TWI487535B

TWI487535B - 類鐸受體３（ｔｏｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ３）拮抗劑，方法及用途

Info

Publication number: TWI487535B
Application number: TW094141961A
Authority: TW
Inventors: Jill M Carton; Shizhong Chen; Mark Cunningham; Anuk Das; Karen Duffy; Jill M Giles-Komar; Theresa J Goletz; David M Knight; Roberta Lamb; Mouhamadou L Mbow; Kristen Picha; Gopalan Raghunathan; Mateo Lani San; Robert T Sarisky; Vedrana Stojanovic-Susulic; Nicole Stowell; Raymond Sweet; Shanrong Zhao
Original assignee: Centocor Inc
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2005-11-29
Publication date: 2015-06-11
Also published as: NZ555475A; KR20070090969A; BRPI0518664A2; TW200631594A; AR051836A1; IL183541A; WO2006060513A2; EP1824514B1; WO2006060513A3; MX2007006442A; US20060115475A1; HK1111360A1; CA2589636C; KR101317264B1; EA200701192A1; NO20073293L; EP1824514A4; CA2589636A1; HK1131744A1; IL183541A0

Description

類鐸受體3(TOLL LIKE RECEPTOR 3)拮抗劑，方法及用途

相關申請案之交互參照

本申請案請求2004年11月30日申請的美國臨時申請案60/631,815、2004年12月15日申請的美國臨時申請案60/636,399、2005年1月6日申請的美國臨時申請案60/641,877、2005年8月31日申請的美國臨時申請案60/713,195及2005年10月18日申請的美國臨時申請案60/727,610，其全部內容併入本文以資參考。

發明領域

本發明乃有關類鐸受體3(TLR3)拮抗劑、編碼TLR3拮抗劑之多核苷酸或其片段、及彼等之製法及用途。

發明背景

與炎性疾病有關聯之病變代表保健上受到重大挑戰，有時會痛苦、衰弱及致命。舉例而言，在美國，敗血症及與敗血症相關的疾病每年影響超過750,000人，其致死率為28－50%，每年造成215,000人死亡(Natansonet al.,Crit.Care Med.26 ：1927－1931(1998)；Anguset al.,Crit.Care Med.29 ：1303－1310(2001))。其他炎性疾病例如炎性腸道疾病(IBD)、克隆氏症(Crohn’s disease)與潰瘍性結腸炎每年於美國影響超過1百萬人(Hanaueret al.,Rev.Gastroenterol.Disord.3 ：81－92(2003))。

影響肺功能之炎性肺部疾病例如慢性阻塞性肺疾(COPD)、氣喘與肺感染在美國亦影響相當數量的人民，例如，COPD，據估計影響約1千萬美國人，且流行率正上升中(Mapelet al.,Manag.Care Interface 17 ：61－66(2004))。與彼等炎性疾病相關之病變及彼等疾病之惡化對於健康與經濟具有重大之衝擊。

肺部疾病例如氣喘與COPD之惡化，其特徵為症狀加劇及肺功能衰退。病毒感染與許多肺部疾病相關聯(Johnston,Am.J.Respir.Crit.Care Med.152 ：S46－52(1995)；Bandiet al,FEMS Immunol.Med.Microbiol.37 ：69－75(2003))，一般相信其為惡化之主要原因。跟隨病毒感染之後，肺部中促炎性細胞介素之分泌代表促成多種肺部疾病的炎性反應之決定性步驟(Gemet al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.28 ：731－737(2003)；Panina－Bordignonet al.,Curr.Opin.Pulm.Med.9 ：104－110(2003))。

再者，胰島素抗阻已被認定係所謂代謝症候群之必要特徵，其包括葡萄糖耐受不良、胰島素抗阻、肥胖、高三酸甘油酯血症、低HDL膽固醇、高血壓、及加速型動脈硬化症(Wisse,J.Am.Soc.Nephrol.15 ：2792－20 800(2004))。雖然2型糖尿病與胰島素抗阻間之傾向已清楚地被確立，控制胰島素抗阻及2型糖尿病之分子與細胞機制仍很模糊。

肥胖個體促炎性細胞介素(例如TNF－α、IL－1b與IL－6)含量升高之事實已促成由肥胖誘發之胰島素抗阻係炎性疾病之假說(Karinet al.,Nat.Rev.Drug Discov.3 ：17－26(2004))。因此，炎症、肥胖、胰島素抗阻及異常脂質代謝可能構成代謝症候群之常見特徵。事實上，可能干擾炎性轉錄因子(例如NF－kβ與IKKβ)之非類固醇藥物，例如環氧化酶抑制劑，增加2型糖尿病動物模式與人類病患之胰島素敏感性(Karinet al. ，文獻同前)。此外，由處於IKKb狀態的基因剔除小鼠於髓樣細胞中表現總體胰島素敏感性且成為免於胰島素抗阻之能力顯示，新近數據為胰島素抗阻與炎症間之關係提供支撐(Arkanet al.,Nat.Med.11 ：191－198(2005)；Caiet al.,Nat.Med. 11：183－90(2005))。總之，彼等結果為肥胖、胰島素抗阻及2型糖尿病與炎性疾病之間的關聯提供強有力之基本原由。

宿主免疫系統對微生物抗原之識別係透過固有免疫受體而傳介，其活化作用代表開始炎性反應之重要步驟。類鐸受體(TLR)代表與生俱來之免疫受體家族，於傳介對外來抗原之免疫反應中扮演決定性角色。舉例而言，TLR3為一種哺乳動物模式識別受體，可識別雙股(ds)RNA以及合成用雙股RNA類似物多－核糖肌苷酸－核糖胞苷酸(多(I：C))(Alexopoulouet al.,Nature 413 ：732－238(2001))。此外，已證實TLR3可識別內源配位體(例如自壞死細胞釋放之mRNA)(Karikoet al.,J.Biol.Chem.26 ：12542－12550(2004)，暗示於發炎部位之壞死細胞死亡可能促成TLR3之活化。

利用多(I：C)或利用內源mRNA配位體之TLR3活化作用誘發促炎性細胞介素與化學激素之分泌，此發現暗示TLR3促效劑於與感染相關之炎症期間調控疾病後果。因此，活體內之TLR3接合作用被認為係鑑於病毒感染(Tabetaet al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA 101 ：3516－3521(2004))或與發炎相關之壞死(Karikoet al.,J.Bid.Chem.26 ：12542－12550(2004))而發生。整體而言，彼等資訊說明TLR3之接合觸發磷酸化作用及轉錄活化結果等級聯反應，導使產生被認為係促成固有免疫力的許多炎性細胞介素(綜述於Takeda and Akira,J.Derm.Sci.34 ：73－82(2004))。再者，彼等資訊暗示持續之TLR3活化作用可能係調控與炎性疾病相關的感染之關鍵成分。已公告之資訊證實，促炎性細胞介素之大量表現與全身性發炎反應症候群、與感染相關的急性細胞介素發作(綜述於Van Amersfoortet al.,Clin.Microbiol.Rev.16 ：379－414(2003))、由免疫傳介之慢性疾病例如類風濕性關節炎(綜述於Miossecet al.,Curr.Opin.Rheumatol.16 ：218－222(2004))及炎性腸道疾病(綜述於Ogata and Hibi,Curr.Pharm.Des.9 ：1107－1113(2003))相關，彼等表現提供前述假說之支撐。

雖然試管內研究已證明刺激具有多(I：C)之肺上皮細胞引起多種細胞介素、化學激素之分泌且誘發轉錄因子及使TLRs增加表現(Iekiet al.,Clin.Exp.Allergy 34 ：745－52(2004)；Shaet al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.31 ：358－64(2004))，然而此等事件之生理關聯性仍不清楚。

與炎性疾病及其他(例如與感染有關聯者)相關之彼等病變對於健康與經濟具有重大之衝擊。然而，儘管許多醫藥領域已有進步，適用於許多彼等疾病之處理選擇與治療相對地極少。

例如，使用高劑量皮質類固醇與抗－IgE(例如XOLAIR廠牌之奧馬佐單抗(omalizumab))處理肺部疾病之惡化；已證實吸入性皮質類固醇組合β2促效劑對於減少惡化之發生具有效力。然而，由於彼等療法僅降低惡化進展之風險且與重大的副作用相關，因此業界對於預防及治療肺部疾病惡化之替代治療方法有所需求。

因此，存在瞭解TLR3於炎性疾病上的角色及開拓此角色以開發有效治療彼等疾病之製劑(例如拮抗劑)之需求。

發明概述

本發明之一態樣為抑制選自包括IL－6、IL－8與MIP1－α的細胞介素之細胞生產之類鐸受體3(TLR3)拮抗劑。

本發明之一態樣為與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示之重鏈互補決定區(CDRs)之胺基酸序列及如SEQ ID NOs：19、21與23所示之輕鏈CDRs之胺基酸序列。

本發明之另一態樣為與TLR3具反應性之單離抗體，其含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示之重鏈互補決定區(CDRs)之胺基酸序列及如SEQ ID NOs：19、21與23所示之輕鏈CDRs之胺基酸序列。

本發明之另一態樣為一種單離抗體，其具有如式(I)所示之V_H CDR1胺基酸序列：Thr Thr Tyr Trp Xaa₁ His(I)式中Xaa₁ 為Ile或Met(SEQ ID NO：61)；如式(II)所示之V_H CDR2胺基酸序列：Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa₂ Xaa₃ Glu Lys Xaa₄ Lys Thr(II)式中Xaa₂ 為Tyr或Gly，Xaa₃ 為Asn或Ala及Xaa₄ 為Phe或Gly(SEQ ID NO：62)；及如式(III)所示之V_H CDR3胺基酸序列：Val Gly Val Xaa₅ Ile Thr Thr Phe Pro Tyr(III)式中Xaa₅ 為Met或Ile(SEQ ID NO：63)；及具有如SEQ ID NOs：19、21與23所示之胺基酸序列之V_L CDRs。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示之CDR胺基酸序列之抗體重鏈之單離多核苷酸。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NOs：19、21與23所示之CDR胺基酸序列之抗體輕鏈之單離多核苷酸。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NOs：6、25、27、29、31、45、47、49、51或53所示之胺基酸序列之抗體重鏈之單離多核苷酸。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NOs：16、33、35、37或39所示之胺基酸序列之抗體輕鏈之單離多核苷酸。

本發明之另一態樣為治療或預防炎性疾病之方法，該方法包括投與有其需要之病患預防有效量之TLR3拮抗劑足以治療或預防該炎性疾病之時間。

本發明之另一態樣為增加細胞增殖率之方法，該方法包括使TLR3拮抗劑與表現TLR3受體之細胞接觸足以增加該細胞增殖率之時間。

發明之詳細說明

本說明書中引用之所有公告案，包括惟不限於專利案及專利申請案，均併入本文以資參考。

本文所用之「拮抗劑」一詞意指利用任何機制部分或完全抑制另一分子(例如受體)之效力之分子。本文所用之「TLR3拮抗劑」或「與TLR3具反應性」之化合物係敘述能直接或間接，實質上抵消、減少或抑制TLR3生物活性或TLR3受體活化作用之分子。此等拮抗劑可為，例如，小有機分子、胜肽、多肽、融合蛋白、抗體、抗體片段、模擬體或多核苷酸。

本文所用之「抗體」一詞廣義上意指及包含免疫球蛋白或抗體分子包括多株抗體、單株抗體包括鼠類、人類、人類適應、人類化與嵌合型單株抗體及抗體片段。

一般而言，抗體係展現與專一抗原之結合專一性之蛋白質或胜肽。完整之抗體為雜四聚體醣蛋白，由兩個完全相同的輕鏈與兩個完全相同的重鏈組成。典型地，各輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接；不同的同功型免疫球蛋白之重鏈，其二硫鍵個數也不同。各重鏈與輕鏈亦具有規則相間之鏈間二硫橋鍵。各重鏈於一端具有可變區(V_H )，其後為一些恒定區。各輕鏈於一端具有可變區(V_L )，另一端具有恒定區；輕鏈之恒定區與重鏈之第一恒定區對齊，輕鏈可變區與重鏈之可變區對齊。任一種脊椎動物之諸抗體輕鏈根據其恒定區之胺基酸序列，可歸入兩個清楚區隔類型之一者，亦即κ或λ。

免疫球蛋白視其重鏈恒定區胺基酸序列而定，可分為五個主要種類，亦即IgA、IgD、IgE、IgG與IgM。IgA與IgG再進一步細分為IgA₁ 、IgA₂ 、IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 與IgG₄ 等同功型。

「抗體片段」一詞意指部分完整抗體，通常為完整抗體之抗原結合或可變區。抗體片段之實例包含Fab、Fab’、F(ab’)₂ 與諸Fv片段、雙功能抗體(diabodies)、單鏈抗體分子及由至少兩個完整抗體形成之多專一性抗體。

本文所用之「抗原」一詞意指具有直接或間接產生抗體能力之任何分子。「抗原」之界定內尚包含編碼蛋白質之核酸。

「CDRs」係界定為抗體之互補決定區胺基酸序列，彼等為免疫球蛋白重鏈與輕鏈之高可變區。參閱，例如，Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白可變部分中有三個重鏈及三個輕鏈CDRs或CDR區域。因此，本文所用之「CDRs」係指所有三個重鏈CDR、或所有三個輕鏈CDRs，或適當時，則為所有重鏈以及所有輕鏈。

CDRs提供抗體結合於抗原或抗原決定部位之多數接觸殘基。本發明所關注之CDRS係衍生自供者抗體可變重鏈與輕鏈序列，其包含天然存在的CDRs之類似物，該類似物亦共有或保留與彼等所從出的供者抗體相同之抗原結合專一性及/或中和能力。

本文所用之「上皮細胞」一詞意指源自動物之覆蓋部分游離表面(例如，皮膚)或填充管或腔(例如，結腸)的膜狀細胞組織之細胞。此等細胞可予以單離或包含部分或更高度有系統之細胞組群，例如見於組織、器官或彼等之試管內模式者。

「同質物」一詞意指與參照序列具有介於40%與100%間之序列同一性之蛋白質序列。hTLR3之同質物包括與已知hTLR3序列具有介於40%與100%間之序列同一性之多肽。兩個胜肽鏈間之同一性百分比可藉使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen Corp.,Carslbad,CA)AlignX模數預設設定值之成對排比法予以測定。「TLR3」意指hTLR3及其同質物。全長TLR3胺基酸序列及編碼用多核苷酸序列分別示於SEQ ID NOs：1與2。

