CN104159610A - 用于治疗代谢和心血管疾病的3型toll样受体拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了3型Toll样受体(TLR3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用前述物质的方法。

Description

用于治疗代谢和心血管疾病的3型TOLL样受体拮抗剂
技术领域
本发明涉及3型Toll样受体(TLR3)抗体拮抗剂、编码TLR3抗体拮抗剂或其片段的多核苷酸以及制备并使用前述物质的方法。
背景技术
Toll样受体(TLR)通过启动响应于细菌、病毒、寄生虫以及某些情况下的宿主来源配基的信号转导级联来调控先天性免疫应答的激活并且影响获得性免疫的发展(Lancaster等人，J.Physiol.563：945-955，2005)。质膜定位的TLR、TLR1、TLR2、TLR4和TLR6，识别包括蛋白质或细菌和真菌的脂类组分在内的配基。主要的细胞内TLR、TLR3、TLR7和TLR9，分别响应于dsRNA、ssRNA和未甲基化的CpG DNA。据信TLR信号转导的失调导致了多重问题，并且针对这一轴枢的治疗策略正在开发中(Hoffman等人，Nat.Rev.Drug Discov.4：879-880，2005；Rezaei，Int.Immunopharmacol.6：863-869，2006；Wickelgren，Science312：184-187，2006)。例如，TLR4以及TLR7和9的拮抗剂正在分别针对严重败血症和狼疮而进行临床开发(Kanzler等人，Nat.Med.13：552-559，2007)。
TLR3的信号转导是通过在炎症或病毒感染期间从坏死细胞中释放出的dsRNA、mRNA或RNA来激活的。TLR3激活诱发了干扰素和促炎性细胞因子的分泌并且触发了免疫细胞活化以及募集，其在某些微生物感染期间是保护性的。例如，显性阴性的TLR3等位基因已与在儿童时期受到HSV-1的原发感染的单纯疱疹脑炎的增强的易感性想关联(Zheng等人，Science317：1522-1527，2007)。在小鼠中，TLR3缺陷与在柯萨奇病毒攻击下的降低的存活相关联(Richer等人，PLoS One4：e4127，2009)。然而，已经显示失控的或失调的TLR3信号转导导致了某些病毒感染模型中的发病和致死，包括西尼罗河病毒、白蛉病毒、牛痘病毒和甲型流行性感冒(Wang等人，Nat.Med.10：1366-1373，2004；Gowen等人，J.Immunol.177：6301-6307，2006；Hutchens等人，J.Immunol.180：483-491，2008；Le Goffic等人，PloSPathog.2：E53，2006)。
人和小鼠TLR3细胞外结构域的晶体结构已被测定(Bell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，102：10976-80，2005；Choe，等人，Science309：581-585，2005；Liu等人，Science，320：379-381，2008)。TLR3形成了由多糖修饰的螺线管马蹄铁的整体形状，并且具有富含亮氨酸重复(LRR)基序的23个串联单元。dsRNA结合位点已被标定于两个不同的区域(Liu等人，Science，320：379-81，2008)。信号转导组装体据认为由1个dsRNA和两个TLR3细胞外结构域组成(Leonard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105：258-263，2008)。
已经显示TLR3在一定范围的炎性免疫介导与自体免疫疾病中驱动了发病机制，包括例如感染性休克(Cavassani等人，J.Exp.Med.205：2609-2621，2008)、急性肺损伤(Murray等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.178：1227-1237，2008)、类风湿性关节炎(Kim等人，Immunol.Lett.124：9-17，2009；Brentano等人，Arth.Rheum.52：2656-2665，2005)、哮喘(Sugiura等人，Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.40：654-662，2009；Morishima等人，Int.Arch.Allergy Immunol.145：163-174，2008；Stowell等人，Respir.Res.10：43，2009)、炎性肠病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎(Zhou等人，J.Immunol.178：4548-4556，2007；Zhou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)104：7512-7515，2007)、自体免疫性肝病(Lang等人，J.Clin.Invest.116：2456-2463，2006)和I型糖尿病(Dogusan等人Diabetes57：1236-1245，2008；Lien and Zipris，Curr.Mol.Med.9：52-68，2009)。此外，已经显示TLR3表达的器官特异性提高与失调的局部炎性反应所驱动的大量病理病症相关联，诸如在原发性胆汁性肝硬化的肝组织中(Takii等人，Lab Invest.85：908-920，2005)、在类风湿性关节炎的关节中(Ospelt等人，ArthritisRheum.58：3684-3692，2008)以及过敏性鼻炎患者的鼻粘膜中(Fransson等人，Respir.Res.6：100，2005)。
在坏死条件下，包括内源mRNA在内的细胞内含物的释放触发了细胞因子、趋化因子以及其它诱发局部炎症的因子的分泌，促进了对死亡细胞残余物的清除并且修复损伤。坏死通常延续炎性过程，导致了慢性或过激炎症(Bergsbaken等人，Nature Reviews7：99-109，2009)。坏死位点的TLR3激活可导致这些异常炎性过程并且通过所释放的TLR3配基生成进一步的促炎性正反馈回路。因此，TLR3拮抗作用可在涉及慢性或过激炎症和/或坏死的多种病症中具有益处。
TLR3激活的下调还可以表示肿瘤适应症的新型治疗策略，所述肿瘤适应症包括肾细胞癌和头颈部鳞状细胞癌(Morikawa等人，Clin.Cancer Res.13：5703-5709，2007；Pries等人，Int.J.Mol.Med.21：209-215，2008)。此外，编码具有降低活性的蛋白质的TLR3L423F等位基因已经关联于针对老年“干性”衰老相关的黄斑退化(Yang等人，N.Engl.J.Med.359：1456-1463，2008)，其显示了TLR3拮抗剂在这一疾病中可能是有益的。
与炎性病症和其它病症(诸如与感染相关的病症)相关联的病理，具有重要的健康和经济影响。然而，尽管在众多医学领域中有所进展，对于大量的这些病症具有相对少量的治疗选择和疗法。
因此，对于抑制TLR3活性以治疗TLR3相关病症存在着需求。
附图说明
图1示出了抗-人TLR3(huTLR3)mAb在NF-κB报告基因测定中的效应。
图2A和2B示出了抗-huTLR3mAb在BEAS-2B测定中的效应(％抑制)。
图3A和3B示出了抗-huTLR3mAb在NHBE测定中的效应。
图4示出了抗-huTLR3mAb在PBMC测定中的效应。
图5A和5B示出了抗-huTLR3mAb在HASM测定中的效应。
图6A、6B和6C示出了抗-huTLR3mAb与TLR3突变体的结合。
图7A示出了mAb15EVQ(黑色)和C1068mAb(灰色)(上部图)的表位以及mAb12QVQ/QSV(黑色，底部图)的表位，其与人TLR3ECD结构相叠加。图7B示出了与mAb15EVQ成复合物的TLR3ECD蛋白的局部H/D交换扰动图。
图8A和8B示出了大鼠/小鼠的抗-鼠TLR3mAb mAb5429(替代物)在A)NF-κB和B)ISRE报告基因测定中的效应。
图9示出了所述替代mAb(mAb5429，mAb c1811)在MEF CXCL10/IP-10测定中的效应。
图10示出了所述替代mAb对TLR3的结合特异性。顶栏：同种型对照；底栏：mAb c1811。
图11示出了所述替代mAb在AHR模型中对于penH水平的效应。
图12示出了所述替代mAb在AHR模型中对BAL液中总中性粒细胞数量的效应。
图13示出了所述替代mAb在AHR模型中对BAL液中CXCL10/IP-10水平的效应。
图14示出了所述替代mAb在DSS模型中对于组织病理得分的效应。
图15示出了所述替代mAb在T细胞转移模型中对于A)组织病理得分和B)中性粒细胞内流的效应。
图16示出了所述替代mAb在CIA模型中对于临床得分的效应。
图17示出了所述替代mAb在CIA模型中对于AUC临床得分的效应。
图18示出了在流感病毒A/PR/8/34的鼻内给药之后所述替代mAb对于C57BL/6小鼠存活率的效应。mAb给药在第-1日开始。
图19示出了在流感病毒A/PR/8/34给药后所述替代mAb对于临床得分的效应。mAb给药在第-1日开始。
图20示出了在流感病毒A/PR/8/34给药后所述替代mAb在14天中对于体重的效应。mAb给药在第-1日开始。
图21示出了在(A)WT DIO和(B)TLR3KO DIO动物中在葡萄糖刺激后所述替代mAb对于血糖水平的效应。
图22示出了所述替代mAb在WT DIO动物中对于胰岛素水平的效应。
图23示出了mAb15EVQ在NHBE细胞中对于(A)NTHi和(B)鼻病毒诱发的CXCL10/IP-10和CCL5/RANTES水平的效应。
图24示出了mAb15EVQ在HUVEC细胞中对于(A)sICAM-1水平和(B)活力的效应。
图25示出了在甲型流感病毒A感染3天后施用所述替代mAb后的动物存活率。
图26示出了在甲型流感病毒A感染3天后施用所述替代mAb后的临床得分。
图27示出了在甲型流感病毒A感染3天后施用所述替代mAb后的动物体重变化。
图28示出了huTLR3ECD与Fab12QVQ/QSV、Fab15EVQ和Fabc1068的四元复合物的分子结构，A.使用条带和表面图。TLR3ECD为浅灰色，N末端标记为N；全部Fab分子以深灰色使用条带图示出。B.所述表位染为浅灰色并且针对A中的Fab而在TLR3ECD上标出。在图28、29和30中，为清楚起见，将Fab12QVQ/QSV、Fab c1068和Fab15EVQ在标记中分别简称为Fab12、Fab1068和Fab15。
图29示出了通过Fab15EVQ进行中和作用的机制。A.dsRNA：TLR3信号转导单元(SU)通过在两个TLR3ECD(浅灰和深灰，并且标记为TLR3)之一中高亮Fab15EVQ表位来示出。所述dsRNA配基以浅灰色作为双螺旋示出。B.对sdRNA结合进行空间性抑制的Fab15EVQ结合的示意图，其因此而抑制了所述SU的形成。具有较高亲和性的Fab15EVQ结合将防止所述SU形成或将使预成形的SU解体。
图30示出了Fab12QVQ/QSV和Fab c1068与TLR3信号转导单元(SU)簇集的机制。A.Fab12QVQ/QSV和Fab c1068可结合(或共结合)单一SU。B.在约76个碱基对的dsRNA上的两个SU的最近簇集的模型。为清楚起见，将所述三种表位在不同的分子上加以高亮。C.Fab12QVQ/QSV和Fab c1068的结合由于该抗体与相邻SU之间的空间冲突而防止了SU簇集。两个左向箭头从性质上代表了所述抗体造成的不同程度的SU分离(底部箭头为Fab12QVQ/QSV，而顶部箭头为Fab c1068)。
图31示出了示例性抗体的顺序编号、Kabat编号和Chothia编号之间的对应关系。CDR和HV以灰色高亮显示。
图32示出了mAb15EVQ的VL与人Vk1框架的比对。Chothia高变弯环被加以下划线，互补位残基加以双下划线并且框架差别加以灰色高亮。Vκ1基因为*01等位基因，除非另行指明。残基编号是依序的。
图33示出了mAb15EVQ的VH与人Vh5框架的比对。序列特征如图32所标识。
图34示出了mAb12QVQ/QSV的VL与人Vk3框架的比对。序列特征如图32所标识。
图35示出了mAb15EVQ或mAb12QVQ/QSV的VL和VH与人Jκ、Jλ或Jh框架的比对。序列特征如图32所标识。
发明内容
本发明的一个方面是分离抗体或其片段，其中所述抗体结合3型Toll样受体(TLR3)的SEQ ID NO：2的氨基酸残基K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595和K619。
本发明的另一个方面是分离抗体或其片段，其中所述抗体结合3型Toll样受体(TLR3)的SEQ ID NO：2的氨基酸残基S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195和A219。
本发明的另一方面是具有重链可变区和轻链可变区的分离抗体或其片段，其中所述抗体以所述重链可变区的Chothia残基W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、Y100和D100b以及所述轻链可变区的Chothia残基Q27、Y32、N92、T93、L94和S95来结合具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的TLR3。
本发明的另一方面是具有重链可变区和轻链可变区的分离抗体或其片段，其中所述抗体以所述重链可变区的Chothia残基N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99和Y100以及所述轻链可变区的Chothia残基G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92和D93来结合具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的TLR3。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其中所述抗体具有以下特性的至少一种：
a.以＜10nM的Kd结合人TLR3；
b.在体外聚(I:C)NF-kB报告基因测定中在1μg/ml下降低人TLR3生物活性＞50％；
c.在10μg/ml下抑制以＜100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞的＞60％的IL-6或CXCL10/IP-10的生产；
d.在0.4μg/ml下抑制以＜100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞的＞50％的IL-6或CXCL10/IP-10的生产；
e.在5μg/ml下抑制以62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的＞50％的IL-6生产；
f.在1μg/ml下抑制以62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的＞50％的IL-6生产；
g.在1μg/ml下抑制PBMC细胞进行的＞20％的聚(I:C)诱发的IFN-γ、IL-6或IL-12生产；
h.在体外NF-kB报告基因测定中以IC50＜10μg/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性；或
i.在体外ISRE报告基因测定中以IC50＜5μg/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其与单克隆抗体竞争进行TLR3结合，其中所述单克隆抗体包含特定的重链互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列，特定的轻链CDR1、2和3的氨基酸序列，特定重链可变区(VH)的氨基酸序列或者特定轻链可变区(VL)的氨基酸序列。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，并且其中所述抗体包含特定的重链互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列以及特定的轻链CDR1、2和3的氨基酸序列。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含特定重链可变区(VH)的氨基酸序列和特定轻链可变区(VL)的氨基酸序列。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含特定重链的氨基酸序列和特定轻链的氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的抗体重链，其包含在SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的抗体轻链，其包含在SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211或225中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的抗体重链，其包含在SEQ ID NO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的抗体轻链，其包含在SEQ ID NO：155、156、157、158、203、205、207、165、167或227中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是编码抗体重链的分离的多核苷酸，所述抗体重链包含在SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是编码抗体轻链的分离的多核苷酸，所述抗体轻链包含在SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211或225中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是编码抗体重链的分离的多核苷酸，所述抗体重链包含在SEQ ID NO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是编码抗体轻链的分离的多核苷酸，所述抗体轻链包含在SEQ ID NO：155、156、157、158、203、205、207、165、167或227中示出的氨基酸序列。
本发明的另一方面是包含本发明的分离抗体的药物组合物和配药学上可接受的载体。
本发明的另一方面是一种载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。
本发明的另一方面是一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
本发明的另一个方面是制备与TLR3具有反应性的抗体的方法，包括：培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。
本发明的另一方面是治疗或者预防炎性病症的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防所述炎性病症的时间。
本发明的另一方面是治疗或者预防系统炎性病症的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防所述系统炎性病症的时间。
本发明的另一方面是治疗II型糖尿病的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗所述II型糖尿病的时间。
本发明的另一方面是治疗高血糖的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗所述高血糖的时间。
本发明的另一方面是治疗高胰岛素血症的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗所述胰岛素抗性的时间。
本发明的另一方面是治疗或者预防病毒感染的方法，包括将治疗有效量的本发明的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗或预防所述病毒感染的时间。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指通过任何机制部分地或完全地抑制另一分子诸如受体或细胞内调节物的效应的分子。
如本文所用，“TRL3抗体拮抗剂”或“与TLR3具有反应性的”抗体描述了能够直接或间接地基本上抵消、降低或抑制TLR3生物活性或TLR3受体激活的抗体。例如，与TLR3具有反应性的抗体可直接地结合TLR3并且中和TLR3活性，即，阻断TLR3信号转导以降低细胞因子和趋化因子释放或NF-κB的激活。
如本文所用，术语“抗体”广义地意指并且包括免疫球蛋白或抗体分子(包括多克隆抗体)、单克隆抗体(包括小鼠、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体和抗体片段)。
一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。原始抗体是异四聚化的糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链构成。通常各个轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量有所不同。各个重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键桥。各个重链在一端具有可变域(可变区)(VH)，继之以大量的恒定域(恒定区)。各个轻链在一端具有可变域(VL)，并在另一端具有恒定域；轻链恒定域与重链的第一恒定域并列并且轻链可变域与重链的可变域并列。任何脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列被指定为两种明显不同类型之一，即κ和λ。
免疫球蛋白可以根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步再被分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“抗体片段”是指原始抗体的一部分，一般是所述原始抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，双体、单链抗体分子和通过至少两种原始抗体而形成的多特异性抗体。
免疫球蛋白轻链可变区或重链可变区由三组“抗原结合位点”插入的“框架”区组成。所述抗原结合位点使用如下不同术语来定义：(i)术语互补决定区(CDR)是基于序列可变性(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132：211-250，1970)。一般来讲，所述抗原结合位点具有六个CDR；三个处于VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且三个处于VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991)。(ii)术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的区域，其在如Chothia和Lesk所定义的结构中(Chothia与Lesk，Mol.Biol.196：901-917，1987)是高变的。一般来讲，抗原结合位点具有六个高变区，三个处于VH中(H1、H2、H3)并且三个处于VL中(L1、L2、L3)。Chothia和Lesk是指作为“典型结构”的结构上保守的HV。(iii)如Lefranc所提出的“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003)是基于对来自免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域进行的比较。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT划定(delineation)之间的对应性参见Lefranc等人，Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003.(iv)抗原结合位点可基于特异性决定残基的使用(Specificity Determining ResidueUsage，SDRU)(Almagro，Mol.Recognit.17：132-143，2004)来划定，其中特异性决定残基(SDR)是指直接参与抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。SDRU是对不同类型抗原的SDR的数量和分布的精确度量，如抗原-抗体复合物的晶体结构分析所定义。(v)抗原结合位点还可根据抗体互补位残基所定义，所述残基通过所述抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定。
如本文所用，术语“复合物序列”是指经定义而包括由Kabat、Chothia或IMGT所单独划定的全部氨基酸残基的抗原结合位点，或任何其它合适的抗原结合位点划定。
