MX2014002982A - Antagonistas del receptor tipo toll 3. - Google Patents

Antagonistas del receptor tipo toll 3.

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Abstract

Se describen antagonistas de anticuerpos del receptor tipo toIl 3 (TLR3), polinucleótidos que codifican antagonistas de anticuerpos TLR3 o fragmentos de los mismos, y métodos de elaborar y usar lo anterior.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TIPO TOLL 3 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a antagonistas de anticuerpos del receptor tipo toll 3 (TLR3), polinucleótidos que codifican los antagonistas de los anticuerpos del TLR3 o fragmentos de estos, y metodos de fabricación y uso de lo anterior.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores tipo toll (TLR) regulan la activación de la respuesta inmune innata e influyen en el desarrollo de la inmunidad adaptativa mediante el inicio de cascadas de transducción de señales en respuesta a ligandos bacterianos, virales, parasíticos y, en algunos casos, derivados del huésped (Lancaster et al., J. Physiol. 563:945-955, 2005). Los TLR localizados en la membrana plasmática, TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6, reconocen ligandos que incluyen componentes proteicos o lipidíeos de bacterias y hongos. Los TLR predominantemente intracelulares, TLR3, TLR7 y TLR9, responden al ARNbc, ARNmc y ADN CpG no metilado, respectivamente. Se cree que la desregulación de la señalización del TLR provoca una multitud de problemas, y se están desarrollando estrategias terapéuticas para resolverlos (Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov. 4:879-880, 2005; Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006; Wickelgren, Science 312:184-187, 2006). Por ejemplo, los antagonistas del TLR4 y de los TLR 7 y 9 se encuentran en desarrollo clínico para casos graves de sepsis y lupus, respectivamente (Kanzler etal., Nat. Med. 13:552-559, 2007).
La señalización del TLR3 es activada por el ARNbc, ARNm o ARN liberado de celulas necróticas durante la inflamación o infección viral. La activación del TLR3 induce la secreción de interferones y citoquinas proinflamatorias, y desencadena la activación y el reclutamiento de células inmunes que son protectoras durante ciertas infecciones microbianas. Por ejemplo, se ha asociado un alelo dominante negativo del TLR3 con el aumento de la susceptibilidad a la encefalitis por Herpes Simplex tras la infección primaria con el virus HSV-1 en la infancia (Zheng et al., Science 317:1522-1527, 2007). En ratones, la deficiencia del TLR3 está asociada con una menor supervivencia tras la exposición al virus coxsackie (Richer et al., PLoS One 4:e4127, 2009). Sin embargo, se ha demostrado que la señalización no controlada o desregulada del TLR3 contribuye a la morbilidad y mortalidad en ciertos modelos de infección viral que incluyen Nilo Occidental, flebovirus, vaccinia e influenza A (Wang et al., Nat. Med. 10:1366-1373, 2004; Gowen et al., J. Immunol. 177:6301-6307, 2006; Hutchens et al., J. Immunol. 180:483-491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2:E53, 2006).
Se han determinado estructuras cristalinas de los dominios extracelulares del TLR3 humano y murino ((Bell et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 102:10976-80, 2005; Choe, et al., Science 309:581-585, 2005; Liu et al., Science, 320:379-381 , 2008). El TLR3 adopta la forma general de una herradura solenoide decorada por glicanos y tiene 23 unidades en tándem de mosaicos de repetición rica en leucina (LRR). Los sitios de unión al ARNbc se han mapeado a dos regiones distintas (Liu et al., Science, 320:379-81, 2008). Se ha propuesto que el ensamble de señalización consiste en 1 ARNbc y dos dominios extracelulares del TLR3 (Leonard et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 105: 258-263, 2008).
Se ha comprobado que el TLR3 impulsa mecanismos patogenicos en un espectro de enfermedades inflamatorias, inmunomediadas y autoinmunes que incluyen, por ejemplo, shock séptico (Cavassani et al., J. Exp. Med. 205:2609-2621, 2008), lesión pulmonar aguda (Murray et al., Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 178:1227-1237, 2008), artritis reumatoide (Kim et al., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009; Brentano et al., Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005), asma (Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662, 2009; Morishima et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 145:163-174, 2008; Stowell etal., Respir. Res. 10:43, 2009), enfermedades inflamatorias del intestino, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa (Zhou et al., J. Immunol. 178:4548-4556, 2007; Zhou et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007), enfermedad hepática autoinmune (Lang et al., J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006) y diabetes tipo I (Dogusan et al. Diabetes 57:1236-1245, 2008; Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9:52-68, 2009). Además, se ha demostrado que los aumentos específicos de órganos de la expresión del TLR3 se correlacionan con una serie de afecciones patológicas impulsadas por respuestas inflamatorias locales desreguladas, tales como en el tejido hepático en cirrosis biliar primaria (Takii et al., Lab Invest. 85:908-920, 2005), articulaciones con artritis reumatoide (Ospelt et ai, Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008) y en la mucosa nasal de pacientes con rinitis alergica (Fransson etai, Respir. Res. 6:100, 2005).
En condiciones necróticas, la liberación del contenido intracelular que incluye ARNm endógeno desencadena la secreción de citocinas, quimocinas y otros factores que inducen la inflamación local, facilitan la depuración de restos de células muertas y la reparación de daños. Frecuentemente, la necrosis perpetúa los procesos inflamatorios, lo que contribuye a la inflamación crónica o exagerada (Bergsbaken et ai, Nature Reviews 7:99-109, 2009). La activación del TLR3 en el sitio de necrosis puede contribuir a estos procesos inflamatorios aberrantes y generar un ciclo proinflamatorio adicional de realimentación positiva mediante los ligandos del TLR3 liberados. Por lo tanto, el antagonismo del TLR3 puede ser beneficioso en una variedad de trastornos que involucran la necrosis y/o inflamación crónica o exagerada.
La submodulación de la activación del TLR3 puede representar, además, una estrategia novedosa de tratamiento para indicaciones oncológicas, que incluyen carcinomas de células renales y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (Morikawa etai, Clin. Cáncer Res. 13:5703-5709, 2007; Pries et ai, Int. J. Mol. Med. 21:209-215, 2008). Además, se ha asociado el alelo TLR3L423F que codifica una proteína con actividad reducida con la protección contra la degeneración macular “seca” relacionada con la edad avanzada (Yang et ai, N. Engl. J, Med. 359:1456-1463, 2008), lo que indica que los antagonistas del TLR3 pueden ser beneficiosos en esta enfermedad.
Las patologías asociadas con afecciones inflamatorias y otras, tales como las asociadas con infecciones, tienen impactos significativos en la salud y la economía. Sin embargo, a pesar de los avances en muchas áreas de la medicina, se dispone, comparativamente, de pocas terapias y opciones de tratamiento para muchas de estas afecciones.
Por lo tanto, existe la necesidad de suprimir la actividad del TLR3 para tratar afecciones asociadas con el TLR3.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de mAb del anti-TLR3 humano (huTLR3) en un ensayo de gen reportero para NF-kB.
Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de mAb anti-huT LR3 en un ensayo en NHBE.
La Figura 3 muestra el efecto de mAb anti-huTLR3 en un ensayo en PBMC.
Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de mAb anti-huTLR3 en un ensayo en HASM.
Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran la unión de mAb anti-huTLR3 a mutantes del TLR3.
La Figura 6A muestra los epítopos para el mAb 15EVQ (negro) y el mAb C1068 (gris) (imagen superior) y el epítopo para el mAb 12QVQ/QSV (negro, imagen inferior) superpuestos a la estructura de los ECD TLR3 humano. La Figura 6B muestra el mapa de perturbación del intercambio H/D localizado de la proteína ECD TLR3 acomplejada con el mAb 15EVQ.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto del mAb de rata/ratón anti-TLR3 de ratón, mAb 5429 (sustituto), en ensayos de gen reportero para 7A) NF-kB y 7B) ISRE.
La Figura 8 muestra el efecto de los mAbs sustitutos (mAb 5429, mAb c1811) en el ensayo en MEF CXCL10/IP-10.
La Figura 9 muestra la especificidad de unión del mAb sustituto al TLR3. Panel superior: control de isotipo; panel inferior: mAb c1811.
La Figura 10 muestra el efecto de los mAb sustitutos en el nivel de penH de un modelo AHR.
La Figura 11 muestra el efecto de los mAb sustitutos en el número total de neutrófilos en el fluido de BAL en un modelo AHR.
La Figura 12 muestra el efecto de los mAb sustitutos en los niveles de CXCL10/IP-10 en el fluido de BAL en un modelo AHR.
La Figura 13 muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones histopatológicas en un modelo DSS. Puntuación ciega basada en: necrosis celular simple, ulceración epitelial, descamación epitelial, absceso criptal, proliferación de células criptales, formación de tejido de granulación submucoso en la LP, neutrófilos submucosos, edema submucoso.
Las Figuras 14A y 14B muestran el efecto del mAb sustituto en 14A) las puntuaciones histopatológicas y 14B) la afluencia de neutrófilos en un modelo de transferencia de celulas T.
La Figura 15 muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones clínicas en un modelo CIA.
La Figura 16 muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones clínicas del AUC en modelo CIA.
La Figura 17 muestra el efecto del mAb sustituto en la supervivencia de ratones C57BL/6 después de la administración intranasal de la influenza A/PR/8/34. La dosificación del mAb comenzó en el día -1.
La Figura 18 muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones clínicas después de la administración de la influenza A/PR/8/34. La dosificación del mAb comenzó en el día -1.
La Figura 19 muestra el efecto del mAb sustituto en el peso corporal durante 14 días después de la administración de la influenza A/PR/8/34. La dosificación del mAb comenzó en el día -1.
Las Figuras 20A y 20B muestran el efecto de los mAb sustitutos en los niveles de glucosa en sangre en animales (20A) WT DIO y (20B) TLR3KO DIO después de la exposición a glucosa.
La Figura 21 muestra el efecto del mAb sustituto en los niveles de insulina en animales WT DIO.
Las Figuras 22A y 22B muestran el efecto del mAb 15EVQ en los niveles de CXCL10/IP-10 y CCL5/RANTES inducidos por (22A) NTHi y (22B) rinovirus en celulas NHBE.
Las Figuras 23A y 23B muestra el efecto del mAb 15EVQ en (23A) los niveles de slCAM-1 y (23B) la viabilidad en células HUVEC.
La Figura 24 muestra la supervivencia de los animales tras la administración del mAb sustituto 3 días después de la infección con influenza A.
La Figura 25 muestra las puntuaciones clínicas tras la administración del mAb sustituto 3 días después de la infección con influenza A.
La Figura 26 muestra el cambio de peso corporal de los animales tras la administración del mAb sustituto 3 días después de la infección con influenza A.
Las Figuras 27A y 27B muestran la estructura molecular del complejo cuaternario del ECD huTLR3 con los Fab 12QVQ/QSV, Fab 15EVQ y Fab C1068 en 27A. en representaciones de cinta y de superficie. El ECD TLR3 está en gris claro, con el rótulo N en el N-terminal; todas las moléculas de Fab se muestran en gris oscuro en representación de cintas. 27B. Los epítopos son de color gris claro y tienen rótulos en el ECD TLR3 como en los Fab en A. Por razones de claridad, en las Figuras 27A y 27B, 28 y 29A-29C los rótulos de los Fab 12QVQ/QSV, Fab C1068 y Fab 15EVQ se abrevian como Fab12, Fab1068 y Fab15, respectivamente.
Las Figuras 28A y 28B muestran un mecanismo de neutralización por el Fab 15EVQ. 28A. La unidad de señalización (SU) ARNbc:TLR3 se muestra con el epítopo del Fab 15EVQ resaltado (gris claro) en uno de los dos ECD TLR3 (gris claro y oscuro, y rotulado como TLR3). El ligando del ARNbc se muestra como una doble helice en gris claro. 28B. Una ilustración del Fab 15EVQ que se une al sitio de unión estéricamente inhibido del ARNbc y, por lo tanto, inhibe la formación de la SU. La unión del Fab 15EVQ, que tiene mayor afinidad, impide la formación de la SU o desensambla la SU preformada.
Las Figuras 29A a 29C muestran un mecanismo del Fab 12QVQ/QSV y el Fab c1068, y la aglomeración de las unidades de señalización (SU) del TLR3. 29A. El Fab 12QVQ/QSV y Fab c1068 pueden unirse (o counirse) a una sola SU. 29B. Modelo para la aglomeración más cercana de dos SU en un ARNbc de aproximadamente 76 pares de bases. Por razones de claridad, los tres epítopos están resaltados en moléculas diferentes. 29C. La unión del Fab 12QVQ/QSV y Fab c1068 impide la aglomeración de la SU debido a choques estéricos entre los anticuerpos y SU vecinas. Las dos flechas que apuntan hacia la izquierda representan cualitativamente diferentes grados de separación de las SU debido a los anticuerpos (flecha inferior para el Fab 12QVQ/QSV y flecha superior para el Fab c1068).
La Figura 30 muestra la alineación del VL del mAb 15EVQ con marcos humanos Vk1. Los lazos hipervariables de Chothia están subrayados, los residuos de parátopo presentan subrayado doble y las diferencias de marcos están resaltadas en gris. Los genes Vk1 son alelos *01, a menos que se indique otra cosa. La numeración de los residuos es secuencial.
La Figura 31 muestra la alineación del VH del mAb 15EVQ con marcos humanos Vh5. Las características de la secuencia se indican como en la Figura 30.
Las Figuras 32A y 32B muestran la alineación del VL del mAb 12QVQ/QSV con marcos humanos Vk3. Las características de la secuencia se indican como en la Figura 30.
La Figura 33 muestra la alineación de los VL y VH del mAb 15EVQ o mAb 12QVQ/QSV con marcos humanos Jk, JA o Jh. Las características de la secuencia se indican como en la Figura 30.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es un anticuerpo aislado, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido del receptor tipo toll 3 (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541 , S571 , L595 y K619 de la SEQ ID NO: 2.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido del receptor tipo toll 3 (TLR3) S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195 y A219 de la SEQ ID NO: 2.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado que tiene una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une al TLR3 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, con los residuos de Clothia de la región variable de la cadena pesada W33, F50, D52, D54, Y56, N58, P61, E95, Y97, Y100 y D100b, y los residuos de Clothia de la región variable de la cadena ligera Q27, Y32, N92, T93, L94 y S95.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado que tiene una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une al TLR3 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, con los residuos de Clothia de la región variable de la cadena pesada N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, F99 y Y100, y los residuos de Clothia de la región variable de la cadena ligera G29, S30, Y31 , Y32, E50, D51 , Y91 , D92 y D93.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3, en donde el anticuerpo tiene al menos una de las propiedades siguientes: a. se une al TLR3 humano con una Kd de <10 nM; b. reduce la actividad biológica del TLR3 humano en un ensayo de gen reportero in vitro para poli(l:C) NF-kB en un >50 % a 1 mg/ml; c. inhibe en un >60 % la producción de IL-6 o CXCL10/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli(l:C) a 10 mg/ml; d. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 o CXCL10/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli(l:C) a 0.4 pg/ml; e. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml de poli(l:C) a 5 pg/ml; f. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml de poli(l:C) a 1 pg/ml; g. inhibe en un >20 % la producción inducida por poli(l:C) de IFN-g, IL-6 o IL-12 por células PBMC a 1 pg/ml; h. inhibe la actividad biológica del TLR3 cinomólogo en un ensayo de gen reportero in vitro para NF-kB con IC50 < 10 pg/ml; o i inhibe la actividad biológica del TLR3 cinomólogo en un ensayo de gen reportero in vitro para ISRE con IC50 < 5 pg/ml.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 que compite por la unión del TLR3 con un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de la cadena ligera, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena pesada (VH) o la secuencia de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena ligera (VL).
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de ciertas CDR 1 , 2 y 3 de la cadena ligera.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena pesada (VH) y las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena ligera (VL).
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas cadenas pesadas y las secuencias de aminoácidos de ciertas cadenas ligeras.
Otro aspecto de la invención es una cadena pesada de anticuerpo aislado; la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
Otro aspecto de la invención es una cadena ligera de anticuerpo aislado; la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 o 225.
Otro aspecto de la invención es una cadena pesada de anticuerpo aislado; la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
Otro aspecto de la invención es una cadena ligera de anticuerpo aislado; la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 o 227.
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo; la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo; la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 o 225.
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo; la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo; la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 o 227.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención.
Otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención.
Otro aspecto de la invención es un método para fabricar un anticuerpo reactivo con el TLR3; el método comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir una afección inflamatoria; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria.
Otro aspecto de la invención es un metodo para tratar o prevenir una afección inflamatoria sistémica; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria sistémica.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la diabetes tipo II; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar la diabetes tipo II.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la hiperglucemia; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar la hiperglucemia.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la hiperinsulinemia; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar la resistencia a la insulina.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir infecciones virales; el método comprende administrar a un paciente con necesidad de este una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir infecciones virales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, que incluyen, sin limitarse a, las patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta descripción se incorporan en este documento como referencia como si se expusieran completamente.
El termino “antagonista”, como se usa en la presente descripción, significa una molécula que inhibe parcial o completamente, por cualquier mecanismo, un efecto de otra molécula, tal como un receptor o un mediador intracelular.
Como se usa en la presente descripción, un “antagonista de anticuerpos del TLR3” o un anticuerpo “reactivo con el TLR3” describe un anticuerpo que, directa o indirectamente, es capaz de prácticamente contrarrestar, reducir o inhibir la actividad biológica del TLR3 o la activación del receptor TLR3. Por ejemplo, un anticuerpo reactivo con el TLR3 se puede unir directamente al TLR3 y neutralizar la actividad del TLR3, es decir , bloquear la señalización del TLR3 para reducir la liberación de citocina y quimocina o la activación de NF-kB.
El término “anticuerpos”, como se usa en la presente descripción, se entiende en un sentido amplio e incluye inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo, que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, que incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados y quiméricos, y fragmentos de anticuerpo.
Generalmente, los anticuerpos son proteínas o cadenas peptídicas que exhiben especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos diferentes de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera presenta, además, puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (región variable) (VH) seguido de una serie de dominios constantes (regiones constantes). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas livianas del anticuerpo de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar en uno de dos tipos evidentemente distintos, particularmente, kappa (K) y lambda (l), según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. La IgA y la IgG se clasifican, además, como los isotipos IgA-i, lgA2, IgG-i, lgG2, lgG3 e lgG4.
El término “fragmentos de anticuerpo” significa una porción de un anticuerpo intacto, generalmente, la unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv, diacuerpos, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos.
Una región variable de la cadena ligera o región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina consiste en una región “marco” interrumpida por tres “sitios de unión al antígeno”. Los sitios de unión al antígeno se definen mediante el uso de diversos términos de la manera siguiente: (i) el término regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se basa en la variabilidad de secuencia (Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis CDR; tres en el VH (HCDR1 , HCDR2, HCDR3) y tres en el VL (LCDR1 , LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) El término “región hipervariable”, “HVR”, o “HV” se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo cuya estructura es hipervariable, tal como lo definen Chothia y Lesk (Chothla and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis regiones hipervariables, tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Chothia y Lesk denominan las HV estructuralmente conservadas como “estructuras canónicas” (iii) Las “CDR de IMGT”, como propone Lefranc (Lefranc etal., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003) se basan en la comparación de los dominios V de inmunoglobulinas y receptores de células T. La base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http:bwww_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de estas regiones. La correspondencia entre CDR, HV y delimitaciones de IMGT se describe en Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003. (iv) El sitio de unión al antígeno puede delimitarse, además, en base al uso del residuo determinante de la especificidad (SDRU (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004), en donde residuos determinantes de la especificidad (SDR) se refiere a los residuos de aminoácido de una inmunoglobulina que están directamente involucrados en el contacto con antígenos. El SDRU es una medida precisa de una serie y distribución de SDR para tipos diferentes de antígenos definidos por análisis de estructuras cristalinas de complejos antígeno-anticuerpo. (v) El sitio de unión al antígeno puede definirse, además, como los residuos de parátopo del anticuerpo identificados a partir de la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo.
El término “secuencias compuestas”, como se usa en la presente descripción, significa un sitio de unión al antígeno definido para incluir todos los residuos de aminoácido delimitados individualmente por Kabat, Chothia o IMGT, o cualquier otra delimitación de sitio de unión al antígeno adecuada.
“Los “residuos de Chothia”, como se usa en la presente descripción, son los residuos de VL y VH de anticuerpos enumerados de acuerdo con Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-48, 1997). En las tablas C, D, E y F se muestra la correspondencia entre los dos sistemas de numeración más usados, Kabat (Kabat et al., Sequences of Immunological Interes†, 5.th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991) y Chothia (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-17, 1987) en relación con la numeración secuencial de polipeptidos para anticuerpos ilustrativos de la invención.
Las siguientes tablas C, D, E y F muestran la correspondencia entre la numeración secuencial, de Kabat y de Chothia de anticuerpos ilustrativos. Las CDR y HV están resaltadas en gris.
TABLA C TABLA D TABLA E mAb12QVQ/QSV TABLA F mAb12QVQ/QSV “Marco” o “secuencias de marco” son las secuencias restantes de una región variable distinta de las definidas como sitio de unión al antígeno. El marco se divide, típicamente, en cuatro regiones, FR1, FR2, FR3 y FR3 que forman un supercóntigo para los tres sitios de unión al antígeno en cada región variable. Debido a que el sitio de unión al antígeno puede definirse por varios terminos, como se describió anteriormente, la secuencia exacta de aminoácidos de un marco depende del modo en que se definió el sitio de unión al antígeno.
“Un marco de la región variable de la cadena ligera kappa 1 (VK1)” o “VK1”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales VK1 humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales Vk1 humanos ilustrativos son IGKV1-5*01, IGKV1-6*01, IGKV1-8*01, IGKV1-9*01, IGKV1-12*01, IGKV1-13*02, IGKV1-16*01, IGKV1-17*01, IGKV1 -27*01 , IGKV1-33*01, IGKV1-37*01, IGKV1-39*01, IGKV1D-8*01, IGKV1D-12*01, IGKV1D-13*01, IGKV1 D-16*01 , IGKV1 D-17*01 , IGKV1D- 33*01, IGKV1D-37*01, IGKV1D-39*01, IGKV1D-42*01 o IGKV1D-43*01. La nomenclatura de los genes de la inmunoglobulina es muy conocida.
“Un marco de la región variable de la cadena ligera lambda 3 (VA3)” o “VA3”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales VA3 humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales VA3 humanos ilustrativos son IGLV3-1*01, IGLV3-9*01, IGLV3-10*01, IGLV3-12*01, IGLV3-16*01, IGLV3-19*01, IGLV3-21*01, IGLV3-22*01, IGLV3-25*01 , IGLV3-27*01 e IGLV3-32*01.
“Un marco de la región variable de la cadena pesada Vh5” o “Vh5”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales Vh5 humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales Vh5 humanos ilustrativos son IGHV5-51*01 e IGHV5-1*01.
“Un marco de la región variable de la cadena pesada Vh6” o “Vh6”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales Vh6 humanos, o alelos de estos. Un gen funcional Vh6 humano ilustrativo es IGHV6-1*01.
“Un marco de la región J de la cadena ligera kappa (JK)” O “JK”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales JK humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales VK humanos ilustrativos son IGKJ1 , IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4 e IGKJ5.
“Un marco de la región J de la cadena ligera lambda (JA)” o “JA”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales JA humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales JA humanos ilustrativos son IGLJ1 , IGLJ2, IGLJ3, IGLJ4, IGLJ5, IGLJ6 e IGLJ7.
“Un marco de la región J de la cadena pesada (Jh)” o “Jh”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un marco que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los genes funcionales Jh humanos, o alelos de estos. Los genes funcionales Jh humanos ilustrativos son IGHJ1 , IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5 e IGHJ6.
Los “genes de la línea germinal” o “genes de anticuerpos de la línea germinal”, como se usan en la presente descripción, son secuencias de inmunoglobulina codificadas por celulas no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que conduce al reordenamiento genético y la mutación para la expresión de una inmunoglobulina en particular.
“Supercóntigo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera o pesada codificadas por genes de la línea germinal humana. Por lo tanto, el supercóntigo abarca el marco y el sitio de unión al antígeno.
El término “antígeno”, como se usa en la presente descripción, significa cualquier molécula que tiene la capacidad de generar anticuerpos, ya sea directa o indirectamente. En la definición de “antígeno” se incluye un ácido nucleico que codifica proteínas.