本文所用之「組合」一詞意指所述製劑可於混合物中一起，呈單一製劑同時或呈單一製劑以任何順序相繼投與動物。

本文所用之「炎性疾病」一詞意指部分由細胞介素、化學激素、或炎性細胞(例如嗜中性白血球、單核白血球與淋巴細胞)活性所傳介之對細胞傷害之局部反應，其特徵於多數情形下為疼痛、紅、腫及喪失組織功能。本文所用之「炎性肺部疾病」意指侵襲肺部或與肺部相關聯之炎性疾病。

本文所用之「模擬體」一詞意指具下式(I)之蛋白質：(V1－Pep－Lk－V2－Hg－C_H 2－C_H 3)(t)(I)其中V1為免疫球蛋白可變區N端之一部分，Pep為與細胞表面TLR3結合之多肽，Lk為多肽或化學鍵結，V2為免疫球蛋白可變區C端之一部分，Hg為免疫球蛋白鉸合區域之一部分，C_H 2為免疫球蛋白重鏈C_H 2恒定區，C_H 3為免疫球蛋白重鏈C_H 3恒定區及t為1至10之整數。模擬體視構築體中存在的重鏈恒定功能部位胺基酸序列而定，可模擬不同種類的免疫球蛋白分子(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD與IgE)之性質與功能。於一些模擬體具體實例中，V1可能不存在。本發明模擬體拮抗劑透過與細胞表面TLR3結合而影響TLR3生物活性。

本文所用之「單株抗體」(mAb)一詞意指得自一群實質上同源抗體之抗體(或抗體片段)。單株抗體具高度專一性，典型地係針對單一抗原決定子。修飾詞「單株」表示實質上同源之抗體特性及不需要利用任何特定方法產生抗體。舉例而言，鼠類單株抗體可利用Kohleret al.,Nature 256 ：495－497(1975)之融合瘤方法製造。含有衍生自供者抗體(典型地為鼠類)之輕鏈與重鏈可變區結合衍生自接受者抗體(典型地為另一種哺乳動物例如人類)之輕鏈與重鏈恒定區之嵌合型單株抗體可利用揭示於美國專利案4,816,567之方法製備。具有衍生自非人類供者免疫球蛋白(典型地為鼠類)之CDRs及該分子剩餘之衍生自免疫球蛋白之部分係衍生自一或多種人類免疫球蛋白之人類適應單株抗體可利用熟習此項技藝人士已知之技術，例如揭示於美國專利案5,225,539中者，予以製備。視需要地，人類適應單株抗體可進一步利用揭示於Queenet al.,Proc.Natl Acad Sci(USA),86 ：10029－10032(1989)及Hodgsonet al.,Bio /Technology,9 ：421(1991)之技術，藉由併入經修改之架構支撐殘基以保存結合親和性予以修飾。

用於人類適應化之人類架構序列實例揭示於，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.ncbi.nih.gov/igblast；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.mrc－cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php；www.kabatdatabase.com/top.html；ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat；www.sciquest.com；www.abcam.com；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html；www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab；www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html；www.immunologylink.com；pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html；www.appliedbiosystems.com；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody；www.m.ehim－u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com；www.cancerresearchuk.org；www.biotech.ufl.edu；www.isac－net.org；baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html；www.recab.uni－hd.de/immuno.bme.nwu.edu；www.mrc~cpe.cam.ac.uk；www.ibt.unam.mx/vir/V_ice.html；http：//www.bioinf.org.uk/abs；antibody.bath.ac.uk；www.unizh.ch；www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html；www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.jerini.de；imgt.cines.fr；及Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)；各者全部內容併入本文以資參考。

缺少任何非人類序列之完全人類單株抗體可利用下述參考文獻之技術，以人類免疫球蛋白基因轉殖小鼠製備：例如，Lonberget al.,Nature 368 ：856－859(1994)；Fishwildet al.,Nature Biotechnology 14 ：845－851(1996)及Mendezet al.,Nature Genetics 15 ：146－156(1997)。亦可利用下述參考文獻之技術製備人類單株抗體並以噬菌體展示庫予以最適化：例如，Knappiket al.,J.Mol.Biol.296 ：57－86(2000)及Krebset al.,J.Immunol.Meth.254 ：67－84(2001)。

本文所用之「增殖率」一詞係指每單位時間細胞數之變化或每單位時間透過朝向細胞分裂之細胞週期展現進展標記之細胞數變化。此等標記可為形態上、DNA複製指標或經表現之基因產物。本文所用之「TLR3生物活性」或「TLR3受體活化作用」等詞係指配位體與細胞表面TLR3結果出現之任何活性。

本文使用習知之一及三字母胺基酸代碼如下：

內容組成

本發明乃有關能抑制由TLR3受體傳介的傳訊作用之拮抗劑及此等拮抗劑之用途。此等TLR3拮抗劑具有結合TLR3受體及抑制由TLR3受體傳介的傳訊作用等性質。可被該等拮抗劑抑制之TLR3傳訊作用之機制實例包括抑制激酶活性、轉錄減少或受體拮抗作用。能抑制利用其他機制之由TLR3受體傳介之傳訊作用之其他拮抗劑亦隸屬本發明多個態樣及具體實例範圍之內。彼等拮抗劑可作為研究試劑、診斷試劑及治療劑用。

本發明之一態樣為抑制選自包括IL－6、IL－8與MIP1－α的細胞介素之細胞生產之類鐸受體3(TLR3)拮抗劑。再者，本發明之拮抗劑可抑制RANTES之細胞生產。

於另一態樣中，本發明提供與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，具有如SEQ ID NOs：9(V_H CDR1)、11(V_H CDR2)與13(V_H CDR3)所示之重鏈互補決定區(CDRs)之胺基酸序列及如SEQ ID NOs：19(V_L CDR1)、21(V_L CDR2)與23(V_L CDR3)所示之輕鏈CDRs之胺基酸序列。一例示抗體為含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示之重鏈CDR胺基酸序列及如SEQ ID NOs：19、21與23所示之輕鏈CDR胺基酸序列之單株抗體。

本發明之另一態樣為與TLR3具反應性之單離抗體，其包含具有如SEQ ID NO：6所示胺基酸序列之V_H 及具有如SEQ ID NO：16所示胺基酸序列之V_L 。

本發明之另一態樣為編碼本發明任何抗體或其他蛋白質TLR3拮抗劑或其補體之單離多核苷酸。本文揭示特定之多核苷酸實例，然而，於既定表現系統中具有基因密碼簡併或密碼子偏愛，編碼本發明抗體或其他蛋白質TLR3拮抗劑之其他多核苷酸亦隸屬本發明範圍之內。

本發明之另一態樣為含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示CDR胺基酸序列之抗體重鏈。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NOs：19、21與23所示CDR胺基酸序列之抗體輕鏈之單離多核苷酸。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NO：6所示胺基酸序列之抗體重鏈之單離多核苷酸。一多核苷酸序列實例示於SEQ ID NO：5。

本發明之另一態樣為編碼含有如SEQ ID NO：16所示胺基酸序列之抗體輕鏈之單離多核苷酸。一多核苷酸序列實例示於SEQ ID NO：15。

本發明另一具體實例係適應人類之單株抗體，其含有如SEQ ID NO：25、27、29或31所示之V_H 胺基酸序列及如SEQ ID NO：33、35、37或39所示之V_L 胺基酸序列。編碼SEQ ID NO：25、27、29與31所示V_H 胺基酸序列及SEQ ID NO：33、35、37與39所示V_L 胺基酸序列之單離多核苷酸亦為本發明之態樣。彼等適應人類之單株抗體含有SEQ ID NOs：9、11與13所示之V_H CDR胺基酸序列及SEQ ID NOs：19、21與23所示之V_L CDR胺基酸序列。編碼SEQ ID NO：25、27、29與31之V_H 胺基酸序列之核酸序列分別例示於SEQ ID NOs：26、28、30與32。編碼SEQ ID NO：33、35、37與39之V_L 胺基酸序列之核酸序列分別例示於SEQ ID NOs：34、36、38與40。本發明適應人類單株抗體之一特定具體實例含有如SEQ ID NO：25所示之V_H 胺基酸序列及如SEQ ID NO：33所示之V_L 胺基酸序列。

本發明另一具體實例係單離抗體，其具有如下式(I)所示之V_H CDR1胺基酸序列：Thr Thr Tyr Trp Xaa₁ His(I)式中Xaa₁ 為Ile或Met(SEQ ID NO：61)；如式(II)所示之V_H CDR2胺基酸序列：Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa₂ Xaa₃ Glu Lys Xaa₄ Lys Thr(II)式中Xaa₂ 為Tyr或Gly，Xaa₃ 為Asn或Ala及Xaa₄ 為Phe或Gly(SEQ ID NO：62)；及、如式(III)所示之V_H CDR3胺基酸序列：Val Gly Val Xaa₅ Ile Thr Thr Phe Pro Tyr(III)式中Xaa₅ 為Met或Ile(SEQ ID NO：63)；及具有如SEQ ID NOs：19、21與23所示之胺基酸序列之V_L CDRs。

例示種類包括一種抗體，其具有如SEQ ID NO：33所示之V_L 胺基酸序列及包含具式(I)(其中Xaa₁ 為Met)之V_L －CDR1和分別如SEQ ID NOs：11與13所示之V_L －CDR2與V_L －CDR3胺基酸序列之V_H 胺基酸序列(SEQ ID NO：45，例示核酸示於SEQ ID NO：46)。於此種類中，Xaa₁ 為Met；Xaa₂ 為Tyr；Xaa₃ 為Asn；Xaa₄ 為Phe；及Xaa₅ 為Met。

其他例示種類包括抗體，其具有如SEQ ID NO：33所示之V_L 胺基酸序列和包含分別如SEQ ID NOs：9與13所示之V_H －CDR1與V_H －CDR3胺基酸序列及式(II)之V_H －CDR2，其中：Xaa₂ 為Gly，Xaa₃ 為Asn及Xaa₄ 為Phe(SEQ ID NO：47，例示核酸序列示於SED ID NO：48)；Xaa₂ 為Tyr，Xaa₃ 為Ala及Xaa₄ 為Phe(SEQ ID NO：49，例示核酸序列示於SED ID NO：50)；及Xaa₂ 為Tyr，Xaa₃ 為Asn及Xaa₄ 為Gly(SEQ ID NO：51，例示核酸序列示於SED ID NO：52)。

其他例示種類包括抗體，其具有如SEQ ID NO：33所示之V_L 胺基酸序列和包含分別如SEQ ID NOs：9與11所示之V_H －CDR1與V_H －CDR2胺基酸序列及式(III)之V_H －CDR3，其中Xaa₅ 為Ile(SEQ ID NO：53，例示核酸序列示於SEQ ID NO：54)。

簡言之，例示種類包括具有下述V_L 與V_H 胺基酸序列組合之諸抗體：

本發明進一步包括單離抗體，其中V_H 具有示於SEQ ID NO：45、47、49、51或53之胺基酸序列及V_L 具有示於SEQ ID NO：33、35、37或39之胺基酸序列。

例示抗體拮抗劑可為抗體IgG、IgD、IgGA或IgM等同功型之抗體。此外，此等拮抗劑抗體可利用例如糖基化、異構化、脫糖基化，或非天然發生之共價修飾作用例如添加聚乙二醇基團(聚乙二醇化)與脂質化等方法，進行轉譯後修飾。彼等修飾作用可於活體內或試管內發生。例如，可將本發明抗體接合於聚乙二醇(PEG基化)，以增進其藥物動力學性質。接合作用可利用熟習此項技藝人士已知之技術進行。已證實治療用抗體與PEG之接合增進藥物動力學性質而不干預其功能。參閱，Deckertet al.,Int.J.Cancer 87 ：382－390,2000；Knightet al.,Platelets 15 ：409－418,2004；Leonget al.,Cytokine 16 ：106－119,2001；及Yanget al.,Protein Eng.16 ：761－770,2003。

本發明抗體之藥物動力學性質亦可透過利用熟習此項技藝人士已知技術之Fc修飾作用予以增進。舉例而言，IgG4同功型重鏈於其鉸合區域含有能形成重鏈間或重鏈內二硫鍵結之Cys－Pro－Ser－Cys(CPSC)主結構，亦即，該CPSC主結構中之二Cys殘基可與其他重鏈之對應Cys殘基形成二硫鍵結(重鏈間)或一既定CPSC主結構內之二Cys殘基可互相形成二硫鍵結(重鏈內)。一般相信，活體內異構酶能將IgG4分子之重鏈間鍵轉化為重鏈內鍵結，反之亦然(Aalberse and Schuurman,Immunology 105 ：9－19(2002))。於是，由於在鉸合區域具有重鏈內鍵結之彼等IgG4分子中之重：輕鏈(HL)對彼此並非共價結合，可能解離成為HL單體，然後與衍生自其他IgG4分子之HL單體形成雙專一性、雜二聚體IgG4分子。雙專一性IgG抗體中，兩個Fabs結合之功能部位不同。以Pro取代IgG4鉸合區域中之Ser228，產生「似IgG1之作用」，亦即，該等分子於重鏈間形成穩定之二硫鍵結，因此不易與其他IgG4分子發生HL交換。於一具體實例中，本發明之諸抗體包含具有S228P突變之IgG4 Fc功能部位。

再者，可將本發明抗體中影響與除了FcRn補救受體外之Fc受體結合之位點移除。舉例而言，可將本發明抗體中涉及ADCC活性之Fc受體移除。例如，IgG1鉸合區域中之Leu234/Leu235突變成為L234A/L235A，或IgG4鉸合區域中之Phe234/Leu235突變成為P234A/L235A使FcR結合減至最小及降低免疫球蛋白傳介依賴補體的細胞毒性與ADCC之能力。於一具體實例中，本發明之諸抗體包含具有P234A/L235A突變之IgG4 Fc功能部位。

於本發明之另一具體實例中，諸抗體包含具有S108P、P114A與L115A等突變之IgG4 Fc功能部位，該Fc功能部位具有示於SEQ ID NO：41之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO：41之例示核酸序列示於SEQ ID NO：42。於全長IgG4重鏈中，同等重要之突變為S228P、P234A與L235A。

完全人類、適應人類、人類化及親和性成熟之抗體分子或抗體片段為隸屬本發明範圍內之模擬體、融合蛋白及嵌合蛋白。

本發明拮抗劑可以小於或等於約10^－ ⁷ 、10^－ ⁸ 、10^－ ⁹ 、10^－ ¹ ⁰ 、10^－ ¹ ¹ 或10^－ ¹ ² M之K_d 與TLR3結合。一既定分子(例如hTLR3)對於TLR3受體之親和力，可使用任何適當方法實驗測定。該等方法可利用Biacore或KinExA儀器設備、ELISA或熟習此項技藝者已知之競爭結合分析試驗。

