CN105601742A - Toll样受体3拮抗剂 - Google Patents

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R.T.萨里斯基
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R.劳亨伯格
M.鲁茨
Y.冯
K.赫林加
J.罗
F.滕
A.特普利亚科夫
S.吴
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Abstract

本发明公开了Toll样受体3(TLR3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备和使用上述抗体拮抗剂和多核苷酸的方法。

Description

Toll样受体3拮抗剂
申请为分案申请，原申请的申请日为2009年10月30日，申请号为200980153815.0(PCT/US2009/062813)，发明名称为“Toll样受体3拮抗剂”。
本专利申请要求2008年10月31日提交的美国临时专利申请号61/109974、2009年3月20日提交的美国专利临时申请号61/161860、2009年3月31日提交的美国专利临时申请号61/165100和2009年4月29日提交的美国临时专利申请号61/173686的优先权，将这些专利申请的全文内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及Toll样受体3(TLR3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备和使用所述抗体拮抗剂和多核苷酸的方法。
背景技术
Toll样受体(TLR)可调控天然免疫反应的激活并通过引发响应细菌、病毒、寄生和(在一些情况下)宿主衍生的配体的信号转导级联反应来影响获得性免疫的发展(Lancaster等人，J.Physiol.563：945-955，2005)。位于质膜的TLR(TLR1、TLR2、TLR4和TLR6)可识别包括细菌和真菌的蛋白质或类脂组分在内的配体。主要的情况是胞内的TLR(TLR3、TLR7和TLR9)分别响应dsRNA、ssRNA和未甲基化的CpGDNA。据信，TLR信号转导的失调会引起多种问题，并且治疗策略正在向着这个方向发展(Hoffman等人，Nat.Rev.DrugDiscov.4：879-880，2005；Rezaei，Int.Immunopharmacol.6：863-869，2006；Wickelgren，Science312：184-187，2006)。例如，TLR4、TLR7和TLR9的拮抗剂分别在临床开发上用于严重的败血病和狼疮。(Kanzler等人，Nat.Med.13：552-559，2007)。
TLR3信号转导在发炎或病毒感染期间由坏死细胞释放的dsRNA、mRNA或RNA激活。TLR3激活诱导干扰素和促炎性细胞因子的分泌，并在某些微生物感染期间触发具有保护作用的免疫细胞活化和细胞募集。例如，在儿童中显性负TLR3等位基因与用HSV-1初次感染时对单纯疱疹性脑炎的敏感性增加有关(Zheng等人，Science317：1522-15272007)。在小鼠中，TLR3缺乏与柯萨奇病毒攻击时存活率降低有关(Richer等人，PLoSOne4：e4127，2009)。然而，据显示不受控制或失调的TLR3信号转导在包括西尼罗河病毒、静脉病毒、牛痘和甲型流感在内的某些病毒感染模型中引起发病和死亡(Wang等人，Nat.Med.10：1366-1373，2004；Gowen等人，J.Immunol.177：6301-6307，2006；Hutchens等人，J.Immunol.180：483-491，2008；LeGoffic等人，PloSPathog.2：E53，2006)。
TLR3还表现出可在一系列炎性、免疫介导和自身免疫疾病中驱动致病机制，包括例如脓毒性休克(Cavassani等人，J.Exp.Med.205：2609-2621，2008)、急性肺损伤(Murray等人，Am.J.Respir.Crit.CareMed.178：1227-1237，2008)、类风湿性关节炎(Kim等人，Immunol.Lett.124：9-17，2009；Brentano等人，Arth.Rheum.52：2656-2665，2005)、哮喘(Sugiura等人，Am.J.Resp.CellMol.Biol.40：654-662，2009；Morishima等人，Int.Arch.AllergyImmunol.145：163-174，2008；Stowell等人，Respir.Res.10：43，2009)、炎性肠疾病例如克隆氏病和溃疡性结肠炎(Zhou等人，J.Immunol.178：4548-4556，2007；Zhou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)104：7512-7515，2007)、自体免疫性肝脏疾病(Lang等人，J.Clin.Invest.116：2456-2463，2006)和I型糖尿病(Dogusan等人，Diabetes57：1236-1245，2008；Lien和Zipris，Curr.Mol.Med.9：52-68，2009)。此外，据显示TLR3表达的器官特异性增加与由失调局部炎性反应驱动的多种病理状态相关，例如肝脏组织的原发性胆汁性肝硬化(Takii等人LabInvest.85：908-920，2005)、类风湿性关节炎(Ospelt等人，ArthritisRheum.58：3684-3692，2008)和鼻粘膜的过敏性鼻炎患者(Fransson等人，Respir.Res.6：100，2005)。
在坏死状态下，包括内源mRNA在内的胞内内含物的释放触发诱导局部炎症、有利于死亡细胞残留部分清除并修复损伤的细胞因子、趋化因子和其他因子的分泌。坏死常常一直存在于炎性过程中，引起慢性或严重炎症(Bergsbaken等人，NatureReviews7：99-109，2009)。TLR3在坏死部位活化会引起这些异常的炎性过程并通过释放的TLR3配体产生另一促炎性正反馈环路。从而，TLR3拮抗作用在涉及慢性或严重炎症和/或坏死的各种疾病中可能是有益的。
TLR3活化的下调还可能代表一种包括肾细胞癌和头颈鳞状细胞癌在内的肿瘤学症候的新型治疗策略(Morikawa等人，Clin.CancerRes.13：5703-5709，2007；Pries等人，Int.J.Mol.Med.21：209-215，2008)。此外，编码具有活性降低的蛋白质的TLR3L423F等位基因与对晚期“干性”老年黄斑退化的保护有关(Yang等人，N.Engl.J.Med.359：1456-1463，2008)，这表明TLR3拮抗剂在这种疾病中可能是有益的。
与炎性疾病及其他病症有关的病变，例如与感染有关的那些病变，具有显著的健康和经济影响。然而，尽管在医学的许多领域有进步，但可用于这些病症中的一些病症的治疗选择和治疗方法相对很少。
从而，需要抑制TLR3活性来治疗TLR3相关病症。
附图说明
图1示出了抗人TLR3(huTLR3)mAb在NF-κB报告基因分析中的作用。
图2A和图2B示出了抗huTLR3mAb在BEAS-2B分析中的作用(％抑制)。
图3A和图3B示出了抗huTLR3mAb在NHBE分析中的作用。
图4示出了抗huTLR3mAb在PBMC分析中的作用。
图5A和图5B示出了抗huTLR3mAb在HASM分析中的作用。
图6A、图6B和6C示出抗huTLR3mAb与TLR3突变体的结合。
图7A示出了叠合在人TLR3ECD的结构上的mAb15EVQ(黑色)和C1068mAb(灰色)(上图)的表位和mAb12QVQ/QSV(黑色，下图)的表位。图7B示出了与mAb15EVQ复合的TLR3ECD蛋白的定位H/D交换扰动图。
图8A和图8B示出了大鼠/小鼠抗小鼠TLR3mAbmAb5429(替代品)在A)NF-κB和B)ISRE报告基因分析中的作用。
图9示出了替代品mAb(mAb5429、mAbc1811)在MEFCXCL10/IP-10分析中的作用。
图10示出了替代品mAb与TLR3结合的特异性。上面的分图：同种型对照物；底部的分图：mAbc1811。
图11示出了在AHR模型中替代品mAb对penH水平的作用。
图12示出了在AHR模型中替代品mAb对BAL流体中的总嗜中性粒细胞数量的作用。
图13示出了在AHR模型中替代品mAb对BAL流体中的CXCL10/IP-10水平的作用。
图14示出了在DSS模型中替代品mAb对组织病理学评分的作用。
图15示出了在T细胞转移模型中替代品mAb对A)组织病理学评分和B)嗜中性粒细胞流入的作用。
图16示出了在CIA模型中替代品mAb对临床评分的作用。
图17示出了在CIA模型中替代品mAb对临床AUC评分的作用。
图18示出了在鼻内施予甲型流感/PR/8/34后替代品mAb对C57BL/6小鼠存活率的作用。
图19示出了在施予甲型流感/PR/8/34后替代品mAb对临床评分的作用。
图20示出了在施予甲型流感/PR/8/34后替代品mAb在14天内对体重的作用。
图21示出了在葡萄糖攻击之后替代品mAb对(A)WTDIO和(B)TLR3KODIO动物中血糖水平的作用。
图22示出了替代品mAb对WTDIO动物中胰岛素水平的作用。
图23示出了mAb15EVQ对NHBE细胞中(A)NTHi和(B)鼻病毒诱导CXCL10/IP-10和CCL5/RANTES水平的作用。
图24示出了mAb15EVQ对HUVEC细胞中(A)sICAM-1水平和(B)生存力的作用。
发明内容
本发明的一个方面是一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体结合至少一个TLR3氨基酸残基，所述残基选自SEQIDNO：2的残基K467、R488或R489。
本发明的另一个方面是一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体结合至少一个TLR3氨基酸残基，所述残基选自SEQIDNO：2的残基D116或K145。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其中抗体具有以下性质的至少一种：
a.以＜1μg/ml在体外聚(I：C)NF-κB报告基因分析中减少人TLR3生物活性＞50％；
b.以＜10μg/ml抑制＞60％由用＜100ng/ml聚(I：C)刺激的BEAS-2B细胞产生的IL-6或CXCL10/IP-10；
c.以＜0.4μg/ml抑制＞50％由用＜100ng/ml聚(I：C)刺激的BEAS-2B细胞产生的IL-6或CXCL10/IP-10；
d.以＜5μg/ml抑制＞50％由用62.5ng/ml聚(I：C)刺激的NHBE细胞产生的IL-6；
e.以＜1μg/ml抑制＞50％由用62.5ng/ml聚(I：C)刺激的NHBE细胞产生的IL-6；
f.以＜1μg/ml抑制＞20％由PBMC细胞产生的聚(I：C)诱导IFN-γ、IL-6或IL-12；
g.以IC50＜10μg/ml在体外NF-kB报告基因分析中抑制短尾猴TLR3生物活性；或
h.以IC50＜5μg/ml在体外ISRE报告基因分析中抑制短尾猴TLR3生物活性。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其与单克隆抗体竞争TLR3结合，其中所述单克隆抗体包含某些重链互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列、某些轻链CDR1、2和3的氨基酸序列、某些重链可变区(VH)的氨基酸序列或某些轻链可变区(VL)的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含重链互补决定区(CDR)1、2和3，以及某些轻链CDR1、2和3的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含某些重链可变区(VH)的氨基酸序列和某些轻链可变区(VL)的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含某些重链的氨基酸序列和某些轻链的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种分离的抗体重链，其包含SEQIDNO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种分离的抗体轻链，其包含SEQIDNO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210或211所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种分离的抗体重链，其包含SEQIDNO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种分离的抗体轻链，其包含SEQIDNO：155、156、157、158、203、205、207、165或167所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种编码抗体重链的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种编码抗体轻链的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210或211所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种编码抗体重链的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种编码抗体轻链的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：155、156、157、158、203、205、207、165或167所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体和药用载体。
本发明的另一方面是一种载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。
本发明的另一方面是一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
本发明的另一方面是一种制备可与TLR3反应的抗体的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并回收由宿主细胞产生的抗体。
本发明的另一方面是一种治疗或预防炎性疾病的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗或预防炎性疾病的时间。
本发明的另一方面是一种治疗或预防全身炎性疾病的方法，其包括在将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗或预防全身炎性疾病的时间。
本发明的另一方面是一种治疗II型糖尿病的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗II型糖尿病的时间。
本发明的另一方面是一种治疗高血糖症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗高血糖症的时间。
本发明的另一方面是一种治疗高胰岛素血症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗胰岛素抵抗的时间。
本发明的另一方面是一种治疗或预防病毒感染的方法，其包括将治疗有效量的本发明的分离的抗体施用给对其有需要的患者持续足以治疗或预防病毒感染的时间。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整呈现。
如本文所用的术语“拮抗剂”意指一种分子，其通过任何机制部分地或完全抑制另一分子例如受体或胞内介质的作用。
如本文所用，“TRL3抗体拮抗剂”或“可与TLR3反应的”抗体描述了一种抗体，其能够直接或间接显著对抗、减少或抑制TLR3生物活性或TLR3受体活化。例如，可与TLR3反应的抗体可直接结合至TLR3并中和TLR3活性，即，阻断TLR3信号转导以减少细胞因子和趋化因子释放或NF-κB活化。
如本文所用的术语“抗体”以广义上表示并包括免疫球蛋白或抗体分子(包括多克隆抗体)、单克隆抗体(包括鼠类、人、人适应的(human-adapted)、人化和嵌合单克隆抗体和抗体片段)。
通常，抗体是显示出对特定抗原结合特异性的蛋白质或肽链。完整抗体是由两条相同轻链和两条相同重链构成的异四聚化糖蛋白。通常，各轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而对于不同免疫球蛋白同种型的重链，二硫键的数量有所不同。各重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥键。各重链在一端具有一个可变域(VH)，后面有多个恒定域。各轻链在一端具有可变域(VL)在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链可变域与重链的可变域对齐。任何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定域的氨基酸序列被归为两种明显不同类型之一，即κ和λ。
免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被归为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步再被分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“抗体片段”意指完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双体、单链抗体分子和由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由夹杂有三个“抗原结合位点”的“框架”区构成。使用以下各种术语来定义抗原结合位点：(i)术语互补决定区(CDR)是基于序列变异性的(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132：211-250，1970)。通常，抗原结合位点具有六个CDR，三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1991)。(ii)术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指在结构上高变的抗体可变域的区域，如由Chothia和Lesk定义的(Chothia和Lesk，Mol.Biol.196：901-917，1987)。通常，抗原结合位点具有六个高变区，三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。Chothia和Lesk将结构保守的HV称为“正则结构”。(iii)由Lefranc提出的“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003)是基于T细胞受体与免疫球蛋白的V域的比较。免疫遗传学(IMGT)数据库(http：//www_imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应性在Lefranc等人的Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003中有所描述。(iv)还可根据Almagro(Almagro，Mol.Recognit.17：132-143，2004)，基于“特异性决定残基的使用(SpecificityDeterminingResidueUsage，SDRU)”来描述抗原结合位点，其中特异性决定残基(SDR)是指直接与抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。由Almargo定义的SDRU是对不同类型抗原的SDR的数量和分布的精确测量，其通过对抗原抗体复合物的晶体结构的分析来定义。
如本文所用的术语“复合物序列”意指一种抗原结合位点，其被定义成包括Kabat、Chothia或IMGT单独描述的所有氨基酸残基，或任何其他合适的抗原结合区域描述。
“框架”或“框架序列”是除了被定义为抗原结合位点的那些之外的可变区的剩余序列。因为抗原结合位可以由上面所述的各种术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
如本文所用的术语“抗原”意指具有直接或间接产生抗体能力的任何分子。蛋白质编码核酸包括在“抗原”的定义内。
术语“同系物”意指与参考序列具有40％和100％之间序列同一性的蛋白序列。人TLR3的同系物包括来自与已知人TLR3序列具有40％和100％之间序列同一性的其他物种的多肽。两条肽链之间的同一性百分比可以使用VectorNTIv.9.0.0(Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置通过配对比对来确定。“TLR3”意指人TLR3(huTLR3)及其同系物。全长huTLR3的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQIDNo：1和2示出。huTLR3胞外结构域(ECD)的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQIDNo：3和4示出。
如本文所用的术语“基本相同”意指相比较的两个抗体或抗体片段氨基酸序列是相同的或具有“非实质差异”。非实质差异是抗体或抗体片段氨基酸序列中1、2、3、4、5或6个氨基酸的替代。与本文所公开的序列基本相同的氨基酸序列也是本申请的一部分。在一些实施例中，序列同一性可以是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。同一性百分比可以如上所述来确定。相比较的示例性肽链是重链或轻链可变区。
如本文所用的术语“与...联合”意指所述试剂可以同时作为单一试剂或以任何顺序连续作为单一试剂在混合物中一起施予动物。
如本文所用的术语“炎性疾病”意指部分由细胞因子、趋化因子或炎性细胞(如，嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的活性介导的对细胞损伤的局部反应，在大多数情况下表征为疼痛、发红、肿胀和组织功能丧失。如本文所用的术语“炎性肺部疾病”意指影响肺部或与其有关的炎性疾病。
本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上同源的抗体的群体所获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体具有高度特异性，其通常针对单一抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的基本上同源的性质，并不要求用任何特定方法产生抗体。例如，鼠类mAb可以由Kohler等人的杂交瘤方法(Nature256：495-497，1975)来产生。可用美国专利No.4,816,567中所公开的方法制备这样的嵌合单克隆抗体，其包含衍生自供体抗体(通常为鼠类动物)的轻链和重链可变区和与之相结合的衍生自受体抗体(通常为另一种哺乳类物种，如人类)的轻链和重链恒定区。可以通过本领域技术人员已知的技术(例如美国专利No.5,225,539所公开的技术)来制备具有衍生自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠类)的CDR和衍生自一种或多种人免疫球蛋白的分子的剩余免疫球蛋白衍生部分的人适应mAb。可用于人适应的人框架序列可以由本领域技术人员从相关数据库选择。可选地，可通过诸如Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：10029-10032，1989)和Hodgson等人(Bio/Technology，9：421，1991)所公开的技术，通过结合改变的框架支持残基来进一步修饰人适应mAb以保持亲合力。
缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体可通过(例如)以下文献中提及的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备：，Lonberg等人，Nature368：856-859，1994；Fishwild等人，NatureBiotechnology14：845-851，1996；和Mendez等人，NatureGenetics15：146-156，1997。人单克隆抗体也可以通过(例如)以下文献中提及的技术从噬菌体展示文库制备和优化：，Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86，2000和Krebs等人，J.Immunol.Meth.254：67-842001。
如本文所用的术语“表位”意指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由诸如氨基酸或多糖侧链部分的化学活性(例如，极性、非极性或疏水性)表面分组构成，并可具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表位可以是天然线性，或者可以是不连续表位，如，构象表位，其通过抗原的非邻接氨基酸之间的空间关系而非氨基酸的线性排列而形成。构象表位包括由抗原的折叠产生的表位，其中抗原线性序列不同部分的氨基酸在三维空间中非常邻近。
如本文所用的术语“特异性结合”是指抗体以比对其他抗原或蛋白更大的亲和力与预定抗原结合。通常，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且与预定抗原结合的KD为其与除预定抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)结合的KD的至少1/2。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”或“抗原特异性抗体”例如TLR3特异性抗体互换使用。可以使用下面所述的标准步骤来测量解离常数。
如本文所用的术语“TLR3生物活性”或“TLR3活性”是指由于结合到TLR3的配体而出现的任何活性。TLR3配体包括dsRNA、聚(I：C)和内源mRNA，如，由坏死细胞释放的内源mRNA。一种示例性TLR3活化引起响应TLR3配体的NF-κB的活化。在用聚(I：C)诱导受体时，NF-κB活化可以使用受体-基因分析来分析(Alexopoulou等人，Nature413：732-738，2001；等人，EMBOJ.18：6973-6982，1999)。另一示例性TLR3活化引起响应TLR3配体的干扰素反应因子(IRF-3、IRF-7)的活化。TLR3-介导IRF活化可以使用由干扰素刺激反应元件(ISRE)驱动的报告基因来分析。另一示例性TLR3活化引起促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，例如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、CXCL5/IP-10和RANTES。从细胞、组织释放或流通中的细胞因子和趋化因子可以使用公知的免疫测定法例如ELISA免疫测定法来测量。
本文使用如下的常规一字母和三字母氨基酸代码：
物质的组成
本发明提供能够抑制TLR3生物活性的抗体拮抗剂以及这类抗体的用途。这类TLR3拮抗剂可以具有结合TLR3并抑制TLR活性的特性。示例性机制(通过该机制TLR3活性会被这类抗体抑制)包括体外、体内或原位抑制TLR3结合到配体、抑制受体二聚化、抑制TLR3定位到内体间隔、抑制下游信号转导通路的激酶活性或抑制TLR3mRNA转录。能够通过其他机制抑制TLR3活性的其他抗体拮抗剂也在本发明各个方面及实施例的范围内。这些拮抗剂可用作研究试剂、诊断试剂和治疗剂。
通过使用多胚系基因编码可变区和多种体细胞事件来产生抗体多样性。体细胞事件包括可变(V)基因片段和多样性(D)及连接(J)基因片段的重组以产生完整VH区以及可变和连接基因片段的重组以产生完整VL区。不太可能独立产生具有与本文所公开那些相同或类似的CDR序列的抗体和组合物。在装配和体细胞突变之后抗体基因的序列是高度变化的，并且估计这些变化的基因编码1010个不同抗体分子(ImmunoglobulinGenes，2nded.，eds.Jonioetal.，AcademicPress，SanDiego，Calif.，1995)。
本发明提供衍生自人免疫球蛋白基因文库的新型抗原结合位点。用于承载抗原结合位点的结构通常是抗体重链或轻链或其一部分，其中抗原结合位点定位到如上述确定的天然存在的抗原结合位点。
本发明提供一种可与TLR3反应的分离的抗体或其片段，所述抗体或片段包含重链可变区和轻链可变区二者，并且其中抗体包含重链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，如表1a所示。
表1a.
