sustancialmente de una cadena ligera de anticuerpo donante, y una secuencia marco de la región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, si está presente, sustancialmente a partir del marco de la región variable de cadena ligera humana y de las secuencias de la región constante. Aparte de nanocuerpos y dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos un 85 %, 90 %, 95 % o el 100 % de los restos correspondientes (según la definición de Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. Las secuencias marco conservadas de la región variable de una cadena de anticuerpo o la región constante de una cadena de anticuerpo son sustancialmente de una secuencia marco conservada de la región variable humana o de una región constante humana respectivamente cuando al menos un 85, 90, 95 o 100 % de los restos correspondientes definidos por Kabat son idénticos.

Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferentemente según la definición de Kabat) de un anticuerpo de ratón, también se pueden hacer con menos de todas las CDR (por ejemplo, al menos 3, 4 o 5 CDR de un anticuerpo de ratón) (por ejemplo, Pascalis et al., J . Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un ratón) se combinan con regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas humanas. Dichos anticuerpos retienen sustancial o totalmente la especificidad de unión del anticuerpo de ratón y son aproximadamente dos tercios de secuencia humana.

Un anticuerpo revestido es un tipo de anticuerpo humanizado que retiene algunas y generalmente todas las CDR y algunos de los restos de marcos de la región variable no humana de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros restos de marcos de la región variable que pueden contribuir a epítopos de linfocitos B o T, por ejemplo, restos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) con restos de las posiciones correspondientes de una secuencia de anticuerpo humano. El resultado es un anticuerpo en el que las CDR son total o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los marcos de la región variable del anticuerpo no humano se vuelven más similares a los humanos mediante las sustituciones.

Un anticuerpo humano se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tal anticuerpo puede ser uno producido por un humano o linfocitos B humanos o un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana o por una presentación en fagos, presentación retrovírica, presentación ribosómica y similares (véanse, por ejemplo, Hoogenboom et al., J . Mol. Biol.

227, 381 (1991) (presentación en fagos), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (presentación en fagos), Hanes y Plucthau, PNa S USA 94, 4937-4942 (1997) (presentación ribosómica), Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (presentación en fagos), Scott T IBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russell et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty, TIBTECH 10, 80-84 (1992) y el documento US 5.733.743). Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por la inmunoglobulina de línea germinal humana introducida por maduración in vivo, tal como mediante mutación somática o reordenamiento de genes in vivo. Los anticuerpos humanos pueden incluir también un pequeño número de mutaciones (por ejemplo, hasta 10 por cadena pesada o ligera) introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro).

Un animal transgénico para producir anticuerpos humanos se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes o transcromosomas de cadena pesada y/o ligera humana (integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de que expresan anticuerpos completamente humanos o al menos anticuerpos con regiones variables completamente humanas. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos humanos cuando se inmuniza con el antígeno diana y/o células que expresan el antígeno diana. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, los ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2 o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso de ratones KM transcromosómicos como se describe en el documento WO02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos (denominados colectivamente como "ratones transgénicos") son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antígeno determinado (tal como IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) sometiéndose a recombinación de V-D-J y a conmutación del isotipo. Los ratones diseñados mediante ingeniería genética VELOCIMMUNE® comprenden un reemplazo de segmentos génicos V(D)J sin reorganizar en loci endógenos de ratón con segmentos génicos V(D)J humanos. Los ratones VELOCIMMUNE® expresan anticuerpos quiméricos que tienen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 7.605.237). La mayoría de los otros informes se refieren a ratones que expresan anticuerpos completamente humanos a partir de transgenes completamente humanos en ratones que tienen loci de inmunoglobulinas endógenas inhabilitadas. El ratón VELOCIMMUNE® incluye, en parte, tener un genoma que comprende regiones variables humanas unidas operativamente a loci endógenos de regiones constantes de ratón de manera que el ratón produce anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada humana y una región constante de cadena pesada de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas de los anticuerpos puede aislarse y unirse operativamente al ADN que codifica la constante de cadena pesada humana descrita en el presente documento. A continuación, el ADN puede expresarse en una célula capaz de expresar la cadena pesada completamente humana del anticuerpo.

Varias funciones efectoras de anticuerpos están mediadas, al menos en parte, por receptores Fc (FcR), que se unen a la región Fc de un anticuerpo en el dominio constante (específicamente, el dominio CH2 y c H3) de una inmunoglobulina típica. Hay varios receptores de Fc que son específicos para las diferentes clases de inmunoglobulinas, es decir, IgG, IgE, IgA, IgM y IgD. La familia del receptor Fc de IgG humana se divide en tres grupos: F cyRI (CD64), que puede unirse a IgG con alta afinidad, F cyRII (CD32) y F cyRIII (CD16), ambos receptores de baja afinidad. Cada subclase de F cyR está codificada por dos o tres genes y el corte y empalme alternativo de ARN conduce a múltiples transcripciones, por tanto, existe una amplia diversidad en las isoformas de F cyR (por ejemplo, F cyRIA (CD64; FCGR1A, Swiss Prot P12314), F cyRIB (CD64; FCRG1 B), F cyRIIA (CD32; FCGR2A, Swiss Prot P12318), F cyRIIB (CD32; FCGR2B, Swiss Prot P31994), F cyRIIC (CD32; FCGR2C), F cyRIIIA (CD16a; FCGR3A, Swiss Prot P08637) y F cyRIIIB (CD16b; FCGR3B)). Asimismo, los receptores Fc se expresan en una diversidad de células, incluyendo, por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, neutrófilos y ciertos linfocitos. Por ejemplo, células U937, una línea celular de monocitos humanos, expresan tanto F cyRI como F cyRIIA (véanse, por ejemplo, Jones, et al. J Immunol 135(5):3348-53 (1985); y Brooks, et al. J Exp Med 170:1369-85 (Octubre de 1989)).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC (del inglés, Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) es una actividad para dañar una célula diana cuando una célula portadora del receptor F cy (una célula inmunitaria o similar) se une a una porción Fc de un anticuerpo específico a través del receptor F cy, cuando el anticuerpo específico se ha unido a un antígeno de la superficie celular de la célula diana. Por tanto, la ADCC es un mecanismo mediante el cual las células efectoras positivas al receptor Fc pueden lisar células diana que tienen una molécula específica de antígeno adherente. La actividad ADCC puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la intensidad fluorescente usando un colorante fluorescente como calceína AM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 349-07201). Cuando se emplea este enfoque, se puede calcular la actividad citotóxica (% de lisis celular), utilizando los valores obtenidos, de acuerdo con la ecuación: (A-C)/(B-C)x100, en donde A es un valor fluorescente en cada muestra, B es un valor medio de fluorescencia de las células lisadas y liberadas en un medio con Nonidet P-40 que tiene una concentración final del 1% y C es un valor medio de fluorescencia cuando solo se añadió el medio.

"Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" o "ADCP" (del inglés, Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis) se refiere a la función efectora que elimina (o mata) una célula diana al engullir la célula diana en lugar de inducir la citolisis. La ADCP puede ser un mecanismo in vivo importante para matar células tumorales. ADCP puede medirse mediante métodos de citometría de flujo de fluorescencia de dos colores, por ejemplo métodos que utilizan, por ejemplo, PKH2 (colorante fluorescente verde) y anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeritrina (rojo) contra diferentes proteínas de la superficie celular para diferenciar las células de ensayo, determinando así la actividad fagocítica y la tasa de fagocitosis. Las estrategias terapéuticas que activan selectivamente FcYRlla respecto a FcYRIIb pueden mejorar la actividad fagocítica de los macrófagos (Richards et al. 2008 Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-27).

La citotoxicidad dirigida por complemento o CDC se refiere a la actividad citotóxica del sistema del complemento. La actividad de los CDC se puede medir, por ejemplo, las células diana, el anticuerpo y la solución del complemento (como el complemento de cría de conejo (Cedarlane Technologies)) se incuban y se dejan reaccionar, de acuerdo con los protocolos estándar (NIAID Manual of Tissue Typing Techniques 1979-1980, Editado por J.G . Ray, publicación NIH N.° NIH-83-545.) La actividad citotóxica se puede calcular de la misma manera que la medición de la actividad de ADCC. La actividad citotóxica también se puede medir usando un colorante fluorescente (tal como calceína) o colorantes radiactivos de manera similar a los anteriores con respecto a ADCC.

El término "sujeto" incluye sujetos humanos y otros sujetos mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Las composiciones o métodos "que comprenden" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.