以所需親和力結合拮抗劑分子之既定TLR3同質物可利用包括抗體親和性成熟法等技術及適用於非抗體分子之其他技藝認可之技術予以選定。

本發明之另一具體實例為含有本發明至少一種多核苷酸之載體。此等載體可為質體載體、病毒載體、轉因子系載體或適用於利用任何方法將本發明多核苷酸引入指定生物或基因背景內之任何其他載體。

本發明之另一具體實例為包含本發明任何多核苷酸(例如編碼含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：13的多肽之多核苷酸及編碼含有SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：23的多肽之多核苷酸)之宿主細胞。其他例示宿主細胞包含編碼含有SEQ ID NOs：25、27、29、31、45、47、49、51或53之一多肽之多核苷酸及編碼含有SEQ ID NO：33、35、37或39之一多肽之多核苷酸。此等宿主細胞可為真核生物細胞、細菌細胞、植物細胞或古生細胞。例示真核生物細胞可為哺乳類、昆蟲、鳥類或其他動物來源者。哺乳類真核生物細胞包括胚質永存細胞株例如融合瘤或骨髓細胞瘤細胞株例如SP2/0(美國菌種保存中心(ATCC),Manassas,VA,CRL－1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL－1646)與Ag653(ATCC CRL－1580)鼠類細胞株。例示人類骨髓細胞瘤細胞株為U266(ATTC CRL－TIB－196)。其他有用之細胞株包括衍生自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞例如CHO－K1(ATCC CRL－61)或DG44者。

本發明之另一具體實例為製造與TLR3具反應性之抗體之方法，該方法包括培養本發明之宿主細胞及回收該宿主細胞生產之抗體。此等抗體可為下文例示之為含有分別如SEQ ID NOs：6與16所示之重與輕胺基酸序列之單株抗體1068，或含有如SEQ ID NOs：25、27、29、31、45、47、49、51或53所示之重鏈胺基酸序列及如SEQ ID NOs：33、35、37或39所示之輕鏈胺基酸序列之單株抗體1068之適應人類或適應人類之CDR變異體之TLR3拮抗劑抗體。

本發明之另一具體實例為產生本發明抗體之融合瘤細胞株。

治療方法

本發明提供預防及治療需要減少TLR3活性之症狀之方法。可使用TLR3拮抗劑治療或預防之症狀包括由細胞介素所傳介者及完全或部分由TLR3之活化或經由TLR3途徑之傳訊造成者。本發明包括抑制IL－6、IL－8或MIP1－α的細胞生產之方法，該方法包括使TLR3拮抗劑(例如本文揭示之單離抗體)與表現TLR3受體之細胞接觸足以抑制IL－6、IL－8或MIP1－α生產之時間。

本發明方法可用以治療屬於任何類別之動物病患。此等動物之實例包括哺乳動物例如人類、齧齒類、狗、貓及農場動物與其他動物種類例如鳥類、爬蟲類及魚類。於不希望拘泥於任何特定理論下，一般相信TLR3拮抗劑之治療優勢係由於此等拮抗劑抑制涉及一些炎性疾病的促炎性化學激素與細胞介素分泌之能力；亦相信TLR3拮抗劑之治療優勢係由於此等拮抗劑增加細胞增殖因而促進組織恢復之能力。

舉例而言，本發明方法係用於治療或預防病患之炎性疾病及促進組織恢復(例如外傷性傷害後之傷口或灼傷復原)。再者，本發明方法亦提供試管內細胞密度。

任何TLR3拮抗劑均可於本發明之預防及治療方法中使用。舉例而言，本文揭示之任何單離抗體均可於炎性疾病之治療或預防或促進組織恢復中作為TLR3拮抗劑用。特別有用者為與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：13所示之V_H CDR胺基酸序列及如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：23所示之V_L CDR胺基酸序列。其他有用之抗體包含具有如SEQ ID NOs：25、27、29、31、45、47、49、51或53所示胺基酸序列之V_H 及具有如SEQ ID NOs：33、35、37或39所示胺基酸序列之V_L 。

足以治療或預防既定炎性疾病之既定TLR3拮抗劑之量可容易地予以決定。本發明方法中，TLR3拮抗劑可單獨或與至少一種其他分子組合投與。此等附加分子可為其他TLR3拮抗劑分子或具有非由TLR3受體傳訊作用傳介之治療優勢之分子。抗生素、抗病毒劑、減少細胞介素含量或活性之緩和劑及其他化合物為該等附加分子之實例。

於治療或預防炎性疾病方法之另一具體實例中，係利用抑制TLR3基因表現降低TLR3活性。TLR3基因表現可利用降低TLR3生物活性表現以抑制TLR3傳介的傳訊作用之任何方法予以抑制。此等方法包括，例如，透過與失活的基因體DNAs(例如，基因剔除、啟動子攔劫或其他基因突變方法)重組之基因不活化作用及基因轉錄不活化作用(例如，緘默RNAs或反義RNAs)。熟習此項技藝者將識別降低活性TLR3表現之許多其他方法。

因此，本發明之一態樣為治療或預防炎性疾病之方法，該方法包括投與有其需要的病患治療有效量之TLR3拮抗劑足以治療或預防該炎性疾病之時間。

此等炎性疾病之一實例為與敗血症相關之疾病。敗血症係對感染之全身性反應，嚴重時引致器官衰竭及死亡。於醫學上，敗血症界定為由病毒、細菌、真菌、或寄生物感染產生之全身性炎性反應症候群(SIRS)。由病毒、細菌、真菌、或寄生物感染及由壞死細胞釋放之dsRNA促成敗血症之發作。與敗血症相關之疾病包括SIRS、敗血性休克或多器官功能不良症候群(MODS)。於不希望拘泥於任何特定理論下，一般相信使用TLR3拮抗劑治療，藉由延長罹患與敗血症相關的炎性疾病病患之生還時間，或防止局部炎性情況(例如，於肺中)擴散成為全身性疾病，藉由使固有抗微生物活性成為可能，藉由顯示與抗微生物劑組合使用時之增效活性，藉由使促成病變之局部炎性狀態減至最小程度，或前述任何組合，可提供治療優勢。此等介入足以容許確保病患生存需要之附加治療(例如治療潛藏之感染或減少細胞介素含量)。

此等炎性疾病之另一實例為炎性腸道疾病，此炎性腸道疾病可為克隆氏症或潰瘍性結腸炎。熟習此項技藝者可識別已知或未知病因之引起腸道發炎之其他炎性腸道疾病。再者，TLR3拮抗劑可用於治療及預防與潰瘍性結腸炎或克隆氏症相關之腸道外後遺症例如關節痛與關節炎，包括僵直性脊椎炎、薦腸關節炎與牛皮癬性脊椎關節炎。其他腸道外後遺症包括黏膜傷害例如口腔潰瘍、結節性紅斑(形成疼痛硬化卵形瘤)與特徵為皮膚極嚴重潰瘍之壞疽性膿皮症；眼睛併發症例如鞏膜炎、虹膜炎與葡萄膜炎；腎臟疾病例如腎結石；肝膽疾病例如原發性硬化膽管炎、與潰瘍性結腸炎或克隆氏症相關之特徵為纖維變性發炎之慢性肝臟疾病；及為長期使用皮質類固醇發生的併發症之骨骼疾病包括骨質疏鬆症與骨質缺乏症；亦包括由IBD誘發之肺部功能不良及呼吸疾病包括間質性肺炎、氣管狹窄、細支氣管炎、細支氣管阻塞性組織化肺炎、肺部血管炎、類肉瘤病、慢性支氣管炎、及具有嗜曙紅血球過多之肺部浸潤之臨床疾病。

此等炎性疾病之另一實例為與感染相關之疾病，其包含病毒性或細菌性肺炎，包括嚴重肺炎、囊胞性纖維症、支氣管炎、氣道惡化與急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。該等與感染相關之疾病尚包括重複感染例如原發性病毒感染及續發性細菌感染。

此等炎性疾病之另一實例為炎性肺部疾病，其實例包含由感染誘發之肺部疾病，包括與病毒、細菌、真菌、寄生物或傳染性蛋白質等感染相關者；由過敏原誘發的肺部疾病；由污染物誘發的肺部疾病例如石棉沉著症、矽肺症、或鈹肺症；由胃抽吸誘發的肺部疾病；免疫失調；由基因誘發的炎性肺部疾病例如囊胞性纖維症；及由身體受傷誘發的肺部疾病，例如呼吸器傷害。彼等炎性疾病亦包含氣喘、肺氣腫、支氣管炎、COPD、類肉瘤病、組織細胞增生症、淋巴管肌瘤增生、急性肺傷害、急性呼吸窘迫症候群、慢性肺疾、支氣管肺部異常、社區感染之肺炎、院內感染之肺炎、呼吸器相關肺炎、敗血症、病毒性肺炎、流行性感冒感染、副流感感染、人類間質肺病毒感染、呼吸道融合病毒感染及麴黴菌或其他真菌感染。

此等炎性疾病之另外實例為2型糖尿病、血脂失調(dislipidemia)及代謝症候群。TLR3拮抗劑係用於抑制與肥胖及胰島素抗阻相關之炎性過程。抑制TLR3傳訊作用會改善病患之血脂狀況，亦即降低總膽固醇含量及增加HDlc/LDLc比率。抑制TLR3傳訊作用亦將導致胰島素分泌增加因而導致改善胰島素抗阻。目前之2型糖尿病治療與多種有害副作用相關，包括血糖過低及體重增加。使用TLR3拮抗劑治療2型糖尿病被預期具有較少的副作用及持久之藥物動力性質。再者，以具有長循環半衰期之化合物(例如本發明單離抗體)進行治療，不需要經常用藥，有助於改善用藥順從性－為2型糖尿病之重大議題。

同時，改善血脂狀況有延緩或防止與肥胖及2型糖尿病相關的心血管疾病(例如動脈硬化)進展的可能。此外，抑制TLR3傳訊作用經由直接影響胰臟小島細胞或者藉由影響血脂狀況及保護小島細胞免受高脂含量引致之惡化，可能增加胰島素之流通量。因此，單獨抑制TLR3或組合其他療法有於2型糖尿病中延緩引入胰島素治療及避開與胰島素治療相關之不為所欲之副作用的可能。

再者，罹患C型肝炎與HIV感染的病患由於在肝臟中累積脂質，容易進展為胰島素抗阻及2型糖尿病。利用TLR3拮抗劑抑制TLR3傳訊作用可於此高度危及之病患族群中同時攻擊該感染及胰島素抗阻。

可利用本發明方法預防或治療之其他炎性疾病與神經病變包括多發性硬化症、硬化症、紅斑性狼瘡、及神經退化性與中樞神經系(CNS)失調症包括老年癡呆症、帕金森氏症、亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s disease)、躁鬱症與肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、肝臟疾病包括纖維變性、肝炎C病毒(HCV)與肝炎B病毒(HBV)、關節炎、、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎與幼年型類風濕性關節炎(JRA)、骨質疏鬆症、骨關節炎、胰臟炎、纖維變性、腦炎、牛皮癬、巨細胞性動脈炎、僵直性脊椎炎、自體免疫性肝炎、人類免疫缺乏病毒(HIV)、炎性皮膚疾病、移植、癌症、過敏症、內分泌疾病、其他自體免疫失調症及氣道過度反應。

本發明之其他態樣為增加細胞增殖率之方法，該方法包括利用，例如使細胞與TLR3拮抗劑接觸，降低細胞中之TLR3活性。於本發明此態樣之一具體實例中，細胞可為得自例如上皮或結腸組織之細胞。上皮細胞可源自任何上皮組織，舉例而言，例如，消化道上皮、皮膚上皮、肺上皮、或支氣管肺部上皮。炎性疾病可能影響任何組織，舉例而言，例如，心臟組織及消化道組織，導致結構上與功能上偏離正常組織。於一些情況下，此等炎性疾病可能係遺傳因素或感染的結果。於其他情形下，此等炎性疾病可能係外傷性傷害(舉例而言，例如，灼傷)的結果。熟習此項技藝者將認知許多不同的炎性疾病及相關病變由涉及之不同組織展現。

本發明之另一態樣為治療起因於細胞死亡的疾病之方法，該方法包括投與有其需要的病患治療有效量之TLR3拮抗劑足以治療該疾病之時間。

本發明之另一態樣為預防起因於細胞死亡的疾病之方法，該方法包括投與有其需要的病患治療有效量之TLR3拮抗劑足以預防該疾病之時間。

投與/醫藥組成物

供治療用途之本發明拮抗劑之投與方式可為遞送製劑至宿主之任何適當途徑。蛋白質、抗體、抗體片段與模擬體及彼等製劑之醫藥組成物特別可供非經腸投與用，亦即，經皮下、肌內、皮膚內、靜脈內或經鼻內遞送。

本發明之拮抗劑可於醫藥上可接受之載劑中製備為含有有效量拮抗劑作為活性成分之醫藥組成物。以呈備用注射形式之含拮抗劑之水性懸浮液或溶液為佳，較佳為於生理pH之緩衝液。供非經腸投與之組成物通常包含溶於醫藥上可接受之載劑(較佳為水性載劑)中之本發明拮抗劑之溶液或其混合物。可使用多種水性載劑，例如，0.4%食鹽水、0.3%甘胺酸等。彼等溶液為無菌，通常不含微粒物質。彼等溶液可利用習用、悉知之殺菌技術(例如，過濾法)殺菌。組成物可依需要含有醫藥上可接受之輔助物質，例如pH調整劑及緩衝劑等，俾使接近生理狀況。於此等醫藥組成物中，本發明拮抗劑之濃度可大為不同，亦即，可小於約0.5%，通常為或至少約1%至多達15或20重量%，主要可基於流體容積、黏性等，根據所選擇之特定投與方式予以選定。

因此，供肌內注射用之本發明醫藥組成物可製備為含有1毫升無菌緩衝水，及介於約1奈克至約100毫克，例如，約50奈克至約30毫克或更佳為約5毫克至約25毫克之本發明拮抗劑。同樣地，供注入靜脈內用之本發明醫藥組成物可製成含有約250毫升無菌林格氏溶液，及約1毫克至約30毫克及更佳為約5毫克至約25毫克之本發明拮抗劑。製備非經腸投與用組成物之實際方法為一般悉知及更具細節地見述於，例如，”Remington’s Pharmaceutical Sciences”,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA。

