JP2018118970A - 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

【課題】代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのＴＯＬＬ様受容体３（ＴＬＲ３）アンタゴニストの提供。【解決手段】ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントであって、該抗体が、２５℃における表面プラズモン共鳴によって判定される場合、ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する約５×１０-12Ｍ〜１．７×１０-11の解離定数（ＫD）を有する、単離された抗体又はそのフラグメント。【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＯＬＬ様受容体３（ＴＬＲ３）抗体アンタゴニスト、ＴＬＲ３抗体アンタ
ゴニスト又はそのフラグメントをコードしたポリヌクレオチド、並びに上記を製造及び使
用する方法に関する。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌性、ウイルス性、寄生性、及び場合によってはホ
スト由来のリガンドに反応してシグナル伝達カスケードを開始することにより、自然免疫
反応の活性化を調節し、獲得免疫の発現に影響を与える（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６３：９４５〜９５５，２００５）。細胞膜に局在するＴ
ＬＲであるＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６は、細菌及び真菌のタンパク質又
は脂質成分を含むリガンドを認識する。主として細胞内に存在するＴＬＲであるＴＬＲ３
、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、それぞれ２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ及び非メチル化ＣｐＧ
ＤＮＡに対して応答する。ＴＬＲシグナル伝達の調節不全は、多数の問題を引き起こす
と考えられており、治療方策がこの中枢に向けて開発されている（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．４：８７９〜８８０，２００５、
Ｒｅｚａｅｉ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：８６３〜８６９，２００
６、Ｗｉｃｋｅｌｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２：１８４〜１８７，２００６）。例
えば、深刻な敗血症及び狼瘡用に、それぞれＴＬＲ４のアンタゴニスト、並びにＴＬＲ７
及び９のアンタゴニストが臨床開発されている（Ｋａｎｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
．Ｍｅｄ．１３：５５２〜５５９，２００７）。

ＴＬＲ３シグナル伝達は、炎症又はウイルス感染時に壊死細胞から放出される２本鎖Ｒ
ＮＡ、ｍＲＮＡ又はＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲ３の活性化によってインターフ
ェロン及び炎症性サイトカインの分泌が誘導され、特定の微生物感染において保護作用の
ある免疫細胞の活性化及び動員が誘発される。例えば、ドミナントネガティブなＴＬＲ３
対立遺伝子では、小児期におけるＨＳＶ−１による一次感染時に単純ヘルペス脳炎を発症
しやすくなることが示されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７
：１５２２〜１５２７，２００７）。マウスではＴＬＲ３の欠損は、コクサッキーウイル
スによるチャレンジ試験における生存率の低下との関連が示されている（Ｒｉｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ４１２７，２００９）。しかしながら、コント
ロール不能又は調節不全のＴＬＲ３シグナル伝達は、西ナイル脳炎、フレボウイルス、ワ
クシニア、及びＡ型インフルエンザなどの特定のウイルス感染モデルにおける罹患率及び
死亡率に寄与することを示してきた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：
１３６６〜１３７３，２００４、Ｇｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７
７：６３０１〜６３０７，２００６、Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏ
ｌ．１８０：４８３〜４９１，２００８、Ｌｅ Ｇｏｆｆｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ
Ｐａｔｈｏｎｇ．２：Ｅ５３，２００６）。

ヒト及びマウスＴＬＲ３細胞外ドメインの結晶構造が判定されている（（Ｂｅｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１０２：１０９７６
〜８０，２００５、Ｃｈｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１〜５８５
，２００５、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７９〜３８１，２００
８）。ＴＬＲ３は、グリカンにより装飾されたソレノイド馬蹄様の全体形状をとり、ロイ
シンに富んだ繰り返し（ＬＲＲ）モチーフのタンデム単位を２３個有する。二本鎖ＲＮＡ
結合部位が、２つの別の領域にマッピングされている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，３２０：３７９〜８１，２００８）。信号伝達アセンブリは、１つの二本鎖ＲＮ
Ａ及び２つのＴＬＲ３細胞外ドメインからなることが提案されている。（Ｌｅｏｎａｒｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５：２５８〜
２６３，２００８）。

ＴＬＲ３は、例えば敗血症性ショック（Ｃａｖａｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．２０５：２６０９〜２６２１，２００８）、急性肺損傷（Ｍｕｒｒａｙ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７８：１２２７
〜１２３７，２００８）、リウマチ性関節炎（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｌｅｔｔ．１２４：９〜１７，２００９、Ｂｒｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈ．
Ｒｈｅｕｍ．５２：２６５６〜２６６５，２００５）、喘息（Ｓｕｇｉｕｒａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：６５４〜６６２，２０
０９、Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４５：１６３〜１７４，２００８、Ｓｔｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ
ｐｉｒ．Ｒｅｓ．１０：４３，２００９）、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸
疾患（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：４５４８〜４５５６，２
００７、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
１０４：７５１２〜７５１５，２００７）、自己免疫性肝疾患（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２４５６〜２４６３，２００６）及びＩ型糖尿
病（Ｄｏｇｕｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７：１２３６〜１２４５，２０
０８、Ｌｉｅｎ ａｎｄ Ｚｉｐｒｉｓ，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５２〜６８，
２００９）を含む炎症性、免疫介在性及び自己免疫性疾患の範囲内の病原性機構の動因と
なることが示されている。更に、ＴＬＲ３発現における臓器特異的な増加は、原発性胆汁
性肝硬変における肝臓組織（Ｔａｋｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．８５：
９０８〜９２０，２００５）、リウマチ性関節炎の関節（Ｏｓｐｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，
Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５８：３６８４〜３６９２，２００８）、及びアレル
ギー鼻炎患者の鼻粘膜（Ｆｒａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．６：
１００，２００５）などの調節不全な局所炎症反応が動因となる多くの病的状態と相関す
ることが示されている。

壊死状態では、内因性のｍＲＮＡを含む細胞内容物が放出されることによってサイトカ
イン、ケモカイン、及び局所炎症を誘導し、死細胞の残留物の除去を促進し、損傷を修復
する他の因子の分泌が誘発される。壊死はしばしば炎症性プロセスを持続させ、慢性又は
過剰な炎症に寄与する（Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ ７：９９〜１０９，２００９）。壊死部位におけるＴＬＲ３の活性化は、これら
の異常な炎症性プロセスに寄与し、放出されたＴＬＲ３リガンドを介して更なる炎症促進
性のポジティブなフィードバックループを生じる場合がある。したがって、ＴＬＲ３に対
する拮抗性は慢性若しくは過剰な炎症及び／又は壊死を含む様々な疾患において有用な場
合がある。

ＴＬＲ３活性の下方制御も同様に、腎臓細胞癌、並びに頭部及び頸部扁平上皮細胞癌が
含まれる腫瘍学的な兆候に対して、新規の治療法を示す場合がある（Ｍｏｒｉｋａｗａ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５７０３〜５７０９，２００７
、Ｐｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２１：２０９〜２１５，２
００８）。更に、タンパク質を低活性でコードするＴＬＲ３^L423F対立遺伝子は、進行性
の年齢関連の「乾燥」黄斑変性症からの保護と関連付けられ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：１４５６〜１４６３，２００８）、この疾病におい
てＴＬＲ３アンタゴニストが有益な場合があることが示されている。

炎症状態にともなう病理及び感染症にともなう病理などの他の病理が健康及び経済に及
ぼす影響は多大なものである。しかしながら、多くの医学領域における進歩にも関わらず
、これらの状態の多くでは、治療上の選択肢及び治療法は比較的少ない。

したがって、ＴＬＲ３に関連する状態を治療するためにＴＬＲ３活性を抑制することが
求められている。

本発明の１つの態様は単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ
様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０
、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９
、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１
、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合することを特徴とする。

本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ
様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７
、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７
、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９に結合することを
特徴とする。

本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可
変領域及び軽鎖可変領域を有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｗ３３、Ｆ５０、
Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、
並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及
びＳ９５により、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを
特徴とする。

本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可
変領域及び軽鎖可変領域を有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｎ３１ａ、Ｑ５２
、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及びＹ１００、並びに軽
鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｅ５０、Ｄ５１、
Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３により、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３
に結合することを特徴とする。

本発明の別の態様は、ＴＬＲ３反応性を有し、以下のａ〜ｉの特性のうち少なくとも１
つを有する、単離された抗体である；
ａ．Ｋｄ＜１０ｎＭでヒトＴＬＲ３に結合する、
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒ
トＴＬＲ３の生物活性を、１μｇ／ｍＬで５０％超低減させる、
ｃ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を、１０μｇ／ｍＬで６０％超阻害する、
ｄ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を、０．４μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｅ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
生を、５μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｆ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
生を、１μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｇ．ＰＢＭＣ細胞によるポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩ
Ｌ−１２の産生を、１μｇ／ｍＬで２０％超阻害する、
ｈ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬ
Ｒ３の生物活性を、ＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで阻害する、
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ
３の生物活性を、ＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで阻害する。

本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配
列、特定の軽鎖ＣＤＲ １、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のア
ミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体である。

本発明の別の態様は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＴＬＲ３反応性を有する
単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３
、並びに特定の軽鎖ＣＤＲ １、２及び３のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＴＬＲ３反応性を有する
単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、及び
特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＴＬＲ３反応性を有する
単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖のアミ
ノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号６、８、
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３
６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１
９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示される
アミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は、配列番号５、７
、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３
５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２
１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号１０２、
１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、
２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は配列番号１５５、
１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示され
るアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記
抗体重鎖は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、
２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、
１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、
２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前
記抗体軽鎖は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、
２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、
２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前
記抗体重鎖は配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６
０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を含む
。

本発明の別の態様は、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは
、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７
又は２２７に示されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖をコードする。

本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬
組成物である。

本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターであ
る。

本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。

本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生
された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３反応性を有する抗体の製造方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、炎症状態を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む
、炎症状態の治療又は予防方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、全身性炎症状態を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与すること
を含む、全身性炎症状態の治療又は予防方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、ＩＩ型糖尿病を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、Ｉ
Ｉ型糖尿病の治療方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、高血糖を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高血糖の
治療方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、インスリン抵抗性を治療するうえで充分な時間にわたって投与することを含む
、高インスリン血症の治療方法である。

本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とす
る患者に、ウイルス感染を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを
含む、ウイルス感染の治療又は予防方法である。

ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおける抗ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）ｍＡｂの作用を示す図である。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す図である。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す図である。 Ａ及びＢは、ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの作用を示す図である。 ＰＢＭＣアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの作用を示す図である。 Ａ及びＢは、ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの作用を示す図である。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの結合を示す図である。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの結合を示す図である。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ３ｍＡｂの結合を示す図である。 ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤ上の構造体の上に重なり合った、ｍＡｂ １５ＥＶＱ（黒）及びＣ１０６８ｍＡｂ（灰色）のエピトープ（上の画像）、並びにｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ（黒、下の画像）のエピトープを示す図である。 ｍＡｂ １５ＥＶＱと複合体を形成させたＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質の局所的Ｈ／Ｄ交換撹乱マップを示す図である。 Ａ及びＢは、Ａ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウスの抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ ｍＡｂ ５４２９（代理抗体）の作用を示す図である。 ＭＥＦ ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０アッセイにおける代理ｍＡｂ（ｍＡｂ ５４２９、ｍＡｂｃ １８１１）の作用を示す図である。 ＴＬＲ３に対する代理ｍＡｂの結合の特異性を示す図である。上側のパネルは、アイソタイプコントロール、下側のパネルは、ｍＡｂ ｃ１８１１である。 ＡＨＲモデルにおけるｐｅｎＨレベルに対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中の全好中球数に対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中のＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルに対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 ＤＳＳモデルにおける組織病理学スコアに対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 Ｔ細胞移植モデルにおける、Ａ）組織病理学スコア、及びＢ）好中球流入に対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 ＣＩＡモデルにおける臨床スコアに対する代替ｍＡｂの作用を示す図である。 ＣＩＡモデルにおける臨床ＡＵＣスコアに対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の経鼻投与の後のＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率に及ぼす代替ｍＡｂの作用を示す図である。ｍＡｂの投与は１日目に始められた。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後の臨床スコアに対する代替ｍＡｂの作用を示す図である。ｍＡｂの投与は１日目に始められた。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後に代替ｍＡｂを投与した後の１４日にわたる体重変化に及ぼす代替ｍＡｂの作用を示す図である。ｍＡｂの投与は１日目に始められた。 グルコースチャレンジ後の（Ａ）野生型ＤＩＯ及び（Ｂ）ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物における血中グルコース濃度に対する代替ｍＡｂの作用を示す図である。 野生型ＤＩＯ動物のインスリンレベルに対する代理ｍＡｂの作用を示す図である。 ＮＨＢＥ細胞における、（Ａ）ＮＴＨｉ、及び（Ｂ）ライノウイルス誘導ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳレベルに対するｍＡｂ １５ＥＶＱの作用を示す図である。 ＨＵＶＥＣ細胞における、（Ａ）ｓＩＣＡＭ−１レベル及び（Ｂ）生存率に対する、ｍＡｂ １５ＥＶＱの作用を示す図である。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の生存率を示す図である。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の臨床スコアを示す図である。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の体重変化を示す図である。 Ａにおいて、ｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤとＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ １５ＥＶＱ及びＦａｂ ｃ１０６８との四次構造の分子構造をリボン及び表面表示で示す図である。ＴＬＲ３ ＥＣＤの、Ｎで標識したＮ末端を薄い灰色で示し、すべてのＦａｂ分子を暗い灰色のリボン表示で示す。Ｂ．エピトープは薄い灰色で着色され、ＡにおけるＦａｂについてのようにＴＬＲ３ ＥＣＤ上で標識される。図２８、２９及び３０では、判り易くするために、Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ ｃ１０６８及びＦａｂ １５ＥＶＱの標識を、それぞれ、Ｆａｂ１２、Ｆａｂ１０６８及びＦａｂ１５と略記する。 Ｆａｂ １５ＥＶＱによる中和機構を示す図である。Ａ．（薄い灰色及び暗い灰色で、ＴＬＲ３で標識された）２つのＴＬＲ３ ＥＣＤの一方において、Ｆａｂ １５ＥＶＱエピトープをハイライト（薄い灰色）した二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）を示す。二本鎖ＲＮＡリガンドは薄い灰色の二重らせんとして示される。Ｂ．二本鎖ＲＮＡの結合を立体的に阻害することで、ＳＵの形成を阻害する、Ｆａｂ １５ＥＶＱの結合が図示される。Ｆａｂ １５ＥＶＱの結合は高親和性であり、ＳＵの形成を阻害するか、又はすでに形成されているＳＵを分解する。 Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８及びＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）のクラスター形成の機構を示す図である。Ａ．Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８は、単一ＳＵを結合（又は共結合）することができる。Ｂ．約７６塩基対の二本鎖ＲＮＡ上の２つのＳＵの最近接クラスター形成のモデルである。判り易くするために３つのエピトープが異なる分子中でハイライトされている。Ｃ．Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８の結合は、抗体と、隣接するＳＵとの間の立体的な衝突によりＳＵのクラスター形成を防止する。２つの左を指す矢印は、抗体によるＳＵの分離の異なる度合いを定性的に表すもの（底部の矢印はＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対するもの、頂部の矢印はＦａｂ ｃ１０６８に対するもの）である。 代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す図である。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。 代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す図である。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。 代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す図である。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。 代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す図である。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。 ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＬと、ヒトＶｋ１フレームワークとのアライメント結果を示す図である。Ｃｈｏｔｈｉａによるハイパー可変ループにアンダーラインし、パラトープ残基に二重アンダーラインし、及びフレームワークの差異を灰色でハイライトしてある。特記しない限り、Ｖκ１遺伝子は^*０１対立遺伝子である。残基番号付けは連続的に行っている。 ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＨと、ヒトＶｈ５フレームワークとのアライメント結果を示す図である。配列の特徴は図３２のように示される。 ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬと、ヒトＶｋ３フレームワークとのアライメント結果を示す図である。配列の特徴は図３２のように示される。 ｍＡｂ １５ＥＶＱ又はｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬ及びＶＨと、ヒトＪκ、Ｊλ又はＪｈフレームワークとのアライメント結果を示す図である。配列の特徴は図３２のように示される。

本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべて
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。

本明細書で使用するとき、「アンタゴニスト」なる用語は、何らかの機構によって、受
容体又は細胞内メディエーターなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子の
ことを意味する。

本明細書で使用するとき、「ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト」又は「ＴＬＲ３反応性を有
する」抗体とは、ＴＬＲ３の生物活性又はＴＬＲ３受容体の活性化を直接的又は間接的に
実質上相殺、低減、又は阻害する能力を有する抗体のことを言う。例えば、ＴＬＲ３反応
性を有する抗体は、ＴＬＲ３に直接結合してＴＬＲ３の活性を中和することによって、す
なわちＴＬＲ３のシグナル伝達を遮断することによって、サイトカイン及びケモカインの
放出、又はＮＦ−κＢの活性化を低減させることができる。

用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マ
ウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗
体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。

一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖であ
る。完全な抗体とは、２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タン
パク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合
しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で
異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も
有する。それぞれの重鎖は、一方の末端で可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）を有し、続
いて多数の定常性のドメイン（定常領域）を有する。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイ
ン（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の
第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している
。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（
κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる
。

免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じてＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧ
は、イソ型のＩｇＡ₁、ＩｇＡ₂、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃及びＩｇＧ₄へと更に細かく
分類される。

「抗体フラグメント」なる用語は、完全な抗体の部分、通常は完全な抗体の抗原結合領
域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）₂、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの完全な
抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。

免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの「抗原結合部位」を取り囲
む「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下の様々な用語を使用して定義
されている。（ｉ）用語相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（Ｗｕ
ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０）一般
に、抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、即ちＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤ
Ｒ３）、及びＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を有する（Ｋａｂａｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒ
ｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」とは
、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋにより定義されるように、構造が超可変である抗体可変ド
メインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９０１〜０９１７，１９８７）。一般に抗原結合部位は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ
３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を有している。Ｃｈｏｔ
ｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼んでいる
。（ｉｉｉ）Ｌｅｆｒａｎｃにより提案されるような「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａ
ｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，
２００３）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体からのＶドメインの比較に基づいている
。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベー
ス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらの領域の標準化された番号及
び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの表記間の対応については、Ｌｅｆｒ
ａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７
，２００３に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は、特異性決定残基の使用法（Spec
ificity Determining Residue Usage）（ＳＤＲＵ）に基づいて表記することもでき（Ａ
ｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）、ここで
、特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基
を指す。ＳＤＲＵは、抗原−抗体複合体についての結晶構造解析により定義される、異な
るタイプの抗原に対するＳＤＲの数及び分布の精密な尺度である。（ｖ）抗原結合部位を
、抗原抗体複合体の結晶構造から同定される抗体パラトープ残基とも定義することもでき
る。

用語「複合配列」は、本明細書で使用するとき、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭ
ＧＴによって個別に表記されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域
の表記を含むものとして定義される抗原結合部位を意味する。

本明細書で使用するとき、「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ
−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜４８，１
９９７）により番号付けされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。定序配列ポリペプチド
の番号付けに関して最も使用されている２つの番号付けシステム、即ち、Ｋａｂａｔ（Ｋ
ａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎ
ｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＨ，Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ，１９９１）とＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓ
ｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７，１９８７）間の対応は、本発明の例示的
な抗体に関する図３１に示される。

「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、可変領域において、抗原結合部位
として定義されている配列以外の配列である。フレームワークは、通常、それぞれの可変
領域において、３つの抗原結合部位のための骨格を生成する、４つの領域、ＦＲ１、ＦＲ
２、ＦＲ３、及びＦＲ３に分割される。抗原結合部位は上記に述べたようなさまざまな用
語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がど
のように定義されるかによって決まる。

「軽鎖可変領域カッパ１（Ｖκ１）フレームワーク」又は「Ｖκ１」は、本明細書で使
用するとき、ヒトＶκ１機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされて
いる、アミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｋ１遺伝子は
、ＩＧＫＶ１−５^*０１、ＩＧＫＶ１−６^*０１、ＩＧＫＶ１−８^*０１、ＩＧＫＶ１−９^*
０１、ＩＧＫＶ１−１２^*０１、ＩＧＫＶ１−１３^*０２、ＩＧＫＶ１−１６^*０１、ＩＧ
ＫＶ１−１７^*０１、ＩＧＫＶ１−２７^*０１、ＩＧＫＶ１−３３^*０１、ＩＧＫＶ１−３
７^*０１、ＩＧＫＶ１−３９^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−８^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２^*０１、
ＩＧＫＶ１Ｄ−１３^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１７^*０１、ＩＧ
ＫＶ１Ｄ−３３^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７^*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９^*０１、ＩＧＫＶ
１Ｄ−４２^*０１、又はＩＧＫＶ１Ｄ−４３^*０１である。免疫グロブリン遺伝子の命名法
は周知されたものである。

