ES2435775T3

ES2435775T3 - Moduladores de receptor tipo Toll 3, procedimientos y usos

Info

Publication number: ES2435775T3
Application number: ES06846174T
Authority: ES
Inventors: Karen E. Duffy; Chong C. Huang; Roberta Lamb; Mouhamadou L. Mbow; Robert T. Sarisky; Mateo Lani San
Original assignee: Janssen Biotech Inc; Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2013-12-23
Anticipated expiration: 2026-10-26
Also published as: DK1945820T3; US20070098716A1; EP1945820A2; EP1945820A4; WO2007051164A8; WO2007051164A3; EP1945820B1; WO2007051164A2; US7718778B2; JP5199878B2; JP2009523010A

Abstract

Un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3: que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada como se muestran en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 y las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera como se muestran en SEC ID Nº: 19, 21 y 23; o que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16.

Description

Moduladores de receptor tipo Toll 3, procedimientos y usos

Antecedentes de la invención

El reconocimiento de antígenos extraños por células de mamífero puede estar mediado por un conjunto de receptores inmunes innatos llamados receptores tipo Toll (TLR), véanse los documentos EP 1 887 014, US 2005/112659 y US 2005/158799. Los TLR reconocen patrones conservados derivados de patógenos microbianos identificados como patrones moleculares asociados a patógeno (PAMP) (Barton y col., Science 300:1524-1525, 2003). La interacción de un TLR con una PAMP produce una cascada de señalización que implica la activación de NF-κB y la transcripción de la expresión génica de citocinas. Se han identificado diez receptores tipo Toll humanos y cinco proteínas adaptadoras de TLR.

Los TLR pueden expandir su repertorio de ligandos formando homo-o heterodímeros, además de unirse a diferentes proteínas adaptadoras. Por ejemplo, TLR3 se une a ARNbc, un producto intermedio en la replicación viral. TLR3 también interactúa con PolyI:C, un análogo de ARNbc sintético, y ARNm de células necróticas. La activación de TLR3 conduce a la secreción de interferones tipo I, que son importantes en el control de la infección viral. Una secuencia de aminoácidos de TLR3 humano de longitud completa y la secuencia de polinucleótidos codificante se muestran en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente. Los TLR TLR7, TLR8 y TLR9 también tienen ligandos de ácido nucleico; la activación de estos TLR también puede conducir a la secreción de interferón.

Los interferones tipo I desencadenan cascadas de señalización para activar un conjunto de genes de respuesta temprana inmediata (genes estimulados por IFN o ISG) y han demostrado ser útiles en la clínica, véase el documento US 2004 091491. Las actividades antivirales resultantes incluyen inhibición de la traducción de ARNm, edición de ARN y degradación de ARN (Samuel y col., Clin Microbiol Rev 14:778-809, 2001, y Bhattacharjee y col. Curr. Immunol. Rev 1: 81-90, 2005). Actualmente está siendo usada una terapia de combinación de interferón PEGilado y el compuesto antiviral de amplio espectro ribavirina para tratar infección por hepatitis C (Manns y col., Lancet 358:958-965, 2001).

La función antiviral crítica de IFN de tipo I se demuestra adicionalmente por la evolución de mecanismos de resistencia viral para inhibir la producción de IFN tipo I por células huésped infectadas. Por ejemplo, la proteína NS1 de la gripe antagoniza la activación de IRF-3 y producción de IFNβ (Donelan y col., J Virol 78: 11574-11582, 2004) y la proteína del virus de la viruela A52R se asocia con IRAK2 y TRAF6 para bloquear la señalización aguas abajo de TLR3 (Harte y col., J Exp Med, 197:343-351, 2003). Así, terapias basadas en provocar la activación de TLR o el potenciamiento de rutas de señalización mediadas por TLR aumentan la producción de IFN!/β endógeno y ayudan al huésped en el control de infecciones virales agudas.

El uso de agonistas de TLR para modular el resultado de una respuesta inmunitaria está siendo actualmente investigado para uso terapéutico (O'Neill, Curr Opin Pharm 3:396-403, 2003; Schetter y col., Curr Opin Drug Discov Devel 7:204-210, 2004). Por ejemplo, oligodinucleótidos (ODN) de CpG, un ligando de TLR9, pueden estimular la producción de IFN tipo I y una respuesta de TH1 (Krieg, Annu Rev Immunol 20:709-60, 2002), un hallazgo que sugiere el posible uso de ODN de CpG no solo como un adyuvante de vacuna, sino también para el tratamiento y o prevención de enfermedades que necesitan una potente respuesta de TH1. Otro ejemplo es el agonista de TLR7 sintético imiquimod, un agente aprobado para el tratamiento de condilomas acuminados; se cree que su efecto protector está mediado por la estimulación de citocinas inflamatorias tales como IFN!, TNF! y IL-1β (Saunder, J Amer Acad Derm 43: S6-S11, 2000). En general, estos hallazgos muestran que los agonistas de TLR son una clase novedosa de agentes inmunomoduladores con el potencial de tener un beneficio terapéutico significativo.