El término “homólogo” significa secuencias de proteína que tienen entre 40 % y 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Los homólogos del TLR3 humano incluyen polipéptidos de otras especies que tienen entre 40 % y 100 % de identidad de secuencia con una secuencia conocida del TLR3 humano. El porcentaje de identidad entre dos cadenas peptídicas se puede determinar por alineamiento de pares mediante el uso de la configuración predeterminada del módulo AlignX del vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Por “TLR3” se entiende TLR3 humano (huTLR3) y sus homólogos. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del huTLR3 en toda su extensión se muestran en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del dominio extracelular (ECD) del huTLR3 se muestran en la SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.
El termino “sustancialmente idéntico”, como se usa en la presente descripción, significa que las dos secuencias de aminoácidos del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que se están comparando son idénticas o tienen “diferencias no sustanciales”. Las diferencias no sustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias descritas en la presente descripción también son parte de esta solicitud. En algunas modalidades, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más. El porcentaje de identidad se puede determinar como se describió anteriormente. Las cadenas peptídicas ilustrativas que se están comparando son regiones variables de la cadena pesada o ligera.
El término “en conjunto con”, tal como se usa en la presente descripción, significa que los agentes descritos pueden administrarse a un animal en forma conjunta en una mezcla, al mismo tiempo como agentes únicos, o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.
El término “afección inflamatoria”, como se usa en la presente descripción, significa una respuesta localizada a la lesión celular que está mediada, en parte, por la actividad de citocinas, quimocinas o células inflamatorias ( or ejemplo, neutrófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos) que, en la mayoría de casos, se caracteriza por dolor, enrojecimiento, hinchazón y perdida de la función tisular. El término “afección pulmonar inflamatoria”, como se usa en la presente descripción, significa una afección inflamatoria que afecta o está asociada con los pulmones.
El término “anticuerpo monoclonal” (mAb), como se usa en la presente descripción, significa un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y, típicamente, se dirigen contra un único determinante antigénico. El modificador “monoclonal” indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo y no requiere la producción del anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, se puede obtener mAb murinos mediante el método del hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975. Se puede preparar MAb quiméricos que contienen una región variable de la cadena liviana y pesada derivada de un anticuerpo dador (típicamente, murino) en asociación con regiones constantes de la cadena liviana y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor (típicamente, otra especie de mamíferos tales como humanos) por el método descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 4,816,567. Se puede preparar MAb adaptados a humanos que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina dadora no humana (típicamente, murina) y las partes restantes de la molécula, derivadas de inmunoglobulina, se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas mediante téenicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia, tales como las descritas en la patente de los Estados Unidos núm. 5,225,539. Aquellos con experiencia en la materia pueden seleccionar secuencias de marco humano útiles para la adaptación a humanos a partir de las bases de datos correspondientes. Opcionalmente, los mAb adaptados a humanos se pueden modificar adicionalmente mediante la incorporación de residuos alterados para región estructural a fin de preservar la afinidad de unión mediante teenicas tales como las descritas en Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 y Hodgson etal., Bio/Technology, 9:421, 1991.
Se puede preparar MAb completamente humanos que carecen de secuencias no humanas a partir de ratones transgénicos para inmunoglobulina humana mediante técnicas descritas en, por ejemplo, Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; y Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. Además, se puede preparar y optimizar MAb humanos a partir de genotecas de exhibición de fagos mediante técnicas descritas en, por ejemplo, Knappik etal., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001. Se puede producir fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab’)2, Fd y dAb por clivaje de los anticuerpos o por ingeniería recombinante. Por ejemplo, se puede generar fragmentos Fab y F(ab’)2 mediante el tratamiento de los anticuerpos con una enzima tal como pepsina.
El término “epítopo”, como se usa en la presente descripción, significa una porción de un antígeno a la cual se une específicamente un anticuerpo. Usualmente, los epítopos consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas (tales como polares, no polares o hidrófobas) de entidades tales como aminoácidos o cadenas laterales de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser un epítopo discontinuo, por ejemplo, un epítopo conformacional, formado por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un antígeno en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un epítopo conformacional incluye epítopos obtenidos del plegado de un antígeno, en donde los aminoácidos de distintas porciones de la secuencia lineal del antígeno se encuentran en estrecha proximidad en el espacio tridimensional.
El termino “parátopo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una porción de un anticuerpo a la cual se une específicamente un antígeno. Un parátopo puede ser de naturaleza lineal o discontinua, y puede estar formado por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un anticuerpo en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un “parátopo de cadena ligera” y un “parátopo de cadena pesada” o “residuos de aminoácido de parátopo de cadena ligera” y “residuos de aminoácido de parátopo de cadena pesada” se refieren, respectivamente, a residuos de la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpos en contacto con un antígeno.
El término “unión específica”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado con una afinidad mayor que para otros antígenos o proteínas. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (KD) de 107 M o menor, y se une al antígeno predeterminado con una KD que es al menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipeptido especificado) distinto del antígeno predeterminado. En la presente descripción, las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan indistintamente con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno” o “un anticuerpo específico de antígeno”, por ejemplo, un anticuerpo específico del TLR3. Se puede medir la constante de disociación mediante el uso de procedimientos estándar tal como se describen más abajo.
El término “actividad biológica del TLR3” o “activación del TLR3”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la actividad que se produce como resultado de la unión del ligando al TLR3. Los ligandos del TLR3 incluyen ARNbc, poli(l:C) y ARNm endógeno, por ejemplo, ARNm endógeno liberado de células necróticas. Una activación ilustrativa del TLR3 da como resultado la activación de NF-kB en respuesta al ligando del TLR3. Se puede analizar la activación de NF-kB mediante un ensayo de gen reportero tras la inducción del receptor con poli(l:C) (Alexopoulou et al., Nature 413:732-738, 2001 ; Hácker et al., EMBO J. 18:6973-6982, 1999). Otros activación ilustrativa del TLR3 da como resultado la activación de factores de respuesta al interferón (IRF-3, IRF-7) en respuesta al ligando del TLR3. Se puede analizar la activación de IRF mediada por el TLR3 mediante el uso de un gen reportero impulsado por un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE). Otra activación del TLR3 ilustrativa da como resultado la secreción de citocinas y quimocinas proinflamatorias, por ejemplo, TNF-a, IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-10 y RANTES. La liberación de citocinas y quimocinas de celulas, tejidos o en circulación se puede medir mediante el uso de inmunoensayos muy conocidos, tales como un inmunoensayo ELISA.
En la presente descripción se usan códigos convencionales de una y tres letras para aminoácidos de la manera siguiente: Aminoácido Código de tres letras Código de una letra Alanina ala A Arginina arg R Asparagina asn N Aspartato asp D Cisteína cys C Glutamato glu E Glutamina gin Q Glicina giy G Histidina his H Isoleucina ile I Leucina leu L Usina lys K Metionina met M Fenilalanina phe F Prolina pro P Serina ser S Treonina thr T Triptófano trp w Tirosina tyr Y Valina val V Composiciones de materia La presente invención proporciona antagonistas de anticuerpos capaces de inhibir la actividad biológica del TLR3 y usos de esos anticuerpos. Esos antagonistas del TLR3 pueden tener propiedades de unión al TLR3 e inhibir la activación del TLR3. Los mecanismos ilustrativos mediante los cuales la activación del TLR3 puede resultar inhibida por esos anticuerpos incluyen la inhibición in vitro, in vivo o in situ de la unión del ligando al TLR3, la inhibición de la dimerización del receptor, la inhibición de la ubicación del TLR3 respecto del compartimiento endosomal, la inhibición de la actividad quinasa de las vías de señalización corriente abajo o la inhibición de la transcripción del ARNm del TLR3. Dentro del alcance de los diversos aspectos y modalidades de la invención tambien se encuentran otros antagonistas de anticuerpos capaces de inhibir la activación del TLR3 por otros mecanismos. Estos antagonistas son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos.
En un sistema natural, la diversidad de anticuerpos se crea por el uso de múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos génicos variables con segmentos génicos de diversidad (D) y de unión (J) para formar una región VH completa, y la recombinación de segmentos génicos variables y de unión para formar una región VL completa. El proceso de recombinación propiamente dicho puede ser impreciso, lo que da como resultado la pérdida o adición de aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad se producen en las células B en desarrollo antes de la exposición al antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpos expresados en células B se someten a mutación somática. En base al número estimado de segmentos génicos de la línea germinal, la recombinación aleatoria de estos segmentos y el apareamiento aleatorio VH-VL, se podrían producir hasta 1.6*107 anticuerpos diferentes (Fundamental Immunology, 3.° ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y.). Si se tienen en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (tales como la mutación somática), se cree que se podrían generar más de 1010 anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2.° ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif.). Debido a los muchos procesos involucrados en la generación de la diversidad de anticuerpos, es muy poco probable que anticuerpos monoclonales derivados independientemente con la misma especificidad por el antígeno tengan secuencias de aminoácidos idénticas.
La invención proporciona sitios novedosos de unión a antígeno y cadenas de ¡nmunoglobulina derivadas de genotecas de inmunoglobulina humana. La estructura para portar un sitio de unión al antígeno es, generalmente, una cadena pesada o ligera de anticuerpo, o una porción de esta, en donde el sitio de unión al antígeno se encuentra en un sitio de unión al antígeno de origen natural determinado como se describió anteriormente.
La invención proporciona un anticuerpo aislado, o fragmento de este, reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada, y las secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera, como se muestra en la Tabla 1a.
TABLA 1a 15* CDR definidas por IMGT 15** CDR definidas como consenso En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 192, en donde la HCDR2 de la SEQ ID NO: 192 se define como se muestra en la Fórmula (I): Xaae-I-Xaar-Xaas-R-S-Xaag-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (l) en donde Xaa6 puede ser Arg o Lys; Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser; Xaag puede ser Met, Arg o Tyr; e Xaag puede ser Lys o Arg.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 194, en donde la HCDR2 de la SEQ ID NO: 194 se define como se muestra en la Fórmula (III): l-l-Q -Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S, (III) en donde Xaais puede ser Lys, Thr o lie; Xaai6 puede ser Asn o Asp; e Xaa17 puede ser Val o Leu.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la HCDR2 como se muestra en la SEQ ID NO: 196, en donde la HCDR2 de la SEQ ID NO: 196 se define como se muestra en la Fórmula (V): Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V) en donde Xaa24 puede ser Phe o Arg; e Xaa25 puede ser Ala o Ser.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 191, en donde la LCDR3 de la SEQ ID NO: 191 se define como se muestra en la Fórmula (II): Xaai -S-Y-D— Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaas-T -V, (II) en donde Xaai puede ser Ala, Gln, Gly o Ser; Xaa2 puede ser Gly, Glu o Ser; Xaa3 puede ser Asp o Asn; Xaa4 puede ser Glu o Ser; y Xaa5 puede ser Phe, Ala o Leu.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 193, en donde la LCDR3 de la SEQ ID NO: 193 se define como se muestra en la Fórmula (IV): Xaaio-S-Y-D— Xaan-P-Xaai2-Xaai3-Xaai4-V, (IV) en donde Xaa-io puede ser Gln o Ser; Xaan puede ser Thr, Glu o Asp; Xaa-12 puede ser Val o Asn; Xaai3 puede ser Tyr o Phe; e Xaai4 puede ser Ser, Asn o Gln.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la LCDR3 como se muestra en la SEQ ID NO: 195, en donde la LCDR3 de la SEQ ID NO: 195 se define como se muestra en la Fórmula (VI): Q-Q-Xaai 8— Xaa 19-Xaa2o-Xaa2i -Xaa22-Xaa23-T, (VI) en donde Xaais puede ser Tyr, Gly o Ala; Xaaig puede ser Gly, Glu o Asn; Xaa2o puede ser Ser o Thr; Xaa2i puede ser Val, lie o Leu; Xaa22 puede ser Ser o Leu; y Xaa23 puede ser lie, Ser, Pro o Tyr.
La invención proporciona, además, un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3, que tiene las secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y las secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera, como se muestra en la Tabla 1a.
Los anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos del sitio de unión al antígeno no difieren sustancialmente de las mostradas en la Tabla 1a (SEQ ID NO: 49-121 y 191-196) se incluyen dentro del alcance de la invención. Típicamente, esto implica una o más sustituciones de aminoácidos con un aminoácido que tiene características de carga, hidrofobicidad y estereoquímicas similares. Además, y a diferencia de los sitios de unión al antígeno, se puede realizar sustituciones adicionales en las regiones marco, siempre que no afecten negativamente las propiedades del anticuerpo. Las sustituciones se pueden efectuar para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo, estabilidad o afinidad. En el sitio de unión al antígeno se puede efectuar una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones. Se puede sustituir el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 30 % de los residuos del marco, siempre que el anticuerpo obtenido conserve las propiedades deseadas.
Las modificaciones conservadoras producen moleculas con características funcionales y químicas similares a las de la molécula de la cual se realizan esas modificaciones. Puede lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas mediante la selección de sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (1) la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice, (2) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (3) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una “sustitución conservadora de aminoácidos” puede comprender una sustitución de un residuo nativo de aminoácido por un residuo no nativo para que haya poco o ningún efecto en la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo del polipéptido puede sustituirse, además, con alanina, como se describió anteriormente para la mutagénesis por barrido de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Aquellos con experiencia en la materia pueden determinar sustituciones preferidas de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) en el momento en que esas sustituciones se deseen. Por ejemplo, se puede usar sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia molecular, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moleculas descritas en la presente descripción. En la Tabla 1b se muestran sustituciones de aminoácidos ilustrativas.
En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras abarcan, además, residuos de aminoácidos no naturales que se incorporan, típicamente, mediante síntesis química de péptidos en lugar de síntesis en sistemas biológicos. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis por PCR (patente de los Estados Unidos núm. 4,683,195). Se puede generar genotecas de variantes por métodos muy conocidos, por ejemplo, mediante el uso de codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo, codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW), y el análisis de las genotcas en busca de variantes con propiedades deseadas, como se muestra en el Ejemplo 1. La Tabla 1c muestra sustituciones realizadas a tres antagonistas de anticuerpos del TLR3 raíz dentro de las regiones LCDR3 y HCDR2 para mejorar las propiedades de los anticuerpos.
En función de la delimitación de los sitios de unión al antígeno, los residuos de sitios de unión al antígeno de los anticuerpos de la invención y, posteriormente, los residuos de marco pueden variar ligeramente para cada cadena pesada y ligera.
TABLA 1b.
Las Tablas 2a y 2b muestran los residuos de sitios de unión al antígeno de anticuerpos ilustrativos de la invención delimitados de acuerdo con Kabat, Chothia e IMGT, y sus secuencias compuestas.
En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, y en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones variable de la cadena pesada (VH) y variable de la cadena ligera (VL) y, además, proporciona cada región variable de la cadena pesada y cadena ligera aisladas, como se muestra en la Tabla 3a. F17, F18 y F19 representan variantes de anticuerpos que comprenden secuencias consenso de aminoácidos para las familias 17, 18 y 19, respectivamente (ver Ejemplo 1).
TABLA 1c.
: * Consenso basado en mAb 10, 11, 12 Aunque las modalidades ilustradas en los Ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de una cadena pesada y una de una cadena ligera, un teenico con experiencia reconocerá que las modalidades alternativas pueden comprender regiones variables simples de la cadena pesada o ligera. La región variable simple se puede usar para rastrear una segunda región variable capaz de formar un fragmento de unión al antígeno específico y de dos dominios, capaz de, por ejemplo, unirse al TLR3. El análisis puede realizarse por métodos de análisis de exhibición de fagos mediante el uso de, por ejemplo, el enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en la publicación del PCT núm. W092/01047. En este enfoque, se usa una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L para infectar una genoteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno obtenido, específico y bicatenario, se selecciona de acuerdo con técnicas de exhibición de fagos tal como las descritas.
TABLA 2a En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con el TLR3; el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que tiene secuencias de aminoácidos al menos 95 % identicas a las secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 3a.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que tiene ciertas secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera como se muestra en la Tabla 3b.
Otro aspecto de la invención son polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención o su complemento. En la presente descripción se describen algunos polinucleótidos ilustrativos; sin embargo, otros polinucleótidos que, debido a la degeneración del código genético o a las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los antagonistas de anticuerpos de la invención, también están dentro del alcance de la invención.
TABLA 2b.
TABLA 3a.
Los antagonistas de anticuerpos ilustrativos pueden ser anticuerpos de los isotipos IgG, IgD, IgG, IgA o IgM. Además, esos antagonistas de anticuerpos pueden someterse a modificación postrad uccional mediante procesos tales como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente no natural, tal como la adición de porciones de polietilenglicol (PEG) (pegilación) y lipidación. Esos modificaciones pueden producirse in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden conjugar con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede realizarse mediante téenicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia. Se ha comprobado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica, a la vez que no interfiere con la función. (Deckert et al., Int. J. Cáncer 87:382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; Yang etal., Protein Eng. 16:761-770, 2003).
TABLA 3b.
Además, se podrían mejorar las propiedades farmacocineticas de los anticuerpos de la invención mediante modificaciones del Fe por téenicas conocidas por aquellos con experiencia en la materia. Por ejemplo, las cadenas pesadas del isotipo lgG4 contienen un mosaico Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) en la región de bisagra, capaz de formar enlaces disulfuro ínter o intracadena pesada, es decir, los dos residuos de Cys del mosaico CPSC pueden establecer enlaces disulfuro con los residuos correspondientes de Cys de la otra cadena pesada (Ínter), o los dos residuos de Cys de un mosaico CPSC dado pueden establecer enlaces disulfuro entre sí (intra). Se cree que las enzimas isomerasa in vivo son capaces de convertir enlaces intercadena pesada de moléculas del lgG4 a enlaces intracadena pesada y viceversa (Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19, 2002). Por consiguiente, dado que los pares de cadena pesada:ligera (H:L) en esas moléculas de lgG4 con enlaces intracadena pesada en la región de bisagra no están asociados covalentemente entre sí, pueden disociarse en monómeros H:L que después se vuelven a asociar con monómeros H:L derivados de otras moléculas del lgG4 para formar moléculas de lgG4 biespecíficas y heterodiméricas. En un anticuerpo biespecífico de IgG, los dos Fab de la molécula del anticuerpo difieren en los epitopos a los que se unen. La sustitución del residuo de Ser en el mosaico CPSC de la región de bisagra de lgG4 con Pro da como resultado “un comportamiento análogo a lgG1,” es decir, las moléculas forman enlaces disulfuro estables entre las cadenas pesadas y, por lo tanto, no son susceptibles al intercambio H:L con otras moléculas de lgG4. En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden un dominio Fe de lgG4 con una mutación S a P en el mosaico CPSC. La ubicación del mosaico CPSC se encuentra, típicamente, en el residuo 228 de una cadena pesada madura, pero puede cambiar en función de las longitudes de la CDR.
Además, en los anticuerpos de la invención, los sitios que afectan la unión a receptores del Fe, distintos de un receptor de salvamento FcRn, se pueden eliminar. Por ejemplo, en los anticuerpos de la invención, se pueden eliminar las regiones de unión al receptor del Fe involucradas en la actividad ADCC. Por ejemplo, la mutación de Leu234/Leu235 en la región de bisagra de lgG1 a L234A/L235A o Phe235/Leu236 en la región de bisagra de lgG4 a P235A/L236A minimiza la unión del FcR y reduce la capacidad de la inmunoglobulina para mediar la citotoxicidad dependiente de complemento y la ADCC. En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden un dominio Fe de lgG4 con mutaciones P235A/L236A. La ubicación de estos residuos identificados anteriormente es típica de una cadena pesada madura, pero puede cambiar en función de las longitudes de la CDR. Los anticuerpos ilustrativos con mutaciones P235A/L236A son anticuerpos que tienen las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada mostradas en la SEQ ID NO: 218, 219 o 220.
Las moleculas de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, completamente humanos, adaptados a humanos, humanizados y madurados por afinidad están dentro del alcance de la invención, al igual que las proteínas de fusión y las proteínas quiméricas. La afinidad del anticuerpo hacia un antígeno se puede mejorar por diseño racional o maduración aleatoria de la afinidad mediante el uso de métodos muy conocidos tales como mutagénesis dirigida o aleatoria, o el empleo de genotecas de exhibición de fagos. Por ejemplo, para modular la afinidad de un anticuerpo se puede efectuar sustituciones de los residuos de la zona de Vernier que, en su mayoría, se encuentran en la región marco o en los “residuos determinantes de la afinidad”, ADR (patente de los Estados Unidos núm.6,639,055; publicación del PCT núm. W010/045340).
Las moléculas de anticuerpo, o fragmentos de anticuerpo, completamente humanos, adaptados a humanos, humanizados y madurados por afinidad, modificados para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, afinidad, inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable están dentro del alcance de la invención. La estabilidad de un anticuerpo está influenciada por una serie de factores, que incluyen (1) empaquetamiento nuclear de dominios individuales que afecta su estabilidad intrínseca, (2) interacciones interfaciales proteína/proteína que tienen impacto en el apareamiento de HC y LC, (3) enterramiento de residuos polares y cargados, (4) red de enlaces de H para residuos polares y cargados, y (5) distribución superficial de residuos cargados y polares entre otras fuerzas intra e intermoleculares (Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001). Se puede identificar posibles residuos desestabilizadores de la estructura en base a la estructura cristalina del anticuerpo o por modelado molecular en ciertos casos, y se puede analizar el efecto de los residuos en la estabilidad del anticuerpo mediante la generación y evaluación de variantes que contienen mutaciones en los residuos identificados. Una de las maneras de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar la temperatura del punto medio de la transición termica (Tm) medida por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Generalmente, la Tm de proteínas está correlacionada con su estabilidad e inversamente correlacionada con su susceptibilidad al desplegamiento y la desnaturalización en solución, y con los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a desplegarse (Remmele et al., Biopharm., 13:36-46, 2000). Varios estudios han encontrado una correlación entre la clasificación de la estabilidad física de formulaciones medida como estabilidad térmica por DSC y la estabilidad física medida por otros métodos (Gupta et al., AAPS PharmSci. 5E8, 2003; Zhang et al., J. Pharm. Sci. 93:3076-3089, 2004; Maa etal., Int. J. Pharm., 140:155-168, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm. Res., 21:1353-1361, 2004; Remmele et al., Pharm. Res., 15:200-208, 1997). Los estudios de formulación sugieren que la Tm de un Fab tiene implicaciones en la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente. Las diferencias en aminoácidos en el marco o dentro de los sitios de unión al antígeno podrían tener efectos significativos en la estabilidad termica del dominio del Fab (Yasui, etal., FEBS Lett. 353:143-146, 1994).
Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden unirse al TLR3 con una Kd menor o igual que aproximadamente 107, 108, 109, 10 10, 1011 o 1012 M. La afinidad de una molécula dada para el TLR3, tal como un anticuerpo, se puede determinar experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado. Esos métodos pueden usar instrumentación Biacore o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por aquellos con experiencia en la materia.
Los antagonistas de anticuerpos que se unen a un homólogo dado del TLR3 con una afinidad deseada se pueden seleccionar de genotecas de variantes o fragmentos por téenicas que incluyen la maduración por afinidad de anticuerpos. Los antagonistas de anticuerpos pueden identificarse en base a su inhibición de la actividad biológica del TLR3 mediante el uso de cualquier método adecuado. Esos métodos pueden usar ensayos de gen reportero o ensayos que midan la producción de atocinas mediante el uso de métodos muy conocidos y como se describe en la solicitud.
Otra modalidad de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Esos vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para introducir, por cualquier medio, los polinucleótidos de la invención en un organismo o fondo genetico dado.
Otra modalidad de la invención es una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido; este comprende una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216, o una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 o 225.
Otra modalidad de la invención es una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido; este comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168, o una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 o 227. Esas células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células archea. Las células eucariotas ilustrativas pueden ser de mamífero, insecto, aves o de otros orígenes animales. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como líneas celulares de hibridomas o mieloma, tales como las lineas celulares murinas SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NSO (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC núm. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular ilustrativa de mieloma humano es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de celulas de ovario de hámster chino (CHO), tales como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
Otra modalidad de la invención es un método para fabricar un anticuerpo reactivo con el TLR3; el método comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para fabricar y purificar los anticuerpos son muy conocidos en la materia.
Otra modalidad de la invención es una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo de la invención.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido del receptor tipo toll 3 (TLR3) K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541 , S571, L595 y K619 de la SEQ ID NO: 2.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado, o un fragmento de este, en donde el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido del receptor tipo toll 3 S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141,V144,K145,T166,Q167,V168,S188, E189,D192,A195 yA219 de laSEQ ID NO:2.
