MX2011004635A - Antagonistas de los receptores tipo toll 3. - Google Patents

Antagonistas de los receptores tipo toll 3.

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Mateo Lani San
Raymond Sweet
Robert Rauchenberger
Yiqing Feng
Katharine Heeringa
Jinquan Luo
Fang Teng
Teplyakov Alexey
Sheng-Jiun Wu
Robert T Sarisky
Mark Rutz
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Centocor Ortho Biotech Inc
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Abstract

Se describen anticuerpos antagonistas del receptor 3 tipo Toll (TLR3), polinucleótidos que codifican los anticuerpos antagonistas de TLR3 o fragmentos de los mismos, y métodos para hacer y utilizar los anteriores.

Description

ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES TIPO TOLL 3 Esta aplicación reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número 61/109974, registrada el 31 de octubre de 2008 y la solicitud provisional de Estados Unidos número 61/161860, registrada el 20 de marzo de 2009 y la solicitud provisional de Estados Unidos número 61/165100, registrada el 31 de marzo de 2009 y la solicitud provisional de Estados Unidos número 61/173686, registrada el 29 de abril de 2009, todo el contenido de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con antagonistas polinucleótidos del receptor tipo toll 3 (TLR3) de un anticuerpo que codifican los antagonistas del anticuerpo TLR3 o fragmentos de los mismos, y métodos para su fabricación y utilización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores tipo toll (TLR) regulan la activación de la respuesta inmune innata e influyen en el desarrollo de la inmunidad adaptativa, iniciando cascadas de transducción de señales en respuesta a ligandos bacteriales, virales, parasitarios y en algunos casos derivados de acogida (Lancaster y otros., J. Physiol. 563:945-955, 2005). La membrana plasmática localizada de los TLR, TLR1 , TLR2, TLR4 y TLR6 reconoce ligandos que incluyen los componentes de proteínas o lípidos de bacterias y hongos. Los TLR predominantemente intracelulares, TLR3, TLR7 y TLR9 responden a dsRNA, ssRNA y CpG no metilados de ADN, respectivamente. La desregulación de la señalización TLR se cree que causa una multitud de problemas y las estrategias terapéuticas son en desarrollo hacia este eje.(Hoffman y otros, Nat. Rev. Drug Discov. 4:879-880, 2005; Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006; Wickelgren, Science 312:184-187, 2006). Por ejemplo, los antagonistas de TLR4 y TLR 7 y 9 están en desarrollo clínico para la sepsis severa y el lupus, respectivamente (Kanzler y otros, Nat. Med. 13:552-559, 2007).
La señalización de TLR3 se activa por dsRNA, mRNA o RNA liberado de las células necróticas durante la inflamación o la infección por el virus. La activación de TLR3 induce la secreción de interferón y atocina pro-inflamatorias y desencadena la activación de células inmunes y el reclutamiento que son protectoras durante ciertas infecciones microbianas. Por ejemplo, un alelo dominante negativo TLR3 se ha asociado con una mayor susceptibilidad a la encefalitis por herpes Simplex tras la infección primaria por el HSV-1 en la infancia (Zheng y otros., Science 317:1522-1527 2007). En ratones, la carencia de TLR3 está asociada con una menor supervivencia en la exposición al virus coxsackie (Richer y otros, PLoS One 4:e4127, 2009). Sin embargo, un TLR3 de señalización no controlado o mal regulado se ha demostrado que contribuye a morbilidad y mortalidad en ciertos modelos de infección viral que incluyen Nilo occidental, phlebovirus, vacuna e influenza A (Wang y otros., Nat. Med. 10:1366-1373, 2004; Gowen y otros, J. Immunol. 177:6301-6307, 2006; Hutchens y otros, J. Immunol. 180:483-491 , 2008; Le Goffic y otros, PloS Pathog. 2:E53, 2006).
También se ha demostrado que el TLR3 impulsa mecanismos patogénicos en un espectro de enfermedades inflamatorias, inmunes y autoinmunes que incluyen, por ejemplo, el choque séptico (Cavassani y otros., J. Exp. Med. 205:2609-2621 , 2008), lesión pulmonar aguda (Murray y otros., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:1227-1237, 2008), artritis reumatoide (Kim y otros., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009; Brentano y otros., Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005), asma (Sugiura y otros., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662, 2009; Morishima y otros, Int. Arch. Allergy Immunol. 145:163-174, 2008; Stowell y otros, Respir. Res. 10:43, 2009), enfermedad inflamatoria del intestino tal como enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (Zhou y otros, J. Immunol. 178:4548-4556, 2007; Zhou y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007), enfermedad hepática autoinmune (Lang y otros, J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006) y diabetes tipo I (Dogusan y otros. Diabetes 57:1236-1245, 2008; Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9:52-68, 2009). Además, el aumento de órganos específicos en la expresión de TLR3 se ha mostrado que tiene una correlación con una serie de condiciones patológicas impulsadas por respuestas inflamatorias locales no reguladas, tales como cirrosis biliar primaria de los tejidos del hígado (Takii y otros, Lab Invest. 85:908-920, 2005), articulaciones con artritis reumatoide (Ospelt y otros, Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008), y la mucosa nasal de los pacientes con rinitis alérgica (Fransson y otros., Respir. Res. 6:100, 2005).
En condiciones necróticas, la liberación del contenido ¡ntracelular como mRNA endógeno desencadena la secreción de citocinas, quimocinas y otros factores que inducen la inflamación local, facilita la limpieza de los restos de células muertas y repara los daños. La necrosis perpetúa, frecuentemente, los procesos inflamatorios, lo que contribuye a la inflamación crónica o exagerada (Bergsbaken y otros, Nature Reviews 7:99-109, 2009). La activación de TLR3 en el sitio de la necrosis puede contribuir a estos procesos inflamatorios aberrantes y generar un bucle de retroalimentación positiva más pro-inflamatoria a través de los ligandos TLR3 liberados. Así, el antagonismo TLR3 puede ser beneficioso en una gran variedad de trastornos que involucran una inflamación y/o necrosis crónica o exagerada.
La baja modulación de la activación de TLR3 también puede representar una estrategia terapéutica novedosa para indicaciones oncológicas que incluyen los carcinomas de células renales y cáncer de célula epidernoide de cabeza y cuello (Morikawa y otros, Clin. Cáncer Res. 13:5703-5709, 2007; Pries y otros, Int. J. Mol. Med. 21 : 209-215, 2008). Además, el alelo TLR3L423F que codifica una proteína con actividad reducida se ha asociado con la protección avanzada contra la degeneración macular "seca" relacionada con la edad (Yang y otros, N. Engl. J. Med. 359:1456-1463, 2008), lo que indica que los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos en esta enfermedad.
Patologías asociadas a procesos inflamatorios y otros tales como aquellas asociadas con infecciones, tienen impactos significativos para la economía y la salud. Sin embargo, a pesar de los avances en muchas áreas de la medicina, comparativamente hay pocas opciones de terapia o de tratamiento disponibles para muchas de estas condiciones.
Así, existe la necesidad de suprimir la actividad de TLR3 para tratar las condiciones asociadas con TLR3.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra el efecto de TLR3 anti-humano (huTLR3) mAb en un ensayo de gen reportero NF- ??.
Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de anti-huTLR3 mAb en un ensayo NHBE.
La FIG. 3 muestra el efecto de anti-huTLR3 mAb en un ensayo de PBMC.
Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de anti-huTLR3 mAb en un ensayo HASM.
Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran la unión de anti-huTLR3 mAb a mutantes TLR3, La FIG. 6A muestra los epítopos de mAb 15EVQ (negro) y C1068 mAb (gris) (imagen superior) y epítopo de mAb 12QVQ/QSV (imagen en negro abajo) superpuesto a la estructura de TLR3 ECD humano. La FIG. 6B muestra un H/D localizado de un mapa de intercambio de perturbación de proteína TLR3 ECD complejo con mAb 15EVQ.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de la rata/ratón antiratón TLR3 mAb mAb 5429 sustituto en ensayos de gen reportero A) NF- ?? y B) ISRE.
La FIG. 8 muestra el efecto de los mAb (mAb 5429, mAb c1811 ) sustitutos en el ensayo MEF CXCL10/IP-10.
La FIG. 9 muestra la especificidad de unir el mAb sustituto a TLR3. Panel superior: control de isotipo; panel inferior: mAb c181 .
La FIG. 10 muestra el efecto de los mAb sustitutos en el nivel penH en un modelo AHR.
La FIG. 1 1 muestra el efecto de los mAb sustitutos en el total de número de neutrófilos en el fluido de BAL en un modelo AHR.
La FIG. 12 muestra el efecto de los mAb sustitutos en los niveles de CXCL10/IP-10 en fluido BAL en un modelo AHR.
La FIG. 13 muestra el efecto del mAb sustituto en los puntajes de histopatología en un modelo DSS.
La FIG. 14A muestra el efecto del mAb sustituto en los puntajes de histopatología y la FIG. 14B muestra influjo de neutrófilo en un modelo de transferencia de células T.
La FIG. 15 muestra el efecto del mAb sustituto en puntajes clínicos en un modelo CIA.
La FIG. 16 muestra el efecto del mAb sustituto en puntajes clínicos AUC en un modelo CIA.
La FIG. 17 muestra el efecto del mAb sustituto en la supervivencia de ratones C57BL/6 después de la administración intranasal de la influenza A/PR/8/34.
La FIG. 18 muestra el efecto del mAb sustituto en puntajes clínicos después de la administración de influenza A/PR/8/34.
La FIG. 19 muestra el efecto del mAb sustituto en el peso corporal durante 14 días después de la administración de influenza A/PR/8/34.
Las FIGS. 20A-20B muestran el efecto de los mAb sustitutos en los niveles de glucosa sanguínea en (FIG. 20A) WT DIO y (FIG. 20B) animales TLR3KO DIO después de una sobrecarga de glucosa.
La FIG. 21 muestra el efecto del mAb sustituto en niveles de insulina en animales WT DIO.
Las FIGS. 22A-22B muestran el efecto del mAb sustituto 15EVQ en (FIG. 22A) NTHi y (FIG. 22B) de rinovirus inducido CXCL10/IP-10 y niveles CCL5/RANTES en células NHBE.
La FIG. 23A muestra el efecto de mAb 15EVQ en niveles slCAM-1 y la FIG. 23B muestra la viabilidad en células HUVEC.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo se une al menos a un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado a partir de un grupo que consiste de residuos de K467, R488 o R489 con SEQ ID NO 2.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo se une al menos a un residuo de amino ácido TLR3 seleccionado a partir de un grupo que consiste de residuos de D1 16 o K145 con SEQ ID NO 2.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3, en donde el anticuerpo tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: a. reduce la actividad biológica humana de TLR3 en un ensayo de gen reportero in vitro poli-(l:C) NF-kB >50 % en <1 pg/ml; b. inhibe >60 % de IL-6 o producción de CXCL10/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con < 00 ng/ml poli-(l:C) en <10 g/ml; c. inhibe >50 % de IL-6 o la producción de CXCL10/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml poli- (l:C) en <0.4 pg/ml; d. inhibe la producción de >50 % de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli-(l:C) al <5 Mg/ml; e. inhibe la producción de >50 % de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli-(l:C) en <1 pg/ml; f. inhibe >20 % de poli(l:C)-inducido IFN-?, IL-6 o producción de IL-12 por células PB C en <1 pg/ml; g. inhibe la actividad biológica cynomologus TLR3 en un ensayo de gen reportero in vitro NF-kB con IC50 <10 pg/ml; o h. inhibe la actividad biológica cynomologus TLR3 en un ensayo de gen reportero in vitro ISRE con IC50 <5 g/ml o Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo reactivo aislado con TLR3 que compite por la unión de TLR3 con un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada 1 , 2 y 3, las secuencias de aminoácidos de ciertas CDR de cadena ligera 1 , 2 y 3, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables (VH) de cadena pesada o la secuencia de aminoácidos de ciertas regiones variables (VL) de cadena ligera.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo reactivo aislado de TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de cadena pesada 1 , 2 and 3 y las secuencias de aminoácidos de ciertas CDRs de cadena ligera 1 , 2 y 3.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo reactivo aislado de TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables (VH) de cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables (VL) de cadena ligera.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo reactivo aislado con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cierta cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de cierta cadena ligera.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 122, 123, 197, 199, 201 , 163, 209, 210 o 21 1 .
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo aislado de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 o 167.
Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 122, 123, 197, 199, 201 , 163, 209, 210 o 21 1.
Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 o 167.
Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es una célula huésped que comprende el vector de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es un método de hacer un anticuerpo reactivo con TLR3, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la presente invención y la recuperación del anticuerpo producido por la célula huésped.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar o prevenir una condición inflamatoria, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la condición inflamatoria.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar o prevenir una condición inflamatoria sistémica, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la condición inflamatoria sistémica.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar la diabetes tipo II, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la diabetes tipo II.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar la hiperglicemia, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la hiperglicemia.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar la hiperinsulinemia, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la resistencia a la insulina.
Otro aspecto de la presente invención es un método para tratar o prevenir las infecciones virales, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado de la presente invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir las infecciones virales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones que incluyen, pero sin limitarse a, patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación están incorporadas en la presente como referencia como se indican.
El término "antagonista", como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula que parcial o completamente inhibe, mediante cualquier mecanismo, un efecto de otra molécula, tales como un receptor o mediador intracelular.
Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo de un antagonista TRL3" o un anticuerpo "reactivo con TLR3" describe un anticuerpo que es capaz de directa o indirectamente, contrarrestar, reducir o inhibir sustancíalmente la actividad biológica o la activación del receptor TLR3. Por ejemplo, un anticuerpo reactivo con TLR3 se puede unir directamente a TLR3 y neutralizar la actividad de TLR3, es decir, bloquear la señalización de TLR3 para reducir la liberación de citocina y quimocina o la activación de NF-KB.
El término "anticuerpos", como se usa en la presente descripción, se entiende en un sentido amplio e incluye las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos murinos, humanos, humanos adaptados, humanizados y recombinados monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
Generalmente, los anticuerpos son proteínas o cadenas de péptidos que presentan especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está relacionada con una cadena pesada por una unión de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isótopos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadena regularmente espaciados Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera, está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno de los dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (?) y lambda (?), basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Las ¡nmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, según la secuencia de amino ácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA y IgG son además sub-clasificados como los isótopos IgA-i, lgA2, IgGi, lgG2, lgG3 y lgG4.
El término "fragmentos de anticuerpos" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto, generalmente el antígeno de unión o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos.
Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste de una región "marco" interrumpida por tres "parátopos". Los parátopos se definen con el uso de varios términos como sigue: (i) el término regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) se basa en la variabilidad de la secuencia (Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:21 1-250, 1970). Generalmente, el parátopo tiene seis CDRs; tres en VH (HCDR1 , HCDR2, HCDR3), y tres en VL (LCDR1 , LCDR2, LCDR3) (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) El término "región hipervariable", "HVR", o "HV" se refiere a las regiones del dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en estructura según definido por Chothia y Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Generalmente, el parátopo tiene seis regiones hipervariables, tres en VH (H1 , H2, H3) y tres en VL (L1 , L2, L3). Chothia y Lesk se refieren a HVs estructuralmente conservados como "estructuras canónicas", (iii) Los "IMGT-CDRs" según lo propuesto por Lefranc (Lefranc y otros, Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003) se basan en la comparación de dominios V a partir de inmunoglobulinas y receptores de células T. La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://wwwJmgt._org) proporciona una numeración y definición estandarizada de estas regiones. La correspondencia entre CDR, HV y delineaciones IMGT se describe en Lefranc y otros, Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003. (iv) El parátopo también se puede delimitar en base al Uso del Residuo Determinante de la Especificidad (SDRU), de conformidad con Almagro (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004), en donde los Residuos determinantes de la especificidad (SDR) se refiere a residuos de aminoácido de una inmunoglobulina que están directamente involucrados en el contacto con el antígeno. SDRU según se define por Almargo es una medida precisa de un número y distribución de SDR para diferentes tipos de antígenos según lo definido por análisis de estructuras de cristal de complejos de antígeno-anticuerpo.
El término "secuencias compuestas", como se usa en la presente descripción, se refiere a un parátopo definido para incluir todos los residuos de aminoácido delineados individualmente por Kabat, Chothia o IMGT, o cualquier otra delimitación de una región de unión de anticuerpo.
"Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distintas de las definidas para ser parátopo. Debido a que el parátopo se puede definir por varios términos como se describió anteriormente, la secuencia de aminoácido exacta de un marco depende de cómo se definió el parátopo.
El término "antígeno", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier molécula que tiene la capacidad de generar anticuerpos ya sea directa o indirectamente. Se incluye en la definición de "antígeno" un ácido nucleico que codifica una proteína.
El término "homólogo" se refiere a las secuencias de proteínas que tienen entre 40 % y 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Los homólogos de TLR3 humano incluyen polipéptidos de otras especies que tienen entre 40 % y 100 % de identidad de secuencia a una secuencia humana TLR3 conocida. La similitud porcentual entre dos cadenas peptídicas se puede determinar por la alineación por parejas con el uso de la configuración por defecto del módulo AlignX del vector NTI v. 9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Por "TLR3" se entiende TLR3 (huTLR3) humano y sus homólogos. El nucleótido y las secuencias de aminoácidos de cadena larga huTLR3 se muestran en las SEQ ID NO.: 1 y 2, respectivamente. El nucleótido y las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular huTLR3 (ECD) se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.
El término "sustancialmente idéntico", como se usa en la presente descripción, se refiere a que los dos el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de las secuencias de aminoácidos al ser comparados son idénticos o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de aminoácidos 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en una secuencia de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias descritas en la presente invención también son parte de esta aplicación. En algunas modalidades, la identidad de la secuencia puede ser aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. La similitud porcentual se puede determinar como se describe anteriormente. Ejemplos de cadenas de péptidos que se comparan son las regiones variables de cadena pesada o ligera.
El término "en conjunto con", como se usa en la presente descripción, se refiere a que los agentes descritos se pueden administrar juntos a un animal en una mezcla, al mismo tiempo como agentes únicos o en forma secuencial como agentes únicos en cualquier orden.
El término "condición inflamatoria", como se usa en la presente descripción, se refiere a una respuesta localizada a una lesión celular que está mediada en parte por la actividad de citocinas, quimocinas, o células inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos) que se caracteriza en la mayoría de los casos por dolor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de la función del tejido. El término "condición inflamatoria pulmonar", como se usa en la presente descripción, se refiere a una condición inflamatoria que afecta o está asociada a los pulmones.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb), como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y están, típicamente, dirigidos contra un determinante antigénico único. El modificador "monoclonal" indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo y no requiere producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los mAb murinos se pueden hacer por el método de hibridoma de Kohler y otros, Nature 256:495-497, 1975. Los mAb recombinados que contienen una región variable de cadena ligera y de cadena pesada derivada a partir de un anticuerpo donante (típicamente murino) en asociación con las regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas a partir de un anticuerpo aceptor (típicamente de otra especie de mamíferos como el humano) se pueden preparar por el método descrito en la patente de los EE.UU. núm. 4,816,567. Los mAb adaptados humanos que tienen CDR derivados a partir de una inmunoglobulina de donante no humano (típicamente murino) y las partes restantes derivadas de inmunoglobulina de la molécula que se deriva de una o más inmunoglobulinas humanas se pueden preparar por técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia como los que se describen en la patente de los EE.UU. núm. 5,225,539. La secuencia marco humana útil para la adaptación humana se puede seleccionar de bases de datos pertinentes por aquellos con experiencia en la materia. Opcionalmente, los mAb adaptados humanos se pueden modificar mediante la incorporación de residuos alterados del marco de apoyo para preservar la afinidad de unión por técnicas como las descritas en Queen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 and Hodgson y otros, Bio/Technology, 9:421 , 1991.
Los mAb totalmente humanos carentes de secuencias no humanas se pueden preparar a partir de la inmunoglobulina humana en ratones transgénicos mediante técnicas de referencia en, por ejemplo, Lonberg y otros, Nature 368:856-859, 1994; Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14:845-851 , 1996; y Méndez y otros, Nature Genetics 15:146-156, 1997. Los mAb humanos también se pueden preparar y optimizar a partir de las genotecas de fago por técnicas a las que se hace referencia en, por ejemplo, Knappik y otros, J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; y Krebs y otros, J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001.
El término "epítopo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una porción de un antígeno al cual un anticuerpo se une específicamente. Los epítopos consisten, usualmente, de grupos de restos de superficie químicamente activos (tales como polar, no-polar o hidrófobo) tales como cadenas de lado de aminoácidos o polisacárido y pueden tener tres características estructurales específicas, así como características específicas de carga. Un epítopo puede ser lineal en naturaleza o puede ser un epítopo discontinuo, por ejemplo, un epítopo conformacional, que está formado por una relación espacial entre los aminoácidos no-contiguos de un antígeno en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un epítopo conformacional incluye epítopos derivados del plegado de un antígeno, en donde los aminoácidos de las diferentes partes de la secuencia lineal de los antígenos están en contacto en el espacio de 3 dimensiones.
El término "unión especifica", como se usa en la presente descripción, se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno determinado con una afinidad mayor que otros antígenos o proteínas. Típicamente, el anticuerpo se une con una disociación constante (KD) de 10"7 M o menos, y se une al antígeno predeterminado con un KD que es por lo menos doble inferior a su KD por la unión de un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína, o cualquier otro polipéptido especificado) que no sea el antígeno predeterminado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en la presente invención con el término "un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno" o "un anticuerpo específico del antígeno" por ejemplo un anticuerpo TLR3 específico. La constante de disociación se puede medir con el uso de procedimientos estándar como se describe a continuación.
El término "actividad biológica de TLR3" o "activación de TLR3", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier actividad que se produce como resultado de la unión del ligando TLR3. Los ligandos TLR3 incluyen dsRNA, poli(l:C), mRNA endógeno, por ejemplo, mRNA endógeno liberado de células necróticas. Una activación ejemplar de TLR3 resulta en activación de NF- ?? en respuesta al ligando TLR3. La activación de NF- ?? se pueden probar con el uso de un ensayo de gen reportero a la inducción del gen del receptor con poli-(l:C) (Alexopoulou y otros, Nature 413:732-738, 2001 ; Hácker y otros, EMBO J. 18:6973-6982, 1999). Otro ejemplo de la activación de TLR3 resulta en la activación de factores de respuesta de interferón (IRF-3, IRF-7) en respuesta al ligando TLR3. La activación IRF mediada por TLR3 se puede probar con el uso de un gen reportero conducido por un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE). Otro ejemplo de la activación de TLR3 resulta en secreción de citocinas y quimocinas pro-inflamatorias, por ejemplo TNF-a, IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-10 y RANTES. La liberación de citocinas y quimocinas de las células, tejidos o en circulación se pueden medir con el uso de inmunoensayos bien conocidos, tales como un inmunoensayo ELISA.