Así, existe la necesidad de identificación de novedosos agentes inmunomoduladores que potencien el efecto de agonistas de TLR. Se espera que tales terapias novedosas basadas en TLR tengan una ventaja en proporcionar una respuesta inmunitaria sostenida con pautas de dosificación menos frecuentes.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra secuencias de la región variable de la cadena pesada del mAb anti-hTLR3 C1130. La Fig. 2 muestra secuencias de la región variable de la cadena ligera del mAb anti-hTLR3 C1130. La Fig. 3 muestra la secreción de IL-8, MCP-1, MIP-1!, RANTES y TNF! inducida por C1130 por células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas a 24 h. La Fig. 4 muestra que C1130 potenció la producción de IFN! inducida por CpG a 24 h. La Fig. 5 muestra que C1130 disminuyó la producción de IL-10 inducida por R848 a 24 h. La Fig. 6 muestra el reconocimiento por C1130 de TLR3 de la superficie celular sobre células HEK293 establemente transfectadas. La Fig. 7 muestra el reconocimiento por C1130 de TLR3 de la superficie celular sobre células A549-TLR3.2 establemente transfectadas. La Fig. 8 muestra el reconocimiento por C1130 de CMSP de macaco cinomolgo.

Resumen de la invención

Un aspecto de la divulgación es un anticuerpo aislado reactivo con receptor tipo Toll 3 humano (hTLR3) o sus homólogos que induce la producción celular de una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-8, MCP-1, MIP1-!, RANTES y TNF-!.

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 o sus homólogos que modifica una respuesta inmunitaria a otros ligando de receptores tipo Toll.

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 que tiene la capacidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada como se muestra en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 y las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera como se muestra en SEC ID Nº: 19, 21 y 23.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada como se muestra en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 y las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera como se muestra en SEC ID Nº: 19, 21 y 23.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada del anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 9, 11 y 13.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera del anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 19, 21 y 23.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6.

Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16.

Otros aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para tratar o prevenir infección viral que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un inmunoestimulante.

Otro aspecto de la divulgación es un procedimiento para tratar cáncer que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un inmunoestimulante.

Otro aspecto de la divulgación es un procedimiento para tratar enfermedad inflamatoria del intestino que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un inmunoestimulante.

Otros aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para tratar o prevenir un síntoma asociado a infección viral que comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un agonista de receptor tipo Toll 7 (TLR7).

Otros aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad pulmonar y exacerbación mediada por patógenos que comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un agonista de TLR9 o TLR7.

Otros aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para tratar o prevenir enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD) que comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un agonista de TLR9 o TLR7.

Otros aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para tratar o prevenir enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con un tratamiento inmunológico.

Descripción detallada de la invención

El término “anticuerpos” como se usa en el presente documento se indica en un amplio sentido e incluye inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales que

incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanizados y quiméricos, y fragmentos de anticuerpos.

En general, los anticuerpos son proteínas o polipéptidos que presentan especificidad de unión por un antígeno específico. Los anticuerpos intactos son glucoproteínas heterotetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Normalmente, cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre las cadenas regularmente separadas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras del anticuerpo de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente kappa (∀) y lambda ( #), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA y IgG se subclasifican adicionalmente como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4.

El término “fragmentos de anticuerpos” significa una parte de un anticuerpo intacto, generalmente la región de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos.

El término “antígeno” como se usa en el presente documento significa cualquier molécula que tenga la capacidad para generar anticuerpos tanto directamente como indirectamente. Dentro de la definición de “antígeno” se incluye un ácido nucleico que codifica proteína.

Las “CDR” se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Hay tres CDR o regiones CDR de la cadena pesada y tres de la cadena ligera en la porción variable de una inmunoglobulina. Así, “CDR” como se usa en el presente documento se refiere a las tres CDR de la cadena pesada, o a las tres CDR de la cadena ligera, o tanto a todas las CDR de la cadena pesada como a todas las CDR de la cadena ligera, si es apropiado.

Las CDR proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo al antígeno o epítope. Las CDR de interés en la presente invención se derivan de secuencias de cadenas pesadas y ligeras variables de anticuerpos donantes e incluyen análogos de las CDR que se producen naturalmente, análogos que también comparten o retienen la misma especificidad de unión a antígeno y/o capacidad neutralizante que el anticuerpo donante del que se derivaron.