在某些实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：192所示的HCDR2氨基酸序列，其中SEQIDNO：192的HCDR2如式(I)所示定义：
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S，
(I)
其中
Xaa6可以是Arg或Lys；
Xaa7可以是Tyr、His或Ser；
Xaa8可以是Met、Arg或Tyr；并且
Xaa9可以是Lys或Arg。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：194所示的HCDR2氨基酸序列，其中SEQIDNO：194的HCDR2如式(III)中所示定义：
I-I-Q-Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S，
(III)
其中
Xaa15可以是Lys、Thr或Ile；
Xaa16可以是Asn或Asp；并且
Xaa17可以是Val或Leu。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：196所示的HCDR2氨基酸序列，其中SEQIDNO：196的HCDR2如式(V)所示定义：
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G，
(V)
其中
Xaa24可以是Phe或Arg；并且
Xaa25可以是Ala或Ser。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：191所示的LCDR3氨基酸序列，其中SEQIDNO：191的LCDR3如式(II)所示定义：
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V，
(II)
其中
Xaa1可以是Ala、Gln、Gly或Ser；
Xaa2可以是Gly、Glu或Ser；
Xaa3可以是Asp或Asn；
Xaa4可以是Glu或Ser；并且
Xaa5可以是Phe、Ala或Leu。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：193所示的LCDR3氨基酸序列，其中SEQIDNO：193的LCDR3如式(IV)所示定义：
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V，
(IV)
其中
Xaa10可以是Gln或Ser；
Xaa11可以是Thr、Glu或Asp；
Xaa12可以是Val或Asn；
Xaa13可以是Tyr或Phe；并且
Xaa14可以是Ser、Asn或Gln。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含如SEQIDNO：195所示的LCDR3氨基酸序列，其中SEQIDNO：195的LCDR3如式(VI)所示定义：
Q-Q-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T，
(VI)
其中
Xaa18可以是Tyr、Gly或Ala；
Xaa19可以是Gly、Glu或Asn；
Xaa20可以是Ser或Thr；
Xaa21可以是Val、Ile或Leu；
Xaa22可以是Ser或Leu；并且
Xaa23可以是Ile、Ser、Pro或Tyr。
本发明还提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其具有重链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，如表1a所示。
其抗原结合位点氨基酸序列非实质不同于表1a所示那些(SEQIDNO：49-121和191-196)的抗体涵盖在本发明的范围内。通常，这涉及通过具有类似电荷、疏水或立体化学特征的氨基酸的一个或多个氨基酸替代。与抗原结合位点相比，还可以在框架区中进行额外替代，只要其不会对抗体的特性不利影响。可以进行替代以改善抗体特性，例如稳定性或亲和力。可以对抗原结合位点进行一个、两个、三个、四个、五个或六个替代。
保守修饰将会产生分子，所述分子具有类似于进行这类修饰的那些分子的功能和化学特性。分子功能和/或化学特性的基本修饰可以通过选择氨基酸序列的替代来完成，所述替代在其对维持(1)替代区域中分子主链的结构(例如，片层或螺旋构象)、(2)靶位上分子的电荷或疏水性或(3)分子的大小的作用方面明显不同。例如，“保守氨基酸取代”可能涉及用非天然残基替代天然氨基酸残基，以便在该位置氨基酸残基的极性或电荷少有或没有影响。此外，多肽的任何天然残基还可以用丙氨酸来替代，如先前丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，ActaPhysiol.Scand.Suppl.643：55-67，1998；Sasaki等人，Adv.Biophys.35：1-24，1998)。所需的氨基酸替代(无论保守还是不保守)可以由本领域技术人员在需要这类替代时确定。例如，氨基酸替代可以用来辨别分子序列的重要残基，或者增加或减少本文所述分子的亲和力。示例性氨基酸替代示于表1b中。
表1b.
在某些实施例中，保守氨基酸替代还涵盖通常由化学肽合成而非通过生物系统中合成掺入的非天然存在的氨基酸残基。氨基酸替代可以例如通过PCR诱变来完成(美国专利No.4,683,195)。使用公知的方法，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如编码11个氨基酸(ACDEGKNRSYW)的DVK密码子)并用实例1所示的所需特性筛选变异体的文库，来生成变异体的文库。表1c示出在LCDR3和HCDR2区域内对三种亲代TLR3抗体拮抗剂进行的替代，以改善抗体特性。
根据抗原结合位点的描述，本发明抗体的抗原结合位点残基以及随后框架残基可以因各条重链和轻链略有不同。表2a和表2b示出根据Kabat、Chothia和IMGT所述的本发明示例性抗体的抗原结合位点残基以及它们的复合序列。
表1c.
表2a.
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其包含重链和轻链可变区二者，并且其中抗体包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的氨基酸序列，并且还提供了各分离的重链可变和轻链可变区，如表3a所示。F17、F18和F19表示抗体变异体，其分别包含家族17、18和19的共有氨基酸序列(参见实例1)。
表2b.
表3a.
尽管实例所示的实施例包括成对的可变区，一个来自重链，一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到替代实施例可以包括单一重链或轻链可变区。单一可变区可以用来筛选能够形成二域特异性抗原结合片段的可变域，所述二域特异性抗原结合片段能够例如结合到TLR3。筛选可以通过使用噬菌体展示筛选方法来完成，所述方法使用例如PCT公布No.WO92/01047所公开的分级双组合方法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)。在此方法中，包含H或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的全部文库，所得的二链特异性抗原结合域根据所述的噬菌体展示技术来选择。
在其他实施例中，本发明提供了一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其同时包含具有与表3a所示的可变区氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链和轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了一种分离的抗体，其具有图3b所示的某些重链和轻链氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明抗体的任一种或它们的补体。某些示例性多核苷酸在本文公开，然而，考虑到给定表达系统中遗传密码或密码子优先选择的简并性，编码本发明抗体拮抗剂的其他多核苷酸也在本发明的范围内。
示例性抗体拮抗剂可以是IgG、IgD、IgG、IgA或IgM同种型的抗体。另外，这类抗体拮抗剂可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇(PEG)部分(聚乙二醇化)和脂质化)之类的过程进行翻译后修饰。这类修饰可以在体内或体外发生。例如，本发明的抗体可以缀合至聚乙二醇(聚乙二醇化)以改善其药动学性质。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术来执行。已显示治疗抗体与PEG的缀合会增强了药效学，但不会干扰功能。参见Deckert等人的Int.J.Cancer87：382-390，2000；Knight等人的Platelets15：409-418，2004；Leong等人的Cytokine16：106-119，2001和Yang等人的ProteinEng.16：761-770，2003。
表3b.
本发明抗体的药动学性质还可以通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰来增强。例如，IgG4同种型重链包含在绞链区中的Cys-Pro-Ser-Cys(CPSC)基序，其能够形成重链间或重链内的二硫键，即，CPSC基序中的两个Cys残基可以与其他重链的对应Cys残基形成二硫键(重链间)，或给定CPSC基序内的两个Cys残基可以彼此形成二硫键(重链内)。据信，体内异构酶能够将IgG4分子重链间的键转换为重链内的键，反之亦然(Aalberse和Schuurman，Immunology105：9-19，2002)。
因此，由于在铰链区内具有重链内键的那些IgG4分子中的重链：轻链(H：L)对不与彼此共价相连，所以其会分离为随后与衍生自形成双特异性、异源二聚体IgG4分子的其他IgG4分子的H：L单体重新相连的H：L单体。在双特异性IgG抗体中，抗体分子的两个Fab在其结合的表位方面有所不同。用Pro替代IgG4的铰链区CPSC基序中的Ser残基得到“IgG1样行为”，即，分子在重链之间形成稳定的二硫键，并因此不易受到与其他IgG4分子的H：L交换的影响。在一个实施例中，本发明的抗体将包括IgG4Fc结构域，在CPSC基序中有S到P的突变。CPSC基序的位置通常出现在成熟重链的残基228处，但可以根据CDR长度而改变。
此外，可以移除影响结合到除本发明抗体中的FcRn补救受体以外的Fc受体的位点。例如，在本发明的抗体中可以移除有关ADCC活性的Fc受体结合区。例如，在IgG1铰链区中的Leu234/Leu235突变为L234A/L235A或者IgG4铰链区中的Phe235/Leu236突变为P235A/L236A将最小化FcR结合，并降低免疫球蛋白介导补体依赖性细胞毒性和ADCC的能力。在一个实施例中，本发明的抗体将包括具有P235A/L236A突变的IgG4Fc结构域。上面所辨别的这些残基的位置通常在成熟重链中，但可以根据CDR长度而改变。具有P235A/L236A突变的示例性抗体是具有由SEQIDNO：218、219或220所示序列编码的重链的抗体。
全人、人适应、人化和亲和力成熟的抗体分子或抗体片段在本发明的范围内，如融合蛋白和嵌合蛋白。可以使用公知的方法(例如随机或定向诱变)或采用噬菌体展示文库，通过合理设计或随机亲和力突变来改善对抗原的抗体亲和力。例如，主要位于框架区中的游标区(VernierZone)残基的变异可以用来调节抗体的亲和力，如美国专利No.6,639,055所述。近来，Almagro等人定义了“亲和力决定残基”ADR，其位于CDR中，并且其工程设计可以增加亲和力(Cobaugh等人，JMolBiol.378：622-633，2008)。
被修饰用于改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他所需生物学或生物物理学特性的全人、人适应、人化、亲和力成熟的抗体分子或抗体片段在本发明的范围内。抗体的稳定性受多种因素的影响，包括(1)影响其内在稳定性的独立结构域的核包装、(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白/蛋白界面相互作用、(3)极性和带电残基的包埋、(4)极性和带电残基的氢键网络以及(5)除了分子内力和分子间力以外的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，J.Mol.Biol.，305：989-1010，2001)。使残基不稳定的潜在结构可以基于抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来辨别，并且残基对抗体稳定性的影响可以通过在辨别残基中产生潜藏突变的变异体并对其进行评估来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测得的热转化中间点(Tm)。通常，蛋白Tm与其稳定性相关，并与其对溶液展开和变性的敏感性以及根据蛋白展开趋势的降解过程负相关(Remmele等人，Biopharm.，13：36-46，2000)。多项研究已发现由DSC测得为热稳定性的配方物理稳定性和由其他方法测得的物理稳定性的分级之间的相关性(Gupta等人，AAPSPharmSci.5E8，2003；Zhang等人，J.Pharm.Sci.93：3076-3089，2004；Maa等人，Int.J.Pharm.，140：155-168，1996；Bedu-Addo等人，Pharm.Res.，21：1353-1361，2004；Remmele等人，Pharm.Res.，15：200-208，1997)。配方研究认为FabTm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。框架中或CDR内氨基酸的差异会对Fab域的热稳定性有显著影响(Yasui等人，FEBSLett.353：143-146，1994)。
本发明的抗体拮抗剂可以结合TLR3，Kd小于或等于约10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M。可以使用任何合适的方法通过试验确定给定分子例如抗体对TLR3的亲和力。这类方法可以使用本领域技术人员已知的Biacore或KinExA仪器、ELISA或竞争结合分析。
结合具有所需亲和力的给定TLR3同系物的抗体拮抗剂可以通过包括抗体亲和力突变在内的技术从变异体或片段的文库中选择。抗体拮抗剂可以使用任何合适的方法基于其对TLR3生物活性的抑制来辨别。这类方法可以利用使用公知方法并如本专利申请所述的报告基因分析或测量细胞因子产生的分析。
本发明的另一实施例是包含至少一个本发明的多核苷酸的载体。这类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。
本发明的另一实施例是一种宿主细胞，其包含本发明多核苷酸的任一者，例如编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含一个具有SEQIDNO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216所示氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区，或具有SEQIDNO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209或210所示氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区。
本发明的另一实施例是一种宿主细胞，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含一个具有SEQIDNO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168所示氨基酸序列的免疫球蛋白重链，或具有SEQIDNO：155、156、157、158、203、205、207、165或167所示氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。这类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，如SP2/0(美国模式培养物保藏所(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACCNo.85110503)、FO(ATCCCRL-1646)和Ag653(ATCCCRL-1580)鼠类细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTCCRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些，例如CHO-K1SV(LonzaBiologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCCCRL-61)或DG44。
本发明的另一实施例是一种制造与TLR3反应的抗体的方法，其包括培养本发明的宿主细胞并回收由宿主细胞产生的抗体。制造抗体并将其纯化的方法是本领域公知的。
本发明的另一实施例是一种产生本发明抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的另一实施例是一种可与TLR3反应的分离的抗体或其片段，其中抗体结合至少一个TLR3氨基酸残基，其选自(a)SEQIDNO：2的残基K467、R488或R489、(b)SEQIDNO：2的残基K467、(c)SEQIDNO：2的残基R489、(d)SEQIDNO：2的残基K467和R489以及(e)SEQIDNO：2的残基K467、R488和R489。分离的抗体还可以结合至少一个TLR3氨基酸残基，其选自SEQIDNO：2的残基Y465、Y468、N517、D536、Q538、H539、N541、E570或K619。
本发明的另一实施例是一种分离的抗体或其片段，其中抗体结合至少一个TLR3氨基酸残基，其选自SEQIDNO：2的残基D116或K145A。