Descripción detallada

I. General

En el presente documento se describen regiones constantes de cadenas pesadas de anticuerpos con una región bisagra modificada para reducir la unión a los receptores F cy. La modificación se produce en las posiciones 233-236 por la numeración de la EU mediante el reemplazo de restos naturales por glicina(s) y/o deleción(ones). Los presentes inventores encontraron inesperadamente que tales modificaciones en la región bisagra de los anticuerpos pueden reducir de manera útil la unión de tales anticuerpos a los receptores F cy en mayor medida que las modificaciones previas en esta región y particularmente pueden reducir la unión a los niveles de fondo para cualquiera o todos los FcyRI, F cyRIIA, F cyRIIB y F cyRIIIA. Estas regiones constantes de inmunoglobulina modificadas se pueden incorporar virtualmente en cualquier formato de anticuerpo o proteína de fusión Fc. Tales anticuerpos o proteínas de fusión se pueden utilizar en métodos de tratamiento, particularmente aquellos en los que los mecanismos de acción del anticuerpo o la proteína de fusión Fc no dependen principalmente o en absoluto de las funciones efectoras, como es el caso cuando un anticuerpo inhibe una interacción receptor-ligando o agoniza un receptor.

II. Regiones constantes de cadenas pesadas

En el presente documento se describen regiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina modificadas en las que cada una de las posiciones 233-236 según el número EU está ocupada por G o está desocupada. La posición 236 está sin ocupar en la IgG2 humana canónica pero está ocupada en otros isotipos de IgG humana canónica. Las posiciones 233-235 están ocupadas por restos distintos de G en los cuatro isotipos humanos (ver Fig. 1). La posición 233 no se cree que interaccione directamente con los receptores F cy, pero se incluyó en la mutagénesis porque la eliminación del resto Glu de tipo silvestre en IgG1 e IgG4 o el resto Pro en IgG2 junto con las otras mutaciones reduciría la inmunogenicidad. En cuatro regiones constantes modificadas ilustrativas, las posiciones 233-236 son Gly Gly Gly desocupada, Gly Gly desocupada, desocupada; Gly, desocupada, desocupada, desocupada y todas desocupadas (véase la Fig. 5). Estos segmentos se pueden representar como GGG-, g G--, G — o — con "-" representando una posición desocupada.

La modificación de bisagra dentro de las posiciones 233-236 se puede combinar con la posición 228 ocupada por P. La posición 228 está ocupada naturalmente por P en IgG1 e IgG2 humanas pero está ocupada por S en IgG4 humana y R en IgG3 humana. Una mutación de S228P en un anticuerpo IgG4 es ventajosa para estabilizar un anticuerpo IgG4 y reducir el intercambio de pares de cadenas pesadas cadenas ligeras entre anticuerpos exógenos y endógenos.

Preferentemente, las posiciones 226-229 están ocupadas por C, P, P y C respectivamente.

Las regiones bisagra ilustrativas tienen los restos 226-236, a veces denominados bisagra media (o núcleo) e inferior, ocupados por las secuencias de bisagra modificadas designadas GGG-(233-236), GG--(233-236), G—(233-236) y no G(233-236).

hIgG1 C PPC PA PELLG G PSV F

hIgG2 CPPCPAPPVA-G PSVF

hIgG4 C PSC PA PEFLG G P SV F

GGG-(233-236) CPPCPAPG G G -G PSVF (SEQ ID NO: 1)

GG--(233-236) CPPCPAPGG--GPSVF (SEQ ID NO: 2)

G—(233-236) CPPCPA PG —G PSVF (SEQ ID NO: 3)

no_G(233-236) C PPC PA P— G PSVF (SEQ ID NO: 4)

Las regiones bisagra modificadas descritas anteriormente se pueden incorporar en una región constante de cadena pesada, que normalmente incluye dominios CH2 y CH3 y que puede tener un segmento de bisagra adicional (por ejemplo, una bisagra superior) flanqueando la región designada y una región CH1. Tales segmentos de región constante adicionales presentes son normalmente del mismo isotipo, preferentemente un isotipo humano, aunque pueden ser híbridos de diferentes isotipos. El isotipo de tales segmentos de regiones constantes humanas adicionales es preferentemente IgG4 humana, pero también puede ser IgG1, IgG2 o IgG3 humanas o híbridos de las mismas, en las que los dominios son de isotipos diferentes. Las secuencias ilustrativas de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas se muestran en las Figs. 2-4. Una región constante se considera de un isotipo designado si difiere de ese isotipo en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones internas, excepto, sin embargo, que el dominio CH1 puede omitirse por completo al igual que la región de bisagra superior. Los dominios CH1, CH2 y CH3 se considera que son de isotipo IgG1, IgG2 o IgG4 si difieren de la región CH1, CH2 y CH3 de la secuencia ilustrativa en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, deleciones o inserciones internas. El resto de una bisagra fuera de las secuencias de la región 226-236 presentada anteriormente se considera que es del isotipo IgG1, IgG2 o IgG4 si difiere de la parte correspondiente de la región bisagra de las secuencias de la bisagra ilustrativas en no más de 1 o 2 sustituciones, deleciones o inserciones internas.

Algunas regiones constantes de cadenas pesadas preferidas tienen secuencias de aminoácidos que consisten o comprenden las S EC ID NO: 5, 6, 7 y 8. Estas regiones constantes de cadena pesada incorporan los segmentos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID: 3 y SEQ ID NO: 4 en los restos 226-236 mostrados anteriormente en un isotipo IgG4 por lo demás humano. Otras regiones constantes preferidas difieren de la SEQ ID NO designada en hasta 1,2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones, pero conservan al menos GGG-, GG--, G — o ----en las posiciones de EU 232-236 y P en la posición 228 y preferentemente retienen los restos 226-236 mostrados anteriormente para las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID: 3 y SEQ ID NO: 4. Las variaciones de las SEQ ID NO designada pueden representar una o diversas variaciones alotípicas o isoalotípicas naturales, variaciones para aumentar o reducir una función efectora tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (véanse, por ejemplo, Winter et al., la patente de Estados Unidos N.° 5.624.821; Tso et al., la patente de Estados Unidos N.° 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006) o para prolongar la semivida en seres humanos (véase, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem.

279:6213, 2004), para las que las sustituciones ilustrativas incluyen una Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (numeración de EU. Otras variaciones pueden agregar o eliminar sitios de modificación postraduccional, tales como la glicosilación ligada a N en los motivos N-X-S/T. Las variaciones pueden incluir también la introducción de protuberancias (es decir, reemplazo de uno o más aminoácidos con aminoácidos más grandes) o huecos (es decir, reemplazo de uno o más aminoácidos con aminoácidos más pequeños) para promover la formación de heterodímeros entre diferentes cadenas pesadas para la producción de anticuerpos biespecíficos. T336Y y Y407T son sustituciones ilustrativas para formar un par de protuberancia y hueco respectivamente (Ridgeway et al., Protein Engineering vol.9 n.°7 págs.617-621, 1996). Las variaciones también pueden incluir mutaciones que reducen la interacción de la proteína A (por ejemplo, H435R e Y436F) en el sistema de numeración de EU. Los anticuerpos biespecíficos en los que una cadena pesada tiene tal variación y otra no, pueden separarse de sus anticuerpos parentales mediante cromatografía de afinidad de proteína A. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 9-12 son las mismas que las SEQ ID NO: 5-8 excepto por la presencia de las mutaciones H435R e Y436F. Uno o más restos del extremo C de las regiones constantes, particularmente una lisina C-terminal en la cadena pesada, se pueden perder como resultado de la modificación postraduccional.

Otras regiones constantes de cadena pesada comprenden o consisten en las SEQ ID NO: 16-19 y 20-23, que corresponden a la SEQ ID NO: 5-8 y 9-12 respectivamente, excepto que los primeros son de isotipo IgG1 humano en lugar del de IgG4. Otras regiones constantes de cadena pesada comprenden o consisten en las SEQ ID NO: 24-27 y 28-31, que corresponden a las SEQ ID NO: 5-8 y 9-12 respectivamente, excepto que las primeras son de isotipo IgG2 humano en lugar del de IgG4.

Otras regiones constantes preferidas difieren de la SEQ ID NO designada anteriormente en hasta 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones, pero conservan al menos GGG-, GG--, G — o ----en las posiciones de EU 232-236 y P en la posición 228 y preferentemente retienen los restos 226-236 mostrados anteriormente para las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 de la misma manera que se discutió para regiones constantes de isotipo IgG4.

Las regiones constantes modificadas y los anticuerpos o proteínas de fusión que incorporan tales regiones constantes se caracterizan por una afinidad reducida por los receptores F cy en comparación con los controles emparejados por isotipo (regiones constantes de tipo silvestre o anticuerpos o proteínas de fusión que incorporan las mismas). La afinidad de unión (Ka) se reduce preferentemente al menos en un 90, 95 o 99% en comparación con los controles emparejados por isotipo. Preferentemente, la afinidad de unión se reduce a niveles de fondo (es decir, la misma señal dentro del error experimental que en una reacción de control con un fragmento sc-Fv que carece de cualquier región constante o en la que se usa un receptor irrelevante en lugar de F cy. Preferentemente, la afinidad se reduce a un nivel de fondo o al menos a un 90, 95 o 99% para cada uno de los receptores de F cy humanos, y RI, y RIIA, y RIIB y y RIIIA.