El término “homólogo” significa secuencias de proteína que tienen entre el 40% y el 100% de identidad de secuencias con una secuencia de referencia. Los homólogos de hTLR3 incluyen polipéptidos de otras especies que tienen entre el 40% y el 100% de identidad de secuencias con una secuencia de hTLR3 conocida. La identidad en porcentaje entre dos cadenas de péptidos puede determinarse por alineamiento por emparejamiento usando los parámetros por defecto del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA).

El término “en combinación con” como se usa en el presente documento significa que los agentes descritos pueden administrarse a un animal juntos en una mezcla, simultáneamente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.

El término “mimeticuerpo” como se usa en el presente documento significa una proteína que tiene la fórmula genérica (I):

(V1-Pep-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) (t) (I)

en la que V1 es una parte de un extremo N de una región variable de inmunoglobulina, Pep es un polipéptido que se une a TLR3 de la superficie celular, Lk es un polipéptido o enlace químico, V2 es una parte de un extremo C de una región variable de inmunoglobulina, Hg es una parte de una región bisagra de inmunoglobulina, CH2 es una cadena pesada de la región constante CH2 de la inmunoglobulina y CH3 es una cadena pesada de la región constante CH3 de la inmunoglobulina y t es independientemente un número entero de 1 a 10. Un mimeticuerpo puede imitar propiedades y funciones de diferentes tipos de moléculas de inmunoglobulina tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD e IgE dependientes de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada presente en la construcción. En algunas realizaciones de mimeticuerpos, V1 puede estar ausente. Un mimeticuerpo desvelado en el presente documento modula la actividad biológica de TLR mediante la unión a células que expresan TLR.

El término “anticuerpo monoclonal” (mAb) como se usa en el presente documento significa un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando normalmente dirigidos contra un único determinante antigénico. El adjetivo “monoclonal” indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo y no requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los mAb murinos pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma de Kohler y col., Nature 256:495-497 (1975). Los mAb quiméricos que contienen una región variable de la cadena ligera y de la cadena pesada derivada de un anticuerpo donante (normalmente murino) en asociación con regiones constantes de la cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor (normalmente otra especies de mamífero tal como ser humano) pueden prepararse mediante el procedimiento desvelado en la patente de EE.UU. nº 4.816.567. Los mAb humanizados que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina donante no humana (normalmente murina) y las restantes partes derivadas de inmunoglobulina de la molécula que se deriva de una o más inmunoglobulinas humanas, que tienen opcionalmente residuos de soporte de la región estructural alterados para preservar la afinidad de unión, pueden obtenerse por las técnicas desveladas en Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032 (1989) y Hodgson y col., Bio/Technology, 9:421 (1991).

Secuencias de la región estructural humana a modo de ejemplo útiles para humanización se desvelan en, por ejemplo,

www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www. ncbi.nih.gov/igblast;

www. atcc.org/phage/hdb.html;

www. mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php;

www. kabatdatabase.com/top.html;

ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www. sciquest.com;

www. abcam.com; www. antibodyresource.com/onlinecomp.html;

www. public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;

www. whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;

www. hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab;

www. path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html;

www. immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;

www. appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody;

www. m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www. biodesign.com;

www. cancerresearchuk.org; www. biotech.ufl.edu;

www. isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html;

www. recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www. mrc-cpe.cam.ac.uk;

www. ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www. bioinf.org.uk/abs;

antibody.bath.ac.uk; www. unizh.ch;

www. cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;

www. nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;

www. path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;

www. ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;

www. biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. jerini.de;

imgt.cines.fr; y Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1987).

Pueden prepararse mAb completamente humanos que carecen de cualquier secuencia no humana a partir de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana por técnicas citadas en, por ejemplo, Lonberg y col., Nature 368:856-859 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996) y Mendez y col., Nature Genetics 15:146-156 (1997). También pueden prepararse y optimizarse mAb humanos de bibliotecas de expresión en fago por técnicas citadas en, por ejemplo, Knappik y col., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000) y Krebs y col., J. Immunol. Meth. 254:67-84 (2001).

La presente divulgación se refiere a agentes de unión a receptores TLR3 que pueden modular la señalización mediada por receptores TLR3. Tales agentes de unión incluyen anticuerpos anti-TLR3 que tienen las propiedades de unirse a un receptor TLR3 y modular la señalización mediada por receptores TLR3.

Un aspecto de la divulgación es un anticuerpo reactivo con receptor tipo Toll 3 humano (hTLR3) u homólogos de hTLR3 que inducen producción celular de una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-8, MCP-1, MIP1-!, RANTES y TNF-!. Estos anticuerpos son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos. En particular, los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos que pueden estimular una respuesta inmunitaria contra antígenos extraños.

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo reactivo con hTLR3 u homólogos de TLR3 que modula una respuesta de citocinas inducida por otros ligandos de TLR. La modulación de una respuesta de citocina produce potenciación o modificación de la respuesta inmunitaria a otros ligandos de TLR que incluyen ODN de Cpg y R848. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden potenciar la producción de interferones tipo 1 tales como

interferón-! (IFN-!) cuando se usan en combinación con ligandos de TLR9 tales como oligodinucleótidos de CpG (ODN de CpG).

Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo reactivo con TLR3 u homólogos de hTLR3 que disminuye la producción de IL-10 producida por agonistas de TLR7. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento disminuyen significativamente la producción de la citocina antiinflamatoria IL-10 producida por el agonista de TLR7 R848, también conocido como resiquimod. Aunque no se desea quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que los anticuerpos desvelados en el presente documento potencian la respuesta inflamatoria a agonistas de TLR7.

En una realización, el anticuerpo desvelado en el presente documento es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 que tiene la capacidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal que tiene las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada como se exponen en SEC ID Nº: 9 (CDR H1), 11 (CDR H2) y 13 (CDR H3) y las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera como se muestran en SEC ID Nº: 19 (CDR L1), 21 (CDR L2) y 23 (CDR L3). Un anticuerpo a modo de ejemplo es un anticuerpo monoclonal que tiene secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena pesada como se muestran en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 y secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera como se muestran en SEC ID Nº: 19, 21 y 23.

Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 o un ácido nucleico complementario. También están dentro del alcance de la invención otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican las CDR de la región variable de la cadena pesada mostradas en SEC ID Nº: 9, 11 y 13.

Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 19, 21 y 23 o un ácido nucleico complementario. También están dentro del alcance de la invención otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican la región variable de las CDR de la cadena ligera mostrada en SEC ID Nº: 19, 21 y 23.

Otra realización de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16.

Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6 o su complemento. Un polinucleótido a modo de ejemplo que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC Nº: 6 tiene la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 5.

Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16 o su complemento. Un polinucleótido a modo de ejemplo que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC Nº: 16 tiene la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 15.

Anticuerpos a modo de ejemplo pueden ser anticuerpos de los isotipos IgG, IgD, IgGA o IgM. Adicionalmente, tales anticuerpos pueden modificarse postraduccionalmente mediante procedimientos tales como glucosilación, isomerización, aglucosilación o modificación covalente que no se produce naturalmente tal como la adición de restos de polietilenglicol (PEGilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden producirse in vivo o in vitro. Moléculas de anticuerpo completamente humanas, humanizadas y maduradas por afinidad o fragmentos de anticuerpos están dentro del alcance de la invención, ya que son mimeticuerpos, proteínas de fusión y proteínas quiméricas.

El anticuerpo de la invención puede unirse a hTLR3 con una Kd inferior a o igual a aproximadamente 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 ó10-12 M. La afinidad de una molécula dada por un receptor hTLR3 puede determinarse experimentalmente usando cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos pueden utilizar instrumentación Biacore o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos para aquellos expertos en la materia.

Las moléculas de anticuerpo que se unen a un homólogo de TLR3 dado con una afinidad deseada pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos por técnicas que incluyen maduración por afinidad de anticuerpos y otras técnicas reconocidas en la materia adecuadas para moléculas de no anticuerpo.

Otra realización de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores de plásmido, vectores virales, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo dado o población genética mediante cualquier medio.

Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11 y SEC

ID Nº: 13 y un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21 y SEC ID Nº:

23. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células arquéas. Células eucariotas a modo de ejemplo pueden ser de mamífero, insecto, aviares u otros orígenes animales. Las células eucariotas de mamífero incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas de células de mieloma tales como las líneas celulares murinas SP2/0 (Colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (Colección europea de cultivos celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, RU, ECACC nº 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea de células de mieloma humano a modo de ejemplo es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen aquellas derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) tales como CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.

Otra realización de la invención es un procedimiento de preparación de un anticuerpo de la invención que comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Un anticuerpo tal puede ser el anticuerpo para hTLR3 ejemplificado más adelante como el mAb C1130 que tiene secuencias de aminoácidos pesadas y ligeras como se muestra en SEC ID Nº: 6 y 16, respectivamente

La capacidad de los anticuerpos desvelados en el presente documento para potenciar la producción de IFN-! mediada por CpG proporciona diversas terapias de tipo combinación. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con antígenos extraños tales como moléculas agonistas de TLR o antígenos de vacuna modulará una respuesta inmunitaria y serán útiles en el tratamiento de infecciones. Así, otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con otros inmunoestimulantes tales como interferón o agonistas de TLR9 que incluyen, pero no se limitan a, ODN de CpG para estimular y mantener una respuesta inmunitaria como se mide por la producción potenciada de IFN tipo I (por ejemplo, IFN!) para prevenir o tratar infecciones virales que incluyen virus de la hepatitis, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana y virus del papiloma humano, y otras infecciones cutáneas y asociadas a la mucosa. Por tanto, se desvela el de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con otros inmunoestimulantes tales como interferón o agonistas de TLR9 que incluyen, pero no se limitan a, ODN de CpG para tratar cánceres que incluyen mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, melanoma maligno y sarcomas (incluyendo sarcoma de Kaposi). Además, la divulgación también proporciona el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con otros inmunoestimulantes tales como interferón o agonistas de TLR9 que incluyen, pero no se limitan a, ODN de CpG para tratar enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa).

Otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con un agonista de TLR7 tal como R848 (resiquimod) o imiquimod para proporcionar una terapia de combinación para prevenir o tratar síntomas asociados a infección viral tales como condilomas acuminados. El agonista de TLR7 sintético imiquimod ha sido aprobado por las autoridades reguladoras para el tratamiento de condilomas acuminados. Otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con agonistas de TLR9 o de TLR7 para prevenir o tratar enfermedades pulmonares que incluyen neumonías bacterianas, fúngicas y virales, y exacerbación mediada por patógenos de enfermedades pulmonares tales como asma, bronquitis y enfermedades pulmonares obstructivas crónicas. Todavía otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con agonistas de TLR9

o de TLR7 para prevenir o tratar enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD). Todavía otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo desvelado en el presente documento en combinación con tratamientos inmunes tales como interferón, para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias, que incluyen esclerosis múltiple y lupus.

Los procedimientos desvelados en el presente documento pueden usarse para tratar un animal que pertenece a cualquier género. Ejemplos de tales animales incluyen seres humanos, ratones, aves, reptiles y peces.

Cantidades de un anticuerpo para TLR3 dado suficientes para tratar una afección dada pueden determinarse fácilmente. En el procedimiento desvelado en el presente documento, el anticuerpo para TLR3 puede administrarse individualmente o en combinación con al menos otra molécula de agonista de TLR o antígeno de vacuna.

El modo de administración para uso terapéutico de los anticuerpos de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped. Las proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y mimeticuerpos, y composiciones farmacéuticas de estos agentes, son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, intradérmicamente, intravenosamente o intranasalmente.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo como principio activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere una suspensión o disolución acuosa que contiene el anticuerpo, preferentemente tamponada a pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una disolución del anticuerpo desvelado en el presente documento o una mezcla de los mismos disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Puede emplearse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, 0,4% de solución salina, 0,3% de glicina y similares. Estas disoluciones son estériles y generalmente están libres de materia particulada. Estas disoluciones pueden esterilizarse por

técnicas de esterilización convencionales muy conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, etc. La concentración del anticuerpo desvelado en el presente documento en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, normalmente a o al menos aproximadamente el 1%, a como mucho al 15 o 20% en peso, y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado.

Así, una composición farmacéutica desvelada en el presente documento para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg, o más preferentemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo de la invención. Similarmente, una composición farmacéutica desvelada en el presente documento para infusión intravenosa podría prepararse para contener aproximadamente 250 ml de disolución de Ringer estéril, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y preferentemente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo como se desvela en el presente documento. Procedimientos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables son muy conocidos y se describen en más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento, cuando están en una preparación farmacéutica, pueden estar presentes en formas de dosis unitaria. La dosis terapéuticamente eficaz apropiada puede determinarse fácilmente por aquellos expertos en la materia. Una dosis determinada puede repetirse, si fuera necesario, a intervalos de tiempo apropiados seleccionados según convenga por un médico durante el periodo de tratamiento.

Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de uso. Esta técnica se ha mostrado que es eficaz con inmunoglobulinas convencionales y preparaciones de proteína, y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes específicos.

Ejemplo 1

Generación de mAb anti-TLR3

El mAb anti-TLR3 se generó usando tecnología de hibridomas convencional en ratones Balb/c normales (Kohler y col., J Immunol 6:511-519, 1976). Todos los procedimientos en animales se realizaron según las pautas establecidas por el Comité institucional para el cuidado y uso de animales. Los ratones se inyectaron intradérmicamente dos veces con ADN de plásmido que codifica los aminoácidos 1-703 de TLR3 humano (SEC ID Nº: 3). Los aminoácidos 1-703 se corresponden con el dominio extracelular predicho de TLR3 (SEC ID Nº: 4). Los ratones recibieron las inyecciones de ADN de plásmido de 10 pg/ratón separadas dos semanas. Los ratones se reforzaron por inyección intradérmica con el dominio extracelular de la proteína TLR3 humana recombinante purificada. La primera y segunda inmunizaciones con proteína, con 15 μg de proteína, se produjeron dos y cuatro semanas después de la segunda inyección de ADN de plásmido. El tercer refuerzo (10 μg de proteína) se produjo cinco meses después. Tres días antes de la recogida de los bazos, los ratones se inyectaron intravenosamente con la proteína TLR3 (15 μg/ratón). Se realizaron fusiones de linfocitos B usando procedimientos convencionales (Kohler y col., arriba). Se seleccionaron hibridomas usando medio que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina. Los pocillos se cribaron por ELISA para detectar anticuerpos anti-TLR3. Los pocillos positivos se expandieron y se clonaron usando dilución limitante. Se preparó un gran lote de anticuerpo y se purificó usando una columna de proteína G. Se confirmó que los niveles de endotoxina eran <1 UE/mg. De este modo se generó el mAb C1130. La secuencia de anticuerpos se muestra en las Fig. 1 y 2.