「軽鎖可変領域ラムダ３（Ｖλ３）フレームワーク」又は「Ｖλ３」は、本明細書で使
用するとき、ヒトＶλ３機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされた
アミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶλ３遺伝子は、ＩＧ
ＬＶ３−１^*０１、ＩＧＬＶ３−９^*０１、ＩＧＬＶ３−１０^*０１、ＩＧＬＶ３−１２^*０
１、ＩＧＬＶ３−１６^*０１、ＩＧＬＶ３−１９^*０１、ＩＧＬＶ３−２１^*０１、ＩＧＬ
Ｖ３−２２^*０１、ＩＧＬＶ３−２５^*０１、ＩＧＬＶ３−２７^*０１、及びＩＧＬＶ３−
３２^*０１である。

「重鎖可変領域Ｖｈ５フレームワーク」又は「Ｖｈ５」は、本明細書で使用するとき、
ヒトＶｈ５機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列
を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ５遺伝子は、ＩＧＨＶ５−５１
^*０１及びＩＧＨＶ５−１^*０１である。

「重鎖可変領域Ｖｈ６フレームワーク」又は「Ｖｈ６」は、本明細書で使用するとき、
ヒトＶｈ６機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列
を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ６遺伝子はＩＧＨＶ６−１^*０
１である。

「軽鎖カッパＪ領域（Ｊκ）フレームワーク」又は「Ｊκ」は、本明細書で使用すると
き、ヒトＪκ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配
列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶκ遺伝子は、ＩＧＫＪ１、ＩＧ
ＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、及びＩＧＫＪ５である。

「軽鎖ラムダＪ領域（Ｊλ）フレームワーク」又は「Ｊλ」は、本明細書で使用すると
き、ヒトＪλ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配
列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪλ遺伝子は、ＩＧＬＪ１、ＩＧ
ＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６、及びＩＧＬＪ７である。

「重鎖Ｊ領域（Ｊｈ）フレームワーク」又は「Ｊｈ」は、本明細書で使用するとき、ヒ
トＪｈ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有
するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪｈ遺伝子は、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２
、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、及びＩＧＨＪ６である。

「生殖細胞系列遺伝子」又は「抗体生殖細胞系列遺伝子」は、本明細書で使用するとき
、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを
経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。

本明細書で使用するとき、「スカフォールド」は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコ
ードされる軽鎖又は重鎖可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは
、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。

本明細書で使用するとき、用語「抗原」は、直接又は間接に抗体を生成する能力を有す
る任意の分子を意味する。「抗原」の定義内には、タンパク質コーディング核酸が含まれ
る。

用語「ホモログ」は、参照配列との配列同一性が４０％〜１００％であるタンパク質配
列を意味する。ヒトＴＬＲ３のホモログには、周知のヒトＴＬＲ３配列との配列同一性が
４０％〜１００％であるような他種由来のポリペプチドが含まれる。２つのペプチド鎖の
同一性（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、ペア
でアライメントすることによって決定することができる。「ＴＬＲ３」とは、ヒトＴＬＲ
３（ｈｕＴＬＲ３）及びその同族体を意味する。完全長ｈｕＴＬＲ３のヌクレオチド及び
アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示されている。ｈｕＴＬＲ３細胞
外ドメイン（ＥＣＤ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番
号４に示す。

用語「実質的に同一の」は、本明細書で使用するとき、比較される２つの抗体又は抗体
フラグメントのアミノ酸配列が同一であるか、又は「実体のない差異」を有するというこ
とを意味する。抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列における１、２、３、４、５又
は６個のアミノ酸の置換が、実体のない差異として挙げられる。本明細書で開示する配列
とほぼ同一のアミノ酸配列も本願の一部である。一部の実施形態では、配列の同一性は、
約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又はそれよりも高い可能性がある。同一性（％）は、上記に述べたようにして決定するこ
とができる。比較するペプチド鎖の例としては、重鎖又は軽鎖可変領域がある。

用語「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用するとき、記述の対象である薬剤が、他
の薬剤と共に、混合物として一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順
次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。

用語「炎症状態」は、本明細書で使用するとき、ほとんどの場合、痛み、発赤、腫れ、
及び組織機能の喪失を特徴とし、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば、
好中球、単球、リンパ球、マクロファージ）の活性によりある程度介在される、細胞損傷
に対する局所化された応答を意味する。用語「炎症性肺状態」は、本明細書で使用すると
き、肺を冒す又は肺と関連する炎症状態を意味する。

本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質
な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗
体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対する。「モノクローナル」という
修飾語は、抗体のほぼ均質な性状を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法
によって生成される必要はない。例えば、マウスｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法によって製造す
ることができる。ドナー抗体（通常はマウス）由来の軽鎖及び重鎖可変領域を、アクセプ
ター抗体（通常、例えばヒトなどの別の哺乳動物種）由来の軽鎖及び重鎖の定常領域とと
もに含むキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法によって調
製することができる。ヒト以外のドナーの免疫グロブリン（通常はマウス）由来のＣＤＲ
と、１つ以上のヒト免疫グロブリン由来の分子のその他の免疫グロブリン由来部とを有す
るヒト化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知
の方法によって調製することができる。ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者
であれば関連するデータベースから選別することができる。必要に応じ、ヒト化ｍＡｂは
、結合親和性を維持するために、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，１９９１に開示される
もののような方法によって、変更されたフレームワーク支持残基を組み込むことによって
更に改変することができる。

ヒト以外の配列を全く有さない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１，１９９６
、及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜
１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリンのトランスジェニックマ
ウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００、及びＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１で参照されている方
法によって、ファージディスプレイライブラリから調製し、最適化することもできる。抗
体のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びｄＡｂのフラグメントを
、抗体の切断又は遺伝子組み換え操作により生成してもよい。例えば、ペプシンなどの酵
素により抗体を処理することで、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２のフラグメントを生成しても
よい。

用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分
を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような部位の化学的に活性な
（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷
特性を有し得る。エピトープは元来線状であってもよく、あるいはアミノ酸の１つながり
の線状によってではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成
される不連続エピトープ（例えば立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピト
ープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような
抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。

用語「パラトープ」は、本明細書で使用するとき、抗原が特異的に結合する抗体の一部
を指す。パラトープは元来線状であっても又は不連続であってもよく、１つながりの線状
のアミノ酸よりも、抗体の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成されて
もよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープアミノ酸残基
」及び「重鎖パラトープアミノ酸残基」は、それぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖及び重
鎖残基を指す。

用語「特異的結合」は、本明細書で使用するとき、抗体が所定の抗原と、他の抗原又は
タンパク質に対するよりも高い親和性を有して結合することを指す。通常、抗体における
解離定数（Ｋ_D）は、１０^-7Ｍ以下であり、抗体が所定の抗原と結合する際のＫ_Dは、所定
の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプ
チド）と結合する際のＫ_Dと比較して少なくとも２倍小さい。本明細書では、「抗原を認
識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句を、「抗原と特異的に結合する抗体
」又は「抗原特異的抗体」、例えばＴＬＲ３特異的抗体という用語と互換可能に用いる。
解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。

用語「ＴＬＲ３の生物活性」又は「ＴＬＲ３の活性化」は、本明細書で使用するとき、
リガンドとＴＬＲ３との結合によって生ずる任意の活性を指す。ＴＬＲ３のリガンドには
、２本鎖ＤＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、及び例えば壊死細胞から放出される内因性ｍＲＮＡな
どの内因性ｍＲＮＡが含まれる。ＴＬＲ３の活性化の一例では、ＴＬＲ３のリガンドに応
じてＮＦ−κＢが活性化される。ＮＦ−κＢの活性化は、ポリ（Ｉ：Ｃ）による受容体の
誘導に基づき、リポーター遺伝子アッセイを使用してアッセイすることができる（Ａｌｅ
ｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２〜７３８，２００１、
Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６９７３〜６９８２，１９９９）。
他の代表的なＴＬＲ３の活性化により、ＴＬＲ３リガンドに対する応答として、インター
フェロン応答因子（ＩＲＦ−３、ＩＲＦ−７）の活性化がもたらされる。ＴＬＲ３によっ
て媒介されるＩＲＦの活性化は、インターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）によって制
御されるレポーター遺伝子を用いてアッセイすることができる。別のＴＬＲ３の活性化の
例では、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１
０及びＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカイン及びケモカインが分泌される。細胞、組織
からの、又は循環中のサイトカイン及びケモカインの放出は、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイな
どのよく知られた免疫アッセイによって測定することができる。

本明細書では、以下の通りの従来のアミノ酸１文字表記及び３文字表記を用いる。

物質の組成
本発明はＴＬＲ３の生物活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びこうした
抗体の使用法を提供する。こうしたＴＬＲ３アンタゴニストは、ＴＬＲ３に結合してＴＬ
Ｒ３の活性化を阻害する特性を有し得る。こうした抗体によってＴＬＲ３活性が阻害され
得る機序の例としては、ＴＬＲ３へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくは
インサイチューでの阻害、受容体の二量化の阻害、エンドソーム区画へのＴＬＲ３の局在
化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はＴＬＲ３のｍＲＮＡの転
写の阻害が挙げられる。他の機序によってＴＬＲ３の活性を阻害することが可能な他の抗
体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである
。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。

抗体の多様性は、自然体系では、可変領域をコードする多数の生殖細胞系列遺伝子の使
用及びさまざまな体細胞イベントにより作り出される。体細胞イベントとしては、完全な
ＶＨ領域を作るための多様性（Ｄ）及び接合（Ｊ）遺伝子セグメントを持つ可変遺伝子セ
グメントの組換え、並びに完全なＶＬ領域を作るための可変及び接合遺伝子セグメントの
組換えがある。組み換えプロセスそれ自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部におけるア
ミノ酸の喪失又は追加を生じる可能性がある。多様性のこれらの機序は、抗原暴露に先立
つＢ細胞の発生時に起こる。抗原刺激の後、Ｂ細胞中で発現された抗体遺伝子は、体細胞
変異を受ける。生殖細胞系列遺伝子セグメント、これらのセグメントのランダムな組み換
え、及びランダムなＶＨ−ＶＬの対形成の見積り数に基づいて，１．６×１０⁷までの異
なる抗体が生成可能である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ
ｅｄ．（１９９３），ｅｄ．Ｐａｕｌ，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．
Ｙ．）。抗体多様性に寄与する（体細胞変異などの）他のプロセスを考慮に入れた場合、
１０¹⁰以上の異なる抗体が生成可能であると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９９５），ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。多数のプロセスが抗
体多様性の生成において関与するために、同一の抗原特異性を有する独立した由来のモノ
クローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有するということは極めてあり得ないことである
。

本発明は、新規の抗原結合部位及びヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する免
疫グロブリン鎖を提供する。抗原結合部位を担持させるための構造は一般に抗体の重鎖又
は軽鎖若しくはそれらの部分であり、抗原結合部位は上記に述べたようにして調べた天然
の抗原結合部位に位置付けられる。

本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３反応性を有する単離
された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は表１ａに示されるよ
うな重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤ
Ｒ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び
３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。

１５^* ＩＭＧＴにより定義されたＣＤＲ
１５^** コンセンサスとして定義されたＣＤＲ

特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ
３反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配
列番号１９２に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含み、配列番号１９２のＨＣ
ＤＲ２は式（Ｉ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₆−Ｉ−Ｘａａ₇−Ｘａａ₈−Ｒ−Ｓ−Ｘａａ₉−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｓ
−Ｖ−Ｋ−Ｓ、
（Ｉ）
式中
Ｘａａ₆は、Ａｒｇ又はＬｙｓであっもてよく、
Ｘａａ₇は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであってもよく、
Ｘａａ₈は、Ｍｅｔ、Ａｒｇ又はＴｙｒであってもよく、
Ｘａａ₉は、Ｌｙｓ又はＡｒｇであってもよい。

他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３
反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列
番号１９４に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含み、配列番号１９４のＨＣＤ
Ｒ２は式（ＩＩＩ）に示されるように定義される。
Ｉ−Ｉ−Ｑ−Ｘａａ₁₅−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ₁₆−Ｙ−Ａ−Ｘａａ₁₇−Ｓ−
Ｖ−Ｋ−Ｓ、
（ＩＩＩ）
式中
Ｘａａ₁₅は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＩｌｅであってもよく、
Ｘａａ₁₆は、Ａｓｎ又はＡｓｐであってもよく、
Ｘａａ₁₇は、Ｖａｌ又はＬｅｕであってもよい。

他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３
反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列
番号１９６に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を含み、配列番号１９６のＨＣＤ
Ｒ２は式（Ｖ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₂₄−Ｉ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｘａａ₂₅−Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｑ−Ｇ
、
（Ｖ）
式中
Ｘａａ₂₄は、Ｐｈｅ又はＡｒｇであってもよく、
Ｘａａ₂₅は、Ａｌａ又はＳｅｒであってもよい。

他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３
反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列
番号１９１に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、配列番号１９１のＬＣＤ
Ｒ３は式（ＩＩ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₁−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ₂−Ｘａａ₃−Ｘａａ₄−Ｘａａ₅−Ｔ−Ｖ、
（ＩＩ）
式中
Ｘａａ₁は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであってもよく、
Ｘａａ₂は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってもよく、
Ｘａａ₃は、Ａｓｐ又はＡｓｎであってもよく、
Ｘａａ₄は、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってもよく、
Ｘａａ₅は、Ｐｈｅ、Ａｌａ又はＬｅｕであってもよい。

他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３
反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列
番号１９３に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、配列番号１９３のＬＣＤ
Ｒ３は式（ＩＶ）に示されるように定義される。
Ｘａａ₁₀−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ₁₁−Ｐ−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｖ、
（ＩＶ）
式中
Ｘａａ₁₀は、Ｇｌｎ又はＳｅｒであってもよく、
Ｘａａ₁₁は、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであってもよく、
Ｘａａ₁₂は、Ｖａｌ又はＡｓｎであってもよく、
Ｘａａ₁₃は、Ｔｙｒ又はＰｈｅであってもよく、
Ｘａａ₁₄は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎであってもよい。

他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬＲ３
反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列
番号１９５に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、配列番号１９５のＬＣＤ
Ｒ３は式（ＶＩ）に示されるように定義される。
Ｑ−Ｑ−Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｘａａ₂₀−Ｘａａ₂₁−Ｘａａ₂₂−Ｘａａ₂₃−Ｔ、
（ＶＩ）
式中
Ｘａａ₁₈は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであってもよく、
Ｘａａ₁₉は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｎであってもよく、
Ｘａａ₂₀は、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってもよく、
Ｘａａ₂₁は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであってもよく、
Ｘａａ₂₂は、Ｓｅｒ又はＬｅｕであってもよく、
Ｘａａ₂₃は、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであってもよい。

本発明は、また、表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸
配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖の相補性決定領域
（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有
する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はフラグメントも提供するものである。

抗原結合部位のアミノ酸配列が表１ａのもの（配列番号４９〜１２１及び１９１〜１９
６）と大きく異ならない抗体は本発明の範囲に含まれるものである。一般に、これには、
同様の電荷、疎水性又は立体化学的特性を有するアミノ酸による１以上のアミノ酸置換を
伴う。抗原結合部位ではなく、フレームワーク領域における更なる置換もまた、これらの
置換が抗体の特性に悪影響を及ぼさない限りは行われてもよい。置換は、例えば安定性又
は親和性といった抗体の特性を向上させるために行われてもよい。１、２、３、４、５又
は６個の置換を抗原結合部位に行うことができる。得られる抗体が所望の特性を保持する
ならば、フレームワーク残基の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％
、２５％、又は３０％を置換することができる。

保存的な改変では、こうした改変が行われた分子と同様の機能的及び化学的特徴を有す
る分子が生ずる。分子の機能的及び／又は化学的特性における大幅な改変は、（１）置換
領域における分子骨格の構造を例えばシート又はヘリックス立体構造として維持する、（
２）標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持する、又は（３）分子のサイズを維持
する効果において大きく異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって実現するこ
とができる。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置のアミノ酸残基の極性又は
電荷にほとんどあるいは全く影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換する
ことができる。更に、アラニン・スキャニング変異導入法についてこれまでに述べられて
いるように、ポリペプチド内の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる（Ｍａ
ｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．
６４３：５５〜６７，１９９８、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．３５：１〜２４，１９９８）。当業者であれば、所望のアミノ酸置換（保存的又は非保
存的であるかによらず）を、かかる置換が望ましい時点で決定することができる。例えば
、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を同定したり、又は本
明細書で述べる分子の親和性を増大又は減少させたりすることができる。アミノ酸置換の
例を表１ｂに示す。

特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換には、生体系において合成されるので
はなく、一般的に化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基も含まれ
る。アミノ酸置換は、例えばＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によっ
て行うことができる。変異体のライブラリは、周知の方法を使用して、例えば、無作為（
ＮＮＫ）又は非無作為コドン、例えば、１１種類のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）
をコードするＤＶＫコドンを使用し、実施例１に示されるように、所望の特性を有する変
異体のライブラリをスクリーニングして生成することができる。表１ｃは、抗体の特性を
改善するために、３つの親ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ２領域
内に行った置換を示す。

抗原結合部位の表記に応じて、本発明の抗体の抗原結合部位、次いでフレームワーク残
基は、各重鎖及び軽鎖ごとに若干異なり得る。

表２ａ及び２ｂは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴに従って記述された本発
明の例示的な抗体の抗原結合部位残基及びそれらの複合配列を示したものである。

他の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む、ＴＬ
Ｒ３反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供するものであり、前記抗体は
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含むとともに表３ａに
示されるようなそれぞれの単離された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を提供する。Ｆ１７
、Ｆ１８及びＦ１９は、それぞれ、ファミリー１７、１８及び１９のコンセンサスなアミ
ノ酸配列を含む抗体の変異体を表す（実施例１を参照）。

実施例で説明する実施形態は、１つは重鎖に由来し、１つは軽鎖に由来する１対の可変
領域を含むが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖可変領域を単独で含ん
でもよいということを認識するだろう。単一の可変領域を用いることで、例えばＴＬＲ３
に結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することが可能な
第２の可変領域についてスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、例えば
、国際公開第９２／０１０４７号に開示される階層的二重コンビナトリアルアプローチを
用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。この
アプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他
方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖
特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選別す
る。

他の実施形態では、本発明は、表３ａに示される可変領域のアミノ酸配列と少なくとも
９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含み、ＴＬＲ
３反応性を有する単離された抗体又はフラグメントを提供する。

別の態様では、本発明は、表３ｂに示されるような特定の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
を有する単離された抗体を提供する。

本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離されたポ
リヌクレオチドである。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺
伝暗号の縮重又は特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アン
タゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。

抗体アンタゴニストの例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭアイソ
タイプの抗体が挙げられる。更にこうした抗体アンタゴニストは、グリコシル化、異性化
、脱グリコシル化、又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加（ペグ化）及び
脂質化など非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されてもよい。このよう
な修飾は、インビボ又はインビトロで行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチ
レングリコールと接合（ＰＥＧ化）することによって薬物動態的なプロファイルを向上さ
せることができる。接合は、当業者に周知の方法によって行うことができる。治療用抗体
をＰＥＧと接合させることによって、機能は低下せずに薬物動態が向上されることが示さ
れている。（Ｄｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２
〜３９０，２０００、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９
〜４１８，２００４、Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１
１９，２００１、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：７６１〜７
７０，２００３）。

本発明の抗体の薬物動態的特性は、当業者には周知の方法により、Ｆｃ修飾によって向
上させることも可能である。例えば、ＩｇＧ４アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖
間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ
（ＣＰＳＣ）というモチーフを含んでいる。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙ
ｓ残基が他の重鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合する（重鎖間）か、あるいは
特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合し得る（重鎖内
）。生体内のイソメラーゼ酵素は、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、ま
たその逆反応を行うことが可能であると考えられている（Ａａｌｂｅｒｓｅ及びＳｃｈｕ
ｕｒｍａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：９〜１９，２００２）。したがって、ヒン
ジ領域に重鎖内結合を有するこうしたＩｇＧ４分子内の重鎖：軽鎖（Ｈ：Ｌ）の各ペアは
互いに共有結合していないことからＨ：Ｌモノマーに解離し、更に他のＩｇＧ４分子に由
来するＨ：Ｌモノマーと再会合して、二重特異的なヘテロダイマーのＩｇＧ４分子を形成
する。二重特異的なＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂはそれらが結合するエピト
ープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＣＰＳＣモチーフのＳｅｒ残基をＰｒｏで置換す
ることによって「ＩｇＧ１様挙動」が生じる。すなわち、これらの分子は重鎖同士の間に
安定したジスルフィド結合を形成するために他のＩｇＧ４分子とのＨ：Ｌ交換が起きない
。一実施形態では、本発明の抗体はＣＰＳＣモチーフ内にＳからＰへの突然変異を有する
ＩｇＧ４のＦｃドメインを含むものとなる。ＣＰＳＣモチーフの位置は典型的に、成熟し
た重鎖の残基２２８に見出されるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。