Asimismo, las funciones efectoras dependientes de la unión al receptor F cy, tales como ADCC o ADCP se reducen, preferentemente en al menos un 90, 95 o 99% o más preferentemente al nivel de fondo. Tales funciones incluyen la destrucción o fagocitosis celular, la activación de linfocitos B y la liberación de mediadores inflamatorios, tales como citocinas. Algunos de estos efectos pueden cuantificarse midiendo la CE50, que se refiere a la concentración media máxima efectiva de un anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición especificado. La C E 50 representa esencialmente la concentración de un anticuerpo donde se observa un 50 % de su efecto máximo. Algunos anticuerpos o proteínas de fusión que incluyen una región constante de cadena pesada modificada descrita en el presente documento muestran una citotoxicidad de menos de un 20% de citolisis (es decir, % de citotoxicidad) o menos de un 10% o 5%, 4 %, 3 %, 2% o incluso 0 % o citolisis indetectable (citotoxicidad), como se midió en un ensayo de destrucción celular in vitro o ex vivo en comparación con anticuerpos de control emparejados por isotipos adecuados con una región constante de tipo silvestre, opcionalmente, medido a una concentración de anticuerpos o proteínas de fusión de 10 nM.

Sin embargo, la afinidad de unión de un anticuerpo o proteína de fusión que incorpora tal región constante de cadena pesada preferentemente no se ve afectada sustancialmente por la región constante modificada. Es decir, la afinidad de unión es normalmente la misma dentro del error experimental o al menos dentro de un factor de 2 o 3 de un anticuerpo de control adecuado con una región constante de tipo silvestre emparejada por isotipo. Lo mismo ocurre con las propiedades funcionales que no dependen de la unión de F cyR, tales como la capacidad para inhibir la unión receptor-ligando (por ejemplo, CE50) o la capacidad para agonizar un receptor.

La inmunogenicidad de regiones constantes modificadas o de regiones constantes modificadas incorporadas de anticuerpos o proteínas de fusión en comparación con controles de isotipos emparejados puede evaluarse in vitro a partir de la maduración de los dendrocitos o la proliferación de linfocitos T en desafío (Gaitonde et al., Methods Mol. Biol. 2011;716:267-80) o in vivo comparando la incidencia de anticuerpos reactivos contra los anticuerpos administrados entre poblaciones. La inmunogenicidad de las regiones constantes modificadas o anticuerpos o proteínas de fusión que incorporan la constante modificada preferentemente no es significativamente diferente de los controles de isotipo emparejado o no es peor que 2, 3 o 5 veces mayor que la del control de isotipo emparejado. Asimismo, los parámetros farmacocinéticos tales como Cmáx, Cmedia, área bajo la curva y semivida preferentemente no son significativamente diferentes o al menos no son menores en un factor de no más de 2, 3 o 5 que los controles emparejados por isotipo. Tales parámetros se pueden medir en un ratón tal como se describe en los Ejemplos, en otro modelo animal o en un ser humano. La retención sustancial de tales parámetros PK proporciona una indicación de que las regiones constantes modificadas o los anticuerpos o proteínas de fusión que los incorporan no han sufrido cambios conformacionales sustanciales que desencadenan mecanismos de eliminación mejorados.

III. Anticuerpos y proteínas de fusión

Las regiones constantes de cadena pesada modificadas descritas anteriormente pueden incorporarse en anticuerpos u otras proteínas de fusión. Por ejemplo, para la expresión de un anticuerpo monoespecífico, una región constante de cadena pesada modificada se expresa fusionada con una región variable de cadena pesada y junto con una cadena ligera que incluye una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La cadena pesada y ligera se unen entre sí a través de la región CH1 de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera para formar un heterodímero. A continuación, dos heterodímeros se emparejan por asociación de las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada de la IgG para formar una unidad tetrámera, como es el caso de un anticuerpo convencional. Para la expresión de un anticuerpo biespecífico, una región constante pesada modificada se expresa fusionada a cada una de las dos regiones variables de cadena pesada de diferentes especificidades diana. Las cadenas pesadas pueden ensamblarse cada una con una cadena ligera coexpresada y los complejos de cadena pesada-cadena ligera pueden formar heterodímeros en los que están presentes ambas cadenas pesadas. Las regiones variables de cadenas ligeras pueden ser las mismas (véase, por ejemplo, el documento US 20100331527A1) o diferentes dentro de una unidad.

Las regiones constantes modificadas se pueden usar con cualquier tipo de anticuerpo modificado por ingeniería genética, incluidos anticuerpos quiméricos, humanizados, sustituidos en superficie o humanos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o una preparación de anticuerpos policlonales modificados por ingeniería genética (véase el documento US 6.986.986).

Para las proteínas de fusión, se expresa una región constante modificada unida a un polipéptido heterólogo. Un polipéptido heterólogo en una proteína de fusión es un polipéptido que no está unido de forma natural a una región constante de inmunoglobulina. Dicho polipéptido puede ser una proteína de longitud completa o cualquier fragmento de la misma de longitud suficiente para retener la unión específica al antígeno unido por la proteína de longitud completa. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede ser un dominio extracelular de receptor o un ligando del mismo. El polipéptido heterólogo proporciona una región de unión en el extremo N de la región constante y en ocasiones, se denomina simplemente como una región de unión. La región CH1 de IgG no se incluye normalmente en la región constante para proteínas de fusión. La región bisagra superior a veces se omite o se reemplaza por un péptido enlazador sintético. Se conocen en la técnica proteínas receptoras ilustrativas cuyos dominios extracelulares se pueden combinar con regiones constantes de cadena pesada modificadas descritas en el presente documento (véanse, por ejemplo, Klinkert, et al. J Neuroimmunol. 72(2): 163-8 (1997); Milligan et al., Curr Pharm. Des. 10(17): 1989-2001 (2004); y Schwache y Muller-Newen, Eur. J Cell Biol. 91 (6-7):428-34 (2012), doi: 10,1016/j.ejcb.201 1 .07,008. Epub 29 septiembre 201 1).

La región de unión de una proteína de fusión puede ser cualquiera de los tipos de regiones de unión utilizadas en otras proteínas de fusión producidas hasta la fecha (entre otras).

Un anticuerpo o proteína de fusión multiespecífico(a) puede incluir especificidades de unión para un antígeno sobre una diana (por ejemplo, una célula cancerosa o patógeno) y para un antígeno sobre una célula efectora (por ejemplo, CD3 sobre un linfocito T). Dicho complejo multiespecífico forma un puente entre la célula diana y la célula efectora y promueve la actividad citotóxica o de opsonización de la célula efectora. Un anticuerpo o proteína de fusión multiespecífico(a) puede incluir adicional o alternativamente especificidades de unión para dos antígenos diferentes sobre la misma diana (por ejemplo, una célula cancerosa o un patógeno). Tal anticuerpo o proteína de fusión puede tener una mayor toxicidad selectiva hacia la célula diana que un anticuerpo o proteína de fusión con especificidad para un solo antígeno. Otros anticuerpos o proteínas de fusión multiespecíficos(as) incluyen regiones de unión tanto para un receptor como para su ligando o contrarreceptor. Dichos anticuerpos o proteínas de fusión pueden ejercer una mayor inhibición que los anticuerpos o proteínas de fusión que se unen al receptor o ligando/contrarreceptor solos. Cualquiera de estas especificidades y otras pueden combinarse en el mismo complejo multiespecífico.

Los anticuerpos o las proteínas de fusión pueden modificarse también químicamente, mediante conjugación covalente con un polímero para, por ejemplo, aumentar adicionalmente su semivida circulante. Se ejemplifican polímeros ilustrativos y métodos para unirlos a péptidos en, por ejemplo, los documentos US 4.766.106, Us 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. Los polímeros ilustrativos adicionales incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG ) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 40.000, tal como entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 20.000, por ejemplo, aproximadamente 3.000-12.000 g/mol).

Los anticuerpos o las proteínas de fusión pueden ser un anticuerpo radiomarcado con fines diagnósticos o terapéuticos. Los ejemplos de radioisótopos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc y 125I, 1311, 186Re y 225Ac. Se conocen métodos para preparar aminoácidos y anticuerpos radiomarcados o proteínas de fusión que los contienen (véanse, por ejemplo, Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y los documentos US 4,681,581, US 4.735.210, US 5.101.827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5.648.471 y US 5.697.902. Por ejemplo, se puede conjugar un radioisótopo mediante un método de cloramina T. Otros marcadores detectables incluyen una enzima, un cromóforo o un marcador fluorescente.

Los anticuerpos o proteínas de fusión se pueden conjugar con un agente tóxico. Los agentes tóxicos pueden ser citotóxicos o citostáticos. Algunos ejemplos de agentes tóxicos incluyen agentes antitubulina, auristatinas, aglutinantes de la ranura menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizantes de quimioterapia, duocarmicinas, camptotecinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos preformados, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizantes de la radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares.