Ejemplo 2

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana

Se aislaron CMSP de sangre humana. La sangre completa se recogió de un donante humano en jeringuillas recubiertas con heparina. Se añadieron aproximadamente 50 ml de disolución salina estéril equilibrada con Hank (HBSS) (Invitrogen) cada 100 ml de sangre. Se añadieron treinta y ocho ml de sangre:HBSS a un tubo cónico de 50 ml y debajo se estratificaron lentamente 11 ml de disolución Ficoll-Paque Plus (Amersham). Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 40 minutos a temperatura ambiente. El freno centrífugo se apagó para preservar el gradiente. Las CMSP forman una capa blanca justamente encima de Ficoll. Las CMSP de un cónico se aspiraron con una pipeta en un cónico nuevo de 50 ml. El tubo se llenó con HBSS para lavar el resto de Ficoll. Las células se centrifugaron a 600 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se vertió y el sedimento se resuspendió en 10 ml de disolución de lisis de glóbulos rojos (Sigma) en un único tubo. El tubo se incubó a temperatura ambiente durante diez minutos. El tubo se enrasó a 50 ml con HBSS y las células se sedimentaron por centrifugación a 600 x g. Las células se lavaron dos veces más con HBSS. Después del lavado final, el sedimento se resuspendió en medio completo:

medio RPMI 1640/ 10% de SBF/ 1X aminoácidos no esenciales/ 1X piruvato de sodio/ 10 ug/ml de gentamicina. La gentamicina se compró de Sigma; los otros componentes del medio se compraron de Invitrogen. Se extrajo una alícuota de las células y se mezcló con 50 μl de azul de tripano para obtener una cifra de células vivas. Las células se sembraron en placas de 48 pocillos a una concentración de 3 x 106 células/pocillo (0,5 ml/pocillo).

Ejemplo 3

Determinación de los efectos de anticuerpos anti-hTLR3 sobre la producción de citocinas/quimiocinas

Se añadieron anticuerpos purificados a CMSP a una concentración final de 20 μg/ml. Las células y los anticuerpos se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos a una hora antes de la adición de 1 μg/ml de CpG2216 (sintetizado por Invitrogen) o 1 μg/ml de R848 (Invivogen). CpG2216 tiene la secuencia 5'-ggG GGA CGA TCG TCg ggg gg-3'. Las bases en letras mayúsculas están ligadas por enlaces fosfodiéster y aquellas en minúscula están ligadas por enlaces fosforotioato. R848, también conocido como resiquimod, es una imidazoquinolinamina, y está en la misma clase de compuestos que imiquimod. Los sobrenadantes se recogieron después de 24 h y se congelaron a -20 ºC.

Las concentraciones de citocinas y quimiocinas en los sobrenadantes se midieron usando tecnología Luminex. Se usó un kit Luminex de Biosource para medir las siguientes citocinas/quimiocinas: IL-β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF!, IFN!, IFN∃, RANTES, MCP-1, MIP-1! y IP-10. En algunos casos, los niveles de IFN! se midieron usando un kit de ELISA (PBL Biomedical Labs). Se realizó análisis estadístico usando análisis de varianza bifactorial con comparaciones por emparejamiento de seguimiento.

Los resultados se muestran en la Fig. 3 e indican que la incubación de CMSP con C1130 produjo la producción de IL-8, MCP-1, MIP-1 !, RANTES y TNF-! por células humanas (n=3 experimentos). Estos efectos no se observaron en CMSP incubadas con otro anticuerpo anti-IgG1 murina de TLR3, C1068, que se generó de un modo similar a C1130. Los lotes de anticuerpo purificado se probaron para endotoxina y los niveles fueron inferiores a 1 UE/mg.

Ejemplo 4

Determinación de los efectos de anticuerpos anti-hTLR3 sobre la producción de IFN

Como se sabe que algunos TLR dimerizan y/o usan diferentes proteínas adaptoras para alterar la especificidad de unión a ligando, CMSP que se pretrataron con el anticuerpo anti-hTLR3 C1130 se estimularon con ligandos para otros TLR, en particular CpG2216 como se describe en el Ejemplo 3 para examinar el efecto de modulación de TLR3 en respuesta a otros ligandos de TLR. Como los ligandos para TLR3 y TLR9 son ácidos nucleicos, y ambos activan la secreción de interferón, se supuso que podrían compartir una ruta de señalización. Los resultados de los tres experimentos se muestran en la Fig. 4 e indican que CMSP incubadas con C1130 y CpG2216 secretaron más IFN! que las células estimuladas con CpG solo. El aumento promedio fue 7 veces.