可以使用若干公知的方法来确定本发明抗体的结合表位。例如，当各个组分的结构是已知的时，可以执行电脑模拟的蛋白质-蛋白质对接以辨别相互作用的相容位点。可以通过抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换，以对可以被抗体结合的抗原上的区域进行绘图。抗原的片段和点突变可以用来定位对抗体结合至关重要的氨基酸。对于诸如TLR3之类的大蛋白质而言，当结合位点首先定位到蛋白上的区域时，例如通过对接、片段诱变或H/D互换来简化点突变绘图。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体或其片段，其与单克隆抗体竞争TLR3结合，其中所述单克隆抗体包含某些重链互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列、某些轻链CDR1、2和3的氨基酸序列、某些重链可变区(VH)的氨基酸序列或某些轻链可变区(VL)的氨基酸序列。本发明的示例性单克隆抗体是一种分离的抗体，其包含具有SEQIDNO：216所示氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO：41所示氨基酸序列的轻链可变区以及是一种抗体，其包含具有SEQIDNO：214所示氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO：211所示氨基酸序列的轻链可变区。
使用公知的方法可以体外分析结合到TLR3之间的竞争。例如，在存在未标记抗体的情况下，MSDSulfo-TagTM琥珀酰亚胺酯标记的抗体结合到TLR3可以通过ELISA来评估。本发明的示例性抗体是mAb12、mAb15和mAbc1811(参见表3a)。先前所述的抗TLR3抗体c1068及其衍生物(在PCT公布No.WO06/060513A2中有所描述)、TLR3.7(eBiosciences，目录号14-9039)和ImgenexIMG-315A(ImgenexIMG-315A；针对人TLR3氨基酸生成，氨基酸55-70，VLNLTHNQLRRLPAAN)不会与通过结合到TLR3与mAb12、15或c1811竞争，如实例5所示。
本发明的另一方面是一种可与TLR3反应的分离的抗体，其中抗体具有至少一个以下特性：
a.SEQIDNO：214的重链可变区；或
b.SEQIDNO：211的轻链可变区；或
c.SEQIDNO：214的重链可变区和SEQIDNO：211的轻链可变区；或
d.如SEQIDNO：70、77和72所示的重链互补决定区(CDR)1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)氨基酸序列；或
e.如SEQIDNO：67、68和78所示的轻链互补决定区(CDR)1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)氨基酸序列；或
f.如SEQIDNO：70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列和如SEQIDNO：67、68和78所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
g.与具有SEQIDNO：214的氨基酸序列的可变区具有至少95％同一性的重链可变区；或
h.与具有SEQIDNO：211的氨基酸序列的可变区具有至少95％同一性的轻链可变区。
治疗方法
本发明的TLR3拮抗剂(例如TLR3抗体拮抗剂)可以用来调节免疫系统。虽然不希望被任何具体理论约束，但本发明的拮抗剂可以通过防止或减少配体结合到TLR3、TLR3二聚化、TLR3内在化或TLR3运输来调节免疫系统。本发明的方法可以用来治疗属于任何类别的动物患者。这类动物的例子包括哺乳动物，例如人、啮齿动物、狗、猫和家畜。例如，本发明的抗体可用于抵抗TLR3活性、治疗炎症、炎性和代谢疾病，并且还可用于制备用于这种治疗的药剂，其中药剂为以本文所定义剂量给药而制备。
通常，可以由本发明的TLR3抗体拮抗剂给药预防或治疗的炎性疾病、感染相关病症或免疫介导炎性疾病包括由细胞因子或趋化因子介导的那些以及由TLR3的活化或通过TLR3通路的信号转导完全或部分引起的那些病症。这类炎性疾病的例子包括败血病相关病症、炎性肠疾病、自体免疫疾病、炎性疾病和感染相关病症。还认为癌症、心脏血管和代谢病症、神经病学和纤维变性病症可以通过本发明的TLR3抗体拮抗剂给药来预防或治疗。炎症会影响组织或者是全身性的。示例性患病组织是呼吸道、肺、胃肠道、小肠、大肠、结肠、直肠、心血管系统、心脏组织、血管、关节、骨和滑膜组织、软骨、上皮、内皮、肝和脂肪组织。示例性全身炎性疾病是细胞因子风暴或高细胞因子血症、全身炎性反应综合征(SIRS)、移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、灾难性抗磷脂抗体综合征、严重病毒感染、流行性感冒、肺炎、休克或败血病。
炎症是生物体抵挡侵入剂的保护性反应。炎症是涉及许多细胞和体液介体的级联反应事件。一方面，炎性反应的抑制会引起宿主免疫失能；然而，如果让其未经检查，炎症会导致严重的并发症，包括慢性炎性疾病(如，哮喘、牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠疾病等等)、脓毒性休克和多器官衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态共用共同的炎性介体，例如细胞因子、趋化因子、炎性细胞或由这些细胞分泌的其他介体。
通过其配体聚(I：C)、dsRNA或内源mRNA的TLR3活化导致信号转导通路的活化，从而导致促炎性细胞因子的合成和分泌、炎性细胞(例如巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞)的活化和募集、细胞死亡和组织破坏。TLR3诱导IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、MIP-1、CXCL5/IP-10和RANTES以及与免疫细胞募集和活化有关的其他促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，从而造成自体免疫的组织破坏和其他炎性疾病。TLR3配体内源mRNA在炎症期间从坏死细胞释放，并会产生正反馈回路以活化TLR3并维持炎症和进一步组织损伤。TLR3拮抗剂(例如TLR3抗体拮抗剂)会使细胞因子分泌正常化，减少炎性细胞的募集，并减少组织损伤和细胞死亡。因此，TLR3拮抗剂具有治疗炎症和一系列炎性疾病的治疗潜能。
炎性疾病的一个例子是败血病相关病症，其可以包括全身炎性反应综合征(SIRS)、脓毒性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。由病毒、细菌、真菌或寄生感染以及由坏死细胞释放的dsRNA会造成败血病发病。虽然不希望被具体理论约束，但人们相信用TLR3拮抗剂处理可以通过延长患有败血病相关炎性疾病的患者的生存时间来提供治疗有益效果，或通过加强先天抗微生物活性、通过展示与抗微生物剂结合时的协同作用、通过最小化造成病变的局部炎性状态或上述的任意组合来预防局部炎性事件(如，在肺中的)扩散变成全身性病症。这类干预可能足以使得额外的治疗(如，引起感染或细胞因子水平减少的治疗)对保证患者生存是必要的。败血病可以通过D-半乳糖胺和聚(I：C)的给药在动物例如小鼠中建模。在这类模型中，D-半乳糖胺是用作败血病敏化剂的肝毒素，并且聚(I：C)是模拟dsRNA并活化TLR3的败血病诱导分子。TLR3拮抗剂治疗可以增加败血病鼠类模型中动物存活率，并且因此TLR3拮抗剂可用于败血病治疗。
胃肠炎症是胃肠道的粘膜层的炎症，并涵盖急性和慢性炎性疾病。急性炎症通常特征在于短时间的发病和中性粒细胞的渗透或流入。慢性炎症通常特征在于相对较长期的发病和单核细胞的渗透或流入。粘膜层可以是肠(包括小肠和大肠)、直肠、胃(胃部)衬里或口腔的粘膜。示例性慢性胃肠炎性疾病是炎性肠疾病(IBD)、由环境侵害诱发的结肠炎、由治疗方案(例如化学疗法的给药、放射治疗等)引起或与其相关(如，作为副作用)的胃肠道炎症(如，结肠炎)、传染性结肠炎、缺血性结肠炎、胶原性或淋巴细胞性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、诸如慢性肉芽肿病或乳糜泻的病症中的结肠炎、食物过敏症、胃炎、感染性胃炎或小肠结肠炎(如，幽门螺旋杆菌感染的慢性活动性胃炎)以及由传染剂引起的胃肠炎症的其他形式。
炎性肠疾病(IBD)包括一组通常未知病原学的慢性炎性疾病，如，溃疡性结肠炎(UC)和克隆氏病(CD)。临床和实验证据表明IBD的致病机制是多因子的，涉及敏感性基因和环境因子。在炎性肠疾病中，组织损伤由对肠道菌群抗原的不适当或严重免疫反应引起。存在炎性肠疾病的若干动物模型。一些最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱发的结肠炎模型或噁唑酮模型，其诱发结肠的慢性炎症和溃疡(Neurath等人，Intern.Rev.Immunol19：51-62，2000)。另一模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，其诱发由血性腹泻显现的急性结肠炎、体重减轻、结肠的缩短和伴随中性粒细胞侵润进的粘膜溃疡。DDS诱发的结肠炎组织学特征在于炎性细胞侵润进固有膜，伴随淋巴样增生、灶性隐窝损伤和上皮溃疡(Hendrickson等人，ClinicalMicrobiologyReviews15：79-94，2002)。另一模型涉及原初CD45RB高CD4T细胞继承性转移到RAG或SCID小鼠。在此模型中，供体原初T细胞攻击接受者消化道，造成慢性肠炎症和类似于人炎性肠疾病的症状(ReadandPowrie，Curr.Protoc.Immunol.Chapter15unit15.13，2001)。在这些模型的任一者中的本发明拮抗剂的给药可以用来评价这些拮抗剂改善症状的潜在功效，并改变与消化道中炎症相关疾病(例如炎性肠疾病)的病程。若干处理选择是可用于IBD，例如抗TNF-α抗体治疗已使用了十年，用于治疗克隆氏病(VanAssche等人，Eur.J.Pharmacol.EpubOct2009)。然而，大多数患者是当前治疗难以治疗的(Hanauer等人，Lancet359：1541-1549，2002；Hanauer等人，Gastroenterology130：323-333，2006)，并且因此需要针对难治患者群体的新疗法。
炎性疾病的另一例子是炎性肺部疾病。示例性炎性肺部病包括感染诱发的肺部病症(包括与病毒、细菌、真菌、寄生虫或朊病毒感染有关的那些)、过敏原诱发的肺部病症、污染诱发的肺部病症(例如石棉沉着病、硅肺病或铍中毒)、胃内容物吸入诱发的肺部病症、免疫失调、具有遗传倾向性的炎性疾病(例如囊性纤维变性)和物理创伤诱发的肺部病症(例如呼吸机损伤)。这些炎性疾病还包括哮喘、肺气肿、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肉状瘤病、组织细胞增多病、淋巴管肌瘤病、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺病、支气管肺发育异常、社会获得性肺炎、医院性肺炎、呼吸机相关性肺炎、败血病、病毒性肺炎、流行性感冒感染、副流感感染、轮状病毒感染、人变型肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染和曲霉菌或其他真菌感染。示例性感染相关炎性疾病可以包括病毒性或细菌性肺炎，包括严重肺炎、囊性纤维变性、支气管炎、气道恶化和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这类感染相关病症可能涉及复性感染，例如原发病毒感染和继发细菌感染。
哮喘是肺的炎性疾病，其特征在于气道高反应性(“AHR”)、支气管狭窄、喘鸣、嗜酸性粒细胞性或中性粒细胞性炎症、粘液高分泌、上皮下纤维变性和升高的IgE水平。患有哮喘的患者最经常因为呼吸道的微生物感染(如，鼻病毒、流行感冒病毒、流感嗜血杆菌等)而经历“恶化”(症状的加重)。哮喘攻击可以通过环境因素(如，蛔虫、昆虫、动物(如，猫、狗、兔子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸟)、真菌、空气污染物(如，烟草烟雾)、刺激性毒气、烟雾、蒸汽、气溶胶、化学物、花粉、运动或冷空气而触发。除了哮喘之外，影响肺部的若干慢性炎性疾病特征在于中性粒细胞侵润进气道，例如慢性阻塞性肺疾患(COPD)、细菌性肺炎和囊性纤维变性(Linden等人，Eur.Respir.J.15：973-977，2000；Rahman等人Clin.Immunol.115：268-276，2005)，并且诸如COPD、变应性鼻炎和囊性纤维变性的疾病特征在于气道高反应性(Fahy和O’Byrne，Am.J.Respir.Crit.CareMed.163：822-823，2001)。哮喘和气道炎症的常用动物模型包括卵清蛋白激发模型和乙酰甲胆碱敏感化模型(Hessel等人，Eur.J.Pharmacol.293：401-412，1995)。抑制由培养的人支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞或气道平滑肌细胞产生细胞因子和趋化因子还可以用作体外模型。本发明拮抗剂给药到这些模型的任一者可以用来评价这些拮抗剂用于改善症状和改变哮喘、气道炎症、COPD等病程的用途。
可以由本发明的方法预防或治疗的其他炎性疾病和神经病变是由自身免疫疾病引起的那些。这些病症和神经病变包括多发性硬化、全身红斑性狼疮和神经变性及中枢神经系统(CNS)疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、双相型障碍和肌萎缩性侧索硬化(ALS))、肝脏疾病(包括原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝/脂肪性肝炎、纤维变性、丙型肝炎病(HCV)和乙型肝炎病(HBV))、糖尿病和胰岛素抵抗、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、脑出血、中风及心肌梗塞、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和青少年类风湿性关节炎(JRA)、骨质疏松症、骨关节炎、胰腺炎、纤维变性、脑炎、牛皮癣、巨细胞性动脉炎、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、人免疫缺陷症病毒(HIV)、炎性皮肤病症、移植、癌症、过敏症、内分泌病、创伤修复、其他自身免疫疾病、气道高反应性和细胞、病毒或朊病毒介导感染或疾病。
关节炎(包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由于损伤引起的关节炎关节等)是会得益于抗炎性蛋白(例如本发明的拮抗剂)治疗用途的普通炎性疾病。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响全身并作为关节炎最常见形式的全身性疾病。由于类风湿性关节炎引起组织损伤，所以TLR3配体可以存在于炎症的位点。TLR3信号转导的激活会在发炎关节处维持炎症和进一步的组织损伤。类风湿性关节炎的若干动物模型是本领域已知的。例如，在胶原诱发关节炎(CIA)模型中，小鼠逐渐产生非常类似于人类风湿性关节炎的慢性炎性关节炎。本发明的TLR3拮抗剂给药到CIA模型小鼠可以用来评价这些拮抗剂用于改善症状并改变病程的用途。
韦利斯氏病(糖尿病)是指衍生自多个诱发因素且特征在于高血糖症的疾病过程((LeRoith等人(编辑)，DiabetesMellitus，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，Pa.U.S.A.1996)以及在其中引用的所有参考文献。不受控制的高血糖症因增加的微血管和大血管疾病风险与增加且过早的死亡率有关，所述疾病包括肾病、神经病变、视网膜病、高血压、脑血管疾病和冠心病。因此，葡萄糖内稳态的控制是糖尿病治疗的至关重要的方法。
潜在缺陷使得糖尿病划分为两大类：当患者在其胰腺中缺少产胰岛素β细胞时出现的I型糖尿病(胰岛素依赖性韦利斯氏病，IDDM)和出现在具有受损β细胞胰岛素分泌和/或胰岛素作用抗性的患者中的2型糖尿病(非胰岛素依赖性韦利斯氏病，NIDDM)。
2型糖尿病特征在于伴有相对而非绝对胰岛素缺乏的胰岛素抵抗。在胰岛素抵抗个体中，身体分泌异常高量的胰岛素以补偿这种缺陷。当存在不足量的胰岛素来补偿胰岛素抵抗并适当控制葡萄糖时，葡萄糖耐量降低的状态会继续发展。在大量的个体中，胰岛素分泌进一步下降，而血浆葡萄糖水平上升，从而引起糖尿病的临床状态。肥胖相关炎症与胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂异常和心血管病的发展密切有关。肥胖脂肪募集并保留巨噬细胞，并可以产生会干扰胰岛素信号转导并诱发抗胰岛素性的过量促炎性细胞因子，包括TNF-α和IL-6、游离脂肪酸和脂肪细胞因子。巨噬细胞上的TLR3活化会造成脂肪的促炎性状态。抗胰岛素性的若干动物模型是已知的。例如，在饮食诱发肥胖症模型(DIO)中，动物逐渐产生高血糖症以及抗胰岛素性并且伴有体重增加。本发明的TLR3拮抗剂给药到DIO模型可以用来评价拮抗剂用于改善与2型糖尿病有关的并发症并改变病程的用途。
示例性癌症可以包括细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种恶性疾病，包括(但不限于)下列疾病中的至少一种：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞或T细胞ALL、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞性白血病、骨髓异常增生综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金病、恶性淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多症、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高血钙综合征、实体瘤、腺癌、鳞状细胞癌、肉瘤、恶性黑素瘤、特别是转移性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关的骨再吸收、癌症相关的骨痛等。