IV. Expresión de anticuerpos

Los ácidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpos o proteínas de fusión pueden fabricarse por síntesis en estado sólido, amplificación por PCR de fragmentos de oligonucleótidos solapantes o mutagénesis dirigida al sitio de ácidos nucleicos existentes. Tales ácidos nucleicos se expresan en un vector de expresión. Los vectores pueden configurarse para codificar una región constante de cadena pesada modificada y/o una región constante de cadena ligera humana de manera que se pueden expresar como fusiones con regiones variables de cadena pesada y cadena ligera insertadas o un polipéptido heterólogo.

El origen de los elementos de control de la expresión y la replicación (promotor, potenciador, péptido señal, etc.) en un vector puede configurarse para su uso en diferentes tipos de células, tales como bacterias, levaduras u otros hongos, células de insecto o células de mamífero. Las células de mamífero son un hospedador preferido para expresar segmentos de nucleótidos que codifican anticuerpos o proteínas de fusión descritas en el presente documento (véase Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, Nueva York, 1987)). En la técnica se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas e incluyen líneas celulares de CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos, incluyendo Sp2/0 y NS0. Preferentemente, las células no son humanas. Preferentemente, un anticuerpo o proteína de fusión descritos en el presente documento se expresa a partir de una línea celular monoclonal.

Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen etal., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y los sitios de procesado de la información necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores procedentes de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y similares. Véase Co et al., J . Immunol. 148:1149 (1992).

Las células se transfectan con uno o más vectores que codifican el anticuerpo o la proteína de fusión que se va a expresar. Para un anticuerpo multicatenario, las cadenas pesada y ligera se pueden expresar en el mismo vector o en vectores separados. Para la expresión de complejos multiespecíficos, el ADN que codifica los componentes de los complejos (es decir, diferentes anticuerpos o proteínas de fusión) puede estar en el mismo vector o en diferentes vectores.

Las cadenas de anticuerpos o proteínas de fusión se expresan, se procesan para eliminar los péptidos señal, se ensamblan y se secretan desde las células huésped. Los anticuerpos o proteínas de fusión se pueden purificar a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante métodos convencionales de purificación de anticuerpos. Si la región constante híbrida incluye una porción de IgG, a continuación, la purificación puede incluir una etapa de cromatografía utilizando la proteína A o proteína G como reactivo de afinidad. También se pueden utilizar procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como el intercambio iónico, cromatógrafo de hidroxiapatita o HPLC (véase en líneas generales, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, Nueva York, 1982)).

V. Aplicaciones

Aunque los anticuerpos y las proteínas de fusión que incorporan regiones constantes de cadena pesada modificadas descritas en el presente documento se pueden usar en general en métodos de tratamiento o diagnóstico, son particularmente útiles en situaciones en las que el mecanismo de acción del anticuerpo o proteína de fusión es total o al menos predominantemente independiente de funciones efectoras. Tal es el caso, por ejemplo, cuando el objetivo terapéutico no es destruir una célula diana, sino inhibir o activar una molécula de la superficie celular sobre su superficie sin desencadenar citotoxicidad. Otro escenario en el que es deseable una unión reducida a los receptores Fc es cuando el anticuerpo es biespecífico y sus propiedades terapéuticas deseadas surgen de las diferentes especificidades de unión. Por ejemplo, un uso común de anticuerpos biespecíficos es combinar una especificidad dirigida a un tumor con una especificidad de activación de linfocitos T para desencadenar la muerte de linfocitos T específicos de tumores. En este caso, si la porción Fc se une a un receptor Fc, a continuación, eso podría desencadenar potencialmente la destrucción indeseable de las células que portan receptores Fc por linfocitos T o la destrucción de linfocitos T por las células portadoras del receptor Fc, tal como las células citolíticas naturales o los macrófagos. Otro escenario en el que la falta de funciones efectoras puede ser ventajoso es inhibir la agregación de péptidos que contribuyen a la patogénesis, como en la enfermedad amiloidogénica. Unos escenarios adicionales son el diagnóstico in vivo, en el que se pretende que un anticuerpo o proteína de fusión se una a una diana pero no da como resultado la eliminación de la diana o de las células que portan la diana.

VI. Dianas

Los anticuerpos o proteínas de fusión que incorporan una región constante de cadena pesada modificada pueden dirigirse a cualquier número de proteínas diana celulares. Los anticuerpos o proteínas de fusión son particularmente útiles para proteínas diana unidas a la superficie. La respuesta deseada puede ser, por ejemplo, la eliminación de una diana o célula o virus que lo porta, la transducción de señales a través de un receptor, por ejemplo, inducir apoptosis, inhibir la unión de un receptor a un ligando o contrarreceptor o la internalización un anticuerpo o proteína de fusión conjugado(a) con un agente tóxico. Pueden fabricarse anticuerpos o proteínas de fusión para las mismas dianas que los anticuerpos o proteínas de fusión comerciales existentes o pueden derivatizarse versiones de anticuerpos comerciales o proteínas de fusión en los que la región constante existente se ha reemplazado por una región constante modificada descrita en el presente documento.

Las dianas de interés incluyen receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, FG FR , HGFR, PDGFR, EFG R, NGFR y V EG FR ) y sus ligandos. Otras dianas son los receptores de proteína G e incluyen el receptor de la sustancia K, el receptor de angiotensina, los receptores adrenérgicos a y p, los receptores de serotonina y el receptor de PAF. Véase, por ejemplo, Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56:625 649 (1987). Otras dianas son CD (grupo de marcadores de diferenciación). Otros objetivos incluyen canales iónicos (por ejemplo, canales de calcio, sodio y potasio), receptores muscarínicos, receptores de acetilcolina, receptores de Ga b A, receptores de glutamato y receptores de dopamina (véanse Harpold, la patente de Estados Unidos N.° 5.401.629 y la patente de Estados Unidos N.° 5.436.128). Otras dianas son proteínas de adhesión tales como integrinas, selectinas y miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (véanse Springer, Nature 346:425 433 (1990). Osborn, Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992)). Otras dianas son citocinas, tales como las interleucinas IL-1 a aproximadamente IL-37 hasta la fecha, factores de necrosis tumoral, interferón y factor de crecimiento tumoral beta, factor estimulador de las colonias (C SF; del inglés, Colony Stimulating Factor) y factor estimulador de las colonias de granulocitos monocitos (GM-CSF). Véase Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Massachusetts 1991)). Otras dianas son péptidos amiloidogénicos, tales como Abeta, alfa-sinucleína o péptido priónico. Otras dianas son hormonas, enzimas y mensajeros intracelulares e intercelulares, tales como, adenil ciclasa, guanil ciclasa y fosfolipasa C. Las moléculas diana pueden ser humanas, de mamíferos o bacterianas. Otras dianas son antígenos, tales como proteínas, glicoproteínas y carbohidratos de patógenos microbianos, tanto virales como bacterianos y tumores.

Algunos ejemplos de anticuerpos comerciales y sus dianas incluyen alemtuzumab (CD52); rituximab (CD20); trastuzumab (Her/neu); nimotuzumab, cetuximab (EG FR ); bevacizumab (VEGF); palivizumab (RSV); abciximab (GpI-Ib/IIIa); infliximab, adalimumab, certolizumab, golimumab (TNF-alfa); baciliximab, daclizumab (IL-2); omalizumab (IgE); gemtuzumab (CD33); natalizumab (VLA-4); vedolizumab (alfa4beta7); belimumab (BAFF); otelixizumab, teplizumab (CD3); ofatumumab, ocrelizumab (CD20); epratuzumab (CD22); alemtuzumumab (CD52); eculizumab (C5); canakimumab (IL-1beta); mepolizumab (IL-5); reslizumab, tocilizumab (IL-6R); ustekinumab, briakinumab (IL-12, 23). Entre los ejemplos de proteínas de fusión comerciales se incluyen etanercept que se une a TNF-alfa, alefacept (fusión de LFA3-Fc que se une a CD2), fusión de TACI-Fc que se une a BAFF y APRIL, abatacept (CTLA-4-Fc que se une CD80 y CD86) y romiplostim (un péptido análogo de trombopoyetina fusionado con Fc). Cualquiera de los anticuerpos comerciales o proteína de fusión se puede modificar para reemplazar la región constante de cadena pesada existente con una región constante de cadena pesada modificada descrita en el presente documento. Como alternativa, una región constante de cadena pesada modificada puede estar unida a otros anticuerpos con la misma especificidad de diana (por ejemplo, como la determinada por un ensayo de competición) que cualquiera de los anticuerpos comerciales o proteínas de fusión anteriores.

VII. Métodos de tratamiento y composiciones farmacéuticas

Los anticuerpos y proteínas de fusión descritos en el presente documento pueden utilizarse también para suprimir diversas respuestas inmunes indeseables, incluidas las de las mismas terapias en las que se han usado los anticuerpos comerciales mencionados anteriormente.