於醫藥製劑中，本發明之拮抗劑可呈單位劑量型存在。適當之治療有效劑量可容易地由熟習此項技藝人士決定。如果需要，則決定之劑量可於治療期間，依醫師選定之適當時間間隔重複投與。

本發明之拮抗劑可凍乾貯存，使用之前，於適當載劑中再組成。此技術已被證實對於習知免疫球蛋白類及蛋白質製劑有效，及可使用此項技藝中已知之凍乾及再組成技術。

拮抗劑可利用提供此等分子至細胞之任何技術投與。就細胞而言，舉例而言，可藉由在培養基中補充該拮抗劑而進行試管內拮抗劑投與；藉由將靜脈內注射該拮抗劑至動物或組織中進行活體內拮抗劑投與。熟習此項技藝者將認知試管內或活體內投與拮抗劑至細胞之其他方式。此等方式亦包括上文詳述之遞送製劑至宿主之彼等方式。

茲參照下文之具體、非限制實例敘述本發明。

實例 1

抗 －hTLR3 拮抗劑單株抗體之鑑定利用細胞系篩檢分析法鑑定能封阻經由hTLR3受體之傳訊作用之抗－hTLR3拮抗劑單株抗體。使用標準技術(Kohleret al., 1976)，於BALB/C小鼠中產生製造抗－hTLR3單株抗體之一群融合瘤。利用經皮膚內注射編碼hTLR3胺基酸1－703之質體DNA(SEQ ID NO：3)，對小鼠進行hTLR3之免疫處理。胺基酸1－703(SEQ ID NO：4)相當於預測之hTLR3胞外功能部位。先使用10微克質體DNA對小鼠進行注射，兩週後，進行第二次之10微克DNA注射。此第二次10微克質體DNA注射兩週後，投與各小鼠15微克DNA之追加注射。於B細胞融合三天前，以於磷酸鹽緩衝鹽液(PBS；10 mM磷酸鹽、150 mM NaCl，pH 7.4)中之15微克hTLR3蛋白質，對小鼠進行靜脈內注射。收取經免疫處理的小鼠之脾臟，使用標準方法(Kohleret al., 1976)，進行B細胞融合。使用含次黃嘌呤－胺基喋呤－胸腺核苷之培養基選擇融合瘤，先利用酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)篩檢抗－TLR3。利用限制稀釋法選殖製造抗－hTLR3單株抗體之個別融合瘤。

藉由使用人類A549衍生之肺上皮細胞株穩定大量表現之hTLR3之細胞系篩檢分析法，鑑定製造抗－TLR3拮抗劑單株抗體之融合瘤。

用以產生供彼等分析法用之篩檢及對照細胞株之A549細胞(ATCC CRL：CCL－185)係得自美國菌種保存中心(Manassas,VA)。篩檢用細胞株係命名A549－hTLR3之A549衍生細胞株。以編碼hTLR3與抗新黴素基因之哺乳類質體表現載體穩定轉染A549－hTLR3細胞。對照組A549衍生細胞株命名A549－neo。單僅以編碼該抗新黴素基因之哺乳類質體表現載體穩定轉染A549－neo細胞。根據廠商之操作指南及標準篩檢與選殖方法，利用Lipofectamine(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)轉染，產生彼等穩定轉染之細胞株。標準條件下，於含10% FBS、1% MEM非必要胺基酸(Gibco Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)、1 mM麩胺醯胺、1 mM丙酮酸鈉、20 mM HEPES與0.5毫克/毫升G418之最低營養要求培養基(MEM)中培養A549－hTRL3及A549－neo細胞。

使用A549－hTLR3細胞進行細胞系篩檢分析法，鑑定出一hTLR3拮抗劑單株抗體，命名mAb 1068。構成彼等篩檢分析法之基礎原則為多(I：C)刺激存在A549－hTLR3細胞中之hTLR3受體，導致細胞介素生產增加。相較於未暴露於單株抗體之對照組A549－hTLR3細胞，經由篩檢分析法鑑定出之候選hTLR3拮抗劑單株抗體可於A549－hTLR3細胞中透過hTLR3受體抑制由多(I：C)傳介之傳訊作用，及引致降低之細胞介素生產。

篩檢分析法之進行係在添加5微克/毫升多(I：C)(Amersham Biosciences Corp.,Piscataway,NJ)之前，於37℃培育具有測試單株抗體之A549－hTLR3細胞30分鐘；24小時後，測定細胞培養物上澄液中之細胞介素量。同法處理對照組A549－hTLR3細胞，惟彼等細胞不與測試單株抗體一起培育。根據廠商指導，使用Luminex多通道分析(Luminex Corp.,Austin,TX)及接合IL－6(介白素－6)、IL－8(介白素－8)、與RANTES(根據活化作用調控，正常地T－表現，及據推測分泌之)專一單株抗體之珠粒測定篩檢分析法中之細胞介素產量。利用此等分析法鑑定hTLR3與拮抗劑mAb 1068之結合作用。

使用標準方法，自表現mAb 1068之融合瘤選殖編碼mAb 1068之重鏈與輕鏈之重鏈與輕鏈核酸序列。mAb 1068重鏈與輕鏈核酸及胺基酸序列分別示於圖1與2及SEQ ID NOs：6與16。使用標準方法，產生包含編碼重組mAb 1068(r1068)之重鏈與輕鏈核酸序列之細胞株。

實例 2

hTLR3 拮抗劑於人類肺衍生細胞中抑制 IL－6 、 IL－8 與 RANTES 等細胞介素生產之作用 hTLR3拮抗劑mAb 1068於人類肺上皮衍生之A549－hTLR3細胞中抑制由hTLR3－傳介之IL－6(圖3)、IL－8(圖4)與PANTES(圖5)等細胞介素之生產。然而，於彼等人類肺衍生細胞中，hTLR3專一鼠類mAb TLR3.7(eBioscience,San Diego,CA)不抑制hTLR3傳介、多(I：C)誘發之IL－6(圖3)、IL－8(圖4)與RANTES(圖5)之生產。由於先前之工作暗示TLR3.7單株抗體可能拮抗hTLR3受體(Matsurnoto M.et al.,Biochem.Biophys Res.Commun.24 ：1364－1369(2002))，因此1068與TLR3.7單株抗體間之此項區別很重要。此先前工作記述TLR3.7單株抗體似乎在人類纖維母細胞衍生MRC－5細胞中抑制多(I：C)誘發的IFN－β之生產(Matsumoto M.et al.,Biochem.Biophys Res.Commun.24 ：1364－1369(2002))。本文之結果清楚地指出，1068 hTLR3拮抗劑單株抗體比TLR3.7單株抗體抑制更寬廣的細胞介素譜之生產，且可據此將此二單株抗體互相區分。

IL－6、IL－8與RANTES專一細胞介素分析法之進行係如圖3、圖4與圖5所示，在添加5微克/毫升多(I：C)(Amersham Biosciences Corp.,Piscataway,NJ)之前，於37℃培育具有1068單株抗體或TLR3.7單株抗體之A549－hTLR3細胞30分鐘。24小時後，酌情使用Luminex儀器設備(Luminex Corp.,Austin,TX)及接合IL－6、IL－8或RANTES專一單株抗體之珠粒測定細胞培養物上澄液中之細胞介素量。各細胞介素之Luminex分析法係根據廠商指示進行。

實例 3

hTLR3 拮抗劑於初級人類支氣管－上皮細胞中抑制 MIP1－α 與 IL－6 細胞介素之生產 hTLR3拮抗劑mAb 1068於初級人類支氣管－上皮細胞中抑制由hTLR3－傳介之MIP1－α(圖6)與IL－6(圖7)等細胞介素之生產。

MIP1－α與IL－6專一細胞介素分析法之進行係如圖6或圖7所示，在添加5微克/毫升多(I：C)(Amersham Biosciences Corp.,Piscataway,NJ)之前，於37℃培育具有1068單株抗體或非專一性多株小鼠IgG製劑之初級人類支氣管－上皮細胞細胞30分鐘。24小時後，酌情使用Luminex儀器設備(Luminex Corp.,Austin,TX)及接合MIP1－α或IL－6專一單株抗體之珠粒測定細胞培養物上澄液中之細胞介素量。各細胞介素之Luminex分析法係根據廠商指示進行。初級人類支氣管－上皮細胞係使用標準方法，自人類組織試樣單離。

實例 4

剔除 TLR3 活性減緩炎性腸道疾病症狀之嚴重性於剔除TLR3受體基因活性(圖8)之IBD鼠類模式中，炎性腸道疾病(IBD)症狀之嚴重性降低。克隆氏症及潰瘍性結腸炎可使用已攝入硫酸鈉葡聚醣(DSS)之動物為模式(Hendrickson B.A.et al.,Clin Microbiol Rev.15 ：79－94,2002)。於彼等動物模式中觀察到的症狀包括體重大量減少(圖8)與上皮細胞潰瘍。彼等症狀模擬於罹患IBD(例如潰瘍性結腸炎或克隆氏症)之病患中觀察到之彼等症狀。相較於DSS處理之野生型小鼠，於此IBD鼠類模式中，DSS處理之TLR3剔除小鼠體重未大量減少(圖8)，並顯露較溫和之上皮細胞傷害(根據組織病理學分析)。彼等結果顯示，TLR3傳訊作用於炎性過程中(例如涉及IBD者)扮演決定性角色。

於彼等實驗中，野生型C57BL/6公小鼠或TLR3剔除小鼠(Alexopoulouet al.,Nature,413 ：732－738(2001))各如圖8所示，任意給與含5%(w/v)硫酸鈉葡聚醣(DSS)之飲用水或未補充之水5天，以誘發急性潰瘍性結腸炎。所有小鼠均為6－8週大，各處理組均具有至少5隻小鼠。藉由觀察體重(圖9)、結腸重量、糞便硬度、直腸出血與結腸免疫組織病理學等變化，評估DSS處理後之結腸炎進展。所有此等評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。圖8中之數據以處理1至5天之重量變化百分比表示。各符號代表得自一隻小鼠之數據。WT標明野生型小鼠；KO標明TLR剔除小鼠。橫條代表平均值；所示數據為三個獨立實驗之合成。對照組野生型及未接受DSS之TLR3基因剔除小鼠(圖8)顯示類似之重量變化(P＝0.06，t－試驗)。野生型及接受DSS之TLR3基因剔除小鼠(圖8)明顯地顯示不同之重量變化(P＝0.003，t－試驗)。

於實驗第5天，收取動物結腸供組織病理學分析用。使用標準方法，將結腸包埋於石蠟中，切片，以蘇木素與曙紅染色。得自接受DSS的野生型小鼠之代表性結腸切片展現黏膜潰瘍及稠密之炎性浸潤以及腺窩與杯狀細胞喪失。得自接受未補充之水的TLR3基因剔除小鼠之代表性結腸切片具有與接受未補充之水的野生型小鼠之結腸所觀察類似之形態與組織學。得自接受DSS的TLR3基因剔除小鼠之代表性結腸包含一些稠密之細胞浸潤，惟除此之外展現未受損傷之黏膜上皮及極微之杯狀細胞喪失。此組織病理數據指出，接受DSS之TLR3基因剔除小鼠較接受DSS之野生型小鼠形成較少之上皮潰瘍，顯示TLR3活性可於炎性過程中(例如涉及IBD者)扮演決定性角色。

實例 5

hTLR3 拮抗劑處理終止炎性腸道疾病相關之減重於IBD鼠類模式中，hTLR3拮抗劑處理降低炎性腸道疾病(IBD)相關的減重之嚴重性(圖9)。數據顯示，以TLR3拮抗劑處理可減弱與IBD(例如潰瘍性結腸炎及克隆氏症)相關之症狀。此外，此結果進一步指出，TLR3傳訊作用可於炎性疾病例如IBD中扮演重要角色。

於彼等實驗中，野生型C57BL/6公小鼠各如圖9所示，任意給與含5%(w/v)硫酸鈉葡聚醣(DSS)之飲用水或未補充之水5天，以誘發急性潰瘍性結腸炎。如圖9所示，於DSS處理最初4天，每天對小鼠進行0.2毫克mAb 1068於PBS載劑中、0.2毫克非專一性小鼠IgG多株抗體製劑於PBS載劑中、或單獨PBS載劑之腹膜內注射。各注射液由於PBS中之0.9毫升單株抗體或非專一性IgG製劑或單獨0.9毫升PBS載劑組成。所有小鼠均為6－8週大，各處理組含有至少5隻小鼠。

藉由觀察體重(圖8)、結腸重量、糞便硬度、直腸出血、與結腸免疫組織病理學等變化，評估DSS處理後之結腸炎進展。所有此等評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。

圖9中之數據以處理1至4天之重量變化百分比表示。各符號代表得自一隻小鼠之數據。橫條代表平均值；所示數據為兩個獨立實驗之合成。

接受DSS與mAb 1068之小鼠及未接受DSS之小鼠間，其重量變化無顯著差異[P<<0.05，唐氏試驗(Dunn’s test)；圖9]。接受DSS與mAb 1068的小鼠之重量變化則與接受DSS與於PBS中之非專一性IgG或單獨PBS之小鼠觀察所得有顯著差異(二者均為P<0.01；唐氏試驗；圖9)。

實例 6

hTLR3 拮抗劑處理小鼠中，慢性結腸炎嚴重性降低所有研究均使用六至八週大之野生型C57BL/6母小鼠與出身背景為C57BL/6之TLR3剔除(KO)小鼠(Alexopoulouet al.,Nature 413 ：732－738,(2001))。給與小鼠合計三個週期之於飲用水中之2%(wt/vol)硫酸鈉葡聚醣(DSS)(Okayasuet al.,Gastroenterology 98 ：694－702(1990))。任意給與DSS水5天，以誘發急性潰瘍性結腸炎，然後給與未摻雜之飲用水(白水)9天。第14天開始2%DSS之第二個5天週期，隨後休息9天。第28天開始2%DSS之第三個週期，此次為7天。在兩個不同時間點犧牲小鼠：於進行研究第25天進入第二個週期休息後，或者於進行研究第37天第三個DSS週期之後。各處理組由至少8隻小鼠組成。藉由觀察整個研究期間之體重變化以及犧牲後之其他評估參數包括結腸長度、結腸重量、糞便硬度、直腸出血、與結腸免疫組織病理學等變化，評估DSS處理後之結腸炎進展。