如本文所用，“Chothia残基”是抗体VL和VH残基，其根据Al-Lazikani来编号(Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-48，1997)。两种最常用的编码体系Kabat(Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NIH，Bethesda，MD，1991)和Chothia(Chothia与Lesk，Mol.Biol.196：901-17，1987)相对于依序多肽编码之间的对应性针对本发明的示例性抗体在图31中加以示出。
“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。框架通常分成四个区域FR1、FR2、FR3和FR3，它们形成每个可变区中的三个抗原结合位点的支架。因为抗原结合位点可以由如上所述的不同术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
如本文所用，“轻链可变区κ1(Vκ1)框架”或“Vκ1”是指具有由任意人Vκ1功能基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Vk1基因是IGKV1-5*01、IGKV1-6*01、IGKV1-8*01、IGKV1-9*01、IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-16*01、IGKV1-17*01、IGKV1-27*01、IGKV1-33*01、IGKV1-37*01、IGKV1-39*01、IGKV1D-8*01、IGKV1D-12*01、IGKV1D-13*01、IGKV1D-16*01、IGKV1D-17*01、IGKV1D-33*01、IGKV1D-37*01、IGKV1D-39*01、IGKV1D-42*01或IGKV1D-43*01。免疫球蛋白基因的命名是为人所熟知的。
如本文所用，“轻链可变区λ3(Vλ3)框架”或“Vλ3”是指具有由任意人Vλ3功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Vλ3基因是IGLV3-1*01、IGLV3-9*01、IGLV3-10*01、IGLV3-12*01、IGLV3-16*01、IGLV3-19*01、IGLV3-21*01、IGLV3-22*01、IGLV3-25*01、IGLV3-27*01和IGLV3-32*01。
如本文所用，“重链可变区Vh5框架”或“Vh5”是指具有由任意人Vh5功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Vh5基因是IGHV5-51*01和IGHV5-1*01。
如本文所用，“重链可变区Vh6框架”或“Vh6”是指具有由任意人Vh6功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Vh6基因是IGHV6-1*01。
如本文所用，“轻链κJ-区(Jκ)框架”或“Jκ”是指具有由任意人Jκ功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Vκ基因是IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4和IGKJ5。
如本文所用，“轻链λJ-区(Jλ)框架”或“Jλ”是指具有由任意人Jλ功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Jλ基因是IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6和IGLJ7。
如本文所用，“重链J-区(Jh)框架”或“Jh”是指具有由任意人Jh功能性基因或其等位基因所编码的氨基酸序列的框架。示例性的功能性人Jh基因为GHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5和IGHJ6。
如本文所用，“种系基因”或“抗体种系基因”是由非淋巴细胞所编码的免疫球蛋白序列，其不经过导致了基因重排和突变以进行特定免疫球蛋白表达的成熟加工。
如本文所用，“支架”是指由人种系基因编码的轻链或重链可变区的氨基酸序列。因此，支架涵盖了框架和抗原结合位点两者。
如本文所用，术语“抗原”是指具有直接或间接产生抗体能力的任何分子。“抗原”的定义中包括有编码蛋白质的核酸。
术语“同系物”是指与参比序列具有介于40％和100％之间的序列同一性的蛋白质序列。人TLR3的同系物包括来自其它物种的多肽，其与已知的人TLR3序列具有介于40％和100％之间的序列同一性。可使用Vector NTIv.9.0.0(Invitrogen，Carlsbad，CA)的AlignX模块的默认设置通过逐对比对来测定两种多肽链之间的百分比同一性。“TLR3”是指人TLR3(huTLR3)及其同系物。全长huTLR3的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和2中示出。huTLR3细胞外结构域(ECD)的核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ IDNO：3和4中示出。
如本文所用，术语“基本相同”是指进行比较的两种抗体或抗体片段的氨基酸序列是相同的或具有“非实质性差别”。非实质性差别是在抗体或抗体片段的氨基酸序列中1、2、3、4、5或6个氨基酸的替换。与本文所公开的序列基本相同的氨基酸序列也是本申请的一部分。在一些实施例中，所述序列同一性可以是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。百分比同一性可如上文所述测定。示例性的进行比较的肽链为重链或轻链可变区。
如本文所用，术语“进行组合”是指所描述药剂可以在混合物中、作为单一药剂同时地或作为单一药剂以任何顺序先后地共同向动物施用。
如本文所用，术语“炎性病症”是指对细胞损伤的局部反应，其部分地由细胞因子、趋化因子或炎性细胞(例如，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的活性介导，在多数情况下其特征在于疼痛、发红、肿胀以及组织功能的丧失。如本文所用，术语“炎性肺病”是指影响肺部或与之关联的炎性病症。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指获自基本上均质抗体的群体的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，通常针对单一抗原决定簇。修饰词“单克隆”表明所述抗体的基本均质的特征，并且并不要求通过任何特定方法的抗体生产。例如，鼠单克隆抗体可以由Kohler等人Nature256：495-497，1975中的杂交瘤方法来制备。包含来源于供体抗体(通常为小鼠)的轻链和重链可变区结合来源于受体抗体(通常为另一哺乳类物种，诸如人)的轻链和重链恒定区的嵌合mAb可通过在美国专利No.4,816,567中公开的方法来制备。可以通过本领域技术人员已知的技术(诸如美国专利No.5,225,539所公开的技术)来制备这样的人适应单克隆抗体，其具有衍生自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR和衍生自一种或多种人免疫球蛋白的分子的剩余免疫球蛋白衍生部分。可用于人适应的人框架序列可以由本领域技术人员从相关数据库选择。任选地，可以通过诸如Queen等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：10029-10032，1989和Hodgson等人，Bio/Technology，9：421，1991中公开的那些技术来掺入改变的框架支持残基以保留结合亲和性，可进一步修饰人适应的mAb。
缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体，可通过在下述文献中提到的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备：例如，Lonberg等人，Nature368：856-859，1994；Fishwild等人，Nature Biotechnology14：845-851，1996；以及Mendez等人，Nature Genetics15：146-156，1997。还可以通过在下述文献中提到的技术从噬菌体展示文库制备和优化人mAb：例如，Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86，2000；以及Krebs等人，J.Immunol.Meth.254：67-842001。抗体的片段例如Fab、F(ab’)2、Fd和dAb片段可通过抗体的切割或者通过重组工程来产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来产生。
如本文所用，术语“表位”是指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由化学活性的(诸如极性、非极性或疏水性)表面部分组而组成，诸如氨基酸或多糖侧链，并且可具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可以是线状特征的或可以是不连续的表位，例如，构象表位，其通过抗原的非连续性氨基酸之间的空间关系所形成，而非氨基酸的线型系列。构象表型包括通过抗原折叠而得的表位，其中来自所述抗原的线型序列的不同部分的氨基酸在3-维空间中靠近。
如本文所用，术语“互补位”是指抗原特异性结合的抗体部分。互补位可以是线状特征的或可以是不连续的，通过抗体的非连续性氨基酸之间的空间关系所形成，而非氨基酸的线型系列。“轻链互补位”和“重链互补位”或“轻链互补位氨基酸残基”和“重链互补位氨基酸残基”分别是指与抗原相接触的抗体轻链和重链残基。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体以比针对其它抗原或蛋白质更高的亲和性结合预定的抗原。通常，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且与预定抗原结合的KD至少两倍低于其与除预定抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)结合的KD。短语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文可以与术语“特异性地结合抗原的抗体”或“抗原特异性抗体”互换使用，例如TLR3特异性抗体。可以如下所述使用标准程序来测量解离常数。
如本文所用，术语“TLR3生物活性”或“TLR3激活”是指配基结合TLR3所导致的任何活性。TLR3配基包括dsRNA、聚(I:C)和内源mRNA，例如，从坏死细胞中释放的内源mRNA。示例性的TLR3激活导致了NF-κB响应于TLR3配基的激活。可使用报告基因测定法通过使用聚(I:C)诱发报告者来测定NF-κB的激活(Alexopoulou等人，Nature413：732-738，2001；等人，EMBO J.18：6973-6982，1999)。另一示例性的TLR3激活导致了响应于TLR3配基的干扰素应答因子(IRF-3、IRF-7)的激活。TLR3-介导的IRF激活可使用由干扰素刺激应答元件(ISRE)所驱动的报告基因来测定。另一示例性的TLR3激活导致了促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，例如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、CXCL5/IP-10和RANTES。细胞因子和趋化因子从细胞、组织中或在循环中的释放可使用熟知的免疫测定法来测量，诸如ELISA免疫测定法。
本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码：
物质的组成
本发明提供了能够抑制TLR3生物活性的抗体拮抗剂以及此类抗体的用途。此类TLR3拮抗剂可以具有结合TLR3和抑制TLR3激活的特性。可以通过这类抗体抑制TLR3激活的示例性的机制包括体外、体内或原位抑制配基结合TLR3、抑制受体二聚化、抑制TLR3定位于内质网区室、抑制下游信号转导通路的激酶活性或者抑制TLR3的mRNA转录。能够通过其它机制抑制TLR3激活的其它抗体拮抗剂也处于本发明的多个不同方面和实施例的范围内。这些拮抗剂可用于研究试剂、诊断试剂和治疗剂。
在天然体系中，抗体多样性是通过使用编码可变区的多种种系基因和多种体细胞事件来创建的。所述体细胞事件包括可变基因片段与多样性(D)和连接(J)基因片段进行重组以制造完整的VH区，以及可变和连接基因片段重组以制造完整的VL区。所述重组过程自身可以是不精确的，导致了V(D)J接合处的氨基酸丢失或增加。这些多样性机制发生于进行抗原暴露前的发育的B细胞中。在抗原刺激后，B细胞中所表达的抗体基因发生了体细胞突变。根据种系基因片段的估计数量，这些片段的随机重组以及随机VH-VL配对，可产生多达1.6×107种不同的抗体(Fundamental Immunology，第3版(1993)，Paul编辑，Raven Press，New York，N.Y.)。当导致了抗体多样性(诸如体细胞突变)的其它加工被计入时，据认为可生成1010种以上的不同抗体(Immunoglobulin Genes，第2版(1995)，Jonio等人编辑，Academic Press，San Diego，Calif.)。由于参与产生抗体多样性的所述众多加工过程，独立生成的具有相同抗原特异性的单克隆抗体具有相同的氨基酸序列是很不可能的。
本发明提供来源于人免疫球蛋白基因文库的新型抗原结合位点和免疫球蛋白链。携带抗原结合位点的结构一般是抗体重链或轻链或其部分，其中所述抗原结合位点位于天然存在的抗原结合位点，如上文描述所测定。
本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或其片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含重链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，如表1a所示。
表1a.
15* IMGT所定义的CDR
15** 根据共有序列定义的CDR
在某些实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含HCDR2氨基酸序列，如SEQ ID NO：192中示出，其中所述SEQ ID NO：192的HCDR2如式(I)中示出所定义：
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-R-S-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S，
(I)
其中
Xaa6可以是Arg或Lys；
Xaa7可以是Tyr、His或Ser；
Xaa8可以是Met、Arg或Tyr；并且
Xaa9可以是Lys或Arg。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含HCDR2氨基酸序列，如SEQ ID NO：194中示出，其中所述SEQ ID NO：194的HCDR2如式(III)中示出所定义：
I-I-Q-Xaa15-R-S-K-W-Y-N-Xaa16-Y-A-Xaa17-S-V-K-S，
(III)
其中
Xaa15可以是Lys、Thr或Ile；
Xaa16可以是Asn或Asp；并且
Xaa17可以是Val或Leu。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含HCDR2氨基酸序列，如SEQ ID NO：196中示出，其中SEQ ID NO：196的HCDR2如式(V)中示出所定义：
Xaa24-I-D-P-S-D-S-Y-T-N-Y-Xaa25-P-S-F-Q-G，
(V)
其中
Xaa24可以是Phe或Arg；并且
Xaa25可以是Ala或Ser。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含LCDR3氨基酸序列，如SEQ ID NO：191中示出，其中SEQ ID NO：191的LCDR3如式(II)中示出所定义：
Xaa1-S-Y-D-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-T-V，
(II)
其中
Xaa1可以是Ala、Gln、Gly或Ser；
Xaa2可以是Gly、Glu或Ser；
Xaa3可以是Asp或Asn；
Xaa4可以是Glu或Ser；并且
Xaa5可以是Phe、Ala或Leu。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含LCDR3氨基酸序列，如SEQ ID NO：193中示出，其中SEQ ID NO：193的LCDR3如式(IV)中示出所定义：
Xaa10-S-Y-D-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V，
(IV)
其中
Xaa10可以是Gln或Ser；
Xaa11可以是Thr、Glu或Asp；
Xaa12可以是Val或Asn；
Xaa13可以是Tyr或Phe；并且
Xaa14可以是Ser、Asn或Gln。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含LCDR3氨基酸序列，如SEQ ID NO：195中示出，其中SEQ ID NO：195的LCDR3如式(VI)中示出所定义：
Q-Q-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T，
(VI)
其中
Xaa18可以是Tyr、Gly或Ala；
Xaa19可以是Gly、Glu或Asn；
Xaa20可以是Ser或Thr；
Xaa21可以是Val、Ile或Leu；
Xaa22可以是Ser或Leu；并且
Xaa23可以是Ile、Ser、Pro或Tyr。
本发明还提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其具有重链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，如表1a所示。
本发明的范围内还涵盖了抗原结合位点的氨基酸序列与表1a中示出的氨基酸序列(SEQ ID NO：49-121和191-196)非实质性区别的抗体。通常这涉及了使用具有类似电荷、疏水或立体化学特征的氨基酸进行的一个或多个氨基酸替换。与抗原结合位点呈对比，还可产生框架区内的另外的替换，只要它们并不对所述抗体的特性进行不良影响。可作出替换以改善抗体特性，例如稳定性或亲和性。可对抗原结合位点产生一个、两个、三个、四个、五个或六个替换。可替换1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的框架残基，只要所得的抗体保留了所期望的特性。
保守修饰将产生这样的分子：所述分子具有与在其中做出此种修饰的那些分子类似的功能和化学特征。在所述分子的功能和/或化学特性中的实质性修饰可通过在所述氨基酸序列中选择替换来实现，所述替换在其对于维持以下的效果上明显不同：(1)该替换区域中的分子主链的结构例如，作为片层或螺旋构象，(2)该靶点处的分子电荷或疏水性，或(3)所述分子的大小。例如，“保守性氨基酸替换”可涉及天然氨基酸残基受到非天然残基的替换，从而使该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎无影响或无影响。此外，还可以用丙氨酸来替换多肽中的任何天然残基，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67，1998；Sasaki等人，Adv.Biophys.35：1-24，1998)。所期望的氨基酸替换(无论是保守性还是非保守性)可由本领域的技术人员在需要此类替换时来决定。例如，可使用氨基酸替换来鉴定所述分子序列的重要残基，或用于提高或降低本文所述分子的亲和性。示例性的氨基酸替换示于表1b中。
在某些实施例中，保守性氨基酸替换还涵盖了非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成并入而非通过生物系统中的合成。氨基酸替换可以例如通过PCR诱变来进行(美国专利号4,683,195)。变体文库可使用熟知的方法而生成，例如使用随机(NNK)或非随机密码子，例如编码11种氨基酸(ACDEGKNRSYW)的DVK密码子，并且针对具有所期望性能的变体筛选文库，如实例1中示出。表1c示出了对三种亲本TLR3抗体拮抗剂在LCDR3和HCDR2区中做出的用于改善抗体特性的替换。
根据对抗原结合位点的划定，本发明的抗体的抗原结合位点残基以及随后的框架残基可就各个重链和轻链而有轻微变化。
表1b.
原始残基 示例性替换 更保守的替换
Ala(A) Val，Leu，Ile Val
Arg(R) Lys，Gln，Asn Lys
Asn(N) Gln Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser，Ala Ser
Gln(Q) Asn Asn
Gly(G) Pro，Ala Ala
His(H) Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile(I) Leu，Val，Met，Ala，Phe，Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys(K) Arg，1，4二氨基-丁酸，Gln，Asn Arg
Met(M) Leu，Phe，Ile Leu
Phe(F) Leu，Val，Ile，Ala，Tyr Leu
Pro(P) Ala Gly
Ser(S) Thr，Ala，Cys Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr，Phe Tyr
Tyr(Y) Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val(V) Ile，Met，Leu，Phe，Ala，Norleucine Leu
表2a和2b示出了根据Kabat、Chothia和IMGT而划分的本发明的示例性抗体的抗原结合位点残基以及它们的组成序列。
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，并且其中所述抗体包含所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列并且还提供表3a中示出的各个分离的重链可变区和轻链可变区。F17、F18和F19分别表示包含17、18和19家族共有氨基酸序列的抗体变体(参见实例1)。
表1c.
*根据mAb的共有序列10，11，12
尽管“实例”中所示的实施例包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到其它实施例可以包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选第二可变区，所述第二可变区能够形成双结构域的特异性抗原结合片段，所述片段能够，例如，结合TLR3。所述筛选可以通过噬菌体展示筛选方法来完成，其中使用例如在PCT公布WO92/01047中公开的分级双重组合方法。在此方法中，包含H或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合域根据所描述的噬菌体展示技术来选择。
表2a.
在其它实施例中，本发明提供了与TLR3具有反应性的分离抗体或片段，其包含重链可变区和轻链可变区两者，其具有与表3a中示出的可变区氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了分离抗体，其具有如表3b中示出的某些重链和轻链氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体的任一种或它们的互补序列。本文公开了某些示例性的多核苷酸，然而，鉴于在给定表达系统中的给定的遗传密码简并性或密码子偏倚性而编码本发明抗体拮抗剂的其它多核苷酸也在本发明的范围内。
表2b.
表3a.
示例性的抗体拮抗剂可以是IgG、IgD、IgG、IgA或IgM同种型的抗体。另外，此类抗体拮抗剂可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇(PEG)部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。这种修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以缀合至聚乙二醇(聚乙二醇化)以改善其药代动力学类型。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术来执行。已经证实，治疗性抗体与PEG的缀合会增强药效学而不干扰功能。(Deckert等人，Int.J.Cancer87：382-390，2000；Knight等人，Platelets15：409-418，2004；Leong等人，Cytokine16：106-119，2001；Yang等人，Protein Eng.16：761-770，2003)。
表3b.