Códigos convencionales de aminoácidos de una a tres letras se usan en la presente invención como sigue: Aminoácido Código de tres letras Códi Alanina ala A Arginina arg R Asparagina asn N Aspartato asp D Cisteína cys C Glutamato glu E Glutamina gln Q Glicina giy G Histidina his H Isoleucina ile 1 Leucina leu L Usina lys K Metionina met Fenilalanina phe F Prolina pro P Serina ser S Treonina thr T Triptófano trp w Tirosina tyr Y Valina val V Composiciones de materia La presente invención proporciona antagonistas de anticuerpos capaces de inhibir la actividad biológica de TLR3 y los usos de tales anticuerpos. Tales antagonistas TLR3 pueden tener las propiedades de la activación de unión de TLR3 e inhibir la activación de TLR3. Ejemplos de mecanismos por los que se puede inhibir la activación de TLR3 por tales anticuerpos incluye inhibición in vitro, in vivo o in situ de la unión del ligando de TLR3, inhibición de la dimerización del receptor, la inhibición de la localización de TLR3 al compartimiento endosomal, la Inhibición de la actividad de la cinasa de vías de señalización corriente abajo, o la inhibición de la transcripción de TLR3 mRNA. Otros antagonistas de anticuerpos capaces de inhibir la activación de TLR3 por otros mecanismos también están dentro del alcance de los diversos aspectos y modalidades de la presente invención. Estos antagonistas son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos.
La diversidad de anticuerpos se crea mediante el uso de múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables en una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de la variable (V) de segmentos de genes y la diversidad (D) y de unión (J) de segmentos de genes para hacer una región VH completa y la recombinación de la variable y unir segmentos de genes para hacer una región VL completa. Los anticuerpos y composiciones que tienen secuencias de CDR idénticas o similares a las que se describen en la presente invención no es probable se hayan generado de forma independiente. La secuencia de los genes de anticuerpo después de ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y estos genes variados se estiman que codifican 1010 moléculas de anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2.° ed., eds. Jonio y otros, Academic Press, San Diego, Calif., 995).
La presente invención proporciona nuevos parátopos derivados de genotecas de genes de inmunoglobulina humana. La estructura para llevar a un parátopo es, generalmente, un anticuerpo de cadena pesada o ligera o parte del este, en donde el parátopo se localiza a un parátopo de ocurrencia natural determinado como se describe anteriormente.
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de este reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada en las secuencias de aminoácidos 1 , 2 y 3 (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera en las secuencias de aminoácidos 1 , 2 y 3 (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) como se muestra en la Tabla 1a.
TABLA 1A.
SEQ ID NO: mAb HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 16 52 88 54 49 50 51 17 58 64 60 55 56 57 18 70 77 72 67 68 69 19 82 83 84 79 80 89 1 46 47 48 43 44 45 2 52 53 54 49 50 51 3 58 59 60 55 56 57 4 61 62 60 55 56 57 5 61 64 60 55 56 63 6 61 64 60 55 56 65 7 61 64 60 55 56 66 8 70 71 72 67 68 69 9 70 73 72 67 68 69 10 70 75 72 67 68 74 11 70 77 72 67 68 76 12 70 77 72 67 68 78 13 82 83 84 79 80 81 14 82 86 84 79 80 85 15* 82 86 84 79 80 87 15** 111 112 84 109 110 113 15-1 111 114 84 109 110 113 15-2 115 112 84 109 110 113 15-3 116 112 84 109 110 113 15-4 111 117 84 109 110 113 15-5 116 118 84 109 110 113 15-6 116 112 119 109 110 113 15-7 111 112 84 120 110 113 15-8 111 112 84 121 110 113 15-9 116 118 119 109 110 113 F17 61 192 60 55 56 191 F18 70 194 72 67 68 193 F19 82 196 84 79 80 195 En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 192, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 192 se define como se muestra en la Fórmula (I): Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, ( en donde Xaa6 puede ser Arg o Lys; Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser; Xaa8 puede ser Met, Arg o Tyr y Xaag puede ser Lys o Arg.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 194, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 194 se define como se muestra en la Fórmula (III): l-l-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S, (III) en donde Xaai5 puede ser Lys, Thr o lie; Xaai6 puede ser Asn o Asp y Xaai7 puede ser Val o Leu.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 196, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 196 se define como se muestra en la Fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V) en donde Xaa24 puede ser Phe o Arg y Xaa25 puede ser Ala o Ser.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 191 , en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 191 se define como se muestra en la Fórmula (II): Xaa S-Y-D— Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V, (II) en donde Xaai puede ser Ala, Gln, Gly o Ser; Xaa? puede ser Gly, Glu o Ser; Xaa3 puede ser Asp o Asn; Xaa4 puede ser Glu o Ser y Xaas puede ser Phe, Ala o Leu.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 193, en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 se define como se muestra en la Fórmula (IV): Xaaio-S-Y-D— Xaan-P-Xaai2-Xaai3-Xaai4-V, (IV) en donde Xaaio puede ser Gln o Ser; Xaan puede ser Thr, Glu o Asp; Xaai2 puede ser Val o Asn; Xaai3 puede ser Tyr o Phe y Xaau puede ser Ser, Asn o Gln.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 195, en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 195 se define como se muestra en la Fórmula (VI): Q-Q-Xaais— Xaai9-Xaa2o- aa2i- aa22- aa23-T, (VI) en donde Xaais puede ser Tyr, Gly o Ala; Xaaig puede ser Gly, Glu o Asn; Xaa2o puede ser Ser o Thr; Xaa2i puede ser Val, lie o Leu; Xaa22 puede ser Ser o Leu y Xaa23 puede ser He, Ser, Pro o Tyr.
La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada en las secuencias de aminoácidos 1 ,2 y 3 (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera en las secuencias de aminoácidos 1 , 2 y 3 (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) como se muestra en la Tabla 1a.
Los anticuerpos cuyo parátopo de secuencias de aminoácidos difieren insustancialmente de aquellos que se muestran en la Tabla 1a (SEQ ID NO: 49-121 y 191 -196) están comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Típicamente, esto incluye una o más sustituciones de aminoácidos con un aminoácido que tiene una carga similar, hidrófoba o características estereoquímicas. Las sustituciones adicionales en las regiones marco, a diferencia de los parátopos, también se pueden hacer siempre y cuando no afecten negativamente a las propiedades del anticuerpo. Se pueden hacer sustituciones para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo, estabilidad o afinidad. Se pueden hacer una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones al parátopo.
Las modificaciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a las de la molécula de la cual se realizan las modificaciones. Las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas se pueden lograr mediante la selección de sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto para mantener (1 ) la estructura de la estructura molecular en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lienzo o helicoidal, (2) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar de destino o (3) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservadora" puede incluir una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo, de manera que hay poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga de los residuos de aminoácidos en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de exploración de alanina (MacLennan y otros, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki y otros, Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Las sustituciones deseadas de aminoácidos (ya sean conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por aquellos con experiencia en la materia al momento en que se desean dichas sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden utilizar para identificar residuos importantes de la secuencia de molécula o para aumentar y disminuir la afinidad de las moléculas que se describen en la presente invención. Ejemplos de las sustituciones de aminoácidos se muestran en la Tabla 1 b.
TABLA 1 B.
En ciertas modalidades, las sustituciones conservadoras de aminoácidos también abarcan residuos de aminoácidos de ocurrencia no natural que típicamente se incorporan por síntesis química de péptidos en lugar de síntesis en los sistemas biológicos. Las sustituciones de aminoácido se pueden hacer por ejemplo por mutagénesis PCR (patente de Estados Unidos núm. 4,683,195). Las genotecas de las variantes se pueden generar con el uso de métodos bien conocidos, por ejemplo, con el uso de codones al azar (NNK) o no al azar, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW), y tamizaje de las genotecas de variantes con propiedades deseadas, como se muestra en el Ejemplo 1. La Tabla 1c muestra sustituciones realizadas a tres antagonistas parentales de anticuerpo TLR3 dentro de las regiones LCDR3 y HCDR2 para mejorar las propiedades del anticuerpo.
Según la delimitación de los parátopos, los residuos de los parátopos de los anticuerpos de la presente invención y posteriormente los residuos del marco pueden variar ligeramente para cada cadena pesada y ligera. Las Tablas 2a y 2b muestran los residuos de parátopos de ejemplos de anticuerpos de la presente invención delimitados de conformidad con Kabat, Chothia y IMGT, y sus secuencias compuestas.
TABLA 1C.
Familia 17 SEQ ID LCDR3 mAb NO: 17 A S Y D G D E F T V 3 4 5 Q E S A 6 G S N S L 7 S S S L Consenso A,Q,G,S S Y D G.E.S D,N E,S F,A,L T V 191 'Consenso basado en mAbs 10, 11 , 12 Familia 18A, 18B SEQ ID HCDR2 NO: mAb 18 I I Q K R S K W Y N N Y A V S V K S 8 T D 9 I D L 10 11 12 Consenso I I Q ?,t,? R S K w Y N N,D Y A V,L S V K S 194 Familia 19 SEQ ID HCDR2 NO: mAb 19 F I D P S D S Y T N Y S A P F Q G 13 14 15 15.1 R 15.2 15.3 15.4 S 15.5 R S 15.6 15.7 15-8 15-9 R S Consenso F,R I D P S D S Y T N Y A,S P S F Q G 196 TABLA 2A.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de su variable (VH) de cadena pesada y las regiones variables (VL) de cadena ligera y también proporciona para cada variable de cadena pesada aislada y cada región variable de cadena ligera como se muestra en la Tabla 3a. F17, F18 y F19 representan variantes de anticuerpos que comprenden secuencias de aminoácidos de consenso para las familias 17, 18 y 19, respectivamente (véase Ejemplo 1 ).
TABLA 2B. 15 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-1 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-1 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-1 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-1 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-2 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-2 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-2 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-2 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 5-3 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-3 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-3 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-3 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-4 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-4 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-4 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-4 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-5 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-5 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-5 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-5 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-6 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-6 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-6 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-6 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-7 IMGT QSISSY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-7 Kabat RASQSISSYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-7 Chothia SQSISSY AAS GNTLSY 15-7 Consenso 120 RASQSISSYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-8 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-8 Kabat RASQSIGLYLN AASSLQS QQGNTLSYT 15-8 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-8 Consenso 121 RASQSIGLYLN 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT 15-9 IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT 15-9 Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT 15-9 Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY 15-9 Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT TABLA 3A.
Aunque las modalidades ilustradas en los ejemplos comprenden pares de regiones variables, una a partir de una cadena pesada y una a partir de una cadena ligera, un técnico con experiencia reconocerá que las modalidades alternativas pueden comprender regiones de una sola variable de cadena pesada o ligera. La región de una sola variable se puede usar para detectar dominios variables capaces de formar un fragmento de unión al antígeno de dos dominios capaz de, por ejemplo, unirse a TLR3. La detección se puede lograr por métodos de fagos de detección con el uso por ejemplo, de un enfoque jerárquico de combinación dual descrito en la patente publicada del PCT núm. WO92/0 047. En este enfoque, una colonia individual que contiene ya sea un clon de cadena H o L se usa para infectar una genoteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio específico de unión de antígeno de dos cadenas resultante se selecciona de conformidad con la técnica de visualización de fagos como se describe.
En otras modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una región variable de cadena pesada y de cadena ligera, que tienen secuencias de aminoácidos por lo menos 95 % idénticos a la región variable de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Tabla 3a.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado que tiene ciertas secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera, como se muestra en la Tabla 3b.
Otro aspecto de la presente invención es de polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención o su complemento. Algunos ejemplos de polinucleótidos se describen en la presente invención, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degradación del código genético o las preferencias codónicas en un sistema de expresión determinado, codifican los antagonistas de anticuerpos de la presente invención están también dentro del alcance de la presente invención.
Los antagonistas de anticuerpos ilustrativos pueden ser anticuerpos de los isótopos de las IgG, IgD, IgG, IgA o IgM. Además, tales antagonistas de anticuerpos pueden modificarse postranslacionalmente mediante procesos tales como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente de origen no natural tal como la adición de entidades de polietilenglicol (PEG) (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse a polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia. La conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG ha demostrado mejorar la farmacodinamia sin interferir con la función. Véase Deckert y otros, Int. J. Cáncer 87:382-390, 2000; Knight y otros, Platelets 15:409-418, 2004; Leong y otros, Cytokine 16:106-119, 2001 ; y Yang y otros, Protein Eng. 16:761-770, 2003.
TABLA 3B.
Cadena pesada Cadena ligera mAb SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14 102 155 15 102 156 15-1 130 156 15-2 131 156 15-3 132 156 15-4 133 156 15-5 134 156 15-6 135 156 15-7 102 157 15-8 102 158 15-9 160 156 F17 204 203 F18 206 205 F19 208 207 14EVQ 220 155 15EVQ 220 156 5429 166 165 C1811 168 167 Las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de la invención pueden mejorarse mediante modificaciones de Fe por técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia. Por ejemplo, las cadenas pesadas de isótopos de lgG4 contienen una estructura Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) en la región de articulación capaz de formar enlaces disulfuro de cadena pesada ínter- o intra-, es decir, los dos residuos Cys en la estructura CPSC pueden formar un enlace dísulfuro con los residuos Cys correspondientes en la otra cadena pesada (inter) o los dos residuos Cys dentro de una estructura CPSC pueden formar un enlace disulfuro entre sí (intra). Se cree que las enzimas isomerasa in vivo son capaces de convertir los enlaces inter cadenas pesadas de moléculas de lgG4 a enlaces íntracadena pesada y viceversa (Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19, 2002). En consecuencia, dado que los pares de cadena pesada:ligera (H:L) en aquellas moléculas de lgG4 con enlaces intracadena pesada en la región de articulación no están asociados covalentemente entre sí, pueden disociarse en monómeros H:L que luego se asocian nuevamente con monómeros H:L derivados de otras moléculas de lgG4 que forman moléculas de lgG4 biespecíficas, heterodiméricas. En un anticuerpo de IgG biespecífico los dos Fab de la molécula de anticuerpo difieren en los epítopos que unen. Al sustituir el residuo Ser en la estructura CPSC de la región de articulación con Pro da como resultado un "comportamiento similar a lgG1", es decir, las moléculas forman enlaces disulfuro estables entre las cadenas pesadas y, por lo tanto, no son susceptibles de intercambiar H:L con otras moléculas de lgG4. En una o modalidad los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio lgG4 Fe con una mutación S a P en la estructura CPSC. La ubicación de la estructura CPSC se encuentra, típicamente, en el residuo 228 de una cadena pesada madura pero puede cambiar dependiendo de las longitudes CDR.
Además, los sitios pueden removerse que afectan el enlace a los receptores Fe diferentes a un receptor de recuperación FcRn en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, las regiones que enlazan el receptor Fe involucradas en actividad ADCC pueden removerse en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, la mutación de Leu234/I_eu235 en la región de articulación de lgG1 a L234A/L235A o Phe235/Leu236 en la región de articulación de lgG4 a P235A/L236A minimiza la unión FcR y reduce la capacidad de la ¡nmunoglobulina para mediar la citotoxicidad dependiente del complemento y ADCC. En una modalidad los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio lgG4 Fe con mutaciones P235A/L236A. La ubicación de estos residuos identificados anteriormente es típica en una cadena pesada madura pero puede cambiar dependiendo de las longitudes CDR. Los anticuerpos ilustrativos que tienen mutaciones P235A/L236A son anticuerpos que tienen cadenas pesadas codificadas por secuencia mostradas en la SEQ ID NO: 218, 219 ó 220.
Las moléculas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos completamente humanos, adaptados al ser humano, humanizados y madurados por afinidad están dentro del alcance de la invención como proteínas de fusión y proteínas quiméricas. La afinidad de los anticuerpos hacia un antígeno puede mejorarse por diseño racional o maduración de afinidad aleatoria con métodos conocidos tales como mutagénesis aleatoria o dirigida, o con genotecas de presentación de fagos. Por ejemplo, la variación de los residuos de la Zona Vernier que en su mayoría reside en la región estructural puede emplearse para modular la afinidad de un anticuerpo como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,639,055. Recientemente, Almagro y otros, definieron "Affinity Determining Residues", ADR, que residen en los CDR, y cuya ingeniería puede aumentar la afinidad (Cobaugh y otros, J Mol Biol. 378: 622-633, 2008).
Las moléculas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos completamente humanos, adaptados al ser humano, humanizados y madurados por afinidad modificados para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, afinidad, inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable están dentro del alcance de la invención. La estabilidad del anticuerpo es influenciada por un número de factores, que incluyen (1 ) empaque de núcleo de dominios individuales que afecta su estabilidad intrínseca, (2) interacciones de la interfaz proteína/proteína que tienen impacto sobre el apareamiento HC y LC, (3) relleno de residuos polares y cargados, (4) redes de enlace H para residuos polares y cargados; y (5) carga superficial y distribución de residuos polares entre otras fuerzas intra- e ¡nter-moleculares (Worn y otros, J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001 ). Los residuos desestabilizadores de estructura potencial pueden identificarse en base a la estructura cristalina del anticuerpo o por modelo molecular en ciertos casos, y el efecto de los residuos en la estabilidad de anticuerpo puede probarse por generación y evaluación de las mutaciones que contienen variantes en los residuos identificados. Uno de los modos de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar el punto medio de transición térmica (Tm) tal como se mide por calorimetría de barrido diferencial (DSC). Generalmente, la proteína Tm se correlaciona con su estabilidad y se correlaciona inversamente con su susceptibilidad para despliegue y desnaturalización en solución y el proceso de degradación que depende de la tendencia de la proteína para desplegarse (Remmele y otros, Biopharm., 13:36-46, 2000). Un número de estudios han encontrado correlación entre el ordenamiento de la estabilidad física de las formulaciones medidas según la estabilidad térmica por DSC y estabilidad física medida por otros métodos (Gupta y otros, AAPS PharmSci. 5E8, 2003; Zhang y otros, J. Pharm. Sci. 93:3076-3089, 2004; Maa y otros, Int. J. Pharm., 140:155-168, 1996; Bedu-Addo y otros, Pharm. Res., 21 :1353-1361 , 2004; Remmele y otros, Pharm. Res., 15:200-208, 1997). Los estudios de formulación sugieren que un Fab Tm tiene consecuencias para la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente. Las diferencias en aminoácidos en la estructura o dentro de los CDR podrían tener efectos significativos en la estabilidad térmica del dominio Fab (Yasui, y otros, FEBS Lett. 353:143-146, 1994).
Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden unir TLR3 con una K¿ menor o igual que aproximadamente 10'7, 10"8, 10"9, 10"10, 10"11 ó 10' 12 M. La afinidad de una molécula específica para TLR3, tal como un anticuerpo puede determinarse experimentalmente con cualquier método adecuado. Tales métodos pueden usar instrumentos Biacore o KinExA, ELISA o ensayos por unión competitiva conocidos por aquellos con experiencia en la materia.
Los antagonistas de anticuerpos que unen un homólogo de TLR3 específico con una afinidad deseada pueden seleccionarse de genotecas de variantes o fragmentos por técnicas que incluyen maduración de la afinidad de anticuerpos. Los antagonistas de anticuerpos pueden identificarse en base a su inhibición de la actividad biológica de TLR3 usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden usar ensayos reporteros de genes o ensayos que miden la producción de citoquina con el uso de métodos conocidos y como se describe en la solicitud.
Otra modalidad de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores de plásmidos, vectores virales, vectores para expresión de baculovirus, vectores con base de transposón o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo específico o antecedente genético por cualquier otro medio.
Otra modalidad de la invención es una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ó 216 o una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 122, 123, 197, 199, 201 , 163, 209 ó 210.
Otra modalidad de la invención es una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 102, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ó 168, o una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 ó 167. Tales células huésped pueden ser células eucarióticas, células bacteriales, células vegetales o células de archaea. Las células eucarióticas ilustrativas pueden ser de mamíferos, insectos, aviar u otro origen animal. Las células eucarióticas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma tales como SP2/0 (Colección de cultivo tipo americano (ATCC, por sus siglas en inglés), manasas, VA, CRL-1581), NSO (Colección europea de cultivos celulares (ECACC, por sus siglas en inglés), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC núm. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y líneas celulares de murino Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ilustrativa es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen aquellas derivadas de las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) tales como CHO-K1 SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61 ) o DG44.
Otra modalidad de la invención es un método de preparación de un reactivo de anticuerpo con TLR3 que comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos de preparación de anticuerpos y su purificación son conocidos en la materia.
Otra modalidad de la invención es una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo de la invención.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento de éste que es reactivo con TLR3, en donde el anticuerpo une al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado de un grupo que consiste de (a) residuos K467, R488, ó R489 de la SEQ ID NO: 2; (b) residuo K467 de la SEQ ID NO: 2; (c) residuo R489 de la SEQ ID NO: 2; (d) residuos K467 y R489 de la SEQ ID NO: 2; y (e) residuos K467, R488, y R489 de la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo aislado puede unir, además, al menos un residuo de aminoácido de TLR3 seleccionado de los residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541 , E570 ó K619 de la SEQ ID NO:2.
Otra modalidad de la invención es el anticuerpo aislado o fragmento de éste, en donde el anticuerpo une al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado de un grupo que consiste de residuos D1 16 ó K145 de la SEQ ID NO: 2.
Varias tecnologías conocidas pueden emplearse para determinar el epítopo de unión de los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, cuando las estructuras de ambos componentes individuales son conocidas, el acoplamiento proteína-proteína in silico puede llevarse a cabo para identificar los sitos compatibles de interacción. El intercambio hidrógeno-deuterio (H/D) puede llevarse a cabo con el complejo antígeno y anticuerpo para mapear las regiones en el antígeno que pueden unirse por el anticuerpo. La mutagénesis de segmentos y puntos del antígeno puede usarse para ubicar aminoácidos importantes para la unión de anticuerpos. Para proteínas grandes tales como TLR3, el mapeo de mutagénesis por puntos se simplifica cuando el sitio de unión se localiza primero a una región en la proteína, tal como por acoplamiento, mutagénesis de segmentos o intercambio H/D.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento de este reactivo con TLR3 que compite por la unión de TLR3 con un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones complementariedad de cadena pesada determinando regiones (CDR) 1 , 2 y 3, las secuencias de aminoácidos de ciertas CDR 1 , 2 y 3, de cadena ligera, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de cadena pesada (VH) o la secuencia de aminoácidos de ciertas regiones variables de cadena ligera (VL). Los anticuerpos monoclonales ilustrativos de la invención son un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 216 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 41 , y un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 214 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 2 1.
La competencia entre la unión a TLR3 puede realizarse en ensayos in vitro con métodos conocidos. Por ejemplo, la unión del anticuerpo marcado de NHS-éster MSD Sulfo-Tag™ a TLR3 en presencia de un anticuerpo no marcado puede evaluarse mediante ELISA. Los anticuerpos ilustrativos de la invención son mAb 12, mAb 15 y mAb c181 1 (véase la Tabla 3a). Los anticuerpos c1068 antiTLR3 descritos anteriormente y sus derivados (descritos en la publicación PCT núm. WO06/060513A2), TLR3.7 (eBiosciences, cat. núm. 14-9039) y Imgenex IMG-315A (Imgenex IMG-315A; generados contra los aminoácidos TLR3 de seres humanos aminoácidos 55-70, VLNLTHNQLRRLPAAN) no compiten con la unión a TLR3 con mAb 12, 15 ó c 81 1 como se muestra en el Ejemplo 5.