由不清楚上述研究設計之獨立獸醫病理學家進行組織病理學評估。針對結腸之縱向切片進行一組變化之計分，包括上皮細胞壞死、上皮潰瘍與蛻皮、腺窩喪失、腺窩細胞增生、於固有層形成肉芽組織、黏膜下層之肉芽組織、黏膜下層炎性細胞浸潤及黏膜下層水腫。反映傷害擴大之計分如下：0，不存在；1，溫和，病灶；2，溫和，多病灶；3，中等，常發現，惟於有限區域；4，嚴重，於提交組織之許多區域常發現；5，很嚴重，擴大至提交組織之大部分。

使用學生氏試驗(Student’s test)(JMP,SAS Institute；GraphPad Prism)進行統計分析。罹患潰瘍性結腸炎及克隆氏症的病患之症狀包括體重減輕、出現便血、及結腸上皮層潰瘍。因此硫酸鈉葡聚醣－處理小鼠誘發之症狀部分模擬罹患潰瘍性結腸炎或克隆氏症病患所見症狀(Hendricksonet al.,Clin.Microbiol.Rev.15 ：79－94(2002))。

於此模式中，野生型及TLR3 KO小鼠攝入DSS之各週期體重均減少。然而，TLR3 KO小鼠之減重情形比野生型小鼠不顯著。根據利用結腸發炎及傷害總測量之評估，TLR3 KO小鼠亦顯示較小之疾病嚴重性：TLR3 KO小鼠之結腸縮短比WT小鼠所見明顯較少；且TLR3 KO小鼠直腸出血頻率減少很多。結腸黏膜傷害之組織病理學評估與彼等總測量一致。就單一細胞壞死、上皮潰瘍、上皮蛻皮、腺窩脫離及腺窩膿腫之中位計分而言，TLR3 KO小鼠比WT小鼠更低。彼等數據加在一起顯示缺少TLR3傳訊作用於慢性結腸炎小鼠模式中授予部分疾病保護作用，及暗示TLR3傳訊作用有加重人類IBD嚴重性之可能。

為了進一步證明TLR3於疾病調節上之角色，乃以拮抗劑抗－TLR3 mAb 1068處理WT C57BL/6小鼠。預防性(於第一個DSS週期開始，「Pr」)或「治療性」(於第二個DSS週期開始，「Th」；圖35)地使接觸DSS小鼠組接受0.2毫克抗－TLR3 mAb 1068。接觸DSS小鼠之對照組接受PBS(載劑對照組)或0.2毫克非專一性負對照組單株抗體。另一組對照組未給與DSS。圖35之星號代表抗－TLR3拮抗劑單株抗體用藥之諸時間點。

所有接觸DSS小鼠組別於攝取DSS之第一週期後，減重即告減少(圖36)。圖36中各符號代表至少八隻小鼠之平均值，誤差棒代表標準偏差。於第0至4天、第14至18天及第28至35天給與DSS。然而，以抗－TLR3單株抗體處理組相較於以PBS處理組或單株抗體對照組，顯示減重情形較少，且於第二DSS週期後體重回復速率較快(圖37)。抗－TLR3單株抗體處理組於第三DSS週期後之減重情形大為減少(圖38)。接受PBS或對照組單株抗體之接觸DSS小鼠，從研究開始(第0天)至研究結束(第37天)，平均淨減重大約20%。以抗－TLR3單株抗體處理明顯降低大約10%之減重(圖39)。圖39中，所示數據為從研究開始(第0天)至研究結束(第37天)之體重變化%；正數值顯示淨增重，負數值顯示淨減重。抗－TLR3單株抗體處理組之減重%明顯地小於以對照組載劑(PBS)或非專一性IgG處理之組別[預防性抗－TLR3處理(抗－TLR3 P)vs.PBS，P＝0.006；抗－TLR3 P vs.非專一性IgG，P＝0.006)；治療性抗－TLR3(抗－TLR3 Th)vs.PBS，P＝0.001；抗－TLR3 Th vs.非專一性IgG，P＝0.009]。各符號代表一隻小鼠；橫條代表平均值。

抗－TLR3單株抗體處理亦減少結腸縮短長度。預防性或者治療性地以抗－TLR3單株抗體處理的小鼠組別之結腸長度別明顯大於給與載劑或對照組單株抗體之組別(圖40)(抗－TLR3 P vs.PBS，P＝0.009；抗－TLR3 P vs.非專一性IgG，P＝0.01；抗－TLR3 Th vs.PBS，P＝0.03；抗－TLR3 Th vs.非專一性IgG，P＝0.04)。

再者，根據溫和組織病理學變化(包括上皮細胞壞死、腺窩脫離、上皮潰瘍與蛻皮、腺窩喪失與腺窩細胞增生)及慢性修復性組織病理學變化(包括於固有層形成肉芽組織、黏膜下層之肉芽組織、黏膜下層炎性細胞浸潤與黏膜下層水腫；圖41a)評估，相較於給與PBS或非專一性對照組單株抗體之對照組，以抗－TLR3單株抗體治療性處理之組別，其結腸黏膜傷害顯然較不嚴重。圖式中所示數據代表接受DSS及不同處理(組別：1，經PBS載劑處理；3，預防性抗－TLR3單株抗體；4，治療性抗－TLR3單株抗體；5，非專一性對照組單株抗體)的各組小鼠之所有組織病理學計分總和、溫和變化總和、或慢性變化總和。各圖式右側之圓圈涵蓋各處理組別計分之平均值及標準偏差。各組別間統計學上之顯著差異以具有最小重疊之圓圈表現。

特別是，相較於PBS或非專一性單株抗體，抗－TLR3單株抗體處理減少上皮潰瘍及防止黏膜下層與固有層中肉芽組織之形成(圖41b)。圖式中所示數據代表接受DSS及不同處理(組別：1，經PBS載劑處理；3，預防性抗－TLR3單株抗體；4，治療性抗－TLR3單株抗體；5，非專一性對照組單株抗體)的各組小鼠之組織病理學計分。各圖式右側之圓圈涵蓋各處理組別計分之平均值及標準偏差。各組別間統計學上之顯著差異性以具有最小重疊之圓圈表現。

為了確定潛在免疫與抗－TLR3－授予之保護相關，乃檢測免疫細胞族群及全身細胞介素量。觀察到接觸DSS與脾臟及腸繫膜淋巴結中活化T細胞數之增加相關(圖42)，符合說明T細胞涉及此慢性結腸炎模式之已公告報告。使用流式細胞技術測量分別代表全身及局部T細胞活化作用之脾臟及腸繫膜淋巴結中CD62L^l ^o ^w T細胞之頻率。慢性結腸炎與脾臟及腸繫膜淋巴結中活化CD4＋(助手)T細胞頻率增加相關，暗示助手T細胞活化作用全面增加。脾臟中活化CD8＋具效應T細胞之頻率降低伴隨腸繫膜淋巴結中活化CD8＋ T細胞頻率增加，暗示具效應T細胞流通至腸部位。從第25天，第二DSS週期之後，示出數據。各符號代表得自一隻小鼠之數據；橫條代表平均值。

此外，於接觸DSS小鼠之脾臟中發現CD11b＋細胞頻率較高，可能反映炎性巨噬細胞中結腸炎相關之增加。顯著地，預防性抗－TLR3單株抗體處理與脾臟CD11b＋細胞頻率明顯減少至未接觸DSS之對照組小鼠所見含量相關(圖43)。接觸DSS之抗－TLR3單株抗體處理小鼠脾臟中之CD11b＋細胞百分比與未接受DSS之小鼠類似，且顯著地低於接受PBS(P＝0.001)或非專一性IgG(P＝0.02)之接觸DSS小鼠。從第25天，第二DSS週期之後，示出數據。各符號代表得自一隻小鼠之數據；橫條代表平均值。

接觸DSS小鼠之血清細胞介素概況亦顯示與抗－TLR3單株抗體處理相關之改變：於預防性接受抗－TLR3單株抗體之小鼠中測得增加之IL－4及IL－10含量(圖44)。於誘發慢性DSS結腸炎期間之抗－TLR3單株抗體處理提高全身性IL－4及IL－10含量。所示數據分別代表第2及第3 DSS週期後之時間點，第25天及第37天，之數據。各符號代表得自一隻小鼠之數據；橫條代表平均值。IL－4與IL－10二者均被證明於炎性之調控上扮演關鍵角色。觀察到IL－10剔除小鼠自然形成結腸炎，暗示IL－10於控制IBD免疫致病機轉中之專一角色。彼等結果暗示，抗－TLR3單株抗體處理改變由DSS攝取誘發的炎性及T細胞反應。

總之，彼等數據證明，以抗－TLR3單株抗體封阻TLR3傳訊作用可於慢性結腸炎模式中改善疾病嚴重性，及提供抗－TLR3單株抗體治療人類IBD之潛在效力之證據。

實例 7

hTLR3 拮抗劑處理增加敗血症存活利用投與D－半乳糖胺及多(I：C)，可使用動物(例如小鼠)作為敗血症模式。於此等模式中，D－半乳糖胺係一種肝毒素，其功能為敗血症「致敏劑」；多(I：C)為敗血症誘發分子，模擬dsRNA及活化TLR3。結果指示，於敗血症鼠類模式中，TLR3拮抗劑處理幾乎使動物存活率加倍。

如圖10所示，於彼等實驗中，野生型C57BL/6母小鼠給與1毫克hTLR3拮抗劑1068 mAb於PBS載劑中、1毫克非專一性鼠類多株IgG製劑於PBS載劑中、或單獨PBS載劑之腹膜內注射。各注射液由於PBS中之1毫升單株抗體或非專一性IgG製劑或單獨1毫升PBS載劑組成。如圖10所示，第二天使小鼠接受10微克多(I：C)與20毫克D－半乳糖胺(Sigma－Aldrich Corp.,St.Louis,MO)於100微升無菌PBS中之腹膜內注射。每天兩次，監測小鼠之存活3天。所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。結果顯示，hTLR3拮抗劑處理增加敗血症鼠類模式中之動物存活率(圖10)。

實例 8

hTLR3 拮抗劑處理於敗血症鼠類模式中降低 IL－6 及 TNF－α 細胞介素生產於敗血症鼠類模式中，hTLR3拮抗劑處理降低與炎症相關之IL－6(圖11)及TNF－α(圖12)細胞介素之血清含量。此結果指示，抑制TLR3活性可藉由降低TLR3傳介之促成敗血症的細胞介素之生產而促進敗血症存活。

投與多(I：C)兩小時後，利用CO₂ /O₂ 麻醉小鼠後眼窩竇採血法，製備得自如實例6所述處理的小鼠之血清，其製備係於室溫培育血液，隨後於2500 rpm離心15分鐘。進行細胞介素分析試驗之前，於－80℃貯存血清。酌情使用Luminex儀器設備(Luminex Corp.,Austin,TX)及接合IL－6(圖11)或TNF－α(圖12)專一單株抗體之珠粒測定血清試樣中之細胞介素含量。各細胞介素之Luminex分析法係根據廠商指示進行。所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。

圖11與圖12中之各符號代表得自一隻小鼠之數據。橫條代表平均值；所示數據為兩個獨立實驗之合成。投與多(I：C)兩小時後，以mAb 1068處理顯著減少血清IL－6含量(P＝0.04，t－試驗；圖11)；投與多(I：C)兩小時後，以mAb 1068處理顯著減少血清TNF－α含量(P＝0.03，t－試驗；圖12)。

實例 9

多 I：C 投與誘發促炎性細胞介素之分泌及向上調控肺中之 TLR 基因表現每24小時，使經異佛蘭(Isoflurane)麻醉處理之野生型公或母C57BL/6小鼠接受多(I：C)於PBS中之三種劑量或單獨PBS之鼻內投與三天。所有小鼠均為12週大。如表1所示，各多(I：C)劑量含有50微克或100微克多(I：C)；各劑量容積為50微升。各處理組別含有6至8隻小鼠。利用CO₂ 處理犧牲小鼠，於最後一次劑量24小時後，進行肺插管。於肺中注入1毫升PBS，進行支氣管沖洗(BAL)，回收流出物。然後離心彼等BAL製劑使細胞沉澱，收集不含細胞之上澄液，貯存於－80℃至供多通道細胞介素分析試驗用。所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。

酌情使用Luminex多通道分析(Luminex Corp.,Austin,TX)及接合IFN γ、IL－1α、IL－6、CXCL10、JE、KC、MGCSF、MIP1α、RANTES、TNFα、或GMCSF專一單株抗體之珠粒(LINCO Research,St.Charles,MO)測定BAL上澄液中之細胞介素含量。各細胞介素之Luminex分析法係根據廠商指示進行。數據以得自6至8隻小鼠的平均微微克/毫升±平均值之標準誤差(SEM)表示。

結果指示，50或100微克多I：C之多次投與誘發升高之細胞介素、化學激素及生長因子包括干擾素γ(IFN γ)、介白素－6(IL－6)、組織壞死因子－α(TNFα)、化學激素(CXC主結構)配位體10(CXCL10)、化學激素(CC主結構)配位體2(JE)、化學激素KC(KC)、巨噬細胞炎性蛋白－1α(MIP－1α)、根據活化作用調控、正常地T細胞表現及分泌/CCL5(RANTES)、鼠類顆粒細胞群落刺激因子(mG－CSF)及顆粒細胞－巨噬細胞群落－刺激因子(GM－CSF)等蛋白質含量(表1)。此結果指示，TLR3活化作用可能於細胞介素、化學激素、及生長因子傳介之肺病變例如COPD中扮演重要角色。

此外，肺組織之Taqman即時PCR分析證明，多次投與引起諸細胞介素基因以及多種TLRs之mRNA及細胞內傳訊分子(表2)之向上調控。彼等數據證明，活體內投與多I：C，一種合成之雙股RNA類似物，引起級聯情況，造成多種促炎性細胞介素、化學激素之分泌及例如TLR2、TLR3、TLR7與TLR9等TLR基因表現之向上調控。

實例 10

TLR3 活化作用增加肺組織中細胞介素、化學激素、生長因子及鐸基因轉錄量利用即時PCR(RT－PCR)測定從根據上文實例8所述處理之公或母C57BL/6小鼠之肺中抽取的總RNA之轉錄量。總RNA係使用Trizol^T ^M (Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)自小鼠肺組織試樣抽取，並使用RNEaSy Mini套組(Qiagen Inc.,Valencia,CA)予以單離。然後收集得自進行相同處理的6至8隻小鼠之RNA。