本发明的抗体的药代动力学特性还可以通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰来增强。例如，IgG4同种型重链在铰链区包含能够形成重链间或重链内二硫键的Cys-Pro-Ser-Cys(CPSC)基序，即，CPSC基序中的两个Cys残基可与其它重链的对应Cys残基成二硫键(重链间)或给定的CPSC基序之内的两个Cys残基可互相成二硫键(重链内)。据信体内异构酶能够将IgG4分子的重链间的键转换成为重链内的键，并且反之亦然(Aalberse和Schuurman，Immunology105：9-19，2002)。因此，由于在铰链区具有重链间键的这些IgG4分子的重链:轻链(H:L)组对并非彼此共价结合，它们可分离成为H:L单体，其随后与来自其它IgG4分子的H:L单体重结合，形成双特异性异质二聚体IgG4分子。在双特异性IgG抗体中，所述抗体分子的两个Fab在其结合的表位上不同。在IgG4的铰链区CPSC基序中以Pro替换Ser残基导致了“IgG1样行为”即，所述分子在重链间形成稳定的二硫键并且因此而不易进行与其它IgG4分子的H:L交换。在一个实施例中，本发明的抗体将包含在CPSC基序中具有S向P的突变的IgG4Fc结构域。所述CPSC基序的位置通常见于成熟重链的残基228，但可根据CDR长度而变化。
此外，还可在本发明的抗体中去除影响除FvRn补救受体之外的Fc受体结合的位点。例如，可在本发明的抗体中去除参与ADCC活性的Fc受体结合区。例如，IgG1的铰链区中Leu234/Leu235向L234A/L235A的突变或IgG4的铰链区中Phe235/Leu236向P235A/L236A的突变最小化了FcR结合并且降低了所述免疫球蛋白介导补体依赖性细胞毒性和ADCC的能力。在一个实施例中，本发明的抗体将包含具有P235A/L236A突变的IgG4Fc结构域。上文鉴定的这些残基的位置在成熟重链中是典型的，但是可根据CDR长度而变化。具有P235A/L236A突变的示例性的抗体是具有SEQ ID NO：218、219或220中示出的重链氨基酸序列的抗体。
完全人抗体、人适应的抗体、人源化抗体和亲和性成熟抗体分子或抗体片段处于本发明的范围之内，如其融合蛋白和嵌合蛋白的形式。对于抗原的抗体亲和性可通过合理设计或随机亲和性成熟来改善，通过所熟知的方法而进行，诸如随机或定向诱变，或使用噬菌体展示文库。例如，可对多数位于框架区内的游标区残基产生替换或对“亲和性决定残基”ADR产生替换以调节抗体的亲和性(美国专利No.6,639,055；PCT公开WO10/045340)。
经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和性、免疫原性或其它所期望的生物或生物物理性能的完全人抗体、人适应的抗体、人源化抗体和亲和性成熟抗体分子或抗体片段属于本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的个体结构域的核心堆叠，(2)对HC和LC组对具有影响的蛋白质/蛋白质相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，J.Mol.Biol.，305：989-1010，2001)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过产生并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。用于提高抗体稳定性的方法之一是提高热相变中点(Tm)如差示扫描量热法(DSC)所测定。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Biopharm.，13：36-46，2000)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，AAPS PharmSci.5E8，2003；Zhang等人，J.Pharm.Sci.93：3076-3089，2004；Maa等人，Int.J.Pharm.，140：155-168，1996；Bedu-Addo等人，Pharm.Res.，21：1353-1361，2004；Remmele等人，Pharm.Res.，15：200-208，1997)。制剂研究提示，Fab的Tm对于对应mAb的长期物理稳定性有所牵涉。框架或抗原结合位点之内的氨基酸差别对于Fab结构域的热稳定性具有显著影响(Yasui等人，FEBS Lett.353：143-146，1994)。
本发明的抗体拮抗剂可以以小于或等于约10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M的Kd结合TLR3。可以使用任意合适的方法以实验测定给定分子诸如抗体针对TLR的亲和性。此类方法可以采用本领域技术人员已知的Biacore或KinExA仪器、ELISA或竞争结合分析。
以所期望的亲和性结合给定TLR3同系物的抗体拮抗剂可通过包括抗体亲和性成熟在内的技术从变体或片段的文库中选择。抗体拮抗剂可根据其对TLR3生物活性的抑制使用任何合适的方法来鉴定。此类方法可使用报告基因测定法或测量细胞因子制备的测定法，使用所熟知的方法并如本发明中所描述来进行。
本发明的另一实施例是包含至少一种本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、杆状病毒表达载体、基于转座子的载体或任何其它适用于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。
本发明的另一实施例是包含任何本发明的多核苷酸的宿主细胞，诸如编码包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽的多核苷酸，所述重链可变区具有如SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215或216中所示出的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211或225中所示出的氨基酸序列。
本发明的另一实施例是包含多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽，所述重链具有如SEQ IDNO：102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166或168中所示出的氨基酸序列，所述轻链具有如SEQ ID NO：155、156、157、158、203、205、207、165、167或227中所示出的氨基酸序列。此类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性的真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性的人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明的另一个实施例是制备与TLR3具有反应性的抗体的方法，所述方法包括：培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。制造抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。
本发明的另一个实施例是产生本发明的抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的另一个实施例是分离抗体或其片段，其中所述抗体结合3型Toll样受体(TLR3)的SEQ ID NO：2的氨基酸残基K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595和K619。
本发明的另一个实施例是分离抗体或其片段，其中所述抗体结合3型Toll样受体(TLR3)的SEQ ID NO：2的氨基酸残基S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195和A219。
数种熟知的方法可用于测定本发明的抗体的结合表位。例如，当两种单独组分的结构均是已知的时候，可进行in silico蛋白质-蛋白质对接以鉴定相互作用的相容位点。可使用所述抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换以标测所述抗原上可能受到该抗体结合的区域。可使用所述抗原的片段和点诱变来定位对于抗体结合而言重要的氨基酸。对于诸如TLR3这样的大蛋白质，当首先将所述结合位点定位于所述蛋白质上的区域时简化了点诱变标测，诸如通过对接、片段诱变或H/D交换。当两种单独组分的结构均是已知的时候，可进行in silico蛋白质-蛋白质对接以鉴定相互作用的相容位点。抗体-抗原复合物的共结晶结构可用于鉴定对于表位和互补位有贡献的残基。
本发明的另一实施例是分离抗体或其片段，其中所述抗体以所述重链可变区的Chothia残基W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、Y100和D100b并以所述轻链可变区的Chothia残基Q27、Y32、N92、T93、L94和S95来结合具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的TLR3。所述重链互补位和所述轻链互补位Chothia残基对应于SEQ IDNO：216的重链残基W33、F50、D52、D55、Y57、N59、P62、E99、Y101、Y104和D106，以及SEQ ID NO：41的轻链残基Q27、Y32、N92、T93、L94和S95。
本发明的另一实施例是分离抗体或其片段，其中所述抗体以所述重链可变区的Chothia残基N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99和Y100并以所述轻链可变区的Chothia残基G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92和D93来结合具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的TLR3。所述重链互补位和所述轻链互补位Chothia残基对应于SEQ IDNO：214的重链残基N32、Q54、R56、S57、K58、Y60、Y104、P105、F106和Y107，以及SEQ ID NO：211的轻链残基G28、S29、Y30、Y31、E49、D50、Y90、D91和D92。
可通过，例如，将所述互补位残基移植进入合适的支架，将经工程化的支架装配进入全抗体，表达所得的抗体，并且测试针对结合TLR3或对于TLR3生物活性的影响的所述抗体，从而制备具有结合TLR3的特定互补位残基的分离抗体。示例性的支架是人种系基因编码的人抗体可变区的氨基酸序列。可根据，例如，总序列同源性、互补位残基之间的％同一性或所述支架与示例性抗体(诸如mAb15EVQ或mAb12QVQ/QSV)之间的典型结构类别的同一性，从而选择所述支架。人抗体种系基因公开于，例如Tomlinson等人，J.Mol.Biol227：776-798，以及InternationalImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http_://_www_imgt_org)中。还可使用共有的人框架区域，例如，如美国专利No.6,300,064中所描述。合适的支架的选择可根据，例如，PCT公开No.WO10/045340中描述的方法来进行。
可用作互补位残基移植于其上的支架的示例性人种系基因是由Vκ1、Vλ3、Vh5、Vh6、Jκδ、Jλ和Jh框架所编码的基因。种系J-区以其整体或以部分使用来选择FR4序列。例如，所述mAb15EVQ轻链互补位残基可移植入由IGKV1-39*01所编码的Vκ1框架，其直接连接IGKJ1所编码的J区序列。还可使用来自其它Vκ1基因的序列，并且可将其它Jκ基因的FR4序列替换IGKJ1。所述mAb15EVQ重链互补位残基可以移植入由IGHV5-51*01编码的Vh5框架，随后为构成HCDR3的约11-13个残基(例如12个残基)以及由IGHJ1所编码的FR4序列。所述11-13个残基在FR3区(“CAR”)的末端和FR4区(对于多数JH区为WGQ)的起始端之间，并且包括来自mAb15EVQ Vh的4个限定的互补位残基。还可使用来自其它Vh5基因的序列，并且可将其它Jh基因的FR4序列替换IGJH1。又如，所述mAb12QVQ/QSV轻链互补位残基可移植入由IGLV3-1*01编码的Vλ3框架，其直接连接IGJL2所编码的J区。还可使用其它Vλ3和Jλ基因的序列。LCDR3的长度维持约9-11个残基，例如10个残基。这些约9-11个残基在FR3区(对于多数Vλ支架为“YYC”)的末端和FR4区(对于多数JL区为“FGG”)的起始端之间，并且包括来自mAb12QVQ/QSV的3个限定的互补位残基。所述mAb12QVQ/QSV重链互补位残基可以移植入由IGHV6-1*01编码的Vh6框架，随后为构成HCDR3的约9-11个残基(例如10个残基)以及由IGJH1所编码的FR4序列。所述约9-11个残基在FR3区(“CAR”)的末端和FR4区(对于多数JH区为WGQ)的起始端之间，并且包括来自mAb12QVQ/QSV Vh的4个限定的互补位残基。其它Jh基因的FR4序列可替换IGHJ1。可使用标准方法来评估所得抗体对TLR3的结合和生物活性。图32-35中示出了所述mAb15EVQ和所述mAb12QVQ/QSV轻链可变区和重链可变区与示例性的Vκ1、Vh5、Vλ3、Vh6、Jκ、Jλ或Jh基因之间的比对。还可通过对游标区残基或亲和性决定残基的替换来修饰所述互补位移植工程化抗体以改善抗体特性，例如亲和性，如上文所描述。只要所述互补位移植的抗体维持了对TLR3的结合，所述互补位移植抗体中的框架氨基酸序列可以与mAb15EVQ或12QVQ/QSV框架序列是70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的。
除所述互补位残基外还可使用标准方法来移植来自抗原结合位点的序列。例如，可移植完全的HCDR3或LCDR3。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体或其片段，其与单克隆抗体竞争进行TLR3结合，其中所述单克隆抗体包含特定的重链互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列，特定的轻链CDR1、2和3的氨基酸序列，特定重链可变区(VH)的氨基酸序列或者特定轻链可变区(VL)的氨基酸序列。本发明的示例性单克隆抗体可以是包含具有SEQ ID NO：216中示出的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：41中示出的轻链可变区氨基酸序列的分离抗体，以及包含具有SEQ ID NO：214中示出的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：211中示出的轻链可变区氨基酸序列的抗体。
在结合TLR3之间的竞争可使用所熟知的方法进行体外测定。例如，可通过ELISA评估MSD Sulfo-TagTM NHS酯标记的抗体在存在非标记抗体的情况下对TLR3的结合。本发明的示例性抗体是mAb12、mAb15和mAbc1811(参见表3a)。此前描述的抗-TLR3抗体c1068及其衍生物(描述于PCT公开No.WO06/060513A2)、TLR3.7(eBiosciences，目录编号14-9039)和Imgenex IMG-315A(Imgenex IMG-315A；针对人TLR3氨基酸55-70VLNLTHNQLRRLPAAN而生成)并不与mAb12、15或c1811竞争结合TLR3，如实例5中示出。
本发明的另一方面是与TLR3具有反应性的分离抗体，其中所述抗体具有以下特性的至少一种：
a.以＜10nM的Kd结合人TLR3；
b.在体外聚(I:C)NF-kB报告基因测定中在1μg/ml下降低人TLR3生物活性＞50％；
c.在10μg/ml下抑制以＜100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞的＞60％的IL-6或CXCL5/IP-10生产；
d.在0.4μg/ml下抑制以＜100ng/ml聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞的＞50％的IL-6或CXCL5/IP-10生产；
e.在5μg/ml下抑制以62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的＞50％的IL-6生产；
f.在1μg/ml下抑制以62.5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE细胞的＞50％的IL-6生产；
g.在1μg/ml下抑制PBMC细胞进行的＞20％的聚(I:C)诱发的IFN-γ、IL-6或IL-12生产；
h.在体外NF-kB报告基因测定中抑制食蟹猴TLR3生物活性，使用IC50＜10μg/ml；或
i.在体外ISRE报告基因测定中抑制食蟹猴TLR3生物活性，使用IC50＜5μg/ml。
治疗方法
本发明的TLR3拮抗剂，例如TLR3抗体拮抗剂可用于调节免疫系统。尽管不期望受限于任何具体理论，本发明的拮抗剂通过防止或降低配基结合TLR3、TLR3的二聚化、TLR3内化或TLR3运送来调节免疫系统。本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，本发明的抗体可用于在治疗炎症、炎性和代谢疾病中拮抗TLR3活性，并且还可用于制备用于这一治疗的药物，其中所述药物经制备用于以本文限定的剂型进行的给药。
一般来讲，可通过施用本发明的TLR3抗体拮抗剂来预防或治疗的炎性病症、感染相关病症或免疫介导的炎性病症包括由细胞因子和趋化因子所介导的疾病以及完全或部分地由TLR3的激活或通过所述TLR3通路进行的信号转导所导致的病症。此类炎性病症的例子包括败血病相关病症、炎性肠病、自体免疫疾病、炎性病症和感染相关病症。还认为癌症、心血管和代谢病症、神经和纤维化病症可通过施用本发明的TLR3抗体拮抗剂来预防和治疗。炎症可影响组织或是全身性的。示例性受患组织是呼吸道、肺、胃肠道、小肠、大肠、结肠、直肠、心血管系统、心脏组织、血管、关节、骨和滑膜组织、软骨、上皮、内皮、肝组织或脂肪组织。示例性全身炎性病症是细胞因子风暴或高细胞因子血症、全身炎性反应综合征(SIRS)、移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)、灾难性抗磷脂抗体综合征、严重病毒感染、流行性感冒、肺炎、休克或败血病。
炎症是生物体的保护性反应，用于抵抗侵袭物。炎症是级联事件，其涉及众多的细胞和体液的调节物。一方面，对炎性反应的抑制可使宿主免疫受损；然而，如果不加检查，炎症可导致严重的并发症，包括慢性炎性疾病(例如，哮喘、牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病等等)、感染性休克和多器官功能衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态共有相同的炎性调节物，诸如细胞因子、趋化因子、炎性细胞和由这些细胞分泌的其它调节物。
通过其配基聚(I:C)、dsRNA或内源mRNA进行的TLR3激活导致了信号转导通路的激活，引起了促炎性细胞因子的合成和分泌、炎性细胞诸如巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的激活和募集、细胞死亡和组织破坏。TLR3诱发了IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、MIP-1、CXCL5/IP-10和RANTES以及参与免疫细胞募集和激活的其它促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，因此而引起自体免疫中和其它炎性疾病中的组织破坏。TLR3配基内源mRNA在炎症期间从坏死细胞中释放，并且可产生正反馈回路以激活TLR3并且维持炎症以及进一步的组织损伤。TLR3拮抗剂，诸如TLR3抗体拮抗剂，可使细胞因子分泌正常化，降低炎性细胞募集并且降低组织损伤和细胞死亡。因此，TLR3拮抗剂具有治疗炎症和一定范围的炎性病症的治疗潜力。
炎性病症的一个例子是败血病相关病症，其可包括全身炎性反应综合征(SIRS)、感染性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。由病毒、细菌、真菌或寄生性感染以及由坏死细胞所释放的dsRNA可引起败血病的发病。尽管并不期望束缚于任何具体理论，据信使用TLR3拮抗剂进行的治疗可通过在患有败血病相关炎性病症的患者中延长存活时间或预防局部炎性事件(例如，在肺部)扩散以成为全身病症、通过强化先天抗微生物活性、通过在与抗微生物剂组合时展现协同活性、通过最小化造成病变的局部炎性状态或任意前述组合来提供治疗有益效果。此类干预可足以允许必要的附加治疗(例如，治疗潜在的感染或降低细胞因子水平)以确保患者存活。败血病可通过施用D-半乳糖胺和聚(I:C)而在动物中建立模型，诸如小鼠。在此类模型中，D-半乳糖胺是肝毒素，其作为败血病敏化剂起作用，而聚(I:C)是败血症诱发分子，其模仿dsRNA并激活TLR3。TLR3拮抗剂治疗可在败血症的小鼠模型中提高动物存活率，并且因此TLR3拮抗剂可用于治疗败血症。
胃肠炎症是胃肠道粘膜层的炎症并且涵盖了急性和慢性炎性病症。急性炎症一般特征在于短发病时间和中性粒细胞的浸润或内流。慢性炎症一般特征在于相对较长的发病时期和单核细胞的浸润或内流。粘膜层可以是肠(包括小肠和大肠)、直肠、胃(胃脏)内壁或口腔的粘膜。示例性慢性胃肠炎性病症是炎性肠病(IBD)、环境损害诱发的结肠炎(例如，治疗方案诸如施用化学疗法、放射治疗等导致的或相关的(例如作为副作用)胃肠炎症(例如，结肠炎))、感染性结肠炎、缺氧性结肠炎、胶原性或淋巴性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、诸如慢性肉芽肿疾病或腹腔疾病这样的病症下的结肠炎、食品过敏、胃炎、感染性胃炎或小肠结肠炎(例如，幽门螺旋菌感染性慢性活动性胃炎)以及由于感染物导致的其它形式的胃肠炎症。
炎性肠病(IBD)包括一类慢性炎性病症，一般未知病原，例如，溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。临床和实验证据提示，IBD的发病是多因素的，涉及易感性基因和环境因素。在炎性肠病中，组织损伤是由针对肠道微生物抗原的不正确或过激的免疫应答所导致的。存在着用于炎性肠病的数种动物模型。某些最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱发的结肠炎模型或唑酮模型，其在结肠中诱发了慢性炎症和溃疡(Neurath等人，Intern.Rev.Immunol19：51-62，2000)。另一模型使用了硫酸葡聚糖钠(DSS)，其诱发了急性结肠炎，表现为血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和具有中性粒细胞浸润的粘膜溃疡。DSS诱发的结肠炎组织学特征在于炎性细胞向固有层的浸润，具有淋巴样增生、局部隐窝损伤和上皮溃疡(Hendrickson等人，Clinical Microbiology Reviews15：79-94，2002)。另一模型涉及初始CD45RB高CD4T细胞向RAG或SCID小鼠的过继转移。在这一模型中，供体初始T细胞攻击了受体肠部，导致了类似于人炎性肠病的慢性肠炎症和病症(Read and Powrie，Curr.Protoc.Immunol.第15章第15.13单元，2001)。本发明的拮抗剂在任何这些模型中的施用可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变与肠炎症诸如炎性肠病相关的病程的潜在效能。用于IBD的多种治疗选择是可用的，例如抗-TNF-α抗体治疗已被用于治疗克罗恩氏病有十年时间(Van Assche等人，Eur.J.Pharmacol.2009年10月电子出版)。然而，显著百分比的患者对于当前的治疗是难治的(Hanauer等人，Lancet359：1541-1549，2002；Hanauer等人，Gastroenterology130：323-333，2006)，并且因此需要靶向于难治患者群体的新型疗法。