更に、本発明の抗体のＦｃＲｎサルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響する
部位を除去することもできる。例えば、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合領域を本
発明の抗体において除去することができる。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３
４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異、又はＩｇＧ４のヒンジ領域の
Ｐｈｅ２３５／Ｌｅｕ２３６のＰ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａへの突然変異によって、ＦｃＲへ
の結合性が最小となり、補体依存性細胞傷害活性及びＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリン
の能力が低減する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ突然変異
を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。上記で同定したこれらの残基の位置は成熟した
重鎖においては典型的なものであるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。Ｐ２３５Ａ／
Ｌ２３６Ａ突然変異を有する抗体の例としては、配列番号２１８、２１９又は２２０に示
される重鎖アミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。

完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、及び親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは、
融合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。抗原に対する抗
体親和性は、ランダム又は部位特異的な突然変異誘発などの周知の方法を用いた合理的設
計（rational design）又はランダムな親和性成熟によるか、あるいはファージディスプ
レイライブラリを用いることによって高めることができる。例えば、大部分がフレームワ
ーク領域中に存在するバーニアゾーン残基又は「親和性決定残基（Affinity Determining
Residue）」、すなわち、ＡＤＲに対して置換を行うことで、抗体の親和性を調節するこ
とができる（米国特許第６，６３９，０５５号、国際公開第１０／０４５３４０号）。

安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は所望の生物学的若しくは生物物
理学的特性を高めるように改変された完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、親和性成熟抗体
分子又は抗体フラグメントは本発明の範囲に含まれる。抗体の安定性は、（１）内在的な
安定性に影響する個々のドメインのコアパッキング、（２）重鎖と軽鎖とのペアリングに
影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、
（４）極性及び荷電残基の水素結合ネットワーク、及び（５）分子内及び分子間力の中で
も特に表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの要因によって影響される（Ｗｏｒｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５：９８９〜１０１０，２００１）。残基
を不安定化させる可能性のある構造は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっ
ては分子モデリングによって識別することが可能であり、抗体の安定性に対するこれらの
残基の影響を、識別された残基中で変異を有する変異体を生成及び評価することにより試
験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ
）によって測定される熱転移中点（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質の
Ｔｍはその安定性と相関し、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並び
にそのタンパク質のアンフォールドのしやすさに依存する分解プロセスと負の相関を示す
（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）
。多くの研究によって、ＤＳＣにより熱安定性として測定された製剤の物理的安定性のラ
ンク付けと他の方法により測定された物理的安定性のランク付けとの間に相関関係が見出
されている（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８，２００
３、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜３０８９，
２００４、Ｍａａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１４０：１５５〜１６８
，１９９６、Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ ｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２１：１３５３
〜１３６１，２００４、Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５：
２００〜２０８，１９９７）。これらの配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂ
の長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク中又は抗
原結合部位内におけるアミノ酸の差は、Ｆａｂドメインの熱安定性に大きく影響し得る（
Ｙａｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：１４３〜１４６，１９９４）
。

本発明の抗体アンタゴニストは、約１０^-7、１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、又は
１０^-12Ｍ以下のＫ_DでＴＬＲ３と結合することができる。抗体などの特定の分子のＴＬＲ
３に対する親和性は、任意の適当な方法によって実験的に求めることができる。このよう
な方法は、当業者に周知のＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的
結合アッセイを利用し得る。

特定のＴＬＲ３ホモログと所望の親和性で結合する抗体アンタゴニストは、抗体親和性
成熟などの方法によって変異体又はフラグメントのライブラリから選択することができる
。抗体アンタゴニストは、任意の適当な方法を用いてＴＬＲ３の生物活性の阻害に基づい
て同定することができる。かかる方法では、周知の方法を使用し、本願に記載されるよう
に、レポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用し得る。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクター
である。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイル
ス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生
物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の
任意のベクターであってもよい。

本発明の別の実施形態は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２
２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、
１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、
２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖
可変領域、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５
、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９
、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を有する
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、
本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞である。

本発明の別の実施形態は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４
、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミ
ノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、又は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、
２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する免
疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であ
る。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってもよ
い。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる
。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）
、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ
．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株などの不死化
細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−
ＴＩＢ−１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎ
ｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞
に由来するものが挙げられる。

本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって
産生された抗体を回収することと、を含む、ＴＬＲ３反応性を有する抗体の製造方法であ
る。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。

本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

本発明の別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸
残基、Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４
６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５
１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合する、単離された
抗体又はそのフラグメントである。

別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基、Ｓ
１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ
１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及
びＡ２１９に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。

幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。
例えば、両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質−タンパ
ク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定することができる。抗原抗体複
合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合し得る抗原の領
域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることに
より、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。ＴＬＲ３のような大
きなタンパク質では、最初にドッキング、セグメント突然変異誘発、又はＨ／Ｄ交換など
によって結合部位の位置をそのタンパク質の特定の領域に限定することで点突然変異誘発
によるマッピングが単純化される。両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシ
リコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定する
ことができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに
寄与する残基を同定することができる。

本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領
域のＣｈｏｔｈｉａ残基、Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、
Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基、
Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５により、配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラト
ープＣｈｏｔｈｉａ残基は、配列番号２１６の重鎖残基Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５
、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４、及びＤ１０６、並びに配列番
号４１の軽鎖残基Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４、及びＳ９５に対応する。

本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体は、配
列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３を、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残
基Ｎ３１ａ、Ｑ５２、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及び
Ｙ１００、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、
Ｅ５０、Ｄ５１、Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３に結合する。重鎖パラトープ及び軽鎖パラト
ープＣｈｏｔｈｉａ残基は、配列番号２１４の重鎖残基Ｎ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７
、Ｋ５８、Ｙ６０、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６、及びＹ１０７、並びに配列番号２１
１の軽鎖残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及びＤ
９２に対応する。

例えば、パラトープ残基を好適な骨格にグラフトし、作製した骨格を完全な抗体に組立
て、得られた抗体を発現させ、及びＴＬＲ３への結合又はＴＬＲ３の生物活性に及ぼす影
響について抗体を試験することにより、ＴＬＲ３を結合する特定のパラトープ残基を有す
る単離された抗体を作製することができる。代表的な骨格は、ヒト生殖細胞系列遺伝子に
よりコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列である。例えば、全体配列同一性、パ
ラトープ残基間の同一性（％）、又は骨格と、ｍＡｂ １５ＥＶＱ又はｍＡｂ １２ＱＶ
Ｑ／ＱＳＶなどの代表的な抗体との間の正準構造クラス同一性に基づいて、骨格を選択す
ることができる。ヒト抗体生殖細胞系遺伝子が、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２７：７７６〜７９８、及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ＿：／／＿
ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）に開示されている。例えば、米国特許第６，３００，０６４
号で述べられているように、コンセンサスなヒトフレームワーク領域も使用することがで
きる。例えば、国際公開第１０／０４５３４０号に記載されている方法に従って、好適な
骨格の選択を行うことができる。

パラトープ残基をグラフトする骨格として使用可能な代表的なヒト生殖細胞系列遺伝子
は、Ｖκ１、Ｖλ３、Ｖｈ５、Ｖｈ６、Ｊκ、Ｊλ、及びＪｈフレームワークによりコー
ドされた遺伝子である。この生殖細胞系列Ｊ領域は、ＦＲ４配列を選択するために、その
全体又は一部を使用される。例えば、ｍＡｂ １５ＥＶＱ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧκ
Ｊ１によりコードされたＪ領域配列に直接連結されている、ＩＧＫＶ１−３９^*０１によ
りコードされたＶκ１フレームワークにグラフトすることができる。他のＶκ１遺伝子由
来の配列を使用することもでき、ＩＧκＪ１の代わりに、他のＪκ遺伝子のＦＲ４配列を
置換することもできる。ｍＡｂ １５ＥＶＱ重鎖パラトープ残基と、続いて、ＨＣＤＲ３
及びＩＧＨＪ１によりコードされたＦＲ４配列を構成する約１１〜１３個の残基、例えば
１２個の残基を、ＩＧＨＶ５−５１^*０１によりコードされたＶｈ５フレームワークにグ
ラフトすることができる。１１〜１３個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦ
Ｒ４領域（大部分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端の間に懸り、ｍＡｂ １５ＥＶＱＶ
ｈ由来の４個の規定されたパラトープ残基を含む。他のＶｈ５遺伝子由来の配列を使用す
ることもでき、ＩＧＪＨ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもでき
る。別の例では、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧＪＬ２により
コードされたＪ領域配列に直接連結したＩＧＬＶ３−１^*０１によりコードされたＶλ３
フレームワークにグラフトすることができる。他のＶλ３及びＪλ遺伝子の配列を使用す
ることもできる。ＬＣＤＲ３の長さは、約９〜１１個の残基、例えば、１０個の残基で維
持される。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（大部分のＶラムダ骨格に対する
「ＹＹＣ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＬ領域に対する「ＦＧＧ」）の初端との間
に懸り、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ由来の３個の規定されたパラトープ残基を含む。ｍ
Ａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ重鎖パラトープ残基と、続いてＨＣＤＲ３及びＩＧＪＨ１によ
りコードされたＦＲ４配列を構成する約９〜１１個の残基、例えば１０個の残基を、ＩＧ
ＨＶ６−１^*０１によりコードされたＶｈ６フレームワークにグラフトすることができる
。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦＲ４領域（大部
分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端との間に懸り、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶＶｈか
らの４個の規定されたパラトープ残基を含む。ＩＧＨＪ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦ
Ｒ４配列を置換することもできる。ＴＬＲ３への結合及び得られた抗体の生物活性を、標
準的な方法を用いて評価することができる。ｍＡｂ １５ＥＶＱ及びｍＡｂ １２ＱＶＱ
／ＱＳＶ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、代表的なＶκ１、Ｖｈ５、Ｖλ３、Ｖｈ６、
Ｊκ、Ｊλ又はＪｈ遺伝子とのアライメントを、図３２〜３５に示す。パラトープをグラ
フトした、作製された抗体を、バーニアゾーン残基又は親和性決定残基の置換により更に
改変して、抗体の特性、例えば上述のように親和性を改善することができる。パラトープ
をグラフトした抗体がＴＬＲ３への結合を保持する限り、パラトープをグラフトした抗体
中のフレームワークアミノ酸配列は、ｍＡｂ １５ＥＶＱ又は１２ＱＶＱ／ＱＳＶフレー
ムワーク配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、又は９９％同一であってもよい。

標準的な方法を用いて、パラトープ残基に追加して抗原結合部位由来の配列をグラフト
することもできる。例えば、完全なＨＣＤＲ３又はＬＣＤＲ３をグラフトしてもよい。

本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配
列、特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミ
ノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体と
ＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフ
ラグメントである。本発明のモノクローナル抗体の例としては、配列番号２１６に示され
るアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４１に示される軽鎖可変領域のアミノ
酸配列を含む単離された抗体、並びに配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を有する重
鎖可変領域及び配列番号２１１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体がある
。

ＴＬＲ３との結合についての競合は周知の方法によってインビトロでアッセイすること
ができる。例えば、非標識抗体の存在下でのＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ
−エステル標識抗体のＴＬＲ３への結合を、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。
本発明の抗体の例としては、ｍＡｂ １２、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１がある
（表３ａを参照）。既述の抗ＴＬＲ３抗体ｃ１０６８及びその誘導体（国際公開第０６／
０６０５１３（Ａ２）号に記載）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ
番号１４−９０３９）、並びにＩｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｉ
ＭＧ−３１５Ａ、ヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ
）に対して生成された）は、実施例５に示されるようにｍＡｂ１２、１５、又はｃ１８１
１のいずれともＴＬＲ３に対する結合について競合しない。

本発明の別の態様は、以下の特性のうち少なくとも１つを有する、ＴＬＲ３反応性を有
する単離された抗体である。
ａ．１０ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＬＲ３へ結合する、
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒ
トＴＬＲ３の生物活性を１μｇ／ｍＬで５０％超低減させる、
ｃ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を、１０μｇ／ｍＬで６０％超阻害する、
ｄ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を、０．４μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｅ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
生を、５μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｆ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
生を、１μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
ｇ．ＰＢＭＣ細胞によるポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩ
Ｌ−１２の産生を、１μｇ／ｍＬで２０％超阻害する、
ｈ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬ
Ｒ３の生物活性をＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで阻害するか、又は
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ
３の生物活性をＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで阻害する。

治療方法
本発明のＴＬＲ３アンタゴニスト、例えばＴＬＲ３抗体アンタゴニストは、免疫系を調
節する目的で使用することができる。何らのかの特定の理論に束縛されることも望むもの
ではないが、本発明のアンタゴニストは、ＴＬＲ３へのリガンドの結合、ＴＬＲ３の二量
化、ＴＬＲ３の細胞内移行、又はＴＬＲ３の輸送を防止又は低減することによって免疫系
を調節し得るものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物の患者を
治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び
家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば本発明の抗体は、ＴＬＲ３活性の中和、炎症、
炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の
調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるよう
に調製される。

一般的に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって予防又は治療すること
が可能な炎症状態、感染にともなう状態、又は免疫介在性炎症性疾患には、サイトカイン
又はケモカインによって媒介されるもの、及びＴＬＲ３の活性化又はＴＬＲ３経路を介し
たシグナル伝達に全体的又は部分的に起因する状態が含まれる。こうした炎症状態の例と
しては、敗血症にともなう状態、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、及び感染
にともなう状態が挙げられる。更に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によっ
て癌、心血管及び代謝性の状態、神経病及び線維症の状態を予防又は治療することも可能
であると考えられる。炎症は組織を冒し、全身性の症状となり得る。罹患する組織の例と
しては、気道、肺、消化管、小腸、大腸、結腸、直腸、心血管系、心組織、血管、関節、
骨及び滑膜組織、軟骨、上皮、内皮、肝又は脂肪組織が挙げられる。全身性の炎症状態の
例としては、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群
（ＳＩＲＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急
性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフル
エンザ、肺炎、ショック、又は敗血症がある。

炎症は、侵入する病原体を撃退するための生物による防御反応である。炎症は、多くの
細胞性及び体液性のメディエーターが関与するカスケードイベントである。一方で炎症反
応の抑制はホストを免疫的に無防備状態にし、炎症を放置した場合には慢性炎症性疾患（
例えば、喘息、乾癬、関節炎、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、
敗血性ショック、及び多臓器不全などの重篤な合併症を引き起こし得る。重要な点として
、これらの多様な疾患状態は、サイトカイン、ケモカイン、炎症細胞、及びこれらの細胞
によって分泌される他のメディエーターなどの共通の炎症性メディエーターを共有してい
る。

リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）、２本鎖ＲＮＡ又は内因性のｍＲＮＡによってＴＬＲ３
が活性化されるとシグナル伝達経路が活性化され、これにより炎症性サイトカインの合成
及び分泌、マクロファージ、顆粒球、好中球及び好酸球などの炎症細胞の活性化及び動員
、細胞死、並びに組織の破壊が引き起こされる。ＴＬＲ３は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ
−１２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ、並びに免
疫細胞の動員及び活性化に関わる他の炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導す
ることにより、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患における組織の破壊に寄与する。ＴＬＲ
３のリガンドである内因性のｍＲＮＡは炎症時に壊死細胞から放出され、ポジティブフィ
ードバックループを引き起こすことによってＴＬＲ３を活性化し、炎症及び更なる組織破
壊を持続させる。ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのようなＴＬＲ３アンタゴニストはサイト
カインの分泌を正常化し、炎症細胞の動員を低減し、組織破壊及び細胞死を低減させると
考えられる。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは炎症及び広範な炎症状態を治療する
うえで治療上の可能性を有するものである。

炎症状態の１つの例は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血性ショック又は多臓
器不全症候群（ＭＯＤＳ）が含まれ得る、敗血症にともなう状態である。ウイルス、細菌
、真菌、又は寄生虫感染によって、及び壊死細胞によって放出される２本鎖ＲＮＡは敗血
症の発症に寄与し得る。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ＴＬ
Ｒ３アンタゴニストによる治療は、敗血症にともなう炎症状態を有する患者の生存時間を
延ばすことにより治療効果を与え、又は内在的な抗菌活性を強化することにより、抗菌剤
と組み合わされる場合に相乗的な活性を示すことにより、病状に寄与する局所的炎症状態
を最小化することにより、若しくは上記の任意の組み合わせにより、局所的な（例えば、
肺における）炎症イベントが広がって全身症状となることを防ぐことができると考えられ
ている。こうした介入は、患者の生存を確実にするために必要とされる更なる治療（例え
ば基礎となる炎症の治療又はサイトカインレベルの低減）を可能とするうえで充分なもの
となり得る。敗血症はＤ−ガラクトサミン及びポリ（Ｉ：Ｃ）を投与することによってマ
ウスなどの動物でモデル化することができる。こうしたモデルにおいて、Ｄ−ガラクトサ
ミンは、敗血症感作物質として機能する肝臓毒素であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）は２本鎖ＲＮＡ
を模倣してＴＬＲ３を活性化させる敗血症誘導分子である。ＴＬＲ３アンタゴニストによ
る治療は敗血症のマウスモデルにおける動物の生存率を高め得るものであり、したがって
ＴＬＲ３アンタゴニストは敗血症の治療に有用であると考えられる。

消化管の炎症は消化管の粘膜走の炎症であり、急性及び慢性の炎症状態が含まれる。急
性炎症は、短時間の発症及び好中球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。慢
性炎症は、比較的長期の発症及び単核球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる
。粘膜層は、（小腸及び大腸を含む）腸、直腸、胃（胃部）壁、又は口腔の粘膜であって
もよい。慢性の消化管炎症状態の例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、外界からの刺激
によって誘導される大腸炎（例えば、化学療法、放射線療法などの投与のような治療レジ
メンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう（例えば副作用として）消化管炎
症（例えば大腸炎））、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、膠原性又はリンパ性大腸炎、壊死
性腸炎、慢性肉芽腫症又はセリアック病などの状態における大腸炎、食品アレルギー、胃
炎、感染性胃炎又は小腸結腸炎（例えばヘリコバクター・ピロリの感染による慢性活動性
胃炎）、及び感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態がある。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）な
どの、一般に病因が不明の一群の慢性炎症性疾患が含まれる。臨床的及び実験的証拠は、
ＩＢＤの病因が感受性遺伝子及び環境因子が関与する多因子的なものであることを示唆し
ている。炎症性腸疾患では、組織の傷害は、腸内の微生物叢の抗原に対する不適切又は過
剰な免疫反応によってもたらされる。炎症性腸疾患の幾つかの動物モデルが存在している
。最も広く用いられているモデルには、結腸に慢性炎症及び潰瘍形成を誘発する２，４，
６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導性大腸炎モデル又はオ
キサゾロンモデルがある（Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ １９：５１〜６２，２０００）。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結
腸の短縮、及び好中球の浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成として発現する急性大腸炎を誘発
する硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。ＤＳＳ誘発大腸炎は、リンパ組
織過形成、陰窩傷害（focal crypt damage）、及び上皮潰瘍形成をともなう、基底膜内へ
の炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５：７９〜
９４，２００２）。別のモデルは、ナイーブなＣＤ４５ＲＢ^high ＣＤ４Ｔ細胞をＲＡＧ
又はＳＣＩＤマウスに養子移入する。このモデルでは、ドナーのナイーブＴ細胞がレシピ
エントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性腸疾患に似た慢性腸炎症及び症状を引き
起こす（Ｒｅａｄ ａｎｄ Ｐｏｗｒｉｅ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｕｎｉｔ １５．１３，２００１）。これらのモデルのいずれか
において本発明のアンタゴニストの投与を用いることによって、これらのアンタゴニスト
が、炎症性腸疾患等の腸内の炎症に伴う症状を改善し、疾患の経過を変化させる潜在的な
有効性を評価することができる。ＩＢＤに対しては幾つかの治療の選択肢が利用可能であ
り、例えば抗ＴＮＦα抗体療法がクローン病を治療するために１０年前から使用されてい
る（Ｖａｎ Ａｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｐｕｂ
Ｏｃｔ ２００９）。しかしながら、かなりの割合の患者が現在の治療法に応答しない
（Ｈａｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１５４１〜１５４９，２００
２、Ｈａｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０：３２
３〜３３３，２００６）ことから、難治性の患者集団を標的とした新たな治療法が求めら
れている。