Para determinar el epítopo de unión de los anticuerpos de la invención se puede emplear varias metodologías conocidas. Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de ambos componentes individuales, se puede efectuar el acoplamiento molecular proteína-proteína in silico para identificar sitios compatibles de interacción. Se puede efectuar el intercambio hidrógeno-deuterio (H/D) con el complejo antígeno y anticuerpo para mapear las regiones del antígeno que pueden estar unidas por el anticuerpo. Se puede usar mutagenesis de segmento y de punto del antígeno a fin de localizar aminoácidos importantes para la unión de anticuerpos. En el caso de las proteínas de gran tamaño, tales como el TLR3, el mapeado por mutagénesis de punto se simplifica cuando el sitio de unión se localiza primero a una región de la proteína, tal como por acoplamiento molecular, mutagénesis de segmento o intercambio H/D. Cuando se conocen las estructuras de ambos componentes individuales, se puede efectuar el acoplamiento molecular proteína-proteína in silico para identificar sitios compatibles de interacción. Para identificar los residuos que contribuyen al epítopo y el parátopo se puede usar la coestructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado, o fragmento de este, en donde el anticuerpo se une al TLR3 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, con los residuos Clothia de la región variable de la cadena pesada W33, F50, D52, D54, Y56, N58, P61 , E95, Y97, Y100 y D100b y con los residuos Clothia de la región variable de la cadena ligera Q27, Y32, N92, T93, L94 y S95. Los residuos Chothia del parátopo de la cadena pesada y el parátopo de la cadena ligera corresponden a los residuos de la cadena pesada W33, F50, D52, D55, Y57, N59, P62, E99, Y101, Y104 y D106 de la SEQ ID NO: 216, y los residuos de la cadena ligera Q27, Y32, N92, T93, L94 y S95 de la SEQ ID NO: 41.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado, o fragmento de este, en donde el anticuerpo se une al TLR3 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, con los residuos Clothia de la región variable de la cadena pesada N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, F99 y Y100, y con los residuos Clothia de la región variable de la cadena ligera G29, S30, Y31 , Y32, E50, D51 , Y91, D92 y D93. Los residuos Chothia del parátopo de la cadena pesada y el parátopo de la cadena ligera corresponden a los residuos de la cadena pesada N32, Q54, R56, S57, K58, Y60, Y104, P105, F106 y Y107 de la SEQ ID NO: 214, y los residuos de la cadena ligera G28, S29, Y30, Y31 , E49, D50, Y90, D91 y D92 de la SEQ ID NO:211.
Se puede fabricar anticuerpos aislados que tienen ciertos residuos de parátopo que se unen al TLR3, por ejemplo, por injerto de los residuos de parátopo en un supercóntigo adecuado, ensamble de los supercóntigos genéticamente manipulados en anticuerpos enteros, expresión de los anticuerpos obtenidos, y ensayo de los anticuerpos para unirse al TLR3 o para un efecto en la actividad biológica del TLR3. Los supercóntigos ilustrativos son secuencias de aminoácidos de regiones variables de anticuerpos humanos codificadas por genes de la línea germinal humana. Los supercóntigos se pueden seleccionar en base a, por ejemplo, homología de secuencia en general, % de identidad entre los residuos de parátopo, o identidad de clase de estructura canónica entre el supercóntigo y un anticuerpo ilustrativo, tal como el mAb 15EVQ o mAb 12QVQ/QSV. Los genes de la línea germinal de anticuerpos humanos se describen en, por ejemplo, Tomlinson et al., J. Mol. Biol 227:776-798 y en la base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http_:b_www_imgt_org). Además, se pueden usar regiones consenso de marco humano, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,300,064. La selección del supercóntigo adecuado se puede efectuar, por ejemplo, según los metodos descritos en la publicación del PCT núm. W010/045340.
Los genes ilustrativos de la línea germinal humana que se pueden usar como supercóntigos sobre los cuales se injertan los residuos de parátopo son los genes codificados por las estructuras Vk1, VA3, Vh5, Vh6, JK, JA y Jh. Para seleccionar secuencias de FR4 se usan regiones J de la línea germinale, ya sea en su totalidad o en parte. Por ejemplo, los residuos de parátopo de la cadena ligera del mAb 15EVQ pueden injertarse en un marco VK1 codificado por IGKV1 -39*01 que está unido directamente a la secuencia de la región J codificada por IGKJ1. Además, se puede usar secuencias de otros genes VK1 y se puede sustituir las secuencias de FR4 de otros genes JK en lugar de IGKJ1. Los residuos de parátopo de la cadena pesada del mAb 15EVQ pueden injertarse en un marco Vh5 codificado por IGHV5-51*01, seguido de aproximadamente 11-13 residuos, por ejemplo, 12 residuos, para constituir la HCDR3 y la secuencia de FR4 codificada por IGHJ1. Los 11-13 residuos abarcan entre el final de la región FR3 (“CAR”) y el comienzo de la región FR4 (WGQ para la mayoría de las regiones JH) y se compone de 4 residuos de parátopo definidos a partir del mAb 15EVQ Vh. Además, se puede usar secuencias de otros genes Vh5 y se puede sustituir las secuencias de FR4 de otros genes Jh en lugar de IGJH1. En otro ejemplo, los residuos de parátopo de la cadena ligera del mAb 12QVQ/QSV pueden injertarse en un marco VA3 codificado por IGLV3-1*01 que está unido directamente a la secuencia de la región J codificada por IGJL2. Además, se puede usar secuencias de otros genes VA3 y JA. La longitud de la LCDR3 se mantiene en aproximadamente 9-11 residuos, por ejemplo, 10 residuos. Estos aproximadamente 9-11 residuos abarcan entre el final de la región FR3 (“YYC” para la mayoría de los supercóntigos V lambda) y el comienzo de la región FR4 (“FGG” para la mayoría de las regiones JL) e incluyen 3 residuos de parátopo definidos a partir del mAb 12QVQ/QSV. Los residuos de parátopo de la cadena pesada del mAb 12QVQ/QSV pueden injertarse en un marco Vh6 codificado por IGHV6-1*01, seguido de aproximadamente 9-11 residuos, por ejemplo, 10 residuos, para constituir la HCDR3 y la secuencia de FR4 codificada por IGJH1. Los aproximadamente 9-11 residuos abarcan entre el final de la región FR3 (“CAR”) y el comienzo de la región FR4 (WGQ para la mayoría de las regiones JH) e incluyen 4 residuos de parátopo definidos a partir del mAb 12QVQ/QSV Vh. Puede sustituirse secuencias FR4 de otros genes Jh en lugar de IGHJ1. La unión al TLR3 y la actividad biológica del anticuerpo obtenido se pueden evaluar mediante el uso de metodos estándar. En las Figuras 30 a 33 se muestran alineaciones de regiones variables de la cadena pesada y regiones variables de la cadena ligera del mAb 15EVQ y mAb 12QVQ/QSV con los genes ilustrativos VK1 , Vh5, VA3, Vh6, JK, JA o Jh. Los anticuerpos genéticamente manipulados con parátopos injertados pueden modificarse aún más por sustituciones de los residuos de la zona de Vernier o los residuos determinantes de la afinidad para mejorar las propiedades de los anticuerpos, por ejemplo, afinidad, como se describió anteriormente. Siempre que el anticuerpo con parátopos injertados conserve la unión al TLR3, la secuencia de aminoácidos del marco en el anticuerpo con parátopos injertados puede ser 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a las secuencias de marco del mAb 15EVQ o 12QVQ/QSV.
Además de residuos de parátopo, puede injertarse secuencias provenientes de sitios de unión al antígeno mediante el uso de métodos estándar. Por ejemplo, puede injertarse una HCDR3 o LCDR3 completa.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado, o un fragmento de este, reactivo con el TLR3 que compite con un anticuerpo monoclonal por la unión del TLR3, en donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1 , 2 y 3 de la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 1 , 2 y 3 de la cadena ligera, las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena pesada (VH) o la secuencia de aminoácidos de ciertas regiones variables de la cadena ligera (VL). Los anticuerpos monoclonales ilustrativos de la invención son un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada, que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 216, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 41, y un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 214, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 211.
La competencia entre la unión al TLR3 se puede analizar in vitro mediante el uso de metodos muy conocidos. Por ejemplo, la unión al TLR3 del anticuerpo marcado con una cola Sulfo-Tag™ NHS-éster de MSD en presencia de un anticuerpo no marcado puede evaluarse por ELISA. Los anticuerpos ilustrativos de la invención son mAb 12, mAb 15 y mAb c1811 (ver Tabla 3a). Los anticuerpos anti-TLR3, descritos anteriormente, c1068 y sus derivados (descritos en la publicación del PCT núm. W006/060513A2), TLR3.7 (eBiosciences, núm. de cat. 14-9039) e Imgenex IMG-315A (Imgenex IMG-315A; generados contra aminoácidos del TLR3 humano, aminoácidos 55-70, VLNLTHNQLRRLPAAN) no compiten por la unión al TLR3 con los mAb 12, 15 o c1811, como se muestra en el Ejemplo 5.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3, en donde el anticuerpo tiene al menos una de las propiedades siguientes: a. se une al TLR3 humano con una Kd de <10 nM; b. reduce la actividad biológica del TLR3 humano en un ensayo de gen reportero in vitro para poli(l:C) NF-kB en >un 50 % a 1 mg/ml; c. inhibe en un >60 % la producción de IL-6 o CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli(l:C) a 10 pg/ml; d. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 o CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 ng/ml de poli(l:C) a 0.4 pg/ml; e. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml de poli(l:C) a 5 pg/ml; f. inhibe en un >50 % la producción de IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62.5 ng/ml de poli(l:C) a 1 pg/ml; g. inhibe en un >20 % la producción inducida por poli(l:C) de IFNg, IL-6 o IL-12 por células PBMC a 1 pg/ml. h. inhibe la actividad biológica del TLR3 cinomólogo en un ensayo de gen reportero in vitro para NF-kB con IC50 <10 pg/ml;< o i. inhibe la actividad biológica del TLR3 cinomólogo en un ensayo de gen reportero in vitro para ISRE con IC50 <5 pg/ml< Metodos de tratamiento Para modular el sistema inmune se puede usar antagonistas del TLR3 de la invención, por ejemplo, antagonistas de anticuerpos del TLR3. Aunque sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, los antagonistas de la invención pueden modular el sistema inmunológico mediante la prevención o reducción de la unión de ligandos al TLR3, la dimerización del TLR3, la internalización del TLR3 o el tráfico del TLR3. Los métodos de la invención pueden usarse para tratar un paciente animal perteneciente a cualquier clasificación. Los ejemplos de esos animales incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para antagonizar la actividad del TLR3 en el tratamiento de inflamaciones, enfermedades inflamatorias y metabólicas y, además, son útiles en la preparación de un medicamento para ese tratamiento, en donde el medicamento se prepara para la administración en dosis definidas en la presente descripción.
Generalmente, las afecciones inflamatorias, afecciones asociadas con infecciones o trastornos inflamatorios inmunomediados que pueden prevenirse o tratarse mediante la administración de antagonistas de anticuerpos del TLR3 de la invención incluyen los mediados por citocinas o quimocinas, así como las condiciones que resultan total o parcialmente de la activación del TLR3 o de la señalización a través de la vía del TLR3. Los ejemplos de esas afecciones incluyen afecciones Inflamatorias asociadas a la sepsis, enfermedades inflamatorias del intestino, trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios y afecciones asociadas a infecciones. Además, se cree que pueden prevenirse o tratarse cánceres, afecciones cardiovasculares y metabólicas, afecciones neurológicas y fibróticas mediante la administración de antagonistas de anticuerpos del TLR3 de la invención. La inflamación puede afectar a un tejido o ser sistémica. Los tejidos afectados ilustrativos son el tracto respiratorio, pulmón, tracto gastrointestinal, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto, sistema cardiovascular, tejido cardiaco, vasos sanguíneos, articulaciones, huesos y tejido sinovial, cartílago, epitelio, endotelio, tejido hepático o adiposo. Las afecciones inflamatorias sistémicas ilustrativas son tormenta de citocinas o hipercitocinemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS), síndrome de insuficiencia respiratoria aguda grave (SARS), síndrome antifosfolípido catastrófico, infecciones virales graves, influenza, neumonía, shock o sepsis.
La inflamación es una respuesta protectora de un organismo para defenderse de un agente invasor. La inflamación es un evento en cascada que involucra muchos mediadores celulares y humorales. Por un lado, la supresión de respuestas inflamatorias puede dejar un huésped inmunocomprometido; sin embargo, si no se controla, la inflamación puede conducir a complicaciones graves, que incluyen enfermedades inflamatorias crónicas {por ejemplo, asma, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino y similares), shock séptico y fallo multiorgánico. Es importante destacar que estos diversos estados patológicos comparten mediadores inflamatorios comunes, tales como citocinas, quimocinas, celulas inflamatorias y otros mediadores secretados por estas células.
La activación del TLR3 por sus ligandos poli(l:C), ARNbc o ARNm endógeno conduce a la activación de vías de señalización que originan la síntesis y secreción de citocinas proinflamatorias, la activación y el reclutamiento de células inflamatorias, tales como macrófagos, granulocitos, neutrófilos y eosinófilos, muerte celular y destrucción tisular. El TLR3 induce la secreción de IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, MIP-1, CXCL5/IP-10 y RANTES, y otras citocinas y quimocinas proinflamatorias involucradas en el reclutamiento y la activación de células inmunes, lo que contribuye, así, a la destrucción tisular en enfermedades autoinmunes y otras enfermedades inflamatorias. Durante la inflamación de células necróticas se libera ARNm, el ligando endógeno del TLR3, y puede originar un ciclo de realimentación positiva para activar el TLR3 y perpetuar la inflamación y el daño tisular adicional. Los antagonistas del TLR3, tales como antagonistas de anticuerpos del TLR3, pueden normalizar la secreción de citocinas, reducir el reclutamiento de células inflamatorias y reducir el daño tisular y la muerte celular. Por lo tanto, los antagonistas del TLR3 tienen potencial terapéutico para tratar la inflamación y un espectro de afecciones inflamatorias.
Un ejemplo de una afección inflamatoria es la afección asociada a la sepsis, que puede incluir el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), choque séptico o síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS). El ARNbc liberado por infección viral, bacteriana, micótica o parasitaria y por células necróticas puede contribuir a la aparición de la sepsis. Aunque sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que el tratamiento con antagonistas del TLR3 puede proporcionar un beneficio terapeutico al prolongar los tiempos de supervivencia en pacientes que sufren de afecciones inflamatorias asociadas a la sepsis, o impedir la propagación de un evento inflamatorio local (por ejemplo, en el pulmón) para convertirse en una afección sistémica por medio de potenciar la actividad antimicrobiana innata, demostrar actividad sinérgica cuando se combina con agentes antimicrobianos, minimizar el estado inflamatorio local que contribuye a la patología, o cualquier combinación de lo anterior. Esa intervención puede ser suficiente para permitir el tratamiento adicional ( por ejemplo, tratamiento de infecciones subyacentes o reducción de los niveles de citocinas) necesario para asegurar la supervivencia del paciente. La sepsis puede modelarse en animales, tales como ratones, por administración de D-galactosamina y poli(l:C). En esos modelos, la D-galactosamina es una hepatotoxina que funciona como sensibilizador de la sepsis, y el poli(l:C) es una molécula inductora de la sepsis que imita el ARNbc y activa el TLR3. En un modelo murino de sepsis, el tratamiento con antagonistas del TLR3 puede aumentar las tasas de supervivencia de los animales y, por lo tanto, los antagonistas del TLR3 pueden ser útiles en el tratamiento de la sepsis.
La inflamación gastrointestinal es la inflamación de una capa de la mucosa del tracto gastrointestinal, y abarca afecciones inflamatorias agudas y crónicas. La inflamación aguda se caracteriza, generalmente, por un tiempo de inicio corto y la infiltración o afluencia de neutrófilos. La inflamación crónica se caracteriza, generalmente, por un período de inicio relativamente más largo y la infiltración o afluencia de celulas mononucleares. La capa de la mucosa puede ser la mucosa del intestino (que incluye el intestino delgado y el intestino grueso), el recto, el revestimiento del estómago (gástrico) o la cavidad bucal. Las afecciones inflamatorias gastrointestinales crónicas ilustrativas son la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) inducida por agresiones ambientales ( por ejemplo , inflamación gastrointestinal (por ejemplo, colitis) provocada por o asociada con ( por ejemplo, como efecto secundario) un régimen terapéutico, tal como la administración de quimioterapia, terapia de radiación y similares), colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis colágena o linfocítica, enterocolitis necrotizante, colitis en afecciones tales como enfermedad granulomatosa crónica o enfermedad celíaca, alergias a alimentos, gastritis, gastritis infecciosa o enterocolitis ( por ejemplo, gastritis crónica activa infectada por Helicobacter pylori) y otras formas de inflamación gastrointestinal provocada por un agente infeccioso.
La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) incluye un grupo de trastornos inflamatorios crónicos de etiología generalmente desconocida, por ejemplo, colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD). La evidencia clínica y experimental sugiere que la patogénesis de la IBD es multifactorial e involucra genes de susceptibilidad y factores ambientales. En la enfermedad inflamatoria del intestino, el daño tisular proviene de una respuesta inmune inadecuada o exagerada a los antígenos de la microflora intestinal. Existen varios modelos animales de enfermedades inflamatorias del intestino. Algunos de los modelos más usados son el modelo de colitis inducida por el ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico/etanol (TNBS) o el modelo de oxazalona, que induce la inflamación crónica y ulceración del colon (Neurath etai, Intern. Rev. Immunol 19:51-62, 2000). Otro modelo usa dextransulfato sódico (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea sanguinolenta, perdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza, histológicamente, por infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de criptas y ulceración epitelial (Hendrickson et al., Clinical Microbiology Reviews 15:79-94, 2002). Otro modelo involucra la transferencia adoptiva de células T CD4 CD45RBhigh vírgenes a ratones RAG o SCID. En este modelo, las células T vírgenes del donante atacan el intestino receptor y provocan inflamación intestinal crónica y síntomas similares a enfermedades inflamatorias intestinales humanas (Read and Powrie, Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 15 unidad 15.13, 2001). Se puede usar la administración de antagonistas de la presente invención en cualquiera de estos modelos a fin de evaluar la eficacia potencial de esos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de enfermedades asociadas con la inflamación intestinal, tales como la enfermedad inflamatoria del intestino. Se dispone de varias opciones de tratamiento para la IBD; por ejemplo, para tratar la enfermedad de Crohn se han usado terapias con anticuerpos anti-TNF-a durante una década (Van Assche et al., Eur. J. Pharmacol. Epub Oct 2009). Sin embargo, un porcentaje significativo de pacientes son refractarios a los tratamientos actuales (Hanauer et al., Lancet 359:1541-1549, 2002; Hanauer et al., Gastroenterology 130:323-333, 2006) y, por lo tanto, se necesitan nuevas terapias dirigidas a poblaciones de pacientes refractarios.
Otro ejemplo de afección inflamatoria es una afección pulmonar inflamatoria. Las afecciones pulmonares inflamatorias ilustrativas incluyen afecciones pulmonares inducidas por infecciones, que incluyen las asociadas con infecciones virales, bacterianas, micóticas, parasitarias o por priones; afecciones pulmonares inducidas por alergenos; afecciones pulmonares inducidas por contaminantes, tales como asbestosis, silicosis o beriliosis; afecciones pulmonares inducidas por aspiración gástrica, desregulación inmune, afecciones inflamatorias con predisposición genética, tales como fibrosis quística, y afecciones físicas pulmonares inducidas por traumatismo, tales como las lesiones por ventilador. Estas afecciones inflamatorias incluyen, además, asma, enfisema, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), sarcoidosis, histiocitosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía nosocomial, neumonía asociada al ventilador, sepsis, neumonía viral, infección por influenza, infección por parainfluenza, infección por rotavirus, infección por metapneumovirus humano, infección por virus sincitial respiratorio y aspergillus u otras infecciones micóticas. Las enfermedades inflamatorias ilustrativas asociadas a infecciones pueden incluir neumonía viral o bacteriana, como neumonía grave, fibrosis quística, bronquitis, exacerbaciones de las vías respiratorias y síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS). Esas afecciones asociadas con infecciones pueden involucrar infecciones múltiples tales como una infección viral primaria y una infección bacteriana secundaria.
El asma es una enfermedad inflamatoria de los pulmones que se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias (“AHR”), broncoconstricción, sibilancias, inflamación eosinofílica o neutrofílica, hipersecreción de moco, fibrosis subepitelial y niveles elevados de IgE. Los pacientes con asma experimentan “exacerbaciones”, un empeoramiento de los síntomas, debido, comúnmente, a infecciones microbianas del tracto respiratorio ( por ejemplo, rinovirus, virus de la influenza, Haemophilus influenza, etc.). Los ataques asmáticos pueden estar provocados por factores ambientales ( por ejemplo, áscaris, insectos, animales ( por ejemplo, gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsters, cobayos y aves), hongos, contaminantes del aire ( por ejemplo, humo del tabaco), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, sustancias químicas, polen, ejercicio o aire frío. Además del asma, varias enfermedades inflamatorias crónicas que afectan el pulmón se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, por ejemplo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), neumonía bacteriana y fibrosis quística (Linden et al., Eur. Respir. J. 15:973-977, 2000; Rahman et al., Clin. Immunol. 115:268-276, 2005), y enfermedades tales como COPD, rinitis alérgica y fibrosis quística se caracterizan por la hiperreactividad de las vías respiratorias (Fahy and O’Byrne, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:822-823, 2001). Los modelos animales más usados para el asma y la inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de exposición a ovoalbúmina y los modelos de sensibilización a metacolina (Hessel et al., Eur. J. Pharmacol. 293:401-412, 1995). La inhibición de la producción de citocinas y quimocina a partir de celulas humanas cultivadas, tales como células bronquiales epiteliales, fibroblastos bronquiales o células de músculo liso de las vías respiratorias se puede usar, además, como modelo in vitro. Se puede usar la administración de antagonistas de la presente invención a cualquiera de estos modelos, a fin de evaluar el uso de esos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso del asma, la inflamación de las vías respiratorias, la COPD y similares.
Otras afecciones y neuropatías inflamatorias, que pueden prevenirse o tratarse mediante los procedimientos de la invención son las provocadas por enfermedades autoinmunes. Estas afecciones y neuropatías incluyen esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y trastornos neurodegenerativos y del sistema nervioso central (CNS), que incluyen la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, trastorno bipolar y esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedades del hígado que incluyen cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedad/esteatohepatitis del hígado graso no alcohólico, fibrosis, virus de la hepatitis C (HCV) y la hepatitis B (HBV), diabetes y resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares que incluyen aterosclerosis, hemorragia cerebral, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica y artritis reumatoide juvenil (JRA), osteoporosis, osteoartritis, pancreatitis, fibrosis, encefalitis, psoriasis, arteritis de celulas gigantes, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), afecciones inflamatorias cutánea, trasplantes, cáncer, alergias, enfermedades endocrinas, reparación de heridas, otros trastornos autoinmunes, hiperreactividad de las vías respiratorias e infecciones o trastornos mediados por células, virus o priones.
Las artritis, que incluyen osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesiones y similares, son afecciones inflamatorias comunes que se beneficiarían del uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias, tales como los antagonistas de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica que afecta todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Debido a que la artritis reumatoide provoca daño tisular, los ligandos del TLR3 podrían estar presentes en el sitio de la inflamación. La activación de la señalización del TLR3 puede perpetuar la inflamación y el daño tisular adicional en la articulación inflamada. En la materia se conocen varios modelos animales para la artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se asemeja considerablemente a la artritis reumatoide humana. Se puede usar la administración de los antagonistas del TLR3 de la presente invención a los ratones del modelo CIA, a fin de evaluar el uso de estos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de las enfermedades.
Diabetes mellitus, diabetes, se refiere a un proceso patológico derivado de múltiples factores causales y caracterizado por hiperglucemia (LeRoith et al., (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. U.S.A. 1996) y todas las referencias allí citadas. La hiperglucemia no controlada está asociada con un incremento y una prematuridad de la mortalidad, debido a un mayor riesgo de enfermedades microvasculares y macrovasculares, que incluyen nefropatía, neuropatía, retinopatía, hipertensión, enfermedad cerebrovascular y enfermedad cardiaca coronaria. Por lo tanto, el control de la homeostasis de la glucosa es un enfoque sumamente importante para el tratamiento de la diabetes.