使用Omniscript^T ^M 套組(Qiagen Inc.,Valencia,CA)，根據廠商之操作指南，自各RNA收集物製備cDNAs。如廠商指示，使用TaqMan^T ^M Low Density Immune Profiling Array Cards(Applied Biosystems,Foster City,CA)或訂製之Low Density Array(LDA)顯示卡擴增100奈克cDNA。使用Primer Express^T ^M 軟體(Applied Biosystems)設計探針與引子組合。然後根據廠商指示，使用ABI PRISM^T ^M 7000HT儀器設備(Applied Biosystems)，於384槽版式中進行TaqMan^T ^M RT－PCR(Applied Biosystems)。

使用ABI PRISM^T ^M 7000HT儀器設備及相關軟體進行PCR早期指數期之數據收集及轉錄定量。對照18S核糖體RNA之轉錄量，將個別轉錄量常態化。表2中之數據係以相較於使用PBS載劑處理之小鼠，接受多次投與多(I：C)小鼠之mRNA轉錄量平均增加倍數表示。數據代表自6至8隻小鼠收集之RNA。

數據指出，TLR3活化作用增加鼠類肺組織中細胞介素、化學激素、生長因子及鐸基因轉錄作用(例如TLR3及其他類鐸受體)(表2)。此結果進一步指示，TLR3活化作用及其他類鐸受體(TLRs)之活化作用可能於細胞介素、化學激素、與生長因子傳介之肺病變中扮演重要角色。

實例 11

TLR3 活化作用增加肺組織之炎性細胞量 TLR3活化作用增加鼠類肺組織之炎性細胞量(圖13、14、與15)。此結果指示，TLR3活化作用可能於與肺被炎性細胞(圖13)例如嗜中性白血球(圖14)及單核細胞(圖15)(例如單核白血球或淋巴細胞)滲入增加相關之肺病變中扮演重要角色。

炎性細胞滲入接受多(I：C)的C57BL/6小鼠肺中之評估係利用血球計數法(圖13)或鑑別染色法(圖14與圖15)進行。小鼠接受如上文實例8所述之多次多(I：C)劑量或單一多(I：C)劑量。單一多(I：C)劑量係經鼻內投與經異佛蘭麻醉之公或母C57BL/6小鼠。所有小鼠介於八至十二週大。單一劑量由50微克或100微克多(I：C)於50微升PBS中組成。BAL回收肺浸潤細胞，接受單一多(I：C)劑量之動物係於多(I：C)投與24小時後進行；接受多劑量之動物則於最後多(I：C)投與24小時後進行。BAL係根據上文實例8所述進行。

使經處理之小鼠肺進行BAL後回收之細胞沉澱物懸浮於含0.1% BSA之200微升杜貝可氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝鹽液(DPBS)。然後取50微升該懸浮細胞，將其添加至50微升吐克氏血液(Turk’s Blood)稀釋流體(Red Bird Service,Osgood,IN)中，充分混合，利用血球計計算總細胞數(圖13)。然後取100微升懸浮液(含有少於1 x 10⁵ 個細胞/微升)裝填於Cytospin^T ^M 載片裝配上，於400 rpm離心4分鐘。自Cytospin^T ^M 裝配移出載片，令其乾燥至少一小時。接著將載片浸於Wright－Giemsa中染色90秒，於ddH₂ O中脫色5分鐘。令載片乾燥隔夜。使用100倍物鏡，將油鏡浸於油中，進行載片之鑑別計數，計算嗜中性白血球(圖14)與單核細胞(圖15)總數。然後將收集自各處理組別之6至8隻小鼠之肺浸潤細胞平均值與SEM數據製圖(圖13、14、與15)。

實例 12

TLR3 基因剔除動物免除肺組織中由多 (I：C) 誘發的炎性細胞量之增加利用血球計數法及鑑別染色法鑑定嗜中性白血球與單核細胞，以評估炎性細胞之滲入C57BL/6或TLR3基因剔除小鼠或接受單一或多次多(I：C)投與小鼠之肺中。小鼠如實例8所述接受多次多(I：C)劑量或如實例10所述接受單一多(I：C)劑量。BAL回收肺浸潤細胞，接受單一多(I：C)劑量之動物係於多(I：C)投與24小時後進行；接受多劑量之動物則於最後多(I：C)投與24小時後進行。BAL係根據上文實例8所述進行。如實例10所述，利用血球計數法或鑑別染色法評估炎性細胞之滲入野生型C57BL/6或TLR3基因剔除小鼠之肺中。數據以相較於單獨接受PBS動物之平均肺浸潤細胞計數，多(I：C)處理動物平均肺浸潤細胞計數之增加倍數表示。數據代表得自6隻小鼠之值。

表3所示結果指出，相較於野生型小鼠，TLR3基因剔除小鼠免除肺組織中由多(I：C)誘發的炎性細胞量之增加；多(I：C)投與之影響主要係由於TLR3活化作用。再者，結果指示，TLR3活化作用可能於與肺被炎性細胞例如嗜中性白血球及單核細胞(例如單核白血球或淋巴細胞)滲入增加相關之肺病變中扮演重要角色。

表 3：相較於野生型小鼠，TLR3基因剔除(KO)小鼠免除肺組織中由多(I：C)誘發的炎性細胞量之增加。數據以相較於單獨接受PBS動物之平均肺浸潤細胞計數，多(I：C)處理動物平均肺浸潤細胞計數之增加倍數表示。數據代表得自6隻小鼠之值。

實例 13

具有多 (I：C) 之 TLR3 活化作用於乙醯甲基膽鹼攻毒動物中進一步損害肺功能每24小時，使野生型公或母C57BL/6小鼠接受單一多(I：C)劑量於PBS中或單獨PBS(圖16)或多(I：C)於PBS中之三種劑量或單獨PBS之鼻內投與三天(圖17)。多(I：C)活化TLR3。所有小鼠均為十二週大。各多(I：C)劑量含有50微克或100微克多(I：C)，容積為50微升。各處理組別含6至8隻小鼠。

使用PenH值作為呼吸道阻塞標記及最後一次多(I：C)劑量24小時後之喘息效應(breathing effect)評估肺功能。如圖16或圖17所示，利用全身體積變化描記器(WBP)，自增加暴露於乙醯甲基膽鹼攻毒之小鼠收集PenH值。乙醯甲基膽鹼增加喘息效應且損害肺功能。使乙醯甲基膽鹼溶於PBS中，呈噴霧氣溶膠投與。所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。圖16與17中之數據代表得自各處理組別6至8隻小鼠之平均值與SEM。

結果指示，TLR3之活化進一步於乙醯甲基膽鹼攻毒野生型小鼠中損害肺功能(圖16與圖17)。此結果暗示，TLR3活化作用可能進一步損害由於感染、慢性阻塞性肺疾(COPD)、或其他疾病已受肺傷害之苦的個體之肺功能。因此，拮抗TLR3活性之治療處置可防止已受損害肺功能之苦的個體附加之肺功能傷害。

實例 14

TLR3 基因剔除動物於乙醯甲基膽鹼攻毒期間免受由多 (I：C) 誘發之肺功能傷害使如實例12所述之公或母野生型C57BL/6小鼠或TLR3基因剔除小鼠進行單一(圖18)及多劑量(圖19)多(I：C)投與。使用利用如實例12所述WBP收集之PenH值評估肺功能。乙醯甲基膽鹼投與亦如實例12所述。所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。圖18與19中之數據代表得自各處理組別6至8隻小鼠之平均值與SEM。

TLR3基因剔除動物於乙醯甲基膽鹼攻毒期間免受由多(I：C)誘發之肺功能傷害(圖18與圖19)。此結果指示，括抗TLR3活性之治療處置可防止由於感染、慢性阻塞性肺疾(COPD)、或其他疾病已受肺功能傷害之苦的個體附加之肺功能傷害。此外，此結果進一步指示，多(I：C)投與之影響主要由於TLR3活化作用。

實例 15

hTLR3 拮抗劑對人類肺支氣管上皮細胞中細胞介素與化學激素產生之影響人類肺支氣管上皮細胞株BEAS－2B係得自美國菌種保存中心(CRL－9609)。使BEAS－2B生長於被覆膠原蛋白I燒瓶(BD Biosciences)之LHC－9不含血清培養基中，於0.25%胰蛋白酶/EDTA中簡略洗滌後，予以收取。然後於LHC－9不含血清培養基(Biosource)中洗滌細胞，以1x10⁶ /毫升之濃度使其再懸浮於LHC－9培養基中。將細胞塗佈於被覆膠原蛋白I之96槽平底盤上，每槽200微升；每一條件進行三重複培養槽。

經6小時培育令細胞附著後，取出培養基，以200微升新鮮培養基替換。每槽添加125奈克TLR3促效劑多(I：C)之前，於37℃培育mAb 1068之十倍系列稀釋液40分鐘。經多(I：C)刺激24小時後，收集培養上澄液，進行試樣之Luminex多通道分析(Luminex Corp.,Austin,TX)以檢測IL－6、IL－8、RANTES、MCP－1、IP－10、IFN－α、IFN－γ、IL－1β、IL－12、TNF－α、MCP－1、與IL－10表現量。

結果指示，抗－TLR3拮抗劑mAb 1068(與圖20之mAb CNTO260相同)於多(I：C)刺激之BEAS－2B細胞中降低IL－6、IL－8、RANTES、MCP－1與IP－10產生。如圖20所示，IL－6、IL－8、RANTES、MCP－1與IP－10之表現以mAb 1068劑量依存方式被降低。試樣中未檢測到IFN－α、IFN－γ、IL－1β、IL－12、TNF－α、MCP－1、與IL－b表現。

實例 16

hTLR3 拮抗劑處理增加致命性肺炎之存活於彼等實驗中，8至10週大之野生型C57BL/6母小鼠，以於50微升PBS中之5個斑點形成單位(PFU)流行性感冒病毒A/PR/8經鼻內予以感染，接著於8天後，以於50微升PBS中之50個群落形成單位(CFU)肺炎鏈球菌經鼻內予以感染。

該病毒與細菌劑量單獨投與時未達致死量，惟彼等劑量一起，則對大多數小鼠具致命性(圖22)。模擬感染之對照組小鼠接受PBS而非流行性感冒病毒A/PR/8或肺炎鏈球菌。hTLR3拮抗劑處理小鼠於第8天接種肺炎鏈球菌之前2小時，經由腹膜內注射接受0.6毫克或0.06毫克(於0.2毫升PBS中)之投與(預防性投與)，於第9天再同法進行投與(治療性投與)。對照組模擬處理小鼠經由腹膜內投與，接受0.6毫克或0.06毫克於PBS中之非專一性IgG。各處理或對照組含7隻小鼠。此處所述之所有評估均根據已建立之動物照料及使用指導方針進行。

於雞蛋中培養流行性感冒A/PR/8病毒，使用具有MDCK細胞之標準分析法測定PFU力價，並呈供接種用之凍結病毒貯存株保存。於含5%綿羊血之胰化酪蛋白大豆洋菜培養皿(TSA/血液)上，使肺炎鏈球菌(ATCCNumber：6301^T ^M )種菌生長隔夜，然後從培養皿中移出細菌，使其懸浮於磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)中。使用600奈米處之光密度及標準方法計算PBS懸浮液中之細菌CFU力價。接著於PBS中製備細菌種菌。利用標準群落形成試驗確定細菌種菌中之CFU，以測定投與小鼠之種菌中實際存在之細菌數。

製備種菌後，如上文所述使用流行性感冒A/PR/8病毒或肺炎鏈球菌經鼻內感染小鼠。模擬感染之對照組小鼠如上文所述接受經鼻內投與之PBS。hTLR3拮抗劑處理小鼠如上文所述接受經腹膜內預防性及治療性投與之mAb 1068。模擬處理之對照組小鼠如上文所述接受經腹膜內投與之於PBS中之非專一性IgG。單獨流行性感冒A/PR/8病毒與肺炎鏈球菌劑量未達致死量，因為被單獨病毒或細菌感染之小鼠100%存活(圖22)。然而，彼等用它法未達致死劑量之病毒或細菌加在一起感染，則使大多數小鼠產生致命性肺炎(圖22)。

細菌感染48小時後，使小鼠安樂死，無菌操作下獲取肺臟，於無菌PBS中均質化，於PBS中製備均漿稀釋液，將稀釋液放置於TSA/血液培養皿上，以測定肺臟中之細菌負擔。然後培育該等培養皿至看見菌落並計算CFUs。如圖23所示，先前以未達致死劑量之流行性感冒病毒感染，經肺炎鏈球菌感染2天後，增加肺中之細菌負擔。

相較於接受0.6毫克或0.06毫克非專一IgG對照組單株抗體之對照組小鼠，於第8及第9天每隻小鼠投與0.6毫克或0.06毫克抗－TLR3 mAb 1068增加被流行性感冒病毒A/PR/8與肺炎鏈球菌感染的小鼠之存活率(圖22)。

重要的是，C57BL/6母小鼠平均體重介於18克與20克之間；因此對接受0.6毫克mAb 1068之小鼠而言，所投與TLR3拮抗劑之劑量範圍為大約3.0毫克/公斤與3.3毫克/公斤體重之間，接受0.06毫克mAb 1068之小鼠則為大約30毫克/公斤與33毫克/公斤體重之間。圖21係標示此範圍之較低端。

實例 17

TLR3 活性對結腸上皮細胞增殖率之影響於鼠類模式中，結腸上皮細胞之增殖率由於剔除TLR3受體基因活性而增加(數據示於表4)。於彼等實驗中，如上文所述之野生型C57BL/6公小鼠或TLR3基因剔除小鼠各自經腹膜內給與於1毫升PBS中之1毫克溴脫氧尿苷(BrdU)，2小時後，犧牲小鼠。所有小鼠為6至8週大，各處理組別具有至少3隻小鼠。

然後獲取供組織病理學分析用之結腸。將結腸組織固定，切段，包埋於石蠟中，製備5微米之切片。根據廠商之操作指南，使切片相繼與小鼠抗－BrdU IgG單株抗體(Becton－Dickinson Biosciences，Inc.,San Jose,CA)、山羊抗－小鼠IgG單株抗體(Becton－Dickinson Biosciences,Inc.,San Jose,CA)、山葵過氧化酶(HRP)接合物(Becton－Dickinson Biosciences,Inc.,San Jose,CA)、及二胺基聯苯胺(DAB)基質(Becton－Dickinson Biosciences,Inc.,San Jose,CA)培育。培育後之切片使用標準方法，以蘇木素進行對比染色。