Ejemplo 5

Determinación de los efectos de anticuerpos anti-hTLR3 sobre la producción de IL10

Los ligandos para TLR7 y TLR8 también son ácidos nucleicos. R848 (resiquimod) es un ligando sintético para TLR7 y TLR8 en seres humanos, que se ha mostrado que reconoce ARN monocatenario rico en guanosina y uridina (Heil y col., Science 5663: 1526, 2004) y se usó para estimular CMSP humanas. La activación de TLR7, como TLR3, provoca la secreción de interferones tipo I. Los resultados en la Fig. 5 indican que C1130 no afectó los niveles de IFN! secretado por CMSP en respuesta a R848. Aunque las CMSP normalmente secretan niveles muy altos de IFN! en respuesta a R848, en dos de los tres experimentos la estimulación con R848 indujo la producción de %500 pg/ml de IFN! (un nivel suficientemente bajo para ver supuestamente cualquier efecto por un mAb agonista o antagonista). C1130 afectó los niveles de IL-10 inducidos por R848. En tres experimentos, C1130 disminuyó la IL-10 producida por R848 un promedio de 5 veces.

Ejemplo 6

Reconocimiento de TLR3 de la superficie celular epitelial por el anticuerpo C1130

Se realizaron análisis de citometría de flujo en un instrumento de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). El anticuerpo C1130 se conjugó con APC usando un kit de marcado de IgG1 de ratón Zenon según el protocolo del fabricante. Se incubaron cinco microlitros de reactivo de marcado por 1 μg de mAb durante 5 minutos a temperatura ambiente y se protegieron de la luz. Se añadió reactivo de bloqueo a una relación de 5 μl a 1 μg de mAb según el protocolo del fabricante. Los anticuerpo marcados con Zenon se usaron en el plazo de 30 minutos desde la conjugación. HEK293 (células epiteliales de riñón embrionario humano) que se transfectaron establemente con TLR3 humano se compraron de Invivogen.

293-TLR3 se fijaron por incubación de 15 minutos en Cytofix tanto antes de como tras la posterior tinción. Aproximadamente 1 x 106 células en 50 μl se incubaron con anticuerpo marcado con APC en placa de fondo redondo de 96 pocillos durante 30-60 minutos sobre hielo. Las células se lavaron 3 veces en PBS + 1% de SBF por centrifugación a 1600 rpm durante 2 minutos. La adquisición de datos se realizó en un instrumento Becton-Dickinson FACSCalibur y el análisis de datos se realizó usando WinList (Verity Software House, Topsham, ME).

Los resultados en la Fig. 6 muestran que el anticuerpo C1130 se une a TLR3 de superficie sobre células 293-hTLR3 fijadas tanto antes como después de la tinción. Se usó un anti-hTLR3 marcado con PE comercialmente disponible (clon 3.7) como control positivo e IgG1 de ratón marcada con APC Zenon como control negativo. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-hTLR3 C1130 reconoce células epiteliales.

Ejemplo 7

Reconocimiento de TLR3 de la superficie celular epitelial de pulmón por el anticuerpo C1130

Se obtuvieron células A549, una línea celular epitelial de pulmón humano, de la Colección americana de cultivos tipo (nº de acceso de ATCC CCL-185). Las células se transfectaron con un vector de expresión de mamífero que codificaba un marcador de selección de neomicina junto con una copia de longitud completa del gen TLR3 humano bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Inc). También se transfectaron células A549 en paralelo con el ADN de plásmido de vector solo (que codifica resistencia a neomicina) como control. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se tripsinaron entonces y se sembraron a dilución de 1:20 en medio que contenía neomicina (G418) a 0,5 mg/ml. Los clones de las células aparecieron después de 2 semanas de crecimiento en medio de selección que contenía G418. Las colonias de células de cada transfección se reunieron por separado. Líneas celulares A549 derivadas de la transfección y selección con el vector de expresión de TLR3 humano de longitud completa (A549-hTLR3) o control de vector (A549-neo) se mantuvieron en medio de crecimiento que contenía 0,5 mg/ml de G418.