Los defectos subyacentes conducen a la clasificación de la diabetes en dos grandes grupos: diabetes tipo I (diabetes mellitus dependiente de insulina, IDDM), que se presenta cuando los pacientes carecen de celulas beta productoras de insulina en sus glándulas pancreáticas, y la diabetes tipo 2 (diabetes mellitus no dependiente de insulina, NIDDM), que se produce en pacientes con secreción insuficiente de células beta y/o resistencia a la acción de la insulina.
La diabetes tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina acompañada de una deficiencia relativa, en lugar de absoluta, de insulina. En los individuos resistentes a la insulina, el cuerpo secreta cantidades anormalmente elevadas de insulina para compensar este defecto. Cuando existen cantidades insuficientes de insulina para compensar la resistencia a la insulina y controlar adecuadamente la glucosa, se desarrolla un estado de intolerancia a la glucosa. En un número significativo de individuos, la secreción de insulina disminuye aún más y el nivel de glucosa plasmática aumenta, lo que da como resultado el estado clínico de diabetes. La inflamación asociada con la adiposidad ha estado fuertemente implicada en el desarrollo de la resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, dislipidemia y enfermedad cardiovascular. El tejido adiposo de obesos recluta y retiene macrófagos y puede producir un exceso de citocinas proinflamatorias que incluyen TNF-a e IL-6, ácidos grasos libres y adipoquinas, que pueden interferir con la señalización de la insulina e inducir resistencia a la insulina. La activación del TLR3 en macrófagos puede contribuir al estado proinflamatorio del tejido adiposo. Se conocen varios modelos animales de resistencia a la insulina. Por ejemplo, en un modelo de obesidad inducida por la dieta (DIO) los animales desarrollan hiperglucemia y resistencia a la insulina acompañadas de un aumento de peso. Se puede usar la administración de antagonistas del TLR3 de la presente invención al modelo DIO a fin de evaluar el uso de los antagonistas para mejorar las complicaciones asociadas con la diabetes tipo 2 y alterar el curso de la enfermedad.
La enfermedad del hígado graso abarca un espectro de afecciones hepáticas y se clasifica, típicamente, como alcohólica o no alcohólica. En cualquiera de los casos, la enfermedad del hígado graso varía de la esteatosis hepática simple (acumulación y deposición de lípidos) a la esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica (ASH o NASH) que, frecuentemente, progresa a fibrosis hepática, cirrosis y, probablemente, carcinoma hepatocelular. La enfermedad del hígado graso alcohólico (AFLD) y no alcohólico (NAFLD) son histológicamente indistinguibles; sin embargo, por definición, la NAFLD se desarrolla en pacientes que consumen poco o nada de alcohol. En cambio, la NAFLD se encuentra, frecuentemente, en individuos con obesidad, síndrome metabólico y diabetes tipo 2, y está estrechamente ligada con la resistencia a la insulina (Utzschneider et al., J Clin Endocrinol Metab 91:4753-4761, 2006). Con el drástico aumento reciente de la prevalencia a la obesidad y la resistencia a la insulina, la NAFLD ha superado a la AFLD y a la enfermedad hepática inducida por hepatitis viral como la enfermedad hepática crónica más común. Se ha calculado que aproximadamente el 75 % de las personas con obesidad tienen NAFLD y un 20 % puede tener NASH (Clark, J Clin Gastroenterol 40(Suppl 1):S5-S10, 2006; Lazo et al., Semin Liver Dis 28:339-350, 2008).
La enfermedad coronaria aterosclerótica (CHD) representa la principal causa de muerte y morbilidad cardiovascular en el mundo occidental. Los factores de riesgo para la enfermedad coronaria aterosclerótica incluyen hipertensión, diabetes mellitus, antecedentes familiares, genero masculino, humo del cigarrillo, alto colesterol en suero, niveles de colesterol altos en lipoproteína de baja densidad (LDL) y niveles de colesterol bajos en lipoproteína de alta densidad (HDL). Generalmente, un nivel de colesterol total por encima de aproximadamente 225-250 mg/dl está asociado con una elevación significativa del riesgo de CHD. Diversos estudios clínicos han demostrado que los niveles elevados de colesterol total o colesterol LDL promueven la aterosclerosis humana. Las investigaciones epidemiológicas han establecido que la morbilidad y mortalidad cardiovasculares varían directamente con el nivel de colesterol total y colesterol LDL.
Los cánceres ilustrativos pueden incluir al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluyen, pero no se limitan a, leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de células B o células T, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CM), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células capilares, síndrome mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, carcinoma de células renales, cáncer de mama, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de neoplasia maligna, tumores sólidos, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, sarcomas, melanoma maligno, melanoma particularmente metastásico, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con cáncer y dolor óseo relacionado con cáncer.
Las enfermedades cardiovasculares ilustrativas pueden incluir síndrome de aturdimiento cardiaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, hemorragia, arteriosclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad diabética aterosclerótica, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, shock, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía pulmonar, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardíacas, latidos ectópicos auriculares, aleteo auricular, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), síndrome posperfusión, respuesta a la inflamación por derivación coronaria cardiopulmonar, taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia regular de QRS estrecho, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias del haz de His, bloqueo auriculoventricular, bloqueo de rama, trastornos isquemicos del miocardio, enfermedad arterial coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatía, cardiomiopatía congestiva dilatada, miocardiopatía restrictiva, cardiopatías valvulares, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardíacos, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad aterosclerótica periférica, tromboangitis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno y enfermedad de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, várices, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, lesión del síndrome isquemia y reperfusión.
Las enfermedades neurológicas ilustrativas pueden incluir enfermedad neurológica en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, migraña, complejo de demencia del SIDA, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios básales o trastornos cerebelosos; trastornos del movimiento hipercinético tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del CNS; trastornos hipocinéticos del movimiento, tales como la enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno multisistémico mitocondrial); trastornos principales desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración de células del cuerno anterior, tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down de la mediana edad; enfermedad difusa por cuerpos de Lewy; demencia senil del tipo cuerpos de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz y demencia pugilística.
Las afecciones fibróticas ilustrativas pueden incluir fibrosis hepática (que incluye, pero no se limita a, cirrosis inducida por alcohol, cirrosis inducida por virus, hepatitis autoinmunoinducida); fibrosis pulmonar (que incluye, pero no se limita a, esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática); fibrosis renal (que incluye, pero no se limita a, esclerodermia, nefritis diabética, nefritis glomerular, nefritis por lupus); fibrosis dérmica (que incluye, pero no se limita a, esclerodermia, cicatrización hipertrófica y queloide, quemaduras); mielofibrosis; neurofibromatosis; fibroma; fibrosis intestinal; y adherencias fibróticas que provienen de procedimientos quirúrgicos. En ese método, la fibrosis puede ser fibrosis específica de órgano o fibrosis sistémica. La fibrosis específica de órgano puede asociarse con al menos uno de fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis cardíaca, fibrosis vascular, fibrosis cutánea, fibrosis ocular, fibrosis de la médula ósea u otro tipo de fibrosis. La fibrosis pulmonar puede asociarse con al menos uno de fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, asma, sarcoidosis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La fibrosis hepática puede asociarse con al menos uno de cirrosis, esquistomasomiasis o colangitis. La cirrosis se puede seleccionar de cirrosis alcohólica, cirrosis poshepatitis C, cirrosis biliar primaria. La colangitis es colangitis esclerosante. La fibrosis renal puede asociarse con nefropatía diabética o glomerulosclerosis por lupus. La fibrosis cardiaca puede asociarse con infarto de miocardio. La fibrosis vascular puede asociarse con restenosis arterial postangioplastia o aterosclerosis. La fibrosis cutánea puede asociarse con cicatrices de quemaduras, cicatrices hipertróficas, queloides o dermatopatía fibrosante nefrogénica. La fibrosis ocular puede asociarse con fibrosis retrorbital, cirugía poscatarata o vitreorretinopatía proliferativa. La fibrosis de médula ósea puede asociarse con mielofibrosis idiopática o mielofibrosis inducida por fármacos. Las demás fibrosis pueden seleccionarse de la enfermedad de Pcyronie, contractura de Dupuytren o dermatomiositis. La fibrosis sistémica puede ser esclerosis sistémica o enfermedad de injerto contra huésped.
Composiciones farmacéuticas/administración La “cantidad terapéuticamente eficaz” del agente eficaz en el tratamiento o la prevención de afecciones en las que es deseable la supresión de la actividad del TLR3 se puede determinar por téenicas estándar de investigación. Por ejemplo, la dosis del agente que es eficaz en el tratamiento o la prevención de afecciones inflamatorias tales como asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o artritis reumatoide puede determinarse por administración del agente a modelos animales correspondientes, tales como los modelos descritos en la presente descripción.
Además, para ayudar a identificar los intervalos óptimos de dosificación puede emplearse, opcionalmente, ensayos in vitro. Aquellos con experiencia en la materia pueden determinar la selección de una dosis eficaz en particular (por ejemplo, a través de ensayos clínicos) en base a la consideración de varios factores. Esos factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas involucrados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el técnico con experiencia. La dosis precisa a emplear en la formulación depende, además, de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o en modelos animales.
En los metodos de la invención, el antagonista del TLR3 se puede administrar individualmente o en conjunto con al menos otra molécula. Esas moléculas adicionales pueden ser otras moléculas antagonistas del TLR3 o moléculas con un beneficio terapéutico no mediado por la señalización del receptor TLR3. Los antibióticos, antivirales, paliativos y otros compuestos que reducen los niveles o la actividad de citocinas son ejemplos de esas moléculas adicionales.
El modo de administración para el uso terapéutico del agente de la invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped. Las composiciones farmacéuticas de estos agentes son particularmente útiles para la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o intranasal.
El agente de la invención se puede preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del agente como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Esos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, que incluyen los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar 0.4 % de solución salina y 0.3 % de glicina. Estas soluciones son estériles y, generalmente, libres de materia particulada. Se pueden esterilizar mediante teenicas de esterilización convencionales y muy conocidas {por ejemplo, filtración). Según la necesidad, las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y reguladores, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración del agente de la invención en esa formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos que aproximadamente 0.5 %, normalmente, igual o al menos aproximadamente 1 % hasta 15 o 20 % en peso, y se selecciona, principalmente, en base a la dosis requerida, volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración que se haya seleccionado.
Por lo tanto, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 mi de agua amortiguada estéril, y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o, con mayor preferencia, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo antagonista del TLR3 de la invención. Además, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa que contenga aproximadamente 250 mi de solución estéril de Ringer, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y, preferentemente, 5 mg a aproximadamente 25 mg de un antagonista de la invención. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son muy conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes del uso. Esta teenica ha demostrado su eficacia con inmunoglobulinas convencionales y preparaciones de proteína, y puede emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la materia.
La presente invención será descrita con referencia a los siguientes ejemplos específicos, no limitantes.
EJEMPLO 1 Identificación y derivación de mAb antagonistas del anti-huTLR3 Se usó la genoteca de exhibición de fagos MorphoSys Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®) Gold (Morphosys AG, Martinsried, Alemania) como fuente de fragmentos de anticuerpos humanos y se sometió a rondas de selección (“panning”) contra un antígeno purificado del TLR3 generado de la expresión de los aminoácidos 1-703 del TLR3 humano (huTLR3) (SEQ ID NO: 4) con una etiqueta de poli-histidinas en el C-terminal y se purificó por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado. Los aminoácidos 1 a 703 corresponden al dominio extracelular (ECD) predicho del huTLR3. Los fragmentos Fab (Fab) que se unieron específicamente al ECD huTRL3 se seleccionaron por medio de presentar la proteína TLR3 de diversas maneras, de modo que un conjunto diverso de fragmentos de anticuerpos se pudiera identificar, secuenciar y confirmar como exclusivo. Mediante distintas estrategias de rondas de selección, se identificaron 62 candidatos (distintas secuencias de la región V) como ligandos exclusivos del ECD huTLR3.
Los 62 candidatos identificados como ligandos del ECD hTLR3 se rastrearon para evaluar la actividad neutralizante en una variedad de ensayos basados en celulas correspondientes para identificar la actividad antiinflamatoria. Con el uso de datos preliminares de actividad (ver Ejemplo 2 más abajo), cuatro candidatos de los 62 (Fab 16-19) que definen las familias 16-19 se seleccionaron como raíz para la maduración de la CDR2 de la cadena pesada (HCDR2) y la CDR3 de la cadena ligera (LCDR3). Uno de los candidatos raíz (el candidato 19) exhibió un sitio de glicosilación ligado al N en la HCDR2; para eliminar el sitio, se efectuó una mutación Ser a Ala (S a A) en este candidato. Después de la maduración de la CDR de los cuatro candidatos raíz, se identificó un total de 15 candidatos de la progenie (candidatos 1-15) para una caracterización adicional, como se describe en el Ejemplo 2. En la Tabla 3 se muestra una lista de las regiones variables de la cadena ligera y pesada presentes en cada uno de los 19 candidatos. En la presente descripción, los candidatos se denominan mAb 1-19 o Fab 1-19, en función de si eran Fab o clonados como cadenas de anticuerpo en toda su extensión (Ejemplo 3). Debido al diseño del vector de expresión, los extremos amino maduros de las regiones variables de todos los candidatos fueron QVE para la cadena pesada y DI para la cadena ligera. Las secuencias preferidas en estos extremos son aquellas en los respectivos genes de la línea germinal que tienen alta identidad con las secuencias de los candidatos. En las familias 17 y 18 las secuencias de la línea germinal son QVQ para VH y SY para VL. En la familia 19, las secuencias son EVQ para VH y DI para VL. La secuencia SY es exclusiva del subgrupo lambda 3 y existen informes de heterogeneidad cuando el residuo amino terminal es S o Y. Por lo tanto, en el caso de la VL de las familias 17 y 18, el termino consenso QSV del subgrupo prominente lambda 1 se consideró un sustituto más adecuado para DIE. Estos cambios se introdujeron en los candidatos 9, 10 y 12 de la familia 18, y en los candidatos 14 y 15 de la familia 19. En este proceso se efectuó la optimización de codones de las regiones de VH y VL de estos anticuerpos. Las secuencias de aminoácidos de las variantes N-terminal en la línea germinal de la región variable de la cadena ligera de los candidatos 9, 10 y 11 se muestran en la SEQ ID NO: 209-211, y las secuencias de aminoácidos de variantes N-terminal en la línea germinal de la región variable de la cadena pesada de los candidatos 9, 10, 12, 14, y 15 se muestran en la SEQ ID NO: 212-216, respectivamente. En la presente descripción, las variantes N-terminal de los candidatos se denomina candidato/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14 EVQ o 15EVQ. Las variantes N-terminal en la línea germinal se expresaron como mAb y, en comparación con sus homólogos raíz, no mostraron ningún efecto en la unión al TLR3 o en su capacidad para inhibir la actividad biológica del TLR3 (datos no mostrados).
EJEMPLO 2 Determinación de la actividad de antagonistas del TLR3 in vitro Los 15 candidatos con CDR madurada descritos anteriormente se seleccionaron como terapeuticos humanos potenciales y se determinó una variedad de actividades de unión y neutralización. Los ensayos y resultados de la actividad de los cuatro Fab raíz, Fabs 16-19, y los 15 Fab con CDR madurada, Fab 1-15, o sus variantes de la región V de la línea no germinal, se describen más abajo.
Inhibición de la cascada de señalización de NF-kB e ISRE Se cultivaron células 293T en medios DMEM y GlutaMax (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementados con FBS inactivado por calor y se transfectaron con 30 ng de plásmidos reporteros de luciferasa de luciérnaga con pNF-kB o ISRE, 13.5 ng del vector pcDNA3.1, 5 ng de phRL-TK y 1.5 ng de pCDNA que codifica FL TLR3 (SEQ ID NO: 2). El plásmido phRL-TK contiene el gen de luciferasa de Renilla impulsado por el promotor de timidina quinasa HSV-1 (Promega, Madion, Wl). Los anticuerpos del TLR3 se incubaron 30-60 min antes de la adición de poli(l:C) (GE Flealthcare, Piscataway, NJ). Las placas se incubaron 6 h o 24 h a 37 °C antes de la adición del reactivo de luciferasa Dual-Glo y las placas se lcyeron en un lector de placas FLUOstar. Se obtuvieron valores normalizados (relaciones de luciferasa) por medio de dividir las RLU de luciernaga por las RLU de Renilla. Tras la estimulación con el agonista del TLR3 poli(l:C) (1 mg/ml), la producción de luciferasa de luciérnaga estimulada por la cascada de señalización del NF-kB O ISRE se inhibo específicamente por incubación de las células con anticuerpos anti-TLR3 (0.4, 2.0 y 10 pg/ml) antes de la estimulación. En la Figura 1 se muestran los resultados de los ensayos para NF-kB y se expresan como % de inhibición de la relación luciérnaga/Renilla con 5465 como control positivo (Mab neutralizante del anti-TLR3 humano), y un mAb anti-factor tisular humano (859) como control de ¡sotipo para lgG4 humana. Se logró >un 50 % de inhibición con concentraciones de mAb de 0.4-10 pg/ml. El c1068 y TLR3.7 inhibieron aproximadamente el 38 % y el 8 % de la actividad biológica del TLR3 a 10 pg/ml. En el ensayo de gen reportero para ISRE se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados).
Liberación de citocinas en células BEAS-2B Se sembraron células BEAS-2B (línea celular normal del epitelio bronquial humano transformada con SV-40) en platos recubiertos con colágeno tipo I y se incubaron con o sin anticuerpos anti-TLR3 humano antes de la adición de poli(l:C). Veinticuatro horas después de los tratamientos, se recolectaron los sobrenadantes y se analizaron para evaluar los niveles de citocinas y quimocinas mediante el uso de un ensayo multiplex de microesferas diseñado a medida para la detección de IL-6, IL-8, CCL-2/MCP-1 , CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10. Los resultados se muestran en las tablas A y B como % de inhibición de la relación inidividual citocinas/quimioquinas después del tratamiento con mAb a 0.4, 2.0 y 10 mg/ml. 5465 es un control positivo; 859 es un control de isotipo.
Las siguientes tablas A y B muestran el efecto (% de inhibición) o mAb anti-huTLR3 en un ensayo en BEAS-2B.
TABLA A TABLA B Liberación de citocinas en celulas NHBE La liberación de citocinas se analizó, además, en células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) (Lonza, Walkersville, MD). Las células NHBE se expandieron y transfirieron a platos recubiertos con colágeno y se incubaron durante 48 horas, después de lo cual el medio se retiró y se repuso con 0.2 mi de medio fresco. Después, las células se incubaron con o sin mAb anti-TLR3 humano 60 minutos antes de la adición de poli(l:C). Los sobrenadantes se recolectaron después de 24 horas y se almacenaron a -20 °C se analizaron inmediatamente para evaluar los niveles de IL-6. Los resultados se grafican en las Figuras 2A y 2B como % de inhibición de la secreción de IL-6 después del tratamiento con mAb mediante el uso de una dosis entre 0.001 y 50 mg/ml. 5465 es un control positivo, 859 es un control de isotipo. La mayoría de los mAb inhibieron al menos el 50 % de la producción de IL-6 a <1 pg/ml y lograron una inhibición de 75 % a <5 pg/ml.
Liberación de citocinas en células PBMC La liberación de citocinas se analizó, además, en células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC). Se recolectó sangre entera de donantes humanos en tubos de recolección de heparina, en los cuales se depositó lentamente una solución de Ficoll-Paque Plus. Los tubos se centrifugaron y las PBMC, que formaban una capa blanca justo por encima de la solución de Ficoll, se recuperaron y se sembraron. Las PBMC se incubaron con o sin mAb anti-TLR3 humano antes de la adición de 25 pg/ml de poli(l:C). Despues de 24 horas, los sobrenadantes se recolectaron y los niveles de citocinas se determinaron mediante el uso de teenología Luminex. Los resultados se grafican en la Figura 3 como porcentaje acumulativo de inhibición de IFN-g, IL-12 e IL-6 mediante el uso de una dosis única de mAb (0.4 mg/ml); 5465 es un control positivo; hlgG4 es un control de isotipo.
Liberación de citocinas en células HASM Brevemente, se incubaron células humanas del músculo liso de vías respiratorias (HASM) con o sin mAb anti-TLR3 humano antes de la adición de una combinación sinérgica de 500 ng/ml de poli(l:C) y 10 ng/ml de TNF-a. Después de 24 horas, los sobrenadantes se recolectaron y los niveles de citocinas se determinaron mediante el uso de tecnología Luminex. Los resultados se grafican en las Figuras 4A y 4B como niveles de quimocina CCL5/RANTES mediante el uso de tres dosis de mAb (0.4, 2 y 10 pg/ml). 5465 es un control positivo; hlgG4 es un control de isotipo.
Los resultados de los ensayos in vitro en células humanas confirman la capacidad de los anticuerpos de la invención para reducir la liberación de citocinas y quimocinas como resultado de la unión al huTLR3.
EJEMPLO 3 Constructos de anticuerpos en toda su extensión Las cadenas pesadas de los cuatro Fab raíz (candidatos núms. 16-19) y 15 Fab de la progenie (candidatos núms. 1-15) se clonaron en un fondo de lgG4 humana con una mutación S229P Fe. Los candidatos 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ se clonaron en un fondo de lgG4 humana con mutaciones F235A/L236A y S229P Fe.
Las secuencias maduras de aminoácidos de la cadena pesada en toda su extensión se muestran en las SEQ ID NO: 90-102 y 218-220 de la manera siguiente: Candidato SEQ IDNO: 16 90 17 91 18 92 19 93 1 94 2 95 3 96 4 97 5, 6, 7 98 8 99 9 100 10, 11, 12 101 13, 14, 15 102 9EVQ 218 10EVQ,12EVQ 219 14EVQ,15EVQ 220 Para la expresión, estas secuencias de cadena pesada pueden incluir una secuencia líder N-terminal, tal como MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 103). Las secuencias de nucleótidos ilustrativas que codifican la cadena pesada de los candidatos 14EVQ y 15EVQ con una secuencia líder y la forma madura (sin secuencia líder) se muestran en la SEQ ID NO: 104 y 105, respectivamente. Además, para la expresión, las secuencias de cadena ligera de los anticuerpos de la invención pueden incluir una secuencia líder N-terminal, tal como MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 106). Las secuencias de nucleótidos ilustrativas que codifican la cadena ligera del candidato 15 de codón optimizado con una secuencia líder y la forma madura (sin secuencia líder) se muestran en la SEQ ID NO: 107 y 108, respectivamente.
EJEMPLO 4 Caracterización de la unión de los mAb anti-TLR3 Los valores de EC50 para la unión de los mAb al dominio extracelular (ECD) del TLR3 humano se determinaron por ELISA. La proteína ECD TLR3 humana se diluyó a 2 mg/ml en PBS y en cada pocilio de una placa de 96 pocilios (Corning Inc., Acton, MA) se depositaron alícuotas de 100 mI. Despues de una incubación durante la noche a 4 °C, la placa se lavó 3 veces en regulador de lavado que consiste en 0.05 % de Tween-20 (Sigma-Aldrich) en PBS. Los pocilios se bloquearon con 200 mI de solución de bloqueo que consiste en 2 % l-Block (Applied Biosystems, Foster City, CA) y 0.05 % de Tween-20 en PBS. Despues de un bloqueo de 2 horas a temperatura ambiente, la placa se lavó 3 veces y se añadieron diluciones en serie TABLA 4 de los candidatos mAb anti-TLR3 1 a 19 en regulador de bloqueo. Los mAb anti-TLR3 se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces. Esto fue seguido por la adición de anti-lgG humana de oveja conjugada con peroxidasa (GE Healthcare, Piscataway, NJ) diluida 1:4000 en regulador de bloqueo, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó 3 veces en regulador de lavado. La unión se detectó mediante la incubación durante 10-15 minutos en TMB-S (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA). La reacción se detuvo con 25 mI de H2SO4 2N y se lcyó la absorbancia a 450 nm con substracción a 650 nm mediante el uso de un espectrofotómetro SPECTRA Max (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Los valores de EC50 se determinaron por regresión no lineal mediante el uso del software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
Los valores de EC50 se determinaron por unión al huTLR3 (Tabla 4) mediante la incubación con 100 ml de diluciones en serie a 4 veces de mAb desde 2.5 mg/ml hasta 0.6 mg/ml. Como controles negativos se incluyeron un anti-factor tisular humano, mAb 859, y hu lgG4K.
La afinidad de unión para el ECD hTLR3 se determinó, además, mediante análisis Biacore. Los datos (no mostrados) indican que los mAb 1-19 tenían una Kd para el ECD hTLR3 menor que 108 M.