Otro aspecto de la invención es un reactivo de anticuerpo aislado con TLR3, en donde el anticuerpo tiene al menos una de las siguientes propiedades: a. reduce la actividad biológica de la TLR3 humana en un ensayo de genes reporteros poli(l:C) NF-kB in vitro >50 % en <1 pg/ml; b. inhibe >60 % de la producción de IL-6 ó CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli l:C) en <10 pg/ml; c. inhibe >50 % de la producción de IL-6 ó CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli (l:C) en <0.4 pg/ml; d. inhibe >50 % de la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli(l:C) en <5 pg/ml; e. inhibe >50 % de la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli(l:C) en <1 pg/ml; f. inhibe >20 % de poli(l:C)-inducido IFN-?, producción de IL- 6 ó IL-12 por las células PBMC en <1 pg/ml. g. inhibe la producción de la actividad biológica de la TLR3 cinomóloga en un ensayo de genes reporteros NF-kB in vitro con IC50 <10 pg/ml; o h. inhibe la actividad biológica de la TLR3 cinomóloga en un ensayo de genes reporteros con IC50 <5 pg/ml.
Métodos de tratamiento Los antagonistas de TLR3 de la invención, por ejemplo, los antagonistas de anticuerpos TLR3, pueden usarse para modular el sistema inmunológico. Sin desear estar limitados por ninguna teoría en particular, los antagonistas de la invención pueden modular el sistema inmunológico al evitar o reducir la unión del ligando a TLR3, dimerización de TLR3, internacionalización de TLR3 o tráfico de TLR3. Los métodos de la invención pueden usarse para tratar a un paciente animal que pertenezca a cualquier clasificación. Los ejemplos de tales animales incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para antagonizar la actividad de TLR3, en el tratamiento de la inflamación, enfermedades inflamatorias y metabólicas y también son útiles en la preparación de un medicamento para tal tratamiento en donde el medicamento se prepara para administración en dosis definidas en la presente invención.
Generalmente, las condiciones inflamatorias, las condiciones asociadas a infecciones o trastornos inflamatorios inmunomediados, los antagonistas de anticuerpos TLR3 antagonistas de anticuerpos de la invención incluyen aquellos mediados por citoquinas o quemoquinas y aquellas condiciones que resultan total o parcialmente de la activación de TLR3 o señalización por la vía de TLR3. Los ejemplos de tales condiciones inflamatorias incluyen condiciones asociadas a sepsis, enfermedades inflamatorias de colon, trastornos autoinmunológicos, trastornos inflamatorios y condiciones asociadas a infecciones. También se piensa que los cánceres, las condiciones cardiovasculares y metabólicas, condiciones neurológicas y fibróticas pueden evitarse o tratarse por medio de la administración de antagonistas de anticuerpos TLR3 de la invención. La inflamación puede afectar un tejido o ser sistémica. Los tejidos afectados ilustrativos son el tracto respiratorio, pulmón, el tracto gastrointestinal, intestino delgado, intestino grueso, colon recto, el sistema cardiovascular, tejido cardíaco, vasos sanguíneos, articulaciones, hueso y tejido sínovial, tejido cardíaco, vasos sanguíneos, articulaciones, hueso y tejido sinovial, cartílago, epitelio, endotelio, tejido hepático o adiposo. Las condiciones inflamatorias sistémicas ilustrativas son trastorno de citoquina o hipercitoquinemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), enfermedad injerto contra huésped (GVHD, por sus siglas en inglés), síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS, por sus siglas en inglés), síndrome de insuficiencia respiratoria aguda severa (SARS, por sus siglas en inglés), síndrome anti-fosfolípido catastrófico, infecciones virales severas, influenza, neumonía, shock, o sepsis.
La inflamación es una respuesta protectora para bloquear un agente invasor. La inflamación es un evento escalonado que involucra muchos mediadores celulares y humorales. Por un lado, la supresión de las respuestas inflamatorias puede dejar a un huésped inmunocomprometido; sin embargo, si no se controla, la inflamación puede llevar a complicaciones serias que incluyen enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, asma, psoriasis, artritis, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del colon y similares), shock séptico y complicaciones de múltiples órganos. Es importante señalar, que estos estados de trastornos diversos comparten mediadores inflamatorios comunes, tales como citoquinas, quemoquinas, células inflamatorias y otros mediadores segregados por estas células.
La activación de TLR3 por medio de sus ligandos poli(l:C), dsRNA o mRNA endógeno lleva a la activación de vías de señalización que resultan en la síntesis y secreción de citoquinas proinflamatorias, activación y reclutamiento de las células inflamatorias, tales como macrofagos, granulocitos, neutrófilos y eosinófilos, muerte celular, y destrucción de tejidos. TLR3 induce la secreción de IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, MIP-1 , CXCL5/IP-10 y RANTES, y otras citoquinas y quemoquinas proinflamatorias implicadas en el reclutamiento y activación de células inmunes, por ello, contribuye a la destrucción de tejidos en las enfermedades autoinmunes y otras enfermedades inflamatorias. El mRNA endógeno del ligando de TLR3 se libera de las células necroticas durante la inflamación, y puede resultar en un circuito de retroalimentación positivo para activar la TLR3 y perpetuar la inflamación y posterior daño tisular. Los antagonistas de TLR3, tales como los antagonistas de anticuerpos TLR3, pueden normalizar la secreción de citoquinas, reducir el reclutamiento de células inflamatorias, y reducir el daño tisular y muerte celular. Por lo tanto, los antagonistas de TLR3 tienen potencial terapéutico para tratar la inflamación y un espectro de condiciones inflamatorias.
Un ejemplo de una condición inflamatoria es la condición asociada a la sepsis que puede incluir el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, por sus siglas en inglés), shock séptico o síndrome de múltiples órganos (MODS, por sus siglas en inglés). El dsRNA liberado por infección viral, bacterial, fúngica o parásita y por células necróticas puede contribuir al comienzo de sepsis. Sin desear estar limitados una teoría particular, se cree que el tratamiento con antagonistas de TLR3 antagonistas puede proporcionar un beneficio terapéutico al extender los tiempos de sobrevivencia en pacientes que sufren de condiciones inflamatorias asociadas a sepsis o evitar que un evento inflamatorio local (por ejemplo, en el pulmón) se disemine y se convierta en una condición sistémica, al potencializar la actividad antimicrobiana innata, al demostrar actividad sinérgica cuando se combina con agentes antimicrobianos, al minimizar el estado inflamatorio local que contribuye a la patología, o cualquier combinación de los anteriormente mencionados. Tal intervención puede ser suficiente para permitir tratamiento adicional (por ejemplo, tratamiento de la infección subyacente o reducción de los niveles de citoquina) necesario para asegurar la sobrevivencia del paciente. La sepsis puede esquematizarse en animales, tales como ratones, mediante la administración de D-galactosamina y poli(l:C). En tales modelos, la D-galactosamina es una hepatotoxina que funciona como un sensibilizador de sepsis y poli(l:C) es una molécula inductora de sepsis que imita el dsRNA y activa la TLR3. El tratamiento con antagonista de TLR3 puede incrementar las tasas de sobrevivencia animal en un modelo murino de sepsis, y por ello, los antagonistas de TLR3 pueden ser útiles en el tratamiento de la sepsis.
La inflamación gastrointestinal es una inflamación de una capa de mucosa del tracto gastrointestinal, y abarca las condiciones agudas y crónicas. La inflamación aguda se caracteriza, generalmente, por un tiempo corto de inicio e infiltración o influjo de neutrófilos. La inflamación crónica se caracteriza, generalmente, por un periodo relativamente más largo de inicio e infiltración o influjo de células mononucleares. La capa de mucosa puede ser la mucosa del colon (que incluye el intestino delgado y el intestino grueso), recto, revestimiento del estómago (gástrico), o cavidad oral. Las condiciones inflamatorias gastrointestinales crónicas ilustrativas son la enfermedad inflamatoria del colon (IBD, por sus siglas en inglés), colitis inducida por lesiones ambientales (por ejemplo, inflamación gastrointestinal (por ejemplo, colitis) causada por o asociada con (por ejemplo, como un efecto secundario) un régimen terapéutico, tal como la administración de quimioterapia, terapia de radiación, y similares), colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis colagenosa o linfocítica, enterocolitis necrotizante, colitis en condiciones tales como enfermedad granulomatosa crónica o enfermedad celíaca, alergias causadas por alimentos, gastritis, gastritis infecciosa o enterocolitis (por ejemplo, gastritis activa crónica por infección con Helicobacter pylori) y otras formas de inflamación gastrointestinal causada por un agente infeccioso.
La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD, por sus siglas en inglés) incluye un grupo de trastornos inflamatorios crónicos de etiología generalmente desconocida, por ejemplo, colitis ulcerativa (CU) y enfermedad de Crohn (CD, por sus siglas en inglés). La evidencia clínica y experimental sugiere que la patogenia de la IBD es multifactorial involucrando genes de susceptibilidad y factores ambientales. En la enfermedad inflamatoria del intestino, el tejido dañado es resultado de una respuesta inmune exagerada o inapropiada a los antígenos de la microflora intestinal. Existen diversos modelos animales para las enfermedades inflamatorias del intestino. Algunos de los modelos más ampliamente usados son el modelo de colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico/etanol (TNBS) o el modelo por oxazalona, que inducen la ulceración e inflamación crónica en el colon (Neurath y otros, Intern. Rev. Immunol 19:51-62, 2000). Otro modelo usa el dextran sulfato sódico (DSS), el cual induce una colitis aguda que se manifiesta mediante diarrea sangrante, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración neutrófila. La colitis inducida DSS se caracteriza, histológicamente, por la infiltración de las células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de la cripta, y ulceración epitelial (Hendrickson y otros, Clinical Microbiology Reviews 15:79-94, 2002). Otro modelo involucra la transferencia adoptiva de células dealt0 CD4 T na'íve CD45RBT a ratones RAG o SCID. En este modelo las células na'íve T del donante atacan el intestino receptor lo que produce síntomas e inflamación crónica del intestino similares a las enfermedades inflamatorias del intestino humano (Read y Powrie, Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 15 unidad 15.13, 2001). La administración de antagonistas de la presente invención a cualquiera de estos modelos se puede usar para la evaluación de la eficacia potencial de estos antagonistas para aliviar los síntomas y modificar el curso de las enfermedades asociadas con la inflamación en el intestino tales como la enfermedad inflamatoria del intestino. Se tiene disponible diversas opciones de tratamiento para IBD, por ejemplo, se han usado las terapias de antídoto anti-TNF-a durante una década para tratar la enfermedad de Crohn (Van Assche y otros, Eur. J. Pharmacol. Epub, Oct. 2009). Sin embargo, un porcentaje significativo de pacientes son resistentes a los tratamiento actuales (Hanauer y otros, Lancet 359:1541-1549, 2002; Hanauer y otros, Gastroenterology 130:323-333, 2006), y así se necesitan nuevas terapias dirigidas a la población de pacientes resistentes a los tratamientos.
Otro ejemplo de una enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria pulmonar. Las enfermedades inflamatorias ilustrativas incluyen las enfermedades pulmonares inducidas por una infección que incluyen aquellas asociadas a infecciones virales, bacteriales, fúngicas, parasitarias o transmitidas por priones; enfermedades pulmonares inducidas por alérgenos; enfermedades pulmonares inducidas por contaminantes atmosféricos tales como asbestosis, silicosis, o beriliosis; enfermedades pulmonares inducidas por aspiración gástrica, trastorno inmune, enfermedades inflamatorias con predisposición genética tales como fibrosis cística, y enfermedades pulmonares inducidas por un traumatismo físico tales como la lesión producida por el respirador. Estas enfermedades inflamatorias incluyen, además, asma, enfisema, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés), sarcoidosis, histiositosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonaria, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía hospitalaria, neumonía asociada al respirador, sepsis, neumonía viral, infección por virus de la influenza, infección por virus parainfluenza, infección por rotavirus, infección por metapneumovirus humano, infección por virus sincitial respiratorio y aspergillus u otras infecciones fúngicas. Las enfermedades inflamatorias ilustrativas asociadas a infecciones pueden incluir neumonía viral o bacterial que incluye neumonía severa, fibrosis cística, bronquitis, exacerbaciones de las vías respiratorias y síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS, por sus siglas en inglés). Dichas enfermedades asociadas con la infección pueden involucrar múltiples infecciones tales como una infección viral primaria y una infección bacterial secundaria.
El asma es una enfermedad inflamatoria pulmonar que se caracteriza por la hiperreactividad de las vías respiratorias ("AHR", por sus siglas en inglés), broncoconstricción, respiración silbante, inflamación neutrófila o eosinofílica, hipersecreción mucosa, fibrosis subepitelial, y niveles elevados de IgE. Los pacientes con asma experimentan "exacerbaciones", un empeoramiento de los síntomas debido, frecuentemente, a infecciones microbianas del tracto respiratorio {por ejemplo, rinovirus, virus de la influenza, Haemophilus influenza, etc.). Los ataques asmáticos se pueden activar por factores ambientales (por ejemplo, ascárides, insectos, animales (por ejemplo, gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsters, conejillos de indias y pájaros), hongos, contaminantes atmosféricos {por ejemplo, humo del cigarrillo), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, químicos, polen, ejercicio, o aire frío. Aparte del asma, las diversas enfermedades inflamatorias crónicas que afectan el pulmón se caracterizan por infiltración neutrófila de las vías respiratorias, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), neumonía bacteriana y fibrosis cística (Linden y otros, Eur. Respir. J. 15:973-977, 2000; Rahman y otros, Clin. Immunol. 115:268-276, 2005), y las enfermedades tales como COPD, rinitis alérgica y fibrosis cística se caracterizan por hiperreactividad de las vías respiratorias (Fahy y O'Byrne, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:822-823, 2001). Los modelos animales comúnmente usados para el asma e inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de exposición a la ovalbúmina y los modelos de sensibilización de metacolina (Hessel y otros, Eur. J. Pharmacol. 293:401-412, 1995). Además, se puede usar como modelo in vitro la inhibición a la producción de la citocina y quimocina a partir de células epiteliales bronquiales humanas cultivadas, fibroblastos bronquiales o células musculares lisas de las vías respiratorias. La administración de antagonistas de la presente invención a cualquiera de estos modelos se puede usar para evaluar el uso de dichos antagonistas en el alivio de los síntomas y la modificación del curso del asma, inflamación de las vías respiratorias, COPD y similares.
Otras enfermedades inflamatorias y neuropatías, las cuales se pueden prevenir o tratar por los métodos de la invención, son aquellas causadas por las enfermedades autoinmunitarias. Estas enfermedades y neuropatías incluyen esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, y trastornos neurodegenerativos y del sistema nervioso central (SNC) que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, el trastorno bipolar y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)), las enfermedades biliares que incluyen cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis, fibrosis, virus C de la hepatitis (VHC) y virus B de la hepatitis (VHB), diabetes y resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares que incluyen aterosclerosis, hemorragia cerebral, derrame cerebral, infarto al miocardio, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriática y artritis reumatoide juvenil (ARJ), osteoporosis, osteoartritis, pancreatitis, fibrosis, encefalitis, soriasis, artritis de células gigantes, espondilitis anquilosante, hepatitis autoimmune, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), enfermedades inflamatorias dermatológicas, transplante, cáncer, alergias, enfermedades endocrinas, recuperación de una herida, otros trastornos autoimmunes, hiperreactividad de las vías respiratorias o trastornos o infecciones celulares, virales o transmitida por priones.
La artritis, que incluye la osteoartritis, la artritis reumatoide, las articulaciones con artritis como resultado de una lesión, y similares, es una enfermedad inflamatoria común que se podrá beneficiar con el uso terapéutico de las proteínas antíinflamatorias, tales como las antagonistas de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Los ligandos TLR3 podrían estar presentes en el lugar de la inflamación dado que la artritis reumatoide resulta en daño tisular. La activación de la señal TLR3 puede prolongar la inflamación y daño tisular posterior en la articulación inflamada. Diversos modelos animales para la artritis reumatoide se conocen en la materia. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollaron artritis inflamatoria crónica que es muy parecida a la artritis reumatoide humana. La administración de los antagonistas TLR3 de la presente invención a los ratones del modelo CIA se puede usar para evaluar el uso de estos antagonistas para aliviar los síntomas y modificar el curso de las enfermedades.
La diabetes mellitus, diabetes, se refiere a un proceso de la enfermedad que se deriva a partir de factores de múltiples causas y se caracteriza por la hiperglicemia (LeRoith y otros, (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, Pa. Estados Unidos, 1996), y todas las referencias que se citan en él. La hiperglicemia no controlada se asocia con una mortalidad prematura y una tasa de mortalidad incrementada debido a un riesgo incrementado de enfermedades microvasculares y macrovasculares, que incluyen nefropatía, neuropatía, retinopatía, hipertensión, enfermedad cerebrovascular y enfermedad cardiaca coronaria. Por lo tanto, el control de homeostasis es un enfoque críticamente importante para el tratamiento de la diabetes.
Los defectos subyacentes conllevan a una clasificación de la diabetes en dos grandes grupos: diabetes tipo I (diabetes mellitus dependiente de insulina, DMID), que se presenta cuando el paciente sufre de una falta de células beta productoras de insulina en sus glándulas pancreáticas, y diabetes tipo 2 (diabetes mellitus no dependiente de insulina, DMNID), que ocurre en pacientes con una discapacidad en la secreción de insulina de las células beta y/o resistencia a la acción de la insulina.
La diabetes de tipo 2 se caracteriza por una resistencia a la insulina acompañada por una relativa, más que absoluta, deficiencia de la insulina. En los individuos resistentes a la insulina, el cuerpo segrega cantidades anormalmente altas de insulina para compensar este defecto. Cuando están presentes cantidades inadecuadas de insulina para compensar la resistencia a la insulina y el control adecuado de glucosa, se realiza un estado de tolerancia a la discapacidad de glucosa. En un número significativo de individuos, la secreción de glucosa disminuye posteriormente y los niveles de glucosa plásmica suben, lo que resulta en un estado clínico de diabetes. La inflamación asociada a la obesidad se ha implicado, contundentemente, con el desarrollo de la resistencia a la insulina, la diabetes de tipo 2, la dislipidemia y las enfermedades cardiovasculares. La adiposidad exagerada recluta y retiene los macrófagos y puede producir citocinas proinflamatorias en un número excesivo que incluyen TNF-a y IL-6, adipocinas y ácidos grasos libres, los cuales pueden interferir con la señal de insulina e inducir a la resistencia a la insulina. La activación de TLR3 en los macrófagos puede contribuir en el estado proinflamatorio del tejido adiposo. Se conocen diversos modos animales de resistencia a la insulina. Por ejemplo, los animales desarrollan hiperglicemia y resistencia a la insulina además de un aumento de peso en un modelo de obesidad inducida por dieta (OID). La administración de los antagonistas TLR3 de la presente invención al modelo OID se puede usar para evaluar el uso de los antagonistas para aliviar las complicaciones asociadas con la diabetes de tipo 2 y modificar el curso de la enfermedad.
Los casos de cáncer ilustrativos pueden incluir al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de célula B o célula T, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células capilares, síndrome mielodisplásico (SMD), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, carcinoma de células renal, cáncer de mamas, carcinoma nasofaríngeo, histíocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, sarcomas, melanoma maligno, particularmente melanoma metastásico, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con cáncer y dolor óseo relacionado con cáncer.
Las enfermedades cardiovasculares pueden incluir enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente que incluyen, pero no se limitan a, síndrome de aturdimiento miocárdico, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, derrame cerebral, derrame cerebral isquémico, hemorragia, arteriesclerosis, aterosclerosís, restenosis, enfermedad aterosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascuiar, síncope, shock, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardíaca, cor pulmonale, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardiacas, latidos ectópicos atriales, aleto atrial, fibrilación atrial (sostenida o paroxysmal), síndrome postperfusión, respuesta inflamatoria al bypass cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica o multifocal, taquicardia regular de QRS estrecho, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias del haz de His, bloque atrioventricular, bloque completo de rama derecha, trastorno isquémico del miocardio, enfermedad arterial coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, miocardiopatía, miocardiopatía congestiva dilatada, miocardiopatía restrictiva, enfermedad valvular cardiaca, endocarditis, enfermedad del pericardio, tumores cardiacos aneurismas periféricos y aórticos, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastorno vascular periférico, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad arterioesclerótica periférica, thromboangeitis obliterans, enfermedad arterial periférica funcional, enfermedad y fenómeno de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, síndrome posbomba y lesión por reperfusión isquemia.
Las enfermedades neurológicas pueden incluir enfermedad neurológica en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, migrañas, complejo SIDA demencia, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transverso aguda; trastorno extrapiramidales y cerebelosos tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios básales o trastornos cerebelares; trastornos de movimiento hipocinético tales como Corea de Huntington y corea senil; trastornos de movimiento inducidos por fármacos, tales como aquellos inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina CNS; trastornos de movimiento hipoquinético tales como la enfermedad de Parkinson; Palsy supranuclear progresivo; lesiones estructurales del cerebelo; degeneración espinocerebelosa tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales del cerebelo, degeneraciones del sistema múltiples ( encel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, y trastorno mitocondrial multisistémico); trastornos de núcleo por demielinación tales como esclerosis múltiple, mielitis tranverso aguda; y trastornos de la unidad motora tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del asta anterior tales como esclerosis lateral amiotrofica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down a mediana edad; enfermedad difusa por cuerpos de Lewy; demencia senil por cuerpos de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz y demencia pugilística.
Las enfermedades ficróticas pueden incluir fibrosis del hígado (que incluye pero no se limita a cirrosis inducida por alcohol, cirrosis inducida por virus, hepatitis inducida autoinmune); fibrosis pulmonar (que incluye, pero no se limita a, escleroderma, fibrosis pulmonar idiopática); fibrosis del riñon (que incluye, pero no se limita a, escleroderma, nefritis diabética, nefritis glomerular, nefritis por lupus); fibrosis dérmica (que incluye, pero no se limita a, escleroderma, cicatrices queloídes e hipertróficas, quemaduras); mielofibrosis; neurofibromatosis; fibroma; fibrosis intestinal; y adhesiones fibróticas resultantes de los procedimientos quirúrgicos. En dicho método, la fibrosis puede ser fibrosis sistémica o fibrosis específica de órgano. La fibrosis específica de órgano se puede asociar con al menos una de fibrosis pulmonar, fibrosis del hígado, fibrosis del riñon, fibrosis cardiaca, fibrosis vascular, fibrosis dérmica, fibrosis de los ojos, fibrosis de la médula ósea u otras fibrosis. La fibrosis pulmonar se puede asociar con al menos una de fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, asma, sarcoidosis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La fibrosis del hígado se puede asociar con al menos una de cirrosis, esquistomasomiasis o colangitis. La cirrosis se puede seleccionar de cirrosis alcohólica, cirrosis posthepatitis C, cirrosis biliar primaria. La colangitis es colangitis esclerosante. La fibrosis de los ríñones se puede asociar con nefropatía diabética o lupus glomeruloescelerosis. La fibrosis cardiaca se puede asociar con infarto de miocardio. La fibrosis vascular se puede asociar con restenosis coronaria de postangioplastía o aterosclerosis. La fibrosis dérmica se puede asociar con cicatrices de quemaduras, cicatrices hipertróficas, queloides, o dermopatía fibrosante nefrogénica. La fibrosis ocular se puede asociar con fibrosis retro-orbital, cirugía postcataratas o vitreoretinopatía proliferativa. La fibrosis de la médula ósea se puede asociar con mielofibrosis idiopática o mielofibrosis inducida por fármacos. Las otras fibrosis se pueden seleccionar a partir de enfermedad de Peyronie, contractura de Dupuytren o dermatomiositis. La fibrosis sistémica puede ser esclerosis sistémica o enfermedad del injerto contra el huésped.