示例性心血管疾病可以包括细胞、组织、器官、动物或患者中的心血管病，包括(但不限于)心脏顿抑综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性动脉粥样硬化疾病、高血压、高动脉压、肾血管性高血压、晕厥、中风、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺心病、原发性肺动脉高压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房纤维性颤动(持久性或突发性)、灌注后综合征、心肺分流术炎症反应、混乱性或多源性房性心动过速、规则窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室纤维性颤动、希氏束心律不齐、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血疾病、冠状动脉病、心绞痛、心肌梗塞、心肌症、扩张性充血性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉及外周动脉瘤、主动脉夹层、主动脉炎症、腹主动脉及其分支的闭塞、外周血管疾病、闭塞性动脉疾病、外周动脉粥样硬化疾病、血管闭塞性脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏综合征及疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓形成、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合症和缺血-再灌注损伤。
示例性神经病学疾病可以包括细胞、组织、器官、动物或患者中的神经病，包括(但不限于)神经变性疾病、多发性硬化、偏头痛、AIDS先天性痴呆、脱髓鞘性病(例如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎)、锥体束外和小脑疾病(例如皮质脊髓系统损伤)、基底神经节疾病或小脑疾病、运动过度疾病(例如亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病)、药物诱发运动疾病(例如由封闭CNS多巴胺受体的药物诱发的那些，如帕金森氏病)、进行性核上性麻痹、小脑结构损伤、脊髓小脑变性(例如脊髓性共济失调、弗里德赖希氏共济失调、小脑皮质退化、多发性系统退化(门切尔、代-托二氏、夏伊-德雷格和麦查多-格里罗二氏))、全身性疾病(雷弗素姆氏病、血β-脂蛋白缺乏症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统疾病)、脱髓鞘轴疾病、(例如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎)、动作单元的疾病(例如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，如肌萎缩性侧索硬化、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)、阿耳茨海默氏病、中年唐氏综合征、弥漫性Lewy体疾病、路易体型老年痴呆、韦-科二氏综合征、慢性醇中毒、克雅氏病、亚急性硬化全脑炎、哈-斯二氏病和拳击员痴呆。
示例性的纤维变性病症可以包括肝纤维变性(包括但不限于酒精诱发的肝硬化、病毒诱发的肝硬化、自身免疫诱发的肝炎)；肺纤维变性(包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维变性)；肾纤维变性(包括但不限于硬皮病、糖尿病性肾炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎)；皮肤纤维变性(包括但不限于硬皮病、肥大性和瘢痕疙瘩性瘢痕形成、灼伤)；骨髓纤维变性；神经纤维瘤病；纤维瘤；肠纤维变性；和由外科手术操作引起的纤维变性粘连。在这样的方法中，纤维变性可以是器官特异性纤维变性或系统性纤维变性。器官特异性纤维变性可以与肺纤维变性、肝纤维变性、肾纤维变性、心脏纤维变性、血管纤维变性、皮肤纤维变性、眼纤维变性、骨髓纤维变性或其他纤维变性中的至少一种有关。肺纤维变性可以与特发性肺纤维变性、药物诱发肺纤维变性、哮喘、肉状瘤病或慢性阻塞性肺疾病中的至少一种有关。肝纤维变性可以与肝硬变、血吸虫病或胆管炎中的至少一种有关。肝硬变可以选自于酒精性肝硬变、丙型肝炎后肝硬变、原发性胆汁性肝硬变。胆管炎是硬化性胆管炎。肾纤维变性可以与糖尿病性肾病变或狼疮性肾小球性肾炎有关。心脏纤维变性可以与心肌梗塞有关。血管纤维变性可以与血管成形术后再狭窄或动脉粥样硬化有关。皮肤纤维变性可以与烧伤疤痕、肥大疤痕、瘢痕疙瘩或肾原性纤维皮肤病有关。眼纤维变性可以与球后纤维变性、白内障后手术或增生性玻璃体视网膜病有关。骨髓纤维变性可以与特发性骨髓纤维变性或药物诱发骨髓纤维变性有关。其他纤维变性可以选自于佩洛尼氏病、杜普伊特伦氏挛缩或皮肌炎。系统性纤维变性可以是系统性硬化或移植物抗宿主病。
给药/药物组合物
对需要抑制TLR3活性的病症治疗或预防有效的试剂“治疗有效量”可以通过标准研究技术来确定。例如，对炎性疾病(例如哮喘、克隆氏病、溃疡性结肠炎或类风湿性关节炎)的治疗或预防有效的试剂剂量可以通过将试剂给药到相关动物模型(例如本文所述的模型)来确定。
另外，体外分析可以可选地用来帮助辨别最佳剂量范围。具有有效剂量的选择可以由本领域技术人员基于若干因素的考虑(如，经过临床试验)来确定。这类因素包括将要治疗或预防的疾病、涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态和本领域技术人员已知的其他因素。在制剂中要使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从得自体外或动物模型试验系统的剂量效应曲线推测得到。
在本发明的方法中，TLR3拮抗剂可以单独给药或与至少一种其他分子结合给药。这类额外的分子可以是其他TLR3拮抗剂分子或不被TLR3受体信号转导介导的具有治疗有益效果的分子。抗生素、抗病毒素、减尘剂和减少细胞因子水平或活性的其他化合物是这类额外分子的例子。
本发明试剂治疗用途的给药方式可以是将试剂递送到宿主的任何合适的途径。这些试剂的药物组合物可特别用于非肠道给药(如，皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、静脉注射、皮下注射或鼻内给药)。
本发明的试剂可以制备为药物组合物，其包含有效量的试剂作为药用载体中的活性成分。术语“载体”是指据以给予该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药物媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可以使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。这些溶液可通过常规的、熟知的除菌技术(如过滤)进行除菌。组合物可以包含按需要用来大致估计生理状况的药用辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、稳定、增稠、润滑和着色剂等。在这类药物配方中本发明试剂的浓度可以广泛变化，即，从小于约0.5重量％(通常至少约1重量％)至多达15或20重量％，并将根据所选给药的具体方式主要基于所需剂量、流体量、粘度等来选择。
从而，用于肌内注射的本发明的药物组合物可以制备来包含1ml无菌缓冲水以及约1ng至约100mg(如约50ng至约30mg，或更优选约5mg至约25mg)的本发明TLR3抗体拮抗剂。类似地，用于静脉输注的本发明的药物组合物可以构成来包含约250ml的无菌林格氏溶液以及约1mg至约30mg且优选5mg至约25mg的本发明的拮抗剂。用于非肠道制备可给药组合物的实际方法是公知的，并在例如“Remington′sPharmaceuticalScience”(第十五版，MackPublishingCompany，Easton，PA)中得以更详细描述。
本发明的抗体拮抗剂可以冻干以便于储存，使用之前可以在合适的载体中复原。显示此技术对常规免疫球蛋白和蛋白制备有效，并且可以采用本领域已知的低压冻干法和重建技术。
本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。
实例1
抗huTLR3拮抗剂mAbs的鉴别和衍生
MorphoSys人组合抗体文库金色噬菌体展示文库(MorphosysAG，Martinsried，Germany)被用作人抗体片段的来源，并淘选由具有C末端多组氨酸标记的人TLR3(huTLR3)(SEQIDNO：4)的氨基酸1-703的表达产生并由固定化金属亲和层析纯化的纯化TLR3抗原。氨基酸1-703对应于huTLR3的预测胞外域(ECD)。特异性结合到huTRL3ECD的Fab片段(Fab)通过以各种方式呈现TLR3蛋白来选择，以便不同组的抗体片段可以被辨别、排序并证实为唯一的。将来自不同淘选策略的62个候选物(不同V-区序列)辨识为唯一的hTLR3ECD结合剂。
筛选辨识为huTLR3ECD结合剂的62个候选物在与辨别抗炎活性相关的各种基于细胞分析中的中和活性。使用初步活性数据(参见下面实例2)，从62个候选物选择定义家族16-19的四个候选物(Fab16-19)作为用于重链CDR2(HCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)的CDR成熟的亲代。亲代候选物中的一个(候选物19)在HCDR2中显示出N联糖基化位点；在这个候选物中产生Ser至Ala(S至A)突变，以除去该位点。在四个亲代候选物的CDR突变之后，辨别总共15种子代候选物(候选物1-15)的另外表征，如下面实例2所述。存在于19个候选物的每一种中的轻链和重链可变区的列表示于上面的表3中。根据其是Fab还是被克隆为全长抗体链(实例3)，候选物在本文被称为mAb1-19或Fab1-19。由于表达载体设计，所有候选物的可变区的成熟氨基酸末端是重链的QVE和轻链的DI。在这些末端优选的序列是与候选物序列具有高度一致性的各个胚系基因中的那些。对于家族17和18而言，胚系基因序列是VH的QVQ和VL的SY。对于家族19而言，序列是VH的EVQ和VL的DI。SY序列对λ亚族3是独特的，并且有S或Y作为氨基末端残基不均匀性的报道。从而，显性λ亚族1的QSV共有末端被视为家族17和18的VL的DIE的更合适替换。这些变化被引入家族18的候选物9、10和12以及家族19的候选物14和15。在此过程中，这些抗体的VH和VL区均进行密码子优化。分别地，候选物9、10和11的轻链可变区N端胚系变异体的氨基酸序列示于SEQIDNO：209-211，并且候选物9、10、12、14和15的重链可变区N端胚系变异体的氨基酸序列分别示于SEQIDNO：212-216。候选物N端变异体在本文被称为候选物/mAb/Fab9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ。N端胚系变异体被表示为mAbs，并当与其亲代对应物(数据未示出)相比时，显示对结合到TLR3或其对抑制TLR3生物活性的能力没有影响。
实例2
体外TLR3拮抗剂活性的测定
上述的15种CDR-成熟候选物被选为潜在人类治疗学，并确定一系列的结合和中和活性。下面描述四个亲代Fab(Fab16-19)和15个CDR成熟Fab(Fab1-15)或其非胚系V-区变异体的活性分析和结果。
NF-κB和ISRE信号转导级联反应的抑制
293T细胞在补充有热灭活FBS的DMEM和GluaMax培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长，并用30ngpNF-κB或ISRE荧火虫荧光素酶报告基因质粒、13.5ngpcDNA3.1载体、5ngphRL-TK和编码FLTLR3的1.5ngpCDNA(SEQIDNO：2)转染。phRL-TK质粒包含由HSV-1胸苷激酶启动子(Promega，Madion，WI)驱动的Renilla萤光素酶基因。TLR3抗体可以在添加聚(I：C)(GEHealthcare，Piscataway，NJ)之前孵育30-60分钟。板在添加Dual-Glo萤光素酶试剂之前在37℃下孵育6h或24h，并且板在FLUOstar板读取器上读取。通过将荧火虫RLU除以RenillaRLU获得归一化值(萤光素酶比)。当用TLR3激动剂聚(I：C)(1μg/ml)刺激时，具体地，通过在刺激之前用抗TLR3抗体(0.4、2.0和10μg/ml)孵育细胞来抑制NF-κB或ISRE信号转导级联反应刺激的荧火虫萤光素酶的产生。NF-κB分析的结果示于图1，并被表达为萤火虫/海肾比的抑制百分比，其中将5465作为阳性对照(中和抗人TLR3Mab)以及抗人组织因子mAb(859)作为人IgG4同种型对照。用mAb浓度0.4-10μg/ml实现＞50％抑制。c1068和TLR3.7在10μg/ml下抑制约38％和8％的TLR3生物活性。用ISRE报告基因分析获得类似的结果(数据未示出)。
BEAS-2B细胞的细胞因子释放
BEAS-2B细胞(SV-40转化的正常人支气管上皮细胞系)接种在I型胶原包被的培养皿中，并在添加聚(I：C)之前用或不用抗人TLR3抗体孵育。在处理之后的二十四小时，收集上清液并使用检测IL-6、IL-8、CCL-2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10的定制多路微球分析来分析其细胞因子和趋化因子水平。在0.4、2.0和10μg/ml下的mAb处理之后的结果作为各个细胞因子/趋化因子的抑制百分比示于图2。5465是阳性对照；859是同种型对照。
NHBE细胞中细胞因子释放
细胞因子释放也在正常人支气管上皮(NHBE)细胞(Lonza，Walkersville，MD)中进行分析。NHBE细胞被扩展并转移到包被的培养皿，孵育48小时，在此之后移除培养基并用0.2ml的新鲜培养基补充。随后在添加聚(I：C)之前，用或不用抗人TLR3mAb将细胞孵育60分钟。在24小时之后收集上清液，并在-20℃下保存或直接分析IL-6水平。在使用在0.001至50μg/ml剂量进行mAb处理之后的结果作为IL-6分泌的抑制百分比作图表示在图3中。5465是阳性对照，859是同种型对照。在＜1μg/ml下大部分mAb抑制至少50％的IL-6产生，并在＜5μg/ml下实现75％的抑制。
PBMC细胞中细胞因子释放
细胞因子释放也在人外周血单个核细胞(PBMC)中进行分析。将全血从人供体收集进肝素采集管，Ficoll-PaquePlus溶液缓慢在下面分层到该管。将管离心，并在Ficoll正上方形成白色层的PBMC被回收并划板。随后在添加25μg/ml聚(I：C)之前用或不用抗人TLR3mAb孵育PBMC。在24小时后，收集上清液，并使用Luminex技术确定细胞因子水平。使用单剂量的mAb(0.4μg/ml)的作为IFN-γ、IL-12和IL-6的累积抑制百分比的结果作图表示在图4中，其中，5465是阳性对照；hIgG4是同种型对照。
HASM细胞中细胞因子释放
简而言之，在添加500ng/ml聚(I：C)和10ng/mlTNF-α的协同组合之前用或不用抗人TLR3mAbs孵育人气道平滑肌(HASM)细胞。在24小时之后，收集上清液，并使用Luminex技术确定细胞因子水平。使用三种剂量的mAb(0.4、2和10μg/ml)的作为趋化因子CCL5/RANTES水平的结果作图表示在图5中。5465是阳性对照；hIgG4是同种型对照。
在人细胞中体外分析的结果确认本发明抗体由于结合到huTLR3而减少细胞因子和趋化因子释放的能力。
实例3
全长抗体构造
四个亲代Fab(候选物号16-19)和15个子代(候选物号1-15)重链克隆到具有S229PFc突变的人IgG4基底上。候选物9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ克隆到具有F235A/L236A和S229PFc突变的人IgG4基底上。
成熟全长重链氨基酸序列示于SEQIDNO：90-102和218-220，如下：
对于表达而言，这些重链序列可以包括N端前导序列，例如MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQIDNO：103)。具有前导序列和成熟形式(没有前导序列)的编码候选物14EVQ和15EVQ的重链的示例性核苷酸序列分别示于SEQIDNO：104和105中。同样，对于表达而言，本发明抗体的轻链序列可以包括N端前导序列，例如MGVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQIDNO：106)。具有前导序列和成熟形式(没有前导序列)的编码密码子优化候选物15的轻链的示例性核苷酸序列分别示于SEQIDNO：107和108中。
实例4
抗TLR3mAb结合的表征
mAbs结合到人TLR3胞外域(ECD)的EC50值由ELISA来确定。人TLR3ECD蛋白在PBS中被稀释到2μg/m，并且将100μl等分试样分配到96孔板(CorningInc.，Acton，MA)的各孔。在4℃下过夜孵育后，板在由PBS中0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich)组成的洗涤缓冲液中洗涤3次。用由在PBS中2％I-Block(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)和0.05％Tween-20组成的200μl封闭液封闭各孔。在室温下封闭2小时后，板被冲洗3次，接着将抗TLR3mAb候选物1至19的连续稀释液添加在封闭缓冲液中。抗TLR3mAbs在室温下孵育2小时，并冲洗3次。在其之后将过氧化物酶标记的羊抗人IgG(GEHealthcare，Piscataway，NJ)在封闭缓冲液中以1∶4000稀释，在室温下孵育1小时，接着在洗涤缓冲液中洗涤3次。通过在TMB-S(FitzgeraldIndustriesInternational，Inc.，Concord，MA)中进行10-15分钟孵育来检测结合的情况。通过25μl2NH2SO4来停止反应，并且使用SPECTRAMax分光光度计(MolecularDevicesCorp.，Sunnyvale，CA)在450nm下读取吸光度，减去650nm下的读数。使用GraphPadPrism软件(GraphPadSoftware，Inc.，SanDiego，CA)通过非线性回归来确定EC50值。
确定用100μl的2.5μg/ml到0.6pg/ml的mAbs4倍连续稀释液孵育结合到huTLR3的EC50值(表4)。抗人组织因子mAb859和huIgG4κ被包括作为阴性对照。
表4
还通过Biacore分析来确定huTLR3ECD的结合亲和力。数据(未示出)表示mAb1-19具有小于10-8M的huTLR3ECD的Kd。