Una categoría de trastornos inmunitarios tratables mediante anticuerpos o proteínas de fusión descrita en el presente documento es el rechazo de trasplantes. Cuando se trasplantan células u órganos alogénicos (por ejemplo, piel, riñón, hígado, corazón, pulmón, páncreas y médula ósea) a un huésped (es decir, el donante y el donatario son individuos diferentes de la misma especie), es probable que el sistema inmunitario del hospedador organice una respuesta inmunitaria hacia los antígenos extraños en el trasplante (enfermedad del hospedador frente al injerto) que conduce a la destrucción del tejido trasplantado. Los anticuerpos o proteínas de fusión de la invención son útiles, entre otros, para bloquear las respuestas inmunitarias inducidas por aloantígenos en el donatario.

Un uso relacionado de los anticuerpos o proteínas de fusión descritos en el presente documento es modular la respuesta inmunitaria implicada en la enfermedad de "injerto contra hospedador" (GVHD; del inglés, Graft Versus Host Disease). La GVHD es una enfermedad potencialmente mortal que se produce cuando células inmunocompetentes se transfieren a un receptor alogénico. En esta situación, Las células inmunocompetentes del donante pueden atacar los tejidos en el receptor. Los tejidos de la piel, epitelio intestinal y hepático son dianas frecuentes y pueden quedar destruidas durante el recorrido de la GVHD. La enfermedad supone un problema especialmente grave cuando se va a trasplantar tejido inmunitario, tal como en el trasplante de médula ósea; pero también se ha documentado una GVHD menos grave también en otros casos, incluidos los trasplantes de corazón e hígado.

Otra situación en la que es deseable la inmunosupresión es en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes tipo 1, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, síndrome del hombre rígido, artritis reumatoide, miastenia grave y lupus eritematoso. En estas enfermedades, el cuerpo desarrolla una respuesta inmunitaria celular y/o humoral contra uno de sus propios antígenos que conduce a la destrucción de ese antígeno y a consecuencias potencialmente paralizantes y/o fatales. Las enfermedades autoinmunitarias se tratan mediante la administración de uno de los anticuerpos o proteínas de fusión descritos en el presente documento. Otros trastornos inmunitarios tratables mediante anticuerpos o proteínas de fusión que incluyen regiones constantes modificadas descritas en el presente documento incluyen asma, alergias, enfermedad celíaca, psoriasis y uveítis. La enfermedad celíaca, la psoriasis y la uveítis son enfermedades autoinmunitarias.

Los anticuerpos o proteínas de fusión descritos en el presente documento pueden utilizarse para el tratamiento de cánceres en los que se expresa un antígeno diana para el que se expresa el anticuerpo o la proteína de fusión. Los métodos se pueden utilizar para tratar tumores sólidos y particularmente neoplasias hematológicas, tales como leucemia (por ejemplo, leucemia de linfocitos grandes granulares de linfocitos T), linfoma (de Hodgkin o no Hodgkin) o mieloma múltiple. Los tumores sólidos incluyen piel (por ejemplo, melanoma), ovario, endometrial, vejiga, mama, recto, de colon, gástrico, pancreático, pulmón, timo, riñón y cerebro. La destrucción de las células cancerosas pueden ser el resultado de un mecanismo independiente de las uniones de F cyR, tal como por inducción de apoptosis, inhibición de una interacción receptor-ligando o por acción de una fracción citotóxica conjugada.

Los anticuerpos o la proteína de fusión se puede(n) utilizar para el tratamiento de infecciones patógenas, tales como una infección vírica, bacteriana, protozoaria o fúngica. Asimismo, la destrucción puede suceder mediante un mecanismo independiente de la unión de F cyR, tal como por la inhibición de una interacción entre un patógeno y una célula dando a otros elementos del sistema inmunológico una oportunidad para destruir al patógeno o mediante la acción de un radionucleótido o toxina unido(a).

Los anticuerpos o proteínas de fusión se administran en un régimen eficaz, lo que significa que una dosificación, vía de administración y frecuencia de administración que retrasa el inicio, reduce la gravedad, inhibe un deterioro adicional y/o mejora al menos un signo o síntoma de cáncer. Si un sujeto ya padece cáncer a partir de un trastorno, el régimen puede denominarse un régimen terapéuticamente eficaz. Si el sujeto tiene un riesgo elevado del trastorno respecto a la población general, pero aún no presenta síntomas, el régimen puede denominarse un régimen profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede observarse en un sujeto individual respecto a los controles históricos o la experiencia pasada en el mismo sujeto. En otros ejemplos, la eficacia terapéutica o profiláctica se puede demostrar en un ensayo preclínico o clínico en una población de sujetos tratados respecto a una población de control de sujetos sin tratar.

Las dosificaciones de ejemplo para un anticuerpo o proteína de fusión son 0,01-20 o 0,5-5 o 0,01-1 o 0,01-0,5 o 0,05­ 0,5 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, 0,1, 0,5, 1,2, 3, 4, o 5 mg/kg) o 10-1500 mg como una dosificación fija. La dosificación depende de la afección del sujeto y la respuesta al tratamiento previo, en caso de que lo hubiera, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.

La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal o intramuscular. Se prefiere la administración en la circulación sistémica mediante administración intravenosa o subcutánea. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, mediante infusión durante un período de 30-90 min.

La frecuencia de administración depende de la semivida del anticuerpo o proteína de fusión en la circulación, la afección del sujeto y la vía de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diariamente, semanalmente, mensualmente, trimestralmente o en intervalos irregulares en respuesta a cambios en la afección del sujeto o progresión del trastorno que se está tratando. Una frecuencia ilustrativa para la administración intravenosa es entre semanal y trimestralmente durante una causa continua de tratamiento, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente. Para administración subcutánea, una frecuencia de dosificación ilustrativa es diaria a mensualmente, aunque también es posible una dosificación más o menos frecuente.

El número de dosificaciones administradas depende de si el trastorno es agudo o crónico y de la respuesta del trastorno al tratamiento. Para trastornos agudos o empeoramientos agudos de trastornos crónicos, a menudo son suficientes entre 1 y 10 dosis. A veces, una sola dosis de bolo, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o un empeoramiento agudo de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse en caso de recaída de un trastorno agudo o empeoramiento agudo. Para los trastornos crónicos, se puede administrar un anticuerpo a intervalos regulares, por ejemplo, semanalmente, quincenal, mensualmente, trimestralmente, cada seis meses durante al menos 1, 5 o 10 años o la vida del sujeto.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son preferentemente estériles y sustancialmente isotónicas y se fabrican en condiciones GMP. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria (es decir, la dosis para una sola administración). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los anticuerpos se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente, en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el lugar de la inyección). La solución puede contener agentes formulatorios, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso.

El tratamiento con los anticuerpos descritos en el presente documento se puede combinar con otros tratamientos eficaces contra el trastorno que se está tratando. Para el tratamiento de trastornos inmunitarios, los tratamientos convencionales incluyen inhibidores de la desgranulación de mastocitos, corticoesteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y fármacos antiinflamatorios más potentes como azatioprina, ciclofosfamida, leukeran, FK506 y ciclosporina. También se pueden utilizar agentes antiinflamatorios biológicos, tales como Tysabri® (natalizumab) o Humira® (adalimumab). Cuando se utilizan para el tratamiento del cáncer, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden combinar con quimioterapia, radiación, tratamiento con células madre, cirugía o tratamiento con otros productos biológicos como Herceptin® (trastuzumab) contra el antígeno HER2, Avastin® (bevacizumab) contra V EG F o anticuerpos para el receptor de EG F, tal como (Erbitux®, cetuximab) y Vectibix® (panitumumab). Los agentes de quimioterapia incluyen clorambucilo, ciclofosfamida o melfalán, carboplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina y mitoxantrona, metotrexato, fludarabina y citarabina, etopósido o topotecán, vincristina y vinblastina. Para las infecciones, el tratamiento puede combinarse con antibióticos, agentes antivíricos, antifúngicos o antiprotozoarios o similares.

VIII. Otras aplicaciones

Los anticuerpos o proteínas de fusión pueden utilizarse para detectar su molécula diana en el contexto del diagnóstico o tratamiento clínico o en investigación. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar un antígeno relacionado con cáncer como una indicación de que un sujeto padece un trastorno inmunomediado susceptible de tratamiento. Los anticuerpos pueden venderse también como reactivos de investigación para la investigación de laboratorio en la detección de dianas y su respuesta a diversos estímulos. En tales usos, los anticuerpos o proteínas de fusión pueden marcarse con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por rotación, enzimas o radioisotipos y se pueden proporcionar en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo. Los anticuerpos o la proteína de fusión también puede(n) utilizarse para purificar sus antígenos diana, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

La presencia de anticuerpos marcados o la fusión puede detectarse in vivo con fines de diagnóstico. El diagnóstico puede comprender: a) administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado o proteína de fusión; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo marcado o la proteína de fusión se concentre(n) en sitios donde puede detectarse el antígeno y permitir que el anticuerpo marcado no unido se aclare al nivel de fondo; c) determinar un nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado o la proteína de fusión en el sujeto, de manera que la detección del anticuerpo marcado por encima del nivel de fondo sea indicativa de que el sujeto tiene la enfermedad o trastorno o sea indicativa de la gravedad de la enfermedad o trastorno. El anticuerpo o la proteína de fusión se puede marcar con una fracción de formación de imágenes adecuada para la detección utilizando un sistema de formación de imágenes particular conocido por los expertos en la técnica. Los niveles de fondo se pueden determinar mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo la comparación de la cantidad de anticuerpo marcado detectado con un valor estándar determinado previamente para un sistema de formación de imágenes particular. Los métodos y sistemas que pueden utilizarse en los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, tomografía computarizada (TAC; en inglés, CT), exploración de cuerpo entero como tomografía por emisión de positrones (PET ; del inglés, Positron Emission Tomography), formación de imágenes por resonancia magnética (IRM; en inglés, MRI) y ecografía.