炎症状態の別の一例は炎症性の肺状態である。炎症性の肺状態の例としては、ウイルス
、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発され
る肺状態、アレルゲンにより誘発される肺状態、アスベスト症、珪肺症、又はベリリウム
肺症などの汚染物質により誘発される肺状態、胃吸引により誘発される肺状態、嚢胞性線
維症などの遺伝的素因にともなう免疫無調節炎症状態、及び人工呼吸器傷害などの物理的
外傷により誘発される肺状態が挙げられる。これらの炎症状態には更に、喘息、肺気腫、
気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、
リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、市
中肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染
、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒト・メタニューモウイルス感染、呼吸
系発疹ウイルス感染、及びアスペルギルス感染又は他の真菌感染も含まれる。感染にとも
なう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道増悪、及び急性
呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染
にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次細菌感染のように複数の感染をともなう場
合がある。

喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）、気管支収縮、喘鳴、好酸球又は好中球性炎症、粘液分
泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥレベルによって特徴付けられる肺の炎症性疾患で
ある。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えばライノウイルス、インフ
ルエンザウイルス、ヘモフィルスインフルエンザなど）により症状の悪化である「増悪」
を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えばネコ、イヌ、
ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例え
ば煙草の煙）、刺激性ガス、フューム、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は
冷気によって誘発される。喘息以外にも、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌
性肺炎、及び嚢胞性線維症などの肺に影響を与える幾つかの慢性炎症性疾患が、気道への
好中球の浸潤によって特徴付けられ（Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉ
ｒ．Ｊ．１５：９７３〜９７７，２０００、Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１１５：２６８〜２７６，２００５）、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、及
び嚢胞性線維症などの疾患は、気道過敏性によって特徴付けられている（Ｆａｈｙ ａｎ
ｄ Ｏ’Ｂｙｒｎｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６３：
８２２〜８２３，２００１）。喘息及び気道炎症の一般的に用いられる動物モデルとして
は、オボアルブミンチャレンジモデル及びメタコリン感作モデルが挙げられる（Ｈｅｓｓ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９３：４０１〜４１２，１９
９５）。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイ
トカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本
発明のアンタゴニストをこれらのモデルのいずれかに投与することによって、喘息、気道
炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善し、経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの
使用を評価することができる。

本発明の方法によって予防又は治療し得る他の炎症状態及び神経障害は、自己免疫疾患
によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症
、全身性エリテマトーデス、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン
病、双極性疾患、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性及び中枢神経系（Ｃ
ＮＳ）疾患、原発性胆汁性硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患／脂
肪性肝炎、線維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等の
肝臓疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及
び心筋梗塞等の心血管疾患、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマ
チ（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強
直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性皮膚状態、移植
、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに、
細胞、ウイルス又はプリオンによって介在される感染症又は疾患が挙げられる。

変形性関節症、関節リウマチ、怪我による関節炎を有する関節などを含む関節炎は、本
発明のアンタゴニストのような抗炎症性タンパク質の治療的使用によって利するところの
ある一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は全身を冒す全身性疾患で
あり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。関節リウマチは組織の傷害を引き起こす
ため、ＴＬＲ３リガンドが炎症部位に存在し得る。ＴＬＲ３シグナル伝達の活性化によっ
て、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続し得る。関節リウマチの幾つか
の動物モデルが当該技術分野において知られている。例えばコラーゲン誘発関節炎（ＣＩ
Ａ）モデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。
本発明のＴＬＲ３アンタゴニストをＣＩＡモデルマウスに投与することによって、疾患の
症状を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価する
ことができる。

真性糖尿病すなわち糖尿病は、複数の原因因子によって誘導され、高血糖によって特徴
付けられる疾患プロセス（ＬｅＲｏｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．Ｕ．Ｓ．Ａ １９９６）、及びそこに引用されるすべ
ての参照を指す。制御されない高血糖は、腎障害、神経障害、網膜障害、高血圧、脳血管
疾患及び冠状動脈性心疾患などの微小血管及び大血管性疾患のリスクが増大するために死
亡率が増加し、若年死をともなう。したがって、グルコースホメオスタシスの制御は糖尿
病の治療にとって極めて重要なアプローチである。

基礎となる欠陥により、糖尿病は、患者の膵線にインスリンを産生するβ細胞が存在し
ない場合に発症するＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）と、β細胞のイン
スリン分泌不全及び／又はインスリンの作用に対する抵抗性を有する患者において発症す
る２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）の２つの大きなグループに分類
される。

２型糖尿病は、絶対的ではなく、相対的なインスリン欠乏をともなうインスリン抵抗性
によって特徴付けられる。インスリン抵抗性の患者では、身体はこの欠陥を補償するため
に異常に高量のインスリンを分泌する。インスリン抵抗性を補償し、血糖値を適正に制御
するために不適切な量のインスリンが存在すると、耐糖能異常の状態が現れる。多くの患
者でインスリン分泌は更に低下し、血漿グルコース濃度が上昇し、糖尿病の臨床状態がも
たらされる。肥満症にともなう炎症は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質代謝異常、
及び心血管疾患の発症に深く関わっていることが示唆されている。肥満脂肪はマクロファ
ージを動員及び維持し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、遊離脂肪酸
及びアディポカインを過剰に産生する場合があり、インスリンシグナル伝達を妨害してイ
ンスリン抵抗性を誘発し得る。マクロファージのＴＬＲ３活性化は、こうした脂肪の炎症
誘発状態に寄与し得る。インスリン抵抗性の幾つかの動物モデルが知られている。例えば
、食餌誘発肥満モデル（ＤＩＯ）では、動物は体重増加をともなう高血糖症及びインスリ
ン抵抗性を発症する。ＤＩＯモデルに本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを投与することに
よって、２型糖尿病にともなう合併症を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらの
アンタゴニストの使用を評価することができる。

脂肪性肝疾患は肝疾患の範囲を包含し、通常は、アルコール性又は非アルコール性のい
ずれかで分類される。どちらの場合も、脂肪性肝疾患は、単なる肝脂肪変性（脂質の蓄積
及び堆積）からアルコール性及び非アルコール性の脂肪性肝炎（ＡＳＨ又はＮＡＳＨ）ま
での範囲に及ぶが、これは肝線維症、肝硬変、及び恐らくは肝細胞がんまで進行すること
が多い。アルコール性（ＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、
組織学的に見て区別がつかないが、定義によると、ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんど
又は全く摂取しない患者で発症する。その代わりに、ＮＡＦＬＤは、肥満症、メタボリッ
ク症候群、及び２型糖尿病の個人で頻繁に見られ、インスリン抵抗性と密接に関連してい
る（Ｕｔｚｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
Ｍｅｔａｂ ９１：４７５３〜４７６１、２００６）。肥満症及びインスリン抵抗性の有
病率における近年の劇的な増加とともに、ＮＡＦＬＤは、最もよく見られる慢性肝疾患と
して、ＡＦＬＤ及びウイルス性の肝炎誘発性肝疾患を上回っている。肥満症の人のおよそ
７５％がＮＡＦＬＤを有し、２０％もの人がＮＡＳＨを有する可能性があると推定されて
いる（Ｃｌａｒｋ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ４０（Ｓｕｐｐｌ １
）：Ｓ５〜Ｓ１０、２００６、Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉ
ｓ ２８：３３９〜３５０、２００８）。

アテローム性冠状動脈硬化性心疾患（ＣＨＤ）は、西洋社会における死及び心血管罹患
率の主な原因である。アテローム性冠状動脈硬化性心疾患の危険因子には、高血圧、真性
糖尿病、家族歴、男性であること、喫煙、血清コレステロールの上昇、低比重リポタンパ
ク（ＬＤＬ）コレステロールレベルの上昇及び高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロ
ールレベルの低下が挙げられる。一般に、約２２５〜２５０ｍｇ／ｄｌを超える総コレス
テロールレベルは、ＣＨＤの危険性の大幅な上昇に関係する。様々な臨床研究により、総
コレステロールレベル及びＬＤＬコレステロールレベルの上昇がヒトのアテローム性動脈
硬化を促進させることが立証されている。疫学的調査は、血管罹患率及び死亡率が総コレ
ステロール及びＬＤＬコレステロールのレベルと直接関係して変化することを立証してい
る。

癌の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞又
はＴ細胞のＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リ
ンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、
ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、
カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性
の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒
色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛を含む（
ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも
１つの悪性疾患を挙げることができる。

心血管疾患の例としては、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性
卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧
、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原
発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）
、潅流後症候群、心肺バイパス炎症反応、無秩序型又は多源性（chaotic又はmultifocal
）心房頻拍、規則的で狭いＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブ
ロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型
うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈及
び抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、抹消血管障
害、閉塞性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性抹消動脈障
害、レイノー現象及び障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、渦静
脈、動静脈フィスチュラ、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ
後症候群、及び虚血性再潅流傷害を含む（ただしこれらに限定されない）、細胞、組織、
臓器、動物又は患者における心血管疾患を挙げることができる。

代表的な神経性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、ＡＩＤＳ痴
呆複合症、例えば多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎などの脱髄性疾患、例えば皮質脊髄
系の病変などの錐体外路及び小脳疾患、大脳基底核の疾患又は小脳疾患、例えばハンチン
トン舞踏病及び老年舞踏病などの運動亢進性運動障害、例えばＣＮＳドーパミン受容体を
遮断する薬物によって誘導される運動障害などの薬物誘導性運動障害、例えばパーキンソ
ン病などの運動低下性運動障害、進行性核上性麻痺、小脳の構造的病変、例えば脊髄性運
動失調などの脊髄小脳変性、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性（Ｍ
ｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄ
ｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性疾患（Ｒｅｆｓｕｍ病、無β−リポタンパク血症、運動失調
、毛細管拡張症、及びミトコンドリア性多系疾患）、例えば多発性硬化症、急性横断性脊
髄炎などの脱髄性コア疾患、及び神経性筋萎縮などの運動ユニットの障害（例えば筋委縮
性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮、及び若年性脊髄性筋委縮などの前角細胞変性）、ア
ルツハイマー病、中年のダウン症候群、びまん性レビー小体病、レビー小体型の老年性認
知症、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、慢性アルコール中毒、クロイツフェルト・ヤコ
ブ病、亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデン・シュパッツ病、ボクサー痴呆を含む（た
だしこれらに限定されない）細胞、組織、臓器、動物又は患者における神経疾患を挙げる
ことができる。

線維症状態の例としては、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己
免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）、肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含む
がこれらに限定されない）、腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス
腎炎を含むがこれらに限定されない）、皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、
火傷を含むがこれらに限定されない）、骨髄線維症、神経線維腫症、線維腫、腸線維症、
及び外科手術による線維化付着などが挙げられる。このような１つの方法において、線維
症は臓器特異性線維症又は全身性線維症のいずれであってもよい。臓器特異性線維症は、
肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、心臓線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、
骨髄線維症、又はその他の線維症のうち少なくとも１つに関連し得る。肺線維症は、特発
性肺線維症、薬剤誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患のう
ち少なくとも１つに関連し得る。肝臓線維症は、肝硬変、住血吸虫症（schistomasomiasi
s）、又は胆管炎のうち少なくとも１つに関連し得る。肝硬変は、アルコール性肝硬変、
Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎で
ある。腎線維症は、糖尿病性腎障害又はループス糸球体腎炎にともない得る。心線維症は
、心筋梗塞にともない得る。血管線維症は、血管形成術後動脈再狭窄、又はアテローム性
動脈硬化にともない得る。皮膚線維症は、火傷瘢痕化、肥厚性瘢痕化、ケロイド、又は腎
性線維性皮膚症にともない得る。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後又は増殖性硝
子体網膜症にともない得る。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症
にともない得る。他の線維症は、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮又は皮膚筋炎から
選択され得る。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片体宿主病から選択され得る。

投与／医薬組成物
ＴＬＲ３活性の抑制が所望される病態の治療又は予防に効果的な剤の「治療上の有効量
」は、標準的な研究技術により判定され得る。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎
又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明
細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定する
ことができる。

加えて、インビトロアッセイを、至適用量の範囲を同定する一助として所望により選択
することもできる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの要因の考慮に基づ
いて（例えば、臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は
予防しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周
知の他の要因が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度
にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用
量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することが
できる。

本発明の方法では、ＴＬＲ３アンタゴニストは単独で、又は少なくとも１種類の他の分
子と組み合わせて投与することができる。こうした更なる分子は、他のＴＬＲ３アンタゴ
ニスト分子か、又はＴＬＲ３受容体のシグナル伝達によって媒介されない治療効果を有す
る分子であってもよい。抗生剤、抗ウイルス剤、緩和剤、及びサイトカインのレベル又は
活性を低減する他の化合物はこうした更なる分子の例である。

本発明の薬剤の治療上の使用のための投与方法は、薬剤をホストに送達する任意の好適
な経路でよい。これらの薬剤の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、
皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。

本発明の薬剤は、有効量の薬剤を薬学的に許容される担体中の有効成分として含有する
医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、活性化合物と共に投与
する希釈剤、補助剤、賦形剤又は溶媒のことを指す。こうした薬剤用溶媒は、落花生油、
大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物油、植物油又は合成油由来のものを含む、水及
び油などの液体であり得る。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いる
ことができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これら
は、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物には
、生理学的条件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、
潤滑剤及び着色剤などの製薬学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こ
うした製薬学的組成物に含まれる本発明の薬剤濃度は、重量にして約０．５％未満、通常
は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異なってもよく
、選択される特定の投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度な
どに基づいて選択される。

したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２
５ｍｇの本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストを含有するように調製することができる。
同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び
約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含有
するように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法
は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。

本発明の抗体アンタゴニストは凍結乾燥して保存することができ、使用の前に適切な担
体中で還元することができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタン
パク製剤に有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び溶解法を用いることがで
きる。

次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。

（実施例１）
抗ｈｕＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂの同定及び誘導
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｇｏｌｄファージディスプレイライブラリ（Ｍ
ｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をヒト抗体フラグ
メントの供給源として使用し、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを有するヒトＴＬＲ３（ｈｕ
ＴＬＲ３）（配列番号４）のアミノ酸１〜７０３を発現させることによって生成した精製
ＴＬＲ３抗原に対してパニングさせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによ
って精製した。アミノ酸１〜７０３は、予想されるｈｕＴＬＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ
）と一致している。ｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤと特異的に結合するＦａｂフラグメント（Ｆａ
ｂ）を、多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるよ
うに様々な方法でＴＬＲ３タンパク質を提示することによって選択した。異なるパンニン
グの手法により、６２種類の候補物質（Ｖ領域配列が異なる）がｈＴＬＲ３のＥＣＤに結
合する固有の物質として同定された。

ｈｕＴＬＲ３のＥＣＤ結合物質として同定されたこれら６２種類の候補物質を、抗炎症
活性の特定に関するさまざまな細胞アッセイにより中和活性についてスクリーニングした
。予備活性データ（下記実施例２を参照）を用いて、ファミリー１６〜１９を形成する４
種類の候補物質（Ｆａｂ１６〜１９）を、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）及び軽鎖ＣＤＲ３
（ＬＣＤＲ３）のＣＤＲ成熟の親として６２種類の候補物質から選択した。これらの親候
補物質の１つ（候補物質１９）でＨＣＤＲ２にＮ結合型グリコシル化部位が認められたた
め、この候補物質にＳｅｒ→Ａｌａ（Ｓ→Ａ）の突然変異を導入してこの部位を除去した
。４種類の親候補物質のＣＤＲ成熟の後、全部で１５種類の子孫候補物質（候補物質１〜
１５）が同定され、これを下記実施例２で述べるように更なる特性評価に供した。１９種
類の候補物質のそれぞれに存在する軽鎖及び重鎖可変領域のリストを上記表３に示した。
本明細書において、各候補物質は、Ｆａｂであるか完全長の抗体鎖としてクローニングさ
れた（実施例３）ものであるかに応じてｍＡｂ １〜１９又はＦａｂ １〜１９と呼ぶも
のとする。発現ベクターの設計のため、すべての候補物質について可変領域の成熟したア
ミノ末端は重鎖ではＱＶＥであり、軽鎖ではＤＩであった。これらの末端の好ましい配列
は、候補配列と高い相同性を有するそれぞれの生殖細胞遺伝子内の配列である。ファミリ
ー１７及び１８では、生殖細胞系配列はＶＨでＱＶＱ、ＶＬでＳＹである。ファミリー１
９ではこの配列はＶＨでＥＶＱ、ＶＬでＤＩである。ＳＹ配列はλサブグループ３に固有
であり、アミノ末端残基としてのＳ又はＹは種間で異なることが報告されている。したが
って、有名なλサブグループ１からのＱＳＶコンセンサス末端は、ファミリー１７及び１
８のＶＬのＤＩＥのより好適な置換になるものと考えられる。これらの改変を、ファミリ
ー１８から候補物質９、１０及び１２に、ファミリー１９から候補物質１４及び１５に導
入した。このプロセスでは、これらの抗体のＶＨ及びＶＬ領域のコドンを最適化した。候
補物質９、１０及び１１の軽鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番
号２０９〜２１１に示し、候補物質９、１０、１２、１４及び１５の重鎖可変領域のＮ末
端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２１２〜２１６にそれぞれ示す。これらの候
補物質のＮ末端変異体を本明細書では、候補物質／ｍＡｂ／Ｆａｂ ９ＱＶＱ／ＱＳＶ、
１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱと呼ぶ。これらの
Ｎ末端生殖細胞変異体をｍＡｂとして発現させたところ、それぞれの親候補物質と比較し
た場合にＴＬＲ３への結合についても、ＴＬＲ３の生物活性を阻害する能力においても何
らの影響を示さなかった（データは示されていない）。

（実施例２）
インビトロでのＴＬＲ３アンタゴニスト活性の判定
上記に述べた１５種類のＣＤＲ成熟させた候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選
択し、広範な結合及び中和活性を調べた。４種類の親ＦａｂであるＦａｂ１６〜１９及び
１５種類のＣＤＲ成熟であるＦａｂ１〜１５又はこれらの非生殖細胞Ｖ領域変異体につい
て、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。

ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥシグナル伝達カスケードの阻害
熱で不活化したＦＢＳを補充したＤＭＥＭ及びＧｌｕｔａＭａｘ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で２９３Ｔ細胞を増殖させ、３０ｎｇのｐＮＦ−κ
Ｂ又はＩＳＲＥホタルルシフェラーゼレポータープラスミド、１３．５ｎｇのｐｃＤＮＡ
３．１ベクター、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫ、及び１．５ｎｇのＦＬ ＴＬＲ３をコードし
たｐＣＤＮＡ（配列番号２）をトランスフェクトした。ｐｈＲＬ−ＴＫプラスミドは、Ｈ
ＳＶ−１チミジンキナーゼプロモータ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によっ
て制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有している。ＴＬＲ３抗体を３０〜
６０分インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）を加えた。各プレートを３７℃で６時間又は２４時間インキュベー
トした後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を加え、各プレートをＦＬＵＯｓｔａｒ
プレートリーダで読み取った。ホタルの相対発光量（ＲＬＵ）をウミシイタケのＲＬＵで
割ることによって正規化された値（ルシフェラーゼ比）を求めた。ＴＬＲ３アゴニストポ
リ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍＬ）による刺激の際、ホタルルシフェラーゼの産生を刺激する
ＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥシグナル伝達カスケードは、刺激前に、細胞を抗ＴＬＲ３抗体（
０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬ）とインキュベートすることによって特異的に阻害さ
れた。ＮＦ−κＢアッセイの結果を図１に示し、５４６５をポジティブコントロール（抗
ヒトＴＬＲ３Ｍａｂを中和する）として、また抗ヒト組織因子ｍＡｂ（８５９）をヒトＩ
ｇＧ４アイソタイプコントロールとして、ホタル／ウミシイタケ比の阻害率（％）として
表した。０．４〜１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ濃度で５０％超の阻害率が得られた。ｃ１０６
８及びＴＬＲ３．７は、１０μｇ／ｍＬでＴＬＲ３生物活性の約３８％及び８％を阻害し
た。同様の結果がＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイで得られた（データは示されていな
い）。

ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるサイトカイン放出
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＳＶ−４０で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞株）を、Ｉ
型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトＴＬＲ３抗体の存在下又は非存
在下でインキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。処理の２４時間後に上清を回収
し、カスタム多重ビーズアッセイを用いてサイトカイン及びケモカインレベルについてア
ッセイして、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ−２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及
びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を検出した。結果を、０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬの
ｍＡｂで処理した後の、サイトカイン／ケモカインの個別の阻害率（％）として図２に示
す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールであ
る。

ＮＨＢＥ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌ
ｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）においてもアッセイした。ＮＨＢＥ細胞を増殖させ、コラー
ゲンコーティングした培養皿に移して４８時間インキュベートした後、培地を除去して０
．２ｍＬの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂの存在下又は非存
在下で６０分間インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液
を回収し、−２０℃で保存するか、又は直ちにＩＬ−６のレベルについてアッセイした。
結果を、投与量０．００１〜５０μｇ／ｍＬでのｍＡｂ処理後の、ＩＬ−６分泌の阻害率
（％）として図３にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９は
アイソタイプコントロールである。大部分のｍＡｂは１μｇ／ｍＬ未満でＩＬ−６の産生
の少なくとも５０％を阻害し、５μｇ／ｍＬ未満で阻害率７５％を達成した。

ＰＢＭＣ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）においてもアッセイした。
ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰ
ｌｕｓ溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してＦｉｃｏｌ
ｌの直ぐ上に白色の層を形成しているＰＢＭＣを回収して播種した。この後、ＰＢＭＣを
抗ヒトＴＬＲ３ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした後、２５μｇ／ｍＬの
ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いて
、サイトカインレベルを求めた。５４６５をポジティブコントロールとし、ｈＩｇＧ４を
アイソタイプコントロールとして用い、ｍＡｂの単回用量（０．４μｇ／ｍＬ）によるＩ
ＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の累積阻害率（％）として、結果を図４にグラフ化し
て示す。

ＨＡＳＭ細胞におけるサイトカイン放出
簡潔に言うと、５００ｎｇ／ｍＬのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−
αの相乗的組み合わせを加える前に、ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞を、抗ヒトＴＬＲ
３ ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした。２４時間後、上清を収集し、Ｌ
ｕｍｉｎｅｘ技術を用いてサイトカインのレベルを測定した。結果を、ｍＡｂの３つの用
量（０．４、２及び１０μｇ／ｍＬ）を用いてケモカインＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのレベ
ルとして図５にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、ｈＩｇＧ４は
アイソタイプコントロールである。

ヒト細胞におけるインビトロアッセイからの結果によって、ｈｕＴＬＲ３に結合するこ
とによりサイトカイン及びケモカインの放出を低減させる本発明の抗体の能力が確認され
た。

（実施例３）
完全長の抗体コンストラクト
４種類の親Ｆａｂ（候補物質番号１６〜１９）及び１５種類の子孫Ｆａｂ（候補物質番
号１〜１５）の重鎖をＳ２２９Ｐ Ｆｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド
上にクローニングした。候補物質９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／
ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱを、Ｆ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ及びＳ２２９Ｐ Ｆｃ突
然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。

成熟した完全長の重鎖アミノ酸配列を以下のように配列番号９０〜１０２及び２１８〜
２２０に示す。

発現のため、これらの重鎖はＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号１０
３）のようなＮ末端のリーダー配列を含んでもよい。リーダー配列を有する候補物質１４
ＥＶＱ及び１５ＥＶＱの重鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌク
レオチド配列の例を、配列番号１０４及び１０５にそれぞれ示す。同様に、発現のために
、本発明の抗体の軽鎖の配列は、ＭＧＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号
１０６）のようなＮ末端のリーダー配列を含むことができる。リーダー配列を有するコド
ン最適化された候補物質１５の軽鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードす
るヌクレオチド配列の例を、配列番号１０７及び１０８にそれぞれ示す。

（実施例４）
抗ＴＬＲ３ｍＡｂの結合の特性評価
ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するｍＡｂの結合のＥＣ５０値をＥＬＩＳ
Ａによって求めた。ヒトＴＬＲ３のＥＣＤタンパク質をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、
１００μＬの一定分量を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，
ＭＡ）の各ウェルに分配した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳに０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた洗浄緩衝液中で３回プレート
を洗った。ウェルを、ＰＢＳに２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたブ
ロッキング溶液２００μＬでブロックした。室温で２時間ブロッキングした後、プレート
を３回洗浄し、次いで、

抗ＴＬＲ３ｍＡｂ候補物質１〜１９をブロッキング緩衝液中で段階的に希釈した。この
抗ＴＬＲ３ｍＡｂを室温で２時間インキュベートして３回洗った。この後、ブロッキング
緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅ
ａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加え、室温で１時間インキュベート
した後、洗浄緩衝液中で３回洗った。結合は、ＴＭＢ−Ｓ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）中
で１０〜１５分間インキュベートすることによって検出した。反応を、２５μＬの２ＮＨ
₂ＳＯ₄で停止させ、ＳＰＥＣＴＲＡＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用し、４５０ｎｍで吸光度を読み取
り６５０ｎｍでの値を差し引いた。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプリズム
ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を使用して非線形回帰によって求めた。

ｍＡｂを２．５μｇ／ｍＬ〜０．６ｐｇ／ｍＬまで４倍ずつ希釈した１００μＬの連続
希釈液とインキュベートすることにより、ｈｕＴＬＲ３に対する結合についてＥＣ５０値
を求めた（表４）。抗ヒト組織因子ｍＡｂ８５９及びｈｕＩｇＧ４κをネガティブコント
ロールとして含めた。

ｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対する結合親和性もＢｉａｃｏｒｅ分析によって求めた。デー
タ（示されていない）は、ｍＡｂ１〜１９ではｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対するＫｄが１０
^-8Ｍ未満であることを示した。

（実施例５）
競合的エピトープ結合
抗ＴＬＲ３抗体競合グループ又は「エピトープビン」を決定するためにエピトープ結合
実験を行った。

競合的ＥＬＩＳＡを行うため、実施例１に述べるようにして作製した５μＬ（２０μｇ
／ｍＬ）の精製ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質を、ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の各
ウェルに室温で２時間コーティングした。１５０μＬの５％ ＭＳＤブロッカーＡ緩衝液
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに加えて室温で２時間インキ
ュベートした。プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗った後
、標識した抗ＴＬＲ３ｍＡｂと異なる競合物質との混合液を加えた。標識した抗体（１０
ｎＭ）を、濃度を増加させた（１ｎＭ〜２μＭ）非標識抗ＴＬＲ３抗体とインキュベート
し、次いで２５μＬの量の混合液を、指定されたウェルに加えた。室温で穏やかに振盪し
ながら２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７
．４）で３回洗った。ＭＳＤリードバッファーＴを蒸留水で希釈して（４倍）ウェル１個
当たり１５０μＬの量で分配し、そしてＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で分析し
た。製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の使用説明書に従って、ＭＳ
Ｄ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステルで抗体を標識した。

以下の抗ＴＬＲ３抗体、すなわち、（表３ａに示される）ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｈｕｍ
ａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙより入手したｍ
Ａｂ １〜１９、（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号に記載される）ｃ１０６８
、ｃ１８１１（マウスＴＬＲ３タンパク質で免疫性を与えられたラットから作製されるハ
イブリドーマにより産生されるラット抗マウスＴＬＲ３ｍＡｂ）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１４−９０３９）、及び
（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手したヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜
７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して生成される）ＩＭＧ−３１５Ａを評
価した。ｍＡｂ ９、１０、１２、１４及び１５については、変異体９ＱＶＱ／ＱＳＶ、
１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ、又は１５ＥＶＱをこの実験で使
用した。

競合アッセイに基づき、抗ＴＬＲ３抗体を５つの異なるビンに割り当てた。ビンＡ：ｍ
Ａｂ １、２、１３、１４ＥＶＱ、１５ＥＶＱ、１６、１９、ビンＢ：ｍＡｂ ３、４、
５、６、７、８、９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１１、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、
１７、１８、ビンＣ：抗体Ｉｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ、ビンＤ：抗体ＴＬＲ３．
７、ｃ１０６８、及びビンＥ：抗体ｃ１８１１、である。

（実施例６）
エピトープマッピング
実施例５で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピ
ングのために選択した。エピトープマッピングは、ＴＬＲ３セグメントスワッピング実験
、突然変異誘発、Ｈ／Ｄ交換、及びインシリコタンパク質−タンパク質ドッキングを含む
各種のアプローチを用いて行った（Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍ
ｅ ６，ＧｌｅｎＥ．Ｍｏｒｒｉｓ ｅｄ．，１９９６）。

ＴＬＲ３セグメントスワッピング。ＴＬＲ３ヒト−マウスキメラタンパク質を用いてＴ
ＬＲ３上の全体の抗体結合ドメインの位置を特定した。ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外
ドメインを３つのセグメントに分割した（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿００３
２５６のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列に基づくアミノ酸番号によるａａ １〜２０９、ａａ
２１０〜４３６、ａａ ４３７〜７０８）。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸２１０〜４３６及び
４３７〜７０８を対応するマウスのアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ
．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸２１１〜４３７及び４３８〜７０９）と置き換え
ることによってＭＴ５４２０キメラタンパク質を生成した。ヒトアミノ酸の位置４３７〜
７０８をマウスＴＬＲ３のアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．
ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸４３８〜７０９）で置き換えることによってＭＴ６２５１
キメラを生成した。すべてのコンストラクトを、標準的なクローニング手法を用いてｐＣ
ＥＰ４ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）で生
成させた。各タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内でＶ５−Ｈｉｓ６ Ｃ末端融合タンパク質
として一過性に発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。

ｍＡｂ ｃ１０６８。ｍＡｂ ｃ１０６８は、高親和性のヒトＴＬＲ３ ＥＣＤに結合
したが、マウスＴＬＲ３にはよく結合しなかった。ｃ１０６８は、ＭＴ５４２０及びＭＴ
６２５１の両方に結合する能力をなくし、これは、結合部位が、ＷＴヒトＴＬＲ３タンパ
ク質のアミノ酸４３７〜７０８内に位置することを示していた。

ｍＡｂ１２ＱＶＱ／ＱＳＶ。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは両方のキメラに結合したが
、このことはｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位が配列番号２に示される配列を有す
るヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置していることを示している。

インシリコタンパク質−タンパク質ドッキング。ｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造（下記
参照）及び公開ヒトＴＬＲ３構造（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
Ｒｅｓ．１２：３７５〜３７８，２００６）は、ドッキングするための開始モデルとして
使用のために、ＣＨＡＲＭｍ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔ．Ｃ
ｈｅｍ．４：１８７〜２１７，１９８３）において、エネルギーが最小化された。タンパ
ク質ドッキングは、ＺＤＯＣＫ ２．１（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ５１：３９７〜４０８，２００３）と同様のＺＤＯＣＫｐｒｏ １．０（Ａｃｃｅｌ
ｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により６°の角度グリッドで行った。ヒトＴＬＲ３
の周知のＮ結合グリコシル化部位であるＡｓｎ残基（Ａｓｎ５２、７０、１９６、２５２
、２６５、２７５、２９１、３９８、４１３、５０７、及び６３６）（Ｓｕｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１１４４〜１１１５１，２００６）は、ＺＤ
ＯＣＫアルゴリズムにおけるエネルギー項により、抗体−抗原複合体界面への関与がブロ
ックされた。２０００個の最初のポーズを出力してクラスター化し、ドッキングポーズを
リファインしてＲＤＯＣＫで再スコアリングを行った（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ ５３：６９３〜７０７，２００３）。最初のＺＤＯＣＫスコアが最も高かった２
００個のポーズ及びＲＤＯＣＫの上位２００個のポーズを視覚的に調べた。

Ｆａｂ １５ＥＶＱの結晶化を２０℃で蒸気拡散法によって行った（Ｂｅｎｖｅｎｕｔ
ｉ及びＭａｎｇａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：１６３３〜５１、２０
０７）。最初のスクリーニングは、９６ウェルプレートでＨｙｄｒａロボットを使用して
セットアップした。実験は、０．５μＬのタンパク質溶液を０．５μＬのリザーバ溶液と
混合した液滴で構成した。液滴は９０μＬのリザーバ溶液に対して平衡化した。５０ｍＭ
のＮａＣｌを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．４）中のＦａｂ溶液をＡｍ
ｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−５ｋＤａセルを使用して１４．３ｍｇ／ｍＬにまで濃縮した。ス
クリーニングは、Ｗｉｚａｒｄ Ｉ ＆ ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｌａｎｄ，ＷＡ）及びインハウス結晶化スクリーンによっ
て行った。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶを類似の方法で結晶化させた。

Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ＣＣＤ
検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ
ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏ
ｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して、Ｘ線回折データを収集し、処理した。回折強度を、１
／２°の像当たり１２０秒の露光時間で２７０°（結晶回転）にわたって検出した。Ｘ線
データをプログラムＤ^*ＴＲＥＫ（Ｒｉｇａｋｕ）により処理した。構造は、Ｐｈａｓｅ
ｒ又はＣＮＸプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して分
子置換法によって決定した。すべてのデータをＦａｂ １５ＥＶＱに対して１５〜２．２
Å及びＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して５０〜１．９Åの解像度範囲で使用して、原
子配置及び温度因子をＲＥＦＭＡＣにより精密化した。水分子は、３σのカットオフレベ
ルを使用して、（Ｆ_o−Ｆ_c）の電子密度ピークに加えられた。すべての結晶学的計算は、
ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ
ａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ ４．１９９４．ＣＣＰ４パッケージ：タンパク質
結晶学のためのプログラム。Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０〜７６
３）で行われた。モデル調整は、プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２，２００４）を使用して
行った。

解像されたｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造は、抗体結合部位が重鎖の多数の負に帯電し
た残基（Ｄ５２、Ｄ５５、Ｅ９９、Ｄ１０６及びＤ１０９）によって特徴付けられること
を示すものであった。したがってｍＡｂ １５ＥＱＶとＴＬＲ３との間の認識には、正に
帯電した残基が関与している可能性が高いと考えられた。行ったタンパク質−タンパク質
ドッキングシミュレーションは、複数の正に帯電した残基を含むＴＬＲ３上の２個の大き
なパッチが、抗体に対して優れた相補性を示すことを示唆するものであった。シミュレー
トしたＴＬＲ３−抗ＴＬＲ３抗体複合体の界面内のＴＬＲ３上の残基は、Ｒ６４、Ｋ１８
２、Ｋ４１６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９及びＫ４９３であった。

突然変異誘発実験。単一及び組み合わせの突然変異をＴＬＲ３ ＥＣＤの、上記でｍＡ
ｂ１２及びｍＡｂ １５ＥＶＱのエピトープを含有していることが特定された領域内の表
面残基に導入し、突然変異タンパク質を抗体結合について試験した。

ヒトＴＬＲ３のアミノ酸１〜７０３（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列（配列番
号４、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿００３２５６）を標準的なプロトコルを用いてクロ
ーニングした。表５ａに示されるオリゴヌクレオチドを用い、製造者のプロトコルに従っ
てＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、すべての突然変異体を、部位特異的突然
変異誘発によって作製した。突然変異はＤＮＡの配列決定によって確認した。タンパク質
はＣＭＶプロモーターの制御下で、ＨＥＫ２９３細胞内でＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合タンパ
ク質として発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。

結合アッセイ。ヒトＴＬＲ３に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５Ｅ
ＶＱの結合活性及び生成された変異体をＥＬＩＳＡによって評価した。プロセスを促進す
るため、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶと共にＣ末端Ｈｉｓタグを含有するＴＬＲ３ ＥＣ
Ｄ突然変異体をコトランスフェクトすることで、予想されるｍＡｂ １５ＥＶＱの結合部
位における突然変異体をＨＥＫ細胞内で同時発現させた後、金属アフィニティークロマト
グラフィーにより精製した。回収された試料は、ＴＬＲ３突然変異体とｍＡｂ１２との複
合体であった。このアプローチは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５ＥＶＱ
の結合部位が互いに離れており、したがって一方の部位における点変異が他方の部位のエ
ピトープに影響する可能性が低いことから実行可能であった。これらの複合体をＥＬＩＳ
Ａ結合アッセイで使用した。ＰＢＳに加えた２０μｇ／ｍＬの野生型ＴＬＲ３ ＥＣＤ又
は突然変異タンパク質を各ウェル当たり５μＬずつ、ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）にコー
ティングした。プレートを室温で６０分間インキュベートし、ブロッキングした。

ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ緩衝剤（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で４℃にて一晩。翌日、プレートを洗浄し、ＭＳＤ
Ｓｕｌｆｏ−タグ標識したｍＡｂ １５ＥＶＱを５００ｐＭ〜１ｐＭの濃度で１．５時間
添加した。洗浄後、ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを使用して標識抗体を検出し、ＳＥＣＴＯ
Ｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。ヒトＴＬＲ３及び変異体
に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合活性を評価するため、ｍＡｂ １５ＥＶＱと
同時発現させ、検出抗体を標識ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶとした以外はｍＡｂ １５Ｅ
ＶＱについて述べたのと同様にして結合ＥＬＩＳＡを行った。

ｍＡｂ１２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位は、セグメント交
換実験において決定されたようにヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置
付けられた。以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った。すなわち、Ｄ１１６Ｒ、
Ｎ１９６Ａ、Ｎ１４０Ａ、Ｖ１４４Ａ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１６３Ｅ、及びＱ１
６７Ａ。野生型ＴＬＲ３及びＶ１４４Ａ突然変異体は、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対
して同等の結合性を示した（図６Ａ）。抗体はＴＬＲ３Ｄ１１６Ｒ突然変異体には結合せ
ず、Ｋ１４５Ｅ突然変異体に対しては大幅に低い結合親和性を有した。したがって、ＴＬ
Ｒ３の表面上で近接して配置されている残基Ｄ１１６及びＫ１４５は、ｍＡｂ １２ＱＶ
Ｑ／ＱＳＶに対する中心的なエピトープ部位と同定された（図７Ａ）。

ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ結合エピトープのこれら２つの重要な残基は、ＴＬＲ３の
外部ドメインのＮ末端セグメントの２本差ＲＮＡ結合部位の面の近くに位置が特定されて
いる（Ｐｉｒｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５：７６１〜７６３，２００８）。完全なエピトープは隣接領域に、実施した突
然変異分析によっては明らかにされなかった他の残基を含有すると考えられる。いずれの
特定の理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶがその
ＴＬＲ３エピトープに結合すると、ＴＬＲ３外部ドメインへの２本鎖ＲＮＡの結合に直接
的又は間接的に干渉することにより、受容体の二量化及び下流のシグナル伝達経路の活性
化が妨害されるものと考えられる。

ｍＡｂ １５ＥＶＱ：以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った：Ｒ６４Ｅ、Ｋ
１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ、Ｙ４６５Ａ、Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８８Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｎ５１７Ａ
、Ｄ５３６Ａ、Ｄ５３６Ｋ、Ｑ５３８Ａ、Ｈ５３９Ａ、Ｈ５３９Ｅ、Ｎ５４１Ａ、Ｅ５７
０Ｒ、Ｋ６１９Ａ、Ｋ６１９Ｅ、二重突然変異体Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ、三重突然変異
体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓ、及び三重突然変異体Ｒ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／
Ｋ４９３Ｅ。野生型ＴＬＲ３、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ突然変異体及び三重突
然変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓは、ｍＡｂ １５ＥＶＱに対して同等の結
合性を示した（図６Ｂ及び表５ｂ）。抗体は、ＴＬＲ３突然変異体Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８９
Ｅ、Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ及びＲ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅには結合しなかっ
た（図６Ｂ及び６Ｃ）。残りの変異体は中間的な結合性を示し、Ｒ４８８Ｅが最も高い作
用を示した。これらの突然変異体のすべてがｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに結合した。こ
れらの結果は、残基Ｋ４６７及びＲ４８９がｍＡｂ １５ＥＶＱエピトープの重要な決定
因子であることを示すものである。残基Ｒ４８８もエピトープに寄与した。これらの残基
は、ＴＬＲ３の同じ表面上に近接して配置されていた（図７Ａ）。この結果はまた、いず
れもＫ４６７、Ｒ４８８及びＲ４８９と同じ表面上に位置する残基Ｙ４６５、Ｙ４６８、
Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９がエピト
ープに寄与することを示している。この結果は、ｍＡｂ １５ＥＶＱを用いたＨ／Ｄ交換
実験によって更に支持された。図７Ａは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及び１５ＥＶＱ（
黒）に対する結合エピトープ部位と、Ｃ１０６８ｍＡｂ（灰色）に対する結合エピトープ
部位とがヒトＴＬＲ３の構造上で重なっていることを示している。ｍＡｂ １５ＥＶＱに
対するエピトープは、残基Ｙ４６５、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ｎ５１
７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９の範囲にわたっ
ている。