实例5
竞争表位结合
执行表位结合试验来确定抗TLR3抗体竞争组或“表位框并法(epitopebin)”。
对于竞争ELISA而言，如实例1所述产生的5μl(20μg/ml)的纯化人TLR3ECD蛋白包被在MSDHighBind板上(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)，每孔在室温下保持2小时。将150μl的5％MSDBlockerA缓冲液(MesoScaleDiscovery)加至各孔并在室温下孵育2小时。将板用0.1MHEPES缓冲液(PH7.4)洗涤三次，接着添加用不同竞争物标记的抗TLR3mAb的混合物。标记的抗体(10nM)用增加浓度(1nM至2μM)的未标记抗TLR3抗体进行孵育，然后以25μl混合物的体积加到指定的孔。在2小时孵育后，在室温下轻轻摇动，用0.1MHEPES缓冲液(pH7.4)将板洗涤3次。用蒸馏水稀释MSDReadBufferT(4倍稀释)并以150μL/孔的体积进行分配，用SECTORImager6000分析。用MSDSulfo-TagTM琥珀酰亚胺酯根据制造商的说明(MesoScaleDiscovery)标记抗体。
评价下面的抗TLR3抗体：从MorphoSys人组合抗体文库获得的mAb1-19(在表3a中所示)；c1068(WO06/060513A2中描述)、c1811(由用小鼠TLR3蛋白免疫的大鼠生成的杂交瘤产生的大鼠抗小鼠TLR3mAb)、TLR3.7(eBiosciences，SanDiego，CA，目录号14-9039)和IMG-315A(由Imgenex(SanDiego，CA)的人TLR3氨基酸氨基酸55-70(VLNLTHNQLRRLPAAN)产生)。对于mAb9、10、12、14和15而言，变异体9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ被用于此研究。
基于竞争分析，抗TLR3抗体被分配到五种不同bin。BinA：mAb1、2、13、14EVQ、15EVQ、16、19；BinB：mAb3、4、5、6、7、8、9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、11、12QVQ/QSV、17、18；BinC：抗体ImgenexIMG-315A；BinD：抗体TLR3.7、c1068；和BinE：抗体c1811。
实例6
表位标测
选择实例5所述的不同表位bin的代表性抗体用于进一步表位标测。使用各种方法来完成表位标测，包括TLR3片段交换实验、诱变、H/D交换和计算机模拟蛋白质-蛋白质对接(TheEpitopeMappingProtocols，MethodsinMolecularBiology，Volume6，GlenE.Morrised.，1996)。
TLR3片段交换TLR3人-小鼠嵌合蛋白被用来将全体抗体结合域定位在TLR3上。人TLR3蛋白胞外域被分为三个片段(根据基于人TLR3氨基酸序列的氨基酸编号的aa1-209、aa210-436、aa437-708，GenBankAcc.No.NP_003256)。通过用对应小鼠氨基酸(小鼠TLR3，GenBankAcc.No.NP_569054，氨基酸211-437和438-709)替代人TLR3氨基酸210-436和437-708来产生MT5420嵌合蛋白。MT6251嵌合体通过用小鼠TLR3氨基酸(小鼠TLR3，GenBankAcc.No.NP_569054，氨基酸438-709)在位置437-708替代人氨基酸而产生。所有构造使用标准克隆步骤在pCEP4载体(LifeTechnologies，Carslbad，CA)中产生。蛋白在HEK293细胞中作为V5-His6C末端融合蛋白瞬时表达，并如实例1所述地被纯化。
mAbc1068.mAbc1068结合具有高亲和力的人TLR3ECD，但不会很好地结合到鼠类TLR3。c1068丧失其同时结合到MT5420和MT6251的能力，从而证明结合位点位于WT人TLR3蛋白的氨基酸437-708内。
mAb12QVQ/QSV.mAb12QVQ/QSV同时结合嵌合体，表明mAb12QVQ/QSV的结合位点位于具有SEQIDNO：2所示序列的人TLR3蛋白的氨基酸1-209内。
计算机模拟蛋白质-蛋白质对接mAb15EVQ的晶体结构(见下文)以及所公布的人TLR3结构(Bell等人，J.EndotoxinRes.12：375-378，2006)在CHARMm中能量最小化(Brooks等人，J.Computat.Chem.4：187-217，1983)，以用作对接的开始模型。蛋白质对接通过ZDOCKpro1.0(Accelrys，SanDiego，CA)进行，其相当于具有6度角形网格(angulargird)的ZDOCK2.1(Chen和Weng，Proteins51：397-408，2003)。人TLR3(Asn52、70、196、252、265、275、291、398、413、507和636)中已知的N联糖基化位点Asn残基(Sun等人，J.Biol.Chem.281：11144-11151，2006)通过ZDOCK算法中的能项阻断参与抗体-抗原复合物界面。2000种初始样态被输出并分成簇，并且对接样态被完善并在RDOCK中重新评分(Li等人，Proteins53：693-707，2003)。目测具有最高初始ZDOCK评分的200种样态和前200种RDOCK样态。
mAb15EVQ的结晶在20℃下通过蒸汽扩散方法进行(Benvenuti和Mangani，NatureProtocols2：1633-51，2007)。使用Hydra机器人在96孔板中建立初步筛选。实验由与0.5μl的储存溶液混合的0.5μl的蛋白溶液的小滴构成。小滴和90μl的储存溶液保持平衡。在20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4，包含50mMNaCl)中的Fab溶液使用AmiconUltra-5kDa细胞浓缩至14.3mg/ml。筛选通过WizardI&II(EmeraldBioSystems，BainbridgeIsland，WA)和内部结晶筛选来完成。
收集X射线衍射数据，并使用装配有OsmicTMVariMaxTM共焦光学器件、Saturn944CCD检测器和X-streamTM2000低温冷却系统(Rigaku，Woodlands，TX)的RigakuMicroMaxTM-007HF微焦距X射线发生器来处理。衍射强度通过270°晶体旋转检测，每半度图像为120s的曝光时间。X射线数据用程序D*TREK(Rigaku)进行处理。该结构使用程序Phaser或CNX(Accelrys，SanDiego，CA)通过分子置换法来确定。原子位置和温度因素使用分辨率范围(mAb15)和(mAb12)中的所有数据的REFMAC来进行完善。在使用3σ截止电平的(Fo-Fc)电子密度峰处添加水分子。所有结晶计算用CCP4程序套件(CollaborativeComputationalProject，Number4.1994.TheCCP4suite：programsforproteincrystallography.ActaCrystallogr.D50：760-763)来完成。模型调节使用程序COOT(Emsleyetal.，ActaCrystallogr.D60：2126-2132，2004)来进行。
mAb15EVQ的分辨晶体结构显示抗体结合位点的特征在于重链中多个带负电的残基(D52、D55、E99、D106和D109)。从而，mAb15EVQ和TLR3之间的识别最有可能涉及带正电的残基。所进行的蛋白质-蛋白质对接模拟认为涉及多个正电残基的TLR3上的两大块显示对抗体的良好互补性。TLR3-抗TLR3抗体模拟复合物的界面中TLR3上的残基是R64、K182、K416、K467、Y468、R488、R489和K493。
诱变研究单点突变和多点突变被引入上面辨别区域中TLR3ECD的表面残基，以包含mAb12和mAb15EVQ的表位，并测试突变蛋白的抗体结合。
使用标准方案来克隆编码人TLR3氨基酸1-703(ECD)的核苷酸序列(SEQIDNO：4；GenBankaccessionnumberNP_003256)。利用表5a所示的寡核苷酸，根据制造商的方案使用StrategeneQuickchangeIIXL试剂盒(Stratagene，SanDiego，CA)通过定点诱变产生所有的突变型。通过DNA顺序分析来验证突变型。蛋白在CMV启动子下表达为HEK293细胞中的C末端His-tag融合蛋白，并如实例1所述地被纯化。
表5a.用于定点诱变的寡核苷酸示出正义寡核苷酸的序列具有互补序列的反义寡核苷酸被用于诱变反应。
结合分析通过ELISA评价mAb12QVQ/QSV和mAb15EVQ结合到人TLR3的能力以及产生的变异体。为了加速此过程，所预测的mAb15EVQ结合位点中的突变型通过包含TLR3ECD突变型与mAb12QVQ/QSVC的C末端Histag的共转染共同表达在HEK细胞中，接着通过金属亲和层析来纯化。所回收的样本是TLR3突变型与mAb12的复合物。此方法是可行的，因为mAb12QVQ/QSV和mAb15EVQ结合位点彼此远离；并且因此，在一个位点的点突变不太可能影响在另一位点的表位。这些复合物被用于ELISA结合分析。5μl每孔的PBS中20μg/ml野生型TLR3ECD或突变蛋白包被在MSDHighBind板上(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)上。板在室温下孵育60分钟，并在4℃下在MSDBlockerA缓冲液(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)中过夜封闭。在第二天，洗涤板，并且在1.5小时内添加500pM至1pM浓度的MSDSulfo-tag标记的mAb15EVQ。在洗涤之后，使用MSDReadBufferT检测标记的抗体，并使用SECTORImager6000读取板。为了评价mAb12QVQ/QSV结合到人TLR3和变异体的能力，通过mAb15EVQ进行共同表达，并且除了检测抗体标记mAb12QVQ/QSV以外，如针对mAb15EVQ所述地结合ELISAs。
mAb12QVQ/QSV：如片段交换研究确定的，mAb12QVQ/QSV的结合位点定位在人TLR3蛋白的氨基酸1-209内。评价下面的TLR3突变型：D116R、N196A、N140A、V144A、K145E、K147E、K163E和Q167A。野生型TLR3和V144A突变型显示出类似的与mAb12QVQ/QSV的结合(图6A)。抗体不会结合到TLR3D116R突变型，并具有显著减少的对K145E突变型的结合亲和力。从而，在TLR3的表面上紧密并列的残基D116和K145被辨识为mAb12QVQ/QSV的关键表位位点(图7A)。
结合表位的mAb12QVQ/QSV的两个关键残基定位在TLR3外功能区的N端片段处dsRNA结合位点的表面附近(Pirher等人，NatureStruct.&Mol.Biol.，15：761-763，2008)。完整表位将在邻近区域中包含其他残基，其不会被所进行的突变分析所展现。不希望被约束到任何具体理论，据信，mAb12QVQ/QSV结合在其TLR3表位上会直接或间接妨碍dsRNA结合在TLR3胞外域上，从而干扰受体二聚化和下游信号转导通路的激活。
mAb15EVQ：评价下面的TLR3突变型：R64E、K182E、K416E、Y465A、K467E、R488E、R489E、N517A、D536A、D536K、Q538A、H539A、H539E、N541A、E570R、K619A、K619E、双重突变型K467E/Y468A、三重突变型T472S/R473T/N474S和三重突变型R488E/R489E/K493E。野生型TLR3、R64E、K182E、K416E突变型和三重突变型T472S/R473T/N474S显示出类似的与mAb15EVQ的结合(图6B和表5b)。抗体不会结合到TLR3突变型K467E、R489E、K467E/Y468A和R488E/R489E/K493E(图6B和图6C)。剩下的变异体显示与具有最大影响的R488E居间结合。所有这些突变型结合到mAb12QVQ/QSV。这些结果显示出残基K467和R489是mAb15EVQ表位的关键决定子。残基R488还构成表位。这些残基紧密并列在TLR3的同一表面上(图7A)。结果还显示全部在与K467、R488和R489相同表面上的残基Y465、Y468、N517、D536、Q538、H539、N541、E570和K619构成了表位。此结论被与mAb15EVQ的H/D交换研究所支持。图7A示出叠加在人TLR3结构上的mAb12QVQ/QSV和15EVQ(黑色)及C1068mAb(灰色)的结合表位位点。mAb15EVQ的表位涵盖残基Y465、K467、Y468、R488、R489、N517、D536、Q538、H539、N541、E570和K619。
H/D交换研究对于H/D交换而言，用于分析抗体扰动的步骤类似于先前所述的步骤(Hamuro等人，J.Biomol.Techniques14：171-182，2003；Horn等人，Biochemistry45：8488-8498，2006)，但有一些修改。重组TLR3ECD(由具有C末端His-tag的Sf9细胞表达并被纯化)在氘化水溶液中孵育预定时间，使得氘结合在可交换氢原子上。氘化TLR3ECD在含有固定化mAb15EVQ的柱上捕集，然后用含水缓冲液洗涤。将反向交换的TLR3ECD蛋白从柱洗脱，并用蛋白酶消化和质谱分析确定含氘片段的位置。作为参考对照，类似地处理TLR3ECD样本，不同之处在于，其仅在抗体柱上捕集之后接触氘化水，然后以与实验样本相同的方式进行洗涤和洗提。推断与抗体结合的区域为相对不会被交换的那些位点，因此这些区域与参考TLR3ECD样本相比含有较高比率的氘。约80％的蛋白可以映射到特异性肽。通过mAb15EVQ进行的TLR3ECD的H/D交换扰动的地图示于图7B。为清楚起见，仅示出被mAb15EVQ影响的那部分周围的TLR3片段。延伸到TLR3ECD的氨基和羧基端的蛋白的剩余部分不被显著地影响。
H/D交换研究将SEQIDNO：2的肽片断465YNKYLQL471，514SNNNIANINDDML526和529LEKL532辨识为TLR3上的交换通过结合到mAb15EVQ而特别改变的区域。理所当然，H/D交换是线性映射方法，并且通常不能限定肽片段内哪些残基最受抗体结合影响。然而，H/D交换和突变结果之间的扩大重叠使图7A所示的表面是mAb15的结合位点的置信度增加。这种结合位点处于与先前针对mAbc1068所述相同的线性氨基酸序列区域中(PCT公布号WO06/060513A2)，但发现与这些抗体之间缺少交叉竞争相符合，其定位在完全不重叠的表面(图7A)。
mAb15EVQ结合表位在空间上邻近TLR3上C末端片段处的dsRNA结合位点(Bell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)103：8792-8797，2006；Ranjith-Kumar等人，JBiolChem，282：7668-7678，2007；Liu等人，Science，320：379-381，2008)。不希望被约束到任何具体理论，据信，mAb15EVQ结合在其TLR3表位造成与配体dsRNA分子和/或二聚体配偶体的立体冲突，从而防止配体结合和配体诱发的受体二聚化。
表5b.
实例7
具有增强热稳定性的变异体的产生
进行基于结构的工程设计来产生具有增加热稳定性的抗体变异体，同时努力维持生物活性并最小化免疫原性。
选择用于工程设计的mAb15EVQ。为了最小化免疫原性，只追踪基于结构考虑预测为有益的胚系突变。使用BLAST搜索将mAb15EVQ的VL和VH序列(分别为SEQIDNO：41和SEQIDNO：216)与人胚系基因对准。对于VH和VL而言，分别地，所辨别的最接近胚系序列是GenBankAcc.No.AAC09093和X59318。辨别在胚系VH、VL和mAb15EVQVH和VL序列的那些之间存在下列差异：(VH)V34I、G35S、F50R、A61S和Q67H；(VL)G30S、L31S和A34N。所辨别的序列差异被映射到mAb15EVQ的晶体结构上，并且选择预测改变包装和界面相互作用的残基用于工程设计。基于抗体的晶体结构(参见实例6)，辨别使残基不稳定的潜在结构。(1)V34附近VH的核心中的小型封闭腔体。此腔体大得足以容纳略大的侧链，例如Ile。(2)VHCDR3的E99被掩埋在没有H键网络的VH/VL界面处。E99的带负电羧酸盐基团处于大体疏水的环境中，主要范德瓦尔斯(vdw)接触到邻近残基。掩埋带电基团通常是在能量方面不利的，因此具有不稳定的影响。(3)VH的F50是VH/VL界面残基。其芳族侧链体积大，因此可能对配对具有负面影响。计算Fv的H键和vdw包装网络，并在Pymol(www：//_pymol_org)中进行目测检查。通过Caver(Petrek等人，BMCBioinformatics，7：316，2006)计算掩埋在VH和VL域中的腔体。在Pymol中准备所有分子图形。使用QuickChangeIIXL定点诱变试剂盒(Stratagene，SanDiego，CA)、Change-IT多点突变定点诱变试剂盒(USBCorporation，Cleveland，OH)或QuickChangeII定点诱变试剂盒(Stratagene，SanDiego，CA)，利用标准克隆技术，对编码如实例3所述产生的Fab片段或IgG4全人抗体的表达载体进行突变。根据各个制造商的建议完成反应。为了进行验证而确定所获得克隆的序列，并且所得的工程设计变异体被称为mAb15-1-15-9。SEQIDNO的列表：对于CDR而言，轻链和重链的可变区以及mAb15EVQ及其工程设计变异体的全长重链和轻链示于表6。表7示出产生各变异体的引物。
表6.
通过免疫测定法评价ELISAmAbs15-1-15-9与TLR3的结合。人TLR3ECD(100μl的2μg/mlTLR3-ECD)在4℃下过夜结合到黑色Maxisorb板(eBioscience)。板被洗涤并封闭，并且稀释抗体以每孔50μl双份等分到孔上。板在室温下孵育2小时，轻轻地摇动。使用发光POD基片(RocheAppliedScience，Mannheim，Germany，目录号11582950001)和山羊抗人Fc：HRP(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA，目录号109-035-098)来检测结合的情况，并且在SpectraMax板读取器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)中读取板。
表7.