Si diferentes versiones de una secuencia están asociadas con un número de referencia en diferentes momentos, se entiende la versión asociada con el número de referencia en la fecha de entrada en vigor de presentación de esta solicitud. La fecha de entrada en vigor de presentación significa la primera entre la fecha de presentación real o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de referencia, si corresponde. Asimismo, si diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares se publican en diferentes momentos, se entiende la versión publicada más recientemente en la fecha de entrada en vigor de presentación de la solicitud, a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, etapa, elemento, realización o aspecto de la invención se puede usar en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Expresión de anticuerpos de bisagra modificada

Varios de los anticuerpos descritos en los siguientes ejemplos son anticuerpos biespecíficos en los que un brazo es el de un anticuerpo anti-hCD3 y el otro brazo es de un anticuerpo anti-hCD20, como se describe en el documento WO2014047231.

El anticuerpo 1, 9F7_VH_IgG4 _GGG-(233-236), se preparó mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning (Agilent Technologies, Inc.; N.° de cat.210518) siguiendo el protocolo del fabricante y comenzando con una región CH de IgG4 quimérica (que contenía las modificaciones S228P y ELLG233-236PVA; véase el documento WO2014047231). Después de la confirmación de la secuencia, la región codificante se movió a un vector parental utilizando sitios de restricción Xho1-Not1 para evitar cualesquiera mutaciones en la región no codificante y posteriormente generando un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada, que tiene las modificaciones de bisagra de la SEQ ID NO: 1.

La secuencia de ácido nucleico de región variable anti-CD3 (9F7 VH; véase "L2K" basado en el documento WO2004/106380) se amplificó y se introdujo en el mismo plásmido que la IgG4 de bisagra modificada S228P, GGG-(233-236) y la secuencia se confirmó utilizando PCR. El plásmido final se usó para producir el Anticuerpo 1 utilizando metodologías de cultivo celular estándar para aislar anticuerpos.

El Anticuerpo 2, 9F7_VH_IgG4_GG--(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 1 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con GG--(233-236) (SEQ ID NO: 2). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD3 (9F7 VH; véase el documento WO2004/106380) se amplificó y se introdujo en el mismo plásmido utilizando métodos estándar de biología molecular. El Ac 2 se aisló utilizando metodologías estándar.

El Anticuerpo 3, 9F7_VH_IgG4_G--(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 1 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con GG--(233-236) (SEQ ID NO: 3). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD3 (9F7 VH; véase el documento WO2004/106380) se amplificó y se introdujo en el mismo plásmido utilizando métodos estándar de biología molecular. El Ac 3 se aisló utilizando metodologías estándar.

El Anticuerpo 4, 9F7_VH_IgG4_No_G(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 1 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con GG--(233-236) (SEQ ID NO: 4). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD3 (9F7 VH; véase el documento WO2004/106380) se amplificó y se introdujo en el mismo plásmido. El Ac 4 se aisló utilizando metodologías estándar.

El anticuerpo 5, 3B9_VH_IgG4 _GGG-(233-236), se preparó mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning (Agilent Technologies, Inc.; N.° de cat.210518) siguiendo el protocolo del fabricante y comenzando con una región CH de IgG4 quimérica (que contenía las modificaciones S228P y ELLG233-236PVA; véase el documento WO2014047231). El anticuerpo 5 es un anticuerpo anti-CD20 bivalente, monoespecífico y la secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD20 (3B9 VH) se aisló utilizando metodologías estándar como se describe en el documento WO2014047231.

El Anticuerpo 6, 3B9_VH_IgG4_GC--(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 5 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con GG--(233-236) (SEQ ID NO: 2). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD20 (3B9 VH; véase el documento WO2014047231) se aisló utilizando metodologías estándar.

El Anticuerpo 7, 3B9_VH_IgG4_G—(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 5 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con G—(233-236) (SEQ ID NO: 3). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD20 (3B9 VH; véase el documento WO2014047231) se aisló utilizando metodologías estándar.

El Anticuerpo 8, 3B9_VH_IgG4_No_G(233-236), se fabricó análogamente al Anticuerpo 5 utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar un constructo de vector con la CH de IgG4 de bisagra modificada con No_G(233-236) (SEQ ID NO: 4). La secuencia de ácido nucleico de la región variable anti-CD20 (3B9 VH; véase el documento WO2014047231) se aisló utilizando metodologías estándar.

Los dominios variables de la proteína antitransmembrana (TM) del anticuerpo 9 (B6H12.2, obtenido de BioXCell, N.° de cat. BE0019-1) se clonaron en un plásmido que contenía el ácido nucleico de IgG4 de bisagra modificada S228P, GGG-(233-236), mediante métodos descritos de manera similar para el Anticuerpo 1.

El anticuerpo 10, B6H12.2_VH_IgG4_PVA se fabricó de acuerdo a los protocolos descritos en el presente documento, que tiene un dominio Fc de IgG4 quimérico (S228P y ELLG233-236PVA).

El anticuerpo 11, anticuerpo anti-FELD1_VH_IgG4_PVA, es un isotipo emparejado con el Anticuerpo 10, que tiene un dominio Fc de IgG4 quimérico (S228P y ELLG233-236PVA).

El anticuerpo de control A (Lote-L2), 9F7_VH_IgG4, es un anticuerpo de isotipo IgG4 humano antiCD3 (9F7 VH; véase el documento WO2004/106380) (excepto que tiene una mutación de CH3* 435R y 436F, denominada la mutación en estrella; véase el documento US20100331527A1).

El anticuerpo de control B (Lote-L2), 9F7_VH_IgG1, es un anticuerpo de isotipo IgG1 humano antiCD3 (9F7 VH; véase el documento WO2004/106380).

Anticuerpo de control C: 9F7_VLx3B9_VH_IgG4, se fabricó de acuerdo con los protocolos descritos en el documento WO2014047231. El Ac de control C es un anticuerpo monoclonal antiCD3xanti-CD20 biespecífico que tiene una cadena pesada de IgG4 de tipo silvestre (salvo un brazo tiene la mutación en estrella en la región CH3 para facilitar el aislamiento del anticuerpo biespecífico).

El anticuerpo de control D (Lote-L5): 9F7_VLx3B9_VH_IgG4_PVA, se fabricó de acuerdo con los protocolos descritos en el documento WO2014047231. El Ac de control D es un anticuerpo monoclonal anti-CD3xanti-CD20 biespecífico que tiene una cadena pesada de IgG4 de tipo silvestre [IgG4(S228P y ELLG233-236PVA) quimérica, salvo una cadena pesada tiene la mutación en estrella en la región CH3 para facilitar el aislamiento del anticuerpo biespecífico].

Anticuerpo de control E: El anticuerpo monoclonal Anti-FelD1 se une a un antígeno felino sin reactividad cruzada con CD20 o CD3 humano. Este control de anticuerpo no específico de IgG1 se obtuvo mediante métodos descritos en la Publicación PCT N.° WO2013/166236, publicada el 7 de noviembre, 2013.

Anticuerpo de control F: es una preparación de lotes pequeños (sobrenadante) de 9F7 (antiCD3) con el Fc de IgG4 quimérico (S228P y ELLG233-236PVA) (véase también el documento WO2014047231).

Ac de control G: 9F7_VH_IgG4_PVA se fabricó de acuerdo con los protocolos descritos en el documento WO2014047231(Lote n.° 2, purificado). El Ac de control G es un anticuerpo monoclonal anti-CD3 monoespecífico que tiene una cadena pesada de IgG4 modificada [IgG4(S228P y ELLG233-236PVA) quimérica, salvo una cadena pesada tiene la mutación en estrella en la región CH3 para facilitar el aislamiento del anticuerpo biespecífico].

Ac de control H (Lote n.° 02-091210): 3B9_VH_IgG1 es un anticuerpo de isotipo IgG1 humano antiCD20 (3B9 VH; véase el documento WO2004/106380).

Ac de control I (Lote n.° 01-110607): 3B9_VH_IgG4 es un anticuerpo de isotipo IgG4 humano antiCD20 (3B9 VH; véase el documento WO2004/106380).