Ｈ／Ｄ交換実験。Ｈ／Ｄ交換については、抗体の摂動を分析するために使用される手順
は、既述した手順（Ｈａｍｕｒｏ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ １４：１７１〜１８２，２００３、Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ４５：８４８８〜８４９８，２００６）と同様の手順に幾つかの変更を加えたもの
であった。組換えＴＬＲ３ ＥＣＤ（Ｃ末端Ｈｉｓタグを付加してＳｆ９細胞で発現させ
て精製したもの）を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能な水素
原子に重水素を取り込ませた。重水素化ＴＬＲ３ ＥＣＤを、固定されたｍＡｂ １５Ｅ
ＶＱを含有するカラムで捕捉した後、水性緩衝液で洗った。逆交換したＴＬＲ３ ＥＣＤ
タンパク質をカラムから溶出し、重水素含有フラグメントの局在性をプロテアーゼ消化及
び質量分析により調べた。基準コントロールとして、ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料を、抗体カラ
ムで捕捉した後に重水素化水と接触させてから実験試料と同様にして洗浄及び溶出した点
を除いて同様に処理した。抗体と結合する領域は比較的交換から保護される部位であり、
そのため、基準ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料と比較して高い割合の重水素を含有するものと推測
された。タンパク質の約８０％を特定のペプチドにマッピングすることができた。ｍＡｂ
１５ＥＶＱによるＴＬＲ３ ＥＣＤのＨ／Ｄ交換の摂動のマップを図７Ｂに示す。分か
りやすさのために、ＴＬＲ３の、ｍＡｂ １５ＥＶＱに影響される部分の周囲のセグメン
トのみを示す。ＴＬＲ３ ＥＣＤのアミノ末端及びカルボキシル末端に延びるタンパク質
の残りの部分は大きく影響されなかった。

Ｈ／Ｄ交換実験により、配列番号２のペプチドセグメント₄₆₅ＹＮＫＹＬＱＬ₄₇₁、₅₁₄
ＳＮＮＮＩＡＮＩＮＤＤＭＬ₅₂₆、及び₅₂₉ＬＥＫＬ₅₃₂が、ｍＡｂ １５ＥＶＱとの結合
によってＴＬＲ３上の交換が特に変化する領域として同定された。その性質上、Ｈ／Ｄ交
換は線形マッピング法であり、ペプチド内のどの残基が抗体結合によって最も影響される
かを定義することは通常できない。しかしながら、Ｈ／Ｄ交換と突然変異の結果が大きく
重なっていることは、図７Ａに示される表面がｍＡｂ １５ＥＶＱの結合部位であること
の更なる確証を与えるものである。この結合部位は、ｍＡｂ ｃ１０６８について過去に
述べられているもの（国際公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号）と同じ直線状アミノ酸
配列領域内にあったが、まったく重ならない表面（図７Ａ）上に位置付けられることが判
明し、これらの抗体間で交差競合が見られないことと一致する。

ｍＡｂ １５ＥＶＱ結合エピトープは、ＴＬＲ３上のＣ端末セグメントにおいて、２本
鎖ＲＮＡ結合部位に空間的に近位であった（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３：８７９２〜８７９７，２００６、Ｒａｎｊｉ
ｔｈ−Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８２：７６６８〜７６７
８，２００７、Ｌｉｕ ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７９〜３８１，２００
８）。いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １５ＥＶＱ
がそのＴＬＲ３エピトープと結合すると、リガンドである２本鎖ＲＮＡ分子及び／又は二
量体のもう一方との立体障害を生じ、リガンドの結合及びリガンドによって誘導される受
容体の二量化が妨げられるものと考えられる。

（実施例７）
熱安定性が向上した変異体の作製
結晶構造に基づいた機能改変（Structure-based engineering）を行って高い熱安定性
を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物活性を維持して免疫原性を最小に抑える
ことを試みた。

ｍＡｂ １５ＥＶＱを機能改変用に選択した。免疫原性を最小に抑えるため、構造的考
慮に基づいて有益であることが予想される生殖細胞突然変異のみを行った。ｍＡｂ １５
ＥＶＱのＶＬ及びＶＨの配列（それぞれ配列番号４１及び配列番号２１６）を、ＢＬＡＳ
Ｔサーチを使用してヒト生殖細胞遺伝子と並べた。同定された最も近い生殖細胞系配列は
、ＶＨ及びＶＬについて、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＣ０９０９３
及びＸ５９３１８であった。生殖細胞のＶＨ及びＶＬとｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＨ及びＶ
Ｌ配列との間で以下の違いが特定された。すなわち、（ＶＨ）Ｖ３４Ｉ、Ｇ３５Ｓ、Ｆ５
０Ｒ、Ａ６１Ｓ、及びＱ６７Ｈ；（ＶＬ）Ｇ３０Ｓ、Ｌ３１Ｓ、及びＡ３４Ｎ。特定され
た配列の違いをｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造上にマッピングし、パッキング及び界面相
互作用を変化させることが予測される残基を機能改変用に選択した。抗体の結晶構造（実
施例６を参照）に基づいて、構造を不安定化させる可能性のある残基を特定した。（１）
ＶＨのコア内のＶ３４の近くに小さな包囲空洞が特定された。この空洞は、Ｉｌｅ等のわ
ずかに大きい側鎖に対応するのに十分大きかった。（２）ＶＨ ＣＤＲ３のＥ９９は、Ｈ
結合ネットワークなしに、ＶＨ／ＶＬ界面に埋め込まれていた。Ｅ９９の負に帯電したカ
ルボキシレート基は概ね疎水性環境にあり、周囲の残基と主としてファンデルワールス（
ｖｄｗ）接触状態にあった。荷電基を埋め込むことは、通常はエネルギー的に好ましくな
く、したがって不安定化作用をもたらす。（３）ＶＨのＦ５０は、ＶＨ／ＶＬの界面残基
である。その芳香族側鎖は嵩張るため、ペアリングに負の影響を及ぼし得る。Ｆｖの水素
結合及びｖｄｗパッキングネットワークを計算し、Ｐｙｍｏｌにより視覚的に調べた（ｗ
ｗｗ：／／＿ｐｙｍｏｌ＿ｏｒｇ）。ＶＨ及びＶＬドメイン内の埋め込まれた空洞はＣａ
ｖｅｒ（Ｐｅｔｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：３
１６，２００６）によって計算した。分子のグラフィック図はすべてＰｙｍｏｌで作製し
た。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ多重突然変異部位特異的
突然変異誘発キット（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、
又はＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、標準的なクローニング法によって実施例３
で述べたようにして作製したＦａｂフラグメント又はＩｇＧ４完全ヒト抗体をコードした
発現ベクターに突然変異を導入した。反応を、それぞれの製造者の推奨に従って行った。
得られたクローンの配列を、確認のために配列決定し、得られた機能改変された変異体を
、改変された重鎖又は軽鎖に従ってｍＡｂ １５−１〜１５−１０と命名した。各変異鎖
（Ｈ又はＬ）は、野生型ｍＡｂ １５ＥＶＱ Ｌ又はＨ鎖で発現して抗体を生成したが、
ｍＡｂ １５−１０の重鎖は、ｍＡｂ １５−６からであった。ｍＡｂ １５ＥＶＱ及び
その機能改変された変異体のＣＤＲ、軽鎖及び重鎖の可変領域、並びに完全長の重鎖及び
軽鎖の配列番号のリストを表６に示す。表７は、各変異体の作製用のプライマーを示す。

ＴＬＲ３に対するｍＡｂ １５−１〜１５−９の結合性をＥＬＩＳＡ免疫アッセイによ
って評価した。ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤ（１００μＬの２μｇ／ｍＬ ＴＬＲ３ ＥＣＤ）
を黒色のＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に４℃で一晩結合させた
。プレートを洗ってブロッキングし、希釈した抗体をウェル上に各ウェル当たり５０μＬ
で二重に一定分量に分配した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベ
ートした。発光ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ５８２ ９５０ ００１）及びヤギ抗ヒ
トＦｃ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖ
ｅ，ＰＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０３５−０９８）を使用して結合を検出し、プレート
をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎ
ｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で読み取った。

ＤＳＣ実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌのＡｕｔｏ ＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（Ｍ
ｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）で行って、基準細胞と試料細
胞との間の温度差を継続的に測定して出力単位に較正した。試料は、１０℃〜９５℃まで
６０℃／時の加熱速度で加熱した。前走査時間は１５分とし、フィルタリング時間は１０
秒間とした。ＤＳＣ実験で使用した濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬであった。得られたサーモ
グラムの分析はＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウエア（ＭｉｃｒｏＣａｌ，
ＬＬＣ）を用いて行った。

作製した変異体の熱安定性（Ｔｍ）をＤＳＣによって測定した（表８）。ＴＬＲ３に対
する抗体の変異体の結合性は親抗体の結合性と同等であった。

（実施例８）
代理抗ＴＬＲ３抗体の作製
実施例１で作製したヒト化抗体がマウスＴＬＲ３に対して充分な特異性もアンタゴニス
ト活性も有さなかったことから、本明細書においてｍＡｂ ５４２９と命名するキメラア
ンタゴニストであるラット／マウス抗マウスＴＬＲ３抗体を作製して様々なインビボモデ
ルにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代理キメラ
ｍＡｂ ５４２９及びその親ラット抗マウスＴＬＲ３抗体ｃ１８１１はインビトロ及びイ
ンビボでマウスのＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、幾つかのマウスの疾患モデルにおいて
発症機構を改善した。

以下に考察するデータは、有害な炎症の誘発及び持続化におけるＴＬＲ３の役割を示唆
するものであり、例えば高サイトカイン血症、喘息及び気道炎症、炎症性腸疾患及び関節
リウマチ、ウイルス感染、及びＩＩ型糖尿病などの急性及び慢性の炎症状態におけるＴＬ
Ｒ３アンタゴニスト及びＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療的使用の根拠を与えるもので
ある。

代理ｍＡｂ ５４２９の作製
通常の方法を用いて作製した、遺伝子組み換え型マウスＴＬＲ３の外部ドメイン（配列
番号１６２のアミノ酸１〜７０３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４
）により、ＣＤラットに免疫性を与えた。マウスＴＬＲ３に特異的な抗体力価を示す２匹
のラットのリンパ球を、ＦＯ骨髄腫細胞に融合させた。マウスＴＬＲ３に反応性のモノク
ローナル抗体のパネルを識別し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胎仔線維芽
細胞アッセイにおいてインビトロアンタゴニスト活性に関して試験した。ハイブリドーマ
株Ｃ１８１１Ａを更なる研究のために選択した。機能する可変領域遺伝子をハイブリドー
マによって分泌されるｍＡｂ ｃ１８１１から配列決定した。次いで、クローニングされ
た重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入し、ｍＡｂ ５
４２９と表示されるキメララット／ＢａｌｂＣｍｕＩｇＧ１／κｍＡｂを通常の方法によ
って作製するためのコード配列を得た。抗体を実施例３で述べたようにして発現させた。
ｍＡｂ ５４２９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１６４及び配列番号
１６３にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６６及び配列番号１６
５にそれぞれ示す。ｍＡｂ ｃ１８１１の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６８
及び配列番号１６７にそれぞれ示す。

ｍＡｂ ５４２９の特性評価
ｍＡｂ ５４２９を、ＴＬＲ３シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビト
ロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。

マウスルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
マウスＴＬＲ３のｃＤＮＡ（配列番号１６１、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ：ＮＭ＿
１２６１６６）をマウス脾臓ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ
，ＭＡ）からＰＣＲによって増幅し、標準的な方法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。２００
μＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全ＤＭＥＭ中、４×１０⁴細胞／ウェルの濃度で９６ウ
ェル白色透明底プレートに播種し、３０ｎｇのｐＮＦ−κＢホタルルシフェラーゼ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）又は３０ｎｇのｐＩＳＲＥホタルルシフェ
ラーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、５ｎｇのｐｈＲＬ−
ＴＫコントロールウミシイタケルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）レポータープラスミド、１．５ｎｇの完全長マウスＴＬＲ３をコードする
ｐＣＥＰ４、及び１３．５ｎｇの空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用し
てトランスフェクションを行い、全ＤＮＡ量を５０ｎｇ／ウェルとした。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を３７℃で３０分〜１時間、抗マウスＴＬＲ３抗体と新鮮な無
血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした後、０．１又は１μｇ／μＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を加
えた。２４時間後にＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Luciferase Ass
ay System）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してプレートを収穫した
。相対的な光量単位を、ＦＬＵＯｓｔａｒＯＰＴＩＭＡ多重検出リーダーを使用し、ＯＰ
ＴＩＭＡＬソフトウエア（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により
測定した。標準化された値（ルシフェラーゼ比）はホタルの相対光量単位（ＲＬＵ）をウ
ミシイタケのＲＬＵで割ることによって得た。ｍＡｂ ５４２９、並びにその親ｍＡｂ
ｃ１８１１及びｍＡｂ １５（表３ａ）は、用量依存的にポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＮＦ−κＢ
及びＩＳＲＥ活性化を低下させ（図８Ａ及び８Ｂ）、ＴＬＲ３の活性を中和するこれらの
抗体の能力が実証された。ＩＳＲＥアッセイにおいて測定されたＩＣ５０は、ｍＡｂ ５
２４９、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１についてそれぞれ０．５、２２、及び０．
７μｇ／ｍＬであった。

マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６ＭＥＦ細胞をＡｒｔｉｓ Ｏｐｔｉｍｕｓより入手した（Ｏｐｔｉ−Ｍ
ＥＦ（商標）Ｃ５７ＢＬ／６−０００１）。細胞を、２００μＬのＭＥＦ培地（ｇｌｕｔ
ａｍａｘ、１０％熱失活ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、及び１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを加
えたＤＭＥＭ）中、９６ウェル平底プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に２０，０００細胞
／ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、３７℃／５％ ＣＯ₂で行った。播
種の２４時間後に、ｍＡｂ ５４２９又はｍＡｂ ｃ１８１１を各ウェルに加えた。プレ
ートをｍＡｂと１時間インキュベートした後、各ウェルにポリ（Ｉ：Ｃ）を１μｇ／ｍＬ
で加えた。２４時間のインキュベーションの後、上清を回収した。ビーズキット（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用い、サイトカインレベルを
定量して、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を製造者のプロトコルに従って検出した。結果をＧ
ｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリ
（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルを用量依存的に低下させ、
これらの抗体が内因性のＴＬＲ３を中和してＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する能力が実証
された（図９）。

フローサイトメトリー−表面染色
各群１０匹ずつのＣ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３ＫＯ）（
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、雌、８〜１２週齢、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ
．）に１ｍＬの３％チオグリコレート培地（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内投与し、９６時間後に
マウスを安楽死させ、各マウスからの腹膜を１０ｍＬの滅菌ＰＢＳで洗浄した。チオグリ
コレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁し、細胞の生存率を
ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、２５０μＬ
のＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｃａ²⁺−Ｍｇ²⁺、１％熱失活ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナト
リウム）に再懸濁し、濡れた氷上に保持した。ＣＤ１６／３２試薬（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ）を１０μｇ／１０⁶細胞で１０分間使用してマクロファージ上のＦｃ受容体をブロ
ッキングした。細胞を１００μＬ／ウェル中、１０⁶細胞で分配して表面染色を行った。
Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）−接合ｍＡｂ
ｃ１８１１及びｍＡｂ １６７９（ＴＬＲ３特異性を有さないことからアイソタイプコン
トロールとして用いられるラット抗マウスＴＬＲ３抗体）を０．２５μｇ／１０⁶細胞で
加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、２５０μＬのＦＡＣＳ
緩衝液に再懸濁した。生存率染色として７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を５μＬ／ウェルで３０分を超えないように加えた後、ＦＡＣＳ
Ｃａｌｉｂｕｒで試料を取得して死細胞集団を検出した。試料はＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ
Ｐｒｏソフトウエアを使用してＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによって採取した。ＦＣＳ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓを使用して収集したデータのヒストグラムを作成することによって分析した
。

Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウスからのマウスチオグリコレート誘発腹
腔マクロファージへのｍＡｂ ｃ１８１１の結合がフローサイトメトリーにより評価され
て、結合特異性が判定された。このキメラ抗体のマウスＦｃ領域は非特異性結合に寄与す
ることが予想されたため、ｍＡｂ ５４２９は、このアッセイには使用されなかった。ｍ
Ａｂ ｃ１８１１は、ＴＬＲ３ＫＯマクロファージへの結合を示さず、Ｃ５７ＢＬ／６腹
腔マクロファージの細胞表面への結合が増大したが、これは、ＴＬＲ３に対するｍＡｂの
特異性を示唆する（表１０）。ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合領域を有するｍＡｂ ５４
２９は、ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合特異性を有することが推測される。

（実施例９）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはＴＬＲ３媒介性全身性炎症から防御する。
モデル
ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導された全身性サイトカイン／ケモカインモデルをＴＬＲ３媒
介性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、腹腔内投与したポリ（Ｉ：Ｃ）
（ＰＩＣ）により、ＴＬＲ３によって一部媒介される全身性のサイトカイン及びケモカイ
ン応答を誘導した。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７
ＢＬ／６バックグラウンド、８〜１０週齢、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）に、ｍ
Ａｂ ５４２９を０．５ｍＬのＰＢＳ中、１０、２０又は５０ｍｇ／ｋｇで、ｍＡｂ ｃ
１８１１を、０．５ｍＬのＰＢＳ中、２、１０又は２０ｍｇ／ｋｇで、又は０．５ｍＬの
ＰＢＳを単独（溶媒コントロール）で皮下に投与した。抗体投与の２４時間後、マウスに
、０．１ｍＬのＰＢＳ内の５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号２
６−４７３２ロット番号ＩＨ０１５６）を腹腔内投与した。ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの
１及び４時間後に後眼窩より血液を採取した。全血より血清を調製してＬｕｍｉｎｅｘに
よりサイトカイン及びケモカインの濃度について分析した。

結果
腹腔内投与されたポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３ノックアウト動物においてケモカイン及
びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、ＴＬＲ３によ
って一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した（表９Ａ）。Ｔ
ＬＲ３依存性のポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたメディエーターは、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポス
トチャレンジ１時間では、ＩＬ−６、ＫＣ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１及びＴＮＦ−αであり
、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポストチャレンジ４時間では、ＩＬ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及
びＴＮＦ−αであった。ｍＡｂ ｃ１８１及びｍＡｂ ５４２９は両方とも、これらのＴ
ＬＲ３依存性メディエーターのレベルを大幅に低下させ、これらの抗体がインビボでＴＬ
Ｒ３シグナル伝達を低減させる能力が実証された（表９Ｂ）。表９の値は、６つの動物／
群の平均サイトカイン又はケモカイン濃度（±標準誤差）をｐｇ／ｍＬで示している。こ
れらのデータは、ＴＬＲ３の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなど
の状態における過剰なＴＬＲ３介在サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえ
で有用となり得ることを示唆するものである。

（実施例１０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する。
モデル
気道過敏症をポリ（Ｉ：Ｃ）によって誘発させた。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ
／６バックグラウンド、１２週齢、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）をイソフルラン
で麻酔し、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）を数回投与量（１０〜１００μｇ）
で鼻腔内投与した。各投与の間に２４時間の休止時間を置いてポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢ
Ｓ）を３回マウスに投与した。最後のポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）の投与の２４時間後
に、全身プレチスモグラフィー（ＢＵＸＣＯシステム）を用いて肺機能及びメタコリンに
対する気道過敏症を測定した。マウスを全身プレチスモグラフチャンバに入れ、少なくと
も５分間順応させた。ベースラインの読み取りの後、増加する量の霧状化したメタコリン
（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にマウスを暴露した。霧状化メタコリンを２分
間投与した後、５分間のデータ収集時間、その後、１０分間の休止時間を置いた後、メタ
コリンの用量を増大させた後続のチャレンジを行った。空気流の抵抗の増加をエンハンス
トポーズ（Ｐｅｎｈ）として測定し、５分間の記録時間にわたった平均のＰｅｎｈ値とし
て表した（ＢＵＸＣＯシステム）。肺機能の測定の後、マウスを安楽死させ、肺にカニュ
ーレを挿管した。肺に１ｍＬのＰＢＳを注入し、流出液を回収することによって気管支肺
胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。肺組織を切除して凍結した。ＢＡＬ液を遠心（１２００ｒｐ
ｍ、１０分）し、細胞を含まない上澄み液を回収して、解析を行うまでの間−８０℃で保
存した。細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳに再懸濁して全細胞計数及び分画別の細胞計
数を行った。製造者のプロトコル及びＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキッ
ト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ）に従って多重アッセイを行った。