Administración/Composiciones farmacéuticas La "cantidad efectiva terapéutica" del agente efectiva en el tratamiento o prevención de las enfermedades donde la supresión de la actividad TLR3 es deseable se puede determinar por técnicas de búsqueda estándar. Por ejemplo, la dosis del agente que será efectiva en el tratamiento o prevención de las enfermedades inflamatorias tales como asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa o artritis reumatoide se puede determinar por la administración del agente para modelos animales relevantes tales como los modelos descritos en la presente invención.
Adicionalmente, los ensayos in vitro se pueden emplear, opcionalmente, para ayudar a identificar intervalos óptimos de dosis. La selección de una dosis efectiva particular se puede determinar (por ejemplo, mediante estudios clínicos) por aquellos con experiencia en la materia en base a la consideración de diversos factores. Dichos factores incluyen la enfermedad que se tratará o prevendrá, los síntomas involucrados, la masa corporal del paciente, el estado inmune del paciente y otros factores conocidos por el técnico con experiencia. La dosis precisa a emplearse en la formulación dependerá, además, de la ruta de administración y la gravedad de la enfermedad, y deberá decidirse de conformidad con el juicio del profesional y las circunstancias de cada paciente. La dosis efectiva se puede extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas a partir de sistemas de prueba del modelo animal o in vitro.
En los métodos de la invención, el antagonista TLR3 se puede administrar solo o en combinación con al menos otra molécula. Dichas moléculas adicionales pueden ser otra molécula antagonista TLR3 o moléculas con un beneficio terapéutico sin la transmisión de la señal del receptor TLR3. Los antibióticos, antivirales, paliativos y otros compuestos que reducen la actividad o niveles de citocina son ejemplos de dichas moléculas adicionales.
El modo de administración para uso terapéutico del agente de la invención puede ser cualquier modalidad que suministre el agente al huésped. Las composiciones farmacéuticas de estos agentes para la administración parenteral son particularmente útiles, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutáneo o intranasal.
El agente de la invención se puede preparar como una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva del agente como un ingrediente activo del portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra la composición activa. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos tales como agua y aceites que incluyen aquellos de origen sintético, vegetal, animal o petróleo tales como aceite de cacahuate, aceite de frijol de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Por ejemplo, se puede usar una solución salina al 0.4 % y glicina al 0.3 %. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de material particulado. Se deben esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales y conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden tener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para acercar las enfermedades fisiológicas tales como agentes amortiguadores y de ajuste del pH, agentes de estabilización, espesamiento, lubricación y de coloración, etc. La concentración del agente de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de 0.5 %, usualmente o al menos aproximadamente 1 % a tanto como 15 ó 20 % en peso y se seleccionará, principalmente, en base a la dosis, volumen de fluido, viscosidades, etc. requeridos, de conformidad con el modo particular de administración seleccionado.
Así, una composición farmacéutica de la invención para inyecciones intramusculares se podría preparar para contener 1 mi de agua amortiguada estéril y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o más, preferentemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de una antagonista anticuerpo de TLR3 de la invención. Similarmente, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa se podría elaborar para contener aproximadamente 250 mi de solución de Ringer estéril, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y, preferentemente, de 5 mg a aproximadamente 25 mg de un antagonista de la invención. Los métodos actuales de preparación de composiciones administrables vía parenteral son bien conocidas y se describen en más detalle en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15° Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los antagonistas anticuerpos de la invención se pueden liofilizar para almacenamiento y reconstruir en un portador adecuado antes de usar. Esta técnica ha demostrado ser efectiva con immunoglobulinas convencionales y se puede usar preparaciones de proteínas y técnicas de reconstitución y liofilización conocidas en la materia.
La presente invención se describirá ahora en relación a los siguientes ejemplos específicos no limitantes.
EJEMPLO 1 Identificación y derivación de mAb antagonista TLR3 anti-humano La genoteca de anticuerpos recombinantes humanos MorphoSys (HuCAL®) genoteca Gold de expresión en Fango (Morphosys AG, Martinsried, Alemania) se usó como una fuente de fragmentos de anticuerpos humanos y se separó contra un antígeno TLR3 purificado que se generó a partir de la expresión de aminoácidos 1-703 de TLR3 (huTLR3) (SEQ ID NO: 4) humano con un tag C-terminal de poli-histidina y se purificó mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado. Los aminoácido 1-703 corresponden al dominio extracelular (ECD) predecido de TLR3 humano. Los fragmentos Fab (Fab) que se unen específicamente a ECD TRL3 humano se seleccionaron mediante la presentación de la proteína TLR3 en una variedad de formas de tal manera que un conjunto diverso de fragmentos de anticuerpo se pudo identificar, secuenciar y confirmar como único. A partir de diferentes estrategias de adsorción, 62 candidatos (secuencias con diferentes regiones V) se identificaron como aglutinantes hTLR3 ECD únicos.
Los 62 candidatos identificados como aglutinantes huTLR3 ECD se seleccionaron para neutralizar la actividad en un intervalo de ensayo en base a células en relación a la identificación de actividad antiinflamatoria. Al usar datos de actividad preliminar (véase Ejemplo 2 más abajo), cuatro candidatos (Fabs 16-19) que definen las familias 16-19 se seleccionaron a partir de 62 como parentales para la maduración CDR de CDR2 (HCDR2) de cadena pesada y CDR3 (LCDR3) de cadena ligera. Uno de los candidatos parentales (candidato 19) exhibió un sitio unido a N-glicolosación en HCDR2; se realizó una mutación Ser a Ala (S a A) en este candidato para borrar el sitio. Al seguir la maduración CDR de los cuatro candidatos parentales, un total de 15 candidatos de progenie (candidatos 1-15) se identificaron para caracterización posterior como se describe en el Ejemplo 2 más abajo. Una lista de las regiones variables de cadena pesada y ligera presente en cada uno de los 19 candidatos se muestra en la Tabla 3 anteriormente. Los candidatos se refieren en la presente invención como mAb 1-19 o Fabs 1-19, dependiendo de si son Fabs o clonados como cadenas de anticuerpo en toda su extensión (Ejemplo 3). Debido al diseño del vector de expresión, el amino-terminal maduro de las regiones variables para todos los candidatos fue QVE para la cadena pesada y DI para la cadena ligera. Las secuencias preferidas en estos terminales son aquellos en los genes germinales respectivos con alta identidad a las secuencias candidatas. Para las familias 17 y 18 las secuencias germinales son QVQ para VH y SY para VL. Para la familia 19, las secuencias son EVQ para VH y DI para VL. La secuencia SY es única para el subgroupo lambda 3 y existen reportes de heterogeneidad con S o Y como el residuo amino terminal. Así, el terminal de consenso QSV del subgroupo lambda 1 prominente se consideró un reemplazo más adecuado para DIE para VL de las familias 17 y 18. Estos cambios se introdujeron en los candidatos 9, 10 y 12 de la familia 18 y los candidatos 14 y 15 de la familia 19. En este proceso, las regiones VH y VL de estos anticuerpos son codones optimizados. Las secuencias de aminoácido de las variantes germinales de la región N-terminal variable de cadena ligera 9, 10 y 1 se muestran en la SEQ ID NO: 209-211 , y las secuencias de aminoácido de las variantes germinales de la región N-terminal variable de cadena pesada para los candidatos 9, 10, 12, 14, y 15 se muestran en la SEQ ID NO: 212-216, respectivamente. Las variantes N-terminal de los candidatos son referidas en la presente invención como candidato/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ. Las variantes germinales N-terminal se expresaron como mAb y no mostraron algún efecto en la aglutinación a TLR3 o en su habilidad para inhibir la actividad biológica TLR3 cuando se comparan con sus contrapartes (no se muestra los datos).
EJEMPLO 2 Determinación de la actividad antagonista de TLR3 in vitro Los candidatos 15 CDR madurados descritos anteriormente se seleccionaron como terapéuticos humanos potenciales y se determinaron una variedad de actividades de unión y neutralización. Los ensayos de actividad y los resultados para los cuatro Fab parentales, Fab 16-19, Fab 15 CDR madurados, Fab 1-15 o sus variantes de región V no germinales se describen a continuación.
Inhibición de cascada de señalización NF- ?? y ISRE Las células 293T fueron cultivadas en medios de DMEM y GlutaMax (Invitrogen, Carisbad, CA) suplementados con FBS activado por calor y transfectado con 30 ng de pNF-?? o plásmidos reporteros de photinus-luciferina-4-monooxigenasa ISRE, 13.5 ng de vector pcADN3.1 , 5 ng de phRL-TK, y 1.5 ng de FL TLR3 que codifica pCADN (SEQ ID NO: 2). El plásmido phRL-TK contiene el gen luciferasa Renilla impulsado por el promotor de timidina quinasa del HSV-1 (Promega, Madion, Wl). Los anticuerpos TLR3 fueron incubados 30-60 min. antes de la adición de poli(l:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Las placas fueron incubadas 6 h o 24 h a 37 °C antes de la adición del reactivo luciferasa Dual-Glo, y las placas se leyeron en un lector de placas FLUOstar. Los valores normalizados (índices de luciferasa) se obtuvieron al dividir el RLU de luciérnaga por el RLU de Renilla. Luego de la estimulación con el agonista de TLR3 poli (l:C) (1 g/ml), la producción de photinus-luciferina-4-monooxigenasa estimulada por cascada de señalización NF- KB O ISRE fue inhibida específicamente mediante la incubación de células con anticuerpos anti-TLR3 (0.4, 2.0 y 10 pg/ml) antes de la estimulación. Los resultados para los ensayos de NF- KB se muestran en la Fig. 1 y se expresan como el % de inhibición de la relación Luciérnaga/Renilla con 5465 como el control positivo (Mab TLR3 de neutralización antihumano) y el factor de tejido antihumano mAb (859) como el control de isotipo lgG4 humano. >Se logró 50 % de inhibición con concentraciones de mAb de 0.4 a 10 pg/ml. El c1068 y TLR3.7 inhibieron aproximadamente 38 % y 8 % de actividad biológica de TLR3 en 10 pg/ml. Se obtuvieron resultados similares con el ensayo del gen reportero de ISRE (no se muestran los datos).
Liberación de citocina en células BEAS-2B Las células BEAS-2B (línea de células epiteliales bronquiales de ser humano normal transformadas SV-40) se sembraron en placas recubiertas con colágeno tipo I y se incubaron con o sin anticuerpos TLR3 antihumano antes de la adición de poli (l:C). Se recolectó el sobrenadante veinticuatro horas después de los tratamientos y se evaluó para determinar los niveles de citocina y quimocina con el uso de un ensayo de microesferas multiplex para la detección de IL-6, IL-8, CCL-2/MCP-1 , CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10. Los resultados se muestran en los Cuadros A y B como el % de inhibición de la citocina/quimocina individual que siguen el tratamiento con mAb en 0.4, 2.0 y 10 pg/ml. El 5465 es un control positivo; el 859 es un control de isotipo.
Efecto (% de inhibición) o anti-huTLR3 mAb en un ensayo de BEAS-2B CUADRO A CUADRO B Liberación de citocina en células NHBE La liberación de citocina también se evaluó en células epiteliales bronquiales de un ser humano normal (NHBE) (Lonza, Waikersville, MD). Las células NHBE se expandieron y transfirieron a placas recubiertas con colágeno y se incubaron durante 48 horas después de las cuales el medio se eliminó y se volvió a llenar con 0.2 mi de medio fresco. Luego, las células fueron incubadas con o sin mAb TLR3 antihumano 60 minutos antes de la adición de poli (l:C). Se recolectó el sobrenadante después de 24 horas y se almacenó a 20 °C o se evalúo inmediatamente para determinar los niveles de IL-6. Se graficaron los resultados en las Figs. 2A-2B como el % de inhibición de la secreción de IL-6 seguida del tratamiento de mAb con el uso de dosis entre 0.001 y 50 pg/ml. El 5465 es un control positivo, el 859 es un control de isotipo. La mayoría de mAb inhibieron al menos 50 % de la producción de IL-6 en <1 Mg/ml, y lograron 75 % de inhibición en <5 pg/ml.
Liberación de citocina en células PBMC También se hizo ensayos de liberación de citocina en células mononucleares de sangre periférica de ser humano (PBMC, por sus siglas en inglés). Se recolectó toda la sangre de donantes humanos en tubos de recolección de heparina a los cuales se revistió lentamente por debajo con una solución de Ficoll-Paque Plus. Se centrifugaron los tubos y las PBMC que formaron una capa blanca justo por encima de la solución de Ficoll se recubrieron y sembraron en placas. Luego, las PBMC se incubaron con o sin mAb TLR3 antihumano antes de la adición de 25 pg/ml de poli(l:C). Después de 24 h se recolecto el sobrenadante y se determinaron los niveles de citocina con el usos de tecnología Luminex. Los resultados se graficaron en la Fig. 3 como un porcentaje acumulativo de inhibición de IFN-?, IL-12 y IL-6 con el uso de una sola dosis de mAb (0.4 Mg/ml) con 5465 es un control positivo y; hlgG4 es un control de isotipo.
Liberación de citocina en células HASM Brevemente, las células de las vías respiratorias humanas de músculo liso (HASM, por sus siglas en inglés) se incubaron con o sin mAb TLR3 antihumano antes de la adición de una combinación sinergística de 500 ng/ml de poli(l:C) y 10 ng/ml de TNF-a. Después de 24 h, se recolectó el sobrenadante y los niveles de citocina fueron determinados con el usos de tecnología Luminex. Los resultados se grafican en las Figs. 4A-4B como los niveles de la quimocina CCL5/RANTES con el usos de dosis de mAb (0.4, 2 y 10 pg/ml). 5465 es un control positivo; hlgG4 es un control de isotipo.
Los resultados de los ensayos in vitro en células humanas confirman la habilidad de los anticuerpos de la invención para reducir la liberación de citocina y quimocina como un resultado de la unión a huTLR3.
EJEMPLO 3 Constructos de anticuerpo en toda su extensión Se clonaron cuatro Fab parentales (candidatos núm. 16-19) y 15 cadenas pesadas de Fab progenie (candidatos num. 1-15) en un antecedente lgG4 de ser humano con una mutación S229P Fe. Los candidatos 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ fueron clonados en un antecedente lgG4 de ser humano con mutaciones F235A L236A y S229P Fe.
Las secuencias de aminoácidos maduros de cadena pesada en toda su extensión se muestran en la SEQ ID NO: 90-102 y 218-220 según se describe a continuación: Candidato SEQ ID NO: 16 90 17 91 18 92 19 93 94 95 96 97 98 8 99 9 100 10, 11 , 12 101 13, 14, 15 102 9EVQ 218 0EVQ, 2EVQ 219 14EVQ, 15EVQ 220 Como expresión, estas secuencias de cadena pesada pueden incluir una secuencia líder N-terminal tal como MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 103). Las secuencias de nucleótidos ilustrativos que codifican la cadena pesada de candidatos 14EVQ y 15EVQ con una secuencia líder y la forma madura (sin una secuencia líder) se muestran en la SEQ ID NO: 104 y 105, respectivamente. Igualmente, como expresión, las secuencias de cadena ligeras de los anticuerpos de la invención pueden incluir una secuencia líder N-terminal tal como MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 106). Las secuencias de nucleótidos ilustrativos que codifican la cadena ligera de candidato 15 de codón optimizado con una secuencia líder y la forma madura (sin una secuencia líder) se muestran en la SEQ ID NO: 107 y 108, respectivamente.
EJEMPLO 4 Caracterización de la unión mAb Anti-TLR3 Los valores EC50 para la unión de las mAb al dominio extracelular TLR3 humano (ECD, por sus siglas en inglés) se determinaron por ELISA. La proteína de ECD TLR3 humana se diluyó a 2 pg/ml en PBS y se dispensaron alícuotas de 100 µ? a cada pocilio de la placa de 96 pocilios (Corning Inc., Acton, MA). Después de la incubación durante toda la noche a 4 °C, se lavó la placa 3 veces en un tampón acuoso que consiste de 0.05 % de Tween-20 (Sigma-Aldrích) en PBS. Se bloquearon los pocilios con 200 µ? de solución de bloqueo que consiste de 2 % de l-Block (Applied Biosystems, Foster City, CA) y 0.05 % de Tween-20 en PBS. Después de bloquear por 2 horas a temperatura ambiente, se lavó la placa 3 veces seguido de la adición de diluciones en serie de los candidatos 1 a 19 de mAb anti-TLR3 en tampón de bloqueo. Los mAb anti-TLR3 fueron incubados por 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces. Esto fue seguido por la adición de oveja anti-lgG humana conjugado con peroxidasa (GE Healthcare, Piscataway, NJ) diluido 1 :4000 en tampón de bloqueo, incubado por 1 hora a temperatura ambiente seguido de 3 lavadas en tampón acuoso. La unión se detectó mediante la incubación de 10 a 15 minutos en TMB-S (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA). Se detuvo la reacción con 25 µ? 2N H2S04 y una lectura de absorbancia a 450 nm con sustracción a 650 nm con el usos de un espectrofotómetro SPECTRA Max (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Los valores EC50 se determinaron por regresión no lineal con el usos del software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
Los valores EC50 se determinaron para la unión a huTLR3 (Tabla 4) mediante la incubación con 100 µ? de diluciones en serie de 4 veces de mAb de 2.5 µg/ml a 0.6 pg/ml. Se incluyeron como controles negativos un factor de tejido antihumano mAb 859 y hu lgG4k.
TABLA 4 Candidato núm. EC50 (ng/ml) 1 17.18 2 53.12 3 23.42 4 12.77 5 19.94 6 19 7 16.13 8 18.58 9 22.61 10 15.84 11 26.33 12 25.59 13 23.51 14 33.59 15 32.64 16 43.66 17 13.8 18 9.68 19 66.54 La afinidad de unión para ECD huTLR3 también se determinó por análisis Biacore. Los datos (no se muestran) indicaron que los mAb 1 -19 tuvieron un Kd para ECD huTLR3 de menos de 10~8 M.
EJEMPLO 5 Unión competitiva de epítopos Los experimentos de unión de epítopos se realizaron para determinar los grupos de competencia de anticuerpo anti-TLR3 o "unión de epítopos".
Para el ELISA, se recubre 5 µ? (20 pg/ml) de proteína de ECD TLR3 humana generada según se describió en el Ejemplo 1 en una placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por pocilio por 2 h a temperatura ambiente. Se añade 150 µ? de 5 % de tampón A bloqueador MSD (Meso Scale Discovery) a cada pocilio y se incuba por 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón HEPES 0.1 M, pH 7.4, seguido de la adición de la mezcla de mAb anti-TLR3 etiquetado con diferentes competidores. Los anticuerpos etiquetados (10 nM) fueron incubados con concentraciones crecientes (1 nM a 2 µ?) de anticuerpos anti-TLR3 no etiquetados, y luego se añadieron a los pocilios designados en un volumen de mezcla de 25 µ?. Después de una incubación de 2 horas con agitación ligera a temperatura ambiente, se lavaron las placas tres veces con tampón HEPES 0.1 M (pH 7.4). Se diluyó el tampón T de lectura MSD con agua destilada (4 veces) y se dispensó a un volumen de 150 µ?/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000. Los anticuerpos se etiquetaron con MSD Sulfo-Tag™ NHS-ester de conformidad con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).
Se evaluaron los siguientes anticuerpos anti-TLR3: mAb 1-19 obtenido de la genoteca de anticuerpos recombinantes humanos MorphoSys (mostrada en la Tabla 3a); c 068 (descrito en la patente núm. WO06/060513A2), c1811 (mAb TLR3 de rata anti-ratón producido por un hibridoma generado de ratas inmunizadas con proteína TLR3 de ratones), TLR3.7 (eBiosciences, San Diego, CA, cat. no 14-9039) y IMG-315A (generado contra aminoácidos TLR3 humanos aminoácidos 55-70 (VLNLTHNQLRRLPAAN) de Imgenex, San Diego, CA). Para mAb 9, 10, 12, 14 y 15, se usaron las variantes 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ en este estudio.
Basados en ensayos de competencia, los anticuerpos anti-TLR3 se asignaron a cinco uniones distintas. Unión A: mAb 1 , 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; Unión B: mAb 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 1 1 , 12QVQ/QSV, 17, 18; Unión C: anticuerpo Imgenex IMG-315A; Unión D: anticuerpos TLR3.7, c1068; y unión E: anticuerpo c181 1 .
EJEMPLO 6 Mapeo de epítopos Los anticuerpos representativos de uniones de epítopos distintos según se describe en el Ejemplo 5 se seleccionaron para un mapeo de epítopos adicional. El mapeo de epítopos se realizó con el uso de diversos alcances, que incluyen experimentos de intercambio de segmentos de TLR3, mutagénesis, intercambio H/D y acoplamiento in silicio de proteína-proteína (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volumen 6, Glen E. Morris ed., 1996).
Intercambio de segmentos de TLR3. Las proteínas quiméricas humanas antiratón de TLR3 se usaron para localizar dominios de unión de anticuerpo gruesas en TLR3. El dominio extracelular de proteínas de TLR3 humanas se dividió en tres segmentos (aa 1-209, aa 210-436, aa 437-708 de conformidad con la numeración de aminoácidos basada en la secuencia de aminoácidos de TLR3 humanos, GenBank, acceso núm. NP_003256). La proteína quimérica MT5420 fue generada al reemplazar los aminoácidos 210-436 y 437-708 de TLR3 humanos mediante los aminoácidos de ratón correspondientes (TLR3 de ratón, GenBank, acceso núm. NP_569054, aminoácidos 21 1-437 y 438-709). La quimera MT6251 fue generada al reemplazar los aminoácidos humanos en las posiciones 437-708 mediante aminoácidos TLR3 de ratón (TLR3 de ratón, GenBank, acceso núm. NP_569054, aminoácidos 438-709). Todos los constructos fueron generados en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carslbad, CA) con el usos de procedimientos de clonación estándar. Las proteínas fueron expresadas de forma pasajera en las células HEK293 como proteínas de fusión C-terminal V5-His6, y purificadas según se describe en el Ejemplo 1 . mAb c1068. MAB c 068 ECD ligado a TLR3 humano con alta afinidad, pero no se unen bien a murino TLR3. c1068 perdió su capacidad para unirse a MT5420 y MT6251 , lo que demuestra que el lugar de unión fue ubicado dentro de los aminoácidos 437-708 de la proteína TLR3 humana WT. mAb 12QVQ/QSV. mAb 12QVQ/QSV ligados a ambas quimeras, que indican que el lugar de unión para mAb 12QVQ/QSV fue ubicado dentro de los aminoácidos 1 -209 de la proteína TLR3 humana que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2.