炎性病症的另一个例子是炎性肺病。示例性炎性肺病包括感染诱发的肺病，包括与病毒、细菌、真菌、寄生虫或朊病毒感染相关联的肺病；过敏原诱发的肺病；污染物诱发的肺病，诸如石棉肺、矽肺或铍肺；胃内容物吸入诱发的肺病、免疫失调、具有遗传倾向的炎性病症诸如囊性纤维化，以及物理创伤诱发的肺病，诸如呼吸机肺损伤。这些炎性病症还包括哮喘、肺气肿、支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、肉样瘤病、组织细胞增多病、淋巴管性肌瘤病、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺病、支气管肺发育异常、社区获得性肺炎、医院性肺炎、呼吸机关联性肺炎、败血病、病毒性肺炎、流行性感冒感染、变异流行性感冒病毒感染、轮状病毒感染、人类偏肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染和曲霉或其它真菌感染。示例性的感染相关炎性疾病可包括病毒性或细菌性肺炎，包括重症肺炎、囊性纤维化、支气管炎、呼吸道急性加重和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。此类感染相关病症可涉及多重感染，诸如原发性病毒感染和继发性细菌感染。
哮喘是肺部的炎性疾病，其特征在于气道高反应性(“AHR”)、支气管狭窄、哮鸣音、嗜酸性或嗜中性炎症、粘液过分泌、上皮下纤维化以及升高的IgE水平。患有哮喘的患者经历了“急性加重”(症状的恶化)，最常见是因为呼吸道的微生物感染(例如，鼻病毒、流行性感冒病毒、感冒嗜血杆菌)。哮喘发作可由环境因素所触发(例如，蛔虫、昆虫、动物(例如，猫、犬、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸟类)、真菌、大气污染物(例如，烟草烟雾)、刺激性气体、烟雾、蒸气、气溶胶、化学品、花粉、活动或冷空气。除哮喘外，影响肺的多种慢性炎性疾病的特征在于对气道的中性粒细胞浸润，例如慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、细菌性肺炎和囊性纤维化(Linden等人，Eur.Respir.J.15：973-977，2000；Rahman等人，Clin.Immunol.115：268-276，2005)，并且诸如COPD、过敏性鼻炎和囊性纤维化这样的疾病的特征在于气道高反应性(Fahy与O’Byme，Am.J.Respir.Crit.Care Med.163：822-823，2001)。常用的哮喘和气道炎症动物模型包括卵清蛋白激发模型和乙酰甲胆碱敏感化模型(Hessel等人，Eur.J.Pharmacol.293：401-412，1995)。对来自培养的人支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞或气道平滑肌细胞的细胞因子和趋化因子的抑制也可作为体外模型使用。本发明的拮抗剂对于任何这些模型的给药可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变哮喘、气道炎症、COPD等等的病程的用途。
可通过本发明的方法来预防或治疗的其它炎性病症和神经病变是由自体免疫疾病导致的那些。这些病症和神经病变包括多发性硬化症、系统性红斑狼疮、以及神经退化性和中枢神经系统(CNS)失调，包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、双相性精神障碍和肌萎缩侧索硬化症(ALS)、肝脏疾病(包括原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精脂肪肝疾病/脂肪性肝炎、纤维变性、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)、糖尿病和胰岛素抗性)、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、脑溢血、中风和心肌梗塞)、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和青少年类风湿性关节炎(JRA)、骨质疏松、骨关节炎、胰腺炎、纤维变性、脑炎、牛皮癣、巨细胞性动脉炎、强直性脊柱炎、自体免疫肝炎、人免疫缺陷病毒(HIV)、炎性皮肤病症、移植、癌症、过敏、内分泌疾病、创伤修复、其它自体免疫疾病、气道高反应性以及细胞、病毒或朊病毒介导的感染或失调。
关节炎(包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由损伤引起的关节炎的关节等)是可受益于抗炎性蛋白诸如本发明的拮抗剂的治疗性用途的常见炎性病症。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病并且是关节炎的最常见形式之一。由于类风湿性关节炎导致了组织损伤，TLR3配基可在炎症位置存在。TLR3信号转导的激活可在红肿关节中维持炎症和进一步的组织损伤。本领域中已知多种类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱发的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展出了与人类风湿性关节炎高度相似的慢性炎性关节炎。本发明的TLR3拮抗剂对CIA模型小鼠的施用可用于评估这些拮抗剂改善症状和改变疾病病程的用途。
糖尿病(多尿症)是指源自多种治病因素并且特征在于高血糖的疾病过程(LeRoith等人，(编辑)，Diabetes Mellitus，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，Pa.U.S.A.1996)以及本文引用的全部文献。失控的高血糖关联于微血管和大血管病变的提高风险而造成的增多的和过早的死亡，包括肾病、神经病变、网膜病变、高血压、脑血管疾病和冠心病。因此，葡萄糖体内平衡的控制是治疗糖尿病的关键性重要手段。
潜在的缺陷将糖尿病归为两个大类：I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)，其当患者在其胰腺中缺少产胰岛素的β细胞时发生，以及2型糖尿病，(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)，其在具有受损的β细胞胰岛素分泌和/或对胰岛素活性的抗性的患者中发生。
2型糖尿病的特征在于胰岛素抗性，伴有相对的而非绝对的胰岛素缺乏。在胰岛素抗性个体中，身体分泌异常高量的胰岛素以补偿这一缺陷。当存在不足量的胰岛素以补偿胰岛素抗性并充分地控制葡萄糖时，发展出葡萄糖耐受性异常状态。在显著数量的个体中，胰岛素分泌进一步下降并且血糖水平升高，导致了临床状态的糖尿病。肥胖相关的炎症已被强烈地牵涉于胰岛素抗性、2型糖尿病、血脂异常和心血管疾病的发展。肥胖脂肪募集并且维持了巨噬细胞，并且可生成过量的促炎性细胞因子，包括TNF-α和IL-6，游离脂肪酸和脂肪因子，其可干扰胰岛素信号转导并且诱发胰岛素抗性。巨噬细胞上的TLR3激活可引起脂肪组织的促炎性状态。已知数种胰岛素抗性的动物模型。例如，在膳食诱发的肥胖症模型(DIO)中，动物发展出随着体重增加的高血糖和胰岛素抗性。向所述DIO模型施用本发明的TLR3拮抗剂可用于评估所述拮抗剂改善与2型糖尿病关联的并发症以及改变病程的用途。
脂肪性肝病涵盖了一定范围的肝病并且通常分为酒精性或非酒精性。在任一种情况下，脂肪性肝病的范围均从简单的肝脂肪变性(脂肪积聚和沉积)至酒精性和非酒精性脂肪性肝炎(ASH或NASH)，其通常进展为肝纤维化、硬化以及可能情况下的肝细胞恶性肿瘤。酒精性(AFLD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在组织学上不可区分；然而，根据定义NAFLD在饮用少量或不引用酒精的患者中发展。相反，NAFLD常见于患有肥胖症、代谢综合征以及2型糖尿病的个体中，并且密切联系于胰岛素抗性(Utzschneider等人，J Clin Endocrinol Metab91：4753-4761，2006)。随着近期肥胖症和胰岛素抗性流行的迅猛提高，作为最常见的慢性肝病NAFLD已经超越了AFLD和病毒性肝炎诱发的肝病。已经估计，约75％患有肥胖症的人具有HAFLD并且多至20％的可具有NASH(Clark，J Clin Gastroenterol40(附录1)：S5-S10，2006；Lazo等人，Semin Liver Dis28：339-350，2008)。
动脉粥样硬化性冠心病(CHD)是西方世界死亡和心血管发病的主要原因。动脉粥样硬化性冠心病的风险因素包括高血压、糖尿病、家族史、男性、香烟烟雾、高血清胆固醇、高低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平和低高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平。一般来讲，超过约225-250mg/dl的总胆固醇水平关联于CHD风险的显著提高。多种临床研究已经显示，提高水平的总胆固醇或LDL胆固醇促进了人动脉粥样硬化。流行病学研究已经证明，心血管发病率和死亡率直接随着总胆固醇和LDL胆固醇水平而变化。
示例性癌症可包括在细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种恶性疾病，包括但不限于白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、B细胞或T细胞ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛发细胞性白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠恶性肿瘤、胰恶性肿瘤、肾细胞恶性肿瘤、乳腺癌、鼻咽恶性肿瘤、恶性组织细胞增多病、恶性肿瘤的肿瘤伴随综合征/高血钙症、实体瘤、腺癌、鳞状上皮细胞癌、肉瘤、恶性黑素瘤尤其是转移性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关的骨重吸收和癌症相关的骨痛。
示例性心血管可包括在细胞、组织、器官、动物或患者中的心血管疾病，包括但不限于心脏顿抑综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病动脉粥样硬化性疾病、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、昏厥、休克、心血管系统性梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房纤颤(持续的或阵发性)、灌注后综合征、心肺旁路炎症反应、紊乱性或多源性房性心动过速、规则窄QRS波心动过速、特异性心律失常、心室纤维性颤动、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支性传导阻滞、心肌缺血性失调、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、心包膜疾病、心脏肿瘤、大动脉和外周动脉瘤、主动脉壁夹层形成、主动脉炎症、腹主动脉及其分支的闭塞、外周血管疾病、闭塞性动脉失调、外周动脉粥样硬化疾病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛症、静脉疾病、静脉血栓、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征和局部缺血再灌注损伤。
示例性神经疾病可包括在细胞、组织、器官、动物或患者中的神经疾病，包括但不限于神经退行性疾病、多发性硬化症、偏头痛、AIDS痴呆综合征、脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化症和急性横向脊髓炎；锥体束外和小脑失调，诸如皮质脊髓系统病灶；基底神经节失调或小脑失调；多动性运动失调，诸如亨廷顿氏舞蹈症和老年性舞蹈症；药源性运动失调，诸如阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的失调；运动减少性失调，诸如帕金森氏病；进行性核上性麻痹；小脑结构性病灶；脊髓小脑的退化，诸如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)、小脑皮层退化、多发性系统退化(Mencel症、Dejerine-Thomas症、Shi-Drager症和Machado-Joseph症)；全身失调(雷弗素姆氏病、无β-脂蛋白血症、共济失调、毛细管扩张和线粒体多系统失调)；脱髓鞘核失调，诸如多发性硬化症、急性横向脊髓炎；以及运动单元的失调，诸如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩侧索硬化症、婴儿型骨髓性肌萎缩症和青少年型骨髓性肌萎缩症)；阿尔茨海默病；中年的唐氏综合症；弥漫性路易体病；路易体型老年痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克雅二氏症；亚急性硬化泛脑炎、哈-斯二氏病和拳击员痴呆。
示例性的纤维化病症可包括肝纤维化(包括但不限于酒精诱发的硬化症、病毒诱发的硬化症、自体免疫诱发的肝炎)；肺纤维化(包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维化)；肾纤维化(包括但不限于硬皮病、糖尿病肾炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎)；表皮纤维化(包括但不限于硬皮病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩、烧伤)；骨髓纤维化；神经纤维瘤；纤维瘤；肠纤维化；以及外科手术导致的纤维性粘着。在这一方法中，所述纤维化可以是器官特异性纤维化或全身纤维化。所述器官特异性纤维化可关联于肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、血管纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化、骨髓纤维化或其它纤维化中的至少一种。所述肺纤维化可关联于特发性肺纤维化、药源性肺纤维化、哮喘、肉样瘤病或慢性阻塞性肺部疾病中的至少一种。所述肝纤维化可关联于硬化症、血吸虫病或胆管炎中的至少一种。所述硬化症可以是酒精性硬化症、丙型肝炎后硬化症、原发性胆汁性肝硬化。所述胆管炎可以是硬化性胆管炎。所述肾纤维化可关联于糖尿病性肾病或狼疮肾小球硬化症。所述心脏纤维化可关联于心肌梗塞。所述血管纤维化可关联于血管成形术后的动脉再狭窄或动脉粥样硬化。所述皮肤纤维化可关联于烧伤瘢痕、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或肾源性纤维化皮肤病。所述眼纤维化可关联于眼后纤维化、白内障手术或增生性玻璃体视网膜病变。所述骨髓纤维化可关联于发性骨髓纤维化或药物诱发的骨髓纤维化。所述其它纤维化可选自佩罗尼氏病、杜普伊特伦挛缩或皮肌炎。所述全身性纤维化可以是全身性硬化症或移植物抗宿主病。
给药/药物组合物
可通过标准研究技术测定在治疗或预防期望抑制TLR3活性的病状中有效的“治疗有效量”的所述药剂。例如，将在治疗或预防炎性病症诸如哮喘、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎或类风湿性关节炎中有效的药剂量可通过向相关的动物模型中施用所述药剂来测定，诸如本文所述的模型。
此外，体外测定法可任选地用于辅助鉴定最佳的剂量范围。对具体有效量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来测定。这类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员所知的其它因素。计划用于制剂中的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病严重性，并且应根据执业者的判断以及各个患者的状况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。
在本发明的方法中，所述TLR3拮抗剂可单独施用或与至少一种其它分子组合来施用。这类附加的分子可以是其它TLR3拮抗剂分子或具有并非通过TLR3受体信号转导而介导的治疗有益效果的分子。抗生素、抗病毒物、缓和剂和降低细胞因子水平或活性的其它化合物是这类附加分子的例子。
本发明的药剂的治疗应用的给药模式可以是将该药剂递送至宿主的任何合适的路径。这些药剂的药物组合物尤其有用于非肠道给药，例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内。
本发明的药剂可以制备成药物组合物，其含有在配药学上可接受的载体中的有效量的药剂作为活性成分。术语“载体”是指据活性化合物与其一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药物媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可以使用0.4％盐水溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物。它们可通过常规的已知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可按需含有配药学上可接受的辅助物质以模拟生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本发明的药剂在这种药物制剂中的浓度可变动很大，即从小于约0.5％、通常为或至少约1％至多达15或20重量％，且将根据所选择的具体给药方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。
因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含1ml的无菌缓冲水，以及1ng至约100mg的本发明的TLR3抗体拮抗剂，例如，约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg。相似地，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可经制备以包含约250ml的无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg并且优选地5mg至约25mg的本发明的拮抗剂。用于制备非肠道施用的组合物的实际方法是众所周知的，且更详细地描述在，例如，“Remington’s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA中。
可以将本发明的抗体拮抗剂冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中重构。已证实此技术对常规免疫球蛋白和蛋白制备有效，并且可以采用本领域已知的冻干法和复构技术。
本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。
实例1
抗-huTLR3拮抗剂mAb的鉴定和衍生化
MorphoSys人组合抗体文库(MorphoSys Human Combinatorial AntibodyLibrary)()Gold噬菌体展示文库(Morphosys AG，Martinsried，Germany)用作为人抗体片段的来源并且针对纯化的TLR3抗原进行淘选，所述TLR3抗原通过表达具有C末端聚组氨酸标签的人TLR3(huTLR3)的氨基酸1-703(SEQ ID NO：4)而生成并通过固相金属亲和色谱来纯化。氨基酸1-703对应于huTLR3的预测细胞外结构域(ECD)。特异性结合于huTLR3ECD的Fab片段(Fab)通过以多种方式呈递TLR3蛋白来选择，从而可对一组不同的抗体片段进行鉴定、测序并证实其独特性。通过不同的淘选策略将62种候选物(不同的V区序列)鉴定为独特的hTLR3ECD结合物。
在一定范围的相关于鉴定抗炎活性的基于细胞的测定法中，针对中和活性来筛选被鉴定为huTLR3ECD结合物的62种候选物。使用原始的活性数据(参见下文实例2)，从所述62种中选择定义了家族16-19的四种候选物(Fab16-19)作为亲本用于重链CDR2(HCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)的CDR成熟。亲本候选物之一(候选物19)在HCDR2中表现出N-键合的糖基化位点；在这一候选物中制备了Ser至Ala(S至A)的突变以删除该位点。在对四种亲本候选物进行CDR成熟后，鉴定了总计15种子代候选物(候选物1-15)以用于进一步表征，如下文实例2中所描述。所述19种候选物中各自存在的轻链和重链可变区的列表在上文表3中示出。所述候选物在此称为mAb1-19或Fab1-19，这取决于它们是否为Fab或作为全长抗体链被克隆(实例3)。由于表达载体设计，所有候选物的可变区的成熟氨基末端对于重链为QVE，而对于轻链为DI。这些末端处的优选序列是处于相应的种系基因中与所述候选序列具有高度同一性的那些序列。对于家族17和18，所述种系序列对于VH为QVQ，而对于VL为SY。对于家族19，所述序列对于VH为EVQ，而对于VL为DI。所述SY序列是λ亚族3独有的，并且就S或Y作为氨基末端残基有异质性的报道。因此，对于家族17和18的VL的DIE而言，来自主要的λ亚族1的QSV共有末端被认为是更为合适的替换。将这些变化引入来自家族18的候选物9、10和12以及来自家族19的候选物14和15。在这一过程中，这些抗体的VH和VL区均进行了密码子优化。候选物9、10和11的轻链可变区N末端种系变体的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：s209-211中示出，并且候选物9、10、12、14和15的重链可变区N末端种系变体的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：s212-216中示出。所述候选物的N末端变体在此称为候选物/mAb/Fab9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ。所述N末端种系变体被表达成为mAb，并且当与其亲本对应物相比较时，其对于结合TLR3或在其抑制TLR3生物活性的能力上表现出无影响(数据未显示)。
实例2
对TLR3拮抗剂活性的体外测定
上述15种CDR成熟化候选物被选作为潜在的人治疗剂，并且测定了一定范围的结合和中和活性。下文描述了活性测定法和所述四种亲本Fab，Fab16-19和15种CDR成熟化Fab，Fab1-15或其非种系V区变体的结果。
NF-κB和ISRE信号转导级联的抑制