*p5069作为重链的单基因。p5069的可变区交换到p5070主链
在MicroCal’sAutoVP-capillaryDSC系统(MicroCal，LLC，Northampton，MA)上完成DSC实验，其中连续测量参照与样本细胞之间的温度差，并与动力单位校准。将样本以60℃/小时的加热速率从10℃加热到95℃。预扫描时间是15分钟，并且过滤时间为10秒。用于DSC实验的浓度约为0.5mg/ml。使用MicroCalOrigin7软件(MicroCal，LLC)完成所得热谱曲线的分析。
通过DSC测量所产生变异体的热稳定性(Tm)(表8)。抗体变异体与TLR3的结合比得上亲代抗体的情况。
表8.变异体熔融温度(TM)的一览表以及用于制造这些变异体的理论基础
实例8
替代抗TLR3抗体的产生
产生嵌合拮抗大鼠/小鼠抗小鼠TLR3抗体(本文称为mAb5429)用于评价对抑制各种体内模型中TLR3信号转导的作用，因为实例1产生的人化抗体不具有足够的特异性或对小鼠TLR3的拮抗剂活性。替代嵌合mAb5429以及其亲代大鼠抗小鼠TLR3抗体c1811在体外和体内抑制TLR3信号转导，并改善小鼠中若干疾病模型中的致病机制。
下面讨论的数据表明TLR3在诱导和维持有害炎症中的作用，并有助于理解TLR3拮抗剂和TLR3抗体拮抗剂的治疗用途的原理，例如急性和慢性炎性疾病，包括高细胞因子血症、哮喘和气道炎症、炎性肠疾病和类风湿性关节炎、病毒感染和II型糖尿病。
替代品mAb5429的产生
CD大鼠用使用常规方法产生的重组鼠类TLR3外功能区(seqIDNO：162的氨基酸1-703，GenBankAcc.No.NP_569054)进行免疫。显示对鼠类TLR3特异性抗体滴度的两只大鼠的淋巴细胞被融合到FO骨髓瘤细胞。辨别一组对鼠类TLR3起反应的单克隆抗体，并在测试在鼠类荧光素酶报告基因和鼠类胚胎成纤维细胞分析中的体外拮抗剂活性。选择用于进一步研究的杂交瘤细胞系C1811A。确定来自由杂交瘤分泌的mAbc1811的功能可变区基因的序列。克隆的重链和轻链可变区基因随后分别插入提供编码序列的质粒表达载体，用于使用常规方法产生被指定为mAb5429的嵌合大鼠/BalbCmulgG1κmAb。如实例3所述表达抗体。mAb5429重链和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQIDNO：164和SEQIDNO：163，并且重链和轻链全长序列分别示于SEQIDNO：166和SEQIDNO：165。mAbc1811的重链和轻链全长序列分别示于SEQIDNO：168和SEQIDNO：167。
mAb5429的表征
mAb5429的特征在于用于其对TLR3信号转导的中和能力的一组体外分析。下面描述了活性分析和结果。
鼠类荧光素酶报告基因分析
鼠类TLR3cDNA(SEQIDNO：161，GenBankAcc.No：NM_126166)通过PCR从鼠类脾脏cDNA(BDBiosciences，Bedford，MA)扩增，并使用标准方法克隆入pCEP4载体(LifeTechnologies，Carslbad，CA)。200μlHEK293T细胞在完全DMEM中以4×104细胞/孔的浓度在96孔白色透光底板中划板，并在第二天使用Lipofectamine2000(InvitrogenCorp.，Carslbad，CA)用于转染，利用30ngpNF-κB荧火虫荧光素酶(Stratagene，SanDiego，CA)或30ngpISRE荧火虫荧光素酶(BDBiosciences，Bedford，MA)、5ngphRL-TK控制海肾荧光素酶(PromegaCorp.，Madison，WI)报告基因质粒、1.5ng编码全长鼠类TLR3的pCEP4和13.5ng空pcDNA3.1载体(LifeTechnologies，Carslbad，CA)来使总DNA量达到50ng/孔。转染后24小时，在添加0.1或1μg/μl聚(I：C)之前，将细胞在新鲜的无血清DMEM中用抗鼠类TLR3抗体在37℃下孵育30分钟至1小时。使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI)在24小时后收获板。通过OPTIMA软件(BMGLabtechGmbH，Germany)，使用FLUOstarOPTIMA多检测读取器，测量相对光单位。通过用萤火虫相对光单位(RLU)除以RenillaRLU获得归一化值(荧光素酶比)。mAb5429以及其亲代mAbc1811和mAb15(表3a)以剂量依赖性方式减少聚(I：C)诱导的NF-kB和ISRE活化(图8A和图8B)，从而证明其拮抗TLR3活性的能力。对于mAb5249、mAB15和mAbc1811而言，在ISRE分析中测得的IC50分别是0.5、22和0.7μg/ml。
鼠类成纤维细胞(MEF)分析
从ArtisOptimus(Opti-MEFTMC57BL/6-0001)获得C57BL/6MEF细胞。将细胞在200μlMEF培养基(具有glutamax的DMEM、10％加热灭活FBS、1xNEAA和10μg/m庆大霉素)中以20,000细胞/孔在96孔平底板(BDFalcon)上划板。所有孵育在37℃/5％CO2下完成。在划板之后24小时，将mAb5429或mAbc1811添加到孔。将板用mAb孵育1小时，在其之后将1μg/ml的聚(I：C)添加在各孔中。在24小时孵育之后收集上清液。遵循制造商方案，使用bead试剂盒(InvitrogenCorp.，Carslbad，CA)检测CXCL10/IP-10来确定细胞因子水平。使用GraphPadPrism软件作图表示结果。两种抗体均以剂量依赖性的方式减少了聚(I：C)诱导的CXCL10/IP-10水平，从而证明这些抗体拮抗内源TLR3并抑制TLR3信号转导的能力(图9)。
流式细胞分析-表面染色法
C57BL/6和TLR3敲出(TLR3KO)(C57BL/6基底；雌性，8-12周龄，AceAnimals，Inc.)，每组10个，用1ml的3％巯基醋酸盐培养基(Sigma)腹腔内给药，并在96小时后，小鼠被安乐死，并且用10ml无菌PBS灌洗来自各只小鼠的腹膜。巯基醋酸盐引出的腹膜巨噬细胞再悬浮在PBS中，并且使用台盼蓝染色来评价细胞生存力。将细胞通过离心制成团块，并再悬浮在250μlFACS缓冲液(PBS-Ca2+-Mg2+，1％加热灭活FBS，0.09％叠氮化钠)中并保持在湿冰上。以10μg/106细胞使用CD16/32试剂(eBioscience)10分钟以封闭巨噬细胞上的Fc受体。以100μl中106细胞/孔分配细胞，以进行表面染色。以0.25μg/106细胞添加Alexa-Fluor647(分子探针)-标记的mAbc1811和mAb1679(不具有TLR3特异性的大鼠抗小鼠TLR3抗体，因此用作同种型对照)，并在黑暗中在冰上孵育30分钟。在250μl的FACS缓冲液中洗涤并再悬浮细胞。在获得FACSCalibur上的样本以检测死亡细胞群之前，在不超过30分钟的时间内，以5μl/孔添加生存力染剂7-AAD(BDBiosciences，Bedford，MA)。使用CellQuestPro软件通过FACSCalibur收集样本。FCSExpress被用来通过形成柱状图分析收集的数据。
通过流式细胞分析来评价mAbc1811与来自C57BL/6和TLR3KO小鼠的鼠类巯基醋酸盐引出的腹膜巨噬细胞的结合，以确定结合特异性。因为期望此嵌合抗体的小鼠Fc区有助于非特异性结合，所以mAb5429未被用于此分析。mAbc1811未显示出与TLR3KO巨噬细胞的结合，并表现出与C57BL/6腹膜巨噬细胞的细胞表面结合增强，从而表明mAb对TLR3的特异性(图10)。具有与mAbc1811相同结合区的mAb5429被认为具有与mAbc1811相同的结合特异性。
实例9
TLR3抗体拮抗剂防御TLR3介导的全身性炎症
模型
聚(I：C)诱导的全身性细胞因子/趋化因子模型被用作TLR3介导全身性炎症的模型。在此模型中，腹腔内递送的聚(I：C)(PIC)诱导部分TLR3介导的全身性细胞因子和趋化因子反应。
雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6基底，8-10周龄，AceAnimals，Inc.)在0.5mlPBS中以10、20或50mg/kg皮下给予mAb5429，在0.5mlPBS中以2、10或20mg/kg皮下给予mAbc1811或单独皮下给予0.5mlPBS(载体对照)。在抗体剂量给药后24小时，小鼠腹腔内给予0.1mlPBS中50μg聚(I：C)(Amersham目录号26-4732批号IH0156)。在聚(I：C)激发后1小时和4小时，收集球后血。从全血制备血清，并通过Luminex分析细胞因子和趋化因子的浓度。
结果
腹腔内递送的聚(I：C)诱发部分TLR3介导的全身性细胞因子和趋化因子反应，如由TLR3KO动物中明显减少的一组趋化因子和细胞因子的产生所证明的(表9A)。TLR3依赖性聚(I：C)诱导的介体在聚(I：C)激发后1小时是IL-6、KC、CCL2/MCP-1和TNF-α在聚(I：C)激发后4小时是IL-1α、CCL5/RANTES和TNF-α。mAbc1811和mAb5429都显著减少这些TLR3依赖性介体的水平，从而证明抗体在体内减少TLR3信号转导的能力(表9B)。表9中的数值示出六种动物/组±SEM中的平均细胞因子或趋化因子浓度(pg/ml)。这些数据表明，在诸如细胞因子风暴或致命性休克的病症中TLR3拮抗作用可以在减少过量的TLR3介导细胞因子和趋化因子水平方面具有有益效果。
表9A.
表9B.
实例10
TLR3抗体拮抗剂减少气道高反应性
模型
气道高反应性由聚(I：C)诱导。
雌性C57BL/6小鼠(12周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6基底，12周龄，AceAnimals，Inc.)用异氟烷进行麻醉，并且在50μl无菌PBS中若干剂量(10-100μg)的聚(I：C)进行臂内给药。小鼠接受聚(I：C)(或PBS)的三次给药，在每次给药之间有24小时休息期。在最后一次聚(I：C)(或PBS)给药后24小时，使用全身体积描记法(BUXCO系统)测量肺功能和对乙酰甲胆碱的气道高反应性。将小鼠放入全身体积描记器室中，并允许习惯于新环境至少5分钟。在基线读数之后，使小鼠接触增加剂量的雾化乙酰甲胆碱(Sigma，St.Louis，MO)。雾化乙酰甲胆碱给药2分钟，接着是5分钟数据采集期，然后在后续增加剂量乙酰甲胆碱激发之前是10分钟休息期。增加的气流阻力测得为增大暂停(EnhancedPause(Penh))，并表示为5分钟记录期的平均Penh值(BUXCO系统)。在肺功能测量后，小鼠被安乐死，并且肺被插管。通过将1ml的PBS注入肺部并回收流出物来完成支气管肺泡灌洗(BAL)。移除并冷冻肺组织。BAL流体被离心(1200rpm，10分钟)，并且在-80℃下收集并储存无细胞的上清液，待分析。细胞团块再悬浮在200μlPBS中，用于总细胞计数和分类细胞计数。遵照制造商方案和多路免疫测定试剂盒(Millipore，Billercia，MA)进行多路分析。
结果
前面的观察证明聚(I：C)的鼻内给药诱导TLR3介导的小鼠肺功能损伤，在基线处具有全身体积描记法(Buxco)中增加的增大暂停(PenH)测量和对烟雾状散开乙酰甲胆碱的增加反应性(气道高反应性的指示)(PCT公布No.WO06/060513A2)。这种肺功能的损伤与嗜中性粒细胞募集进肺以及肺中增加的促炎性细胞因子/趋化因子水平有关。在此研究中，通过在聚(I：C)激发之前以50mg/kg皮下地给药各个抗体，来评价聚(I：C)诱导的肺功能损伤中mAb1811和mAb5429的作用。
通过在聚(I：C)激发之前用TLR3抗体拮抗剂处理动物而显著减少TLR3介导的肺功能损伤。在抗TLR3抗体处理的动物中防止TLR3介导的基线PenH和对乙酰甲胆碱的气道敏感性的增加(图11)。另外，在抗TLR3抗体处理的动物中减少TLR3介导的嗜中性粒细胞募集进小鼠肺以及气道中趋化因子的产生。从采集的支气管肺泡灌洗流体(BALF)测量嗜中性粒细胞数量(图12)和CXCL10/IP-10水平(图13)。研究重复至少三次，得到类似的结果。图11、12和13所示的数据来自一个代表性研究。各个符号表示一只小鼠的数据点，并且水平条显示组平均值。在所用模型中，研究显示全身性给药的TLR3抗体拮抗剂到达肺部，减少TLR3介导的肺功能损伤、嗜中性粒细胞侵润进气道、趋化因子产生和呼吸道炎症。从而，TLR3拮抗剂在治疗或预防以气道高反应性为特征的呼吸性疾病中具有有益效果，所述呼吸性疾病例如是哮喘、变应性鼻炎、慢性阻塞性肺疾(COPD)和囊性纤维变性。
实例11
TLR3抗体拮抗剂预防炎性肠疾病
模型
DSS结肠炎模型被用作炎性肠疾病的模型。
雌性C57BL/6小鼠(＜8周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6基底；＜8周龄称重在16.5g和18g之间，AceAnimals，Inc.)在第1天开始供给γ射线辐照的食物。DSS(硫酸葡聚糖)(MPBiomedicals，Aurora，OH，目录号：160110；35-50kDa；18-20％硫，Lotno.8247J)在热压处理过的酸化饮用水中稀释到5％的最终浓度。DSS水给药5天，在其之后用淡水替换。在整个研究期间允许小鼠随意饮用水。所有水袋每天称重以记录耗水量。在第0天、第2天和第4天，用5mg/kg(0.1mlPBS中0.1mg)mAb5429、小鼠抗TNF-α抗体或PBS作为对照进行小鼠腹腔内剂量给药。在整个研究期间每天监视小鼠，并在第0天至第4天和第7天称重。小鼠在研究的第2天和第7天被安乐死。打开腹腔，并且上行结肠在其连接盲肠处被切断。收集结肠，并将其固定在10％中性缓冲福尔马林中。结肠被石蜡包埋，切片并进行H&E染色(QualtekMolecularLabs，SantaBarbara，CA)。通过兽医病理学家以随机方式完成结肠组织病理评估，如下面所述(PathoMetrix，SanJose，CA)。
组织病理学评价
评价两段大肠、结肠和直肠，并针对下列变化进行打分：(i)单细胞坏死；(ii)上皮溃疡；(iii)上皮脱皮；(iv)隐窝脓肿；(v)细胞增殖；(vi)隐窝细胞增殖；(vii)固有膜中肉芽组织形成；(viii)粘膜下层中肉芽组织；(ix)粘膜下层炎性细胞侵润进、占优势的嗜中性粒细胞；和(x)粘膜下层浮肿。
基于以下标准给予严重程度单一、全面的评分：
0-不存在
1-温和，病灶或偶尔发现
2-温和，多病灶
3-中等，仅在有限区域经常发现
4-严重，在多个区域或送检组织的延长部分发现
5-非常严重，延伸到送检组织的大部分
结果
先前的观察说明，在由DSS摄取诱导炎性肠疾病的模型中TLR3KO动物显示出与野生型小鼠相比明显减少的组织病理学(PCT公布。No.WO06/60513A2)，从而表明TLR3信号转导在此模型的致病机理中起作用。已报道共生细菌RNA或由坏死细胞释放的哺乳动物RNA可以充当内源配体以刺激TLR3信号转导(Kariko等人，Immunity23165-2311752005；Kariko等人，J.Biol.Chem.279：12542-125502004)，并且因此在DSS结肠炎模型中，消化道中内源配体的TLR3刺激会增强并维持炎症。
在用抗TLR3抗体治疗时，疾病严重程度在接触DSS的动物中得到改善，如通过化合物组织病理学评分评估的(图14)。图14作为水平条示出疾病严重程度评分的平均值、标准偏差和95％置信区间。当与未处理的的野生型动物相比时，在用抗TLR3抗体处理的野生型接触DSS的动物中观察到评分显著减少(p＜0.05)。使接触DSS的TLR3KO动物免受DSS诱导的变化。接收抗小鼠TNF-αmAb的接触DSS的动物在DSS模型未显示组织病理学的改善。因此，DSS模型可用于评价可能针对对抗TNF-α治疗不起反应的人类患者群体的疗法，并中和抗TLR3抗体会具有向对抗TNF-α治疗不起反应的患有炎性肠疾病的患者提供有益效果的潜能。
模型
T细胞转移模型被用作炎性肠疾病的模型。在此模型中，通过转移一组来自免疫感受态小鼠的缺调节性T细胞的原初T细胞而在SCID小鼠中诱导消化道炎症，所述T细胞攻击消化道粘膜中的抗原呈递细胞。
原初T细胞(CD4+CD45RB高T细胞)腹腔注入SCID接受者以诱导慢性结肠炎。给予小鼠PBS(腹腔内500μl/小鼠；载体对照)、mAb5429(腹腔内0.1mg/小鼠)、或抗TNF-α抗体(腹腔内0.05mg/小鼠；阳性对照)，其在T细胞转移之后48小时开始，然后在整个8周研究期间每周进行两次。在T细胞转移之后8周(或当小鼠损失其初始体重的＞15％时)，动物被安乐死，并且结肠被取出。结肠被固定、石蜡包埋并进行H&E染色。以随机方式定量评估组织病理学(细胞侵润进、隐窝脓肿、上皮侵蚀、杯形细胞消亡和肠壁增厚)。
结果
在用抗TLR3抗体处理时，在接收T细胞转移的动物中的疾病严重程度得到改善，如由与对照动物相比时组织病理学评分总和显著减少所评估的(p＜0.05)(图15A)。对于评分总和而言，评估隐窝脓肿、溃疡、嗜中性粒细胞通量、杯形细胞消亡、异常隐窝、固有膜炎症和透壁牵连。通过隐窝脓肿、溃疡和嗜中性粒细胞流入观察到显著减少(对于所有而言，p＜0.05)(图15B)。将抗TNF-α抗体以已知的剂量用作阳性对照以提供最佳有益效果。
使用炎性肠疾病的两种公知模型(DSS和T细胞转移模型)的研究证明全身递送的TLR3抗体拮抗剂到达消化道粘膜并减少通过两种不同致病机制诱导的胃肠道炎症。从而，TLR3拮抗剂对治疗炎性肠疾病(包括抗TNF-α-难治病例和胃肠道中其他免疫介导的病变)会是有益的。
实例12
TLR3抗体拮抗剂防御胶原诱发的关节炎
模型
胶原诱发的关节炎(CIA)模型被用作类风湿性关节炎的模型。