EJEMPLO 5 Unión competitiva de epítopos Se realizaron experimentos de unión a epítopo para determinar los grupos competidores de anticuerpos del anti-TLR3 o “grupos de epítopos”).
Para el ELISA competitivo, 5 mI (20 mg/ml) de proteína humana purificada del ECD TLR3 generada como se describió en el Ejemplo 1 se recubrieron en una placas MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por pocilio durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió 150 ml de 5 % de regulador de bloqueo MSD (Meso Scale Discovery) a cada pocilio y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con regulador HEPES 0.1 M, pH 7.4, seguido de la adición de la mezcla de mAb anti-TLR3 con distintos competidores. Los anticuerpos marcados (10 nm) se incubaron con concentraciones crecientes (1 nM a 2 mM) de anticuerpos anti-TLR3 sin marcar y, después, se añadieron a los pocilios designados en un volumen de 25 mI de mezcla. Después de 2 horas de incubación con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con regulador HEPES 0.1 M (pH 7.4). El regulador de lectura T de MSD se diluyó con agua destilada (4 veces), se depositó en un volumen de 150 mI/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000. Los anticuerpos se marcaron con una cola Sulfo-Tag™ NHS-ester de MSD, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).
Se evaluaron los anticuerpos anti-TLR3 siguientes: mAb 1-19 obtenidos de una MorphoSys Human Combinatorial Antibody Library (mostrados en la Tabla 3a); c1068 (descrito en la patente núm. W006/060513A2), c1811 (mAb de rata anti-TLR3 de ratón del producido por un hibridoma generado de ratas inmunizadas con proteína TLR3 de ratón), TLR3.7 (eBiosciences, San Diego, CA, núm. cat. 14-9039) e IMG-315A (generado contra los aminoácidos 55-70 (VLNLTHNQLRRLPAAN) del TLR3 humano, de Imgenex, San Diego, CA). En este estudio se usaron las variantes 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ para los mAb 9, 10, 12, 14 y 15.
En base a ensayos de competencia, se asignaron anticuerpos anti-TLR3 a cinco grupos de epítopos distintos. Grupo A: mAb 1, 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; Grupo B: mAb 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 11, 12QVQ/QSV, 17, 18; Grupo C: anticuerpo IMG-315A de Imgenex; Grupo D: anticuerpos TLR3.7, c1068; y Grupo E: anticuerpo c1811.
EJEMPLO 6 Mapeado de epítopos Para un mapeado adicional de epítopos se seleccionaron anticuerpos representativos de grupos de epítopos distintos, como se describe en el Ejemplo 5. El mapeado de epítopos se realizó mediante el uso de diversos enfoques, que incluyen experimentos de intercambio de segmentos de TLR3, mutagénesis, intercambio H/D in silico y acoplamiento molecular proteína-proteína (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6, Glen E. Morris ed., 1996).
Intercambio de segmentos de TLR3. Para localizar dominios de unión fuerte a anticuerpos en el TLR3 se usaron proteínas quimericas de TLR3 humano-ratón. El dominio extracelular de la proteína TLR3 humana se dividió en tres segmentos (aa 1-209, aa 210-436 y aa 437-708, de acuerdo con la numeración de aminoácidos basada en la secuencia de aminoácidos del TLR3 humano, núm. de acceso del GenBank NP_003256). La proteína quimérica MT5420 se generó mediante reemplazo de los aminoácidos 210-436 y 437-708 del TLR3 humano por aminoácidos correspondientes de ratón (TLR3 de ratón, núm. de acceso del GenBank NP 569054, aminoácidos 211-437 y 438-709). La quimera MT6251 se generó mediante reemplazo de los aminoácidos humanos en las posiciones 437-708 por aminoácidos TLR3 de ratón (TLR3 de ratón, núm. de acceso del GenBank NP_569054, aminoácidos 438-709). Todos los constructos se generaron en el vector pCEP4 vector (Life Technologies, Carslbad, CA) mediante el uso de procedimientos de clonación estándar. Las proteínas se expresaron transitoriamente en células HEK293 como proteínas de fusión en el C-terminal de V5-His6, y se purificaron como se describe en el Ejemplo 1. mAb c1068. El mAb c1068 se unió al ECD TLR3 humano con alta afinidad, pero no presentó una buena unión al TLR3 murino. El c1068 perdió su capacidad de unión al MT5420 y MT6251, lo que demuestra que el sitio de unión estaba localizado dentro de los aminoácidos 437-708 de la proteína TLR3 humana WT. mAb 12QVQ/QSV. El mAb 12QVQ/QSV se unió a ambas quimeras, lo que indica que el sitio de unión para el mAb 12QVQ/QSV estaba localizado dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína TLR3 humana que tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.
Acoplamiento molecular proteína-proteína in silico. La energía de la estructura cristalina del mAb 15EVQ (ver más abajo) y la estructura publicada del TLR3 humano (Bell et al., J. Endotoxin Res. 12:375-378, 2006) se minimizó en CHARMm (Brooks et al., J. Computat. Chem. 4:187-217, 1983) a fin de usarlos como modelos de partida para el acoplamiento molecular. El acoplamiento molecular de las proteínas se realizó con ZDOCKpro 1.0 (Accelrys, San Diego, CA), que es equivalente a ZDOCK 2.1 (Chen and Weng, Proteins 51: 397-408, 2003) con una cuadrícula angular de 6 grados. La participación de los residuos conocidos de Asn en el sitio de glicosilación ligado a N del TLR3 humano (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 y 636) (Sun et al., J. Biol. Chem. 281:11144-11151, 2006) fue bloqueada en la interfase del complejo antígeno-anticuerpo por un término energético en el algoritmo ZDOCK. Se obtuvieron y agruparon 2000 poses iniciales y las poses de acoplamiento molecular se perfeccionaron y se volvieron a puntuar en RDOCK (L¡ et al., Proteins 53:693-707, 2003). Las 200 poses con las puntuaciones ZDOCK iniciales más altas y las 200 mejores poses RDOCK se inspeccionaron visualmente.
La cristalización del Fab 15EVQ se realizó por el metodo de difusión de vapor a 20 °C (Benvenuti and Mangani, Nature Protocols 2:1633-51 , 2007). El análisis inicial se estableció mediante el uso de un robot Hydra en placas de 96 pocilios. Los experimentos consistieron en gotitas de 0.5 pl de solución de proteína mezcladas con 0.5 ml de solución de reserva. Las gotitas se equilibraron contra 90 mI de solución de reserva. La solución del Fab en regulador Tris 20 mM, pH 7.4, que contenía 50 mM de NaCI, se concentró a 14.3 mg/ml mediante el uso de células Amicon Ultra-5 kDa. El análisis se realizó con el Wizard I & II (Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA) y análisis para cristalización en el laboratorio. El Fab 12QVQ/QSV se cristalizó de manera similar.
Los datos de difracción de rayos X se recolectaron y procesaron con el generador de rayos X de microfoco Rigaku MicroMax™-007HF equipado con óptica confocal Osmic™ VariMax™, detector Saturn 944 con dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de crioenfriamiento X-stream™ 2000 (Rigaku, Woodlands, TX). Las intensidades de difracción se detectaron sobre una rotación del cristal de 270°, con un tiempo de exposición de 120 s por imagen de medio grado. Los datos de rayos X se procesaron con el programa D*TREK (Rigaku). La estructura se determinó por el método de reemplazo molecular mediante el uso del programa Phaser o CNX (Accelrys, San Diego, CA). Las posiciones atómicas y los factores de temperatura se refinaron con REFMAC, con el uso de todos los datos en el intervalo de resolución 15-2.2 A para el Fab 15EVQ y 50-1.9 A para el Fab 12QVQ/QSV. Se añadieron moleculas de agua a los picos de densidad electrónica (F0-Fc) mediante el uso del nivel de corte de 3o. Todos los cálculos cristalográficos se realizaron con la suite de programas CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D50:760-763). Los ajustes del modelo se realizaron con el programa COOT (Emslcy etai, Acta Crystallogr. D60:2126-2132, 2004).
La estructura cristalina resuelta del mAb 15EVQ mostró que el sitio de combinación del anticuerpo estaba caracterizado por una serie de residuos con carga negativa en la cadena pesada (D52, D55, E99, D106 y D109). Por lo tanto, es muy probable que el reconocimiento entre el mAb 15EVQ y el TLR3 haya involucrado residuos con carga positiva. Las simulaciones de acoplamiento molecular proteína-proteína realizadas sugirieron que dos parches grandes del TLR3 que involucran múltiples residuos con carga positiva mostraron una buena complementariedad con el anticuerpo. Los residuos del TLR3 en la interfase de los complejos simulados TLR3 - anticuerpo anti-TLR3 fueron R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 y K493.
Estudios de mutagénesis. En los residuos superficiales del ECD TLR3 se introdujeron mutaciones puntuales simples y combinadas en las regiones identificadas anteriormente para contener los epítopos del mAb 12 y mAb 15EVQ, y se analizaron las proteínas mutantes para evaluar la unión a los anticuerpos.
La secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-703 del TLR3 humano (el ECD) (SEQ ID NO:4; num. de acceso al GenBank NP_003256) se clonó mediante el uso de protocolos estándar. Todos los mutantes se generaron por mutagenesis dirigida al sitio mediante el uso del kit Stratagene QuickChange II XL (Stratagene, San Diego, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante y se usaron los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5a. Las mutaciones se verificaron por secuenciación del ADN. Las proteínas se expresaron bajo un promotor del CMV como fusiones con una cola de histidinas en el C-terminal en células HEK293 y se purificaron como se describió en el Ejemplo 1.
Ensayos de unión. La actividad de unión del mAb 12QVQ/QSV y mAb 15EVQ al TLR3 humano y variantes generadas se evaluó por ELISA. Para acelerar el proceso, los mutantes en el sitio de unión predicho del mAb 15EVQ se coexpresaron en células HEK por cotransfección del mutante del ECD TLR3 que contenía una cola de histidinas en el C-terminal con el mAb 12QVQ/QSV, seguido de purificación mediante cromatografía de afinidad de metales. La muestra recuperada fue un complejo del mutante del TLR3 con el mAb 12. Este enfoque fue factible porque los sitios de unión del mAb 12QVQ/QSV y mAb 15EVQ están distanciados entre sí y, por lo tanto, es improbable que las mutaciones puntuales en un sitio afecten el epítopo del otro sitio. Estos complejos se usaron en los ensayos de unión por ELISA. 5 ml por pocilio de 20 mg/ml de ECD TLR3 tipo silvestre o proteínas mutantes en PBS se recubrieron sobre una placa HighBind de MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min y se bloquearon.
Tabla 5a. Se muestran secuencias de los oliqonucleótidos codificantes. Los oliqonucleótidos no codifcantes con secuencias complementarias se usaron en la reacción de mutaqenesis.
Durante la noche en regulador de bloqueo A de MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron y se añadió el mAb 15EVQ marcado con una cola Sulfo de MSD a concentraciones de 500 pM a 1 pM durante 1.5 horas. Después de los lavados, el anticuerpo marcado se detectó con regulador de lectura T de MSD y las placas se lcyeron con un SECTOR Imager 6000. Para evaluar la actividad de unión del mAb 12QVQ/QSV al TLR3 humano y variantes, se efectuó la coexpresión con el mAb 15EVQ y se realizaron ensayos de unión por ELISA como se describió para el mAb 15EVQ, excepto que el anticuerpo a detectar fue el mAb 12QVQ/QSV marcado. mAb 12QVQ/QSV: El sitio de unión del mAb 12QVQ/QSV se localizó dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína TLR3 humana, de acuerdo a lo determinado en los estudios de intercambio de segmentos. Se evaluaron los mutantes siguientes: D116R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E y Q167A. El TLR3 de tipo silvestre y el muíante V144AL mostraron una unión comparable al mAb 12QVQ/QSV (Figura 5A). El anticuerpo no se unió al muíante D116R del TLR3 y mostró una afinidad de unión significativamente reducida al mutante K145E. Por lo tanto, los residuos D116 y K145, que están yuxtapuestos en la superficie del TLR3 se identificaron como sitios de epítopo clave para el mAb 12QVQ/QSV (Figura 6A).
Los dos residuos fundamentales del epítopo de unión del mAb 12QVQ/QSV se localizaron cerca de la cara del sitio de unión del ARNbc en el segmento N-terminal del ectodominio TLR3 (Pirher, et al., Nature Struct. & Mol. Biol., 15:761-763, 2008). El epítopo completo contiene otros residuos en las regiones vecinas que no quedaron revelados por los análisis mutacionales realizados. Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la unión del mAb 12QVQ/QSV a su epítopo del TLR3 puede interferir directa o indirectamente con la unión del ARNbc al ectodominio TLR3, lo que, de esta manera, altera la dimerización del receptor y la activación de las vías de señalización corriente abajo. mAb 15EVQ: Se evaluaron los mutantes siguientes: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, Q538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, un doble mutante K467E/Y468A, un triple mutante T472S/R473T/N474S y un triple mutante R488E/R489E/K493E. El TLR3 de tipo silvestre, los mutantes R64E, K182E, K416E y el triple mutante T472S/R473T/N474S mostraron una unión comparable al mAb 15EVQ (Figura 5B y Tabla 5b). El anticuerpo no se unió a los mutantes del TLR3 K467E, R489E, K467E/Y468A y R488E/R489E/K493E (Figuras 5B y 5C). Las variantes restantes mostraron una unión intermedia, en donde el R488E fue el que tuvo el mayor efecto. Todos estos mutantes se unieron al mAb 12QVQ/QSV. Estos resultados mostraron que los residuos K467 y R489 son determinantes fundamentales del epítopo del mAb 15EVQ. El residuo R488 tambien contribuyó al epítopo. Estos residuos están yuxtapuestos en la misma superficie del TLR3 (Figura 6A). Los resultados mostraron, además, que los residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 y K619, todos en la misma superficie que K467, R488 and R489, contribuyeron al epítopo. Esta conclusión fue respaldada, además, por los estudios de intercambio H/D con el mAb 15EVQ. La Figura 6A muestra los sitios de unión de epítopos para los mAb 12QVQ/QSV y 15EVQ (negro) y C1068 mAb (gris) superpuestos a la estructura del TLR3 humano. El epítopo para el mAb 15EVQ cubre los residuos Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 y K619.
Estudios de intercambio H/D. En el intercambio H/D, los procedimientos usados para analizar la perturbación del anticuerpo fueron similares a los descritos previamente (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45:8488-8498, 2006) con algunas modificaciones. Se incubó ECD TLR3 recombinante (expresado a partir de células Sf9 con una cola de histidinas en el C-terminal y purificado) en una solución de agua deuterada por tiempos predeterminados, lo que dio como resultado la incorporación de deuterio en átomos de hidrógeno intercambiables. El ECD TLR3 deuterado se capturó en una columna que contenía el mAb 15EVQ inmovilizado y, despues, se lavó con regulador acuoso. La proteína del ECD TLR3 intercambiado se eluyó de la columna y la localización de los fragmentos con deuterio se determinó por digestión con proteasa y análisis por espectrometría de masa. Como control de referencia, se procesó una muestra de ECD TLR3 de manera similar, excepto que se expuso al agua deuterada recién después de la captura en la columna del anticuerpo y, posteriormente, se lavó y eluyó de la misma manera que la muestra experimental. Se dedujo que las regiones unidas al anticuerpo son los sitios relativamente protegidos del intercambio y, por lo tanto, contienen una fracción mayor de deuterio de la muestra del ECD TLR3 de referencia. Aproximadamente el 80 % de la proteína pudo mapearse a péptidos específicos. En la Figura 6B se muestran los mapas de la interrupción del intercambio H/D del ECD de TLR3 por el mAb 15EVQ. Por razones de claridad, solo se muestra el segmento del TLR3 alrededor de la porción afectada por el mAb 15EVQ. El resto de la proteína, que se extiende hasta los amino y carboxilo terminales del ECD TLR3 no se vio afectado de forma apreciable.
Los estudios de intercambio H/D identificaron los segmentos peptídicos 465YNKYLQL471, 514SNNNIANINDDML526 y 529LEKL532 de la SEQ ID NO: 2 como las regiones en donde el intercambio en el TLR3 estuvo particularmente alterado por la unión al mAb 15EVQ. Por su naturaleza, el intercambio H/D es un método de mapeado lineal y, usualmente, no puede definir cuales son los residuos del segmento peptídico que resultan más afectados por la unión del anticuerpo. Sin embargo, la amplia coincidencia entre los resultados mutacionales y de intercambio H/D brinda apoyo adicional al hecho que la superficie que se muestra en la Figura 6A es el sitio de unión para el mAb 15EVQ. Este sitio de unión estaba en la misma región lineal que la secuencia de aminoácidos descrita previamente para el mAb c1068 (publicación del PCT núm. W006/060513A2), pero se comprobó que se localiza sobre una superficie en la que no existe traslapamiento (Figura 6A), en concordancia con la falta de competencia cruzada entre estos anticuerpos.
El epítopo de unión del mAb 15EVQ estaba espacialmente proximal al sitio de unión del ARNbc en el segmento C-terminal del TLR3 (Bell et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 103: 8792-8797, 2006; Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem, 282: 7668-7678, 2007; Liu et al., Science, 320: 379-381, 2008). Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la unión del mAb 15EVQ en su epítopo del TLR3 provoca choques estéricos con una molécula ligando del ARNbc y/o el dímero asociado, lo que impide la unión del ligando y la dimerización del receptor inducida por el ligando.
TABLA 5b.
EJEMPLO 7 Generación de variantes con estabilidad térmica mejorada Para generar variantes de anticuerpos con estabilidad térmica mejorada, se realizó la manipulación genética basada en la estructura, al mismo tiempo que se trató de mantener la actividad biológica y minimizar la inmunogenicidad.
Para la manipulación genética se seleccionó el mAb 15EVQ. Para minimizar la inmunogenicidad, se buscaron solamente las mutaciones de la línea germinal destinadas a ser beneficiosas, en base a consideraciones estructurales. Las secuencias de VL y VH del mAb 15EVQ (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 216, respectivamente) se alinearon con los genes de la línea germinal humana mediante el uso de búsquedas BLAST. Las secuencias de la línea germinal más cercanas identificadas fueron los núms. de acceso del GenBank AAC09093 y X59318 para VH y VL, respectivamente. Entre la línea germinal de VH, VL y las de las secuencias del mAb 15EVQ se identificaron las diferencias siguientes: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S y Q67H; (VL) G30S, L31S y A34N. Las diferencias identificadas en las secuencias se mapearon sobre la estructura cristalina del mAb 15EVQ, y para la manipulación genetica se seleccionaron los residuos destinados a alterar el empaquetamiento y las interacciones de la interfase. En base a la estructura cristalina del anticuerpo (ver Ejemplo 6), se identificaron los posibles residuos desestabilizadores de la estructura. (1) En el núcleo de la VH, cerca de V34, se identificó una cavidad encerrada pequeña. Esta cavidad era lo suficientemente grande para dar cabida a una cadena lateral ligeramente más grande, tal como lie. (2) El E99 de la CDR3 de VH estaba enterrado en la interfase VHA/L sin una red de enlaces de H. El grupo carboxilato de carga negativa del E99 se encontraba en un ambiente generalmente hidrófobo con contactos principalmente de van der Waals (vdw) a residuos vecinos. Usualmente, el enterramiento de un grupo cargado es energéticamente desfavorable y, por lo tanto, tiene un efecto desestabilizador. (3) El F50 de VH es un residuo de la interfase VHA/L. Su cadena lateral aromática es voluminosa y, por lo tanto, puede tener un impacto negativo en el apareamiento. Las redes de enlaces de H y de empaquetamiento de vdw se calcularon e inspeccionan visualmente en Pymol (www:b_pymol_org). Las cavidades enterradas en los dominios de VH y VL se calcularon por Caver (Petrek et al., BMC Bioinformatics, 7:316, 2006). Todas las figuras de los gráficos moleculares se prepararon en Pymol. Se realizaron mutaciones a los vectores de expresión que codifican fragmentos Fab o anticuerpos humanos enteros de lgG4 generados como se describió en el Ejemplo 3, mediante el uso de téenicas de clonación estándar que usan el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change II XL (Stratagene, San Diego, CA), el kit de mutagénesis dirigida al sitio Change-IT Múltiple (USB Corporation, Cleveland, OH) o el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change II (Stratagene, San Diego, CA). Las reacciones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de cada fabricante. Los clones obtenidos se secuenciaron para la verificación, y las variantes genéticamente manipuladas obtenidas se denominaron mAb 15-1 - 15-10, de acuerdo con su cadena pesada o ligera modificada. Cada cadena de variante (H o L) se expresó con la cadena L o H del mAb 15EVQ de tipo silvestre para producir anticuerpos, excepto que la cadena pesada del mAb 15-10 era del mAb 15-6. En la Tabla 6 se muestra una lista de los SEQ ID NO: de las CDR, regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, y cadenas pesada y ligera en toda su extensión del mAb 15EVQ y sus variantes genéticamente manipuladas. La Tabla 7 muestra los iniciadores para la generación de cada variante.
TABLA 6 La unión de los mAb 15-1 - 15-9 al TLR3 se evaluó por inmunoensayo ELISA. El ECD TLR3 humano (100 ml de 2 mg/ml de ECD TLR3) se unió durante la noche y a 4 °C a una placa Maxisorb negra (eBioscience). Las placas se lavaron y se bloquearon, y los anticuerpos diluidos se dividieron en alícuotas de 50 pl por pocilio y por duplicado en los pocilios. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. La unión se detectó mediante el uso de sustrato POD de luminiscencia (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, núm. cat. 11 582950001) y anti-Fc humano de cabra:HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, núm. cat. 109-035-098) y la placa se lcyó en un lector de placas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Los experimentos DSC se realizaron en un sistema de DSC capilar Auto VP de MicroCal (MicroCal, LLC, Northampton, MA) en el cual se midieron continuamente las diferencias de temperatura entre las celulas de referencia y de la muestra, y se calibraron a unidades de energía. Las muestras se calentaron de 10 °C a 95 °C a una velocidad de calentamiento de 60 °C/hora. El tiempo de preexploración fue de 15 minutos y el periodo de filtrado fue de 10 segundos. La concentración usada en los experimentos de DSC fue de aproximadamente 0.5 mg/ml. El análisis de los termogramas obtenidos se realizó con el software MicroCal Origin 7 (MicroCal, LLC).
TABLA 7 La estabilidad termica (Tm) de las variantes generadas se midió por DSC (Tabla 8). La unión de las variantes de anticuerpos al TLR3 fue comparable a la del anticuerpo raíz.
Tabla 8. Resumen de temperaturas de fusión (TM) de las variantes y la justificación de su elaboración EJEMPLO 8 Generación de un anticuerpo sustituto anti-TLR3 Se generó un anticuerpo antagonista quimerico de rata/ratón anti-TLR3 de ratón, denominado en la presente descripción mAb 5429, para evaluar los efectos de la inhibición de la señalización del TLR3 en varios modelos in vivo, debido a que los anticuerpos humanizados generados en el Ejemplo 1 no tenían la especificidad o actividad antagonista suficiente para el TLR3 de ratón. El sustituto quimerico mAb 5429, así como su anticuerpo raíz de rata anti-TLR3 de ratón, c1811 , inhibió la señalización del TLR3 de ratón in vitro e in vivo y mejoró los mecanismos patogénicos en varios modelos de enfermedad en ratones.
Los datos que se analizan más abajo sugieren una función para el TLR3 en la inducción y perpetuación de la inflamación perjudicial, y contribuyen a la justificación para el uso terapéutico de antagonistas del TLR3 y antagonistas de anticuerpos del TLR3, por ejemplo, en afecciones inflamatorias agudas y crónicas que incluyen hipercitocinemia, asma e inflamación de las vías respiratorias, enfermedades inflamatorias del intestino y artritis reumatoide, infecciones virales y diabetes tipo II.
Generación del mAb sustituto 5429 Se inmunizaron ratas CD con el ectodominio del TLR3 murino recombinante (aminoácidos 1-703 de la SEQ ID NO: 162, núm. de acceso del GenBank NP 569054) generado mediante métodos de rutina. Los linfocitos de dos ratas que demostraban títulos de anticuerpo específicos al TLR3 murino se fusionaron con células de mieloma FO. Se identificó un panel de anticuerpos monoclonales reactivos al TLR3 murino y se analizaron para evaluar la actividad antagonista in vitro en los ensayos de gen reportero de luciferasa murina y fibroblastos embrionarios murinos. La línea de hibridoma C1811A se seleccionó para un trabajo posterior. Se secuenciaron genes funcionales de la región variable a partir del mAb c1811 secretado por el hibridoma. Después, los genes clonados de la región variable de la cadena pesada y ligera se insertaron, respectivamente, en vectores de expresión plasmídicos que proporcionaron las secuencias codificantes para generar, mediante metodos de rutina, un mAb quimérico Rat/Balb C mulgGI/k designado como mAb 5429. Los anticuerpos se expresaron como se describió en el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del mAb 5429 se muestran en la SEQ ID NO:164 y la SEQ ID NO: 163, respectivamente, y las secuencias de la cadena pesada y ligera en toda su extensión se muestran en SEQ ID NO:166 and SEQ ID NO: 165, respectivamente. Las secuencias en toda su extensión de la cadena pesada y ligera del mAb c1811 se muestran en la SEQ ID NO: 168 y la SEQ ID NO: 167, respectivamente.