293T细胞在补充有加热灭活FBS的DMEM和GlutaMax培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长并且使用30ng pNF-κB或ISRE萤火虫荧光素酶报告质粒、13.5ng pcDNA3.1载体、5ng phRL-TK和1.5ng编码FL TLR3的pCDNA(SEQ ID NO：2)进行转染。所述phRL-TK质粒包含海肾(Renilla)荧光素酶基因，其由HSV-1胸苷激酶启动子驱动(Promega，Madion，WI)。在加入聚(I:C)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)之前将TLR3抗体孵育30-60分钟。在加入Dual-Glo荧光素酶试剂前将所述平板在37℃下孵育6h或24h，并在FLUOstar酶标仪上读取平板。通过将萤火虫RLU除以海肾RLU来获得归一化值(荧光素酶比率)。在使用TLR3激动剂聚(I:C)(1μg/ml)进行刺激时，NF-κB或ISRE信号转导级联所刺激的萤火虫荧光素酶生成受到进行刺激前所述细胞与抗-TLR3抗体(0.4、2.0和10μg/ml)的孵育的特异性抑制。NF-κB测定的结果在图1中示出，并且以萤火虫/海肾比率的％抑制表达，5465作为阳性对照(中和抗-人TLR3Mab)并且抗-人组织因子mAb(859)作为人IgG4同种型对照。使用mAb浓度0.4-10μg/ml获得了＞50％抑制。c1068和TLR3.7在10μg/ml下抑制了约38％和8％的TLR3生物活性。使用ISRE报告基因测定法获得了类似的结果(数据未显示)。
BEAS-2B细胞中的细胞因子释放
将BEAS-2B细胞(SV-40转化的正常人支气管上皮细胞系)接种于I型胶原涂覆的碟中并且加入聚(I:C)前进行含或不含抗-人TLR3抗体的孵育。在处理二十四小时后，收集悬浮物并使用用于检测IL-6、IL-8、CCL-2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10的定制复合珠粒测定法(custommulti-plex bead assay)针对细胞因子和趋化因子水平进行测定。在图2中，以在0.4、2.0和10μg/ml下的mAb处理后对个体的细胞因子/趋化因子的％抑制来示出结果。5465是阳性对照；859是同种型对照。
NHBE细胞中的细胞因子释放
还在正常人支气管上皮(NHBE)细胞(Lonza，Walkersville，MD)中测定了细胞因子释放。扩展NHBE细胞并将其转移至胶原涂覆的碟中并且孵育48小时，此后去除该培养基并补充0.2ml新鲜培养基。随后在加入聚(I:C)之前将所述细胞进行含或不含抗-人TLR3mAb的孵育60分钟。24小时后收集上清液并在-20℃下储存或立即进行IL-6水平的测定。在图3中，以在使用介于0.001和50μg/ml之间的剂量进行的mAb处理后对IL-6分泌的％抑制来图示结果。5465是阳性对照，859是同种型对照。多数mAb在＜1μg/ml下抑制了至少50％的IL-6生成，并在＜5μg/ml下获得了75％的抑制。
PBMC细胞中的细胞因子释放
还在人外周血单核细胞(PBMC)中测定了细胞因子释放。从人类供体中将全血采集进入肝素采集管内，向其中缓慢地将Ficoll-Paque Plus溶液铺在下面。离心所述管，并且回收形成所述Ficoll紧上方的白色层的PBMC并涂布平板。随后在加入25μg/ml聚(I:C)之前将所述PBMC进行含或不含抗-人TLR3mAb的孵育。在24小时后，收集上清液并使用Luminex技术来测定细胞因子水平。在图4中，以使用单剂量mAb(0.4μg/ml)对IFN-γ、IL-12和IL-6的累积百分比抑制来图示结果，5465是阳性对照；hIgG4是同种型对照。
HASM细胞中的细胞因子释放
简而言之，在加入500ng/ml聚(I:C)与10ng/ml TNF-α的协同组合之前，对人类气道平滑肌(HASM)细胞进行含或不含抗-人TLR3mAb的孵育。在24小时后，收集上清液并使用Luminex技术测定细胞因子水平。在图5中，以使用三种剂量mAb(0.4、2和10μg/ml)的趋化因子CCL5/RANTES水平来图示结果。5465是阳性对照；hIgG4是同种型对照。
来自人类细胞中的所述体外测定的结果证实了本发明的抗体由于结合huTLR3而降低细胞因子和趋化因子释放的能力。
实例3
全长抗体构建体
所述四种亲本Fab(候选物no.16-19)和15种子代Fab(候选物no.1-15)的重链克隆进入具有S229P Fc突变的人IgG4背景。候选物9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ被克隆进入具有F235A/L236A和S229P Fc突变的人IgG4背景。
所述成熟全长重链氨基酸序列在SEQ ID NO：90-102和218-220中示出如下：
为进行表达，这些重链序列可包含N末端前导序列，诸如MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQ ID NO：103)。编码具有前导序列和成熟形式(不具有前导序列)的候选物14EVQ和15EVQ的重链的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO：104和105中分别示出。同样，为进行表达，本发明的抗体的轻链序列可包含N末端前导序列，诸如MGVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO：106)。编码具有前导序列和成熟形式(不具有前导序列)的经密码子优化的候选物15轻链的示例性核苷酸序列在SEQ ID NO：107和108中分别示出。
实例4
抗-TLR3mAb结合的表征
通过ELISA测定了所述mAb结合人TLR3细胞外结构域(ECD)的EC50值。人TLR3ECD蛋白在PBS中稀释至2μg/ml，并将100μl等分试样分配进入96孔平板(Corning Inc.，Acton，MA)的各个孔中。在4℃下过夜孵育后，将所述平板在由PBS中的0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich)组成的洗涤缓冲液中洗涤3次。使用200μl封闭溶液封闭孔，所述封闭溶液由PBS中的2％I-Block(Applied Biosystems，Foster City，CA)和0.05％Tween-20组成。在室温下封闭2小时后，将所述平板洗涤3次，随后加入系列。
表4：
候选物no. EC50(ng/ml)
1 17.18
2 53.12
3 23.42
4 12.77
5 19.94
6 19
7 16.13
8 18.58
9 22.61
10 15.84
11 26.33
12 25.59
13 23.51
14 33.59
15 32.64
16 43.66
17 13.8
18 9.68
19 66.54
抗-TLR3mAb候选物1至19在封闭缓冲液中稀释。所述抗-TLR3mAb在室温下孵育2小时并洗涤3次。随后加入以1∶4000稀释于封闭缓冲液中的过氧化物酶缀合的羊抗-人IgG(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，在室温下孵育1小时后在洗涤缓冲液中洗涤3次。通过在TMB-S(Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.，Concord，MA)中进行10-15分钟孵育来检测结合。所述反应使用25μl2N H2SO4来终止并且吸光度读数为使用SPECTRA Max分光光度计(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)在450nm下的吸光度减去650nm下的吸光度。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，SanDiego，CA)通过非线性回归来测定EC50值。
通过与100μl从2.5μg/ml至0.6pg/ml的4倍系列稀释度的mAb进行孵育来测定结合huTLR3的EC50值(表4)。包括了抗-人组织因子mAb859和hu IgG4κ以作为阴性对照。
还通过Biacore分析来测定对huTLR3ECD的结合亲和性。所述数据(未示出)显示，mAb1-19对于huTLR3ECD具有低于10-8M的Kd。
实例5
竞争性表位结合
进行了表位结合实验以测定抗-TLR3抗体竞争基团或“表位仓”。
对于竞争性ELISA，将根据实例1中所描述而产生的5μl(20μg/ml)的经纯化的人TLR3ECD蛋白涂覆于MSD HighBind平板(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)的各孔之上，室温下进行2小时。将150μl的5％MSD封闭物A缓冲液(Meso Scale Discovery)加入各孔并在室温下孵育2小时。使用0.1M HEPES缓冲液，pH7.4洗涤平板三次，随后加入具有不同竞争物的标记抗-TLR3mAb混合物。标记抗体(10nM)与增大浓度(1nM至2μM)的未标记抗-TLR3抗体一起孵育，并且随后以25μl混合物的体积加入到指定的孔内。在室温下轻柔振荡孵育2小时后，使用0.1M HEPES缓冲液(pH7.4)洗涤平板3次。使用蒸馏水稀释MSD读出缓冲液T(4倍)并以150μl/孔的体积分配，并以SECTOR Imager6000进行分析。根据制造商(Meso ScaleDiscovery)的说明使用MSD Sulfo-TagTM NHS酯标记抗体。
评估了以下抗-TLR3抗体：获自MorphoSys人组合抗体文库(表3a中示出)的mAb1-19；c1068(描述于WO06/060513A2)、c1811(大鼠抗-小鼠TLR3mAb，通过使用小鼠TLR3蛋白免疫化的大鼠生成的杂交瘤产生)、TLR3.7(eBiosciences，San Diego，CA，目录编号14-9039)和IMG-315A(针对人TLR3氨基酸第55-70位氨基酸(VLNLTHNQLRRLPAAN)生成，来自Imgenex，San Diego，CA)。对于mAb9、10、12、14和15，在本研究中使用了变体9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、12QVQ/QSV、14EVQ或15EVQ。
根据竞争测定法，将抗-TLR3抗体分配给五个不同的仓。仓A：mAb1、2、13、14EVQ、15EVQ、16、19；仓B：mAb3、4、5、6、7、8、9QVQ/QSV、10QVQ/QSV、11、12QVQ/QSV、17、18；仓C：抗体Imgenex IMG-315A；仓D：抗体TLR3.7、c1068；并且仓E：抗体c1811。
实例6
表位标测
来自如实例5描述的不同表位仓的代表性抗体经选择用于进一步的表位标测。表位标测使用不同的方法进行，包括TLR3区段互换实验、诱变、H/D交换和in silico蛋白-蛋白对接(The Epitope Mapping Protocols，Methodsin Molecular Biology，第6卷，Glen E.Morris编辑，1996)。
TLR3区段互换。使用TLR3人-小鼠嵌合蛋白来定位TLR3上的大致抗体结合结构域。人TLR3蛋白细胞外结构域被分成三个区段(aa1-209、aa210-436、aa437-708，根据基于人TLR3氨基酸序列GenBank Acc.No.NP_003256的氨基酸编号)。MT5420嵌合蛋白通过将人TLR3氨基酸210-436和437-708替换以对应的小鼠氨基酸(小鼠TLR3，GenBank Acc.No.NP_569054，氨基酸211-437和438-709)来生成。MT6251嵌合体通过将在第437-708位的人氨基酸替换以小鼠TLR3氨基酸(小鼠TLR3，GenBankAcc.No.NP_569054，氨基酸438-709)来生成。全部构建体均使用标准克隆程序在pCEP4载体(Life Technologies，Carslbad，CA)中生成。所述蛋白质在HEK293细胞中瞬时表达为V5-His6C-末端融合蛋白，并且如实例1中所描述进行纯化。
mAb c1068。mAb c1068以高亲和性结合人TLR3ECD但是并不与小鼠TLR3良好结合。c1068失去了其结合MT5420和MT6251二者的能力，显示了所述结合位点位于WT人TLR3蛋白的氨基酸437-708内。
mAb12QVQ/QSV。mAb12QVQ/QSV均结合嵌合体，表明了mAb12QVQ/QSV的结合位点位于具有SEQ ID NO：2中示出的序列的人TLR3蛋白质的氨基酸1-209内。
In silico蛋白-蛋白对接。mAb15EVQ的晶体结构(见下文)和公开的人TLR3结构(Bell等人，J.Endotoxin Res.12：375-378，2006)在CHARMm进行了能量最小化(Brooks等人，J.Computat.Chem.4：187-217，1983)以用作为对接的起始模型。蛋白质对接使用ZDOCKpro1.0(Accelrys，San Diego，CA)来进行，其等同于ZDOCK2.1(Chen和Weng，Proteins51：397-408，2003)，具有6度的角栅格(angular grid)。对人TLR3中已知的N-键合的糖基化位点Asn残基(Asn52、70、196、252、265、275、291、398、413、507和636)(Sun等人，J.Biol.Chem.281：11144-11151，2006)进行阻断以防通过ZDOCK算法的能量项来参与抗体-抗原复合物的界面。输出了2000种初始位并对其分簇，并将对接位加以精修并在RDOCK中再度计分(Li等人，Proteins53：693-707，2003)。目视检查具有最高的初始ZDOCK得分的200种位以及200种最高的RDOCK位。
Fab15EVQ的结晶化通过蒸气扩散方法在20℃下进行(Benvenuti和Mangani，Nature Protocols2：1633-51，2007)。初始筛选使用Hydra机器人在96孔平板中进行。该实验由0.5μl蛋白质溶液混以0.5μl储池溶液的小滴组成。将该小滴对90μl储池溶液进行平衡。使用Amicon Ultra-5kDa腔室将处于pH7.4，包含50mM NaCl的20mM Tris缓冲液中的Fab溶液浓缩至14.3mg/ml。使用Wizard I&II(Emerald BioSystems，Bainbridge Island，WA)和内部结晶筛选来进行所述筛选。Fab12QVQ/QSV以类似的方式进行结晶化。
收集了X射线衍射数据并处理，使用Rigaku MicroMaxTM-007HF微聚焦X射线发生器，配有OsmicTM VariMaxTM共聚焦光学器件、Saturn944CCD检测器和X-streamTM2000深低温冷却系统(Rigaku，Woodlands，TX)。衍射强度在270°晶体旋转下以120s每半度图像的曝光时间来检测。X射线数据使用D*TREK程序(Rigaku)来处理。通过使用Phaser或CNX程序(Accelrys，SanDiego，CA)来进行的分子置换法测定结构。通过REFMAC使用分辨率范围(对于Fab15EVQ)和(对于Fab12QVQ/QSV)的全部数据来精修原子位置和温度因子。使用3σ的截至电压水平将水分子加入(Fo-Fc)电子密度峰中。全部晶体学计算使用CCP4程序包来实施(CollaborativeComputational Project，Number4.1994.The CCP4suite：programs for proteincrystallography.Acta Crystallogr.D50：760-763)。模型调整使用COOT程序进行(Emsley等人，Acta Crystallogr。D60：2126-2132，2004)。
所解析的mAb15EVQ晶体结构显示，所述抗体组合位点的特征在于重链中大量的带负电残基(D52、D55、E99、D106和D109)。因此，mAb15EVQ与TLR3之间的识别最有可能涉及带正电的残基。所进行的蛋白-蛋白对接模拟提示，TLR3上涉及多个正电残基的两组大片块表现出对抗体的良好互补。TLR3上位于所模拟的TLR3-抗-TLR3抗体界面中的残基是R64、K182、K416、K467、Y468、R488、R489和K493。
诱变研究。将单突变和组合点突变引入经上文鉴定包含mAb12和mAb15EVQ表位的区域中的TLR3ECD的表面残基，并且针对抗体结合测试了所述突变体蛋白质。
将编码人TLR3氨基酸1-703(所述ECD)的核苷酸序列(SEQ IDNO：4；GenBank获取号NP_003256)使用标准方案进行克隆。全部突变体根据制造商规程使用Strategene Quickchange II XL试剂盒(Stratagene，SanDiego，CA)以表5a中示出的寡核苷酸通过定向诱变来生成。通过DNA测序来证实突变。所述蛋白质在HEK293细胞中以CMV启动子表达成为C-末端His-标签融合物，并且如实例1中所描述来纯化。
结合测定。通过ELISA来评估mAb12QVQ/QSV和mAb15EVQ对人TLR3和所产生的变体的结合活性。为加快该过程，通过将包含C-末端His标记的TLR3ECD突变体与mAb12QVQ/QSV进行共转染而将所预测的mAb15EVQ结合位点中的突变体在HEK细胞中进行了共表达，随后通过金属亲和色谱进行纯化。所回收的样品是TLR3突变体与mAB12的复合物。这一方法是可行的，这是因为mAb12QVQ/QSV和mAb15EVQ结合位点相互有别；并且因此，在一个位点上的点突变不太可能影响另一位点的表位。这些复合物被用于ELISA结合测定中。将5μl/孔的处于PBS中的20μg/ml野生型TLR3ECD或突变体蛋白涂覆于MSD HighBind平板之上(Meso ScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)。在室温下孵育所述平板60分钟并进行封闭。
表5a.示出了正义寡核苷酸的序列。在诱变反应中使用了具有互补序列 的反义寡核苷酸。
4℃下在MSD Blocker A缓冲液(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)中过夜。次日洗涤该平板并以500pM至1pM的浓度加入MSD Sulfo标签标记的mAb15EVQ1.5小时。洗涤之后使用MSD Read Buffer T检测所述标记的抗体，并且所述平板使用SECTOR Imager6000来读取。为评估mAb12QVQ/QSV对人TLR3和变体的结合活性，进行了与mAb15EVQ的共表达并如针对mAb15EVQ的描述实施了结合ELISA，不同的是检测用抗体为标记的mAb12QVQ/QSV。
mAb12QVQ/QSV：mAb12QVQ/QSV的结合位点位于人TLR3蛋白的氨基酸1-209内，如所述区段互换研究所测定。评估了以下TLR3突变体：D116R、N196A、N140A、V144A、K145E、K147E、K163E和Q167A。野生型TLR3和V144A突变体表现出可比较的与mAb12QVQ/QSV的结合(图6A)。所述抗体并不结合TLR3D116R突变体并且对于K145E突变体具有显著降低的结合亲和性。因此，在TLR3的表面相近排列的残基D116和K145经鉴定为mAb12QVQ/QSV的关键表位位点(图7A)。
mAb12QVQ/QSV结合表位的两个关键性残基位于TLR3胞外结构域的N-末端区段的dsRNA结合位点的表面附近(Pirher，等人，Nature Struct.&Mol.Biol.，15：761-763，2008)。完全表位应包含相邻区域的其它残基，其并未通过所实施的突变分析而显示出。不期望束缚于任何具体理论，据信mAb12QVQ/QSV在其TLR3表位上的结合可直接或间接地干扰dsRNA结合TLR3胞外结构域，由此而破坏了受体二聚化和下游信号转导通路的激活。
mAb15EVQ：评估了以下TLR3突变体：R64E、K182E、K416E、Y465A、K467E、R488E、R489E、N517A、D536A、D536K、Q538A、H539A、H539E、N541A、E570R、K619A、K619E、双突变体K467E/Y468A、三突变体T472S/R473T/N474S以及三突变体R488E/R489E/K493E。所述野生型TLR3、所述R64E、K182E、K416E突变体以及所述三突变体T472S/R473T/N474S表现出可比较的与mAb15EVQ(图6B和表5b)的结合。所述抗体并不结合TLR3突变体K467E、R489E、K467E/Y468A和R488E/R489E/K493E(图6B和6C)。其余的变体表现出中度结合，R488E具有最大的效果。全部这些突变体均结合mAb12QVQ/QSV。这些结果显示，残基K467和R489是mAb15EVQ表位的关键性决定基。残基R488也作用于该表位。这些残基在TLR3的相同表面上接近排列(图7A)。该结果还显示，残基Y465、Y468、N517、D536、Q538、H539、N541、E570和K619(全部与K467、R488和R489位于相同表面)作用于所述表位。这一结论受到以mAb15EVQ进行的H/D交换研究的进一步支持。图7A显示mAb12QVQ/QSV和15EVQ(黑色)以及C1068mAb(灰色)的结合表位位点在人TLR3的结构上相叠加。mAb15EVQ的表位覆盖了残基Y465、K467、Y468、R488、R489、N517、D536、Q538、H539、N541、E570和K619。
H/D交换研究。对于H/D交换，用于分析抗体扰动的程序类似于此前描述(Hamuro等人，J.Biomol.Techniques14：171-182，2003；Horn等人，Biochemistry45：8488-8498，2006)，有一定修改。重组TLR3ECD(通过Sf9细胞表达，具有C末端His-标签并进行纯化)在氘代水溶液中孵育预定时间，导致了氘在可交换氢原子处的并入。在包含固定化mAb15EVQ的柱上捕获氘代TLR3ECD并使用含水缓冲液洗涤。从柱上洗脱经回向交换的TLR3ECD蛋白并通过蛋白酶消化和质谱分析来测定含氘片段的定位。作为参考对照，对TLR3ECD样品进行了类似处理，不同的是其仅在抗体柱上的捕获后暴露于氘代水，并随后进行洗涤并以与实验样品相同的方式洗脱。结合于所述抗体的区域被推定为相对受保护免于交换的那些位点，并且因此而包含比参照TLR3ECD样品更高的氘比率。约80％的所述蛋白质可被标测至具体的肽。mAb15EVQ对TLR3ECD的H/D交换扰动图在图7B中示出。为清楚起见，仅示出了受到mAb15EVQ影响的部分的周边的TLR3区段。延伸至TLR3ECD的氨基和羧基末端的蛋白质的剩余部分未受到显著影响。
所述H/D交换研究将SEQ ID NO：2的肽区段465YNKYLQL471、514SNNNIANINDDML526和529LEKL532鉴定为在TLR3上的交换特别受结合mAb15EVQ的影响的区域。本质上H/D交换是线性的标测方法，并且通常并不定义所述肽区段中的那些残基最受抗体结合的影响。然而，所述H/D交换与突变结果之间的大量重合给出了增加的置信度，即图7A中示出的表面是mAb15EVQ的结合位点。这一结合位点处于此前针对mAb c1068所描述的相同线型氨基酸序列区域中(PCT公开no.WO06/060513A2)，但是据发现其位于完全不重合的表面(图7A)，这与这些抗体之间缺乏交叉竞争相一致。
所述mAb15EVQ结合表位在空间上邻近于TLR3上的C末端区段处的dsRNA结合位点(Bell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)103：8792-8797，2006；Ranjith-Kumar等人，J Biol Chem，282：7668-7678，2007；Liu等人，Science，320：379-381，2008)。不期望束缚于任何具体理论，据信mAb15EVQ在其TLR3表位上的结合导致了与配基sdRNA分子和/或二聚体伴偶的空间冲突，防止了配基结合和配基诱发的受体二聚化。
表5b.