然後直觀審查經培育之切片，計算結腸腺窩中因BrdU併入DNA中而呈陽性染色之細胞數。於得自相同片段的切片之24個妥為排列之延續腺窩中計算細胞。以BrdU併入作為鑑定經由細胞週期進展的細胞(亦即，增殖細胞)之代用標記。表4中，增殖率數據以每2小時每隻動物每一結腸腺窩BrdU染色細胞之平均數表示。彼等數據以平均增殖率±標準偏差(P<0.0001，T－試驗)呈現。

數據指示，TLR3之不活化作用增加結腸上皮細胞之增殖作用。

實例 18

TLR3 活性於炎性腸道疾病復原期間對結腸上皮細胞增殖率之影響於鼠類模式炎性腸道疾病(IBD)復原期間，結腸上皮細胞之增殖率由於剔除TLR3受體基因活性而增加(表5)。

於彼等實驗中，野生型C57BL/6公小鼠或上述TLR3 KO小鼠各給與含5%(w/v)硫酸鈉葡聚醣(DSS)之飲用水3天，以誘發急性潰瘍性結腸炎。然後供給白水直至30小時後實驗終了。於開始接受白水6小時後，如上文所述，對小鼠注射BrdU。然後令小鼠自DSS誘發的潰瘍性結腸炎復原24小時後，犧牲小鼠。所有小鼠為6至8週大，各處理組別具有至少3隻小鼠。

如上文實例15所述製備及分析供結腸腺窩細胞增殖之組織病理學分析用之結腸試樣。增殖率數據以每24小時每隻動物每一結腸腺窩BrdU染色細胞之平均數表示。彼等數據以平均增殖率±標準偏差(P<0.004，T－試驗)呈現。表5之數據指示，於炎性腸道疾病復原期間，TLR3之不活化作用增加結腸上皮細胞之增殖率。

實例 19

TLR3 基因剔除小鼠之胰島素敏感性 TLR3剔除(KO)(C57BL/6背景)及野生型(WT)對照組小鼠(C57 Bl/6)以由60.9%千卡脂肪與20.8%千卡碳水化合物組成之高脂飼料(Purina TestDiet #58126)餵飼。對照組TLR3 KO及WT小鼠以正常飼料餵飼。使動物禁食隔夜，經由腹膜內注射1.0毫克/克葡萄糖以進行葡萄糖耐受性試驗(GTT)，於0、15、30、60、90、及120分鐘取得血糖讀數。

圖31顯示，相較於高脂飼料餵飼之野生型小鼠，高脂飼料餵飼14及26週之TLR3 KO小鼠顯示於葡萄糖耐受性試驗中有改善。餵飼正常飼料之小鼠如預期未展示任何變化。彼等結果顯示，TLR3傳訊作用可能影響胰島素敏感性而提供使用TLR3拮抗劑治療2型糖尿病之基礎。

圖32顯示高脂餵飼及正常飼料餵飼的小鼠之空腹血糖量。相較於高脂飼料餵飼之野生型小鼠，TLR3 KO動物之空腹血糖量常態化。彼等數據暗示，TLR3傳訊作用可能干擾肝臟葡萄糖代謝，促成葡萄糖耐受性不良及胰島素抗阻之進展。

接著，評估以正常飼料或高脂飼料餵飼的TLR3 KO及野生型小鼠之胰島素量。測量禁食隔夜小鼠於葡萄糖攻毒前後血中胰島素含量。使用Crystal Chem(Downers Grove,IL)Ultra－Sensitive ELISA分析試驗套組(cat # 90060)定量胰島素。以高脂飼料餵飼之TLR3 KO小鼠於基線(未進行葡萄糖攻毒)及葡萄糖攻毒20與60分鐘後，顯示胰島素含量增加(圖33)。整體而言，加上葡萄糖耐受性試驗所得結果，由數據顯示，缺乏TLR3傳訊作用影響胰島素含量及敏感性。

犧牲以高脂飼料餵飼30週之TLR3 KO小鼠，測定其血清試樣中之脂質概況：測定總膽固醇、HDl、LDL、三酸甘油酯與FFA。簡言之，所有脂質試驗均使用GEMCAL Reference Serum(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies,LCC,West Caldwell,NJ)，將未知試樣之吸收變化參照標準吸收變化予以校正。每天於記述結果之前，先進行兩個標準對照組。裝填試樣，獲得脂質數據，以習知單位毫克/分升表示。FFA含量係使用NEFA套組(Wako)予以測定。相較於同法餵飼之野生型小鼠，TLR3 KO動物顯示較低之膽固醇、LDL與HDL以及FFA流通量。彼等結果顯示，缺乏TLR3傳訊作用在降低膽固醇量上扮演有利角色，證明TLR3拮抗劑單株抗體於治療心血管疾病及預防與2型糖尿病相關的心血管併發症上之效用。

總之，所呈現結果顯示，相較於野生型小鼠，以高脂飼料餵飼之TLR3 KO小鼠防禦葡萄糖耐受性不良(為胰島素抗阻之特徵)之進展，證明缺乏TLR3傳訊作用可防護小鼠免受II型糖尿病傷害。再者，數據顯示，相較於以高脂飼料餵飼之野生型小鼠，以高脂飼料餵飼之TLR3 KO小鼠具有較低量之總膽固醇、LDH與HDL膽固醇以及HDLc/LDLc比率，因此表明TLR3拮抗劑於向下調節與心血管疾病相關的危險因子上之有利角色。彼等發現暗示TLR3抑制劑於2型糖尿病、血脂失調及代謝症候群治療方法上之用途。

實例 20

適應人類之抗 －TLR3 單株抗體之產生及鑑定使用鼠類抗－TLR3 mAb C1068之胺基酸序列探詢自公共抗體序列資料庫匯編之人類抗體資料庫。C1068(SEQ ID NO：6)之重鏈可變區顯示與四個重鏈胚細胞序列(亦即人類VH1重鏈族之VB_1－03/JH1 72、VB_1－02/JH1 71、VB_1－08/JH1 71與VB_1－69/JH2 70)之最高同質性。於是乃合成四個核酸構築體，其中係將C1068重鏈之諸CDR區域移入所選定人類胚細胞重鏈序列之內，以產生具有分別如SEQ ID NOs：25、27、29及31所示可變區胺基酸序列之四個適應人類之抗－TLR3單株抗體重鏈，命名HV1、HV4、HV5與HV7。

C1068(SEQ ID NO：16)之輕鏈可變區顯示與四個輕鏈胚細胞序列(亦即人類VK I族之VB_O12/JK2 78、VB_A30/JK2 77、VB_A20/JK4 76與VB_L1/JK2 76)之最高同質性。於是乃合成四個核酸構築體，其中係將C1068輕鏈之諸CDR區域移入所選定人類胚細胞輕鏈序列之內，以產生具有分別如SEQ ID NOs：33、35、37及39所示可變區胺基酸序列之四個適應人類之抗－TLR3單株抗體輕鏈，命名LV1、LV3、LV5與LV7。

表現代表四個重鏈與四個輕鏈可變區構築體之所有可能組合之十六個單株抗體。所有重鏈可變區架構以全長重鏈中殘基108之Ser替換為Pro，Phe114與Leu115替換為Ala(SEQ ID NO：41)；S228P、F234A及L235A之人類IgG4重鏈恒定區表現。所有輕鏈可變區架構以人類K恒定區(SEQ ID NO：4)表現。

利用含有質體的適當重鏈與輕鏈之共轉染，於哺乳類細胞中短暫表現諸抗體。使用標準蛋白A純化抗體，將其透析入PBS中供鑑定用。

使用ELISA版式，與親代鼠類mAb C1068相較下，評估所有16個單株單體與人類TLR3(SEQ ID NO：4)胞外功能部位之結合作用。簡言之，將可溶性人類TLR3胞外功能部位塗覆於96槽盤之諸槽，於各種濃度(10^－ ³ 至10³ 奈克/毫升)培育諸候選單株抗體，使用兔抗－小鼠IgG－HRP檢測鼠類IgG1同功型(Zymed,South San Francisco,CA)之結合抗體，或使用HRP－標記之抗－人類IgG(Jackson 109－036－088)檢測人類IgG4同功型之結合抗體。測定諸EC₅ ₀ 值，結果示於圖24及下文表7。

C1068之EC₅ ₀ 計算值為8奈克/毫升；結果指示，相較於鼠類親代mAb 1068，12個適應人類單株抗體之EC₅ ₀ 計算值減少小於40倍。藉由測定利用Biacore之結合親和性及於細胞系細胞介素釋放分析試驗中之結合活性，進一步鑑定具有粗體字EC₅ ₀ 值之單株抗體。

利用Biacore之結合親和性測定係利用單株抗體捕獲技術及TLR3捕獲技術進行。單株抗體捕獲分析係於25℃使用備有CM5晶片[表面利用標準胺偶聯法，於25℃以蛋白A(6,000 RU)予以修飾]之Biacore 2000生物感應器進行。稀釋抗體至30 nM，於不同蛋白A表面捕獲一分鐘。注射0、0.1、0.3、1.0、3.0、及9.0 nM之TLR3，偵測結合與解離5分鐘。使用兩個6秒脈衝100 nM磷酸使經蛋白A修飾之表面再生。將可利用之結合數據組帶入1：1相互作用模式(CLAMP^T ^M )中。計算速率常數與其比率(KD＝kd /ka )及估算表觀平衡常數時帶來之適配誤差。

TLR3捕獲分析係於25℃使用備有CM5晶片[表面利用標準胺偶聯法，於30℃以抗－His抗體(R&D Systems)(10,000 RU)予以修飾]之Biacore 3000生物感應器進行。於三個表面捕獲80、120、及300 RU密度之人類六－組織胺酸－TLR3，以第四個表面作為參照組。注射二重複之0、0.4、1.1、3.3、10、及30 nM抗體。偵測結合相三分鐘及偵測解離相七分鐘。使用兩個3－秒脈衝50 mM磷酸再生諸抗－His抗體表面。將可利用之結合數據組帶入經校正用於不同趨勢(drifts)之各單株抗體濃度概況之1：1相互作用模式(BIAeval^T ^M )中。計算速率常數與其比率(KD＝kd /ka )及估算表觀平衡常數時帶來之適配誤差。

經計算之K_D 結果示於下文表8。兩個測定值代表1)晶片表面捕獲的抗－TLR3單株抗體與溶液中施加的人類TLR3之結合親和力及2)晶片表面捕獲的TLR3與施加於溶液相中的抗－TLR3單株抗體之結合親和力。結果指示，於利用固定化單株抗體捕獲溶液系TLR3時，所有候選單株抗體保持nM親和性，證實諸組合單株抗體已保留1068之結合特性。當TLR3於晶片上固定化時，多數候選單株抗體保留緊密結合特性，此結果與ELISA結合曲線一致。

利用Biacore測定之適應人類抗－TLR3單株抗體之結合活性亦於細胞系細胞介素釋放分析試驗中予以測定。將人類肺上皮細胞株BEAS－2B塗佈於96槽盤，於細胞中添加多(I：C)或與候選抗體於不含血清基質中預培育之多(I：C)。4天後，移出條件式培養基，利用Luminex技術測定可溶性細胞介素含量。結果示於圖25，證明適應人類之單株抗體保持親代mAb C1068之生物活性，亦即，由使用TLR3配位體多(I：C)攻毒之細胞促炎性細胞介素產生減少測得之TLR3活性中和作用。

實例 21

適應人類之 C1068 重鏈與輕鏈變異體之產生及鑑定鼠類抗－TLR3 mAb 1068 CDRs之電腦篩選免疫原性分析揭示可操作以減少序列之免疫原性計分之於CDR界限內之一系列聚集部位(aggretopes)。一旦鑑定出可予以操作之區域，則應用序列以及結構準則以決定必須使用之胺基酸替換。使用彼等準則，於重鏈可變區(V_H )鑑定出四個單一點－胺基酸替換；於輕鏈可變區(V)鑑定出三個突變(單一突變、雙突變及三突變)。所有八個突變於HV1/LV1背景中互相獨立地進行，並列於表9。同時應用另一種替換，以決定M102殘基轉變為異白胺酸之效應，完成CDRs中全數甲硫胺酸之轉換，因為彼等殘基於轉譯後會被氧化，一種可能對蛋白質溶解性有害之修飾作用。如上文所述產生彼等抗體，並評估TLR3結合作用(見表10與11)及生物活性(見圖26－30)。

如對抗人類TLR3之結合EC₅ ₀ 所示，嫁接於HV1/LV1背景內之1068 CDRs Vh中進行之所有五個單一點突變均具耐性。HV1/LV1背景測得之EC₅ ₀ 為29.2奈克/毫升；134M與Y60G二者之EC₅ ₀ 值均較低，分別為17與14.6奈克/毫升。此暗示彼等變化不僅減少HV1/LV1之電腦篩選免疫原性，亦增進與TLR3之結合作用。其他三個突變之結合作用比HV1/LV1稍微弱些。

V1之CDR1中之突變無一者具耐性(EC₅ ₀ >1000奈克/毫升)，暗示此區域對於1068如何識別人類TLR3具決定性。

頃已完整敘述本發明，對於熟習此項技藝人士而言，在不偏離隨附專利申請之精神或範圍下之許多變化及修飾乃顯見之事。

圖1顯示得自人類TLR3(hTLR3)單株抗體拮抗劑之重鏈可變區序列(CDRs劃出底線)。

圖2顯示得自hTLR3單株抗體拮抗劑之輕鏈可變區序列(CDRs劃出底線)。

圖3顯示利用TLR3拮抗劑於人類肺上皮衍生細胞中抑制由多(I：C)誘發之IL-6細胞介素產生。

圖4顯示利用TLR3拮抗劑於人類肺上皮衍生細胞中抑制由多(I：C)誘發之IL-8細胞介素產生。

圖5顯示利用TLR3拮抗劑於人類肺上皮衍生細胞中抑制由多(I：C)誘發之RANTES細胞介素產生。

圖6顯示利用TLR3拮抗劑於初級人類支氣管-上皮細胞中抑制由多(I：C)誘發之MIP1-α 細胞介素產生。

圖7顯示利用TLR3拮抗劑於初級人類支氣管-上皮細胞中抑制由多(I：C)誘發之IL-6細胞介素產生。

圖8顯示剔除TLR3活性對與IBD-相關的減重之影響。

圖9顯示利用TLR3拮抗劑抑制與IBD-相關的減重。

圖10顯示經由以TLR3拮抗劑處理，鼠類敗血症模式中存活率增加。

圖11顯示利用TLR3拮抗劑，鼠類敗血症模式中IL-6細胞介素生產降低。

圖12顯示利用TLR3拮抗劑，鼠類敗血症模式中TNF-α細胞介素生產降低。

圖13顯示於鼠類肺組織中，由多(I：C)誘發的炎性細胞總數增加。

圖14顯示於鼠類肺組織中，由多(I：C)誘發的嗜中性白血球增加。

圖15顯示於鼠類肺組織中，由多(I：C)誘發的單核炎性細胞增加。

圖16顯示使用單一劑量多(I：C)之TLR3活化，進一步於受乙醯甲基膽鹼攻毒之小鼠中傷害肺功能。

圖17顯示使用多劑量多(I：C)之TLR3活化，進一步於受乙醯甲基膽鹼攻毒之小鼠中傷害肺功能。

圖18顯示TLR3基因剔除小鼠，於乙醯甲基膽鹼攻毒期間，免受由單一劑量多(I：C)誘發的肺功能傷害。

圖19顯示TLR3基因剔除小鼠，於乙醯甲基膽鹼攻毒期間，免受由多劑量多(I：C)誘發的肺功能傷害。

圖20顯示TLR3拮抗劑對人類肺支氣管上皮細胞中細胞介素與化學激素產生之影響。

圖21顯示經由使用TLR3拮抗劑預防及治療，鼠類致命性肺炎模式中存活率增加。

圖22顯示經未達致死劑量之流行性感冒病毒A/PR/8與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )感染後，於鼠類模式中致命性肺炎之進展。