Caracterización del mAb 5429 El mAb 5429 se caracterizó en un panel de ensayos in vitro para evaluar su capacidad de neutralización de la señalización del TLR3. Los ensayos y resultados de la actividad se describen más abajo.
Ensayo de gen reportero luciferasa murina El ADNc del TLR3 murino (SEQ ID NO: 161, núm.: de acceso del GenBank NM 126166) se amplificó por PCR a partir de ADNc de bazo murino (BD Biosciences, Bedford, MA), y se clonó en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carslbad, CA) mediante métodos estándar. Se sembraron 200 pl de células HEK293T en placas de 96 pocilios de fondo blanco transparente a una concentración de 4 x 104 celulas/pocillo en DMEM completo, y al día siguiente se realizaron transfecciones mediante el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) con 30 ng de plásmidos reporteros de pNF-kB luciferasa de luciérnaga (Stratagene, San Diego, CA) o 30 ng de pISRE luciferasa de luciérnaga (BD Biosciences, Bedford, MA), 5 ng del control phRL-TK de luciferasa de Renilla (Promega Corp., Madison, Wl), 1.5 ng pCEP4 que codifica TLR3 murino en toda su extensión y 13.5 ng del vector vacío pcDNA3.1 (Life Technologies, Carslbad, CA) para que la cantidad total de ADN fuera de 50 ng/pocillo. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron de 30 minutos a 1 hora a 37 °C con los anticuerpos anti-TLR3 murinos en DMEM fresco libre de suero antes de la adición de 0.1 o 1 mg/mI de poli(l:C). Las placas se cosecharon después de 24 horas mediante el sistema de ensayo con luciferasa Dual-Glo (Promega, Madison, Wl). Las unidades relativas de luz se midieron mediante un lector de detección múltiple FLUOstar OPTIMA con software OPTIMA (BMG Labtech GmbH, Alemania). Se obtuvieron valores normalizados (relaciones de luciferasa) por medio de dividir las unidades relativas de luz (RLU) de luciérnaga por las RLU de Renilla. El mAb 5429, así como su raíz mAb c1811 y el Mab 15 (Tabla 3a) redujeron la activación inducida por poli(l:C) de NF-kB e ISRE en una manera dependiente de la dosis (Figuras 7A y 7B), lo que demuestra su capacidad para antagonizar la actividad del TLR3. Los IC50 medidos en el ensayo de ISRE fueron 0.5, 22 y 0.7 pg/ml para los mAb 5249, mAB 15 y mAb c1811 , respectivamente.
Ensayo de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) Las celulas C57BL/6 de MEF se obtuvieron de Artis Optimus (Opti-MEF™ C57BL/6 - 0001). Las células se sembraron en placas de 96 pocilios y de fondo plano (BD Falcon) a razón de 20,000 células/pocillo en 200 ml de medios para MEF (DMEM con glutamax, 10 % de FBS inactivado por calor, 1x NEAA y 10 mg/ml de gentamicina). Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C/5 % de CO2. Veinticuatro horas después de la siembra, se añadieron los mAb 5429 o mAb c1811 en los pocilios. Las placas se incubaron con los mAb durante 1 hora, después de lo cual se añadió poli(l:C) a razón de 1 pg/ml en cada pocilio. Los sobrenadantes se recolectaron después de una incubación de 24 horas. Los niveles de citocina se determinaron mediante el uso de un kit para microesferas (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) a fin de detectar CXCL10/IP-10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados se graficaron mediante el uso del software GraphPad Prism. Ambos anticuerpos redujeron los niveles de CXCL10/IP-10 inducido por poli(l:C) en una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra la capacidad de estos anticuerpos para antagonizar el TLR3 endógeno e inhibir la señalización del TLR3 (Figura 8).
Citometría de fluio-Tinción superficial Ratones desactivados para C57BL/6 y TLR3 (TLR3KO) (fondo C57BL/6; hembra, 8-12 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.), 10 por grupo, recibieron una dosis ¡ntraperitoneal de 1 mi de medio tioglicolato al 3 % (Sigma); 96 horas después, los ratones fueron sacrificados y el peritoneo de cada ratón se lavó con 10 mi de PBS estéril. Los macrófagos perifonéales inducidos por tioglicolato se resuspendieron en PBS y se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con azul tripán. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 250 ml de regulador FACS (PBS -Ca2+-Mg2+, 1 % de FBS inactivado por calor, 0.09 % de azida de sodio) y se mantuvieron en hielo húmedo. Se usó reactivo CD16/32 (eBioscience) a razón de 10 mg/106 células durante 10 minutos para bloquear receptores Fe en los macrófagos. Para la tinción superficial, las células se distribuyeron a razón de 106 células en 100 mI/pocillo. Los mAb c1811 y mAb 1679 conjugados con Alexa-Fluor 647 (Molecular Probes) (anticuerpos de rata anti-TLR3 de ratón que no tenían especificidad por el TLR3 y, por lo tanto, se usaron como control de isotipo) se añadieron a razón de 0.25 pg/106 células y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron en 250 pl de regulador FACS. Se añadió la tinción de viabilidad 7-AAD (BD Biosciences, Bedford, MA) a razón de 5 mI/pocillo no más de 30 minutos antes de la adquisición de las muestras en el FACS Calibur para detectar una población de células muertas. Las muestras fueron recolectadas por el FACS Calibur mediante el uso del software Celular Pro Quest. Se usó FCS Express para analizar los datos recolectados por la formación de histogramas.
La unión del mAb c1811 a los macrófagos perifonéales murinos inducidos por tioglicolato procedentes de ratones C57BL/6 y TLR3KO se evaluó por citometría de flujo para determinar la especificidad de unión. En este ensayo no se usó el mAb 5429 porque se esperaba que la región Fe de ratón de este anticuerpo quimerico contribuiría a la unión no específica. El mAb c1811 no mostró unión a los macrófagos del TLR3KO, pero sí un incremento de la unión a las superficies celulares de macrófagos peritoneales de ratones C57BL/6, lo que sugiere una especificidad del mAb para el TLR3 (Figura 9). Se supone que el mAb 5429, que tiene las mismas regiones de unión que el mAb c1811 , tiene la misma especificidad de unión que el mAb c1811.
EJEMPLO 9 Antagonistas de anticuerpos del TLR3 protegen de la inflamación sistémica mediada por el TLR3 Modelo Se usó el modelo sistémico citocina/quimocina inducido por poli(l:C) como modelo de inflamación sistémica mediada por TLR3. En este modelo, el poli(l:C) (PIC) suministrado por vía intraperitoneal indujo una respuesta sistémica de citocina y quimocina que estuvo parcialmente mediada por el TLR3.
Ratones C57BL/6 hembra (8-10 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (fondo C57BL/6; 8-10 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) recibieron mAb 5429 a razón de 10, 20 o 50 mg/kg en 0.5 mi PBS; mAb c1811 a razón de 2, 10 o 20 mg/kg en 0.5 mi PBS, o 0.5 mi de PBS solo (control de vehículo) por vía subcutánea. Veinticuatro horas después de la dosificación del anticuerpo, los ratones recibieron 50 mg de poli(l:C) (Amersham, núm. cat. 26-4732, núm. lote IH0156) en 0.1 mi de PBS por vía intraperitoneal. Se recolectó sangre retrorbital a 1 y 4 horas despues de la exposición a poli(l:C). Se preparó suero a partir de la sangre entera y se analizó para evaluar las concentraciones de citocina y quimocina por Luminex.
Resultados El poli(l:C) suministrado por vía intraperitoneal indujo una respuesta sistémica a citocina y quimocina que fue parcialmente mediada por el TLR3, como lo demuestra la producción significativamente reducida de un panel de quimocinas y citocinas en los animales TLR3KO (Tabla 9A). Los mediadores inducidos por poli(l:C) dependiente del TLR3 fueron IL-6, KC, CCL2/MCP-1 y TNF-a a 1 h después de la exposición a poli(l:C) e IL-1a, CCL5/RANTES y TNF-a a 4 h después de la exposición a poli(l:C). Tanto el mAb c1811 como el mAb 5429 redujeron significativamente los niveles de estos mediadores dependientes del TLR3, lo que demuestra la capacidad de los anticuerpos para reducir la señalización del TLR3 in vivo (Tabla 9B). Los valores de la Tabla 9 se muestran como las concentraciones medias de citocina y quimocina en mg/ml de seis animales/grupo ± SEM. Estos datos sugieren que el antagonismo del TLR3 puede ser beneficioso en la reducción de los niveles excesivos de citocina y quimocina mediados por el TLR3, en condiciones tales como tormenta de citocinas o choque letal.
TABLA 9a. *p<0.001 : ANOVA de una vía para C57BL/6 PBS **p<0.001 ANOVA de una vía para C57BL/6 PIC TABLA 9b. ***p<0.001 , **p<0.01 , *p<0.05: Las estadísticas de ANOVA de una vía se compararon con el grupo C57BL76 + PIC group EJEMPLO 10 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 reducen la hiperreactividad de las vías respiratorias Modelo La hiperreactividad de las vías respiratorias fue inducida por el poli(l:C).
Ratones C57BL/6 hembra (12 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (fondo C57BL/6; 12 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) se anestesiaron con isoflurano y recibieron varias dosis (10-100 pg) de poli(l:C) en 50 ml de PBS estéril por vía ¡ntranasal. Los ratones recibieron tres administraciones de poli(l:C) (o PBS) con un periodo de descanso de 24 horas entre cada administración. Veinticuatro horas después de la última administración de poli(l:C) (o PBS), se midió la función pulmonar y la hiperreactividad de las vías respiratorias a la metacolina mediante el uso de pletismografía de cuerpo entero (sistema BUXCO). Los ratones se colocaron en la cámara del pletismógrafo de cuerpo entero y se dejaron aclimatar durante al menos 5 minutos. Después de las lecturas de la línea base, los ratones se expusieron a dosis crecientes de metacolina nebulizada (Sigma, St. Louis, MO).
La metacolina nebulizada se administró durante 2 minutos, seguido de un período de recolección de datos de 5 minutos, seguido de un período de descanso de 10 minutos, antes de exposiciones posteriores de metacolina a dosis crecientes. El aumento de la resistencia al flujo de aire se midió como pausa mejorada (Penh) y se representa como el valor Penh medio durante el período de registro de 5 minutos (sistema BUXCO). Después de las mediciones de la función pulmonar, los ratones fueron sacrificados y los pulmones fueron canulados. Se realizaron lavados broncoalveolares (BAL) mediante la inyección de 1 mi de PBS en los pulmones y la recuperación del efluente. Los tejidos pulmonares se retiraron y se congelaron. Los fluidos de BAL se centrifugaron (1200 rpm, 10 min) y los sobrenadantes libres de células se recolectaron y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 200 ml de PBS para efectuar los recuentos celulares totales y diferenciales. El ensayo multiplex se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante y el kit de inmunoensayo Multiplex (Millipore, Billercia, MA).
Resultados Las observaciones previas demostraron que la administración intranasal de poli(l:C) indujo un deterioro mediado por el TLR3 de la función pulmonar en ratones, con un aumento de la medición de la pausa mejorada (PenH) en pletismografía de cuerpo entero (Buxco) en la línea base y un aumento de la respuesta a la metacolina administrada en aerosol (una indicación de hiperreactividad de las vías respiratorias) (publ. del PCT núm.
W006/060513A2). Este deterioro de la función pulmonar estuvo asociado con el reclutamiento de neutrófilos en el pulmón y un incremento en los niveles de citocinas/quimocinas proinflamatorias en el pulmón. En este estudio, el efecto del mAb 1811 y el mAb 5429 se evaluó en el deterioro de la función pulmonar inducido por poli(l:C) mediante la administración de cada anticuerpo por vía subcutánea a razón de 50 mg/kg antes de la exposición a poli(l:C).
El deterioro mediado por el TLR3 de la función pulmonar se redujo significativamente por el tratamiento de los animales con antagonistas de anticuerpos del TLR3 antes de la exposición a poli(l:C). En los animales tratados con anticuerpos anti-TLR3 (Figura 10) se impidieron los incrementos mediados por el TLR3 en la línea de base de la PenH y la sensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina. Además, en los animales tratados con anticuerpos anti-TLR3 se redujo el reclutamiento de neutrófilos mediado por TLR3 en el pulmón de ratón y la generación de quimocinas en las vías respiratorias. La cantidad de neutrófilos (Figura 11) y los niveles de CXCL10/IP-10 (Figura 12) se midieron en el líquido de lavado broncoalveolar recolectado (BALF). Los estudios se repitieron al menos tres veces, con resultados similares. Los datos mostrados en las Figuras 10, 11 y 12 son de un estudio representativo. Cada símbolo representa un punto de datos de un ratón y las barras horizontales muestran las medias de los grupos. El estudio demostró que, en el modelo usado, los antagonistas de anticuerpos del TLR3 administrados sistémicamente llegaron el pulmón y redujeron el deterioro de la función pulmonar mediado por el TLR3, la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, la generación de quimocina y la inflamación del tracto respiratorio. Por lo tanto, los antagonistas del TLR3 pueden ser beneficiosos en el tratamiento o la prevención de enfermedades respiratorias caracterizadas por la hiperrespuesta de las vías respiratorias, tales como asma, rinitis alergica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y fibrosis quística.
EJEMPLO 11 Antagonistas de anticuerpos del TLR3 protegen de la enfermedad inflamatoria del intestino Modelo Se usó el modelo de colitis por DSS como modelo de enfermedad inflamatoria intestinal.
Ratones C57BL/6 hembra (<8 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (fondo C57BL/6; <8 semanas de edad, que pesaban entre 16.5 g y 18 g, Ace Animáis, Inc.) se alimentaron con alimentos irradiados con rayos gamma a partir del día -1. Se diluyó DSS (sulfato de dextrano) (MP Biomedicals, Aurora, OH, núm. catálogo: 160110; 35-50 kDa; 18-20 % azufre, núm. lote 8247J) en agua potable acidificada tratada en autoclave hasta una concentración final de 5 %.EI DSS-agua se administró durante 5 días, después de lo cual se reemplazó con agua del grifo. Se permitió que los ratones bebieran agua ad libitum durante todo el estudio. Todas las botellas de agua se pesaron todos los días para registrar el consumo de agua. En los días 0, 2 y 4 los ratones recibieron una dosis por vía intraperitoneal con 5 mg/kg (0.1 mg en 0.1 mi de PBS) de mAb 5429, anticuerpo anti-TNF-a de ratón o PBS como control. Los ratones se controlaron diariamente durante todo el estudio y se pesaron en los días 0 a 4 y en el día 7. Los ratones se sacrificaron en los días 2 y 7 del estudio. Se abrieron las cavidades abdominales y se cortaron los colones ascendentes, en donde se unen al ciego. Los colones se recolectaron y se fijaron en formalina al 10 % en regulador neutro. Los colones se incorporaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con H&E (Qualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA). Las evaluaciones histopatológicas colónicas se realizaron de forma ciega por un patólogo veterinario, tal como se describe más abajo (PathoMetrix, San Jose, CA).
Evaluación histopatolóqica Se evaluaron y puntuaron dos segmentos del intestino grueso, el colon y el recto para los cambios siguientes: (i) necrosis celular simple; (ii) ulceración epitelial; (iii) descamación epitelial; (iv) absceso criptal; (v) proliferación celular; (vi) proliferación de células criptales; (vii) formación de tejido de granulación en la lámina propia;(viii) tejido de granulación en la submucosa; (ix) infiltrado submucoso de células inflamatorias, predominantemente neutrofílico y (x) edema submucoso.
Se proporcionó un puntaje de gravedad único y general, en base a los estándares siguientes: 0 - inexistente 1 - leve, focal o encontrada ocasionalmente 2 - leve, multifocal 3 - moderada, encontrada frecuentemente, pero en áreas limitadas 4 - grave, encontrada frecuentemente en muchas áreas o extensiones del tejido recibido 5 - muy grave, extendida a grandes porciones del tejido recibido Resultados Las observaciones previas indicaron que, en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por la ingestión de DSS, los animales TLR3KO mostraron una histopatología significativamente reducida en comparación con los ratones de tipo silvestre (publ. del PCT núm. W006/60513A2), lo que sugiere que, en este modelo, la señalización del TLR3 desempeña una función en la patogenesis. Se ha informado que el ARN bacteriano comensal o el ARN de mamífero liberado de células necróticas pueden actuar como ligando endógeno para estimular la señalización del TLR3 (Kariko et al., Immunity 23165-2311752005; Kariko et al., J. Biol. Chem. 279:12542-12550 2004) y, por lo tanto, en el modelo de colitis por DSS, la estimulación del TLR3 por ligandos endógenos en el intestino puede aumentar y perpetuar la inflamación.
De acuerdo con la evaluación de puntuaciones de compuestos histopatológicos (Figura 13), la gravedad de la enfermedad resultó mejorada en los animales expuestos al DSS tras el tratamiento con anticuerpos anti-TLR3. La Figura 13 muestra las medias, desviaciones estándar e intervalos de confianza del 95 % para las puntuaciones de gravedad de la enfermedad como barras horizontales. Se observó una reducción significativa de las puntuaciones en los animales de tipo silvestre expuestos al DSS tratados con anticuerpos anti-TLR3 (p < 0.05) en comparación con animales de tipo silvestre no tratados. Los animales TLR3KO expuestos al DSS estuvieron protegidos de los cambios inducidos por el DSS. Los animales expuestos al DSS que recibieron el mAb anti-TNF-a de ratón no mostraron ninguna mejoría de la histopatología en el modelo DSS. Por lo tanto, el modelo DSS puede ser útil en la evaluación de agentes terapeuticos que pueden dirigirse a la población de pacientes humanos que no responden a terapias con anti-TNF-a, y los anticuerpos neutralizantes anti-TLR3 pueden tener el potencial para proporcionar un beneficio a pacientes con la enfermedad inflamatoria del intestino que no responden a las terapias con anti-TNF-a.
Modelo Se usó el modelo de transferencia de células T como modelo de enfermedad inflamatoria del intestino. En este modelo, la inflamación intestinal se indujo en ratones SCID por la transferencia de una población de células T reguladoras carentes de células T vírgenes procedentes de ratones inmunocompetentes, que atacan las celulas presentadoras de antígeno de la mucosa intestinal.
Se inyectaron células T vírgenes (células T CD4+CD45RBhl9h) por vía intraperitoneal a destinatarios SCID para inducir colitis crónica. Los ratones recibieron PBS (500 mI/ratón por vía intraperitoneal; control de vehículo), mAb 5429 (0.1 mg/ratón por vía intraperitoneal) o anticuerpo anti-TNF-a (0.05 mg/ratón por vía intraperitoneal; control positivo); se comenzó 48 horas después de la transferencia de células T y, posteriormente, dos veces por semana durante la totalidad del estudio de 8 semanas. A las 8 semanas después de la transferencia de células T (o cuando los ratones perdieron >el 15 % de su peso corporal original) los animales fueron sacrificados y se extrajeron los colones. Los colones se fijaron, se incorporaron en parafina y se tiñeron con H&E. La histopatología (infiltración celular, abscesos criptales, erosión epitelial, pérdida de células caliciformes y engrosamiento de la pared intestinal) se evaluó cuantitativamente de manera ciega.
Resultados De acuerdo con la evaluación por reducción significativa de la suma de puntuaciones histopatológicas, la gravedad de la enfermedad mejoró en los animales que recibieron la transferencia de células T tras el tratamiento con anticuerpos anti-TLR3, en comparación con los animales de control (p<0.05)(Figura 14A). Para la suma de las puntuaciones, se evaluaron abscesos criptales, ulceración, afluencia de neutrófilos, pérdida de células caliciformes, criptas anormales, inflamación de la lámina propia y afectación transmural. Se observó una reducción significativa en abscesos criptales, ulceración y afluencia de neutrófilos (para todos los p< 0.05) (Figura 14B). El anticuerpo anti-TNF-a se usó como control positivo a dosis conocidas por proporcionar un beneficio óptimo.
Los estudios que usan dos modelos muy conocidos de enfermedades inflamatorias del intestino, el modelo DSS y el modelo de transferencia de células T, demostraron que los antagonistas de anticuerpos del TLR3 suministrados sistémicamente llegaron a la mucosa intestinal y redujeron la inflamación del tracto gastrointestinal inducida mediante dos mecanismos patogénicos diferentes. Por lo tanto, los antagonistas del TLR3 pueden ser beneficiosos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen casos refractarios al anti-TNF-a y otras patologías ¡nmunomediadas del tracto gastrointestinal.
EJEMPLO 12 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 protegen de la artritis inducida por colágeno Modelo Se usó el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) como modelo de artritis reumatoide.
Ratones B10RIII macho (6-8 semanas de edad, Jackson Labs) se dividieron en grupos de 15 por grupo (grupos de artritis) o 4 por grupo (ratones de control). Los grupos de artritis se anestesiaron con isoflurano y recibieron inyecciones de colágeno tipo II (Elastin Products) y adyuvante completo de Freund, complementado con M. tuberculosis (Difeo) en los días 0 y 15. En el día 12, los ratones que desarrollaban artritis por colágeno tipo II se aleatorizaron por peso corporal en grupos de tratamiento y se dosificaron por vía subcutánea (SC) en los días 12, 17 y 22 (d 12, d 17, 2d2) con mAb 5429 (25 mg/kg), el anticuerpo CVAM de control negativo (un mAb recombinante sin especificidad conocida en ratones) (5 mg/kg) o anticuerpo anti-TNF-a (5 mg/kg, control positivo). Además, los grupos de ratones de control se trataron diariamente (QD) con vehículo (PBS) o dexametasona (0.5 mg/kg, Dex, compuesto de referencia) por vía subcutánea (SC) en los días 12-25. Los animales se observaron diariamente desde el día 12 hasta el día 26. Las patas anteriores y posteriores se evaluaron por un sistema de puntuación clínica (mostrado más abajo). Los animales fueron sacrificados en el día 26 del estudio y la histopatología se evaluó de manera ciega (el sistema de puntuación se describe más abajo). La evaluación de la eficacia se basó en el peso corporal de los animales y en las puntuaciones clínicas de artritis. Todos los animales sobrevivieron hasta la finalización del estudio.
Criterios de puntuación clínica para las patas anteriores y posteriores 0 - normal 1 - articulación de la pata posterior o anterior afectada o eritema difuso e hinchazón mínimos 2 - articulaciones de la pata posterior o anterior afectadas o eritema difuso e hinchazón leves 3 - articulaciones de la pata posterior o anterior afectadas o eritema difuso e hinchazón moderados 4 - eritema difuso e hinchazón marcados, o articulaciones =4 dígitos afectadas) 5 - eritema difuso grave e hinchazón grave en toda la pata, incapaz de flexionar dígitos) Metodos de puntuación histopatolóqica para articulaciones de ratón con artritis por colágeno tipo Cuando se puntuaron las patas o tobillos de ratones con lesiones de artritis por colágeno tipo II, se consideró la severidad de los cambios, así como la cantidad de articulaciones individuales afectadas. Cuando se vieron afectadas solo 1-3 articulaciones de las patas o tobillos, de una posibilidad de numerosas articulaciones metacarpales/metatarsales/digitales o tarsales/tibiotarsales, se otorgó una asignación arbitraria de una puntuación máxima de 1 , 2 o 3 para los parámetros descritos más abajo, en función de la gravedad de los cambios. Si estaban involucradas más de 2 articulaciones, los parámetros descritos más abajo se aplicaron a la mayoría de las articulaciones o a las más afectadas.
Los datos clínicos para las puntuaciones de las patas se analizaron mediante el uso del AUC para los días 1-15, y se calcularon los % de inhibición respecto de los controles.