Acoplamiento proteína-proteína in silicio. La estructura de cristal de mAb 15EVQ (véase más abajo) y la estructura TLR3 humana publicada (Bell y otros., J. Endotoxin Res. 12:375-378, 2006) fueron minimizados con energía en CHARMm (Brooks y otros., J. Computat. Chem. 4:187-217, 1983) para usar como los modelos iniciales para el acoplamiento. El acoplamiento de proteínas se realizó con ZDOCKpro 1 .0 (Accelrys, San Diego, CA), que es equivalente a ZDOCK 2.1 (Chen and Weng, Proteins 51 : 397-408, 2003) con una rejilla angular de 6 grados. Los residuos de Asn del lugar de glicosilasíón N-vinculados en TLR3 humanos (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291 , 398, 413, 507 y 636) (Sun y otros., J. Biol. Chem. 281 :1 1 144-1 1 151 , 2006) fueron bloqueados de participar en la interfase de complejo anticuerpo-antígeno mediante un término de energía en el algoritmo ZDOCK. Se generaron y agruparon 2000 colocaciones iniciales y las colocaciones de acoplamiento fueron perfeccionadas y reevaludas en RDOCK (Li y otros., Proteins 53:693-707, 2003). Las 200 colocaciones con los puntajes ZDOCK iniciales más altos y se examinaron visualmente las 200 mejores colocaciones RDOCK.
La cristalización de mAb 15EVQ se realizó mediante el método de difusión de vapor a 20 °C (Benvenuti and Mangani, Nature Protocols 2:1633-51 , 2007). La evaluación inicial se estableció con el uso de un robot Hydra en placas de 96 pocilios. Los experimentos estuvieron compuestos de gotitas de 0.5 µ? de solución de proteina mezclada con 0.5 µ? de solución de receptáculo. Las gotitas fueron equilibradas en comparación con la solución del receptáculo de 90 µ?. La solución Fab en una solución de tampón Tris de 20 mM, pH 7.4, que contiene 50 mM de NaCI se concentró a 14.3 mg/ml con el uso de células de Amicon Ultra-5 kDa. La evaluación se realizó con el Wizard I & II (Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA) y en pantallas de cristalización internas.
Se recolectaron y usaron los datos de difracción por rayos X con el uso del generador de microfocus de rayos X, Rigaku MicroMax™-007HF equipado con un detector CCD de óptica confocal Satum 944 de Osmic™ VariMax™ y un sistema de enfriamiento criogénico X-stream™ 2000 (Rigaku, Woodlands, TX). Las intensidades de difracción fueron detectadas sobre una rotación de cristal de 270° con el tiempo de exposición de 120 s por imagen de medio grado. Los datos de rayos X fueron procesados con el programa D*TREK (Rigaku). La estructura fue determinada mediante el método de remplazo molecular con el uso del programa Phaser o CNX (Accelrys, San Diego, CA). Las posiciones atómicas y los factores de temperatura fueron perfeccionados con REFMAC con el uso de todos los datos en el intervalo de resolución 15-2.2 Á para mAb 15 y 50-1.9 A para mAb 12. Las moléculas acuosas se añadieron en los puntos máximos (F0-Fc) de densidad electrónica con el uso del nivel de rechazo de 3s. Todos los cálculos cristalográficos se realizaron con el paquete de programas CCP4 (Proyecto en colaboración computacional, número 4. 1994. El paquete CCP4: programas para cristalografía de proteínas. Acta Crystallogr. D50:760-763). Los ajustes del modelo se realizaron con el uso del programa COOT (Emsley y otros, Acta Crystallogr. D60:2126-2132, 2004).
La estructura del cristal decidida de mAb 15EVQ mostró que el lugar de combinación del anticuerpo fue caracterizada por un número de residuos cargados negativamente en la cadena pesada (D52, D55, E99, D106 and D 09). Por consiguiente, el reconocimiento entre mAb 15EVQ y TLR3 lo más probable es que involucre residuos cargados positivamente. Las simulaciones de acoplamiento de proteína-proteína realizadas sugirieron que dos grandes placas en TLR3 que involucran residuos con múltiples cargas positivas mostraron buena complementariedad con el anticuerpo. Los residuos en TLR3 en la interfase de los complejos simulados de TLR3 - anticuerpo anti-TLR3 fueron R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 y K493.
Estudios de mutagénesis. Las mutaciones puntuales individuales y en combinación fueron introducidas en los residuos de superficie de ECD TLR3 en las regiones identificadas anteriormente para contener los epítopos de mAb 12 y mAb 15EVQ y las proteínas mutantes fueron evaluadas para la unión con el anticuerpo.
La secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-703 de TLR3 humanos (el ECD), (SEQ ID NO: 4; GenBank, acceso núm. NP_003256), fue clonada con el usos de protocolo estándar. Todos los mutantes fueron generados por mutagénesis dirigida con el usos del equipo Strategene Quickchange II XL (Stratagene, San Diego, CA) de conformidad con el protocolo del fabricante, con el usos de los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5a. Las mutaciones fueron verificadas mediante secuencia de ADN. Las proteínas fueron expresadas bajo un promotor de CMV como las fusiones C-terminal His-tag en células HEK293, y purificadas según se describe en el Ejemplo 1.
TABLA 5A.
Oligonucleotidos usados para mutagénesis dirigida. Se muestran las secuencias de oliqonucleótidos antisentido. Los oligonucleotidos antisentido con secuencias complementarias se usaron en la reacción de mutagenesis.
Ensayos de unión. Se evaluó mediante ELISA la actividad de unión de mAb 12QVQ/QSV y mAb 15EVQ a TLR3 humano y las variantes generadas. Para agilizar el proceso, los mutantes en el lugar de unión mAb 15EVQ pronosticado fueron coexpresados en células HEK mediante cotransfección de muíante TLR3 ECD que contiene una etiqueta C-terminal His con mAb 12QVQ/QSV, seguida de la purificación por cromatografía de afinidad metálica. La muestra recuperada fue un complejo del muíante TLR3 con mAb 12. Esíe alcance facíible debido a que los lugares de unión mAb 12QVQ/QSV mAb 15EVQ esíán distantes entre sí; y por consiguiente, es poco probable que las mutaciones de punto en un lugar afecten el epítopo y el otro lugar. Estos complejos se usaron en los ensayos de unión ELISA. Se cubrieron 5 µ? por pocilio de 20 pg/ml de ECD TLR3 íipo silvestre o proteínas muíaníes en una placa de unión elevada de MSD (Meso Scale Discovery, Gaiíhersburg, MD). Se incubaron las placas a temperatura ambiente por 60 min y se bloquearon durante toda la noche en un tampón A de bloqueo de MSD (Meso Scale Discovery, Gaiíhersburg, MD) a 4 °C. Al día siguieníe, se lavaron las placas y se añadió el mAb 15EVQ MSD etiquetado Sulfo-tag añadido en concentraciones de 500 pM a 1 pM por 1 .5 horas. Después de lavar el anticuerpo etiquetado, se detecíó con el uso de tampón T de lectura de MSD y las placas se leyeron con el uso de un generador de imágenes SECTOR 6000. Para evaluar la actividad de unión de mAb 12QVQ/QSV a TLR3 humana y sus variantes, se realice la coexpresión con mAb 15EVQ y se realizaron los ensayos de unión ELISA, según se describe para mAb 15EVQ, excepto que el anticuerpo de detección se etiquetó mAb 12QVQ/QSV. mAb 12QVQ/QSV: el lugar de unión para mAb 12QVQ/QSVse ubicó dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína TLR3 humana, según se determina en los estudios de intercambio de segmentos. Se evaluaron los siguientes mutantes de TLR3: D1 16R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E y Q167A. El muíante tipo silvestre de TLR3 y V144A mostró una unión comparable a mAb 12QVQ/QSV (Figura 5A). El anticuerpo no se unió al muíante D1 16R de TLR3 y tuvo una afinidad de unión significaíivameníe reducida al muíante K145E. Por consiguiente, los residuos de D1 16 y K145 que se oponen estrechameníe en la superficie del TLR3, fueron ideníificados como lugares claves de epílopo para mAb 12QVQ/QSV (Figura 6A).
Los dos residuos crílicos del epííopo de unión de 12QVQ/QSV mAb fueron ubicados cerca de la cara del lugar de unión de dsRNA en el segmento N-terminal del ecíodominio de TLR3 (Pirher, y otros, Naíure Sírucl. & Mol. Biol., 15:761-763, 2008). El epítopo complete contendrá otros residuos en las regiones cercanas, que no se revelaron medíanle el análisis muíacional realizado. Sin desear eslar limiíados a cualquier teoría en particular, se cree que la unión de mAb 12QVQ/QSV en su epítopo de TLR3 puede interferir direcla o indireclamenle con la unión dsRNA en el ectodominio de TLR3, y por ello interrumpir la dimerización del receptor y la activación de los trayecíos de señalización descendentes. mAb 15EVQ: se evaluaron los siguientes mutantes de TLR3: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, Q538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, un mutante doble K467E/Y468A, un mutante triple T472S/R473T/N474S y un mutante triple R488E/R489E/K493E. Los mutantes de tipo silvestre de TLR3, los mutantes R64E, K182E, K416E y el mutante triple T472S/R473T/N474S mostraron unión comparable a mAb 15EVQ (Figura 5B y Tabla 5b). El anticuerpo no se unió a los mutantes de TLR3, K467E, R489E, K467E/Y468A y R488E/R489E/K493E (Figura 5B y 5C). Las variantes restantes mostraron unión intermedia con la R488E, que tiene el efecto más grande. Todos estos mutantes unidos a mAb 12QVQ/QSV. Los resultados mostraron que los residuos K467 y R489 fueron determinantes críticos del epítopo de mAb 15EVQ. El residuo R488 también contribuyó con el epítopo. Los residuos se opusieron estrechamente en la misma superficie de TLR3 (Figura 6A). Los resultados mostraron que los residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541 , E570 y K619, todos en la misma superficie como K467, R488 y R489, contribuyeron al epítopo. Esta conclusión fue apoyada, además, por los estudios de intercambio de H/D con mAb 15EVQ. La Figura 6A muestra los lugares de unión de epítopos para mAb 12QVQ/QSV y 15EVQ (negro) y mAb C1068 (gris) superpuestos en la estructura de TLR3 humano. El epítopo para mAb 15EVQ cubre los residuos Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, Q538, H539, N541 , E570 y K619.
Estudios de intercambio H/D. Para el intercambio H/D, los procedimientos usados para analizar la perturbación de anticuerpos fueron similares a los descritos anteriormente (Hamuro y otros; J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn y otros; Biochemistry 45:8488-8498, 2006) con algunas modificaciones. Se incubó TLR3 ECD recombinante (expresada de células Sf9 con His-tag de C-terminal y purificada) las veces predeterminadas en una solución de agua deuterada, lo cual produjo la incorporación de deuterio en los átomos intercambiables de hidrógeno. La TLR3 ECD deuterada se capturó en una columna con mAb 15EVQ inmovilizado y después se lavó con un amortiguador acuoso. La proteína TLR3 ECD intercambiada a la inversa se eluyó de la columna y se determinó la localización de los fragmentos con deuterio por medio de digestión con proteasa y análisis de espectro de masa. Como un control de referencia, la muestra de TLR3 ECD se procesó de este modo, excepto que se expuso a agua deuterada únicamente después de la captura en la columna de anticuerpos y después se lavó y se eluyó de la misma manera que la muestra experimental. Se dedujo que las regiones unidas al anticuerpo eran los sitios relativamente protegidos del intercambio y, por lo tanto, contienen una fracción mayor de deuterio que la muestra de TLR3 ECD de referencia. Se podrían mapear los péptidos específicos de aproximadamente 80 % de la proteína. Los mapas de perturbación del intercambio H/D de TLR3 ECD por medio de mAb 15EVQ se muestran en la Figura 6B. Únicamente el segmento de TLR3 alrededor de la porción afectada por mAb 15EVQ se muestra para brindar claridad. El resto de la proteína que se extiende hacia los términos amino y carboxilo de TLR3 ECD no se afectó considerablemente.
Los estudios de intercambio H/D identificaron los segmentos de péptidos 465YNKYLQL4.7i , 514SNNNIANINDDML526 y 529LEKL532 de la SEQ ID NO: 2 como regiones en donde el intercambio de TLR3 se alteró particularmente mediante la unión a mAb 15EVQ. Por su naturaleza, el intercambio H/D es un método de mapeo lineal y, usualmente, no puede definir cuáles residuos dentro del segmento de péptidos se afectan más por la unión a anticuerpos Sin embargo, la amplia superposición entre el intercambio H/D y los resultados mutacionales da más seguridad de que la superficie que se muestra en la Figura 6A es el sitio de unión para mAb 15. Este sitio de unión estaba en la misma región lineal de la secuencia de aminoácidos tal como se describió anteriormente para mAb c1068 (publicación de la PCT núm. WO06/0605 3A2) pero se descubrió que estaba ubicado sobre una superficie completamente no superpuesta (Figura 6A) de acuerdo con la falta de competencia cruzada entre estos anticuerpos.
El epítopo de unión mAb 15EVQ estaba espacialmente proximal al sitio de unión dsRNA en el segmento C-terminal en TLR3 (Bell y otros; Proc. Nati. Acad. Sci. (Estados Unidos) 103: 8792-8797, 2006; Ranjith-Kumar y otros; J Biol Chem, 282: 7668-7678, 2007; Liu y otros; Science, 320: 379-381 , 2008). Sin la intención de estar limitados a una teoría en particular, se cree que la unión de mAb 15EVQ a su epítope TLR3 produce choques esféricos con una molécula del ligando dsRNA y/o el asociado dimérico, lo cual previene la unión del ligando y la dimerización del receptor inducida por ligandos.
TABLA 5B.
EJEMPLO 7 Generación de variantes con estabilidad térmica mejorada El diseño en base a la estructura se realizó para generar variantes de anticuerpos con estabilidad térmica incrementada, con esfuerzos simultáneos para mantener la actividad biológica y minimizar la inmunogenicidad. mAb 15EVQ se seleccionó para el diseño. Para minimizar la inmunogenicidad, únicamente se buscó las mutaciones de líneas germinales pronosticadas como beneficiosas en base a las consideraciones estructurales. Las secuencias VL y VH de mAb 15EVQ (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 216, respectivamente) se alinearon con genes de lineas germinales humanas con el uso de búsquedas BLAST. Las secuencias de líneas germinales más cercanas identificadas fueron de GenBank, acceso núm. AAC09093 y X59318 para VH y VL, respectivamente. Las siguientes diferencias se identificaron entre las líneas germinales VH, VL y las de las secuencias mAb 15EVQ VH y VL: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S y Q67H; (VL) G30S, L3 S y A34N. Las diferencias de las secuencias identificadas se mapearon sobre la estructura cristalina de mAb 15EVQ y los residuos pronosticados de alterar las interacciones de revestimiento e interfase se seleccionaron para el diseño. En base a la estructura cristalina del anticuerpo (véase el Ejemplo 6), se identificó potenciales residuos desestabilizantes de la estructura. (1 ) Se identificó una pequeña cavidad contenida dentro del núcleo de VH cerca de V34. Esta cavidad era lo suficientemente grande para alojar una cadena lateral ligeramente mayor como lie. (2) E99 de VH CDR3 estaba oculto en la interfase de VHA L sin una red de unión a H. El grupo carboxilato con carga negativa de E99 estaba en un ambiente generalmente hidrofóbico mayormente con contactos de van der Waals (vdw) con residuos vecinos. Ocultar un grupo con carga es, usualmente, energéticamente desfavorable y, por lo tanto, tiene un efecto desestabilizante. (3) F50 de VH es un residuo de la interfase VH/VL. Su cadena lateral aromática es voluminosa y, por lo tanto, puede tener un impacto negativo sobre el emparejamiento. Se calculó el enlace a H y las redes de empaque de vdw para el Fv y se examinó visualmente en Pymol (www://_pymol_org). Las cavidades ocultas en los dominios VH y VL se computaron mediante Caver (Petrek y otros; BMC Bioinformatics, 7:316, 2006). Todas las figuras gráficas moleculares se prepararon en Pymol. Se realizó mutaciones a los vectores de expresión que codifican fragmentos Fab o anticuerpos totalmente humanos lgG4 generados, tal como se describió en el Ejemplo 3, con el uso de técnicas estándar de clonación con el kit de mutagénesis sitio dirigida Quick Change II XL (Stratagene, San Diego, CA), kit de mutagénesis sitio dirigida Change-IT Múltiple Mutation (USB Corporation, Cleveland, OH) o el kit de mutagénesis sitio dirigida Quick Change II (Stratagene, San Diego, CA). Las reacciones se realizaron de conformidad con las recomendaciones de cada fabricante. Los clones obtenidos se secuenciaron para verificación y las variantes diseñadas resultantes se denominaron mAb 15-1 - 15-9. Un listado de las SEQ ID NO: para CDR, las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas y cadenas ligeras y pesadas en toda su extensión para mAb 15EVQ y sus variantes diseñadas se muestran en la Tabla 6. La Tabla 7 muestra los cebadores para generar cada variante.
TABLA 6 La unión de mAb 15-1 - 15-9 a TLR3 se evaluó mediante un inmunoensayo ELISA. El TLR3 ECD humano (100 µ? de 2 pg/ml TLR3-ECD) se unió a una placa negra Maxisorb (eBioscience) durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y se bloquearon y los anticuerpos diluidos se alicuotaron a 50 µ? por pocilio por duplicado en los pocilios. La placa se incubó a TA durante 2 horas con agitación suave. La unión se detectó con el uso de sustrato POD de luminiscencia (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, cat. núm. 1 1 582 950 001 ) y Fc:HRP anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, cat. núm. 109-035-098) y la placa se evaluó en un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
TABLA 7 p5069 como único gen para cadena pesada. Región variable de p5069 intercambiada con la cadena principal p5070 Se realizaron experimentos de DSC (por sus siglas en inglés) en un sistema auto VP-capilar de DSC de MicroCal (MicroCal, LLC, Northampton, MA), en donde las diferencias de temperatura entre las células de referencia y las células de muestra se determinaron continuamente y se calibraron a unidades de potencia. Las muestras se calentaron de 10 °C a 95 °C a una velocidad de calentamiento de 60 °C/hora. El tiempo antes de la exploración fue de 15 minutos y el período de filtrado fue de 10 segundos. La concentración usada en los experimentos de DSC fue de aproximadamente 0.5 mg/ml. El análisis de los termogramas resultantes se realizó con el uso del programa MicroCal Origin 7 (MicroCal, LLC).
La estabilidad térmica (Tm) de las variantes generadas se determinó mediante DSC (Tabla 8). La unión de las variantes de anticuerpos a TLR3 era comparable con la del anticuerpo progenitor.
Tabla 8 Resumen de las temperaturas de fusión (TM) de las variantes y base lógica para elaborarlas.
EJEMPLO 8 Generación de un anticuerpo anti-TLR3 sustituto Se generó un anticuerpo TLR3 antagonista quimérico anti-ratón de rata/ratón, en la presente descripción denominado mAb 5429, para evaluar los efectos de inhibición de la señalización de TLR3 en varios modelos in vivo, ya que los anticuerpos humanizados generados en el Ejemplo 1 no tuvieron suficiente especificidad o actividad antagonista para TLR3 de ratón. El mAb 5429 quimérico sustituto, así como su progenitor el anticuerpo de TLR3 anti-ratón de rata c181 1 inhibió la señalización de TLR3 de ratón in vitro e in vivo y mejoró los mecanismos patogénicos de diversos modelos de enfermedades en el ratón.
Los datos que se mencionan a continuación sugieren una función para TLR3 en la iniciación y perpetuación de la inflamación perjudicial y contribuyen a la base lógica para el uso terapéutico de los antagonistas de TLR3 y los antagonistas de anticuerpos de TLR3, por ejemplo, condiciones inflamatorias agudas y crónicas, que incluyen hipercitocinemia, asma e inflamación de las vías respiratorias, enfermedades inflamatorias del intestino y artritis reumatoide, infecciones virales y diabetes tipo II.
Generación del mAb 5429 sustituto Se inmunizó ratas CD con ectodominio de TLR3 recombinante murina (aminoácidos 1-703 de la SEQ ID NO: 162, GenBank, acceso núm. NP_569054) que se generó con el uso de métodos de rutina. Los linfocitos de dos ratas que demostraron títulos de anticuerpos específicos para la TLR3 estaban unidos a células de mieloma FO. Se identificó un grupo de anticuerpos monoclonales reactivos a TLR3 murina y se analizó para detectar actividad antagonista in vitro en el reportero de luciferasa murina y en los ensayos de fibroblastos embriónicos murinos. La línea de hibridomas C181 1A se seleccionó para realizar más estudios. Los genes de la región variable funcional se secuenciaron del mAb c 81 1 secretado por el hibridoma. Después, los genes de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera clonadas se insertaron respectivamente en los vectores de expresión plasmídicos que proporcionaron secuencias codificantes para generar un Rat/Balb C mulgG1/K mAb quimérico diseñado como mAb 5429 con el uso de métodos de rutina. Los anticuerpos se expresaron tal como se describió en el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera mAb 5429 se muestran en la SEQ ID NO: 164 y la SEQ ID NO: 163, respectivamente, y las secuencias de longitud total de cadena pesada y ligera se muestran en la SEQ ID NO:166 y la SEQ ID NO: 165, respectivamente. Las secuencias de longitud total de cadena pesada y ligera de mAb C181 1 se muestran en la SEQ ID NO: 168 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente.
Caracterización de mAb 5429 mAb 5429 se caracterizó en un grupo de ensayos in vitro por su capacidad de neutralización en la señalización de TLR3. Los ensayos de la actividad y los resultados se describen a continuación.
Ensayo de genes reporteros de luciferasa murina El cADN de TLR3 murina (SEQ ID NO: 161 , núm. de registro del GenBank NM_126166) se amplificó mediante PCR de cADN de bazo murino (BD Biosciences, Bedford, MA) y se clonó en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carsibad, CA) con el uso de métodos estándar. 200 células µ? HEK293T se colocaron en placas de 96 pocilios de fondo blanco claro a una concentración de 4 x 104 células/pocilio en DMEM completo y se usó el día siguiente para las transfecciones con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) con 30 ng de pNF-?? luciferasa de luciérnaga (Stratagene, San Diego, CA) o 30 ng de pISRE de luciferasa de luciérnaga (BD Biosciences, Bedford, MA), 5 ng de phRL-TK de plásmidos reporteros de luciferasa de renila control (Promega Corp., Madison, Wl) plásmidos reporteros, 1.5 ng de pCEP4 que codifican la longitud total de TLR3 murina y 13.5 ng de vector vacío pcADN3.1 (Life Technologies, Carslbad, CA) para proporcionar una cantidad total de ADN de 50 ng/pocillo. 24 horas después de la transfección, las células se incubaron de 30 minutos a 1 hora a 37 °C con los anticuerpos TLR3 anti-murinos en DMEM libre de suero fresco antes de la adición de 0.1 ó 1 pg/µ? de polí(l:C). Las placas se recolectaron después de 24 horas con el uso del sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega, Madison, Wl). Las unidades relativas de luz se determinaron con el uso de un lector multidetección FLUOstar OPTIMA con el programa OPTIMA (BMG Labtech GmbH, Alemania). Los valores normalizados (relaciones de luciferasa) se obtuvieron al dividir las unidades relativas de luz de las luciérnagas (RLU) por las RLU Renilla. El mAb 5429 al igual que su progenitor mAb c1811 y mAb 15 (Tabla 3a) redujeron la activación de NF-kB y ISRE inducida por poli (l:C) en un modo dependiente de la dosis (Figuras 7A y 7B), lo cual demuestra su capacidad de antagonizar con la actividad de TLR3. Los IC50 que se midieron en el ensayo ISRE fueron 0.5, 22 y 0.7 pg/ml para mAb 5249, mAB 15 y mAb c181 1 , respectivamente.