Ac de control J (Lote n.° L1): 9F7_VK x3B9_VH_IgG4_PVA se fabricó de acuerdo con los protocolos descritos en el documento WO2014047231. El Ac de control J es un anticuerpo monoclonal anti-CD3xanti-CD20 biespecífico que tiene una cadena pesada de IgG4 de tipo silvestre [IgG4(S228P y ELLG233-236PVA) quimérica, salvo una cadena pesada tiene la mutación en estrella en la región CH3 para facilitar el aislamiento del anticuerpo biespecífico].

Ejemplo 2: Pérdida de afinidad de los receptores Fcv

Los anticuerpos de bisagra modificada (es decir, reemplazo de bisagra GGG-, GG--, G— o no-G; Anticuerpos 1-4) y diversos anticuerpos de control se sometieron a prueba para la afinidad de unión a los receptores Fcy mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR ; del inglés, surface plasmon resonance). Los controles incluyeron el Ac de control D (antiCD3xantiCD20-sIgG4 (S228P y ELFG233-236p Va ), Ac de control B (antiCD3, isotipo IgG1 humano) y Ac de control A (antiCD3, isotipo IgG4 humano).

Brevemente, se realizaron experimentos de SPR a 25 ° C en un instrumento Biacore T200 empleando un chip revestido con carboximetildextrano (CM-5). Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-penta-histidina (G E Healthcare) se inmovilizó sobre la superficie del chip sensor c M-5 utilizando química de acoplamiento de amina estándar. 140UR-376UR de proteínas FcyR humanas o de mono marcadas con His se capturaron sobre el chip CM-5 acoplado a amina anti-penta-histidina (o en el caso de FcRn, aproximadamente 155-299 UR (en inglés, RU) de constructos mutantes FcRn se inmovilizaron sobre un chip Biacore recubierto de anti-myc a alta densidad) y se inyectaron soluciones madre de anticuerpos a 20 pl/min durante 2,5 min sobre las proteínas capturadas y se diluyeron en serie. Se controló la respuesta de unión de mAb y para receptores de baja afinidad, se calculó el equilibrio de unión en estado estacionario. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (K^d) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: K^d (M) = kd / ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). Algunos KD se derivaron utilizando la constante de disociación de equilibrio de estado estacionario; NB = sin unión observada.

Un anticuerpo anti-CD3 designado 9F7 que tiene una región constante de cadena pesada que incluye las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 designadas de segmentos de bisagra en los restos 226-236 y de isotipo IgG4 humano, se sometió a prueba para la afinidad de unión a FcyRI, RIIA, RIIB y RIII humanos. Los controles incluyeron el mismo anticuerpo con isotipos IgG1 o IgG4 de tipo silvestre y el mismo anticuerpo con isotipo IgG4 con una modificación diferente de la región bisagra (es decir, la modificación de la bisagra tiene las posiciones 226-236 ocupadas por CPPCPAPPVA-, las mismas secuencias que en la IgG2 humana, por lo que se denomina Fcquimérico). En el formato Fc quimérico de IgG4, los segmentos restantes de la región constante son IgG4 humana. En el formato Fc quimérico de IgG1, los segmentos CH1 y CH3 son IgG1 humana y CH2 es IgG4 humana.

Los datos muestran que la unión se reduce a niveles de fondo en todos los Anticuerpos 1-4 de bisagra modificada para cada uno de los FcyRI, IIA, IIB y III humanos. Por el contrario, la unión de los anticuerpos IgG1 e IgG4 de Fcquimérico se reduce a niveles de fondo para FcyRI y Fcylll, pero sigue siendo significativa para FcyRIIA y RIIB. Todos los Anticuerpos 1-4 modificados con bisagra mantienen la unión a FcRn, comparable a los formatos IgG4 e IgG4 de bisagra quimérica. Véanse las Figs. 6-10.

Ejemplo 3: Análisis de citotoxicidad

Las células U937 son una línea celular de monocitos que expresa FcyRI y FcyRIIA. Se utilizaron células U937 como control efector de destrucción positivo en el siguiente ensayo de citotoxicidad. Como tal, se sometió a prueba la capacidad de los anticuerpos con regiones CH quiméricas para destruir células U937 a través de interacciones F c/FcyR. Los ensayos de destrucción de calceína se realizaron utilizando el siguiente protocolo: Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC; del inglés, Peripheral Blood Mononuclear Cells) humanas y de cynomolgus sobre Ficoll-Paque (G E Healthcare Life Sciences) o a través de medios de separación de células por densidad de linfocitos de mamíferos (Cedarlane Laboratories), respectivamente. Las PBMC aisladas se activaron durante un periodo de varios días con medios que contenían IL-2 humana recombinante (30U/ml) y perlas de activación de linfocitos T (anti-CD3/CD28 para PBMC humanas, anti-CD2/CD3/CD28 para PBMC de cinomolgo). Los linfocitos T activados se aislaron de las PBMC mediante centrifugación, a continuación, se resuspendieron en 1 ml de medios. Las perlas magnetizadas se eliminaron de los linfocitos T. Las células diana (U937) se etiquetaron con calceína, a continuación, se lavaron y se incubaron (10.000 células por pocillo) con diluciones en serie con factor de dilución de 15 de Ac/sup purificado y linfocitos T humanos CD8+ inmortales (100.000 células/pocillo) durante 3 h a 37C (relación efector:diana - 10:1). Después de la incubación, las placas se centrifugaron y el sobrenadante se transfirió a placas de fondo negro transparente para el análisis de fluorescencia. Cada CE50, definida como la concentración molar de anticuerpo que induce un 50% de citotoxicidad, se determinó utilizando Prism (GraphPad Software, San Diego, California). Los valores se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros (Fig. 11A).

Los experimentos anteriores se realizaron con extractos brutos de los anticuerpos en sobrenadantes de cultivos celulares (Fig. 11A). Se realizaron experimentos análogos con los mismos anticuerpos purificados sobre columnas de afinidad estándar o utilizando el método descrito en Davis et al. (véase el documento US2010/0331527) para anticuerpos biespecíficos (Fig. 11B).

Los datos muestran que todos los anticuerpos de bisagra modificada 1-4 tenían sólo niveles de citotoxicidad de fondo como fue también el caso del anticuerpo IgG4 de Fcquimérico. Los anticuerpos de tipo silvestre IgG1 e IgG4 mostraron una fuerte citotoxicidad debido a su capacidad para interactuar con F cyRI y F cyRIIA. Véanse la Fig. 11A y la Fig. 11B.

Ejemplo 4: Activación de células Jurkat

Este ejemplo prueba si un anticuerpo puede activar células Jurkat (línea celular de leucemia de linfocitos T) transformadas con un constructo NFAT-luciferasa que actúa como marcador de activación. La activación requiere que un anticuerpo se ancle en células HEK293 que expresan F cyRIIA o F cyRIIB.

Se incubaron células Jurkat/NFAT-Luc (50.000/pocillo) con células diana (50.000/pocillo) en presencia de diluciones en serie de diferentes anticuerpos con (Fig. 12B, 12D) o sin (Fig. 12A, 12C) anticuerpo contra un antígeno irrelevante (FeID1) (1,5 mg/ml) durante 4h a 37C. Se añadió One-Glo (Promega) para medir la actividad luciferasa.

Los datos muestran que todos los Anticuerpos 1-4 de bisagra modificada tenían sólo niveles de activación de fondo. Véanse las Figs. 12A - 12D. Por consiguiente, todos los Anticuerpos de bisagra modificada 1-4 carecen de capacidad para unirse a F cyRIIA o IIB sobre células HEC.

Un anticuerpo de control positivo del anticuerpo IgG4 humano de tipo silvestre mostró una fuerte activación que se redujo a niveles cercanos al fondo por el anticuerpo anti-FelD1, que compite por un sitio de anclaje sobre HEK293.

Para demostrar que la falta de activación de las células Jurkat resultó de la disminución de la capacidad de unión de F cyR de los anticuerpos de bisagra modificada en lugar de una capacidad alterada de los anticuerpos para unirse a su diana CD3, se realizó un ensayo con los anticuerpos entrecruzados en una superficie de una placa. Las placas Maxisorp se revistieron con una dilución en serie con factor de dilución de 2 de diferentes Ac comenzando a 10 nM durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 50.000 células Jurkat NFAT Luc por pocillo y los medios para completar el volumen total a 100ul/pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 5 horas. Se añadieron 100ul de One-Glo (Promega) para medir la actividad luciferasa. Transferir a placas nunc blancas opacas antes de leer la actividad de luciferasa. En este experimento, todos los anticuerpos de bisagra modificada 1-4 mostraron una activación similar a los controles emparejados con el isotipo IgG4. Véase la Fig. 13.