結果
過去の観察により、ポリ（Ｉ：Ｃ）の鼻腔内投与はマウスの肺機能にＴＬＲ３によって
媒介される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィ（Ｂｕｘｃｏ）におけるベースライン
のエンハンストポーズ（ＰｅｎＨ）測定値が高くなり、霧状化されたメタコリン（気道過
敏症の指標）に対する応答性が高くなることが示されている（国際公開第０６／０６０５
１３（Ａ２）号）。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症
性サイトカイン／ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけ
るポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導された障害におけるｍＡｂ １８１１及びｍＡｂ ５４２９
の作用を、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立ってそれぞれの抗体を５０ｍｇ／ｋｇで皮下
投与することによって評価した。

ＴＬＲ３によって媒介される肺機能の障害は、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立って動
物をＴＬＲ３抗体アンタゴニストで処置することによって大幅に軽減された。抗ＴＬＲ３
抗体で処置された動物では、ＴＬＲ３によって媒介される、ベースラインＰｅｎＨ及びメ
タコリンに対する気道の感受性の増大が防されした（図１１）。更に、抗ＴＬＲ３抗体で
処置した動物では、ＴＬＲ３によって媒介される、マウスの肺への好中球の動員及び気道
におけるケモカインの生成が低減した。好中球の数（図１２）及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−
１０のレベル（図１３）は、回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から測定した。この
実験を少なくとも３回繰り返して同様の結果を得た。図１１、１２、及び１３に示される
データは、１つの代表的な実験からのものである。各記号は１匹のマウスからのデータポ
イントを表し、横棒線は群の平均を示す。この実験によって、使用したモデルにおいて全
身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストが肺に達し、ＴＬＲ３によって媒介される肺機
能の障害、気道内への好中球の浸潤、ケモカインの生成及び気道の炎症を軽減したことが
示された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞
性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び嚢胞性線維症などの、気道過敏症によって特徴付けられる呼
吸器疾患の治療又は予防に有用であり得る。

（実施例１１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患から防御する。
モデル
ＤＳＳ大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢未満）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６バックグラウンド、８週齢未満で体重１６．５ｇ〜１８ｇ、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌ
ｓ，Ｉｎｃ）にγ線照射した餌を１日目から与えた。ＤＳＳ（硫酸デキストラン）（ＭＰ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ，カタログ番号：１６０１１０、３５〜
５０ｋＤａ、１８〜２０％硫黄，ロット番号８２４７Ｊ）を、オートクレーブにかけた酸
性化した飲料水中で５％の最終濃度まで希釈した。ＤＳＳ水を５日間投与し、その後ＤＳ
Ｓ水をただの水に置き換えた。マウスには実験全体を通じて自由に水を飲ませた。すべて
の水ボトルの重量を毎日測定して水の消費量を記録した。０、２、及び４日目にマウスに
５ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ ＰＢＳに０．１ｍｇを加えた）のｍＡｂ ５４２９、マウス
抗ＴＮＦ−α抗体、又はコントロールとしてのＰＢＳを腹腔内投与した。マウスを実験の
全体を通じて毎日監視し、０〜４日目及び７日目に体重を測定した。マウスを実験の２日
目及び７日目に安楽死させた。腹腔を開き、上行結腸を盲腸と接合する位置で切断した。
結腸を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。結腸をパラフィンに埋め込み、
薄片にスライスし、Ｈ ＆ Ｅ染色（Ｑｕａｌｔｅｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌａｂｓ，
Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）した。下記に述べるように獣医病理学者によって盲
検により結腸の組織病理学的評価を行った（ＰａｔｈｏＭｅｔｒｉｘ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ
，ＣＡ）。

組織病理学的評価
大腸、結腸、及び直腸の２つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すな
わち、（ｉ）単一の細胞の壊死、（ｉｉ）上皮の潰瘍形成、（ｉｉｉ）上皮の脱落、（ｉ
ｖ）陰窩腫瘍、（ｖ）細胞増殖、（ｖｉ）陰窩細胞増殖、（ｖｉｉ）粘膜固有層における
肉芽組織形成、（ｖｉｉｉ）粘膜下組織における肉芽組織、（ｉｘ）粘膜下炎症細胞の浸
潤物、好中球優勢、及び（ｘ）粘膜下浮腫。

重篤度の単一の全体的スコアを以下の基準に基づいて与えた。すなわち、
０−所見を認めず。
１−軽度、限局性、又は時折認められる。
２−軽度、多病巣である。
３−中度、頻繁だが限定された領域に認められる。
４−重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に頻繁に認められる。
５−極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。

結果
過去の観察によれば、ＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳの摂取によって誘発された
炎症性腸疾患のモデルにおいて野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所
見を示すことが実証されており（国際公開第０６／６０５１３（Ａ２）号）、このことは
ＴＬＲ３シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を有することを示唆するも
のである。壊死細胞から放出された共生細菌ＲＮＡまたは哺乳類ＲＮＡがＴＬＲ３シグナ
ル伝達を刺激する内因性リガンドとして作用し得ることが報告されており（Ｋａｒｉｋｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３１６５〜２３１１７５ ２００５、Ｋａｒｉｋ
ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２５４２〜１２５５０ ２００
４）、したがって、腸内での内因性リガンドによるＴＬＲ３刺激は、ＤＳＳ大腸炎モデル
において、炎症を強め持続化させるものである。

化合物組織病理学スコア（図１４）によって評価されるように、ＤＳＳに曝露した動物
における疾患重篤度は、抗ＴＬＲ３抗体による処置によって改善された。図１４は、疾患
重篤度スコアについて平均、標準偏差及び９５％信頼区間を横棒線として示している。抗
ＴＬＲ３抗体で処置した野生型のＤＳＳ曝露動物では、非処置の野生型動物と比較してス
コアの有意な低下が認められた（ｐ＜０．０５）。ＤＳＳに曝露したＴＬＲ３ノックアウ
ト動物は、ＤＳＳによって誘発される変化から防御された。抗マウスＴＮＦ−αｍＡｂを
投与したＤＳＳ曝露動物では、ＤＳＳモデルにおいて組織病理学的所見の改善は認められ
なかった。したがって、ＤＳＳモデルは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しないヒト患者
集団を対象とする治療法の評価において有用であり得、抗ＴＬＲ３抗体を中和することは
、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しない炎症性腸疾患の患者にとって利益となる可能性を
有すると考えられる。

モデル
Ｔ細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能
のあるマウスから得た制御性Ｔ細胞を含まないナイーブＴ細胞（腸粘膜の抗原提示細胞を
攻撃する）の集団を移植することによって、ＳＣＩＤマウスに腸の炎症を誘発した。

ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ^high Ｔ細胞）をＳＣＩＤレシピエントに腹腔
内注射することによって慢性大腸炎を誘発した。マウスに、ＰＢＳ（５００μＬ／マウス
、腹腔内投与、溶媒コントロール）、ｍＡｂ ５４２９（０．１ｍｇ／マウス、腹腔内投
与）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（０．０５ｍｇ／マウス、腹腔内投与、ポジティブコントロ
ール）のいずれかを、Ｔ細胞の移植４８時間後から開始して毎週２回、８週間の実験期間
全体を通じて投与した。Ｔ細胞の移植から８週間後（又はマウスが初期の体重の１５％超
を失った時点）に、動物を安楽死させて結腸を取り出した。結腸を固定し、パラフィンに
埋め込んでＨ ＆ Ｅ染色した。組織病理学的所見（細胞浸潤、陰窩腫瘍、上皮びらん、
杯細胞喪失、及び腸壁の肥厚）を盲検的に定量的に評価した。

結果
コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下（ｐ＜０．
０５）（図１５Ａ）によって評価されるように、疾患重篤度は、Ｔ細胞移植を受けた動物
において抗ＴＬＲ３抗体による処置に応じて改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、
潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発（tran
smural involvement）を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下
が認められた（いずれもｐ＜０．０５）（図１５Ｂ）。抗ＴＮＦα抗体を、最適な利益を
もたらすことが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。

ＤＳＳ及びＴ細胞移植モデルという２つの広く知られた炎症性腸疾患のモデルを用いた
実験により、全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストは腸粘膜に達し、２つの異なる
病因機構によって誘発された消化管の炎症を軽減させることが実証された。したがって、
ＴＬＲ３アンタゴニストは、抗ＴＮＦα不応性の症例及び消化管の他の免疫介在性の病態
を含む炎症性腸疾患の治療に有益であると考えられる。

（実施例１２）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはコラーゲン誘発関節炎から防御する。
モデル
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルを関節リウマチのモデルとして用いた。

雄Ｂ１０ＲＩＩＩマウス（６〜８週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を１群当たり１５
匹（関節炎群）及び１群当たり４匹（コントロール群）の群に分けた。関節炎群をイソフ
ルランで麻酔し、ＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、及び結核菌
（M. tuberculosis）（Ｄｉｆｃｏ）を添加したＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを０及
び１５日目に投与した。１２日目にＩＩ型コラーゲン関節炎を発症したマウスを体重によ
り治療群にランダム化し、ｍＡｂ ５４２９（２５ｍｇ／ｋｇ）、ネガティブコントロー
ル抗体としてＣＶＡＭ（マウスに周知の特異性を示さない組換えｍＡｂ）（５ｍｇ／ｋｇ
）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ポジティブコントロール）を、１２、１７、
及び２２日目（ｄ１２、ｄ１７、２ｄ２）に皮下投与（ＳＣ）した。更に、マウスのコン
トロール群に溶媒（ＰＢＳ）又はデキサメタゾン（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｄｅｘ、基準化合
物）を１２〜２５日目まで毎日（ＱＤ）皮下投与（ＳＣ）した。動物を１２〜２６日まで
毎日観察した。前足及び後足を臨床スコアシステム（下記に示す）によって評価した。実
験２６日目に動物を安楽死させ、組織病理学的所見を盲検的に評価した（下記にスコアシ
ステムを述べる）。有効性評価は、動物の体重及び臨床的関節炎スコアに基づいて行った
。すべての動物が実験終了時まで生存した。

前足及び後足の臨床的スコア基準
０−正常
１−後足又は前足関節が冒されるか、わずかなびまん性紅斑及び腫脹。
２−後足又は前足関節が冒されるか、軽度のびまん性紅斑及び腫脹。
３−後足又は前足関節が冒されるか、中度のびまん性紅斑及び腫脹。
４−顕著なびまん性紅斑及び腫脹又は４本の指の関節が冒される。
５−足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹、指を曲げられない。

ＩＩ型コラーゲン関節炎を有するマウス関節の組織病理学的スコアリング方法
ＩＩ型コラーゲン関節炎の病変を有するマウスの足又は足関節をスコア化する場合、変
化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨／中足骨／指又は足根骨／脛
足根骨の多数の関節の可能性のうち、１〜３個のみの足又は足関節の関節が冒されている
場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの１、２又は３の最大スコアが任意に
与えられる。２個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された／大多数の
関節に下記の基準を適用する。

足スコアの臨床データは、１〜１５日目についてＡＵＣを使用して分析し、コントロー
ルからの阻害率（％）を計算した。

炎症
０−正常
１−冒された関節の滑膜及び関節周囲組織への炎症細胞の最小の浸潤。
２−足の場合には冒された関節に限定された軽度の浸潤。
３−足の場合には冒された関節に限定された中度の浮腫をともなう中度の浸潤。
４−大部分の領域を侵す、顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤。
５−重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤。

パンヌス
０−正常
１−軟骨及び肋軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤。
２−冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう中度の浸潤。
３−冒された関節の中度の硬組織破壊をともなう中度の浸潤。
４−大部分の関節で顕著な関節構造の破壊をともなう顕著な浸潤。
５−全体的又はほぼ全体的な関節構造の破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒
す。

軟骨の傷害
０−正常
１−冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認めない、トルイジン
ブルー染色の最小〜軽度の損失。
２−トルイジンブルー染色が軽度に損傷を受けている。冒された関節に限局性の軽度（
表在性）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
３−冒された関節に多病巣性の中度（深部又は中間層）の軟骨細胞の損失及び／又はコ
ラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の中度の損失。
４−大部分の関節に多病巣性の顕著な（深部〜深層）軟骨細胞の損失及び／又はコラー
ゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の顕著な喪失。
５−すべての関節に多病巣性の重度（深部〜タイドマーク）の軟骨細胞の損失及び／又
はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の重度の喪失。

骨吸収
０−正常
１−小さい範囲の吸収が認める最小の程度。低倍率では容易に確認できず、冒された関
節に破骨細胞をほとんど認めない。
２−より多くの範囲の吸収を認める軽度。低倍率では容易に確認できず、冒された関節
により多くの破骨細胞を認める。
３−皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁（medullary trabecular）及び皮質
骨の明らかな吸収を認める中度。一部の髄様骨梁が損傷し、病変が低倍率で明瞭に確認で
きる。冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
４−残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損を認
める顕著な程度。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞が認められる。大部分の関節が冒
されている。
５−皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊を認める重度。

結果
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び抗マウスＴＮＦ−α抗体をポジティブコントロールとし
て用い、ＰＢＳを溶媒コントロールとして用い、ＣＶＡＭをネガティブコントロール抗体
として用いた。すべての処置は、実験の１２日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶
媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験２２日目までに１００％となっ
た。溶媒又はＣＶＡＭ抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高
かった。Ｄｅｘ（ｄ１８〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α
抗体（ｄ１８〜２６についてｐ＜０．０５）、又は２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（
ｄ１８〜ｄ２３及びｄ２５〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）で処置した各群では有意に低
い臨床スコアが認められた（図１６）。曲線下面積（ＡＵＣ）として表した臨床的関節炎
スコアは、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（低下率４３％）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮ
Ｆ−α抗体（５２％）、又はＤｅｘ（６９％）による処置により、溶媒コントロールと比
較して有意に低下した。図１７は、各群についてＡＵＣの平均及び標準偏差を示す。

各処置の組織病理学的作用についても評価を行った。足の骨吸収は、２５ｍｇ／ｋｇの
ｍＡｂ ５４２９（低下率４７％）による処置によって溶媒コントロールと比較して有意
に低下した。５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体で処置したポジティブコントロールマウス
では、足の炎症（３３％）、軟骨傷害（３８％）、及び合計した足スコア（３７％）は有
意に低下した。Ｄｅｘによる処置によって、足の組織病理学的パラメータのすべてが有意
に低下した（合計スコアにおいて７３％の低下率）。

これらのデータは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが、ＣＩＡモデルにおいて臨床的及び
組織病理学的疾患症状を改善することを示すものであり、関節リウマチの治療におけるＴ
ＬＲ３アンタゴニストの使用を示唆するものである。

（実施例１４）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染から防御する。
モデル
インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして
使用した。

１、４、８及び１２日目に雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノック
アウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、１２週齢、ＡＣＥ Ａｎｉｍａｌｓ，
Ｉｎｃ．、１群当たり１５匹のマウス）に２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９、又はＰＢ
Ｓ単独を皮下投与した。０日目にイソフルランでマウスを麻酔し、インフルエンザＡ／Ｐ
Ｒ／８／３４ウイルス（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＤ，ロット番号２１８１７１）
を２５μＬのＰＢＳに加えたもの（１０^5.55 ＣＥＩＤ５０に相当）を鼻腔内投与した。
動物を体重変化及び生存率について１日２回、１４日間の期間にわたって観察した。臨床
的スコアリングシステムを用いて疾患の進行のレベル及びインフルエンザＡウイルス治療
に対するわずかな改善を評価した。

臨床スコア
０−正常。機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候が認められない。
１−毛皮が逆立っている。歩行のわずかな低下が認められるか、又は認められない。
２−毛皮が逆立っている。歩行時に背中が曲がっている。歩行をいやがる。呼吸困難で
ある。
３−毛皮が逆立っている。呼吸困難である。運動失調。震えが生じている。
４−毛皮が逆立っている。そっと突いても歩行不可能。意識不明。触れると冷たく感じ
る。
５−死亡。

結果
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ ５４２
９（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与したインフルエンザＡ感染野生型マウス及びｍＡｂ ５４２
９を投与しないインフルエンザＡ感染ＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフル
エンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大
した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）が、このことは、ＴＬＲ３の阻害又は
欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防し得ることを示すものである（図１８
）。臨床スコアは、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９を投与した群、及びＴＬＲ３ノッ
クアウト群において有意に低下した（図１９）。マウスの体重をインフルエンザウイルス
投与後１４日間にわたって観察した。インフルエンザＡウイルスを投与したＣ５７ＢＬ／
６マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２
９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフ
ルエンザウイルスを接種した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して有意に大きな体重を示
した（図２０）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエ
ンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり
、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するも
のである。

（実施例１５）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血漿インスリンを低下させる。
モデル
食餌誘発肥満（ＤＩＯ）モデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルと
して用いた。

Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物（約３週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）及びＴＬＲ３ノッ
クアウト動物（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、約３週齢、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，
Ｉｎｃ．）を高脂肪の食餌に１２〜１６週間維持した。ＴＬＲ３ノックアウト及び野生型
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両方に、通常の固形飼料又は６０．９％ ｋｃａｌの脂肪及び２
０．８％ ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食餌（Ｐｕｒｉｎａ ＴｅｓｔＤｉｅｔカ
タログ番号５８１２６）のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、１
２時間／１２時間の明暗サイクルに維持した。各群の各マウスの体重を毎週測定した。ｍ
Ａｂ ５４２９を第１週に週２回、その後は週１回全体で７週間腹腔内投与した。空腹時
に後眼窩から採取した血清試料を、示した時点でのインスリンの測定に用いた。７週目に
一晩絶食させた後、１．０ｍｇ／ｇ（体重）のグルコースを腹腔内投与することによって
耐糖試験を行った。更に、空腹時のインスリン及びグルコースレベルを測定した。

以下の式を用いて、空腹時グルコースレベル及びインスリンレベル（１２）に基づきＨ
ＯＭＡ−ＩＲを式から求めた。すなわち、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（（空腹時グルコース（ｍｍ
ｏｌ／Ｌ）×空腹時インスリン（ｍＵ／Ｌ））／２２．５（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ
．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２７：１４８７〜１４９５，２００４）。空腹時血中
グルコース（血糖値）（ＢＧ）をグルコースオキシダーゼアッセイによって求めた。空腹
時インスリンレベルをインスリンラット／マウスＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃ
ｈｅｍ，ｃａｔ．Ｎｏ．９００６０）を使用して求めた。

結果
１２〜１６週間の高脂肪の食餌の後、野生型ＤＩＯ動物は高血糖及び高インスリンとな
った。ｍＡｂ ５４２９による処置により、野生型ＤＩＯ動物では耐糖能が改善したがＴ
ＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの６０
、９０、１２０及び１８０分後に、ｍＡｂ ５４２９で処置した動物においてコントロー
ル（ＰＢＳのみ）と比較して有意に低い血中グルコースレベルが観察された（図２１Ａ）
。ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では、ｍＡｂを投与しない野生型ＤＩＯ
マウスと比較してＡＵＣの約２１％の低下が観察された。ｍＡｂ ５４２９で処置した野
生型ＤＩＯ動物では空腹時インスリンレベルも低下した（図２２）。ＴＬＲ３ノックアウ
トＤＩＯ動物では、ｍＡｂ ５４２９による処置により空腹時インスリンに改善は認めら
れなかった。恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）分析は、ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型
ＤＩＯ動物においてインスリン感受性の改善を示したが、ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動
物では改善を示さなかった。ＨＯＭＡ−ＩＲ価は、野生型ＤＩＯ、５ｍｇ／ｋｇの野生型
ＤＩＯ ｍＡｂ ５４２９、及び２０ｍｇ／ｋｇの野生型ＤＩＯ ｍＡｂ ５４２９動物
に関して、それぞれ１４．０±９．８、８．７±４．９、９．０±３．０であった。ＴＬ
Ｒ３ノックアウトＤＩＯ動物では何らの効果も認められなかった。

この実験により、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストがＤＩＯモデルにおいて体重の損失をと
もなわずにインスリン抵抗性を改善し、空腹時グルコースを低下させることが示されたが
、このことは、ＴＬＲ３アンタゴニストが高血糖症、インスリン抵抗性、及びＩＩ型糖尿
病の治療に有用であり得ることを示唆するものである。

（実施例１６）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応から防御する。
試薬
細菌性増悪のＣＯＰＤ患者から単離された分類不能型ヘモフィラスインフルエンザ（Ｎ
ＴＨｉ）株３５をＤｒ．Ｔ．Ｆ．Ｍｕｒｐｈｙ（Ｂｕｆｆａｌｏ ＶＡ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）より入手した。ヒトライノウイルス１６を、ア
メリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から、ＴＣＩＤ（５０）＝２．８×１０⁷／ｍ
Ｌのものを入手した。