Ensayo de fibroblasto embriónico murino (MEF) Las células C57BL/6 MEF se obtuvieron de Artis Optimus (Opti-MEF™ C57BL/6 - 0001 ). Las células se colocaron en placas de 96 pocilios de fondo plano (BD Falcon) a 20,000 células/pocilio en 200 µ? de medio MEF (DMEM con glutamax, 10 % de FBS inactivado con calor, 1 x NEAA y 10 Mg/ml de gentamicina). Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C/5 % de CO2. 24 horas después de haberlas colocado en placas, se agregó mAb 5429 o mAb d 8 1 en los pocilios. Las placas se incubaron con mAb durante 1 hora, después se agregó poli(l:C) a 1 pg/ml en cada pocilio. Los sobrenadantes se recolectaron después de una incubación de 24 horas. Los niveles de citocina se determinaron con el uso de un kit de microesferas (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) para detectar CXCL10/IP-10 de conformidad con el protocolo del fabricante. Los resultados se graficaron con el uso del programa GraphPad Prism. Ambos anticuerpos redujeron los niveles de CXCL10/IP-10 inducido por poli(l:C) de una manera dependiente de la dosis, lo cual demuestra la capacidad de estos anticuerpos de antagonizar TLR3 endógeno e inhibir la señalización de TLR3 (Figura 8).
Citometría de flujo- Tinción de superficies Se dosificó intraperitonealmente C57BL/6 y bloqueo de TLR3 (TLR3KO) (C57BL/6 de base; hembra, de 8-12 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.), 10 por grupo, con 1 mi de medio de tioglucolato al 3 % (Sigma) y 96 horas más tarde, a los ratones se les practicó eutanasia y el peritoneo de cada ratón se lavó con 10 mi de PBS estéril. Los macrófagos peritoneales estimulados con tioglucolato se suspendieron otra vez en PBS y la viabilidad de las células se evaluó con el uso de tinción azul tripán. Las células se agruparon mediante centrifugación y se suspendieron otra vez en 250 µ? de regulador FACS (PBS -Ca2+-Mg2+, 1 % de FBS inactivado con calor, 0.09 % de azida sódica) y se mantuvieron en hielo húmedo. El reactivo CD16/32 (eBioscience) se usó a 10 pg/106 células durante 10 minutos para bloquear los receptores Fe en los macrófagos. Las células se distribuyeron a razón de 106 células por cada 100 µ?/pocillo para la tinción de superficie. Alexa-Fluor 647 (Molecular Probes)-mAb c181 1 conjugado y mAb 1679 (anticuerpo de TLR3 anti-ratón de rata sin especificidad para TLR3 y, por lo tanto, se usa como un isótopo control) se agregaron a 0.25 pg/106 células y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron y se suspendieron otra vez en 250 µ? de regulador FACS. La tinción de viabilidad, 7-AAD (BD Biosciences, Bedford, MA), se agregó a 5 µ?/pocillo no más de 30 minutos antes de adquirir las muestras en FACS Calibur para detectar una población de células muertas. Las muestras se recolectaron mediante FACS Calibur con el uso del programa Cell Quest Pro. Se usó FCS Express para analizar los datos recolectados mediante la formación de histogramas.
La unión de mAb c181 1 a los macrófagos peritoneales murinos estimulados con tioglucolato de ratones C57BL/6 y TLR3KO se evaluó mediante citometría de flujo para determinar la especificidad de unión. En este ensayo no se usó mAb 5429 debido a que se esperaba que la región Fe del ratón de este anticuerpo quimérico contribuyera a la unión no específica. mAb c181 1 no demostró unión a los macrófagos TLR3KO ni unión aumentada a las superficies celulares de los macrófagos perifonéales C57BL/6, lo que sugiere una especificidad del mAb por TLR3 (Figura 9). Se asume que mAb 5429, que tiene las mismas regiones de unión que mAb c181 1 , tiene la misma especificidad de unión que mAb c181 1 .
EJEMPLO 9 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen contra la inflamación sistémica mediada por TLR3 Modelo El modelo de citocina/quimocina sistémicas inducidas por poli(l:C) se usó como modelo de la inflamación sistémica mediada por TLR3. En este modelo, el poli(l:C) (PIC) suministrado intraperitonealmente indujo una respuesta sistémica de citocina y quimocina parcialmente mediada por TLR3.
A ratones C57BL/6 hembra (de 8-10 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (C57BL/6 de base; de 8-10 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) se les administró mAb 5429 a 10, 20 ó 50 mg/kg en 0.5 mi de PBS, mAb c181 1 a 2, 10 ó 20 mg/kg en 0.5 mi de PBS o únicamente 0.5 mi de PBS (control vehículo) subcutáneamente. 24 horas después de la dosificación de anticuerpos, a los ratones se les administró 50 pg de poli(l:C) (Amersham Cat. núm. 26-4732 lote núm. IH0156) en 0.1 mi de PBS intraperitonealmente. Se recolectó sangre retroorbitaria 1 y 4 horas después de la prueba de pol¡(l:C). Se preparó suero de sangre completa y se analizó para detectar concentraciones de citocina y quimocina mediante Luminex.
Resultados El poli(l:C) suministrado intraperitonealmente indujo una respuesta sistémica de citocina y quimocina parcialmente mediada por TLR3, tal como lo demostró la producción significativamente reducida de un grupo de quimocinas y citocinas en los animales TLR3KO (Tabla 9A). Los mediadores inducidos por poli(l:C) dependientes de TLR3 eran IL-6, KC, CCL2/MCP-1 y TNF-a 1 hora después de la prueba de poli(l:C) y IL-1a, CCL5/RANTES y TNF-a 4 horas después de la prueba de poli(l:C). Tanto mAb c181 1 como mAb 5429 redujeron significativamente los niveles de estos mediadores dependientes de TLR3, lo cual demuestra la capacidad de los anticuerpos de reducir la señalización de TLR3 in vivo (Tabla 9B). Los valores en la Tabla 9 se muestran como las concentraciones promedio de citocina o quimocina en pg/ml de seis animales/grupos ±SEM. Estos datos sugieren que el antagonismo de TLR3 puede ser beneficioso para reducir el exceso de las concentraciones de citocina y quimocina mediadas por TLR3 en condiciones como la tormenta de citocinas o el choque mortal.
TABLA 9A. *p<0.001: ANOVA unidireccional a C57BL/6 PBS **p<0.001: ANOVA unidireccional a C57BL6 PIC TABLA 9B. ***p<0.001, **p<0.01 , *p<0.05: Las estadísticas de ANOVA unidireccional se compararon con las del grupo C57BL 6 + PIC EJEMPLO 10 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 reducen la hipersensibilidad de las vías respiratorias Modelo La hipersensibilidad de las vías respiratorias se indujo por poli(l:C).
Los ratones C57BL/6 hembra (de 12 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (C57BL/6 de base; de 12 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) se anestesiaron con isoflurano y se administró intranasalmente varias dosis de (10-100 pg) de poli(l:C) en 50 µ? de PBS estéril. Los ratones recibieron tres administraciones de poli(l:C)(o PBS) con un período de receso de 24 horas entre cada administración. 24 horas después de la última administración de poli(l:C)(o PBS), se determinó la función pulmonar y la hipersensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina mediante pletismografía del cuerpo entero (sistema BUXCO). Los ratones se colocaron en la cámara de pletismografía del cuerpo entero y se esperó a que se aclimataran durante por lo menos 5 minutos. Después de las lecturas de los valores iniciales, los ratones se expusieron a dosis en aumento de metacolina nebulizada (Sigma, St. Louis, MO). La metacolina nebulizada se administró durante 2 minutos, seguido de un período de recolección de datos de 5 minutos, seguido de un período de receso de 10 minutos antes de las pruebas posteriores de dosis en aumento de metacolina. La resistencia incrementada al flujo de aire se determinó como pausa realzada (Penh) y se representa como el valor promedio de Penh durante el período de registro de 5 minutos (sistema BUXCO). Después de determinar la función pulmonar, a los ratones se les practicó eutanasia y los pulmones se canularon. Los lavados broncoalveolares (BAL) se realizaron mediante la inyección de 1 mi de PBS en los pulmones y posterior recolección del efluente. Los tejidos pulmonares se removieron y se congelaron. Los fluidos de los BAL se centrifugaron (1200 rpm, 10 min.) y los sobrenadantes libres de células se recolectaron y se almacenaron a -80°C hasta analizarlos. Las agrupaciones de células se suspendieron otra vez en 200 µ? de PBS para los conteos celulares total y diferencial. El ensayo múltiplex se realizó de conformidad con el protocolo del fabricante y el kit de inmunoensayos Múltiplex (Millipore, Billercia, MA).
Resultados Las observaciones anteriores demostraron que la administración intranasal de poli(l:C) indujo un deterioro de la función pulmonar mediado por TLR3 en los ratones con una medición incrementada de la pausa realzada (PenH) en la pletismografía del cuerpo entero (Buxco) en los valores iniciales y una sensibilidad aumentada a la metacolina aerosolizada (un indicador de la hipersensibilidad de las vías respiratorias) (publicación del PCT núm. WO06/060513A2). Este deterioro de la función pulmonar se relacionó con el reclutamiento de neutrófilos hacia el pulmón y las concentraciones aumentadas de citocinas/quimocinas proinflamatorias en el pulmón. En este estudio, el efecto de mAb 181 1 y mAb 5429 se evaluó en el deterioro de la función pulmonar inducido por poli(l:C) al administrar cada anticuerpo a 50 mg/kg subcutáneamente antes de la prueba de poli(l:C).
El deterioro de la función pulmonar mediado por TLR3 se redujo significativamente por medio del tratamiento de animales con antagonistas de anticuerpos TLR3 antes de la prueba de poli(l:C). Los incrementos en los valores iniciales PenH mediados por TLR3 y la sensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina se evitaron en los animales tratados con anticuerpo anti-TLR3 (Figura 10). Además, en los animales tratados con el anticuerpo anti-TLR3, se redujo el reclutamiento de neutrófilos mediado por TLR3 hacia el pulmón del ratón y la generación de quimocinas en las vías respiratorias. La cantidad de neutrófilos (Figura 1 1 ) y las concentraciones de CXCL10/IP-10 (Figura 12) se determinaron a partir del fluido de los lavados bronce-alveolares recolectado (BALF). Los estudios se repitieron por lo menos tres veces con resultados similares. Los datos que se muestran en las Figuras 10, 1 1 y 12 son de un estudio representativo. Cada símbolo representa un punto de datos de un ratón y las franjas horizontales muestran las medias del grupo. El estudio demostró que los antagonistas de anticuerpos TLR3 administrados sistemáticamente alcanzaron el pulmón, redujeron el deterioro de la función pulmonar mediado por TLR3, la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, la generación de quimocinas y la inflamación del tracto respiratorio en el modelo utilizado. De este modo, antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos en el tratamiento o prevención de enfermedades respiratorias caracterizadas por la hipersensibilidad de las vías respiratorias, tales como asma, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y fibrosis cística.
EJEMPLO 11 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen de la enfermedad inflamatoria intestinal Modelo El modelo de colitis DSS se usó como modelo de la enfermedad inflamatoria intestinal.
Se alimentó ratones C57BL/6 hembra (< de 8 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (C57BL/6 de base; < de 8 semanas de edad con un peso entre 16.5 g y 18 g, Ace Animáis, Inc.) con comida irradiada con rayos gamma iniciando el día -1. Se diluyó DSS (sulfato de dextrano) (MP Biomedicals, Aurora, OH, catálogo núm.: 160110; 35-50 kDa; 18-20 % de azufre, Lote núm. 8247J) en agua acidificada para beber, esterilizada en autoclave a una concentración final de 5 %. El agua de DSS se administró durante 5 días, después se reemplazó con agua. A los ratones se les permitió tomar agua ad libítum durante todo el estudio. Las botellas de agua se pesaron a diario para registrar el consumo de agua. En los días 0, 2 y 4 a los ratones se les administró intraperitonealmente 5 mg/kg (0.1 mg en 0.1 mi de PBS) mAb 5429, anticuerpo anti-TNF-a de ratón o PBS como control. Los ratones se monitorearon diariamente durante todo el estudio y se pesaron en los días 0 a 4 y en el día 7. Se les practicó eutanasia a los ratones en los días 2 y 7 del estudio. Se abrió las cavidades abdominales y la porción ascendente de los cólones se cortó donde se une al ciego. Se obtuvo los cólones y se fijaron en formalina neutra regulada al 10 %. Los intestinos gruesos se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con H&E (Qualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA). Un patólogo veterinario realizó evaluaciones histopatológicas ciegas de los cólones tal como se describe a continuación (PathoMetrix, San José, CA).
Evaluación histopatológica Se evaluó y se calificó dos segmentos del intestino grueso, el colon y el recto en busca de los siguientes cambios: (i) necrosis de una sola célula; (ii) ulceración epitelial; (iii) esfacelación epitelial; (¡v) absceso de las criptas; (v) proliferación de células; (vi) proliferación de las células de las criptas; (vii) formación de tejido de granulación en la lámina propia; (viii) tejido de granulación en la submucosa; (ix) infiltrado submucoso de células inflamatorias, predominantemente neutrófilos; y (x) edema de la submucosa.
Se asignó una calificación global única de severidad en base a los siguientes estándares: 0 - inexistente 1 - leve, focal o encontrado ocasionalmente 2 - leve, multifocal 3 - moderado, frecuentemente encontrado pero en áreas limitadas 4 - severo, frecuentemente encontrado en muchas áreas o extensiones del tejido presentado 5 - muy severo, se extiende hasta grandes porciones del tejido presentado Resultados Las observaciones previas demostraron que los animales TLR3KO mostraron una histopatología significativamente reducida en comparación con los ratones salvajes en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal inducida por la ingestión de DSS (publicación del PCT. núm. WO06/60513A2), lo que sugiere que la señalización de TLR3 tiene una función en la patogénesis en este modelo. Se ha reportado que el RNA de bacterias comensales o el RNA de mamíferos liberado por células necróticas puede actuar como ligando endógeno para estimular la señalización de TLR3 (Kariko y otros; Immunity 23165-231 175 2005; Kariko y otros; J. Biol. Chem. 279:12542-12550 2004) y, por lo tanto, la estimulación de TLR3 por ligandos endógenos del intestino puede intensificar y perpetuar la inflamación en el modelo de colitis DSS.
Se mejoró la severidad de la enfermedad en los animales expuestos a DSS al tratarlos con anticuerpos anti-TLR3, tal como lo demostraron los puntajes compuestos de histopatología (Figura 13). La Figura 13 muestra las medidas, desviaciones estándar y los intervalos de confianza de 95 % de los puntajes de severidad de la enfermedad como franjas horizontales. Se observó una reducción significativa en los puntajes de los animales salvajes expuestos a DSS tratados con anticuerpos anti-TLR3 (p < 0.05) en comparación con los animales salvajes no tratados. Los animales TLR3KO expuestos a DSS estuvieron protegidos de los cambios inducidos por DSS. Los animales expuestos a DSS que recibieron TNF-a mAb anti-ratón no demostraron mejoría en la histopatología en el modelo DSS. Por lo tanto, el modelo DSS puede ser útil en la evaluación de terapias que puedan dirigirse a la población de pacientes humanos que no responden a las terapias con anti-TNF-a y neutralizar anticuerpos anti-TLR3 puede tener el potencial de brindar beneficios a los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal que no responden a las terapias con anti-TNF-a.
Modelo Se usó el modelo de transferencia de células T como modelo de la enfermedad inflamatoria del intestino. En este modelo la inflamación del intestino fue inducida en los ratones SCID mediante la transferencia de células T vírgenes desprovistas de células T reguladoras de ratones inmunocompetentes que atacan a las células presentadoras de antígeno en la mucosa intestinal. sltss Se inyectó células T vírgenes (células T CD4+CD45RB ) intraperitonealmente en los receptores de los SCID para inducir colitis crónica. A los ratones se les dio PBS (500 µ?/ratón intraperitonealmente; control de vehículo), mAb 5429 (0.1 mg/ratón intraperitonealmente) o anticuerpo anti-TNF-a (0.05 mg/ratón intraperitonealmente; control positivo) iniciando 48 horas después de la transferencia de células T y después dos veces por semana a lo largo del estudio de 8 semanas. A las 8 semanas después de la transferencia de células T (o cuando los ratones perdieron el >15 % de su peso corporal original) se les practicó eutanasia a los animales y se obtuvo los cólones. Los cólones fueron fijados, incluidos en parafina y tenidos con H&E. Se realizó evaluaciones cuantitativas ciegas de la histopatología (infiltración celular, abscesos de las criptas, erosión epitelial, pérdida de células calciformes y engrosamiento de la pared intestinal).
Resultados Se mejoró la severidad de la enfermedad en los animales que recibieron transferencias de células T al tratarlos con anticuerpos anti-TLR3, tal como lo demostró la significativa reducción en la suma de los puntajes histopatológicos en comparación con los animales control (p<0.05) (Figura 14A). Para obtener la suma de los puntajes se evaluó los abscesos de las criptas, ulceración, aflujo de neutrofilos, pérdida de células calciformes, criptas anormales, inflamación de la lámina propia y afectación transmural. Se observó una reducción significativa en los abscesos de las criptas, ulceración y aflujo de neutrofilos (p< 0.05 para todos) (Figura 14B). El anticuerpo anti-TNF-a se usó como control positivo a dosis que se sabe que brindan un beneficio óptimo.
Los estudios que usan dos modelos bien conocidos de enfermedades inflamatorias del intestino, el modelo DSS y el modelo de transferencia de células T, demostraron que los antagonistas de anticuerpos TLR3 administrados sistémicamente alcanzaron la mucosa intestinal y redujeron la inflamación del tracto gastrointestinal inducida por dos mecanismos patogénicos distintos. Por lo tanto, los antagonistas TLR3 pueden ser beneficiosos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen casos refractarios a anti-TNF-a y otras patologías del tracto gastrointestinal mediadas inmunológicamente.
EJEMPLO 12 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen de la artritis inducida por colágeno Modelo El modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) se usó como modelo de artritis reumatoide.
Se dividió los ratones B10RIII macho (de 6 a 8 semanas de edad, Jackson Labs) en grupos de 15 (grupos con artritis) o de 4 (ratones control). Los grupos con artritis se anestesiaron con isoflurano y recibieron inyecciones de colágeno tipo II (Elastin Products) y adyuvante completo de Freund con suplemento de M. tuberculosis (Difco) en los días 0 y 15. En el día 12, los ratones que desarrollaban artritis de colágeno tipo II se aleatorizaron por peso corporal en grupos de tratamiento y se les administró mAb 5429 (25 mg/kg) por vía subcutánea (SC) en los días 12, 17 y 22 (d12, d17, 2d2), anticuerpo CVAM de control negativo (un mAb recombinante sin especificidad conocida en el ratón) (5 mg/kg) o anticuerpo anti-TNF-a (5 mg/kg, control positivo). Además, los grupos control de ratones se trataron con vehículo (PBS) o dexametasona (0.5 mg/kg, Dex, compuesto de referencia) por vía subcutánea (SC) diariamente (QD) en los días 12-25. Los animales se observaron diariamente de los días 12 al 26. Se evaluó las patas delanteras y traseras con un sistema de puntaje clínico (gue se muestra a continuación). Se les practicó eutanasia a los animales en el día 26 del estudio y se examinó la histopatología en una manera ciega (el sistema de puntaje se describe a continuación). La evaluación de la eficacia se basó en el peso corporal de los animales y en los puntajes de artritis clínica. Todos los animales sobrevivieron hasta la finalización del estudio.
Criterios de puntaje clínico para las patas delanteras y traseras 0 - normal 1 - articulación de las patas delanteras o traseras afectada o eritema difuso mínimo e hinchamiento 2 - articulaciones de las patas delanteras o traseras afectadas o eritema difuso leve e hinchamiento 3 - articulaciones de las patas delanteras o traseras afectadas o eritema difuso moderado e hinchamiento 4 - eritema difuso marcado e hinchamiento o =4 articulaciones de los dedos afectadas) 5 - pata entera con eritema difuso severo e hinchamiento severo, incapacidad para flexionar los dedos) Métodos de puntaje histopatolóqico para articulaciones de ratones con artritis de colágeno tipo II Al momento de asignar un puntaje para las patas o tobillos de ratones con lesiones de artritis de colágeno tipo II, se tomó en cuenta la severidad de los cambios, así como la cantidad de articulaciones individuales afectadas. Cuando únicamente se afectó 1-3 articulaciones de las patas o tobillos de una posibilidad de numerosas articulaciones metacarpeanas/metatarseanas/de los dedos o tarseanas/tibiotarseanas, se asignó arbitrariamente un puntaje máximo de 1 , 2 ó 3 para parámetros menores según la severidad de los cambios. Si había 2 articulaciones involucradas, se aplicó los siguientes criterios a las articulaciones afectadas con mayor severidad/la mayoría de las articulaciones.
Los datos clínicos para el puntaje de las patas se analizaron con el uso de AUC durante los días 1-15 y se calculó el % de inhibición de los controles.
Inflamación 0 - normal 1 - infiltración mínima de células inflamatorias en tejido sinovial y periarticular de las articulaciones afectadas 2 - infiltración leve, si involucra las patas, restringida a las articulaciones afectadas 3 - infiltración moderada con edema moderado, si involucra las patas, restringida a las articulaciones afectadas 4 - infiltración marcada que afecta la mayoría de áreas con edema marcado 5 - infiltración difusa severa con edema severo Pannus 0 - normal 1 - infiltración mínima del pannus en el cartílago y hueso subcondral 2 - infiltración leve con destrucción en la zona marginal del tejido duro en articulaciones afectadas 3 - infiltración moderada con destrucción moderada del tejido duro en articulaciones afectadas 4 - infiltración marcada con destrucción marcada de la arquitectura articular en la mayoría de articulaciones 5 - infiltración severa relacionada con la destrucción total o casi total de la arquitectura articular, afecta todas las articulaciones Daño del cartílago 0 - normal 1 - pérdida mínima a leve de la tinción azul de toluidina sin pérdida evidente de condrocitos o disrupcion del colágeno en las articulaciones afectadas 2 - pérdida leve de la tinción azul de toluidina con pérdida focal leve (superficial) de condrocitos y/o disrupcion del colágeno en las articulaciones afectadas 3 - pérdida moderada de la tinción de azul de toluidina con pérdida multifocal moderada (profundidad en la zona media) de condrocitos y/o disrupcion del colágeno en las articulaciones afectadas 4 - pérdida marcada de la tinción de azul de toluidina con pérdida multifocal marcada (profundidad en la zona profunda) de condrocitos y/o disrupcion del colágeno en la mayoría de las articulaciones 5 - pérdida difusa severa de la tinción de azul de toluidina con pérdida multifocal severa (profundidad en la marca de transición) de condrocitos y/o disrupcion del colágeno en todas las articulaciones Resorción ósea 0 - normal 1 - mínima con pequeñas áreas de resorción, no fácilmente visible a baja magnificación, con osteoclastos poco frecuentes en las articulaciones afectadas 2 - leve con áreas más numerosas de, no fácilmente visibles a baja magnificación, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas 3 - moderada con resorción obvia de hueso medular trabecular y cortical sin defectos de espesor total en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión visible a baja magnificación, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas 4 - marcada con defectos del espesor total en el hueso cortical, a menudo con distorsión del perfil de la superficie cortical remanente, marcada pérdida de hueso medular, numerosos osteoclastos, afecta la mayoría de articulaciones 5 - severa con defectos de espesor total en el hueso cortical y destrucción de la arquitectura articular de todas las articulaciones Resultados Se usó dexametasona (Dex) y anticuerpo TNF-a anti-ratón como control positivo, se usó PBS como control de vehículo y se usó CVAM como un anticuerpo de control negativo. Todos los tratamientos iniciaron en el día 12 del estudio, durante el desarrollo de la enfermedad articular. La incidencia de la enfermedad en animales control de la enfermedad tratados con vehículo era de 100 % para el día 22 del estudio. Los grupos de control negativo tratados con vehículo o con anticuerpo CVAM tenían los puntajes clínicos más altos. Se observó puntajes clínicos significativamente reducidos en los grupos tratados con Dex (p<0.05 durante d18-d26), 5 mg/kg de anticuerpo anti-TNF-a (p<0.05 durante d18-26) o 25 mg/kg de mAb 5429 (p<0.05 durante d18-d23 y d25-d26) (Figura 15). Los puntajes de artritis clínica expresados como el área bajo la curva (AUC) se redujeron significativamente con el tratamiento con 25 mg/kg de mAb 5429 (43 % de reducción), 5 mg/kg de anticuerpo anti-TNF-a (52 %) o Dex (69 %) en comparación con vehículos control. La Figura 16 muestra las medias y desviaciones estándar del AUC de cada grupo.