雄性B10RIII小鼠(6-8周龄，JacksonLabs)被分入每组15只的组(关节炎组)或每组4只的组(对照小鼠)。关节炎组用异氟烷进行麻醉，并在第0天和第15天给予II型胶原(ElastinProducts)和补充有结核分枝杆菌(Difco)的弗氏完全佐剂的注射。在第12天，患有发展中II型胶原关节炎的小鼠通过体重随机分成治疗组，并在第12天、第17天和第22天(d12、d17、d22)用mAb5429(25mg/kg)、阴性对照抗体CVAM(在小鼠中无已知特异性的重组mAb)(5mg/kg)或抗TNF-α抗体(5mg/kg，阳性对照)皮下(SC)剂量给药。另外，小鼠的对照组在第12-25天用载体(PBS)或地塞米松(0.5mg/kg，Dex，参考化合物)每天(QD)皮下(SC)治疗。从第12天至第26天每天观察动物。通过临床评分系统(下面示出)评价前爪和后爪。动物在研究第26天被安乐死，并以随机方式评估组织病理学(下面所述的评分系统)。效力评估基于动物体重和临床关节炎评分。所有动物幸存下来以研究终点。
前爪和后爪的临床评分标准
0-正常
1-后爪或前爪关节受影响或最小弥漫性红斑和溶胀
2-后爪或前爪关节受影响或温和弥漫性红斑和溶胀
3-后爪或前爪关节受影响或中度弥漫性红斑和溶胀
4-显著弥漫性红斑和溶胀，或＝4趾关节受影响)
5-全爪严重弥漫性红斑和严重溶胀，不能弯曲足趾)
患有II型胶原关节炎的小鼠关节的组织病理学评分方法
当对患有II型胶原关节炎损伤的小鼠的爪或踝关节进行评分时，考虑到变化的严重程度以及各个受影响关节的数量。当仅有爪或踝关节的1-3个关节而不是许多掌骨/跖骨/足趾或跗骨/胫跗关节受影响时，根据变化的严重程度对下面参数1、2或3的最高评分给予随机分配。如果涉及超过2个关节，则将下面的标准应用到最严重影响/大多数的关节。
使用第1-15天的AUC分析爪评分的临床数据，并计算对照的抑制百分比。
炎症
0-正常
1-受影响关节的滑膜和关节周组织中炎性细胞的最低侵润进
2-如果是瓜，限制到受影响关节的温和侵润进
3-如果是爪，限制到受影响关节的中度侵润进
4-影响大部分区域的显著侵润进，具有显著浮肿
5-严重扩散侵润进，具有严重浮肿
血管翳
0-正常
1-软骨和软骨下骨中血管翳的最低侵润进
2-温和侵润进，具有受影响关节中硬组织的边缘区破坏
3-温和侵润进，具有受影响关节中中度硬组织破坏
4-显著侵润进，具有关节结构(大多数关节)的显著破坏
5-严重侵润进，伴随关节结构(影响所有关节)的完全或几乎完全破坏
软骨损伤
0-正常
1-最低至温和的甲苯胺蓝染色消失，在受影响关节中没有明显软骨细胞消亡或胶原破坏
2-温和的甲苯胺蓝染色消失，在受影响关节中具有病灶温和(浅表)软骨细胞消亡和/或胶原破坏
3-中度的甲苯胺蓝染色消失，在受影响关节中具有多病灶中度(深达中部区域)软骨细胞消亡和/或胶原破坏
4-显著的甲苯胺蓝染色消失，在大多数关节中具有多病灶中度(深达深部区域)软骨细胞消亡和/或胶原破坏
5-严重的甲苯胺蓝染色消失，在所有关节中具有多病灶严重(深达潮标)软骨细胞消亡和/或胶原破坏
骨再吸收
0-正常
1-最低，具有小型再吸收区域，在低倍放大下不是非常明显，在受影响关节中少有破骨细胞
2-温和，具有更多再吸收区域，在低倍放大下不是很明显，在受影响关节中有更多破骨细胞
3-中度，具有髓质骨小梁和皮层质骨的明显再吸收，在皮质中没有全厚缺陷，一些髓质小梁消亡，在低倍放大下明显的损伤，在受影响关节中更多的破骨细胞
4-显著，皮层质骨中具有全厚缺陷，剩余皮层表面的剖面经常具有畸变，显著的髓质骨消亡，在受影响的大多数关节中许多破骨细胞
5-严重，皮层质骨中具有全厚缺陷，并且所有关节的关节构造破坏
结果
地塞米松(Dex)和抗小鼠TNF-α抗体被用作阳性对照，PBS被用作载体对照，并且CVAM被用作阴性对照抗体。在关节疾病发展期间，在研究的第12天开始所有处理。到研究第22天，载体处理的疾病对照动物的疾病发生率是100％。用载体或CVAM抗体处理的阴性对照组具有最高的临床评分。观察到用Dex(d18-d26，p＜0.05)、5mg/kg抗TNF-α抗体(d18-26，p＜0.05)或25mg/kgmAb5429(d18-d23和d25-d26，p＜0.05)处理组的明显减少的临床评分(图16)。表示为曲线下区域(AUC)的临床关节炎评分与载体对照相比通过用25mg/kgmAb5429(43％减少)、5mg/kg抗TNF-α抗体(52％)或Dex(69％)处理而显著减少。图17示出各组AUC的平均值和标准偏差。
同样评估治疗的组织病理学作用爪骨再吸收与载体对照相比通过用25mg/kgmAb5429(47％降低)处理而显著降低。用5mg/kg抗TNF-α抗体处理的阳性对照小鼠具有明显降低的爪炎症(33％)、软骨损伤(38％)和总计爪评分(37％)。用Dex的处理明显减少所有爪组织病理学参数(总计评分的73％减少)。
这些数据证明，TLR3抗体拮抗剂改善CIA模型中的临床和组织病理学疾病症状，并表明TLR3拮抗剂用于治疗类风湿性关节炎的用途。
实例14
TLR3抗体拮抗剂防御急性致命病毒感染
模型
甲型流感病毒激发模型被用作急性致命病毒感染的模型。
在第1天、第4天、第8天和第12天，雌性C57BL/6小鼠(12周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6基底；12周龄，ACEAnimals，inc.，每组15只小鼠)皮下剂量给药20mg/kgmAb5429或单独PBS给药。在第0天，小鼠用异氟烷进行麻醉，并在25μlPBS(相当于105.55CEID50)中甲型流感/PR/8/34病毒(ATCC，Rockland，MD，Lotno.218171)鼻内给药。在14天期间每天两次观察动物的体重的变化和存活率。临床评分系统被用来评价疾病进展的水平以及对应于甲型流感病毒治疗的微妙改善。
临床评分
0-正常，警觉和反应，没有疾病的可见病症
1-起皱皮毛，有或没有轻微减少的走动
2-起皱皮毛，行走时蜷缩姿势，不愿走动，呼吸困难
3-起皱皮毛，呼吸困难，共济失调，颤抖
4-起皱皮毛，轻刺而不能走动、无意识，触摸感觉寒冷
5-发现死亡
结果
在研究中评价存活率、每日临床评分和体重变化。当与用流感病毒接种的C57BL/6小鼠相比时，mAb5429给药(20mg/kg)的甲型流感感染的WT小鼠和未接收mAb5429的甲型流感感染的TLR3KO均显示存活率的统计学显著升高(分别地，p＜0.001和p＜0.01)，从而表明TLR3的拮抗作用或缺少可以防止流感诱发的死亡率(图18)。在接收20mg/kgmAb5429的组以及TLR3KO组中，临床评分显著减少(图19)。在流感病毒给药后14天期间，观察小鼠的体重。在用甲型流感病毒剂量给药的C57BL/6小鼠中，体重稳定减少。然而，用20mg/kgmAb5429剂量给药的C57BL/6小鼠和TLR3KO小鼠均显示相对于用流行性感冒病毒接种的WTC57BL/6小鼠明显更大的体重。这些结果显示，TLR3抗体拮抗剂减少急性致命流感病毒感染模型中的临床症状和死亡率，并表明TLR3拮抗剂可以在急性感染状态中提供对人的保护。
实例15
TLR3抗体拮抗剂改善高血糖症并减少血浆胰岛素水平
模型
饮食诱发的肥胖症(DIO)模型被用作高血糖症和胰岛素抵抗力和肥胖症的模型。
C57BL/6WT动物(大约3周龄，JacksonLabs)和TLR3KO动物(C57BL/6基底；大约3周龄，AceAnimals，Inc.)维持高脂肪饮食12至16周。TLR3KO和WTC57BL/6小鼠均用正常食物或由60.9％千卡脂肪和20.8％千卡碳水化合物组成的高脂肪饮食(PurinaTestDiet目录号58126)饲养。小鼠维持12：12小时日夜周期，随意饮食和进食。每周测量各组内每只小鼠的重量。第一周每周两次腹腔内给予mAb5429，接着每周一次剂量给药，共7周。在所指出的时间点，空腹球后血清样本被用于胰岛素测量。在第7周空腹过夜后，通过以1.0mg/克体重的葡萄糖腹腔内给药进行葡萄糖耐受性测试。另外，测量空腹胰岛素和葡萄糖水平。
使用下面的公式，基于空腹葡萄糖和胰岛素水平(12)，由公式确定HOMA-IR：HOMA-IR＝((空腹葡萄糖(mmol/l)×空腹胰岛素(mU/l))/22.5(Wallace等人，DiabetesCare27：1487-1495，2004)。使用葡萄糖氧化酶分析来确定空腹血糖(BG)。使用胰岛素大鼠/小鼠ELISA试剂盒(CrystalChem，目录号90060)确定空腹水平。
结果
在高脂肪饮食12-16周后，WTDIO动物高血糖且高胰岛素血。在用mAb5429处理后，葡萄糖耐受性在WTDIO动物中得到改善，但在TLR3KODIO动物中未得到改善。当与对照(仅PBS)相比时，在60分钟、90分钟、120分钟和180分钟，在葡萄糖激发后用mAb5429处理的动物中观察到显著减少的血糖水平(图21A)。当与未接收mAb的WTDIO小鼠相比时，在mAb5429处理的WTDIO动物中观察到AUC减少约21％。在用mAb5429处理的WTDIO动物中，空腹胰岛素水平也减少(图22)。在mAb5429处理后，TLR3KODIO动物在空腹胰岛素方面没有改善。内环境稳定模型评估(HOMA)分析表明用mAb5429处理的WTDIO动物中胰岛素敏感性改善，但在TLR3KODIO动物中没有改善。对于WTDIO、5mg/kg的WTDIOmAb5429和20mg/kg的WTDIOmAb5429而言，HOMA-IR值分别是14.0±9.8、8.7±4.9、9.0±3.0。在TLR3KODIO动物中没有观察到影响。
研究证明TLR3抗体拮抗剂改善胰岛素抵抗力，并在没有体重减轻的情况下减少DIO模型中的空腹葡萄糖，从而表明TLR3拮抗剂对治疗高血糖症、胰岛素抵抗力和II型糖尿病会是有益的。
实例16
TLR3抗体拮抗剂防御细菌和病毒诱导的炎性反应
试剂
从Dr.T.F.Murphy(BuffaloVAMedicalCenter，Buffalo，NY)获得患有细菌加重的COPD患者分离的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)菌株35。从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得人鼻病毒16，TCID(50)＝2.8×107/ml。
NTHi刺激分析
NHBE细胞(Lonza，Wakersville，MD)以1×105/孔接种在Microtest96孔组织培养板(BDBiosciences，Bedford，MA)中。在琼指板上生长16-20小时的NTHi以～2×108cfu/ml再悬浮在生长培养基中，用100μg/ml庆大霉素处理30分钟，并以～2×107/孔添加到含有NHBE的96孔板。在3小时后，移除上清液，并用具有或不具有抗体的新鲜生长培养基替换(0.08至50μg/ml最终浓度)。在24小时孵育之后，在Luminex100IS多路荧光分析器和读取器系统(LuminexCorporation，Austin，TX)中用Cytokine25-plexABbead试剂盒、人(包括IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL12p40p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、Eotaxin、RANTES和MCP-1)(LifeTechnologies，Carslbad，CA)一式三份分析细胞上清液中的细胞因子和趋化因子的存在情况。
鼻病毒刺激分析
NHBE细胞以1×105细胞/孔接种在Microtest96孔组织培养板(BDBiosciences，Bedford，MA)中。第二天，抗体(0.08至50μg/ml最终浓度)被添加到NHBE或BEAS-2B细胞，并孵育1小时，接着添加10μl/孔的鼻病毒。在额外的24小时孵育之后，通过如上所述的luminex测定来分析细胞上清液中的细胞因子和趋化因子。
结果
mAb15EVQ以剂量依赖性的方式抑制NTHi诱导的IP-10/CXCL10和RANTES/CCL5产生，而对照抗体(人IgG4(Sigma，St.Louis，MO))对NTHi刺激未显示出抑制作用(图23A)。mAb15EVQ还抑制鼻病毒诱导的CXCL10/IP-10和CCL5/RANTES产生(图23B)。
实例17
TLR3抗体拮抗剂抑制星形细胞中的炎性反应
方法
来自2个供体的正常人星形细胞(Lonza，Walkersville，MD)以75,000细胞/孔在24孔板上接种，并允许过夜附着。第二天，用200ng/ml聚(I：C)和/或10μg/mlmAb18处理星形细胞24小时。通过Luminex测量细胞因子。
结果
通过mAb18抑制聚(I：C)诱导的IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α，IFN-γ、CXCL9/MIG、CCL3/MIP-1a、CCL4、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10产生，如表10所示。
表10.
实例18
TLR3抗体拮抗剂抑制内皮细胞中的炎性反应
方法
将HUVEC细胞(Lonza，Walkersville，MD)在由Lonza推荐的含血清生长培养基中培养。将细胞再悬浮在无血清培养基(Lonza，Walkersville，MD)中，以3×105细胞/ml接种在96孔板中，并在37℃、5％的CO2下孵育24小时。以增加的浓度(1.5至100μg/ml)添加聚(I：C)(GEHealthcare，Piscataway，NJ)并在37℃下再孵育24小时。对于细胞因子抑制分析而言，将mAb15EVQ以各种浓度(0-50μg/ml)添加到细胞，并孵育30分钟，在其之后在24小时内添加20μg/ml聚(I：C)。收集细胞上清液，并使用人细胞因子30-plex试剂盒和LuminexMAP技术测量细胞因子水平(InvitrogenCorp.，Carslbad，CA)。为了测量sICAM-1表达，用20μg/ml聚(I：C)和各种浓度的mAb15EVQ(0.8-50μg/ml)处理HUVEC细胞。通过ELISA(R&Dsystems)分析细胞上清液的sICAM-1表达。使用CellTiterGlo试剂盒(Promega，Madison，WI)测量细胞生存力。
结果
HUVEC细胞响应于聚(I：C)产生以下细胞因子：IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-6、IL-7、CXCL8/IL-8、IL-12(p40/p70)、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CXCL10/IP-10、CCL5/RANTES、CCL2/MCP-1、VEGF、G-CSF、FGF-basic和HGF(表11)。mAb15EVQ剂量依赖性地减少由聚(I：C)诱导的所有细胞因子的水平(表12)。mAb15EVQ减少聚(I：C)诱导的TNF-α、CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10产生的能力表明TLR3介导活性的抑制可以防御会导致动脉硬化症的白血球和T细胞侵润进。同样，通过mAb15EVQ抑制VEGF表明由VEGF介导的病变(包括在各种癌症中的血管发生和眼病例如年龄相关黄斑变性)中TLR3封闭的潜在有益效果。
TNF-α和IFN-γ在白血球募集中起作用，并增加活化内皮上黏着分子的表达(Doukas等人，Am.J.Pathol.145：137-47，1994；Pober等人，Am.J.Pathol.133：426-33，1988)。CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10与单核细胞和T细胞募集有关，并有助于动脉硬化症的发展(Lundgerg等人，Clin.Immunol.2009)。通过内皮细胞生成VEGF与在血管生成期间各种癌症中的异常组织生长或肿瘤有关(Livengood等人，Cell.Immunol.249：55-62，2007)。
可溶细胞间黏着分子1(sICAM-1)通过溶蛋白性裂解而生成，并为内皮细胞活化的标记物。ICAM-1在白细胞游出和活化中起关键作用，并在炎症期间上游调控内皮细胞和上皮细胞，其中ICAM-1介导经由整联蛋白分子LFA-1和Mac-1附着到白细胞。聚(I：C)活化内皮细胞以上游调控sICAM-1表达，并且该上游调控通过用mAb15EVQ处理而减弱(图24A)。
表11.
聚(I：C)μg/ml IL-6 CXCL8/IL-8 CCL2/MCP-1
10 848.8+50.9 12876.0+2314.0 11813.4+1420.9
5 751.3+2.1 11363.7+108.2 11365.7+113.1
2.5 607.1+91.6 10961.5+2200.7 11607.3+2155.7
1.25 419.2+178.4 9631.5+3675.8 11690.9+3189.9
0.63 263.8+81.4 6231.9+1568.0 9075.6+1152.2
0.31 183.5+168.3 5257.9+1855.0 8106.8+1193.1
0.16 111.9+72.5 4057.6+1127.4 6619.8+1728.2
无聚(I：C) 0.00 1286.6+300.8 1360.1+245.4
聚(I：C)μg/ml IL-2R IL-15 IL-17
100 784.4+45.4 61.3+12.5 43.8+5.3
50 718.6+56.8 61.3+12.5 47.6+0
25 735.7+23.4 56.7+18.9 58.3+4.9
12.5 650.5+29.8 38.8+6.5 39.8+10.9
6.25 643.4+39.9 34.2+0 32.1+0
3.13 681.8+24.3 38.8+6.5 43.8+5.3
1.56 578.6+10.5 29.4+6.7 36.1+5.653 -->
无聚(I：C) 0.0 0.0 0.0
聚(I：C)μg/ml IFNα CXCL10/IP-10 CCL4/MIP-1β
100 50.7+0 3803.1+185.5 234.5+19.7
50 44.9+1.7 2235.9+184.6 291.6+41.8
25 46.1+0 2403.0+271.9 278.7+4.7
12.5 41.2+3.5 2185.4+64.9 243.8+63.4
6.25 36.1+0 2100.0+288.1 201.9+46.2
3.13 40.0+1.8 3553.2+197.1 191.5+20.8
1.56 42.5+1.7 2064.3+242.1 165.3+16.3
无聚(I：C) 0.0 0.0 0.0
表12.