Ejemplo 5: Ensayo ADCC

En este ensayo, los anticuerpos de bisagra modificada tienen regiones variables (3B9_VH) que se unen al antígeno diana de la superficie celular CD20 (Anticuerpos 5 a 8, descritos anteriormente). Las células diana CD20 positivas (Daudi) se etiquetaron con calceína, a continuación, se lavaron y se incubaron (10.000 células por pocillo) con diluciones en serie con factor de dilución de 6 de anticuerpo purificado y células NK92_CD16V (células NK92 modificadas por ingeniería genética para expresar el alelo V de mayor afinidad de FcyRllla en 50.000 células/pocillo) durante 4 h a 37C (relación efector: objetivo - 5:1). La lisis de las células diana se determinó midiendo la fluorescencia de la calceína en el sobrenadante. El porcentaje de citotoxicidad y la CE50 se calcularon de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 3. La Fig. 14 muestra que los anticuerpos de bisagra modificada no median la actividad de ADCC (Fig. 14) contra las células Daudi.

Ejemplo 6: Evaluación PK del anticuerpo monoclonal anti-TM con bisagra modificada

Se produjeron anticuerpos que tienen dominios variables que se unen a una proteína transmembrana multipaso (TM; del inglés, Multipass Transmembrane) ampliamente expresada en tejidos normales y regulada positivamente en diversos cánceres utilizando técnicas bien conocidas (véanse el documento US 5.057.604; documento WO 2011/143624; y documento WO 97/27873).

Evaluación de la tasa de aclaramiento farmacocinético (PK): un anticuerpo anti-TM que tiene una bisagra modificada (Anticuerpo 9) y un Fc de IgG4 quimérico (Anticuerpo 10), así como un control de isotipo con Fc de IgG4 quimérico (Anticuerpo 11) se evaluaron en ratones de tipo silvestre (TS; en inglés, WT) C57BL/6. Para cada mAb anti-TM o control de isotipo, se administró una dosis subcutánea (s.c .) de 1 mg/kg a cohortes de tres ratones. Los ratones se sangraron antes de la dosificación y las muestras de suero se designaron como un presangrado o punto temporal cero. Todos los ratones se sangraron a las 6 horas, 1, 3, 7, 10 y 14 días después de la inyección para el análisis de PK. Las fracciones de suero de las extracciones de sangre se separaron y se congelaron a -80 ° C hasta que se realizó el análisis.

Determinación del nivel total de fármaco en suero mediante ELISA: Los niveles de anticuerpos anti-TM circulantes se determinaron mediante análisis de anticuerpos humanos totales utilizando un inmunoensayo ELISA . Brevemente, se inmovilizó un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch, n.° 109-005-098) a 1 pg/ml en PBS en placas de 96 pocillos durante la noche y las placas se bloquearon con BSA al 5%. El fármaco que contenía las muestras de suero en diluciones en serie de seis dosis y los estándares de referencia de los anticuerpos respectivos en diluciones en serie de 12 dosis se transfirieron a las placas preparadas y se incubaron durante una hora. Los anticuerpos anti-TM unidos a placa se detectaron a continuación utilizando un anticuerpo policlonal anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, n.° 109-035-098). Las placas se revelaron con sustrato TMB (BD Pharmingen, n.° 51-2606KC, n.° 15-2607KC) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante y se registraron las señales de densidad óptica (DO; en inglés, OD) a 450 nm utilizando un lector de placas Victor X4 Multimode de Perkin Elmer. Las concentraciones de anticuerpo anti-TM en los sueros se calcularon basándose en la curva de calibración estándar de referencia generada utilizando el software GraphPad Prism.

A los ratones C57BL/6 TS se les administró una sola dosis s.c. de 1 mg/kg de Anticuerpo 9, Anticuerpo 10 o Control de isotipo (Ac 11). Las concentraciones de anticuerpo total se determinaron en 6 puntos temporales durante un período de tiempo de 14 días. Las concentraciones totales de anticuerpos anti-TM para cada anticuerpo se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Concentraciones^ de anticuer os en suero días 0 025 1 3 7 14

Los perfiles de concentración media frente al tiempo muestran que los tres anticuerpos lograron una concentración sérica máxima (C máx) el día 1. El anticuerpo 9, el anticuerpo 10 y el control de isotipo tuvieron valores de C máx comparables de 13, 14 y 12 |jg/ml, respectivamente. Los tres anticuerpos exhibieron una eliminación lineal con perfiles de PK superpuestos. Estos perfiles PK son similares a los observados en estudios previos para controles de isotipos de IgG1 e IgG4(S228P) (datos no mostrados). El día 14, el Anticuerpo 9 y el control de isotipo tienen niveles medios de fármaco de alrededor de 5 ^g/ml, si bien el Anticuerpo 10 tuvo niveles medios de fármaco de alrededor de 6 ^g/ml. LISTADO DE SECUEN CIAS SEQ ID NO: 1 GGG-(233-236)

PPCPAPGG G -GPSVF

SEQ ID NO: 2 GG--(233-236)

CPPCPAPGG--GPSVF

SEQ ID NO: 3 G---(233-236)

CPPCPAPG---GPSVF

SEQ ID NO: 4 No_G-(233-236)

CPPCPA P G PSVF SEQ ID NO: 5 lgG4 _GGG-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT

CVW DVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRW SVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS

SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 6 lgG4 GG-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT

CVW DVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRW SVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS

SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 7 lgG4_G—(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS W NSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGPSVFLFPPKPKDT LM ISRTPEVT CVW DVSQ ED

PEVQFNW YVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRW SVLTVLH QDW LNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK

GQPREPQVYT LPPSQEEM TK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL

TVDKSRW QEGNVFSCSVM HE ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 8 lgG4 _No_G-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVW DVSQED

PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK

GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL

TVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 9 lgG4* _GGG-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT

CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS

SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 10 lgG4* _GG-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT

VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT

CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS

SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSLGK SEQ ID NO: 11 lgG4* _ G —(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNRFTQKS LSLSLGK

SEQ ID NO: 12 lgG4* _No_G-(233-236)

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS W N SGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APG PSVFLFPPKPKD T LM ISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQ FN W YVD GVEVHN AKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDW LNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK G Q PREPQ VYT LPPSQ EEM TK NQVSLTCLVK GFYPSD IAVE W ESNGQPENN YKTTPPVLDS D G SFFLYSRLTVD KSRW Q EGN VFSCSVM H E ALHNRFTQKS LSLSLGK

Las SEQ ID NO: 13-15 son IgG1, IgG2 e IgG4 humanas de tipo silvestre como se muestra en las Figs. 2-4.

SEQ ID NO: 16 IgGI GGG

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP

KSCDKTHTCPPCP APGGGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS

HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK

EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC

LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW

QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 17 IgGl GG

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APGGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 18 IgGI G

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 19 IgGI no G

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 20 IgGI* GGG

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APGGGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21 IgGl* GG

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APGGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 22 IgGI * G

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 23 IgGI * no G

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCP APG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRFT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 24: lgG2 GGG

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APGGGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 25: lgG2 GG

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APGGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 26 lgG2 G

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 27 lgG2 No G

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 28: lgG2* GGG

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APGGGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNRFTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 29 ^: lgG2* GG

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una cadena pesada de inmunoglobulina IgG4 humana que comprende una región constante, en donde las posiciones 233-236 dentro de un dominio de bisagra son G, G, G y desocupada; G, G, desocupada y desocupada; G, desocupada, desocupada y desocupada; o todas desocupadas, con posiciones numeradas mediante la numeración de EU.

2. La cadena pesada de inmunoglobulina de la reivindicación 1, en donde las posiciones 226-229 son CPPC.

3. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio de bisagra comprende CPPCPAPG GG -GPSVF (SEQ ID NO: 1), CPPCPAPGG--GPSVF (SEQ ID NO: 2), CPPCPA PG —G PSVF (SEQ ID NO: 3) o CPPCPA P— G PSVF (SEQ ID NO: 4).

4. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente, en donde la región constante tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8 o una variante de las mismas que tiene hasta cinco deleciones, sustituciones o inserciones.

5. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8.

6. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8.

7. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

8. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

9. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

10. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente en donde la región constante consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

11. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente, en donde la región constante tiene un dominio CH3 que comprende las modificaciones H435R y Y436F según la numeración de EU.

12. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente unida en el extremo N a una región variable de cadena pesada.

13. La cadena pesada de inmunoglobulina de la reivindicación 12 duplicada con una cadena ligera de inmunoglobulina.

14. La cadena pesada de inmunoglobulina de la reivindicación 12 duplicada con una cadena ligera de inmunoglobulina como un heterodímero que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras.

15. La cadena pesada de inmunoglobulina de la reivindicación 14, en donde:

(a) las dos cadenas pesadas son las mismas; o

(b) las dos cadenas pesadas son diferentes.

16. La cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier reivindicación precedente unida en el extremo N a un polipéptido de unión, en donde opcionalmente el polipéptido de unión es un dominio extracelular.

17. La cadena pesada de inmunoglobulina de la reivindicación 16 unida a través de un enlazador al polipéptido de unión, en donde opcionalmente el polipéptido de unión es un dominio extracelular.

18. La cadena pesada de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, en donde:

(i) la afinidad de unión para cada F cyRI, F cyRIIA, FcyRIIB y F cyRIIIA se reduce a un nivel de fondo y/o

(ii) la actividad de ADCC se reduce a un nivel de fondo.