El anticuerpo C1130 se conjugó con APC como se describe en el Ejemplo 7. Las células A549-TLR3.2 se fijaron por incubación de 15 minutos en Cytofix tanto antes de como tras la posterior tinción. Aproximadamente 1 x 106 células en 50 μl se incubaron con anticuerpo marcado con APC en placa de fondo redondo de 96 pocillos durante 30-60 minutos sobre hielo. Las células se lavaron 3 veces en PBS + 1% de SBF por centrifugación a 1600 rpm durante 2 minutos. La adquisición de datos y el análisis se realizaron como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados en la Fig. 7 muestran que C1130 se une a TLR3 de superficie sobre células A549-TLR3.2 fijadas tanto antes como después de la tinción. Se usó un anti-hTLR3 marcado con PE comercialmente disponible (clon 3.7) como control positivo e IgG1 de ratón marcada con APC Zenon como control negativo. La capacidad de C1130 para reconocer células epiteliales de pulmón indica que tiene posible uso terapéutico en infecciones pulmonares.

Ejemplo 8

Reconocimiento de glóbulos blancos de cinomolgo por el anticuerpo C1130

Sangre completa de macacos cinomolgos se diluyó 1:10 en tampón de lisis de FACS y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos. Entonces, las células se lavaron en PBS + 1% de SBF 4 veces por centrifugación a 1400 rpm durante 8 minutos. El sedimento de células resultante se resuspendió en PBS + 1% de SBF y se contó manualmente usando un hemacitómetro. La viabilidad celular se determinó tiñendo una población de células de muestra con 0,2% de azul de tripano. Todas las muestras probadas tuvieron al menos el 95% de viabilidad.

El sedimento de células total se resuspendió en 1-2 ml de PBS complementado con 10% de SBF y se mantuvo a tanto 4 ºC como 37 ºC para evaluar diferencias en la internalización de receptores. Se distribuyeron cincuenta microlitros (aproximadamente 2 x 106 células) a cada pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron mAb marcados con FITC, PE y APC a 1 μg por pocillo, se incubaron durante al menos 30 minutos a tanto 4 ºC como a 37 ºC y se protegieron de la luz. Entonces, las células se lavaron 3 veces en PBS + 1% de SBF por centrifugación a 1600 rpm durante 2 minutos. Después del lavado final, las células se resuspendieron en tampón Cytofix y se incubaron durante 15 minutos a tanto 4 ºC como a 37 ºC. Tras la fijación con paraformaldehído en el tampón Cytofix, las células se lavaron una vez por centrifugación a 1600 rpm durante 2 minutos y se resuspendieron en 200 μl de PBS + 1% de SBF. Las muestras o bien se leyeron inmediatamente o bien se guardaron durante la noche a 4 ºC antes de la adquisición. La adquisición de datos y el análisis se realizaron como se describe en el Ejemplo 7.

Los resultados mostrados en la Fig. 8 indican que C1130 se une a células positivas CD11b (cino), células positivas para CD83, células positivas para CD86 y células positivas para CD3 de macaco cinomolgo. CD83 se encuentra sobre linfocitos B y células dendríticas y CD3 se encuentra solo sobre linfocitos T, que indica que C1130 reconoce diferentes poblaciones de células en CMSP.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CENTOCOR, INC. 5 <120> MODULADORES DE RECEPTOR TIPO TOLL 3, PROCEDIMIENTOS Y USOS

<130> CEN5116 PCT

<140> PARA SER ASIGNADO 10 <141> 2006-10-27

<150> 60/730,793

<151> 2005-10-27 15 <160> 24

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 20 <211> 2712

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 25

55 <210> 2

<211> 904 55 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 4

<211> 703

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 399 15 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6 30 <211> 133

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212>: PRT 60 <213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212>: PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212>: PRT 25 <213> Mus musculus

65 20

<400> 9

<210> 10

<211> 14 35 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

45 <210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

50 <400> 11

<210> 12

<211> 32 60 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

65 <210> 13

<211> 5

<212>: PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212>: PRT 20 <213> Mus musculus

<400> 14

<210> 15

<211> 387 30 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16 50

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17 25

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

45 <210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

50 <400> 19

55

60: <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 20

65

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 21

15

<210> 22

<211> 32

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<400> 22

<210> 23 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23 35

<210> 24 40 <211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24 45

Claims

REIVINDICACIONES

5 10 15 20 25 30

1. Un anticuerpo aislado reactivo con hTLR3: que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada como se muestran en SEC ID Nº: 9, 11 y 13 y las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena ligera como se muestran en SEC ID Nº: 19, 21 y 23; o que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16. 2. Una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 1. 3. Un polinucleótido aislado que codifica: una cadena pesada del anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 9, 11 y 13; una cadena ligera del anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEC ID Nº: 19, 21 y 23; una cadena pesada del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6. o una cadena ligera del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16. 4. El polinucleótido de la reivindicación 3 que comprende la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 5. 5. El polinucleótido de la reivindicación 3 que comprende la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 15. 6. Un vector que comprende al menos un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 5. 7. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 5. 8. Un procedimiento de preparación de un anticuerpo reactivo con hTLR3 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 7 y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.

35

40

45

50

55