这表明TLR3抗体拮抗剂会抑制白血球运输，从而抑制由炎性细胞流入造成的组织损伤。
对于生存力测定而言，HUVEC被培养、接种并用聚(I：C)刺激，如上所述。mAb15EVQ剂量依赖性地恢复聚(I：C)诱导的HUVEC细胞生存力减少(图24B)。
内皮细胞活化的下行性调节可以抑制过量的免疫细胞侵润进，并减少由在炎性疾病期间增加的细胞因子造成的组织损伤。炎症、细胞因子的过表达和内皮细胞上的黏着分子是发展动脉硬化症和高血压的关键促成因素。这些数据为探究用于包括血管炎和那些特征性内皮机能障碍在内的血管疾病的TLR3拮抗剂的潜在有益效果提供理论基础。被炎症和过表达的细胞因子影响的另一疾病是在免疫抑制和HIV感染的个体中常见的并由卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)引起的卡波西氏肉瘤(KS)。VEGF和细胞因子产生有助于KS细胞的存活率(Livengood等人，CellImmunol.249：55-62，2007)。TLR3拮抗剂在减少与KS和其他肿瘤有关的生成血管的风险以及在预防细胞生存力损失和保护内皮屏障完整性以防止脉管渗漏(一种与器官衰竭和危及生命炎性疾病例如败血病有关的潜在严重病症)方面会是有益的。TLR3拮抗作用在病毒感染方面也会是有益的，所述病毒感染涉及内皮细胞病变，例如由黄病毒科(如，登革热、黄热病)、纤丝病毒科(埃博拉病毒、马尔堡病)、本扬病毒科(如，汉坦病毒、内罗病毒、白蛉病毒属)和沙粒病毒科(如，卢约、拉沙、阿根廷、玻利维亚、委内瑞拉出血热)家族的成员引起的病毒出血热(Sihibamiya等人，Blood113：714-722，2009)。
实例19
TLR3抗体拮抗剂与短尾猴和鼠类TLR3的交叉反应性
使用ISRE报告基因分析来评估对短尾猴或鼠类TLR3的活性，如实例2所述。从全血扩增短尾猴(SEQIDNO：217)和鼠类TLR3cDNA(SEQIDNO：161)，并克隆进pCEP4载体(Clontech)，并如上所述地表达。与在人TLR3NF-kB和ISRE分析中分别0.44和0.65μg/ml的IC50相比，在cynoNF-κB和ISRE分析中，mAb15EVQ分别具有4.18μg/ml和1.74μg/ml的IC50。同种型对照抗体在这些分析中没有效果。

Claims (43)

1.一种分离的抗体或其片段，其中所述抗体结合至少一个toll样受体3(TLR3)氨基酸残基，所述残基选自SEQIDNO:2的残基K467、R488和R489。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或片段，其中所述TLR3氨基酸残基选自：
a.SEQIDNO:2的残基K467；
b.SEQIDNO:2的残基R489；
c.SEQIDNO:2的残基K467和R489；以及
d.SEQIDNO:2的残基K467、R488和R489。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体或片段，其中所述抗体还结合至少一个TLR3氨基酸残基，所述残基选自SEQIDNO:2的残基Y465、Y468、N517、D536、Q538、H539、N541、E570和K619。
4.一种分离的抗体或其片段，其中所述抗体结合至少一个TLR3氨基酸残基，所述残基选自SEQIDNO:2的残基D116和K145。
5.根据权利要求3所述的分离的抗体或片段，其中所述TLR3氨基酸残基选自：
a.SEQIDNO:2的残基D116；
b.SEQIDNO:2的残基D116和K145。
6.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，其中所述抗体具有以下性质中的至少一种：
a.以<1μg/ml在体外聚(I:C)NF-кB报告基因分析中减少人TLR3生物活性>50%；
b.以<10μg/ml抑制>60%由用<100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞产生的IL-6或CXCL10/IP-10；
c.以<0.4μg/ml抑制>50%由用<100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞产生的IL-6或CXCL10/IP-10；
d.以<5μg/ml抑制>50%由用62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞产生的IL-6；
e.以<1μg/ml抑制>50%由用62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞产生的IL-6；
f.以<1μg/ml抑制>20%由PBMC产生的聚(I:C)诱导的IFN-γ、IL-6或IL-12；
g.以IC50<10μg/ml在体外NF-kB报告基因分析中抑制短尾猴TLR3生物活性；或
h.以IC50<5μg/ml在体外ISRE报告基因分析中抑制短尾猴TLR3生物活性。
7.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，所述抗体或片段与单克隆抗体竞争TLR3结合，所述单克隆抗体包含：
a.SEQIDNO:214的重链可变区；或
b.SEQIDNO:211的轻链可变区；或
c.SEQIDNO:214的重链可变区和SEQIDNO:211的轻链可变区；或
d.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链互补决定区(CDR)1、2和3（HCDR1、HCDR2和HCDR3）氨基酸序列；或
e.如SEQIDNO:67、68和78所示的轻链互补决定区(CDR)1、2和3（LCDR1、LCDR2和LCDR3）氨基酸序列；或
f.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列和如SEQIDNO:67、68和78所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
g.与具有SEQIDNO:214的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的重链可变区；或
h.与具有SEQIDNO:211的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的轻链可变区。
8.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，所述抗体或片段包含重链可变区和轻链可变区二者并且其中所述抗体包含：
a.如SEQIDNO:61、192和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:192的HCDR2进一步如式（I）所示定义：
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S，
(I)
其中
Xaa6可以是Arg或Lys；
Xaa7可以是Tyr、His或Ser；
Xaa8可以是Met、Arg或Tyr；并且
Xaa9可以是Lys或Arg；或
b.如SEQIDNO:55、56和191所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:191的LCDR3进一步如式（II）所示定义：
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V，
(II)
其中
Xaa1可以是Ala、Gln、Gly或Ser；
Xaa2可以是Gly、Glu或Ser；
Xaa3可以是Asp或Asn；
Xaa4可以是Glu或Ser；并且
Xaa5可以是Phe、Ala或Leu；或
c.如SEQIDNO:61、192和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:192的HCDR2进一步如式（I）所示定义：
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S，
(I)
其中
Xaa6可以是Arg或Lys；
Xaa7可以是Tyr、His或Ser；
Xaa8可以是Met、Arg或Tyr；并且
Xaa9可以是Lys或Arg；并且
如SEQIDNO:55、56和191所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:191的LCDR3进一步如式（II）所示定义：
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V，
(II)
其中
Xaa1可以是Ala、Gln、Gly或Ser；
Xaa2可以是Gly、Glu或Ser；
Xaa3可以是Asp或Asn；
Xaa4可以是Glu或Ser；并且
Xaa5可以是Phe、Ala或Leu；或
d.如SEQIDNO:70、194和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:194的HCDR2进一步如式（III）所示定义：
I-I-Q–Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S，
(III)
其中
Xaa15可以是Lys、Thr或Ile；
Xaa16可以是Asn或Asp；并且
Xaa17可以是Val或Leu；或
e.如SEQIDNO:67、68和193所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:193的LCDR3进一步如式（IV）所示定义：
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V，
(IV)
其中
Xaa10可以是Gln或Ser；
Xaa11可以是Thr、Glu或Asp；
Xaa12可以是Val或Asn；
Xaa13可以是Tyr或Phe；并且
Xaa14可以是Ser、Asn或Gln；或
f.如SEQIDNO:70、194和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:194的HCDR2进一步如式（III）所示定义：
I-I-Q–Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S，
(III)
其中
Xaa15可以是Lys、Thr或Ile；
Xaa16可以是Asn或Asp；并且
Xaa17可以是Val或Leu；并且
如SEQIDNO:67、68和193所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:193的LCDR3进一步如式（IV）所示定义：
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V，
(IV)
其中
Xaa10可以是Gln或Ser；
Xaa11可以是Thr、Glu或Asp；
Xaa12可以是Val或Asn；
Xaa13可以是Tyr或Phe；并且
Xaa14可以是Ser、Asn或Gln；
g.如SEQIDNO:82、196和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:196的HCDR2进一步如式（V）所示定义：
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G，
(V)
其中
Xaa24可以是Phe或Arg；并且
Xaa25可以是Ala或Ser；或
h.如SEQIDNO:79、80和195所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:195的LCDR3进一步如式（VI）所示定义：
Q-Q–Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T，
(VI)
其中
Xaa18可以是Tyr、Gly或Ala；
Xaa19可以是Gly、Glu或Asn；
Xaa20可以是Ser或Thr；
Xaa21可以是Val、Ile或Leu；
Xaa22可以是Ser或Leu；并且
Xaa23可以是Ile、Ser、Pro或Tyr；或
i.如SEQIDNO:82、196和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:196的HCDR2进一步如式（V）所示定义：
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G，
(V)
其中
Xaa24可以是Phe或Arg；并且
Xaa25可以是Ala或Ser；并且
j.如SEQIDNO:79、80和195所示的轻链CDR1、2和3，其中SEQIDNO:195的LCDR3进一步如式(VI)所示定义：
Q-Q–Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T，
(VI)
其中
Xaa18可以是Tyr、Gly或Ala；
Xaa19可以是Gly、Glu或Asn；
Xaa20可以是Ser或Thr；
Xaa21可以是Val、Ile或Leu；
Xaa22可以是Ser或Leu；并且
Xaa23可以是Ile、Ser、Pro或Tyr。
9.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，所述抗体或片段包含重链可变区和轻链可变区二者，并且其中所述抗体包含：
a.SEQIDNO:10的重链可变区；或
b.SEQIDNO:9的轻链可变区；或
c.SEQIDNO:10的重链可变区和SEQIDNO:9的轻链可变区；或
d.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；或
e.如SEQIDNO:67、68和69所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
f.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列和如SEQIDNO:67、68和69所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
g.与具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的重链可变区；或
h.与具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的轻链可变区。
10.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，所述抗体或片段包含重链可变区和轻链可变区二者，并且其中所述抗体包含：
a.SEQIDNO:214的重链可变区；或
b.SEQIDNO:211的轻链可变区；或
c.SEQIDNO:214的重链可变区和SEQIDNO:211的轻链可变区。
11.一种可与TLR3反应的分离的抗体或片段，所述抗体或片段包含重链可变区和轻链可变区二者，并且其中所述抗体包含：
a.SEQIDNO:36的重链可变区；或
b.SEQIDNO:35的轻链可变区；或
c.SEQIDNO:36的重链可变区和SEQIDNO:35的轻链可变区；或
d.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；或
e.如SEQIDNO:67、68和78所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
f.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列和如SEQIDNO:67、68和78所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；或
g.与具有SEQIDNO:36的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的重链可变区；或
h.与具有SEQIDNO:35的氨基酸序列的可变区具有至少95%同一性的轻链可变区。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段，其中所述抗体是全人的。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段，其中所述抗体或片段是人适应的。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段，其中所述抗体缀合至聚乙二醇。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段，其具有IgG4同种型。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段，其中Fc域包含S229P、P235A或L236A突变。
17.一种药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体或片段以及药用载体。
18.一种编码抗体重链的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的CDR氨基酸序列：
a.如SEQIDNO:61、192和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:192的HCDR2进一步如式（I）所示定义：
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S
其中
Xaa6可以是Arg或Lys；
Xaa7可以是Tyr、His或Ser；
Xaa8可以是Met、Arg或Tyr；并且
Xaa9可以是Lys或Arg；
b.如SEQIDNO:70、194和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:194的HCDR2进一步如式（III）所示定义：
I-I-Q–Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S
其中
Xaa15可以是Lys、Thr或Ile；
Xaa16可以是Asn或Asp；并且
Xaa17可以是Val或Leu；
c.如SEQIDNO:82、196和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:196的HCDR2进一步如式（V）所示定义：
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G
其中
Xaa24可以是Phe或Arg；并且
Xaa25可以是Ala或Ser；
d.如SEQIDNO:52、88和54所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
e.如SEQIDNO:58、64和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
f.如SEQIDNOs:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
g.如SEQIDNO:82、83和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
h.如SEQIDNO:46、47和48所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
i.如SEQIDNO:52、53和54所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
j.如SEQIDNO:58、59和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
k.如SEQIDNO:61、62和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
l.如SEQIDNO:61、64和60所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
m.如SEQIDNO:70、71和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
n.如SEQIDNO:70、73和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
o.如SEQIDNO:70、75和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
p.如SEQIDNO:70、77和72所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
q.如SEQIDNO:82、83和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
r.如SEQIDNO:82、86和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
s.如SEQIDNO:111、114和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
t.如SEQIDNO:115、112和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
u.如SEQIDNO:116、112和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
v.如SEQIDNO:111、117和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
w.如SEQIDNO:116、118和84所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；
x.如SEQIDNO:116、112和119所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列；并且
y.如SEQIDNO:116、118和119所示的重链CDR1、2和3氨基酸序列。
19.一种编码抗体轻链的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的CDR氨基酸序列：
a.如SEQIDNO:55、56和191所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:191的LCDR3进一步如式（II）所示定义：
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V，
(II)
其中
Xaa1可以是Ala、Gln、Gly或Ser；
Xaa2可以是Gly、Glu或Ser；
Xaa3可以是Asp或Asn；
Xaa4可以是Glu或Ser；并且
Xaa5可以是Phe、Ala或Leu；或
b.如SEQIDNO:67、68和193所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:193的LCDR3进一步如式（IV）所示定义：
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V，
(IV)
其中
Xaa10可以是Gln或Ser；
Xaa11可以是Thr、Glu或Asp；
Xaa12可以是Val或Asn；
Xaa13可以是Tyr或Phe；并且
Xaa14可以是Ser、Asn或Gln；或
c.如SEQIDNO:79、80和195所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列，其中SEQIDNO:193的LCDR3进一步如式（VI）所示定义：
Q-Q–Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T，
(VI)
其中
Xaa18可以是Tyr、Gly或Ala；
Xaa19可以是Gly、Glu或Asn；
Xaa20可以是Ser或Thr；
Xaa21可以是Val、Ile或Leu；
Xaa22可以是Ser或Leu；并且
Xaa23可以是Ile、Ser、Pro或Tyr；或
d.如SEQIDNO:49、50和51所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
e.如SEQIDNO:55、56和57所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
f.如SEQIDNO:67、68和69所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
g.如SEQIDNO:79、80和89所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
h.如SEQIDNO:43、44和45所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
i.如SEQIDNO:49、50和51所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
j.如SEQIDNO:55、56和57所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
k.如SEQIDNO:55、56和63所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
l.如SEQIDNO:55、56和65所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
m.如SEQIDNO:55、56和66所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
n.如SEQIDNO:67、68和69所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
o.如SEQIDNO:67、68和74所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
p.如SEQIDNO:67、68和76所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
q.如SEQIDNO:67、68和78所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
r.如SEQIDNO:79、80和81所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
s.如SEQIDNO:79、80和85所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
t.如SEQIDNO:79、80和87所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
u.如SEQIDNO:109、110和113所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；
v.如SEQIDNO:120、110和113所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列；以及
w.如SEQIDNO:121、110和113所示的轻链CDR1、2和3氨基酸序列。
20.一种编码抗体重链的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。
21.一种编码抗体轻链的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210或211所示的氨基酸序列。
22.一种分离的抗体重链，所述抗体重链包含SEQIDNO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。
23.一种分离的抗体轻链，所述抗体轻链包含SEQIDNO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210或211所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗有需要的患者中炎性疾病的药物中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病影响选自如下的组织：呼吸道、肺、胃肠道、小肠、大肠、结肠、直肠、心血管系统、心脏组织、血管、关节、骨和滑液组织、软骨、上皮、内皮、肝或脂肪组织。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病与增加的TLR3介导的嗜中性粒细胞侵润进所述组织有关。
27.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病是炎性肺部疾病。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述炎性肺部疾病是哮喘或慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
29.根据权利要求27所述的用途，其中所述炎性肺部疾病由不可分型的流感嗜血杆菌诱发。
30.根据权利要求27所述的用途，其中所述炎性肺部疾病是气道高反应性。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述气道高反应性与哮喘、过敏性鼻炎、COPD或囊性纤维变性相关。
32.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病是炎性肠疾病。
33.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病与胃肠溃疡相关。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述胃肠溃疡与传染性结肠炎、缺血性结肠炎、胶原性或淋巴细胞性结肠炎或坏死性小肠结肠炎相关。
35.根据权利要求24所述的用途，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
37.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗或预防有需要的患者中全身性炎性疾病的药物中的用途。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述全身性炎性疾病是细胞因子风暴或高细胞因子血症、全身炎性反应综合征(SIRS)、移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征（SARS）、灾难性抗磷脂抗体综合征、严重病毒感染、流行性感冒、肺炎、休克或败血病。
39.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗有需要的患者中II型糖尿病的药物中的用途。
40.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗有需要的患者中高血糖症的药物中的用途。
41.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗有需要的患者中高胰岛素血症的药物中的用途。
42.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗体在制备用于治疗或预防有需要的患者中病毒感染的药物中的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述病毒感染是甲型流感病毒感染。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136231A (zh) * 2018-09-14 2019-01-04 苏州大学 一种翘嘴鳜tlr3基因及其应用

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130090457A1 (en) * 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
PE20110808A1 (es) 2008-10-31 2011-10-31 Janssen Biotech Inc Anticuerpos contra el receptor 3 de tipo toll
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
CA2760525A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Mark Cunningham Toll-like receptor 3 antagonists
EP2451844B1 (en) 2009-07-10 2015-04-22 Innate Pharma Tlr3 binding agents
WO2012095432A2 (en) 2011-01-12 2012-07-19 Innate Pharma Tlr3 binding agents
CN104159610A (zh) * 2011-09-12 2014-11-19 詹森生物科技公司 用于治疗代谢和心血管疾病的3型toll样受体拮抗剂
WO2013178736A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Innate Pharma Tlr3 binding agents
EP3560960A1 (en) * 2013-04-22 2019-10-30 The University of Tokyo Preventive or therapeutic agent for inflammatory disease
US9198898B2 (en) 2013-06-24 2015-12-01 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
US8906951B1 (en) 2013-06-24 2014-12-09 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
WO2015016282A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 国立大学法人東京大学 放射線誘導性消化管症候群の予防又は治療用医薬組成物
GB201522394D0 (en) * 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JOP20170013B1 (ar) 2016-01-22 2021-08-17 Merck Sharp & Dohme أجسام xi مضادة لعامل مضاد للتجلط
BR112018075858A2 (pt) 2016-06-14 2019-04-02 Merck Sharp & Dohme Corp. anticorpos anti-fator xi de coagulação
WO2018165270A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Newtonoid Technologies, L.L.C. Modular elongate wall-mounted sensor system and method
WO2023235771A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 The University Of Chicago Chemical screen of modulators for vaccine adjuvants

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1824514A2 (en) * 2004-11-30 2007-08-29 Centocor, Inc. Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
JP2005505284A (ja) * 2001-10-05 2005-02-24 コリー ファーマスーティカル ゲーエムベーハー Ｔｏｌｌ様受容体３シグナリングアゴニストおよびアンタゴニススト
JP2004016021A (ja) * 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
EA200600069A1 (ru) * 2003-06-20 2006-08-25 Коли Фармасьютикал Гмбх Низкомолекулярные антагонисты toll-подобных рецепторов (tlr)
CA2483732A1 (en) 2004-09-29 2006-03-29 Ronan Le Goffic Toll-like receptor 3, its signalling associated molecule trif and their use thereof
SG158098A1 (en) * 2004-11-30 2010-01-29 Centocor Inc 22 30 74 Date Of Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses
ES2435775T3 (es) * 2005-10-27 2013-12-23 Janssen Biotech, Inc. Moduladores de receptor tipo Toll 3, procedimientos y usos
JP2010520284A (ja) * 2007-03-05 2010-06-10 ユタ ステイト ユニバーシティ Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の限定アゴニスト
JP2010527633A (ja) * 2007-05-25 2010-08-19 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３モジュレーター及びその使用
US8273541B2 (en) * 2008-09-17 2012-09-25 Innate Pharma Compositions and methods for detecting TLR3
CA2739083C (en) * 2008-10-02 2018-05-01 Centocor Ortho Biotech Inc. Translocation interfering toll-like receptor 3(tlr3) variants for suppressing toll-like receptor activity and uses thereof
PE20110808A1 (es) 2008-10-31 2011-10-31 Janssen Biotech Inc Anticuerpos contra el receptor 3 de tipo toll
US20100188778A1 (en) * 2009-01-29 2010-07-29 Castagna Joseph T Disk Drive Assembly Having Flexible Support for Flexible Printed Circuit Board
CA2760525A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Mark Cunningham Toll-like receptor 3 antagonists
EP2451844B1 (en) * 2009-07-10 2015-04-22 Innate Pharma Tlr3 binding agents

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1824514A2 (en) * 2004-11-30 2007-08-29 Centocor, Inc. Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RANJITH-KUMAR C.T.等: "Biochemical and functional analyses of the human toll-like receptor 3 ectodomain", 《J. BIOL. CHEM.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136231A (zh) * 2018-09-14 2019-01-04 苏州大学 一种翘嘴鳜tlr3基因及其应用
CN109136231B (zh) * 2018-09-14 2019-08-30 苏州大学 一种翘嘴鳜tlr3基因及其应用

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