También se evaluó los efectos histopatológicos de los tratamientos. La resorción ósea de las patas disminuyó significativamente con el tratamiento con 25 mg/kg de mAb 5429 (47 % de disminución) en comparación con los vehículos control. Los ratones de control positivo que se trataron con 5 mg/kg de anticuerpo anti-TNF-a presentaron una reducción significativa en la inflamación de las patas (33 %), el daño cartilaginoso (38 %) y las puntuaciones sumadas de las patas (37 %). El tratamiento con Dex redujo significativamente todos los parámetros histopatológicos de las patas (73 % de reducción de los puntajes sumados).
Estos datos demostraron que los antagonistas de los anticuerpos TLR3 mejoran los síntomas clínicos e histopatológicos de la enfermedad en el modelo CIA y sugiere el uso de antagonistas TLR3 en el tratamiento de la artritis reumatoide.
EJEMPLO 14 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen de infecciones virales agudas letales Modelo Se usó un modelo de prueba con virus de influenza A como un modelo de infecciones virales agudas letales.
En los días -1 , 4, 8 y 12, los ratones C57BL/6 hembra (de 12 semanas de edad) o los ratones TLR3KO hembra (C57BL/6 de base; de 12 semanas de edad, de ACE Animáis, ¡na, 15 ratones por grupo) recibieron dosis subcutáneas de 20 mg/kg de mAb 5429 o PBS solo. En el día 0, se anestesió a los ratones con isoflurano y se les administró virus de influenza A/PR/8/34 por vía ¡ntranasal (ATCC, Rockiand, MD, lote núm. 218171 ), en 25 µ? de PBS (equivalente a 05 55 de CEID50). Se observó los animales 2 veces por día para evaluar los cambios en el peso corporal y la sobrevivencia por un período de 14 días. Se usó un sistema de puntaje clínico para evaluar el nivel de progresión de la enfermedad y cambios útiles en la respuesta al tratamiento del virus de la influenza A.
Puntajes clínicos 0 - normal, alerta y reactivo, no hay signos visibles de enfermedad 1 - pelaje erizado, con o sin reducción leve de la ambulación 2 - pelaje erizado, postura encorvada al caminar, ambulación desganada, respiración dificultosa 3 - pelaje erizado, respiración dificultosa, ataxia, tremor 4 - pelaje erizado, incapacidad para deambular tras un toque sutil, inconsciencia se siente frío al tacto 5 - se encontró muerto Resultados En el estudio se evaluó la supervivencia, los puntajes clínicos diarios y los cambios en el peso corporal. Tanto los ratones WT infectados con influenza A que recibieron mAb 5429 (20 mg/kg) como los TLR 3KO infectados con influenza A que no recibieron mAb 5429 demostraron un aumento estadísticamente significativo en la supervivencia (p<0.001 y p<0.01 , respectivamente) al compararlos con los ratones C57BL/6 inoculados con el virus de la Influenza, lo que indica que el antagonismo o la deficiencia de TLR 3 puede prevenir la mortalidad inducida por la influenza (Figura 17). Los puntajes clínicos se redujeron significativamente en el grupo que recibió 20 mg/kg de mAb 5429, así como en el grupo TLR3KO (Figura 18). Se observó el peso corporal de los ratones durante un período de 14 días después de la administración del virus de la influenza. El peso corporal disminuyó sostenidamente en los ratones C57BL/6 que recibieron el virus de influenza A. Sin embargo, tanto los ratones C57BL/6 que recibieron 20 mg/kg de mAb 5429 como los ratones TLR3KO demostraron un peso corporal significativamente mayor en comparación con los ratones WT C57BL/6 inoculados con el virus de influenza (Figura 19). Estos resultados demostraron que los antagonistas de anticuerpos TLR3 redujeron los síntomas clínicos y la mortalidad en un modelo de infección viral de influenza aguda letal y sugieren que los antagonistas TLR3 pueden proporcionar protección para los humanos en los estados infecciosos agudos.
EJEMPLO 15 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 mejoran la hiperqlicemia y reducen la insulina plasmática Modelo Se usó el modelo de obesidad inducida por la dieta (DIO) como modelo de hiperglicemia y resistencia a la insulina y obesidad.
Los animales C57BL/6 WT (aproximadamente de 3 semanas de edad, Jackson Labs) y los animales TLR3KO (C57BL/6 de base; aproximadamente de 3 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) se mantuvieron con una dieta alta en grasas durante 12 a 16 semanas. Tanto los ratones TLR3KO como los WT C57BL/6 se alimentaron ya sea con dieta de alimento normal o dieta alta en grasas (Purina TestDiet cat. núm. 58126) consistente de 60.9 % de kcal de grasa y 20.8 % de kcal de carbohidratos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad 12:12-h, con agua y alimento ad libitum. El peso de cada ratón de cada grupo se determinó semanalmente. El mAb 5429 se administró intraperitonealmente dos veces a la semana durante la primera semana y después una vez a la semana durante un total de 7 semanas. Las muestras de suero de sangre retroorbitaria en ayuno se usaron para medir la insulina en los tiempos indicados. Se realizó pruebas de tolerancia a la glucosa mediante la administración i.p de glucosa a 1 .0 mg/g de peso corporal después de un ayuno nocturno en la semana 7. Además, se determinó las concentraciones de insulina y glucosa en ayuno.
Se determinó HOMA-IR a partir de la ecuación en base a las concentraciones de glucosa e insulina en ayuno (12) con el uso de la siguiente ecuación: HOMA-IR = ((glucosa en ayuno (mmol/l) x insulina en ayuno (mU/l))/ 22.5 (Wallace y otros; Diabetes Care 27: 1487-1495, 2004). La glucosa en sangre en ayuno (BG) se determinó con el uso del ensayo de glucosa oxidasa. Las concentraciones de insulina en ayuno se determinaron con el uso del kit de insulina de rata/ratón ELISA (Crystal Chem, cat. núm. 90060).
Resultados Después de 12-16 semanas con dieta alta en grasas, los animales WT DIO eran hiperglicémicos e hiperinsulinémicos. La tolerancia a la glucosa se mejoró en los animales WT DIO pero no en los animales TLR3KO DIO con el tratamiento con mAb 5429. Se observó concentraciones de glucosa en sangre significativamente reducidas en los animales tratados con mAb 5429 después de la prueba de glucosa a 60, 90, 120 y 180 min en comparación con los control (glucosa PBS) (Figura 20A). Se observó una reducción de aproximadamente 21 % en AUC en los animales WT DIO tratados con mAb 5429 en comparación con los ratones WT DIO que no recibieron mAb. También se redujo las concentraciones de insulina en ayuno en los animales WT DIO tratados con mAb 5429 (Figura 21 ). Los animales TLR3KO DIO no mostraron ninguna mejoría en la insulina en ayuno con el tratamiento de mAb 5429. El análisis de evaluación de modelos homeostáticos (HOMA) indicó sensibilidad mejorada a la insulina en los animales WT DIO tratados con mAb 5429, pero no en los animales TLR3KO DIO. Los valores de HOMA-IR fueron 14.0±9.8, 8.7±4.9, 9.0±3.0 para los animales WT DIO, 5 mg/kg de WT DIO mAb 5429 y 20 mg/kg de WT DIO mAb 5429, respectivamente. No se observó ningún efecto en los animales TLR3KO DIO.
El estudio demostró que los antagonistas de anticuerpos TLR3 mejoraron la resistencia a la insulina y redujeron la glucosa en ayuno en el modelo DIO sin pérdida de peso, lo cual indica que los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos en el tratamiento de hiperglicemia, para la resistencia a la insulina y la diabetes tipo II.
EJEMPLO 16 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen contra las respuestas inflamatorias inducidas por bacterias y virus Reactivos Las cepas 35 no tipificables Haemophilus influenza (NTHi), aisladas de un paciente con enfermedad pulmonar obstructiva crónica con exacerbaciones bacterianas, se obtuvieron del Dr. T. f. Murphy (Buffalo VA Medical Center, Buffalo, NY). El rinovirus humano 16 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) con TCID(50)=2.8 x 107/ml.
Ensayos de estimulación de NTHi Las células NHBE (Lonza, Wakersville, MD) se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios Microtest (BD Biosciences, Bedford, MA) a 1 x 105/pocillo. El NTHi cultivado en placas de agar durante 16-20 horas se suspendieron otra vez en medio de crecimiento a ~2 x 108 cfu/ml, se trataron con 100 pg/ml de gentamicina durante 30 min. y se agregaron a ~2 x 107/pocillo en placas de 96 pocilios que contienen NHBE. Después de 3 horas, los sobrenadantes se removieron y se colocaron otra vez con medio de crecimiento fresco con o sin anticuerpos (de 0.08 a 50 pg/ml de concentración final). Después de una incubación adicional de 24 horas, se analizó la presencia de citocinas y quimocinas en los sobrenadantes de células por triplicado con un kit de microesferas AB de citocinas 25-plex, Human (que incluye IL- ß, IL- RA, IL- 2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-?, GM-CSF, MIP-1a, ???-1 ß, IP-10, MIG, Eotaxin, RANTES y MCP-1 ) (Life Technologies, Carslbad, CA) en el analizador de fluorescencia múltiplex Luminex 100IS y sistema lector (Luminex Corporation, Austin, TX).
Ensayos de estimulación de rinovirus Las células NHBE se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios Microtest (BD Biosciences, Bedford, MA) a 1 x 105 células/pocilio. Al día siguiente, los anticuerpos (de 0.08 a 50 pg/ml de concentración final) se agregaron a las células NHBE o BEAS-2B y se incubaron durante 1 hora, seguido por la adición de 10 µ?/pocillo de rinovirus. Después de 24 horas de incubación adicional, se analizó la presencia de citocinas y quimocinas en los sobrenadantes de células mediante ensayos luminex, tal como se describió anteriormente.
Resultados mAb 15EVQ inhibió la producción de IP-10/CXCL10 y RANTES/CCL5 inducida por NTHi en una manera dependiente de la dosis, mientras que el anticuerpo control, la lgG4 humana (Sigma, St. Louis, MO), mostró no tener ningún efecto inhibidor sobre la estimulación de NTHi (Figura 22A). mAb 15EVQ también inhibió la producción de CXCL10/IP-10 y CCL5/RANTES inducida por rinovirus (Figura 22B).
EJEMPLO 17 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 suprimen las respuestas inflamatorias en astrocitos Métodos Los astrocitos humanos normales de 2 donantes (Lonza, Walkersville, MD) se colocaron en placas de 24 pocilios a 75,000 células/pocilio y se dejó que pegaran durante la noche. Al día siguiente, los astrocitos se trataron con 200 ng/ml de poli(l:C) y/o 10 µg/ml de mAb 18 durante 24 horas. Las citocinas se midieron por Luminex.
Resultados La producción de IL-6, IL-8, IL- 2, IFN-a, IFN-?, CXCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CCL4, CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10 inducida por poli(l:C) se inhibió por medio de mAb 18, tal como se muestra en la Tabla 10.
TABLA 10 *ol: sobre el nivel de detección **bl: debajo del nivel de detección EJEMPLO 18 Los antagonistas de anticuerpos TLR3 suprimen las respuestas inflamatorias en células endoteliales Métodos Las células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) se cultivaron en medio de crecimiento que contiene suero recomendado por Lonza Las células se suspendieron otra vez en medio libre de suero (Lonza, Walkersville, MD), se colocaron en placas de 96 pocilios a 3x105 células/ml y se incubaron a 37 °C, 5 % de C02 durante 24 horas. Se agregó poli(l:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a concentraciones en aumento (de 1 .5 a 100 pg/ml) y se incubó durante otras 24 horas a 37°C. Para los ensayos de inhibición de citocina se agregó mAb 15EVQ a las células a varias concentraciones (de 0 -50 pg/ml) y se incubaron durante 30 min y después se agregó 20 de poli(l:C) durante 24 horas. Los sobrenadantes de células se recolectaron y las concentraciones de citocina se determinaron con el uso del kit de citocina humana 30-plex y tecnología Luminex MAP (Invitrogen Corp. , Carslbad, CA). Para medir la expresión de slCAM-1 , las células HUVEC se trataron con 20 pg/ml de poli(l:C) y distintas concentraciones de mAb 15EVQ (0.8 -50 pg/ml). Los sobrenadantes de células se analizaron para detectar la expresión de slCAM-1 mediante ELISA (sistemas R&D). La viabilidad celular se determinó con el uso del kit CelITiterGIo (Promega, Madison, Wl).
Resultados Las células HUVEC produjeron las siguientes citocinas en respuesta a poli (l:C): IL-1 RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CXCL8/IL-8, IL-12 (?40 70), IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-?, GM-CSF, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1 , CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1 , VEGF, G-CSF, FGF básico, y HGF (Tabla 11 ). mAb 15EVQ dependiente de dosis redujo los niveles de todas las citocinas inducidas por poli (l:C) (Tabla 12). La capacidad de mAb 15EVQ de reducir la producción inducida por poli (l:C) de TNF-a, CCL2/MCP-1 , CCL5/RANTES, y CXCL10/IP-10 sugirió que la inhibición de las actividades mediadas por TLR3 pueden proteger contra los leucocitos y la infiltración de células T que puede causar aterosclerosis. Además, la inhibición de VEGF mediante mAb 15EVQ sugiere un beneficio potencial de bloqueo TLR3 en patologías mediadas por VEGF que incluye angiogénesis en una variedad de cánceres y enfermedades oculares como la degeneración macular relacionada con la edad.
Función TNF-a y IFN-? en el reclutamiento de leucocitos y aumento de la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio activado (Doukas y otros, Am. J. Pathol. 145: 137-47, 1994; Pober y otros, Am. J. Pathol. 133:426-33, 1988). Se implicaron CCL2/ CP-1 , CCL5/RANTES, y CXCL10/IP-10 en el reclutamiento de monocitos y células T y contribuyó al desarrollo de aterosclerosis (Lundgerg y otros, Clin. Immunol. 2009). La generación de VEGF mediante células endoteliales se ha relacionado con el crecimiento de tejido anormal o tumores en varios cánceres durante la angiogénesis (Livengood y otros, Cell. Immunol. 249:55-62, 2007).
La molécula soluble de adhesión intercelular de tipo 1 (slCAM-1 ) se genera mediante la escisión proteolítica y es un marcador de la activación de las células endoteliales. ICAM- juega un papel clave en la migración y activación de leucocitos, y aumentada en las células endoteliales y las células epiteliales durante la inflamación, en donde media la adherencia a los leucocitos a través de las moléculas de integrina LFA-1 y Mac-1. Poli (l:C) activó las células endoteliales para regular la expresión de slCAM-1 y la regulación por incremento se redujo mediante el tratamiento con mAb 15EVQ (Figura 23A).
TABLA 11 Poli(l:C) g/ml IL-6 CXCL8/IL-8 CCL2/MCP-1 10 848.8 + 50.9 12876.0 + 2314.0 11813.4 + 1420.9 5 751.3 + 2.1 11363.7 + 108.2 11365.7 + 113.1 2.5 607.1 + 91.6 10961.5 + 2200.7 11607.3 + 2155.7 1.25 419.2 + 178.4 9631.5 + 3675.8 11690.9 + 3189.9 0.63 263.8 + 81.4 6231.9 + 1568.0 9075.6 + 1152.2 0.31 183.5 + 168.3 5257.9 + 1855.0 8106.8 + 1193.1 0.16 111.9 + 72.5 4057.6 + 1127.4 6619.8 + 1728.2 Sin Pol¡(l:C) 0.00 1286.6 + 300.8 1360.1 + 245.4 Pol¡(l:C) µa??? IL-2R IL-15 IL-1 100 784.4 + 45.4 61.3 + 12.5 43.8 + 5.3 50 718.6 + 56.8 61.3 + 12.5 47.6 + 0 25 735.7 + 23.4 56.7 + 18.9 58.3 + 4.9 12.5 650.5 + 29.8 38.8 + 6.5 39.8 + 10.9 6.25 643.4 + 39.9 34.2 + 0 32.1 + 0 3.13 681.8 + 24.3 38.8 + 6.5 43.8 + 5.3 1.56 578.6 + 10.5 29.4 + 6.7 36.1 + 5.6 Sin Poli(l:C) 0.0 0.0 0.0 Los valores son valores promedio (pg/ml) mAb 15 (ng/ml) 50.00 10.00 2.00 0.40 0.08 0.016 0.003 0 PIC + + + + + + + - IL-6 177.8 ± 214.6 + 359.2 + 727.2 + 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0 5.6* 3.6* 57.6* 50.5* CXCL8/IL-8 1040.7 ± 1765.9 + 6460.3 + 57349.5 + 72422.8 + 470475 + 76066.5 + 964780 + 185.9 971 3684.4 6293.4 88279.2 52393.1 11354.1 1222984 CCL2/MCP-1 11877 ± 1955.4 + 9054.4 + 20000 + 20000 + 20000 + 20000 + 20000 + 165.4 * 72.7 * 4110.9 * 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 IL-2R 25.0 ± 0.0 + 0.0 * 312.3 + 521.5 + 664.7 + 661.2 + 698.4 + 654.2 + 35.3* 1376 * 5.5 9.8 14.8 57.6 14.8 IL-15 0.0 ± 0.0 * 0.0 + 0.0 * 0.0 + 0.0 * 4.1 + 0.0 * 38.8 + 6.5 43.4 + 0.0 38.8 + 6.5 43.4 + 0.0 IL-17 1.3 ± 1.8 * 11.8 + 11.8 + 279 + 6.0 474 + 10.4 54.3 + 40.0 + 0.0 51.2 + 5.1 16.8 16.8 20.2 IFNa 0.9 ± 1.3 * 0.9 + 1.3 * 19.0 + 77 * 36.1 + 0.0 44.9 + 1.7 41.2 + 3.5 473 + 1.7 40.0 + 1.8 CXCL10/IP-10 0.0 ± 0.0 * 58.1 + 2.6* 633.0 + 1441.4 + 3023.8 + 21075 + 2346.4 + 21574 + 471.6 * 971 166.1 372.6 226.1 282.7 CCL4/MIP-1 p 0.0 ± 0.0 * 0.0 + 0.0 * 2.9 + 4.1 * 62.1 + 7.2* 176.6 + 2275 + 2483 + 281.7 + 21 .3 * 19.9 19.4 375 RANTES 3.0 ± 0.0 * 15.4 + 4.5* 201.1 + 952.4 + 2454.4 + 2698.1 + 2624.4 + 3459.7 + 169.1 * 41.1* 98.5 * 88.6 * 129.8 * 181.8 TNFa 1.9 ± 0.4 * 1.6 + 0.0 * 2.2 + 0.0 * 3.4 + 0.0 6.3 + 0.5 8.5 + 0.0 7.6 + 1.4 6.9 + 2.3 VEGF 87.2 ± 8.7* 28.6 + 8.7* 883 + 156.1 + 479.6 + 544.6 + 533.5 + 6073 + 52.1 * 6.4* 14.1 8.3 70.2 29.9 *lndica valores p significativos (menores que 0.05) comparando la concentración de mAb15 con sólo poli(l:C) Los valores son valores promedio (pg/ml) Esto sugirió que los antagonistas de los anticuerpos TLR3 pueden inhibir el tráfico de leucocitos y, por lo tanto, el daño en el tejido causado por el influjo de células inflamatorias.
Para los ensayos de viabilidad, se cultivaron, recubrieron y estimularon HUVEC con poli (I: C) como se describe anteriormente. mAb 15EVQ dependiente de dosis restauró la reducción inducida por poli (I: C) en la viabilidad celular HUVEC (Figura 23B). 15EVQ dependiente de dosis restauró la reducción inducida por poli (I: C) en la viabilidad celular HUVEC (Figura 23B).
La modulación de la activación de las células endoteliales puede suprimir la infiltración excesiva de células inmunes y reducir el daño al tejido causado por las citocinas que se incrementan en condiciones inflamatorias. La inflamación y sobreexpresión de citocinas y moléculas de adhesión en las células endoteliales son contribuyentes clave para el desarrollo de la aterosclerosis y la hipertensión. Estos datos proporcionan una justificación para explorar los beneficios potenciales de los antagonistas TLR3 para su uso en enfermedades de los vasos sanguíneos, incluida la vasculitis y aquellas con disfunción endotelial. Otra enfermedad que se ve afectada por la inflamación y las citocinas sobreexpresadas es el sarcoma de Kaposi (KS), que es común en inmunodeprimidos y personas infectadas por el VIH y es causada por el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV). La producción de VEGF y citocina contribuye a la supervivencia de las células KS (Livengood y otros, Cell Immunol. 249:55-62, 2007). Los antagonistas TLR3 podrían ser beneficioso para la reducción de los riesgos angiogénicos asociados con KS y otros tumores y para evitar la pérdida de viabilidad celular y proteger la integridad de la barrera endotelial para evitar fugas vasculares, una enfermedad potencialmente grave asociada con la insuficiencia de órganos y enfermedades inflamatorias mortales como la sepsis. El antagonismo TLR3 también puede ser beneficioso en las infecciones virales que comprenden la patología de las células endoteliales, como la fiebre hemorrágica viral causada por miembros de la familia flaviviridae (por ejemplo, dengue, fiebre amarilla), filoviridae (ébola Marburg), bunyaviridae (por ejemplo, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus), arenaviridae (por ejemplo, Lujo, Lassa, fiebres hemorrágicas de Argentina Venezuela y Bolivia (Sihibamiya y otros., Blood 1 13:714-722, 2009).
EJEMPLO 19 Reactividad cruzada de los antagonistas de anticuerpos TLR3 con TLR3 cinomólgo y murino Se evaluó la actividad contra el TLR 3 cinomólogo y murino mediante el ensayo ISRE del gen reportero como se describe en el Ejemplo 2. Se amplificaron los ADN del TLR3 cinomólogo (SEQ ID NO: 217) y ADN murino TLR3 (SEQ ID NO: 161) de sangre completa y se clonaron en el vector pCEP4 (Clontech), y se expresaron como se describe anteriormente. mAb 15EVQ presentó IC50 de 4.18 pg/ml y 1.74 pg/ml en los ensayos ciño NF-?? e ISRE, respectivamente, en comparación con IC50 de 0.44 y 0.65 pg/ml en los ensayos de TLR3 NF-kB e ISRE humanos, respectivamente. Los anticuerpos de control de isotipo no tuvieron ningún efecto en estos ensayos.