实例7
具有增强的热稳定性的变体的生成
进行了基于结构的工程化以产生具有提高的热稳定性的抗体变体，同时努力维持生物活性并最小化免疫原性。
mAb15EVQ被选择用于工程化。为最小化免疫原性，仅寻求根据结构考虑被预测为有益的种系突变。使用BLAST搜索将mAb15EVQ的VL和VH序列(分别为SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：216)与人种系基因进行了比对。所鉴定出的最接近的种系序列对于VH和VL分别为GenBank Acc.No.AAC09093和X59318。在所述种系VH、VL与mAb15EVQ的VH和VL序列之间鉴定出了以下差别：(VH)V34I、G35S、F50R、A61S和Q67H；(VL)G30S、L31S和A34N。所鉴定出的序列差别被标测于mAb15EVQ的晶体结构上，并选择预测改变堆叠和界面相互作用的残基进行工程化。根据所述抗体的晶体结构(参见实例6)鉴定出了潜在的结构去稳定化残基。(1)在VH核心靠近V34处鉴定出了小封闭腔体。这一腔体大到足以容纳略微较大的侧链，诸如Ile。(2)VH CDR3的E99被包埋于VH/VL界面而无H结合网络。E99的带负电羧基基团处于基本疏水的环境中，与邻近残基大多为范德华(vdw)接触。包埋电荷基团通常在能量上是不利的并且因此具有去稳定化效果。(3)VH的F50是VH/VL界面残基。其芳族侧链体积大并且因此可对于配对具有不良影响。对Fv的H结合和vdw堆叠网络进行计算并在Pymol中目视检查(www：//_pymol_org)。在VH和VL结构域中包埋的腔室通过Caver来计算(Petrek等人，BMC Bioinformatics，7：316，2006)。全部分子图形在Pymol中制成。使用Quick Change II XL SiteDirected Mutagenesis Kit(Stratagene，San Diego，CA)、Change-IT MultipleMutation Site Directed Mutagenesis Kit(USB Corporation，Cleveland，OH)或Quick Change II Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，San Diego，CA)使用标准克隆技术来向生成如实例3中所描述的编码Fab片段或IgG4全人抗体的表达载体中制造突变。所述反应根据各制造商的建议而进行。所获得的克隆经测序验证，并将所得的工程化变体根据其修饰的重链或轻链而命名为mAb15-1-15-10。各变体链(H或L)与野生型mAb15EVQ L或H链一起表达以产生抗体，不同的是mAb15-10的重链来自于mAb15-6。SEQ IDNO的列表：对于CDR，表6中示出了mAb15EVQ及其工程化变体的轻链和重链的不同区域以及全长重链和轻链。表7示出了用于生成各变体的引物。
表6：
通过ELISA免疫测定法评估mAb15-1-15-9与TLR3的结合。人TLR3ECD(100μl的2μg/ml的TLR3-ECD)在4℃下结合黑色Maxisorb平板(eBioscience)过夜。洗涤并封闭所述平板，并将稀释的抗体以50μl/孔重复分样于孔内。在RT下轻柔振荡孵育所述平板2小时。使用发光POD底物(Roche Applied Science，Mannheim，Germany，目录No.11 582 950 001)和山羊抗-人Fc：HRP(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，目录No.109-035-098)检测结合，并在SpectraMax酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中读取该平板。
在MicroCal’s Auto VP-毛细DSC系统(MicroCal，LLC，Northampton，MA)中进行DSC实验，其中对参比和样品孔之间的温度差异进行了连续测量并校准为能量单位。从10℃至95℃度以60℃/小时的加热速度加热样品。预扫描时间为15分钟并且过滤周期为10秒。所述DSC实验中使用的浓度为约0.5mg/ml。使用MicroCal Origin7软件(MicroCal，LLC)进行所得热谱曲线的分析。
表7：
所生成的变体的热稳定性(Tm)通过DSC进行测量(表8)。所述抗体变体与TLR3的结合与亲本抗体是可比较的。
表8.变体的熔融温度(TM)的概述以及制备它们的根据。
实例8
替代抗-TLR3抗体的生成
生成了在本文命名为mAb5429的嵌合拮抗性大鼠/小鼠抗-鼠TLR3抗体以用于评估在多种体内模型中抑制TLR3信号转导的效果，这是因为在实例1中生成的人源化抗体对于小鼠TLR3不具有充分的特异性或拮抗剂活性。所述替代嵌合mAb5429及其亲本大鼠抗-小鼠TLR3抗体c1811抑制了体外和体内小鼠TLR3信号转导，并且改善小鼠的若干疾病模型中的发病机制。
下文所讨论的数据提示了TLR3在诱发和维持有害炎症中的作用，并且参与了TLR3拮抗剂和TLR3抗体拮抗剂的治疗用途的理论基础，例如急性和慢性炎性病症，包括高细胞因子血症、哮喘和气道炎症，炎性肠病和类风湿性关节炎、病毒感染以及II型糖尿病。
替代mAb5429的生成
使用重组小鼠TLR3胞外结构域(Seq ID NO：162的氨基酸1-703，GenBank Acc.No.NP_569054)免疫CD大鼠，所述胞外结构域使用常规方法生成。将来自表现出特异于小鼠TLR3的抗体滴度的两只大鼠的淋巴细胞融合于FO骨髓瘤细胞。鉴定出了对小鼠TLR3具有反应性的单克隆抗体平板并针对体外拮抗剂活性在小鼠荧光素酶报告基因和小鼠胚胎成纤维细胞测定法中进行测试。杂交瘤细胞系C1811A被选用于进一步的工作。通过从所述杂交瘤中分泌的mAb c1811来对功能性可变区基因进行测序。随后将所克隆的重链和轻链可变区基因分别插入质粒表达载体，其提供了编码序列以用于通过常规方法生成嵌合大鼠/Balb C muIgGl/κmAb，命名为mAb5429。如实例3中所述表达了所述抗体。mAb5429重链和轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：163中分别示出，并且所述重链和轻链全长序列在SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：165中分别示出。mAb c1811的重链和轻链全长序列在SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：167中分别示出。
mAb5429的表征
mAb5429在体外测定法的平板中就其对于TLR3信号转导的中和能力进行了表征。所述活性测定法和结果如下文描述。
小鼠荧光素酶报告基因测定
小鼠TLR3cDNA(SEQ ID NO：161，GenBank Acc.No：NM_126166)使用标准方法通过PCR从小鼠脾脏cDNA(BD Biosciences，Bedford，MA)中扩增并克隆进入pCEP4载体(Life Techmologies，Carslbad，CA)。将200μlHEK293T细胞以在完全DMEM中4×104个细胞/孔的浓度涂布于96孔白色透明底平板中，并次日使用Lipofectamine2000(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA)进行转染，所述转染使用30ng pNF-κB萤火虫荧光素酶(Stratagene，SanDiego，CA)或30ng pISRE萤火虫荧光素酶(BD Biosciences，Bedford，MA)、5ng phRL-TK对照海肾荧光素酶(Promega Corp.，Madison，WI)报告基因质粒、1.5ng编码全长小鼠TLR3的pCEP4以及13.5ng空pcDNA3.1载体(LifeTechnologies，Carslbad，CA)来补足总DNA量至50ng/孔。转染后24小时，在加入0.1或1μg/μl聚(I:C)之前，在37℃下将所述细胞与新鲜无血清DMEM中的抗-小鼠TLR3抗体孵育30分钟至1小时。在24小时后使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega，Madison，WI)收集所述平板。使用FLUOstar OPTIMA多检测读出器以OPTIMA软件(BMG Labtech GmbH，Germany)来测量相对光单位。通过将萤火虫相对光单位(RLU)除以海肾RLU来获得归一化值(荧光素酶比率)。mAb5429及其亲本mAb c1811和mAb15(表3a)以剂量依赖性的方式降低了聚(I:C)诱发的NF-kB和ISRE激活(图8A和8B)，显示了它们拮抗TLR3活性的能力。在ISRE测定法中测得的IC50对于mAb5249、mAB15和mAb c1811分别为0.5、22和0.7μg/ml。
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)测定
C57BL/6MEF细胞可购自Artis Optimus(Opti-MEFTM C57BL/6-0001)。以20,000细胞/孔将所述细胞在200μl MEF培养基(DMEM，具有glutamax、10％加热灭活的FBS、1×NEAA和10μg/ml庆大霉素)中涂布于96孔平底平板(BD Falcon)。全部孵育均在37℃/5％CO2下进行。在涂布平板24小时后，将mAb5429或mAb c1811加入孔内。将所述平板与所述mAb孵育1小时，此后将聚(I:C)以1μg/ml加入各孔内。在24小时孵育后收集上清液。根据制造商规程使用珠粒试剂盒(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA)来检测CXCL10/IP-10，从而测定细胞因子水平。使用GraphPad Prism软件对所述结果作图。两种抗体均以剂量依赖性的方式降低了聚(I:C)诱发的CXCL10/IP-10水平，显示了这些抗体拮抗内源TLR3和抑制TLR3信号转导的能力(图9)。
流式细胞术-表面染色
C57BL/6和TLR3敲除株(TLR3KO)(C57BL/6背景；雌性，8-12周龄，Ace Animals，Inc.)以10只/组使用1ml的3％巯基醋酸盐培养基(Sigma)进行腹膜内注射给药，并且在96小时后，将小鼠安乐处死并对来自各小鼠的腹膜以10ml无菌PBS进行灌洗。将巯基醋酸盐引发的腹膜巨噬细胞重悬浮于PBS中并使用台盼蓝染色来评估细胞存活率。通过离心沉积细胞并将其重悬浮于250μl FACS缓冲液内(PBS-Ca2+-Mg2+，1％加热灭活FBS，0.09％叠氮化钠)并保持于湿冰上。以10μg/106个细胞使用CD16/32试剂(eBioscience)10分钟来封闭巨噬细胞上的Fc受体。以100μl/孔中106个细胞分配所述细胞以用于表面染色。Alexa-Fluor647(Molecular Probes)缀合的mAb c1811和mAb1679(大鼠抗-小鼠TLR3抗体，无TLR3特异性，并且因此而用作为同种型对照)以0.25μg/106个细胞加入并在黑暗中于冰上孵育30分钟。洗涤所述细胞并重悬浮于250μl的FACS缓冲液中。在FACSCalibur对样品采样前，将存活率染色物7-AAD(BD Biosciences，Bedford，MA)以5μl/孔加入不超过30分钟以检测死亡细胞群体。通过FACS Calibur使用Cell Quest Pro软件采样。使用FCS Express通过形成直方图来分析所收集的数据。
通过流式细胞术来评估mAb c1811对来自C57BL/6和TLR3KO小鼠的小鼠巯基醋酸盐引发的腹膜巨噬细胞的结合，从而测定结合特异性。mAb5429并不用于本分析，这是因为这一嵌合抗体的小鼠Fc区预计引起非特异性结合。mAb c1811对TLR3KO巨噬细胞表现出无结合，并对C57BL/6腹膜巨噬细胞的细胞表面表现出提高的结合，提示了所述mAb对TLR3的特异性(图10)。与mAb c1811具有相同结合区域的mAb5429被假定具有与mAb c1811相同的结合特异性。
实例9
TLR3抗体拮抗剂针对TLR3介导的全身炎症进行保护
模型
聚(I:C)诱发的全身细胞因子/趋化因子模型被用作为TLR3介导的全身炎症的模型。在这一模型中，腹膜内递送的聚(I:C)(PIC)诱发了全身的细胞因子和趋化因子反应，其部分地是TLR3介导的。
对雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6背景；8-10周龄，Ace Animals，Inc.)经皮下给以在0.5ml PBS中10、20或50mg/kg的mAb5429，在0.5ml PBS中2、10或20mg/kg的mAb c1811或单独给以0.5ml PBS(媒介物对照)。在抗体给药24小时后，对小鼠经腹膜内给予0.1ml PBS中50μg的聚(I:C)(Amersham目录No.26-4732批号IH0156)。在聚(I:C)刺激1和4个小时后采集眼后血。通过全血制备血清并通过Luminex针对细胞因子和趋化因子浓度进行分析。
结果
腹膜内递送的聚(I:C)诱发了全身细胞因子和趋化因子反应，其部分为TLR3介导的，如TLR3KO动物中成组趋化因子和细胞因子生产的显著降低所证实的那样(表9A)。在聚(I:C)刺激后1小时，TLR3依赖性聚(I:C)诱发的调节物为IL-6、KC、CCL2/MCP-1和TNF-α而在聚(I:C)刺激后4小时为IL-1α、CCL5/RANTES和TNF-α。mAb c1811和mAb5429均显著地降低了这些TLR3依赖性调节物的水平，显示出了所述抗体在体内降低TLR3信号转导的能力(表9B)。表9中的数值以六只动物/组的平均细胞因子或趋化因子浓度(以pg/ml为单位)±SEM来示出。这些数据提示，在诸如细胞因子风暴或致死性休克这样的病症中，TLR3拮抗作用在降低过量的TLR3介导的细胞因子和趋化因子水平中可能是有益的。
表9A.
*p＜0.001：对C57BL/6PBS的单因素方差分析
**p＜0.001：对C57BL/6PIC的单因素方差分析
表9B.
***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05：将单因素方差分析统计值与C57BL/6+PIC组比较
实例10
TLR3抗体拮抗剂降低了气道高反应性
模型
通过聚(I:C)诱发了气道高反应性。
对雌性C57BL/6小鼠(12周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6背景；12周龄，Ace Animals，Inc.)使用异氟烷进行麻醉并鼻内施用了处于50μl无菌PBS中多剂量(10-100μg)的聚(I:C)。小鼠接受了三次聚(I:C)(或PBS)给药，每次给药之间具有24小时的休养期。最后一次聚(I:C)(或PBS)给药24小时后，使用全身体积描记系统(BUXCO系统)测量了肺功能和对乙酰甲胆碱的气道高反应性。将所述小鼠置于全身体积描记仓内，并令其适应至少5分钟。在基线读数后，将小鼠暴露于趋升剂量的雾化乙酰甲胆碱(Sigma，St.Louis，MO)。施用所述雾化乙酰甲胆碱2分钟，随后为5分钟的数据收集期，随后为下一次趋升剂量的乙酰甲胆碱刺激前的10分钟休养期。提高的气道抗性被测量为增强呼气间歇(Penh)并且以5分钟记录期(BUXCO system)的平均Penh值来表示。在肺功能测量后，对小鼠安乐处死并对肺进行插管。通过将1ml的PBS注射进入肺并回收流出物来进行支气管肺泡灌洗(BAL)。移取肺组织并冷冻。BAL液进行离心(1200rpm，10分钟)并收集无细胞上清液并储存于-80℃下直至分析。将细胞沉淀物重悬浮于200μl PBS中以进行总细胞计数和差异细胞计数。根据制造商规程和Multiplex Immunoassay Kit(Millipore，Billercia，MA)进行多元测定。
结果
此前的观测显示，聚(I:C)的鼻内给药在小鼠中诱发了TLR3介导的肺功能损伤，在全身体积描记系统(Buxco)基线处具有提高的增强呼气间歇(PenH)测量值以及对烟雾化的乙酰甲胆碱的提高反应性(气道高反应性的指征)(PCT公开No.WO06/060513A2)。肺功能中的这一损伤与中性粒细胞向肺中的募集以及肺中促炎性细胞因子/趋化因子的提高水平相关联。在本研究中，通过在聚(I:C)刺激前以50mg/kg皮下施用各抗体而在聚(I:C)诱发的肺功能损伤中评估了mAb1811和mAb5429的效果。
通过在聚(I:C)刺激前使用TLR3抗体拮抗剂处理动物而显著降低了TLR3介导的肺功能损伤。在抗-TLR3抗体处理的动物中防止了TLR3介导提高基线PenH和气道对乙酰甲胆碱的敏感性(图11)。此外，在抗-TLR3抗体处理的动物中，TLR3介导的中性粒细胞向小鼠肺中的募集和气道中趋化因子的生成被降低。通过所收集的支气管肺泡灌洗液(BALF)来测量中性粒细胞数量(图12)和CXCL10/IP-10水平(图13)。所述研究重复了至少三次，结果类似。图11、12和13中示出的数据来自一组代表性研究。每个符号代表了来自一只小鼠的数据点，水平条示出了组平均值。本研究显示，在所使用的模型中，全身施用的TLR3抗体拮抗剂到达了肺部，降低了TLR3介导的肺功能损伤、中性粒细胞向气道中的浸润、趋化因子生成和呼吸道炎症。因此，TLR3拮抗剂可在治疗或预防呼吸道疾病中是有益的，所述疾病特征在于气道高反应性，诸如哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化。
实例11
TLR3抗体拮抗剂针对炎性肠病进行保护
模型
DSS结肠炎模型被用作为炎性肠病的模型。
雌性C57BL/6小鼠(8周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6背景；＜8周龄，重16.5g至18g，Ace Animals，Inc.)从第-1日开始以γ照射的食物进行喂养。DSS(硫酸葡聚糖)(MP Biomedicals，Aurora，OH，目录编号160110；35-50kDa；18-20％硫，批号8247J)在高压消毒的酸化饮用水中稀释至5％的最终浓度。施用所述DSS水5天，此后以无味水代替。在整个研究中，允许小鼠随意饮用水。全部水瓶均每日称重以记录水消耗。在第0、2和4日，使用5mg/kg(0.1mg，0.1ml PBS中)mAb5429、小鼠抗-TNF-α抗体或作为对照的PBS对小鼠进行腹膜内给药。在整个研究中每天监测小鼠并在第0至第4日和第7日对其称重。在本研究的第2和第7日安乐处死小鼠。打开腹腔并将升结肠在其连接盲肠处切开。收集结肠并在10％中性缓冲福尔马林中固定。将结肠进行石蜡包埋、切片并进行H&E染色(QualtekMolecular Labs，Santa Barbara，CA)。结肠组织病理学评估由兽医病理学家以盲化方式完成，如下文所描述(PathoMetrix，San Jose，CA)。
组织病理学评估
对两个片段的大肠、结肠和直肠进行评估并针对以下变化而计分：(i)单细胞坏死；(ii)上皮溃疡；(iii)上皮脱落；(iv)隐窝脓肿；(v)细胞增殖；(vi)隐窝细胞增殖；(vii)固有层中肉芽组织的形成；(viii)粘膜下层中的肉芽组织；(ix)粘膜下炎性细胞浸润，中性粒细胞为主；以及(x)粘膜下浮肿。
根据以下标准给出了严重性的单一总体计分：
0-不存在
1-轻微、局部或偶见
2-轻微、多局部
3-中度、多发但在限定区域内
4-严重、多发于大量区域或递交组织的延伸中
5-非常严重、延伸至所递交组织的大部分
结果
此前的观测显示，在DSS摄入诱发的炎性肠病的模型中，TLR3KO动物与野生型小鼠相比表现出显著降低的组织病理学(PCT公开No.WO06/60513A2)，因此提示TLR3信号转导在这一模型的发病中发挥作用。据报道从坏死细胞中释放的共生细菌RNA或哺乳动物RNA可充当内源配基刺激TLR3信号转导(Kariko等人，Immunity23165-2311752005；Kariko等人，J.Biol.Chem.279：12542-125502004)，并且因此胃肠道中的内源配基导致的TLR3刺激可在DSS结肠炎模型中增强并维持炎症。
根据复合组织病理学得分评估，在DSS暴露动物中经抗-TLR3抗体处理后疾病严重性被缓解(图14)。图14以水平条示出了疾病严重性得分的平均值、标准偏差和95％置信区间。当与未处理的野生型动物相比，在以抗-TLR3抗体处理的野生型DSS暴露动物中观察到了所述得分中的显著降低(p＜0.05)。DSS暴露的TLR3KO动物受到了针对DSS诱发的变化的保护。接受抗-小鼠TNF-αmAb的DSS暴露动物在所述DSS模型中表现出组织病理学无改善。因此，所述DSS模型可用于评估治疗剂，所述治疗剂可靶向于人类患者群体，其对于抗-TNF-α治疗无响应，并且中和性抗-TLR3抗体可具有向患有炎性肠病的对抗TNF-α治疗不响应的患者提供益处的潜能。
模型
T细胞转移模型被用作为炎性肠病的模型。在这一模型中，通过转移来自免疫能力小鼠中的清空了调节性T细胞的初始T细胞的群体以在SCID小鼠中诱发胃肠道炎症，所述T细胞攻击胃粘膜中的抗原呈递细胞。
初始T细胞(CD4+CD45RB高T细胞)经腹膜内注射进入SCID受体以诱发慢性结肠炎。在转移T细胞48小时后开始对小鼠给以PBS(500μl/小鼠，经腹膜内；媒介物对照)、mAb5429(0.1mg/小鼠，经腹膜内)或抗-TNF-α抗体(0.05mg/小鼠，经腹膜内；阳性对照)，并随后在整个8周研究中每周进行两次。在T细胞转移8周后(或当小鼠失去其原始体重＞15％时)，对动物安乐处死并移取结肠。对结肠进行固定、石蜡包埋和H&E染色。以盲化方式定量评估组织病理学(细胞浸润、隐窝脓肿、上皮溶蚀、杯状细胞损耗和肠壁增厚)。
结果
在接受了T细胞转移的动物中，疾病严重性经使用抗-TLR3抗体进行治疗而缓解，如根据与对照动物相比在组织病理学得分总和中的显著降低所评估(p＜0.05)(图15A)。对于得分总和，评估了隐窝脓肿、溃疡、中性粒细胞内流、杯状细胞损耗、异常隐窝、固有层炎症和透壁受累。对于隐窝脓肿、溃疡和中性粒细胞内流观测到了显著性降低(全部p＜0.05)(图15B)。抗-TNF-α抗体作为阳性对照在已知提供最佳益处的剂量下使用。
使用两种熟知的炎性肠病模型(所述DSS和所述T细胞转移模型)进行的研究显示，全身递送的TLR3抗体拮抗剂到达了胃粘膜并且降低了通过两种不同发病机制诱发的胃肠道炎症。因此，TLR3拮抗剂可对于治疗炎性肠病是有益处的，所述炎性肠病包括抗-TNF-α-难治性病例，以及胃肠道中的其它免疫介导的病理。
实例12