圖23顯示經流行性感冒病毒A/PR/8與肺炎鏈球菌感染之小鼠肺中之細菌負擔。

圖24A、B、C與D顯示於ELISA分析試驗中，適應人類之抗-TLR3單株抗體與hTLR3之結合作用。

圖25顯示於細胞系細胞介素釋放分析試驗中，適應人類之抗-TLR3單株抗體之評估。

圖26顯示於使用IP-10讀出裝置之細胞系生物活性分析試驗中，變異單株抗體HBV1至HBV8(HBV4除外)之評估。

圖27顯示於使用RANTES讀出裝置之細胞系生物活性分析試驗中，變異單株抗體HBV1至HBV8(HBV4除外)之評估。

圖28顯示於使用IL-8讀出裝置之細胞系生物活性分析試驗中，變異單株抗體HBV1至HBV8(HBV4除外)之評估。。

圖29顯示於使用MCP-1讀出裝置之細胞系生物活性分析試驗中，變異單株抗體HBV1至HBV8(HBV4除外)之評估。

圖30顯示於使用IL-6讀出裝置之細胞系生物活性分析試驗中，變異單株抗體HBV1至HBV8(HBV4除外)之評估。

圖31A及圖31B顯示高脂飼料餵飼14週(A)及26週(B)之TLR3基因剔除小鼠防止與高脂餵飼相關的葡萄糖耐受不良之進展。

圖32顯示TLR3基因剔除小鼠高脂餵飼26週後，具有正常之空腹血糖量。

圖33A、B與C顯示以高脂飼料餵飼TLR3基因剔除小鼠26週，於基線(未進行葡萄糖攻毒)(圖33A)、經葡萄糖攻毒後20分鐘後(圖33B)與60分鐘後(圖33C)，空腹胰島素含量增加。

圖34A、B、C、D與E顯示經高脂餵飼30週後，相較於以高脂飼料餵飼之野生型小鼠，TLR3基因剔除小鼠之脂質概況獲改善，如總膽固醇(圖34A)、HDL(圖34B)、LDL(圖34C)、FFA(圖34D)及HDLc/LDLc比率(圖34E)。圖35顯示於誘發慢性DSS結腸炎期間，使用TLR3拮抗劑之預防(Pr)與治療(T)處理。

圖36顯示各DSS攝取週期出現之減重。

圖37顯示第二DSS週期後之減重及回復。

圖38顯示第三DSS週期後之減重及回復。

圖39顯示TLR3拮抗劑處理對與慢性DSS結腸炎相關之淨減重之影響。

圖40顯示TLR3拮抗劑處理對與慢性DSS結腸炎相關之結腸變短之影響。

圖41A、B與C顯示TLR3拮抗劑處理對慢性DSS結腸炎嚴重性之影響。圖41A為各組別之總和；圖41B為各組溫和組織病理學變化；圖41C為慢性修復性組織病理學變化。圖41D、E與F顯示hTLR3拮抗劑處理於慢性DSS結腸炎中之組織病理作用。圖41D為各組別之上皮潰瘍形成；圖41E為各組別之固有層肉芽組織之形成；圖41F為各組別之黏膜下層肉芽組織之形成。

圖42顯示慢性DSS結腸炎中之T-細胞活化作用。

圖43顯示預防性TLR3拮抗劑處理對脾臟中與DSS相關之CD11b+細胞增加之影響。

圖44顯示TLR3拮抗劑處理對慢性DSS結腸炎中IL-4與IL-10全身含量之影響。

<110> 卡爾頓/CARTON,JILL M. 陳欣柔/CHEN,SHIZHONG 邱寧翰/CUNNINGHAM,MARK 達安克/DAS,ANUK 杜凱倫/DUFFY,KAREN 吉雷斯/GILES－KOMAR,JILL M. 高磊茲/GOLETZ,THERESA J. 奈大衛/KNIGHT,DAVID 羅柏塔/LAMB,ROBERTA 摩哈瑪/MBOW,M.LAMINE 克莉絲/PICHA,KRISTEN 拉谷翰/RAGHUNATHAN,GOPALAN 馬特歐/SAN MATEO,LANI 薩黎斯/SARISKY,ROBERT T. 史托維/STOWELL,NICOLE 史維克/STOJANOVIC－SUSULIC,VEDRANA 史雷門/SWEET,RAYMOND 趙善榮/ZHAO,SHANRONG <120> 類鐸受體3拮抗劑，方法及用途<130> CEN5083 USA NP <140> 待指定<141> 2005－11－30 <150> 60/631,815 <151> 2004－11－30 <150> 60/636,399 <151> 2004－12－15 <150> 60/641,877 <151> 2005－01－06 <150> 60/713,195 <151> 2005－08－31 <150> 60/727,610 <151> 2005－10－18 <160> 63 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2712 <212> DNA <213> 智人<400> 1 <210> 3 <211> 2109 <212> DNA <213> 智人<400> 3<210> 4 <211> 703 <212> PRT <213> 智人<400> 4 <210> 5 <211> 381 <212> DNA <213> 小家鼠<400> 5<210> 6 <211> 138 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 6 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 7<210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 8<210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 9<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 10<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 11 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12<210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 13<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 14<210> 15 <211> 381 <212> DNA <213> 小家鼠<400> 15<210> 16 <211> 127 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 16 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 17<210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 18<210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 19<210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 20<210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 21<210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 22<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 23<210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 24<210> 25 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV1 <400> 25 <210> 26 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV1 <400> 26<210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV4 <400> 27<210> 28 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV4 <400> 28<210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV5 <400> 29<210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV5 <400> 30 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV7 <400> 31<210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈HV7 <400> 32<210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV1 <400> 33 <210> 34 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈Lv1 <400> 34<210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV3 <400> 35<210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV3 <400> 36<210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV5 <400> 37<210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV5 <400> 38<210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV7 <400> 39<210> 40 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈LV7 <400> 40<210> 41 <211> 327 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人類IgG4重鏈恒定區變異體<400> 41 <210> 42 <211> 981 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人類IgG4重鏈恒定區變異體<400> 42 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人類k恒定區<400> 43<210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人類k恒定區<400> 44<210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV1 <400> 45 <210> 46 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV1 <400> 46<210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV2 <400> 47<210> 48 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV2 <400> 48<210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV3 <400> 49<210> 50 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV3 <400> 50 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV4 <400> 51<210> 52 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV4 <400> 52<210> 53 <211> 119 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV5 <400> 53<210> 54 <211> 357 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之重鏈變異體HBV5 <400> 54<210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV6 <400> 55<210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV6 <400> 56<210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV7 <400> 57<210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV7 <400> 58 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV8 <400> 59<210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 適應人類之輕鏈變異體HBV8 <400> 60<210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <221> 不確定<222> (5) <223> 重鏈CDR1其中位置5之Xaa可為異白胺酸或甲硫胺酸<400> 61 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <221> 不確定<222> (11) <223> 重鏈CDR2其中位置11之Xaa可為酪胺酸或甘胺酸<220> <221> 不確定<222> (12) <223> 重鏈CDR2其中位置12之Xaa可為天冬醯胺或丙胺酸<220> <221> 不確定<222> (15) <223> 重鏈CDR2其中位置15之Xaa可為苯丙胺酸或甘胺酸<400> 62<210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <221> 不確定<222> (4) <223> 重鏈CDR3其中位置4之Xaa可為甲硫胺酸或異白胺酸<400> 63

Claims

一種與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，含有(a)在重鏈可變區(V_H )之如SEQ ID NOs：9、11與13所示之重鏈互補決定區(CDRs)之胺基酸序列，及在輕鏈可變區(V_L )之如SEQ ID NOs：19、21與23所示之輕鏈CDRs之胺基酸序列；或(b)如SEQ ID NO：6所示胺基酸序列之重鏈可變區(V_H )及如SEQ ID NO：16所示胺基酸序列之輕鏈可變區(V_L )；或(c)如SEQ ID NO：25、27、29或31所示胺基酸序列之V_H 及如SEQ ID NO：33、35、37或39所示胺基酸序列之V_L 。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：25所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體係源自人類。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體係源自鼠類。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體包含Fab片段。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體包含scFv片段。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體或片段係經人類適應。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體或片段包含嵌合型抗體。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體與聚乙二醇接合。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體或片段包含鼠類抗原結合殘基及人類抗體殘基。
如申請專利範圍第1項之單離抗體，具有IgG4同功型。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中該Fc功能部位包含S228P、P234A及L235A等突變。
一種與TLR3具反應性之單離抗體，其包含(a)如式(I)所示之V_H CDR1胺基酸序列：Thr Thr Tyr Trp Xaa₁ His(I)式中Xaa₁ 為Ile或Met(SEQ ID NO：61)；如式(II)所示之V_H CDR2胺基酸序列：Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa₂ Xaa₃ Glu Lys Xaa₄ Lys Thr(II)式中Xaa₂ 為Tyr或Gly，Xaa₃ 為Asn或Ala及Xaa₄ 為Phe或Gly(SEQ ID NO：62)；及如式(III)所示之V_H CDR3胺基酸序列： Val Gly Val Xaa₅ Ile Thr Thr Phe Pro Tyr(III)式中Xaa₅ 為Met或Ile(SEQ ID NO：63)；及具有如SEQ ID NOs：19、21與23所示之胺基酸序列之V_L CDRs；或(b)如SEQ ID NO：45、47、49、51或53所示胺基酸序列之V_H 及如SEQ ID NO：33、35、37或39所示胺基酸序列之V_L 。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中Xaa₁ 為Met；Xaa₂ 為Tyr；Xaa₃ 為Asn；Xaa₄ 為Phe；及Xaa₅ 為Met。
如申請專利範圍第14項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中Xaa₁ 為Ile；Xaa₂ 為Gly；Xaa₃ 為Asn；Xaa₄ 為Phe；及Xaa₅ 為Met。
如申請專利範圍第16項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：47所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中Xaa₁ 為Ile；Xaa₂ 為Tyr；Xaa₃ 為Ala；Xaa₄ 為Phe；及Xaa₅ 為Met。
如申請專利範圍第18項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：49所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中Xaa₁ 為Ile；Xaa₂ 為Tyr；Xaa₃ 為Asn；Xaa₄ 為Gly；及Xaa₅ 為Met。
如申請專利範圍第20項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：51所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第13項之單離抗體，其中Xaa₁ 為Ile；Xaa₂ 為Tyr；Xaa₃ 為Asn；Xaa₄ 為Phe；及Xaa₅ 為Ile。
如申請專利範圍第22項之單離抗體，其中該V_H 具有如SEQ ID NO：53所示之胺基酸序列及該V_L 具有如SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項之單離抗體及醫藥上可接受之載劑。
一種單離多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項所述包含SEQ ID NOs：9、11與13所示CDR胺基酸序列之抗體重鏈，及如申請專利範圍第1項所述包含SEQ ID NOs：19、21與23所示CDR胺基酸序列之抗體輕鏈；其中該抗體與TLR3反應。
一種單離多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至23項中任一項所述包含SEQ ID NO：6、25、27、29、31、45、47、49、51或53所示胺基酸序列之抗體重鏈，及如申請專利範圍第1至23項中任一項所述包含SEQ ID NO：16、33、35、37或39所示胺基酸序列之抗體輕鏈；其中該抗體與TLR3反應。
如申請專利範圍第26項之單離多核苷酸，其包含SEQ ID NOs：5、26、28、30、32、46、48、50、52或54所示之序列。
如申請專利範圍第26項之單離多核苷酸，其包含SEQ ID NOs：15、34、36、38或40所示之序列。
一種載體，其包含如申請專利範圍第25、26、27或28項之至少一種單離多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第29項之載體。
一種製造與TLR具反應性之抗體之方法，該方法包括培養如申請專利範圍第30項之宿主細胞及回收該宿主細胞生產之抗體。
一種如申請專利範圍第1項之單離抗體於製備藥劑之用途，該藥劑用於抑制IL-6、IL-8或MIP1-α的細胞生產。
一種TLR3拮抗劑於製備藥劑之用途，該藥劑用於增加細胞增殖率，其中該TLR拮抗劑係與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，其在 V_H 含有如SEQ ID NOs：9、11與13所示之重鏈CDRs之胺基酸序列及在V_L 含有如SEQ ID NOs：19、21與23所示之輕鏈CDRs之胺基酸序列。
如申請專利範圍第33項之用途，其中該細胞係存在動物之組織中。
如申請專利範圍第33項之用途，其中該細胞係上皮細胞。
如申請專利範圍第34項之用途，其中該組織係結腸組織。
如申請專利範圍第34項之用途，其中該組織展現與炎性疾病相關之病變。
如申請專利範圍第37項之用途，其中該炎性疾病為炎性腸道疾病。
如申請專利範圍第33項之用途，其中該單離抗體包含具有如SEQ ID NO：6、25、27、29或31所示胺基酸序列之V_H 及如SEQ ID NO：16、33、35、37或39所示胺基酸序列之V_L 。
如申請專利範圍第33項之用途，其中該TLR拮抗劑係與TLR3具反應性之單離抗體，其具有單株抗體之抗原結合能力，包含具有如SEQ ID NO：45、47、49、51或53所示胺基酸序列之V_H 及如SEQ ID NO：33、35、37或39所示胺基酸序列之V_L 。