Claims (67)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1 . Un anticuerpo aislado o fragmento de éste, en donde el anticuerpo se une a al menos un residuo de aminoácido de receptor tipo toll 3 (TLR3) seleccionado del grupo que consiste de residuos K467, R488 y R489 de la SEQ ID NO: 2.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los residuos de aminoácido TLR3 se seleccionan del grupo que consiste de: a. residuo K467 de la SEQ ID NO: 2; b. residuo R489 de la SEQ ID NO: 2; c. residuos K467 y R489 de la SEQ ID NO: 2; y d. residuos K467, R488, y R489 de la SEQ ID NO: 2.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo se une aún más a al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado del grupo que consiste de residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541 , E570 y K619 de la SEQ ID NO: 2.
4. Un anticuerpo aislado o fragmento de éste, en donde el anticuerpo se une a al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado del grupo que consiste de residuos D116 y K145 de la SEQ ID NO: 2.
5. El anticuerpo aislado o fragmento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque los residuos de aminoácido TLR3 se seleccionan del grupo que consiste de: a. residuo D1 16 de la SEQ ID NO: 2; y b. residuos D1 16 y K145 de la SEQ ID NO: 2.
6. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3, en donde el anticuerpo cuenta con al menos una de las siguientes propiedades: a. reduce la actividad biológica TLR3 humana en un ensayo in vitro poli(l:C) NF-KB del gen reportero >50 % a <1 pg/ml; b. inhibe >60 % de la producción de IL-6 o CXCL10/IP-10 de las células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml poli(l:C) a <10 pg/ml; c. inhibe >50 % de la producción de IL-6 o CXCL10/IP-10 de las células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml poli (l:C) a <0.4 g/ml; d. inhibe >50 % de la producción de IL-6 de las células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli (l:C) a <5 pg/ml; e. inhibe >50 % de la producción de IL-6 de las células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml poli (l:C) a <1 pg/ml; f. inhibe >20 % de la producción de IFN-?, IL-6 o IL-12 poli (l:C) inducido mediante PBMC a <1 pg/ml; g. inhibe la actividad biológica TLR3 cinomóloga en un ensayo in vitro NF-kB del gen reportero con IC50 <10 µg/ml¡ o h. inhibe la actividad biológica TLR3 cinomóloga en un ensayo in vitro ISRE del gen reportero con IC50 <5 pg/ml.
7. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que compite por la unión TLR3 con un anticuerpo monoclonal que comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 214; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 211 ; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 214 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 1 ; o d. las regiones determinativas de cadena pesada complementarias (CDR) 1 , 2 y 3 (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) de las secuencias de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 70, 77 y 72; o e. las regiones determinativas de cadena ligera complementarias (CDR) 1 , 2 y 3 (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) de las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 78; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 70, 77 y 72 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 78; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 214; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 1 .
8. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que compite por la unión TLR3 con un anticuerpo monoclonal que comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 216; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 216 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 86 y 84; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO:79, 80 y 87; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 86 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 87; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 216; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
9. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 61 , 192 y 60; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 192 se define aún más como se muestra en la Fórmula (I): Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (l) en donde Xaa6 puede ser Arg o Lys; Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser; Xaae puede ser Met, Arg o Tyr; y Xaa9 puede ser Lys o Arg; o b. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 55, 56 y 191 ; en donde el LCDR3 de las SEQ ID NO: 191 se define aún más como se muestra en la Fórmula (II): XaarS-Y-D— Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V, (II) en donde Xaai puede ser Ala, Gln, Gly o Ser; Xaa2 puede ser Gly, Glu o Ser; Xaa3 puede ser Asp o Asn; Xaa4 puede ser Glu o Ser; y Xaa5 puede ser Phe, Ala o Leu; o c. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 61 , 192 y 60; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 192 se define aún más como se muestra en la Fórmula (I): Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (i) en donde Xaas puede ser Arg o Lys; Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser; Xaa8 puede ser Met, Arg o Tyr; y Xaag puede ser Lys o Arg; y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 55, 56 y 191 ; en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 191 se define aún más como se muestra en la Fórmula (II): Xaa S-Y-D— Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V, (II) en donde Xaai puede ser Ala, Gln, Gly o Ser; Xaa2 puede ser Gly, Glu o Ser; Xaa3 puede ser Asp o Asn; Xaa4 puede ser Glu o Ser; y Xaa5 puede ser Phe, Ala o Leu; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 70, 194 y 72; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 194 se define aún más como se muestra en la Fórmula (III): l-l-Q -Xaai5-R-S-K-W-Y-N-Xaai6-Y-A-Xaai7-S-V-K-S, (III) en donde Xaa-15 puede ser Lys, Thr o lie; Xaai6 puede ser Asn o Asp; y Xaa-| puede ser Val o Leu; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 193; en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 se define aún más como se muestra en la Fórmula (IV): Xaa-io-S-Y-D— Xaan-P-Xaai2-Xaai3-Xaai4-V, (IV) en donde Xaa-?? puede ser Gln o Ser; Xaan puede ser Thr, Glu o Asp; Xaai2 puede ser Val o Asn; Xaa-i3 puede ser Tyr o Phe; y Xaau puede ser Ser, Asn o Gln; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 70, 194 y 72; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 194 se define aún más como se muestra en la Fórmula (II I): l-l-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S, (III) en donde Xaa-i 5 puede ser Lys, Thr o He; Xaa-i6 puede ser Asn o Asp; y Xaa-i puede ser Val o Leu; y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 193; en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 se define aún más como se muestra en la Fórmula (IV): Xaaio-S-Y-D— Xaan-P-Xaai2-Xaai3-Xaa-i4-V, (IV) en donde Xaaio puede ser GIn o Ser; Xaa-n puede ser Thr, Glu o Asp; Xaai2 puede ser Val o Asn; Xaai3 puede ser Tyr o Phe; y Xaa-u puede ser Ser, Asn o GIn; g. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 196 y 84; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 196 se define aún más como se muestra en la Fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V) en donde Xaa24 puede ser Phe o Arg; y Xaa25 puede ser Ala o Ser; o h. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 195; en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 195 se define aún más como se muestra en la Fórmula (VI): Q-Q-Xaais— Xaa-i9-Xaa2o-Xaa2i-Xaa22-Xaa23-T, (VI) en donde Xaais puede ser Tyr, Gly o Ala; Xaa-ig puede ser Gly, Glu o Asn; Xaa2o puede ser Ser o Thr; Xaa2i puede ser Val, lie o Leu; Xaa22 puede ser Ser o Leu; y Xaa23 puede ser lie, Ser, Pro o Tyr; o i. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 196 y 84; en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 196 se define aún más como se muestra en la Fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V) en donde Xaa24 puede ser Phe o Arg; y Xaa25 puede ser Ala o Ser; y j. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 195; en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 195 se define aún más como se muestra en la Fórmula (VI): Q-Q-Xaa-| 8— Xaaig-Xaa2o- aa2i-Xaa22- aa23-T, (VI) en donde Xaai8 puede ser Tyr, Gly o Ala; Xaaig puede ser Gly, Glu o Asn; Xaa2o puede ser Ser o Thr; Xaa2i puede ser Val, lie o Leu; Xaa22 puede ser Ser o Leu; y Xaa23 puede ser lie, Ser, Pro o Tyr.
10. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 6; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 5; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 52, 88 y 54; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 49, 50 y 51 ; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 52, 88 y 54 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 49, 50 y 51 ; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
1 1. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 7; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 7; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 58, 64 y 60; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 55, 56 y 57; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 58, 64 y 60 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 55, 56 y 57; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.
12. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 70, 77 y 72; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 69; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 70, 77 y 72 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 67, 68 y 69; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
13. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 12; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 1 ; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 12 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 1 ; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 83 y 84; o e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 89; o f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 83 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligeras CDR 1 , 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 89; o g. la región variable de cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; o h. la región variable de cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 1 .
14. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 13; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 14 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 13; o d. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 46, 47 y 48; o e. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 43, 44 y 45; o f. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 46, 47 y 48 y las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 43, 44 y 45; o g. la región variable de una cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
15. Un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 16; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 15; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 16 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 15; o d. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 52, 53 y 54; o e. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 49, 50 y 51 ; o f . las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 52, 53 y 54 y las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 49, 50 y 51 ; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
16. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 17; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 17; o d. las secuencias de una cadena pesada CDR de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 58, 59 y 60; o e. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; o f. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en SEQ ID NO 58, 59 y 60 y la cadena ligera CDR de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
17. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 20; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 19; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 20 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 19; o d. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO 61 , 62 y 60; o e. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; o f. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 62 y 60 y las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; o g. la región variable de una cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.
18. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 22; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 ; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 22 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 ; o d. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60; o e. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena ligera, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 63; o f. las secuencias de 1 , 2 y 3 aminoácidos de CDR de una cadena pesada, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60 y la cadena ligera CDR de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 63; o g. la región variable de una cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
19. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 24; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 23; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 24 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 23; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 65; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y de 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 65; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.
20. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 26; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 25; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 26 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 25; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y de 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y de 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 66; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60 y las secuencias de 1 , 2 y de 3 aminoácidos de cadena ligera CDR, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 66; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
21. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 28; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 27; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 28 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 27; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 71 y 72; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 71 y 72; y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
22. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 73 y 72; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 73 y 72 y las secuencias de cadena ligera CDR de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
23. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 32; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 ; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 32 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 ; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 75 y 72; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 74; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 75 y 72 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 74; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31.
24. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y de cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 33; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 34 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 33; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 77 y 72; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 76; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 77 y 72 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 76; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33.
25. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 36; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 36 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 35; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 77 y 72; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 78; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 70, 77 y 72 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 78; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.
26. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 38; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 38 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 83 y 84; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 81 ; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 83 y 84 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 81 ; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.
27. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y una cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 40; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 39; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 40 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 39; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 86 y 84; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 85; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 86 y 84 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 85; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; i. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102; o j. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 155; o k. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 155.
28. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 42; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 42 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o d. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 86 y 84; o e. las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 87; o f. las secuencias de CDR de una cadena pesada de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 82, 86 y 84 y las secuencias de CDR de una cadena ligera de 1 , 2 y 3 aminoácidos, tal como se muestra en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 87; o g. la región variable de la cadena pesada que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42; o h. la región variable de una cadena ligera que es al menos 95 % idéntica a la región variable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 ; i. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102; o j. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o k. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156.
29. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de una cadena pesada y de una cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 216; o b. la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o c. la región variable de una cadena pesada de la SEQ ID NO: 216 y la región variable de una cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o d. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 220; o e. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o f. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 220 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156.
30. Un anticuerpo aislado o un fragmento reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y una de cadena ligera y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124; o b. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 125; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 126; o d. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 127; o e. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 128; o f. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 129; o g. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o h. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 125 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o i. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 126 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o j. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 127 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o k. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 128 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o I. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 129 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 ; o m. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; o n. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 123; u o. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 42 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; o p. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 42 y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 123; o q, la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 1 1 , 1 12 y 84; o r. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 1 1 , 1 14 y 84; o s. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 115, 112 y 84; o t. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 112 y 84; o u. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 117 y 84; o v. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 118 y 84; o w. la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 112 y 119; o x. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 118 y 119; o y. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 112 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o z. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 114 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o aa. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO. : 115, 112 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1,2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o bb. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 112 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o ce. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 117 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o dd. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 118 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o ee. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 116, 112 y 119 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 110 y 113; o ff. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 120, 110 y 113; o gg. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 121, 110 y 113; o hh. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 112 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 120, 110 y 113; o ii. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 111, 112 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 121, 110 y 113; o jj. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 130; o kk. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 131; o II. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 132; o mm. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 133; o nn. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 134; u oo. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 135; o pp. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 160; o qq. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 130 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o rr. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 131 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o ss. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 132 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o tt. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o uu. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 134 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o v. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 135 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o ww. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 160 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 156; o xx. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 157; o yy. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 158; o zz. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 157; o aaa. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 102 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 158.
31 . El anticuerpo o fragmento aislado de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el anticuerpo es totalmente humano.
32. El anticuerpo o fragmento aislado de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento está adaptado a humanos.
33. El anticuerpo o fragmento aislado de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el anticuerpo se conjuga a polietilenglicol.
34. El anticuerpo o fragmento aislado de conformidad con la reivindicación 7 u 8 que tiene un isotipo lgG4.
35. El anticuerpo o fragmento aislado de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque el dominio Fe comprende mutaciones S229P, P235A o L236A.
36. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento aislado de la reivindicación 7 u 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
37. Un anticuerpo o fragmento aislado reactivo con TLR3 que comprende una región variable de cadena pesada y una de cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende: a. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 164; o b. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 163; o c. la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 164 o d. la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 163; o e. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 166; o f. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 165; o g. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 166 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 165; o h. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 168; o i. la cadena ligera de la SEQ ID NO: 167; o j. la cadena pesada de la SEQ ID NO: 168 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 167.
38. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos CDR seleccionadas del grupo que consiste de: a. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 61 , 192 y 60, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 192 además se define como se muestra en la Fórmula (I): Xaae-I-Xaar-Xaas-R-S-Xaag-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S en donde Xaa6 puede ser Arg o Lys; Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser; Xaa8 puede ser Met, Arg o Tyr; y Xaa9 puede ser Lys o Arg; b. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 70, 194 y 72, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 194 además se define como se muestra en la Fórmula (III): l-l-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S en donde Xaa-15 puede ser Lys, Thr o He; Xaa-i6 puede ser Asn o Asp; y Xaai puede ser Val o Leu; c. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 82, 196 y 84, en donde el HCDR2 de la SEQ ID NO: 196 además se define como se muestra en la Fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G en donde Xaa24 puede ser Phe o Arg; y Xaa25 puede ser Ala o Ser; d. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 52, 88 y 54; e. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 58, 64 y 60; f. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en LAS SEQ ID NO: 70, 77 y 72; g. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 82, 83 y 84; h. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 46, 47 y 48; i. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 52, 53 y 54; j. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 58, 59 y 60; k. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 61 , 62 y 60; I. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 61 , 64 y 60; m. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 70, 71 y 72; n. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 70, 73 y 72; o. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 70, 75 y 72; p. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 70, 77 y 72; q. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 82, 83 y 84; r. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 82, 86 y 84; s. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 11 , 1 14 y 84; t. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 15, 1 12 y 84; u. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 16, 1 12 y 84; v. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 1 1 , 1 17 y 84; w. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 16, 1 18 y 84; x. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 16, 1 12 y 1 19; y y. las secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 1 16, 1 18 y 1 19.
39. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos CDR seleccionadas del grupo que consiste de: a. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 191 , en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 191 además se define como se muestra en la Fórmula (II): Xaai-S-Y-D— Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5- T-V, (II) en donde Xaai puede ser Ala, Gln, Gly o Ser; Xaa2 puede ser Gly, Glu o Ser; Xaa3 puede ser Asp o Asn; Xaa4 puede ser Glu o Ser; y Xaa5 puede ser Phe, Ala o Leu; o b. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 193, en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 además se define como se muestra en la Fórmula (IV): Xaa-io-S-Y-D— Xaa-i-i-P-Xaai2-Xaai3-Xaai4-V, (IV) en donde Xaa-?? puede ser GIn o Ser; Xaan puede ser Thr, Glu o Asp; Xaa-|2 puede ser Val o Asn; Xaai3 puede ser Tyr o Phe; y Xaa-|4 puede ser Ser, Asn o GIn; o c. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 195, en donde el LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 además se define como se muestra en la Fórmula (VI): Q-Q-Xaai8— Xaai9-Xaa2o- aa2i-Xaa22- aa23-T, (VI) en donde Xaa-i8 puede ser Tyr, Gly o Ala; Xaa-i9 puede ser Gly, Glu o Asn; Xaa2o puede ser Ser o Thr; Xaa2i puede ser Val, He o Leu; Xaa22 puede ser Ser o Leu; y Xaa23 puede ser lie, Ser, Pro o Tyr; o d. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 49, 50 y 51 ; e. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; f. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; g. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 89; h. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 43, 44 y 45; i. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 49, 50 y 51 ; j. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 57; k. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 63; I. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 65; m. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 55, 56 y 66; n. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 69; o. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 74; p. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 76; q. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 67, 68 y 78; r. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 81 ; s. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 85; t. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 79, 80 y 87; u. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 109, 1 10 y 1 13; v. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 120, 1 10 y 1 13; y w. las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1 , 2 y 3 como se muestran en las SEQ ID NO.: 121 , 1 10 y 1 13.
40. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 0 216.
41 . Un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 122, 123, 197, 199, 201 , 163, 209, 210 ó 21 1.
42. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 0 168.
43. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 ó 167.
44. Una cadena pesada de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ó 216.
45. Una cadena pesada de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 122, 123, 197, 199, 201 , 163, 209, 210 ó 21 1.
46. Una cadena pesada de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ó 168.
47. Una cadena ligera de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 ó 167.
48. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar una condición inflamatona en un paciente.
49. El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria afecta un tejido seleccionado del grupo que consiste de tracto gastrointestinal, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto, sistema cardiovascular, tejido cardíaco, vasos sanguíneos, articulaciones, tejido óseo y sinovial, cartílago, epitelio, endotelio, tejido hepático o adiposo.
50. El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria se asocia con una infiltración de neutrófilos mediada por TLR-3 aumentada en el tejido.
51 . El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria es una condición inflamatoria pulmonar.
52. El uso como el que se reclama en la reivindicación 51 , en donde la condición inflamatoria pulmonar es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés).
53. El uso como el que se reclama en la reivindicación 51 , en donde la condición inflamatoria pulmonar está inducida por influenza Haemophilus no tipificable.
54. El uso como el que se reclama en la reivindicación 51 , en donde la condición inflamatoria pulmonar es hiperreactividad de las vías respiratorias.
55. El uso como el que se reclama en la reivindicación 54, en donde la hiperreactividad de las vías respiratorias está asociada con asma, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o fibrosis quística.
56. El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria es una enfermedad inflamatoria intestinal.
57. El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria está asociada con ulceración gastrointestinal.
58. El uso como el que se reclama en la reivindicación 57, en donde la ulceración gastrointestinal está asociada con colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis colagenosa o linfocítica, o enterocolitis necrotizante.
59. El uso como el que se reclama en la reivindicación 48, en donde la condición inflamatoria es una enfermedad autoinmunitaria.
60. El uso como el que se reclama en la reivindicación 59, en donde la enfermedad es artritis reumatoide.
61 . El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar o evitar una condición inflamatoria sistémica en un paciente.
62. El uso como el que se reclama en la reivindicación 61 , en donde la condición inflamatoria sistémica es tormenta de citocina o hipercitocinemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, por sus siglas en inglés), enfermedad de injerto contra huésped (GVHD, por sus siglas en inglés), síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS, por sus siglas en inglés), síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SARS, por sus siglas en inglés), síndrome antifosfolípido catastrófico, infecciones virales graves, influenza, neumonía, shock o sepsis.
63. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar la diabetes de tipo II en un paciente.
64. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar la hiperglucemia en un paciente.
65. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar la hiperinsulinemia en un paciente.
66. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 7 u 8, para preparar un medicamento para tratar o evitar infecciones virales en un paciente.
67. El uso como el que se reclama en la reivindicación 66, en donde la infección viral es infección por el virus de influenza A.
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WO (1) WO2010051470A2 (es)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
US20130090457A1 (en) * 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
HUE031756T2 (en) 2008-10-31 2017-07-28 Janssen Biotech Inc TLR3 antagonists
PL2425008T3 (pl) * 2009-04-29 2016-03-31 Janssen Biotech Inc Antagoniści receptora toll-podobnego 3
DK2451844T3 (en) 2009-07-10 2015-07-27 Innate Pharma Tlr3-retention agents
AU2012206614A1 (en) 2011-01-12 2013-08-01 Innate Pharma TLR3 binding agents
CN104159610A (zh) * 2011-09-12 2014-11-19 詹森生物科技公司 用于治疗代谢和心血管疾病的3型toll样受体拮抗剂
US9944712B2 (en) 2012-05-31 2018-04-17 Innate Pharma TLR3 binding agents
WO2014174704A1 (ja) * 2013-04-22 2014-10-30 国立大学法人東京大学 炎症性疾患の予防又は治療剤
US9198898B2 (en) 2013-06-24 2015-12-01 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
US8906951B1 (en) 2013-06-24 2014-12-09 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
WO2015016282A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 国立大学法人東京大学 放射線誘導性消化管症候群の予防又は治療用医薬組成物
GB201522394D0 (en) * 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
BR112018014810A2 (pt) 2016-01-22 2018-12-11 Merck Sharp & Dohme Corp. anticorpos anti-fator xi de coagulação
IL315266A (en) 2016-06-14 2024-10-01 Merck Sharp ַ& Dohme Llc Anti-coagulation factor xi antibodies
WO2018165270A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Newtonoid Technologies, L.L.C. Modular elongate wall-mounted sensor system and method
CN109136231B (zh) * 2018-09-14 2019-08-30 苏州大学 一种翘嘴鳜tlr3基因及其应用
WO2023235771A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 The University Of Chicago Chemical screen of modulators for vaccine adjuvants

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
CA2461315A1 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
JP2004016021A (ja) * 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
US7410975B2 (en) 2003-06-20 2008-08-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Small molecule toll-like receptor (TLR) antagonists
CA2483732A1 (en) 2004-09-29 2006-03-29 Ronan Le Goffic Toll-like receptor 3, its signalling associated molecule trif and their use thereof
UA97229C2 (ru) * 2004-11-30 2012-01-25 Центокор, Инк. Изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с toll-подобным рецептором 3 (tlr3)
AR051836A1 (es) * 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
EP1945820B1 (en) * 2005-10-27 2013-08-28 Janssen Biotech, Inc. Toll like receptor 3 modulators, methods and uses
JP2010520284A (ja) * 2007-03-05 2010-06-10 ユタ ステイト ユニバーシティ Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の限定アゴニスト
US20080299138A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Duffy Karen E Toll-Like Receptor 3 Modulators and Uses Thereof
EP2334703B1 (en) 2008-09-17 2015-07-08 Innate Pharma Compositions and methods for detecting tlr3
JP2012504651A (ja) 2008-10-02 2012-02-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体の活性を抑制するための方法
HUE031756T2 (en) * 2008-10-31 2017-07-28 Janssen Biotech Inc TLR3 antagonists
US20100188778A1 (en) * 2009-01-29 2010-07-29 Castagna Joseph T Disk Drive Assembly Having Flexible Support for Flexible Printed Circuit Board
PL2425008T3 (pl) 2009-04-29 2016-03-31 Janssen Biotech Inc Antagoniści receptora toll-podobnego 3
DK2451844T3 (en) * 2009-07-10 2015-07-27 Innate Pharma Tlr3-retention agents

Also Published As

Publication number Publication date
EP2350304A4 (en) 2014-04-16
CY1118797T1 (el) 2017-07-12
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WO2010051470A2 (en) 2010-05-06
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AU2009308763A1 (en) 2010-05-06
KR101683033B1 (ko) 2016-12-06
US9522957B2 (en) 2016-12-20

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