TLR3抗体拮抗剂针对胶原诱发的关节炎进行保护
模型
胶原诱发的关节炎(CIA)模型被用作为类风湿性关节炎的模型。
将雄性B10RIII小鼠(6-8周龄，Jackson Labs)分成15/组(关节炎组)或4只/组(对照小鼠)。在第0日和第15日，对关节炎组使用异氟烷进行麻醉并给以II型胶原(Elastin Products)和补充有结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(Difco)的弗氏完全佐剂的注射。在第12日，具有进行中的II型胶原关节炎的小鼠根据体重随机化进入治疗组，并且在第12、17和22天(d12、d17、2d2)以mAb5429(25mg/kg)、阴性对照抗体CVAM(在小鼠中无已知特异性的重组mAb)(5mg/kg)或抗-TNF-α抗体(5mg/kg，阳性对照)对其进行皮下(SC)给药。此外，在第12至25日，对照组小鼠使用媒介物(PBS)或地塞米松(0.5mg/kg，Dex，参考化合物)逐日(QD)进行皮下(SC)处理。从第12至第26日对动物进行逐日观察。通过临床计分系统来评估前爪和后爪(见下文)。在研究第26日对动物安乐处死，并以盲化方式评估组织病理学(计分系统在下文描述)。效能评估是基于动物体重和临床关节炎得分。全部动物均存活至研究终结。
前爪和后爪的临床计分标准
0-正常
1-后爪或前爪关节受患或最低的扩散红斑和肿胀
2-后爪或前爪关节受患或轻微的扩散红斑和肿胀
3-后爪或前爪关节受患或中度的扩散红斑和肿胀
4-显著的扩散红斑和肿胀，或＝4组指关节受患)
5-严重的扩散红斑和严重肿胀的整个爪体，无法弯曲的指节)
患有II型胶原关节炎的小鼠关节的组织病理学计分方法
当对来自具有II型胶原关节炎的病灶的小鼠的爪或踝进行计分时，考虑了变化的严重性以及受患的个体关节的数量。当可能的大量掌部/跖部/指部或跗骨/胫跗骨关节中仅有1-3组爪关节或踝关节受患时，根据变化严重性而对下文参数给以1、2或3的最大得分的主观指配。如果涉及超过2个关节，则下文标准被应用于最严重受患的/主要的关节。
爪得分的临床数据使用第1-15日的AUC进行分析，并且通过对照计算了％抑制。
炎症
0-正常
1-在受患关节的滑膜和关节周组织中最低的炎性细胞浸润
2-轻微浸润，如果是爪体，限制于受患关节
3-具有中度浮肿的中度浸润，如果是爪体，限制于受患关节
4-显著的浸润，影响大部区域，具有显著的浮肿
5-严重的扩散浸润，具有严重的浮肿
关节翳
0-正常
1-在软骨或软骨下骨处关节翳的最低浸润
2-轻微浸润，受患关节中硬组织的边缘区破坏
3-中度浸润，受患关节中中度的硬组织破坏
4-显著的浸润，大部分关节中关节结构的显著破坏
5-严重的浸润，关联于关节结构的全部或几乎全部破坏，影响所有关节
软骨损伤
0-正常
1-最低至轻微的甲苯胺蓝染色减损，受患关节中无明显软骨细胞减损或胶原破坏
2-轻微的甲苯胺蓝染色减损，受患关节中具有局部轻微(表层)软骨细胞减损和/或胶原破坏
3-甲苯胺蓝染色的中度减损，受患关节中多局部中度(深度达到中间区域)软骨细胞减损和/或胶原破坏
4-甲苯胺蓝染色的显著减损，多数关节中多局部显著(深度达到深区域)软骨细胞减损和/或胶原破坏
5-甲苯胺蓝染色的严重的扩散减损，全部关节中多局部严重(深度达到潮痕)软骨细胞减损和/或胶原破坏
骨重吸收
0-正常
1-最低，具有小面积重吸收，在低倍放大下不易显见，受患关节中罕有破骨细胞
2-轻微，具有更多面积的，低倍放大下不易显见，受患关节中更多的破骨细胞
3-中度，具有髓骨小梁和皮质骨的明显重吸收，无皮质中的全厚度缺陷，某些髓骨小梁的缺损，低倍放大下明显的病灶，受患关节中更多的破骨细胞
4-显著，具有皮质骨中的全厚度缺陷，通常具有剩余皮质表面轮廓的扭曲，髓质骨的显著减损，大量的破骨细胞，影响多数关节
5-严重，具有皮质骨中的全厚度缺陷，以及全部关节的关节结构破坏
结果
地塞米松(Dex)和抗-小鼠TNF-α抗体作为阳性对照使用，PBS作为媒介物对照使用，而CVAM作为阴性对照抗体使用。全部处理在本研究的第12日开始，处于关节疾病发展期间。到第22日，媒介物处理的疾病对照动物的发病率为100％。使用媒介物或CVAM抗体处理的阴性对照组具有最高的临床得分。对于使用Dex(对于d18-d26，p＜0.05)、5mg/kg的抗-TNF-α抗体(对于d18-d26，p＜0.05)或25mg/kg的mAb5429(对于d18-d23和d25-d26，p＜0.05)处理的组，观察到了显著降低的临床得分(图16)。与媒介物对照相比，以曲线下面积(AUC)表示的临床关节炎得分通过使用25mg/kgmAb5429(43％的降低)、5mg/kg的抗-TNF-α抗体(52％)或Dex(69％)的处理显著降低。图17示出了各组AUC的平均值和标准偏差。
还评估了所述处理的组织病理学效应。与媒介物对照相比，通过使用25mg/kg的mAb5429(47％减少)进行处理显著减少了爪骨重吸收。使用5mg/kg的抗-TNF-α抗体处理的阳性对照小鼠具有显著减少的爪炎症(33％)、软骨损伤(38％)和爪得分总和(37％)。使用Dex进行的处理显著降低了全部爪组织病理学参数(总和得分的73％降低)。
这些数据显示，TLR3抗体拮抗剂在CIA模型中改善了临床和组织病理学疾病症状，并且提示了TLR3拮抗剂对于治疗类风湿性关节炎的用途。
实例14
TLR3抗体拮抗剂针对急性致死病毒感染进行保护
模型
甲型流行性感冒病毒刺激模型作为急性致死病毒感染的模型使用。
在第-1、4、8和12日，对雌性C57BL/6小鼠(12周龄)或雌性TLR3KO小鼠(C57BL/6背景；12周龄，ACE Animals，inc.，15只小鼠/组)经皮下以20mg/kg的mAb5429给药或以PBS单独给药。在第0日，所述小鼠通过异氟烷进行麻醉并且进鼻内施用甲型流行性感冒/PR/8/34病毒(ATCC，Rockland，MD，批号218171)，其处于25μl PBS中(等价于105.55CEID50)。针对体重变化和14天期间的存活率而每天观察动物两次。使用临床计分系统来评估疾病进展的水平和响应于甲型流行性感冒病毒治疗的细微改善。
临床得分
0-正常，警觉并具反应性，无可见的疾病迹象
1-表皮褶皱，具有或不具有轻微降低的活动
2-表皮褶皱，行动时蜷缩姿态，慵懒的活动，呼吸困难
3-表皮褶皱，呼吸困难，共济失调，颤抖
4-表皮褶皱，在柔和的戳刺下不能活动，无知觉，触感冰冷
5-被发现死亡
结果
本研究中评估了存活率、每日临床得分以及体重变化。当与以流行性感冒病毒接种的C57BL/6小鼠比较时，施用了mAb5429(20mg/kg)的甲型流行性感冒感染的WT小鼠和未接受mAb5429的甲型流行性感冒感染的TLR3KO在存活率(分别为p＜0.001和p＜0.01)上表现出统计上显著的提高，显示了TLR3的拮抗或缺失可预防流行性感冒诱发的死亡(图18)。在接受了20mg/kg mAb5429的组中以及在TLR3KO组中，临床得分显著降低(图19)。在流行性感冒病毒施用后的14天期间观察了所述小鼠的体重。在以甲型流行性感冒病毒给药的C57BL/6小鼠中体重稳步降低。然而，以20mg/kg mAb5429给药的C57BL/6小鼠以及TLR3KO小鼠显示出相对于以流行性感冒病毒接种的WT C57BL/6小鼠显著更高的体重(图20)。这些结果显示，TLR3抗体拮抗剂在急性致死流行性感冒病毒感染模型中降低了临床症状和死亡率，并且提示TLR3拮抗剂可向处于急性感染状态下的人提供保护。
实例15
TLR3抗体拮抗剂改善了高血糖并降低了血浆胰岛素
模型
饮食诱发的肥胖症(DIO)模型作为高血糖和胰岛素抗性以及肥胖症的模型使用。
将C57BL/6WT动物(约3周龄，Jackson Labs)和TLR3KO动物(C57BL/6背景；约3周龄，Ace Animals，Inc.)在高脂肪膳食下维持12至16周。对TLR3KO和WT C57BL/6小鼠均使用普通食物或由60.9％kcal脂肪和20.8％kcal碳水化合物组成的高脂肪膳食(Purina TestDiet目录编号58126)来喂养。小鼠在12:12小时的光-暗循环中维持，水食自由。每周测量各组内的各小鼠的重量。对mAb5429经腹膜内给以第一周每周两次继之以每周一次的给药，总计7周。在指示的时间点使用空腹眼后血血清样品进行胰岛素测量。在第7周过夜空腹后，通过以1.0mg/g体重经i.p施用葡萄糖来进行葡萄糖耐受测试。此外，还测量了空腹胰岛素和葡萄糖水平。
HOMA-IR通过基于空腹葡萄糖水平和胰岛素水平(12)的方程使用以下方程来测定：HOMA-IR＝((空腹葡萄糖(mmol/l)×空腹胰岛素(mU/l))/22.5(Wallace等人，Diabetes Care27：1487-1495，2004)。使用葡萄糖氧化酶测定法来测定空腹血糖(BG)。使用胰岛素大鼠/小鼠ELISA试剂盒测定空腹胰岛素水平(Crystal Chem，目录No.90060)。
结果
在12-16周高脂肪膳食后，WT DIO动物为高血糖并高胰岛素血。经使用mAb5429进行的处理，葡萄糖耐受在WT DIO动物中有所改善，但是在TLR3KO DIO动物中无改善。在mAb5429处理的动物中，在葡萄糖刺激后第60、90、120和180分钟观察到了与对照(仅用PBS)相比显著降低的血糖水平(图21A)。在mAb5429处理的WT DIO动物中观察到了与未接受所述mAb的WT DIO小鼠相比约21％的AUC降低。在使用mAb5429处理的WT DIO动物中空腹胰岛素水平也有所降低(图22)。TLR3KO DIO动物显示经mAb5429处理在空腹胰岛素上无改善。稳态模型评估法(HOMA)分析显示了在以mAb5429处理的WT DIO动物中的改善的胰岛素敏感性，但在TLR3KO DIO动物中未显示。所述HOMA-IR值对于WT DIO、5mg/kg的WT DIO mAb5429和20mg/kg的WT DIO mAb5429动物分别为14.0±9.8，8.7±4.9，9.0±3.0。在TLR3KO DIO动物中未观察到效果。
本研究显示，TLR3抗体拮抗剂在DIO模型中改善了胰岛素抗性并降低了空腹葡萄糖而无体重减轻，提示了TLR3拮抗剂对于治疗高血糖、胰岛素抗性和II型糖尿病可能是有益的。
实例16
TLR3抗体拮抗剂针对细菌和病毒诱发的炎性反应进行保护
试剂
分离自患有细菌性恶化的COPD患者的不可分型的感冒嗜血杆菌(Haemophilus influenza)(NTHi)菌株35得自T.F.Murphy博士(Buffalo VAMedical Center，Buffalo，NY)。人鼻病毒16购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，TCID(50)＝2.8×107/ml。
NTHi刺激测定法
将NHBE细胞(Lonza，Wakersville，MD)以1×105/孔接种于Microtest96孔组织培养平板(BD Biosciences，Bedford，MA)。将在琼脂平板上生长16-20小时的NTHi以～2×108cfu/ml重悬浮于生长培养基中，使用100μg/ml庆大霉素处理30分钟，并且以～2×107/孔加至包含NHBE的96孔平板中。在3小时后，去除上清液并代之以新鲜的生长培养基，其具有或不具有抗体(0.08至50μg/ml的终浓度)。在另外24小时孵育后，在Luminex100IS多元荧光分析仪和读出器系统(Luminex Corporation，Austin，TX)中使用Cytokine25-plex AB珠粒试剂盒，人类(包括IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL12p40p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、Eotaxin、RANTES和MCP-1)(Life Technologies，Carslbad，CA)一式三份来分析细胞上清液中细胞因子和趋化因子的存在。
鼻病毒刺激测定
将NHBE细胞以1×105个细胞/孔接种于Microtest96孔组织培养平板(BD Biosciences，Bedford，MA)。于次日将抗体(0.08至50μg/ml的终浓度)加至NHBE或BEAS-2B细胞并且孵育1小时，随后加入10μl/孔的鼻病毒。在另外的24小时孵育后，如上文描述通过luminex测定法来分析细胞上清液中细胞因子和趋化因子的存在。
结果
mAb15EVQ以剂量依赖性方式抑制了NTHi诱发的IP-10/CXCL10和RANTES/CCL5生产，而对照抗体人IgG4(Sigma，St.Louis，MO)对于NTHi刺激表现出无抑制效果(图23A)。mAb15EVQ还抑制了鼻病毒诱发的CXCL10/IP-10和CCL5/RANTES生产(图23B)。
实例17
TLR3抗体拮抗剂在星形胶质细胞中抑制了炎性反应
方法
将来自两位供体的正常人星形胶质细胞(Lonza，Walkersville，MD)以75,000个细胞/孔涂布于24孔平板并使其贴附过夜。于次日使用200ng/ml的聚(I:C)和/或10μg/ml的mAb18处理星形胶质细胞24小时。通过Luminex测量细胞因子。
结果
聚(I:C)诱发的IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-γ、CXCL9/MIG、CCL3/MIP-1a、CCL4、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10生产受到了mAb18的抑制，如表10中所示出。
表10：
*o1：超过检测水平
**b1：低于检测水平
实例18
TLR3抗体拮抗剂在内皮细胞中抑制了炎性反应
方法
HUVEC细胞(Lonza，Walkersville，MD)在Lonza所推荐的包含血清的生长培养基中培养。将细胞重悬于无血清培养基中(Lonza，Walkersville，MD)，以3×105个细胞/ml涂布于96孔平板上，并在37℃，5％CO2下孵育24小时。以趋升浓度(1.5至100μg/ml)加入聚(I:C)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)并在37℃下孵育另外24小时。对于细胞因子抑制测定法，将mAb15EVQ以多种浓度(0-50μg/ml)加入所述细胞并孵育30分钟，其后加入20μg/ml聚(I:C)24小时。收集细胞上清液并使用人细胞因子30-plex试剂盒和Luminex MAP技术(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA)来测量细胞因子水平。为测量sICAM-1的表达，使用20μg/ml聚(I:C)和多种浓度的mAb15EVQ(0.8-50μg/ml)处理HUVEC细胞。通过ELISA(R&D systems)针对sICAM-1的表达分析所述细胞上清液。使用CellTiterGlo试剂盒(Promega，Madison，WI)测量细胞存活率。
结果
HUVEC细胞响应于聚(I:C)而产生了以下细胞因子：IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-6、IL-7、CXCL8/IL-8、IL-12(p40/p70)、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CXCL10/IP-10、CCL5/RANTES、CCL2/MCP-1、VEGF、G-CSF、FGF-碱性和HGF(表11)。mAb15EVQ以剂量依赖性方式降低了聚(I:C)诱发的全部细胞因子的水平(表12)。mAb15EVQ降低聚(I:C)诱发的TNF-α、CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10生产的能力提示了对TLR3介导的活性的抑制可针对可导致动脉粥样硬化的白细胞和T细胞浸润进行保护。此外，mAb15EVQ对VEGF的抑制提示了TLR3阻断在VEGF介导的病理中的潜在有益效果，所述病理包括多种癌症和眼病(诸如老年性黄斑变性)中的血管新生。
TNF-α和IFN-γ在白细胞募集中发挥功能并在活化的内皮中提高了粘附分子表达(Doukas等人，Am.J.Pathol.145：137-47，1994；Pober等人，Am.J.Pathol.133：426-33，1988)。CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES和CXCL10/IP-10已被牵涉入单核细胞和T细胞募集，并且参与动脉粥样硬化的发展(Lundgerg等人，Clin.Immunol.2009)。VEGF通过内皮细胞的生成已在多种癌症中被关联于血管新生期间的异常组织生长或肿瘤(Livengood等人，Cell.Immunol.249：55-62，2007)。
表11：
聚(I:C)ng/ml IL-6 CXCL8/IL-8 CCL2/MCP-1
10 848.8+50.9 12876.0+23140 11813.4+1420.9
5 751.3+2.1 11363.7+108.2 11365.7+113.1
2.5 607.1+91.6 10961.5+2200.7 11607.3+2155.7
1.25 419.2+178.4 9631.5+3675.8 11690.9+3189.9
0.63 263.8+81.4 6231.9+1568.0 9075.6+1152.2
0.31 183.5+168.3 5257.9+1855.0 8106.8+1193.1
0.16 111.9+72.5 4057.6+1127.4 6619.8+1728.2
无聚(I:C) 0.00 1286.6+300.8 1360.1+245.4
聚(I:C)ng/ml IL-2R IL-15 IL-17
100 784.4+45.4 61.3+12.5 43.8+5.3
50 718.6+56.8 61.3+12.5 47.6+0
25 735.7+23.4 56.7+18.9 58.3+4.9
12.5 650.5+29.8 38.8+6.5 39.8+10.9
6.25 643.4+39.9 34.2+0 32.1+0
3.13 681.8+243 38.8+6.5 43.8+5.3
1.56 578.6+10.5 29.4+6.7 36.1+5.6
无聚(I:C) 0.0 0.0 0.0
聚(I:C)ng/ml IFNα CXCL10/IP-10 CCL4/MIP-1β
100 50.7+0 3803.1+185.5 2345+19.7
50 449+1.7 2235.9+1846 291.6+41.8
25 46.1+0 2403.0+271.9 278.7+47
12.5 41.2+3.5 2185.4+649 243.8+63.4
6.25 36.1+0 2100.0+288.1 201.9+46.2
3.13 40.0+1.8 3553.2+197.1 191.5+20.8
1.56 42.5+1.7 2064.3+242.1 165.3+16.3
无聚(I:C) 0.0 0.0 0.0
聚(I:C)μg/ml RANTES TNFα VEGF
100 6266.9+1708.7 12.8+3.2 581.1+181.4
50 2919.7+119.4 11.5+3.2 637.9+47.7
25 2805.1+176.7 9.8+2.8 700.3+62.5
12.5 2598.6+68.6 7.3+0.9 513.2+73.5
6.25 2449.2+830.6 6.9+1.4 440.4+29.5
3.13 3117.1+795.7 7.3+0.9 393.9+40.2
1.56 2481.0+719.3 6.0+1.8 358.4+74.8
无聚(I:C) 4.9+4.5 1.9+0.4 32.1+8.8
浓度表示为pg/ml
可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)通过蛋白水解裂解而生成并且是内皮细胞活化的标志物。ICAM-1在白细胞迁移和激活中发挥关键作用，并且在炎症期间在内皮细胞和上皮细胞中被上调，在其中其通过整合素分子LFA-1和Mac-1而介导了对白细胞的粘附。聚(I:C)激活内皮细胞来上调sICAM-1表达，并且使用mAb15EVQ的处理降低了所述上调(图24A)。
表12：
*与mAb15浓度vs单用聚(IC)的比较，表明了显著性的p值(小于0.05)数值为平均值(pg/ml)±SEM
这提示TLR3抗体拮抗剂可抑制白细胞运送并因此抑制了由炎性细胞内流所导致的组织损伤。
对于存活率测定，HUVEC进行了培养，涂布平板并以聚(I:C)进行刺激，如上所述。mAb15EVQ以剂量依赖性的方式恢复了聚(I:C)诱发的HUVEC细胞存活率降低(图24B)。
内皮细胞活化的下调可以抑制过度的免疫细胞浸润并降低由细胞因子导致的组织损伤，其在炎症病状期间被提高。炎症以及细胞因子和粘附分子在内皮细胞上的过表达是发展动脉粥样硬化和高血压的关键因素。这些数据为探索TLR3拮抗剂在血管疾病中的用途的潜在有益效果提供了理论基础，所述血管疾病包括血管炎病以及特征为内皮功能失调的疾病。受患于炎症和过表达的细胞因子的另一种疾病是卡波西氏肉瘤(KS)，其在免疫抑制和HIV感染的个体中常见，并且是由卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)所导致的。VEGF和细胞因子的产生有助于KS细胞的存活(Livengood等人，CellImmunol.249：55-62，2007)。TLR3拮抗剂在降低与KS和其它肿瘤相关联的血管生成风险和在预防细胞存活率减损并保护内皮屏障完整性以防血管渗漏可能是有益的，所述血管渗漏是与器官衰竭和危及生命的炎性病症诸如败血病相关联的潜在严重病症。TLR3拮抗作用还可在涉及内皮细胞病变的病毒感染中是有益的，诸如由黄病毒科(例如登革热病毒、黄热病病毒)、丝状病毒科(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、本雅病毒科(例如汉坦病毒、内罗病毒、白蛉病毒)和沙粒病毒科(例如卢约病毒(Lujo)、拉沙病毒、阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒(Sihibamiya等人，Blood113：714-722，2009))的成员导致的病毒性出血热。
实例20
TLR3抗体拮抗剂与猕猴和小鼠TLR3的交叉反应性