Inflamación 0 - normal 1 - infiltración mínima de celulas inflamatorias en el tejido sinovial y periarticular de las articulaciones afectadas 2 - infiltración leve, si involucra las patas, restringida a las articulaciones afectadas 3 - infiltración moderada con edema moderado, si involucra las patas, restringida a las articulaciones afectadas 4 - infiltración marcada que afecta la mayoría de las áreas, con edema marcado 5 - infiltración difusa grave, con edema grave Pannus 0 - normal 1 - infiltración mínima del pannus en el cartílago y hueso subcondral 2 - infiltración leve, con destrucción de la zona marginal de tejido rígido en las articulaciones afectadas 3 - infiltración moderada, con destrucción moderada de tejido rígido en las articulaciones afectadas 4 - infiltración marcada con destrucción marcada de la arquitectura articular, casi todas las articulaciones 5 - infiltración grave asociada con destrucción total o casi total de la arquitectura articular, afecta todas las articulaciones Daños en el cartílago 0 - normal 1 - perdida mínima a leve de tinción con azul de toluidina sin pérdida evidente de condrocitos o ruptura de colágeno en las articulaciones afectadas 2 - pérdida leve de tinción con azul de toluidina con pérdida focal leve (superficial) de condrocitos y/o ruptura de colágeno en las articulaciones afectadas 3 - pérdida moderada de tinción con azul de toluidina con pérdida multifocal moderada (profundidad hasta la zona media) de condrocitos y/o ruptura de colágeno en las articulaciones afectadas 4 - pérdida marcada de tinción con azul de toluidina con pérdida multifocal marcada (profundidad hasta la zona profunda) de condrocitos y/o ruptura de colágeno en la mayoría de las articulaciones 5 - perdida difusa grave de tinción con azul de toluidina con pérdida multifocal grave (profundidad hasta la línea de calcificación) de condrocitos y/o ruptura de colágeno en todas las articulaciones Resorción ósea 0 - normal 1 - mínima con pequeñas áreas de resorción, no fácilmente evidente con bajo aumento, muy pocos osteoclastos en las articulaciones afectadas 2 - leve con áreas más numerosas, no fácilmente evidente con bajo aumento, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas 3 - moderada con resorción evidente del hueso trabecular medular y cortical, y sin defectos en todo el espesor de la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión evidente con bajo aumento, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas 4 - marcada con defectos en todo el espesor del hueso cortical, frecuentemente, con distorsión del perfil de la superficie cortical restante, pérdida marcada del hueso medular, numerosos osteoclastos, afecta la mayoría de las articulaciones 5 - grave con defectos en todo el espesor del hueso cortical y destrucción de la arquitectura articular de todas las articulaciones Resultados Se usó dexametasona (Dex) y anticuerpo anti-TNF-a de ratón como control positivo, PBS como control de vehículo y CVAM como anticuerpo de control negativo. Todos los tratamientos se iniciaron el día 12 del estudio, durante el desarrollo de la enfermedad articular. En el día 22 del estudio, la incidencia de la enfermedad en los animales de control de la enfermedad tratados con vehículo fue del 100 %. Los grupos de control negativo tratados con el vehículo o anticuerpo CVAM tenían los puntajes clínicos más altos. Se observaron puntuaciones clínicas significativamente reducidas para los grupos tratados con Dex (p<0.05 para d18-d26), 5 mg/kg de anticuerpo anti-TNF-a (p<0.05 para d 18-26), o 25 mg/kg de mAb 5429 (p<0.05 para d18-d23 y d25-d26) (Figura 15). Las puntuaciones clínicas de artritis expresadas como el área bajo la curva (AUC) se redujeron significativamente ante el tratamiento con 25 mg/kg del mAb 5429 (reducción del 43 %), 5 mg/kg de anticuerpo anti-TNF-a (52 %) o Dex (69 %) en comparación con los controles de vehículo. La Figura 16 muestra las medias y las desviaciones estándar de las AUC para cada grupo.
Además, se evaluaron los efectos histopatológicos de los tratamientos. La resorción ósea de las patas se redujo significativamente por el tratamiento con 25 mg/kg del mAb 5429 (47 % de disminución) en comparación con los controles de vehículo. Los ratones de control positivo tratados con anticuerpo anti-TNF-a habían reducido significativamente la inflamación de las patas (33 %), el daño en el cartílago (38 %) y las puntuaciones sumadas de las patas (37 %). El tratamiento con Dex redujo significativamente todos los parámetros histopatológicos de las patas (reducción del 73 % de las puntuaciones sumadas).
Estos datos demuestran que los antagonistas de anticuerpos del TLR3 mejoran los síntomas clínicos e histopatológicos de la enfermedad en el modelo CIA, y sugieren el uso de antagonistas del TLR3 para el tratamiento de la artritis reumatoide.
EJEMPLO 13 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 protegen de las infecciones virales letales agudas Modelo Se usó un modelo de exposición al virus de la influenza A como modelo de infección viral letal aguda.
En los días -1, 4, 8 y 12, ratones C57BL/6 hembra (12 semanas de edad) o ratones TLR3KO hembra (fondo C57BL/6; 12 semanas de edad, ACE Animáis, inc., 15 ratones por grupo) recibieron 20 mg/kg del mAb 5429 o PBS solo por vía subcutánea. En el día 0, los ratones se anestesiaron con isoflurano y recibieron, por vía intranasal, el virus de la influenza A/PR/8/34 (ATCC, Rockland, MD, núm. de lote 218171) en 25 ml de PBS (equivalente a 10555 CEID50). Los animales se observaron dos veces al día para evaluar la supervivencia y los cambios en el peso corporal durante el período de 14 días. Se usó un sistema de puntuación clínica para evaluar el nivel de progresión de la enfermedad y los mejoramientos sutiles en respuesta al tratamiento del virus de la Influenza A.
Puntuaciones clínicas 0 - normal, alerta y reactivo, sin signos visibles de enfermedad 1 - pelaje rizado, con o sin reducción leve de la deambulación 2 - pelaje rizado, postura encorvada al caminar, deambulación renuente, dificultad para respirar 3 - pelaje rizado, dificultad para respirar, ataxia, temblor 4 - pelaje rizado, incapacidad para deambular con un empujón suave, inconsciencia, se siente frío al tacto 5 - encontrado muerto Resultados En el estudio se evaluaron supervivencia, puntuaciones clínicas diarias y cambios en el peso corporal. Tanto los ratones WT infectados con influenza A que recibieron mAb 5429 (20 mg/kg) como los TLR3KO infectados con influenza A que no recibieron mAb 5429 mostraron un aumento estadísticamente significativo de la supervivencia (p<0.001 y p<0.01, respectivamente) en comparación con los ratones C57BL/6 inoculados con el virus de la influenza, lo que indica que el antagonismo o la deficiencia del TLR3 puede prevenir la mortalidad inducida por la influenza (Figura 17). Las puntuaciones clínicas se redujeron significativamente en el grupo que recibió 20 mg/kg del mAb 5429, así como en el grupo TLR3KO (Figura 18). El peso corporal de los ratones se observó durante un período de 14 días despues de la administración del virus de la influenza. El peso corporal disminuyó constantemente en los ratones C57BL/6 dosificados con el virus de la influenza A. Sin embargo, tanto los ratones C57BL/6 dosificados con 20 mg/kg del mAb 5429 como los ratones TLR3KO mostraron un peso corporal significativamente mayor con respecto a los ratones C57BL/6 WT inoculados con el virus de la influenza (Figura 19). Estos resultados demostraron que en un modelo de infección aguda letal por el virus de la influenza los antagonistas de anticuerpos del TLR3 reducen los síntomas clínicos y la mortalidad, y sugirieron que los antagonistas del TLR3 pueden proporcionar protección para los humanos en estados infecciosos agudos.
EJEMPLO 14 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 mejoran la hiperqlucemia y reducen la insulina plasmática Modelo Se usó el modelo de obesidad inducida por la dieta (DIO) como modelo de obesidad, y de hiperglucemia y resistencia a la insulina.
Animales C57BL/6 WT (aproximadamente 3 semanas de edad, Jackson Labs) y animales TLR3KO (fondo C57BL/6; aproximadamente 3 semanas de edad, Ace Animáis, Inc.) se mantuvieron a una dieta rica en grasas durante 12 a 16 semanas. Los ratones TLR3KO y C57BL/6 WT se alimentaron con dieta de pienso normal o rica en grasas (Purina TestDiet, núm. cat. 58126) que consiste en 60.9 % kcal de grasas y 20.8 % kcal de carbohidratos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h, con agua y alimentos ad libitum. El peso de cada ratón en cada grupo se midió semanalmente. El mAb 5429 se administró por vía intraperitoneal a una dosis de dos veces por semana en la primera semana y, posteriormente, una vez por semana por un total de 7 semanas. Para la determinación de insulina en los puntos temporales indicados se usaron muestras sericas en ayunas de sangre retrorbital. Las pruebas de tolerancia a la glucosa se realizaron en la semana 7 mediante la administración intraperitoneal de glucosa a razón de 1.0 mg/g de peso corporal después de un ayuno durante la noche. Además, se midieron los niveles de insulina y glucosa en ayunas.
El HOMA-IR (modelo hemostático de resistencia a la insulina) se determinó a partir de la ecuación basada en los niveles de glucosa y los niveles de insulina en ayunas (12) mediante la ecuación siguiente: HOMA-IR = ((glucosa en ayunas (mmol/l) x insulina en ayunas (mU/l))/ 22.5 (Wallace et al., Diabetes Care 27:1487-1495, 2004). La glucemia en ayunas (BG) se determinó mediante el ensayo de la glucosa oxidasa. Los niveles de insulina en ayunas se determinaron mediante el kit ELISA para insulina de rata/ratón (Crystal Chem, núm. catálogo 90060).
Resultados Despues de 12 a 16 semanas de dieta rica en grasas, los animales DIO WT fueron hiperglucémicos y hiperinsulinémicos. Después del tratamiento con el mAb 5429, la tolerancia a la glucosa mejoró en los animales DIO WT, pero no en los animales DIO TLR3KO. A los 60, 90, 120 y 180 minutos, y en comparación con el control (de PBS solo), se observaron niveles de glucosa en sangre significativamente reducidos en los animales tratados con el mAb 5429 después de la exposición a la glucosa (Figura 20A). En comparación con los ratones DIO WT que no recibieron mAb, se observó una reducción de aproximadamente 21 % del AUC en los animales DIO WT tratados con mAb 5429. Los niveles de insulina en ayunas también se redujeron en los animales DIO WT tratados con mAb 5429 (Figura 21). Los animales DIO TLR3KO no mostraron una mejoría de la insulina en ayunas tras el tratamiento con mAb 5429. El análisis de la evaluación del modelo homeostático (HOMA) indicó una mejoría de la sensibilidad a la insulina en los animales DIO WT tratados con el mAb 5429, pero no en los animales DIO TLR3KO. Los valores de la HOMA-IR fueron 14.0+9.8, 8.7+4.9, 9.0+3.0 para animales DIO WT, 5 mg/kg de mAb 5429 para animales DIO WT, y 20 mg/kg de mAb 5429 para animales DIO WT, respectivamente. No se observó ningún efecto en animales DIO TLR3KO.
El estudio demostró que los antagonistas de anticuerpos del TLR3 mejoraron la resistencia a la insulina y redujeron la glucosa en ayunas en el modelo DIO sin perdida de peso, lo que sugiere que los antagonistas del TLR3 pueden ser beneficiosos para el tratamiento de la hiperglucemia, la resistencia a la insulina y la diabetes tipo II.
EJEMPLO 15 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 protegen de bacterias v respuestas inflamatorias inducidas por virus Reactivos Las cepas no tipificables de Haemophilus influenza (NTHi) 35, aisladas de un paciente de COPD con exacerbaciones bacterianas, se obtuvieron del Dr. T. F. Murphy (Buffalo VA Medical Center, Buffalo, NY). El rinovirus humano 16 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) con TCID(50)=2.8 x 107/ml.
Ensayos de estimulación por NTHi Se sembraron celulas NHBE (Lonza, Wakersville, MD) en placas de cultivo tisular Microtest de 96 pocilios (BD Biosciences, Bedford, MA) a razón de 1 x 105/pocillo. Las NTHi que crecieron en placas de agar durante 16-20 horas se resuspendieron en medio de crecimiento a ~2 x 108ufc/ml, se trataron con 100 mg/nnl de gentamicina durante 30 min y se añadieron a razón de ~2 x 107/pocillo a placas de 96 pocilios que contenían las células NHBE. Después de 3 horas, los sobrenadantes se retiraron y se reemplazaron con medio de crecimiento fresco con o sin anticuerpos (concentración final de 0.08 a 50 pg/ml). Después de 24 horas de incubación adicional, la presencia de citocinas y quimocinas en los sobrenadantes celulares se analizó por triplicado con un kit para microesferas Cytokine 25-plex AB humano (que incluye IL-1 b, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-y, GM-CSF, M!P-1a, MIR-1b, IP-10, MIG, Eotaxin, RANTES y MCP-1) (Life Technologies, Carslbad, CA) en el analizador de fluorescencia multiplex y sistema de lectura Luminex 100IS (Luminex Corporation, Austin, TX).
Ensayos de estimulación por rinovirus Se sembraron células NHBE en placas de cultivo tisular Microtest de 96 pocilios (BD Biosciences, Bedford, MA) a razón de 1 x 105 células/pocillo. Al día siguiente se añadieron anticuerpos (concentración final de 0.08 a 50 pg/ml) a las células NHBE o BEAS-2B y se incubaron durante 1 hora, seguido de la adición de 10 ml/pocillo de rinovirus. Después de 24 horas de incubación adicional, la presencia de citocinas y quimocinas en los sobrenadantes celulares se determinó por ensayos Luminex como se describió anteriormente.
Resultados El mAb 15EVQ inhibió la producción de IP-10/CXCL10 y RANTES/CCL5 inducida por NTHi de una manera dependiente de la dosis, mientras que el anticuerpo de control, lgG4 humana (Sigma, St. Louis, MO), no mostró ningún efecto inhibidor en la estimulación por NTHi (Figura 22A). Además, el mAb 15EVQ inhibió la producción de CXCL10/IP-10 y CCL5/RANTES inducida por rinovirus (Figura 22B).
EJEMPLO 16 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 deprimen las respuestas inflamatorias en astrocitos Metodos Se sembraron astrocitos humanos normales provenientes de 2 donantes (Lonza, Walkersville, MD) en una placa de 24 pocilios a razón de 75,000 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. El día siguiente, los astrocitos se trataron con 200 ng/ml de poli(l:C) y/o 10 mg/ml del mAb 18 durante 24 horas. Las citocinas se midieron por Luminex.
Resultados La producción de IL-6, IL-8, IL-12, IFN-a, IFN-g, CXCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CCL4, CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10 inducida por poli(l:C) resultó inhibida por el mAb 18, como se muestra en la Tabla 10.
TABLA 10 *ol: Por encima del nivel de detección **bl: Por debajo del nivel de detección EJEMPLO 17 Los antagonistas de anticuerpos del TLR3 deprimen las respuestas inflamatorias en celulas endoteliales Métodos Se cultivaron células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) en un medio de crecimiento que contenía suero, recomendado por Lonza. Las células se resuspendieron en medio libre de suero (Lonza, Walkersville, MD), se sembraron en placas de 96 pocilios a razón de 3x105 células/ml y se incubaron a 37 °C, 5 % de C02 durante 24 h. Se añadió poli(l:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) a concentraciones crecientes (1.5 a 100 mg/ml) y se incubó por otras 24 horas a 37 °C. Para los ensayos de inhibición de citocinas, el mAb 15EVQ se añadió a las células a diversas concentraciones (0 - 50 pg/ml) y se incubó durante 30 min, después de lo cual se añadió 20 pg/ml de poli(l:C) durante 24 horas. Los sobrenadantes celulares se recolectaron y los niveles de citocina se midieron mediante el kit para citocina humana 30-plex y teenología MAP de Luminex (Invitrogen Corp., Carslbad, CA). Para medir la expresión de la slCAM-1, las células HUVEC se trataron con 20 pg/ml de poli(l:C) y diversas concentraciones del mAb 15EVQ (0.8 - 50 pg/ml). Los sobrenadantes celulares se analizaron para evaluar la expresión de la slCAM-1 por ELISA (R&D systems). La viabilidad celular se midió con el kit CelITiterGIo (Promega, Madison, Wl).
Resultados Las celulas HUVEC produjeron las citocinas siguientes en respuesta al poli(l:C): IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CXCL8/IL-8, IL-12 (p40 70), IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-g, GM-CSF, CCL3/MIP-1a, 00?4/MIR-1b, CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, VEGF, G-CSF, FGF-básico y HGF (Tabla 11). El mAb 15EVQ redujo, de una manera dependiente de la dosis, los niveles de todas las citocinas inducidos por el poli(l:C) (Tabla 12). La capacidad del mAb 15EVQ para reducir la producción inducida por el poli(l:C) de TNF-a, CCL2/MCP-1 , CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10 sugirió que la inhibición de las actividades mediadas por el TLR3 puede proteger contra la infiltración de leucocitos y células T que puede conducir a la aterosclerosis. Además, la inhibición del VEGF por el mAb 15EVQ sugirió un posible beneficio de bloqueo del TLR3 en patologías mediadas por el VEGF, que incluyen la angiogénesis en una variedad de cánceres y enfermedades oculares, tales como la degeneración macular relacionada con la edad.
El TNF-a e IFN-g cumplen una función en el reclutamiento de leucocitos y el aumento de la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio activado (Doukas et al., Am. J. Pathol. 145:137-47, 1994; Pober etal., Am. J. Pathol. 133:426-33, 1988). CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10 han estado implicados en el reclutamiento de monocitos y células T, y contribuyen al desarrollo de la aterosclerosis (Lundgerg et al., Clin. Immunol. 2009). La generación del VEGF por células endoteliales se ha relacionado con tumores o el crecimiento tisular anormal en una variedad de tipos de cáncer durante la angiogenesis (Livengood et al., Cell. Immunol.249:55-62, 2007).
TABLA 11. concentraciones mostradas como pg/ml La molecula soluble de adherencia intercelular tipo 1 (slCAM-1) se genera por clivaje proteolítico y es un marcador para la activación de células endoteliales. La ICAM-1 desempeña una función clave en la migración y activación de leucocitos, y está sobreregulada en las células endoteliales y células epiteliales durante la inflamación, donde actúa como mediador de la adhesión a leucocitos a través de las moléculas de integrina LFA-1 y Mac-1. El poli(LC) activó las celulas endoteliales para sobreregular la expresión de la slCAM-1, y la sobreregulación resultó reducida por el tratamiento con el mAb 15EVQ (Figura 23A).
TABLA 12 O ooI * Indica valores de p significativos (menores que 0.05) que comparan la concentración del mAb15 frente a poli(IC) solo * Los valores son medias (pg/ml) ± SEM Esto sugirió que los antagonistas de anticuerpos del TLR3 pueden inhibir el tráfico de leucocitos y, por lo tanto, el daño tisular provocado por la afluencia de células inflamatorias.
Para los ensayos de viabilidad, las HUVEC se cultivaron, sembraron y estimularon con poli(l:C) como se describió anteriormente. El mAb 15EVQ restauró, de una manera dependiente de la dosis, la reducción de la viabilidad de las células HUVEC inducida por el poli(l:C) (Figura 23B).
La submodulación de la activación de células endoteliales puede deprimir la infiltración excesiva de células inmunes y reducir el daño tisular provocado por citocinas, que se incrementan durante las afecciones inflamatorias. La inflamación y la sobreexpresión de citocinas y moléculas de adhesión en células endoteliales son contribuyentes clave para el desarrollo de la aterosclerosis y la hipertensión. Estos datos proporcionan una justificación para explorar el posible beneficio de los antagonistas del TLR3 para usar en enfermedades de los vasos sanguíneos, que incluyen vasculitis, y en las que presentan disfunción endotelial. Otra enfermedad que se ve afectada por la inflamación y la sobreexpresión de citocinas es el sarcoma de Kaposi (KS), que es común en individuos inmunodeprimidos e infectados por el HIV, y está provocada por el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV). El VEGF y la producción de citocinas contribuyen a la supervivencia de las células del KS (Livengood et al., Cell Immunol. 249:55-62, 2007). Los antagonistas del TLR3 podrían ser beneficiosos en la reducción de los riesgos angiogénicos asociados con el KS y otros tumores, y en la prevención de la pérdida de la viabilidad celular y protección de la integridad de la barrera endotelial para evitar fugas vasculares, una afección potencialmente grave asociada con la insuficiencia orgánica y afecciones inflamatorias de posible amenaza a la vida, tales como la sepsis. El antagonismo del TLR3 puede ser beneficioso, además, en infecciones virales que involucran patologías de las células endoteliales, tales como las fiebres hemorrágicas virales provocadas por miembros de las familias flaviviridae (por ejemplo, dengue, fiebre amarilla), filoviridae (Ebola, Marburg), bunyaviridae (por ejemplo, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus) y arenaviridae (por ejemplo, fiebres hemorrágicas de Lujo, Lassa, Argentina, Bolivia y Venezuela (Sihibamiya etal., Blood 113:714-722, 2009).
EJEMPLO 18 Reactividad cruzada de antagonistas de anticuerpos del TLR3 con TLR3 cinomóloqo y murino Se evaluó la actividad contra el TLR3 cinomólogo o murino mediante el ensayo de gen reportero para ISRE como se describió en el Ejemplo 2. Se amplificaron los ADNc de TLR3 cinomólogo (SEQ ID NO: 217) y murino (SEQ ID NO: 161) a partir de sangre entera, se clonaron en el vector pCEP4 (Clontech) y se expresaron como se describió anteriormente. El mAb 15EVQ tuvo una IC50 de 4.18 mg/ml y 1.74 pg/ml en los ensayos para NF-kB e ISRE en TLR3 cinomólogo, respectivamente, en comparación con una C50 de 0.44 y 0.65 pg/ml en los ensayos para NF-kB e ISRE en TLR3 humano, respectivamente. Los anticuerpos de control de isotipo no tuvieron ningún efecto en estos ensayos.
EJEMPLO 19 La dosificación terapeutica de los antagonistas de anticuerpos del TLR3 protege de las infecciones virales letales agudas El Ejemplo 13 describe el tratamiento profiláctico (dosificado en los días -1, 4, 8 y 12) con antagonistas de anticuerpos del TLR3 contra la infección por influenza A. Este ejemplo demuestra que la dosificación terapéutica de los antagonistas de anticuerpos del TLR3 (día 3 después de la infección por influenza A tras la aparición de los síntomas clínicos) son eficaces para mejorar la supervivencia.
Modelo Se usó un modelo de exposición al virus de la influenza A como modelo de infección viral letal aguda, tal como se describe en el Ejemplo 13, excepto que la dosificación de los animales con el mAb 5249 se realizó 3 días después de la infección con la influenza A, y los animales dosificados eran de 8 semanas de edad. El mAb de control de isotipo anti-lgG1 de ratón fue de BioLegend. Los animales se dosificaron los días 3, 7 y 11 después de la infección con influenza A.
En el estudio se evaluaron supervivencia, puntuaciones clínicas diarias y cambios en el peso corporal. Tanto los ratones C57BL/6 ratones que recibieron el mAb 5249 como los ratones TLR3KO mostraron un aumento estadísticamente significativo de la supervivencia (p < 0.028 y p < 0.001, respectivamente) con respecto a los ratones C57BL/6 inoculados con el mAb de control de isotipo anti-lgG1 de ratón y el virus de la influenza (Figura 24). En los ratones C57BL/6 dosificados con el mAb 5249 y en los animales TLR3KO las puntuaciones clínicas resultaron reducidas (Figura 25) y los pesos corporales incrementados (Figura 26), en comparación con los ratones C57BL/6 dosificados con el mAb de control de isotipo antí-lgG1 de ratón y el virus de la influenza A. Estos resultados demostraron que en un modelo de infección aguda letal por el virus de la influenza, los antagonistas de anticuerpos del TLR3 reducen los síntomas clínicos y la mortalidad, y sugirieron que los antagonistas del TLR3 pueden proporcionar protección para los humanos en estados infecciosos agudos.
EJEMPLO 20 Epítopos v parátopos de antagonistas de anticuerpos del TLR3 por cristalografía de rayos X El dominio extracelular del TLR3 humano se cristalizó en complejo con los Fab del mAb 15EVQ, mAb 12QVQ/QSV y mAb C1068.
Metodos Expresión y purificación de proteínas La expresión y purificación del ECD TLR3 (aminoácidos 1-703 de la SEQ ID NO: 2) los tres Fab fueron como se describió anteriormente.