使用ISRE报告基因测定法评估了针对猕猴或小鼠TLR3的活性，如实例2中所描述。猕猴(SEQ ID NO：217)和小鼠TLR3cDNA(SEQ IDNO：161)通过全血进行扩增并克隆进入pCEP4载体(Clontech)，并且如上文描述来表达。mAb15EVQ在猕猴NF-κB和ISRE测定法中分别具有4.18μg/ml和1.74μg/ml的IC50，对比在人TLR3NF-kB和ISRE测定法中分别为0.44和0.65μg/ml的IC50。同种型对照抗体在这些测定法中无效果。
实例21
TLR3抗体拮抗剂针对急性致死病毒感染进行保护的治疗性给药
实例14描述了使用TLR3抗体拮抗剂针对甲型流行性感冒感染的预防性治疗(在第-1、4、8和12日给药)。本实例显示，TLR3抗体拮抗剂的治疗性给药(在甲型流行性感冒感染后临床症状发作后3天)在增强存活中是有效的。
模型
甲型流行性感冒病毒刺激模型作为急性致死病毒感染的模型使用，如实例14中所描述，不同的是在于使用mAb5249对动物的给药在以甲型流行性感冒病毒感染3天后进行，并且给药的动物为8周龄。抗-小鼠IgG1同种型对照mAb来自BioLegend。所述动物在以甲型流行性感冒病毒感染3、7和11天后给药。
本研究中评估了存活率、每日临床得分以及体重变化。以mAb5249给药的C57Bl/6小鼠以及TLR3KO小鼠均表现出统计上显著提高的存活率(分别为p＜0.028和p＜0.001)，这是相对以抗-小鼠IgG1同种型对照mAb和流行性感冒病毒接种的C57BL/6小鼠而言(图25)。当与使用抗-小鼠IgG1同种型对照mAb和甲型流行性感冒病毒给药的C57BL/6小鼠比较时，在以mAb5249给药的C57BL/6小鼠以及TLR3KO动物中临床得分被降低(图26)并且体重有所提高(图27)。这些结果显示，TLR3抗体拮抗剂在急性致死流行性感冒病毒感染模型中降低了临床症状和死亡率，并且提示TLR3拮抗剂可向处于急性感染状态下的人提供保护。
实例22
根据X射线晶体学的TLR3抗体拮抗剂表位和互补位
人TLR3细胞外结构域与mAb15EVQ、mAb12QVQ/QSV和mAbc1068的Fab形成复合物来结晶。
方法
蛋白质的表达和纯化
所述TLR3ECD(SEQ ID NO：2的氨基酸1-703)的表达和纯化以及所述三种Fab如上所述。
TLR3ECD-三种Fab的四元复合物的制备
4mg的人TLR3ECD与2.4mg的各种Fab混合并且在4℃下孵育3.5h，其对应于1TLR3ECD：1.1Fab的摩尔比。所述复合物通过离子交换色谱在MonoQ5/50GL柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上纯化，使用20mM TrispH8.5，10％甘油(缓冲液A)进行平衡并使用20mM Tris pH8.5，10％甘油，1M NaCl(缓冲液B)来洗脱。使用缓冲液A来将在1.74ml中约2.48mg的复合物稀释至10ml，将其以1mL/分钟进样至该柱并使用在40倍柱体积上0-40％B的线性梯度来洗脱。实施了五组连续的纯化运行。将来自峰1的级分汇合并使用Amicon-15ml Ultra-30000MWCO和Microcon30000MWCO将其在20mM Tris pH8.5，27mM NaCl，10％甘油中浓缩至14.49mg/mL(消光系数：A280(1mg/mL)＝1.31)。
结晶
使用Oryx4自动蛋白质结晶机器人(Douglas Instruments)进行自动化结晶筛选，其使用Corning平板3550(Corning Inc.，Acton，MA)以坐滴形式分配等体积的蛋白质和储池溶液。初始筛选使用Hampton Crystal Screen HT(HR2-130，Hampton Research，Aliso Viejo，CA)进行。使用来自多个条件的小晶体来产生晶种，其随后用于微晶种-基质筛选(Microseed-Matrix Screening，MMS)。实施了多轮细调，其根据来自给出小晶体的初始筛选的条件。用于MMS的储池条件是基于在细调后给出小晶体的条件：18-28％聚乙二醇(PEG)3350，1M LiCl，pH4.5，以及2.0-2.9M(NH4)2SO4，5％PEG400，pH4.5，并且探究了pH和不同的添加剂。MMS结晶筛选使用Oryx4自动蛋白质结晶机器人(Douglas Instruments)通过以如下体积比分配组分而进行：1份蛋白质溶液：0.25份晶种原液：0.75份储池溶液。从0.1M乙酸钠，pH4.5，2.9M(NH4)2SO4，5％甲基戊二醇(MPD)和0.1M乙酸钠，pH4.5，26％PEG3350，1M LiCl中生长的晶体衍射至～的分辨率。
为改善该晶体的分辨率，使用上述条件进行的MMS被结合以添加剂筛选，其使用Hampton Additive Screen HR2-428(Hampton Research，Aliso Viejo，CA)的选定组分以如下体积比进行：1份蛋白质溶液：0.125份晶种原液：0.2份添加剂溶液：0.675份储池溶液。衍射至～分辨率的与Fab复合的TLR3ECD的X射线质量晶体在施用了MMS和添加剂筛选的组合后通过包含0.1M乙酸钠，pH4.5，28％PEG3350，1M LiCl和30mM Gly-Gly-Gly的溶液而获得。
TLR3ECD四元复合物的X射线数据收集
为进行X射线数据收集，将晶体(大小～1.0×0.5×0.1mm3)浸没于合成的母液(0.1M乙酸钠，pH4.5，28％PEG3350，1M LiCl，16％甘油)中数秒，并在100K的氮气流中快速冷冻。X射线衍射数据使用RigakuMicroMaxTM-007HF微聚焦X射线发生器来收集和处理，其装配有OsmicTMVariMaxTM共聚焦光学器件、Saturn944CCD检测器以及X-streamTM2000深低温冷冻系统(Rigaku，Woodlands，TX)。在250°的晶体转动下以1分钟/半度图像的曝光时间检测衍射强度至最大分辨率X射线数据使用程序D*TREK(Pflugrath，Acta Crystallographica Section D，55：1718-1725，1999)来处理。该晶体属于单斜空间群C2，具有单位晶胞参数： 并且β＝103.17°。不对称单位包含1分子的所述复合物。X射线数据统计在表13中给出。
表13：
结构测定
TLR3ECD-Fab15EVQ-Fab12QVQ/QSV-Fab c1068的晶体结构使用Phaser(Read，Acta Crystallogr D.Biol.Crystallogr.57：1373-1382，2001)通过分子置换来测定。搜索模型为TLR3ECD(Protein DataBank(PDB)structure ID1ziw with all glycans removed，Choe等人，Science309：581-585，2005)和经测定的三种Fab的高分辨率晶体结构(这些Fab结构的晶体数据和精修统计的概述参见表13)。Fab12QVQ/QSV的摆臂角(elbow angle)据发现显著地偏离其游离形式。通过以～5°间隔调整该摆臂角而生成了一系列的Fab12QVQ/QSV模型，其中之一据发现与电子密度吻合良好。使用PHENIX(Adams等人，J.Synchrotron Radiat.11：53-55，2004)进行结构精修。以所述Fab为刚体结构域(每个V或C结构域)和所述TLR3ECD的13个刚性区段(在精修中的定义：30-60、61-108、109-156、157-206、207-257、258-307、308-363、364-415、416-464、465-514、515-570、571-618、619-687)来精修所述结构，每个Fab刚体均有一个B因子，而整个TLR3ECD具有单一的B因子。
向各个Fab刚体引入平移/振动/旋转(TLS)精修，并在SEQ ID NO：2的第330残基处将TLR3ECD分成2组TLS区段。对于15个N糖基化位点的10个而言，多糖密度是可见的。随后添加了来自人TLR3细胞外结构域(Choe等人，Science309：581-585，2005，PDB structure ID：1ziw)的晶体结构的碳水化合物模型。TLR3ECD中的短缺失区段(SEQ ID NO：2的残基337-342)的密度在刚体精修后可见，并且使用来自TLR3细胞外结构2a0z(Bell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)102：10976-10980，2005，PDBstrucutre ID：2a0z)的对应区段填充。TLR3ECD的C末端包含附加的密度，其符合2a0z的密度。这一区段(SEQ ID NO：2的647-703)。随后被代替以2a0w的(残基647-687)。因此，所述TLR3ECD模型是TLR3结构1ziw与2a0z的杂合物，并且作为13个刚体区段来精修(氨基酸范围：30-60、61-108、109-156、157-206、207-257、258-307、308-363、364-415、416-464、465-514、515-570、571-618、619-687)。
Fab12QVQ/QSV的LCDR3明显适配于由其游离形式而来的不同构象。使用标准参数在PHENIX中进行了多起始模拟退火。这一LCDR3的模型在电子密度图中进行了目视检查，并将“最佳匹配”的构象植入原始模型。根据在开始计算前旁置的5％的反射数据的R自由来监测精修处理。在最终循环中，对各残基均包含入一个B因子。使用COOT对所述Fab的摆臂区和蛋白-蛋白界面处的侧链进行模型检定和手动重建(Emsley等人，ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60：2126-32，2004)。对于至的全部15,792组独立反射而言，最终的R晶体和R自由分别为26.8％和30.0％。所述精修统计在表13和14中给出。
结果
所述TLR3ECD-三种Fab的四元复合物的分子结构
所述复合物的整体分子结构在图28中示出。在不对称单元中具有一个TLR3ECS和各个Fab的一个分子。TLR3ECD的结构模型包含来自huTLR的330-687的全部残基(SEQ ID NO：2)。对于所述三种Fab，除溶剂离子和水分子外，来自它们相应的未结合形式的全部残基均被包含。在总体拓扑结构中，所述TLR3ECD分子非常类似于先前报道的结构(对于1ziw的613个Cα为的rmsd，而对于2a0z的595个Cα为)。所述Fab结构全部等同于它们相应的未结合形式，不同的是如方法中所描述Fab12QVQ/QSV的LCDR3，以及摆臂区和TLR3ECD/Fab界面的某些侧链。
表14.
最高分辨率层的值处于()中。
aR合并＝∑|I-<I>|/∑I，其中是所测得的反射强度，并且<I>是这一反射的全部测量值的平均强度。
bR晶体＝∑||F观测|-|F计算||/∑|F观测|，其中F观测和F计算是观测到的和计算所得的结构因子，并且R自由是针对一组在精修前随机选择的5％的反射数据而计算的。
c使用MolProbity计算拉氏图(Davis，I.W.，等人，Nucleic Acids Res)。
表位和互补位
参与TLR3ECD和所述三种Fab之间的结合的残基在图28B中示出。Fab12QVQ/QSV结合于TLR3ECD的N末端附近。构象表位由来自TLR3LRR3-7的残基(SEQ ID NO：2的氨基酸100-221)组成。Fab12QVQ/QSV的结合在所述抗原和抗体上分别包埋了约和对于Fab12QVQ/QSV，所述晶体结构鉴定了如下的TLR3(SEQ ID NO：2)表位残基：S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195和A219。对于12QVQ/QSV，所述晶体结构鉴定了以下互补位残基：轻链(SEQ ID NO：211)：G28、S29、Y30、Y31、E49、D50、Y90、D91和D92。重链(SEQ ID NO：214)：N32、Q54、R56、S57、K58、Y60、Y104、P105、F106和Y107。
Fab15EVQ和Fab c1068结合了不重叠的表位，其在C末端附近横跨了LRR15-23(SEQ ID NO：2的氨基酸406-635)(图28)。Fab15EVQ在所述抗原和抗体上分别包埋了和而Fab c1068在所述抗原和抗体上分别包埋了和Fab15EVQ的表位涵盖了SEQ ID NO：2中示出的TLR3的残基K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595和K619。对于15EVQ，所述晶体结构鉴定了以下互补位残基：轻链(SEQ ID NO：41)：Q27、Y32、N92、T93、L94和S95重链(SEQ ID NO：216)：W33、F50、D52、D55、Y57、N59、P62、E99、Y101、Y104和D106。
对于Fab c1068，所述晶体结构在TLR3(SEQ ID NO：2)上鉴定了以下的表位残基：E446、T448、Q450、R453、R473、N474、A477、L478、P480、S498、P499、Q503、P504、R507、D523、D524、E527、E530和K559。对于Fab c1068，所述晶体结构鉴定了以下互补位残基轻链：H30、N31、Y32、N50、E66、S67、G68(glyc)。重链：T30、T31、Y32、W33、H35、E50、N52、N54、N55、R57、N59、V99、M102、I103和T104。
中和机制和TLR3功能的牵涉
mAb15EVQ：mAb15EVQ表位包含了TLR3的残基N517、H539和N541，其与C末端的dsRNA结合位点相重合(Bell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：8792-7，2006)。因此，不希望束缚于任何具体理论，据信mAb15EVQ针对TLR3配基竞争结合TLR3，并且防止了形成信号转导单元所需的配基诱发的受体二聚化(Liu等人，Science320：379-81，2008)。图29示出了mAb15EVQ的这一直接竞争机制。根据抗体浓度，这一机制可能导致聚(I:C)或dsRNA诱发的TLR3激活的总抑制。
mAb12QVQ/OSV和mAb c1068：如图30中示出，这两种抗体与dsRNA配基无直接的冲突。因此，它们不太可能以类似于mAb15EVQ的方式中和TLR3功能。所述Fab片段还背离该配基定向(图30)。在结构上，mAb12QVQ/QSV和Fab c1068均可结合信号转导单元(SU)而不破坏其功能。立体结构上，一个mAb分子的两个Fab片段不大可能同时结合一个SU中的两个TLR3分子，并因此而防止dsRNA介导的TLR3二聚化。不期望束缚于任何具体理论，据信mAb12QVQ/QSV或mAb c1068与TLR3的结合防止了所述信号转导单元的簇集，这是由于所述抗体与邻近信号转导单元之间的空间冲突。TLR3与dsRNA的结合并不限于由dsRNA：TLR3复合物所定义的信号转导单元(Liu，等人，Science，320：379-81，2008)。多个SU的簇集可能导致信号转导的增强，或有效的TLR3信号转导需要这种簇集。mAb12QVQ/OSV和mAb c1068的定位可阻断该簇集并导致了TLR3活性的中和。抗体的最大中和效应因此而将取决于由于抗体结合而导致的SU分离程度。如图30中所示，mAb12QVQ/QSV将导致比mAb c1068更大的分离，并且这将转化成mAb12QVQ/QSV的更强效能。这符合mAb c1068和mAb15EVQ在饱和浓度下分别导致～50％和100％的TLR3中和的观察结果，并且mAb12QVQ/QSV表现出居间的活性。因此，结合结构性和TLR3中和的研究提示了TLR3信号转导模型，其中所述dsRNA：TLR3信号转导单元进行簇集以实现有效的信号转导。mAb12QVQ/OSV和mAb c1068还定义了一类抗体，其可部分地调控TLR3信号转导而不干扰配基结合或受体二聚化。
实例23
TLR3缺陷改善了脂质特征和肝脏脂肪变性
模型
TLR3-/-小鼠获自Richard A.Flavell博士(Yale University)并在此前被描述(Shulman，J.Clin.Invest.106：171-6，2000)。同时对TLR3-/-和野生型(WT)对照小鼠(C57BL/6)喂以普通食物或高脂肪膳食(HFD)(Purina TestDiet#58126)，其由60.9％kcal的脂肪和20.8％kcal的碳水化合物组成。小鼠在12:12小时的光-暗循环中维持，水食自由。每周测量各小鼠的重量；所述数据以平均值±SD给出。收取肝脏样品用于RNA分离和组织学分析。
使用临床化学仪器(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies，WestCaldwell，NJ)测量总胆固醇(TC)、HDL、LDL和甘油三酯(TG)的血浆水平。使用NEFA试剂盒(Wako Chemicals，Richmond，VA)测定游离脂肪酸(FFA)水平。根据制造商的建议进行样本制备和分析。
使用TaqMan逆转录试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)根据制造商规程以随机六聚体引物来逆转录总肝RNA。TaqMan探针和引物购自LifeTechnologies，Carlsbad，CA。测试了总共35种参与脂和葡萄糖代谢以及炎症的基因以用于基因表达分析。使用2-DeltaDeltaCt计算来进行基因表达的相对定量(Arocho等人，Diagn.Mol.Pathol.15：56-61，2006)。
对于组织学，分离了肝脏并测定了湿重。将肝脏样品在10％的中性缓冲福尔马林中固定，经处理以用于常规的石蜡切片，并进行HE染色。通过组织学评估来测定肝脏脂肪化的水平。使用曼-惠特尼检验(Mann-WhitneyTest)来进行统计分析。
结果
喂以HFD的小鼠在用HFD26周后为高胰岛素血和高血糖(对于第14周数据点，参见实例15)。在第33周检查脂质特征。与WT对照相比，用食品膳食的TLR3-/-小鼠具有显著减少的血浆TG但有类似的TC、HDL、LDL(表15)和FFA水平。在第33周，用HFD的WT对照动物显示出提高的血浆TC、HDL和LDL水平，而TLR3-/-小鼠被部分地保护(表15)。与用HFD的WT动物相比，在喂以HFD的TLR3-/-小鼠中，肝脏重量(针对各自体重进行归一化)降低了～16％，p＜0.05。组织学分析表明，当与WT动物相比时，用HDF的TLR3-/-动物在肝脏实质中还具有显著降低的脂质积聚。
当与WT动物相比时，参与脂和胆固醇代谢的关键基因LXRα和PPARδ的肝表达在喂以HFD的TLR3-/-小鼠中被上调(分别为30％，p＜0.05和186％，p＜0.001)，这与TLR3缺陷型小鼠中的较低脂水平相符合。LXRα的靶基因ABCA1和SREBP1在这些动物中也被上调(分别为71％，p＜0.01和131％，p＜0.001)。TLR信号转导与LXR之间的交互作用已被报道(Castrillo等人，Mol.Cell.4：805-15，2003)。胆固醇转运体ABCA1的上调提示了在HFD喂养的TLR3-/-小鼠中改善的胆固醇转运。
表15：
膳食/菌株 TC HDL LDL TG FFA
食品膳食
WT 79.71±5.56 47.57±4.66 6.57±1.44 104.9±3.36 1.35±0.04
TLR3-/- 75.56±3.24 47.67±2.14 5.56±0.34 91.22±4.67 1.21±0.18
p值 0.253 0.492 0.227 ＜0.05 0.168
高脂肪膳食
WT 218.6±19.37 87.00±5.82 25.13±3.31 120.3±7.80 1.44±0.12
TLR3-/- 120.1±10.32 59.86±4.19 9.00±0.92 123.9±2.50 1.20±0.05
p值 ＜0.001 ＜0.01 ＜0.001 0.343 ＜0.05
在本实例中报道的研究显示，当与野生型动物比较时，肥胖TLR3缺陷型动物具有改善的脂和胆固醇水平，并且表明拮抗TLR3信号转导可以是有益的治疗方法，用于治疗心血管疾病和代谢疾病。

Claims (7)

1. 一种治疗II型糖尿病、高血糖或高胰岛素血症的方法，所述方法包括将治疗有效量的与TLR3具有反应性的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗II型糖尿病、高血糖或高胰岛素血症的时间。
2. 一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的与TLR3具有反应性的分离抗体向对其有需求的患者施用足以治疗心血管疾病的时间。
3. 一种在患者中降低总胆固醇的方法，所述方法包括将治疗有效量的与TLR3具有反应性的分离抗体向对其有需求的患者施用足以在患者中降低总胆固醇的时间。
4. 一种在患者中降低低密度脂蛋白(LDL)的方法，所述方法包括将治疗有效量的与TLR3具有反应性的分离抗体向对其有需求的患者施用足以在患者中降低LDL的时间。
5. 一种在患者中降低肝脏内的脂肪积聚的方法，所述方法包括将治疗有效量的与TLR3具有反应性的分离抗体向对其有需求的患者施用足以降低肝脏内的脂肪积聚的时间。
6. 根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述与TLR3抗体具有反应性的分离抗体包含重链互补决定区1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）以及轻链互补决定区1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3），所述重链互补决定区具有在SEQ ID NO：70、77和72中示出的氨基酸序列，所述轻链互补决定区具有在SEQ ID NO：67、68和78中示出的氨基酸序列。
7. 根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述与TLR3抗体具有反应性的分离抗体包含重链互补决定区1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）以及轻链互补决定区1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3），所述重链互补决定区具有在SEQ ID NO：82、86和84中示出的氨基酸序列，所述轻链互补决定区具有在SEQ ID NO：79、80和87中示出的氨基酸序列。
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