Preparación del complejo cuaternario ECD TLR3-tres Fab Se mezcló 4 mg del ECD TLR3 humano con 2.4 mg de cada Fab y se incubó a 4 °C durante 3.5 h, lo que correspondió a una relación molar de 1 ECD TLR3:1.1 Fab. El complejo se purificó por cromatografía de intercambio aniónico en una columna MonoQ 5/50 GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), equilibrada con 20 mM de Tris pH 8.5, 10 % de glicerol (regulador A) y se eluyó con 20 mM de Tris pH 8.5, 10 % de glicerol y NaCI 1 M (regulador B). Aproximadamente 2.48 mg del complejo en 1.74 mi se diluyó hasta 10 mi con regulador A, se cargó en la columna a razón de 1 ml/min y se eluyó con un gradiente lineal de 0-40 % de B durante 40 volúmenes de columna. Se realizaron cinco rondas consecutivas de purificación. Las fracciones del pico 1 se agruparon, se concentraron con un Amicon-15 mL Ultra-30000 MWCO y un Microcon 30000 MWCO a 14.49 mg/ml en 20 mM de Tris pH 8.5, 27 mM de NaCI, 10 % de glicerol (coeficiente de extinción: A2ao (1 mg/ml) = 1.31).
Cristalización El análisis de cristalización automatizado se realizó mediante el robot automático de cristalización de proteínas Oryx4 (Douglas Instruments) que dosificaba volúmenes iguales de proteína y solución del reservorio en un formato de gota posada mediante el uso de la placa Corning 3550 (Corning Inc., Acton, MA). El análisis inicial fue con una Crystal Screen HT de Hampton (HR2-130, Hampton Research, Aliso Viejo, CA). Se usaron cristales pequeños procedentes de varias condiciones para generar la siembra, la que después se usó en el análisis basado en matriz de microsembrado (MMS). Se realizaron varias rondas de refinado basadas en las condiciones del análisis inicial que dieron cristales pequeños. Las condiciones del reservorio usadas en el MMS se basaron en las que dieron cristales pequeños después de refinado: 18-28 % de polietilenglicol (PEG) 3350, LiCI 1M, pH 4.5 y (NH4)2SO42.0-2.9 M, 5 % PEG400, pH 4.5 y se exploraron el pH y diferentes aditivos. El análisis por cristalización por MMS se realizó mediante el robot automático de cristalización de proteínas Oryx4 (Douglas Instruments) por medio de dispensar componentes en la relación de volumen siguiente: 1 solución de proteína: 0.25 materia prima de siembra: 0.75 solución del reservorio. Los cristales que difractaron a una resolución de ~10-Á crecieron en acetato sódico 0.1 M, pH 4.5, (NH4)2S04 2.9 M, 5 % de metil-pentano-diol (MPD) y acetato sódico 0.1 pH 4.5, 26 % PEG3350, LiC1 1 M.
En un intento de mejorar la resolución de los cristales, se combinó el MMS en las condiciones anteriores con el análisis de aditivos mediante el uso de componentes seleccionados de la Additive Screen HR2-428 de Hampton (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) en la relación de volumen siguiente: 1 solución de proteína: 0.125 materia prima de siembra: 0.2 solución de aditivo: 0.675 solución del reservorio. Después de aplicar una combinación de MMS y análisis de aditivos de una solución que contenía acetato sódico 0.1 M pH 4.5, 28 % de PEG 3350, LiCI 1 M y Gly-Gly-Gly30 mM, se obtuvieron cristales de calidad de rayos X del ECD TLR3 acomplejado con los Fab, que difractó a una resolución de ~5 A.
Recolección de datos de rayos X del complejo cuaternario ECD TLR3 Para la recolección de datos de rayos X, se impregnó un cristal (tamaño ~1.0 x 0.5 x 0.1 mm3) durante unos segundos en un licor madre sintetico (acetato sódico 0.1 M, pH 4.5, 28 % de PEG 3350, LiCI 1 M, 16 % de glicerol) y se congeló instantáneamente en corriente de nitrógeno a 100 K. Los datos de difracción de rayos X se recolectaron y procesaron con un generador de rayos X de microfoco MicroMax™-007HF de Rigaku, equipado con una óptica confocal Osmic™ VariMax™, detector Saturn 944 CCD y un sistema de crioenfriamiento X-stream™ 2000 (Rigaku, Woodlands, TX). Las intensidades de difracción se detectaron sobre una rotación del cristal de 250°, con un tiempo de exposición de 1 min por imagen de medio grado hasta la resolución máxima de 5 A. Los datos de rayos X se procesaron con el programa D*TREK (Pflugrath, Acta Crystallographica Section D, 55:1718-1725, 1999). El cristal pertenece al grupo espacial monoclínico C2 con los parámetros de celda unitaria: a = 214.90 A, b = 142.08 A, c = 125.04 A y b = 103.17°. La unidad asimétrica contiene 1 molécula del complejo. En la Tabla 13 se presentan las estadísticas de los datos de rayos X.
TABLA 13 Recolección de datos Grupo spacial C2 Ejes de celda unitaria (A) 214.90, 142.08, 125.04 Ángulos de celda unitaria (°) 90, 103.17, 90 Resolución (A) 30-5.0 (5.18-5.00) Núm. de reflexiones únicas 15,877 (1589) Terminación (%) 99.8 (99.6) Redundancia 5.2 (4.9) R r union a 0.121 (0.312) <I/s > 7.1 (2.9) Refinado de la estructura Resolución (A) 29.4-5.0 Rcristalina/Rlibre (%) 26.8/30.0 Núm. de reflexiones Grupo de trabajo 15,792 Grupo de prueba (5% data) 788 Rmsd de valores ideales Longitud de enlace (A) 0.007 Ángulos de enlace (°) 0.744 Número de átomos de proteínas 15,442 Rmsd de valores ideales c Regiones favorecidas (%) 93.1 Permitidas (%) 98.8 Prohibidas (%) 1.2 Determinación de la estructura La estructura cristalina del ECD TLR3 - Fab 15EVQ - Fab 12QVQ/QSV - Fab c1068 se determinó por reemplazo molecular mediante el uso de Phaser (Read, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57:1373-1382, 2001). Los modelos de búsqueda fueron estructura de ID 1ziw del ECD TLR3 (Protein DataBank (PDB) con todos los glicanos retirados, Choe et al., Science 309:581-585, 2005) y con las estructuras cristalinas de alta resolución de los tres Fab determinadas (ver un resumen de los datos de cristales y estadísticas de refinado para estas estructuras Fab en la Tabla 13). Se comprobó que el ángulo del codo del Fab 12QVQ/QSV se desviaba significativamente del de la forma libre. Se generó una serie de modelos del Fab 12QVQ/QSV mediante el ajuste del ángulo del codo a intervalos de ~5°, uno de los cuales demostró tener buena concordancia con la densidad electrónica. El refinado de la estructura se realizó con PHENIX (Adams et al., J. Synchrotron Radiat. 11:53-55, 2004). La estructura se refinó como dominios de cuerpo rígido (cada dominio V o C) para los Fab y 13 segmentos rígidos (definiciones usadas en el refinado: 30-60, 61-108, 109-156, 157-206,207-257,258-307,308-363,364-415,416-464,465-514,515- 570,571-618,619-687) para el ECD TLR3 con un factor B para cada Fab de cuerpo rígido y un B simple para la totalidad del ECD TLR3.
Se introdujo el metodo de refinado TLS (Translation/Libration/ Screw) para cada uno de los cuerpos rígidos del Fab y el ECD TLR3 se dividió en 2 segmentos de TLS en el residuo 330 de la SEQ ID NO: 2. La densidad de glicanos fue visible en 10 de los 15 sitios de N-glicosilación. Después se añadieron los modelos de carbohidratos de la estructura cristalina del dominio extracelular del TLR3 humano (Choe et al., Science 309:581-585, 2005, ID de estructura del PDB: 1ziw). La densidad de un segmento corto faltante en el ECD TLR3 (residuos 337-342 de la SEQ ID NO: 2) fue visible después del refinado del cuerpo rígido, y se completó con el segmento correspondiente de la estructura extracelular del TLR3, 2a0z (Bell et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 102:10976-10980, 2005, ID de estructura del PDB: 2a0z). El C-terminal del ECD TLR3 contenía una densidad adicional que coincide con la del 2a0z. Despues, este segmento (647-703 de la SEQ ID NO: 2) se reemplazó con (los residuos 647-687) del 2a0w. Por lo tanto, el modelo ECD TLR3 era un híbrido entre las estructuras 1ziw y 2a0z del TLR3 y refinado como 13 segmentos de cuerpo rígido (intervalo de aminoácidos: 30-60,61-108,109-156,157-206,207-257,258- 307,308-363,364-415,416-464,465-514,515-570,571-618,619-687).
La LCDR3 del Fab 12QVQ/QSV adoptó, aparentemente, una conformación diferente de su forma libre. Se realizó un templado simulado multiarranque con parámetros estándar en PHENIX. Los modelos de esta LCDR3 se inspeccionaron visualmente en el mapa de densidad electrónica y se injertó la conformación de “mejor coincidencia” en el modelo original. El proceso de refinado se monitoreó por Ri¡bre contra el 5 % de las reflexiones descartadas antes de iniciar los cálculos. En la ronda final, se incluyó un factor B para cada residuo. La inspección del modelo y la reconstrucción manual de las regiones del codo de los Fab y las cadenas laterales en las interfases proteína-proteína se realizaron mediante COOT (Emslcy et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.60:2126-32, 2004). Los RCr¡staiina y Rnbre finales fueron 26.8 % y 30.0 %, respectivamente, para las 15,792 reflexiones independientes hasta 5.0 h. En las Tablas 13 y 14 se presentan las estadísticas de refinado.
Resultados Estructura molecular del complejo cuaternario ECD TLR3-tres Fab En las Figuras 27A y 27B se muestran la estructura molecular general del complejo. En la unidad asimetrica hay un ECD TLR3 y una molécula de cada Fab. El modelo estructural del ECD TLR3 incluye todos los residuos, del 30 al 687, del huTLR3 (SEQ ID NO: 2). En el caso de los tres Fab, se incluyeron todos los residuos de sus respectivas formas no unidas, excepto los iones de disolvente y las moléculas de agua. Respecto de la topología general, la molécula del ECD TLR3 es muy similar a las estructuras informadas previamente (rmsd de 0.79 A para 1ziw, 613 Ca’s y 1.37 Á para 2a0z, 595 Ca’s). Las estructuras de los Fab son todas idénticas a sus respectivas formas no unidas, excepto para la LCDR3 del Fab 12QVQ/QSV como se describe en la sección Métodos, así como las regiones de codo y algunas cadenas laterales en las interfases ECD TLR3/Fab.
TABLA 14.
Recolección de datos Fab 12QVQ/QSV Fab 15EVQ Fab C1068 Grupo espacial P2i P2i P2i Dimensiones de la celda a, b, c (Á) 75.83, 80.35, 83.06 54.68, 74.74, 64.99 82.48, 136.94, 83.25 a, b, Uq 90, 115.24, 90 90, 103.69, 90 90, 11495, 90 Resolución (A) 70-2.5 (2.59-2.50) 49-2.2 (2.28-2.20) 50-1.9 (2.0-1.9) Reflexiones únicas 27,785 (1653) 24,439 (1859) 117,490 (5916) Terminación (%) 88.5 (53) 94.2 (72.8) 89.3 (45.2) Redundancia 4 (1.8) 5.2 (4.3) 3.2 (2) D reunió , a n 0.164 (0.297) 0.088 (0.445) 0.065 (0.264) <1/ s > (No promediados) 2.9 (1.2) 3.8 (1.4) 5.7 (1.6) Refinado de la estructura Resolución (A) 15-2.5 (2.56-2.50) 15-2.2 (2.26-2.20) 75.38-1.90 (1.94-1.90) Rcristal¡na/R|¡bre(%) 19.7/25.4 (30.8/40.8) 19.3/26.9 (24.6/31.1) 20.4/27.7 (39.8/51.1) Núm. de reflexiones Grupo de trabajo 26,723 23,308 111,413 Grupo de prueba 882 1,008 5,917 Número de átomos Proteínas 7,046 3,705 13,421 Disolvente (agua, etc.) 486 333 1,779 RMSD bond lengths (A) 0.012 0.013 0.023 RMSD bond angles (°) 1.6 1.5 2 Ramachandran plot 0 Regiones favorecidas (%) 92.3 96.8 97.2 Permitidas (%) 98.9 99.3 997 Prohibidas (%) 1.1 0.7 0.3 Los valores de la capa de mayor resolución figuran entre ()’s. a union = å|l - <l>| / ål, en donde | es la intensidad de la reflexión medida y <|> es la intensidad media de todas las mediciones de esta reflexión b= Rcr¡staiina= å ||F0bs| - |FCaic|| / å |F0bs|, en donde F obs- Y Fcaic Son los factores de estructura observados calculados para un cojunto del 5 % de las reflexiones elegidas aleatoriamente de antes del refinado 0 El gráfico de Ramachandran se calculó con MolProbity (Davis, I.W., et al., Nucleic Acids Res, 32: W615-9, 2004).
Epítopos v parátopos En la Figura 27B se muestran los residuos involucrados en la unión entre el ECD TLR3 y los tres Fab. El Fab 12QVQ/QSV se une cerca del extremo N-terminal del ECD TLR3. El epítopo conformacional se compone de residuos de las LRR 3-7 del TLR3 (aminoácidos 100-221 de la SEQ ID NO: 2. La unión de Fab 12QVQ/QSV se entierra aproximadamente 928 A2 y 896 Á2 en el antígeno y el anticuerpo, respectivamente. En el caso del Fab 12QVQ/QSV, la estructura cristalina identificó los siguientes residuos de epítopo del TLR3 (SEQ ID NO: 2): S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141 , V144, K145, T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195 y A219. En el caso del Fab 12QVQ/QSV, la estructura cristalina identificó los residuos de parátopo siguientes: cadena ligera (SEQ ID NO: 211): G28, S29, Y30, Y31, E49, D50, Y90, D91 y D92. Cadena pesada (SEQ ID NO: 214): N32, Q54, R56, S57, K58, Y60, Y104, P105, F106 y Y107.
El Fab 15EVQ y Fab c1068 se unen a epítopos no superpuestos que abarcan las LRR 15-23 (aminoácidos 406-635 de la SEQ ID NO: 2) cerca del C-terminal (Figuras 27A y 27B). El Fab 15EVQ se entierra 1080 Á2 y 1064 A2 en el antígeno y el anticuerpo, respectivamente, mientras que el Fab c1068 se entierra 963 A2 y 914 A2 en el antígeno y el anticuerpo, respectivamente. El epítopo del Fab 15EVQ cubre los residuos K416, K418, L440, N441 , E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541 , S571, L595 y K619 del TLR3 que se muestran en la SEQ ID NO: 2. En el caso del Fab 15EVQ, la estructura cristalina identificó los residuos de parátopo siguientes: cadena ligera (SEQ ID NO: 41): Q27, Y32, N92, T93, L94, y S95. Cadena pesada (SEQ ID NO: 216): W33, F50, D52, D55, Y57, N59, P62, E99, Y101, Y104 y D106.
En el caso del Fab c1068, la estructura cristalina identificó los siguientes residuos de epítopo en el TLR3 (SEQ ID NO: 2): E446, T448, Q450, R453, R473, N474, A477, L478, P480, S498, P499, Q503, P504, R507, D523, D524, E527, E530 y K559. En el caso del Fab c1068, la estructura cristalina identificó los residuos de epítopo siguientes cadena ligera: H30, N31, Y32, N50, E66, S67, G68 (glyc). Cadena pesada: T30, T31, Y32, W33, H35, E50, N52, N54, N55, R57, N59, V99, M102, 1103 y T104.
Mecanismos de neutralización e implicación de la función del TLR3 mAb 15EVQ: el epítopo del mAb 15EVQ contiene los residuos del TLR3 N517, H539 y N541, que se superponen con el sitio de unión del ARNbc en C-terminal (Bell et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:8792-7, 2006). Por lo tanto, sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que el mAb 15EVQ compite por la unión al TLR3 contra su ligando e impide la dimerización del receptor inducida por el ligando, la cual se requiere para la formación de la unidad de señalización (Liu et al., Science 320:379-81, 2008). Las Figuras 27A y 27B ilustran este mecanismo de competencia directa del mAb 15EVQ. En función de la concentración del anticuerpo, este mecanismo conduciría a la inhibición total del poli(l:C) o la activación del TLR3 inducida por el ARNbc. mAb 12QVQ/QSV v mAb c1068: como se muestra en las Figuras 29A-29C, estos dos anticuerpos no tienen choques directos con el ligando del ARNbc. Por lo tanto, es poco probable que neutralicen la función del TLR3 en un mecanismo similar al del mAb 15EVQ. Además, los fragmentos Fab están orientados lejos del ligando (Figuras 29A-29C). Estructuralmente, el mAb 12QVQ/QSV y el Fab C1068 se pueden unir a una unidad de señalización (SU) sin alterar su función. Estericamente, es poco probable que las dos fragmentos Fab de una molécula del mAb puedan unirse simultáneamente a las dos moléculas del TLR3 en una SU y, por lo tanto, impedir la dimerización del TLR3 mediada por el ARNbc. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que la unión del mAb 12QVQ/QSV o el mAb c1068 al TLR3 impide la aglomeración de la unidad de señalización debido a choques estéricos entre los anticuerpos y las unidades de señalización vecinas. La unión del TLR3 al ARNbc no se limita a la unidad de señalización definida por el complejo ARNbc:TLR3 (Liu, et al., Science, 320: 379-81, 2008). Es posible que la aglomeración de múltiples SU pueda conducir al mejoramiento de la señalización, o que la señalización eficiente del TLR3 requiera de esta aglomeración. La ubicación del mAb 12QVQ/QSV y el mAb C1068 puede bloquear la aglomeración y dar como resultado la neutralización de la actividad del TLR3. Por lo tanto, los efectos neutralizantes máximos de los anticuerpos dependerían del grado de separación de las SU debido a la unión de los anticuerpos. Como se ilustra en las Figuras 29A-29C, el mAb 12QVQ/QSV provocaría una mayor separación que el mAb C1068, y esto podría traducirse en una mayor potencia del mAb 12QVQ/QSV. Esto es consistente con las observaciones de que, a concentraciones de saturación, el mAb c1068 y el mAb 15EVQ pueden conducir a ~50 % y 100 % de neutralización del TLR3, respectivamente, mientras que el mAb 12QVQ/QSV exhibe una actividad intermedia. Por lo tanto, la combinación de los estudios estructurales y de neutralización del TLR3 sugiere un modelo de señalización del TLR3 en el cual las unidades de señalización ARNbc:TLR3 se aglomeran para lograr una señalización eficiente. Además, el mAb 12QVQ/QSV y el mAb C1068 definen una clase de anticuerpos que pueden modular parcialmente la señalización del TLR3 sin interferir con la unión de ligandos o la dimerización del receptor.
EJEMPLO 21 La deficiencia del TLR3 mejora los perfiles lipidíeos v la esteatosis hepática Modelo Se obtuvieron ratones TLR3/_ del Dr. Richard A. Flavell (Yale University) y como se describió previamente (Shulman, J. Clin. Invest. 106:171-6, 2000). Los ratones TLRS^ y los de control (C57BL/6) de tipo silvestre (WT) se alimentaron con una dieta de pienso normal o rica en grasas (HFD) (Purina TestDiet núm. 58126) que consiste en 60.9 % kcal de grasas y 20.8 % kcal de carbohidratos. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h, con agua y alimentos ad libitum. El peso de cada ratón se midió semanalmente; los datos se presentan como medias ± SD. Se tomaron muestras de hígado para el aislamiento de ARN y el análisis histológico.
Los niveles plasmáticos de colesterol total (TC), HDL, LDL y trigliceridos (TG) se midieron mediante un instrumento de química clínica (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, West Caldwell, NJ). Los niveles de ácidos grasos libres (FFA) se determinaron mediante un kit NEFA (Wako Chemicals, Richmond, VA). La preparación de las muestras y los ensayos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
El RNA total de hígado se sometió a transcripción inversa con hexámeros aleatorios mediante el uso del kit TaqMan de reactivos de transcripción inversa (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las sondas TaqMan y los iniciadores se adquirieron de Life Technologies, Carlsbad, CA. Para el análisis de la expresión génica, se examinó un total de 35 genes involucrados en el metabolismo de lípidos y glucosa, como así también en la inflamación. La cuantificación relativa de la expresión génica se realizó mediante el uso de los cálculos 2-DeltaDeltaCt (Arocho et al., Diagn. Mol. Pathol. 15:56-61 , 2006).
Para la histología, se aislaron los hígados y se determinó el peso húmedo. Las muestras de hígado se fijaron en 10 % de formalina en regulador neutro, se procesaron para cortes rutinarios de parafina y se tiñeron con HE.
El nivel de adiposidad hepática se determinó mediante evaluación histológica. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitncy.
Resultados Los animales alimentados con una HFD presentaron hiperinsulinemia e hiperglucemia despues de 26 semanas de HFD (ver los puntos de datos para 14 semanas en el ejemplo 14). Los perfiles lipidíeos se examinaron a las 33 semanas. Los ratones TLRS^ con dieta de pienso tenían un nivel plasmático de TG significativamente menor, pero niveles de TC, HDL, LDL, (Tabla 15) y FFA similares en comparación con los controles WT. Con HFD a las 33 semanas, los animales WT de control mostraron niveles plasmáticos elevados de TC, HDL y LDL, mientras que los ratones TLR3/_ estuvieron parcialmente protegidos (Tabla 15). Los pesos de los hígados (normalizados al peso corporal respectivo) se redujeron -16 %, p<0.05 en ratones TLR3/_ alimentados con HFD en comparación con los de los animales WT con HFD. El análisis histológico indicó que los animales TLR37 con HDF habían reducido significativamente, además, la acumulación de lípidos en el parénquima hepático en comparación con los animales WT.
La expresión hepática de genes clave involucrados en el metabolismo de lípidos y el colesterol, LXRa y PPARd, estaba sobreregulada (30 %, p<0.05 y 186 %, p<0.001, respectivamente) en ratones TLR3_/ alimentados con HFD, en comparación con los animales WT, lo que es consistente con los menores niveles de lípidos en los ratones deficientes en TLR3. Los genes LXRa objetivo ABCA1 y SREBP1 tambien estuvieron sobreregulados (71 %, p<0.01 y 131 %, p<0.001, respectivamente) en estos animales. Se ha informado una interferencia entre la señalización del TLR y el LXR (Castrillo et al., Mol. Cell. 4:805-15, 2003). La sobreregulación del ABCA1, un transportador de colesterol, sugiere un mejoramiento en el transporte del colesterol en ratones TLRS7 alimentados con HFD.
TABLA 15 Los estudios informados en este ejemplo demostraron que los animales obesos deficientes en TLR3 mejoraron los niveles de lípidos y de colesterol en comparación con los animales de tipo silvestre, e indican que el antagonizar la señalización del TLR3 sería un enfoque terapéutico beneficioso para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y metabólicas.

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1. El uso de un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para la fabricación de un medicamento para tratar la diabetes tipo II, hiperglucemia o hiperinsulinemia en un paciente.
2. El uso de un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad cardiovascular en un paciente.
3. El uso de un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para la fabricación de un medicamento para reducir el colesterol total en un paciente.
4 El uso de un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para la fabricación de un medicamento reducir la lipoproteína de baja densidad (LDL) en un paciente.
5. El uso de un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para la fabricación de un medicamento para reducir la acumulación de grasa en el hígado en un paciente.
6. El uso como se reclama en las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 o 5, en donde el anticuerpo aislado reactivo con el anticuerpo del TLR3 comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 70, 77 y 72, y las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 67, 68 y 78.
7. El uso como se reclama en las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 o 5, en donde el anticuerpo aislado reactivo con el anticuerpo del TLR3 comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada 1 , 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 82, 86 y 84, y las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 79, 80 y 87.
8. Un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse en el tratamiento de la diabetes tipo II, hiperglucemia o hiperinsulinemia en un paciente.
9. Un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular en un paciente.
10. Un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse en la reducción del colesterol total en un paciente.
11. Un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse en la reducción de la lipoproteína de baja densidad (LDL) en un paciente.
12. Un anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse en la reducción de la acumulación de grasa en el hígado en un paciente.
13. El anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse de conformidad con la reivindicación 8, 9, 10, 11 o 12, en donde el anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 70, 77 y 72, y las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 67, 68 y 78.
14. El anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 para usarse de conformidad con la reivindicación 8, 9, 10, 11 o 12, en donde el anticuerpo aislado reactivo con el TLR3 comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 82, 86 y 84, y las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 79, 80 y 87.
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