ＮＴＨｉ刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ
９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）
に１×１０⁵／ウェルで播いた。寒天プレート上で１６〜２０時間増殖させたＮＴＨｉを
増殖培地に約２×１０⁸ｃｆｕ／ｍＬで再懸濁し、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで
３０分間処理し、約２×１０⁷／ウェルで、ＮＨＢＥを含有する９６ウェルプレートに加
えた。３時間後に上澄み液を除去し、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍＬの最終濃度）を添
加又は非添加の新鮮な増殖培地に交換した。更に２４時間インキュベートした後、細胞上
澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在を、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＩＳ多重蛍光
分析器及びリーダーシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ
，ＴＸ）内でサイトカイン２５重ＡＢビーズキット、ヒト（ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、
ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１
０、ＩＬ１２ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ
−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、
エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１を含む）によって３重にアッセイした。

ライノウイルス刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に１×１０⁵細胞／ウェルで播いた。翌日、抗体
（０．０８〜５０μｇ／ｍＬの最終濃度）をＮＨＢＥ又はＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に加えて１
時間インキュベートした後、１０μＬ／ウェルのライノウイルスを加えた。更に２４時間
インキュベーションした後、細胞上清中のサイトカイン及びケモカインの存在について上
記に述べたようにｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってアッセイを行った。

結果
ｍＡｂ １５ＥＶＱが、ＮＴＨｉにより誘導されたＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及びＲＡ
ＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体である
ヒトＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）はＮＴＨｉによる刺激に対して阻
害作用を示さなかった（図２３Ａ）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ライノウイルスにより誘導
されたＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生も阻害した（図２３
Ｂ）。

（実施例１７）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する。
方法
２人のドナーから得た正常なヒト星状細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，
ＭＤ）を２４ウェルプレートに７５，０００細胞／ウェルで播き、一晩付着させた。翌日
、星状細胞を２００ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又は１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ １
８で２４時間処理した。サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。

結果
表１０に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１
２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４
、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生はｍＡｂ１８によって阻
害された。

（実施例１８）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する。
方法
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＬｏｎｚａの推奨
する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤ）に再懸濁し、９６ウェルプレートに３×１０⁵細胞／ｍＬで播き、３７
℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を増大する濃度（１．５〜１００μｇ／ｍＬ）
で加え、３７℃で更に２４時間インキュベートした。サイトカイン阻害アッセイに関して
は、ｍＡｂ １５ＥＶＱを様々な濃度（０〜５０μｍＬ）で細胞に加え、３０分間インキ
ュベートし、その後、２０μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を２４時間加えた。細胞上澄み液
を回収し、ヒトサイトカイン３０重キット及びＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＰ技術（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用いてサイトカインレベルを測定
した。ｓＩＣＡＭ−１の発現を測定するため、ＨＵＶＥＣ細胞を２０μｇ／ｍＬのポリ（
Ｉ：Ｃ）及び異なる濃度のｍＡｂ １５ＥＶＱ（０．８〜５０μｇ／ｍＬ）で処理した。
細胞上清をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）によりｓＩＣＡＭ−１の発現について
分析した。細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）により測定した。

結果
ＨＵＶＥＣ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して次のサイトカインを産生した：ＩＬ−１
ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１２
（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ
−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧ
Ｆ−ｂａｓｉｃ、及びＨＧＦ（表１１）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ポリ（Ｉ：Ｃ）により
誘導される全サイトカインのレベルを用量依存的に低下させた（表１２）。ポリ（Ｉ：Ｃ
）により誘導されたＴＮＦ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、及び
ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を低下させるｍＡｂ １５ＥＶＱの能力は、ＴＬＲ３に
より媒介される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながり得る白血球及びＴ細胞
の浸潤に対する防御を与え得ることを示唆するものである。更に、ｍＡｂ １５ＥＶＱに
よるＶＥＧＦの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含
む、ＶＥＧＦによって媒介される病態におけるＴＬＲ３の遮断の潜在的な効果を示唆する
ものである。

ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γは白血球の動員において機能し、かつ活性化された内皮上の
接着分子の発現を増大させる（Ｄｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．
１４５：１３７〜４７，１９９４、Ｐｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
．１３３：４２６〜３３、１９８８）。ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ
及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、単球及びＴ細胞の動員に関与していることが示されて
おり、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与する（Ｌｕｎｄｇｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９）。内皮細胞によるＶＥＧＦの生成は、各種の癌にお
いて脈管形成時の異常な組織増殖又は腫瘍との関連が示されている（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２，２００７）。

可溶性細胞間接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）はタンパク質切断によって生成し、内皮細
胞活性化のマーカーである。ＩＣＡＭ−１は白血球の遊走及び活性化において重要な役割
を有し、炎症時に内皮細胞及び上皮細胞において発現が上昇して、インテグリン分子ＬＦ
Ａ−１及びＭａｃ−１を介した白血球への接着を媒介する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、
内皮細胞を活性化してｓＩＣＡＭ−１の発現を上昇させたが、この発現上昇はｍＡｂ
１５ＥＶＱによる処理によって低減した（図２４Ａ）。

このことは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが白血球のトラフィッキング、したがって炎
症細胞の流入によって引き起こされる組織障害を阻害し得ることを示すものである。

生存率アッセイを行うため、上記で述べたようにＨＵＶＥＣを培養、播種し、ポリ（Ｉ
：Ｃ）で刺激した。ｍＡｂ １５ＥＶＱはポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＨＵＶＥＣ細
胞の生存率の低下を用量依存的に回復させた（図２４Ｂ）。

内皮細胞の活性化の下方調節は、過剰な免疫細胞の浸潤を抑制し、炎症状態において増
加するサイトカインによって引き起こされる組織障害を低減させ得る。炎症及び内皮細胞
におけるサイトカイン及び接着分子の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び高血圧の
発症の主要な寄与因子である。これらのデータは、脈管炎及び内皮機能不全をともなう血
管疾患などの血管の疾患におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用の潜在的な有用性を探求
することの根拠を与えるものである。炎症及び過剰発現したサイトカインによって引き起
こされる別の疾患として、免疫抑制患者及びＨＩＶ感染患者において一般的に見られ、カ
ポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によって引き起こされるカポジ肉腫（ＫＳ）があ
る。ＶＥＧＦ及びサイトカインの産生はＫＳ細胞の生存に寄与する（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２，２００７）。ＴＬＲ
３アンタゴニストは、ＫＳ及び他の腫瘍にともなう血管新生のリスクを低減するうえで有
用であるばかりでなく、細胞生存率の低下を防止し、内皮バリアの完全性を保護すること
によって、臓器不全及び敗血症などの重篤な炎症状態にともなう潜在的に重大な状態であ
る血管漏出を防止するうえでも有用であり得る。ＴＬＲ３拮抗作用はまた、フラビウイル
ス科（例えば、デング、黄熱病）、フィロウイルス科（エボラ、マールブルグ）、ブニヤ
ウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス）、及びアレナ
ウイルス科（例えば、ルヨ、ラッサ、アルゼンチン、ボリビア、ベネズエラ出血熱）によ
って引き起こされるウイルス性出血熱などの内皮細胞の病理に関与するウイルス感染症に
おいて有益であり得る（Ｓｉｈｉｂａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１３：７
１４〜７２２，２００９）。

（実施例２０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスＴＬＲ３との交叉反応性
実施例２で述べたようにＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又
はマウスＴＬＲ３に対する活性を評価した。上述のように、カニクイザル（配列番号２１
７）及びマウスのＴＬＲ３ ｃＤＮＡ（配列番号１６１）を全血から増幅し、ｐＣＥＰ４
ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、発現させた。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、
ヒトＴＬＲ３ ＮＦ−ｋＢアッセイ及びＩＳＲＥアッセイにおけるそれぞれ０．４４μｇ
／ｍＬ及び０．６５μｇ／ｍＬのＩＣ５０と比較して、カニクイザルＮＦ−κＢアッセイ
及びＩＳＲＥアッセイにおいてそれぞれ４．１８μｇ／ｍＬ及び１．７４μｇ／ｍＬのＩ
Ｃ５０を有していた。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何らの作用
も示さなかった。

（実施例２１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与は、急性の致命的なウイルス感染症を防御す
る
実施例１４は、インフルエンザＡ感染症に対するＴＬＲ３抗体アンタゴニストによる予
防的な治療（１、４、８、及び１２日目に投与）について述べている。この実施例は、Ｔ
ＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与（インフルエンザＡ感染後臨床症状の発症３日後
）が生存率の向上において効果的であるということを実証している。

モデル
動物へのｍＡｂ ５２４９の投与をインフルエンザＡの感染後３日後に行ったこと、及
び投与した動物が８週齢であったことを除いて、インフルエンザＡウイルスチャレンジモ
デルを、実施例１４に述べたように急性の致命的なウイルス感染症のモデルとして使用し
た。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂはＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのもの
であった。インフルエンザＡの感染後３、７及び１１日に動物に投与した。

この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ ５２４
９を投与したＣ５７Ｂｌ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウトマウスは、抗マウスＩｇＧ
１アイソタイプコントロールｍＡｂ及びインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／
６マウスと比べて、両方とも統計的に有意な生存率の増加（それぞれｐ＜０．０２８及び
ｐ＜０．００１）を示した（図２５）。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡ
ｂ及びインフルエンザＡを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較した場合、ｍＡｂ ５２
４９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウト動物において臨床的なス
コアは低下し（図２６）、体重は増加した（図２７）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体ア
ンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡
率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にある
ヒトに防御を与えることを示唆するものである。

（実施例２２）
Ｘ線結晶法によるＴＬＲ３抗体アンタゴニストのエピトープ及びパラトープ
ヒトＴＬＲ３細胞外ドメインを、ｍＡｂ １５ＥＶＱ、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及
びｍＡｂ ｃ１０６８のＦａｂｓと複合体の状態で結晶化させた。

方法
タンパク質の発現及び精製
ＴＬＲ３ ＥＣＤ（配列番号２のアミノ酸１〜７０３）の３つのＦａｂの発現及び精製
は上述の通りであった。

ＴＬＲ３ ＥＣＤの３つのＦａｂの四次複合体の作製
１ＴＬＲ３ ＥＣＤ：１．１Ｆａｂのモル比に対応させて、４ｍｇのヒトＴＬＲ３ Ｅ
ＣＤを２．４ｍｇのそれぞれのＦａｂと混合し、４℃で３．５時間インキュベートした。
複合体をアニオン交換クロマトグラフ法により２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１０
％のグリセロール（緩衝液Ａ）で平衡化したＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅ
ａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製し、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ
８．５）、１０％のグリセロール、１ＭのＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）により溶離した。１．
７４ｍＬ中のほぼ２．４８ｍｇの複合体を緩衝液Ａにより１０ｍＬまで希釈し、カラム上
に１ｍＬ／ｍｉｎで充填し、Ｂ濃度の０〜４０％の直線的な勾配により４０カラム容積に
わたって溶離した。５回の連続的な精製操作を行った。ピーク１由来の区分をプールし、
Ａｍｉｃｏｎ−１５ｍＬのＵｌｔｒａ−３００００ＭＷＣＯ及びＭｉｃｒｏｃｏｎ ３０
０００ＭＷＣＯにより２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．５）／２７ｍＭのＮａＣｌ／１０
％グリセロール中に、１４．４９ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（吸光係数：Ａ₂₈₀（１ｍｇ／
ｍＬ）＝１．３１）。

結晶化
Ｃｏｒｎｉｎｇプレート３５５０（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を
用いて等容量のタンパク質及びリザーバ溶液を、シッティングドロップ法で分注するＯｒ
ｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用
いて、自動化結晶化スクリーニングを行った。初期のスクリーニングは、Ｈａｍｐｔｏｎ
Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（ＨＲ２−１３０，Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）により実施した。幾つかの条件から、小さい結
晶を使用してシードを生成し、次いでこれをＭｉｃｒｏｓｅｅｄ−Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｒ
ｅｅｎｉｎｇ（ＭＭＳ）で使用した。小さい結晶を与える初期のスクリーニング条件に基
づき、何回かの精密化を行った。ＭＭＳに使用するリザーバ条件は、精密化後に小さい結
晶を与えた条件に基づくもので、１８〜２８％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３
５０、１ＭのＬｉＣｌ、ｐＨ ４．５及び２．０〜２．９Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５％の
ＰＥＧ４００、ｐＨ ４．５、並びに探索したｐＨ及び異なる添加物、であった。成分を
１タンパク質溶液：０．２５シード原料：０．７５リザーバ溶液の容量比で分注すること
により、Ｏｒｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）を用いて、ＭＭＳ結晶化スクリーニングを行った。約１０Åの分解能で回折する
結晶は、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２．９Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５％メチ
ル−ペンタン−ジオール（ＭＰＤ）及び０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２６％の
ＰＥＧ ３３５０、１ＭのＬｉＣｌから成長させたものであった。

結晶の分解能を改善するための試みとして、上記の条件を有するＭＭＳを、Ｈａｍｐｔ
ｏｎ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２−４２８（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）から選択された成分を容積比：１タンパク質溶
液：０．１２５シード原料：０．２添加物溶液：０．６７５リザーバ溶液で用いる、添加
物スクリーニングと組み合わせた。ＭＭＳと、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２
８％のＰＥＧ ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、及び３０ｍＭのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含
有する溶液からの添加物スクリーニングとの組み合わせを適用した後、Ｆａｂと複合体形
成し、約５Åの分解能で回折する、ＴＬＲ３ ＥＣＤのＸ線品質の結晶を得た。

ＴＬＲ３ ＥＣＤ四次複合体のＸ線データ収集
Ｘ線データを収集するために、結晶（サイズ約１．０×０．５×０．１ｍｍ³）を、合
成母液（０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２８％のＰＥＧ ３３５０、１ＭのＬｉ
Ｃｌ、１６％のグリセロール）中に数秒浸漬し、窒素流中１００Ｋで瞬間凍結した。Ｏｓ
ｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ ＣＣＤ検出
器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ Ｍ
ｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌ
ａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して、Ｘ線回折データを収集し、処理した。回折強度を、１／２
度の像当たり１ｍｉｎの露出時間、５Åの最大分解能で２５０°（結晶回転）にわたって
検出した。Ｘ線データを、プログラムＤ^*ＴＲＥＫ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ａｃｔａ Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，５５：１７１８〜１７２５，
１９９９）により処理した。この結晶は、単位セルパラメータ：ａ＝２１４．９０Å、ｂ
＝１４２．０８Å、ｃ＝１２５．０４Å、及びβ＝１０３．１７の単斜晶系空間群Ｃ２に
属する。この非対称ユニットには１分子の複合体を含む。Ｘ線データ統計値を表１３に示
す。

構造決定
ＴＬＲ３ ＥＣＤ−Ｆａｂ １５ＥＶＱ−Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ−Ｆａｂ ｃ１
０６８の結晶構造を、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：１３７３〜１３８２，２００１）を用いて
分子置換により決定した。探索モデルはＴＬＲ３ ＥＣＤ（すべてのグルカンを取り除い
たＰｒｏｔｅｉｎ ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）構造番号１ｚｉｗ，Ｃｈｏｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１〜５８５，２００５）であり、３つのＦａｂの高
分解能結晶構造を決定した（これらのＦａｂ構造に対する結晶データ及び精密化統計値の
要約としては表１３を参照のこと）。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのエルボー角度は、遊
離形態におけるものから著しくはずれていることが判明した。エルボー角度を約５°間隔
で調整することにより、一連のＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶモデルを生成し、その１つが
電子密度とよく一致することが判明した。構造精密化は、ＰＨＥＮＩＸで実施した（Ａｄ
ａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔ．１１：５３〜５５
，２００４）。ＴＬＲ３ ＥＣＤに対して構造を、Ｆａｂ及び１３個の剛体セグメント（
精密化で使用される定義：３０〜６０、６１〜１０８、１０９〜１５６、１５７〜２０６
、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６４〜４１５、４１６〜４６４
、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１９〜６８７）に対する剛体ド
メイン（各Ｖ又はＣドメイン）として、それぞれのＦａｂ剛体に対する１つのＢ因子及び
ＴＬＲ３ ＥＣＤ全体に対する単一のＢ因子によって精密化した。

Ｆａｂ剛体のそれぞれに対してトランスレーション／ライブレーション／スクリューを
伴う精密化を導入し、配列番号２の残基３３０において、ＴＬＲ３ ＥＣＤを２つのＴＬ
Ｓセグメントに分割した。グリカン密度は１５個のＮ−グリコシル化部位の１０個に対し
て目視可能であった。次いで、ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン（Ｃｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１〜５８５，２００５，ＰＤＢ構造番号：１ｚｉｗ）の結
晶構造からの炭水化物モデルを付加した。ＴＬＲ３ ＥＣＤ中の短い見えないセグメント
（配列番号２の残基３３７〜３４２）に対する密度が剛体の精密化後に目視可能となり、
それは、ＴＬＲ３細胞外構造２ａ０ｚからの対応するセグメントで充填された（Ｂｅｌｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０２：１０９７
６〜１０９８０，２００５，ＰＤＢ構造番号：２ａ０ｚ）。ＴＬＲ３ ＥＣＤのＣ末端は
、２ａ０ｚの密度に一致する更なる密度を含んでいた。次いで、このセグメント（配列番
号２の６４７〜７０３）を２ａ０ｗの（残基６４７〜６８７）により置き換えた。このよ
うに、ＴＬＲ３ ＥＣＤモデルは、ＴＬＲ３構造体１ｚｉｗと２ａ０ｚとの間のハイブリ
ッドであり、１３個の剛体セグメント（アミノ酸範囲：３０〜６０、６１〜１０８、１０
９〜１５６、１５７〜２０６、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６
４〜４１５、４１６〜４６４、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１
９〜６８７）として精密化されたものであった。

Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＬＣＤＲ３は、遊離形態と異なる立体配置を見掛け上と
っていた。マルチスタートシミュレーションアニーリングをＰＨＥＮＩＸの標準的なパラ
メータにより行った。このＬＣＤＲ３のモデルを電子密度マップで目視的に検査し、「最
もよく合う」立体配置を元のモデル上に接合した。精密化のプロセスを、計算開始の前に
確保された反射の５％に対してＲ_freeによりモニターした。最終回では、それぞれの残基
に対して１つのＢ因子を含めた。モデル検査、並びにＦａｂ及びタンパク質−タンパク質
界面における側鎖のエルボー領域の手動による再組立てを、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ
ｒ．６０：２１２６〜３２，２００４）を用いて行った。最終のＲ_cryst及びＲ_freeは、
５．０Åに対する全１５，７９２個の独立の反射について、それぞれ２６．８％及び３０
．０％であった。精密化統計値を表１３及び１４に示す。

結果
ＴＬＲ３ ＥＣＤ−３つのＦａｂ四次複合体の分子構造
複合体の全体的な分子構造を図２８に示す。非対称単位中に１つのＴＬＲ３ ＥＣＤ及
びそれぞれのＦａｂの１分子が存在する。ＴＬＲ３ ＥＣＤに対する構造モデルは、ｈｕ
ＴＬＲ３（配列番号２）の３０〜６８７個のすべての残基を含む。３つのＦａｂに対して
は、それぞれの非結合形からのすべての残基を、溶媒イオン及び水分子を除いて含めた。
ＴＬＲ３ ＥＣＤ分子は、全体のトポロジー（１ｚｉｗに対して０．７９Åのｒｍｓ、６
１３Ｃα’、及び２ａ０ｚに対して１．３７Å、５９５Ｃα’）において以前に報告され
た構造と極めて類似している。このＦａｂ構造は、方法に記載のＦａｂ １２ＱＶＱ／Ｑ
ＳＶのＬＣＤＲ３、並びにＴＬＲ３ ＥＣＤ／Ｆａｂ界面におけるエルボー領域及び一部
の側鎖を除いて、それぞれの非結合形とすべて同一である。

エピトープ及びパラトープ
ＴＬＲ３ ＥＣＤと３つのＦａｂとの間の結合に関与する残基を、図２８Ｂに示す。Ｆ
ａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは、ＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ末端近くで結合した。立体配置エピ
トープは、ＴＬＲ３ＬＲＲ３〜７からの残基（配列番号２のアミノ酸１００〜２２１）か
ら構成されるものであった。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合は、抗原及び抗体上でそ
れぞれほぼ９２８Ų及び８９６Ųを埋め込んだ。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して
は、結晶構造は、次のＴＬＲ３（配列番号２）エピトープ残基：Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ
１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ
１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９を同定した
。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配
列番号２１１）：Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及
びＤ９２、重鎖（配列番号２１４）：Ｎ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｙ６０
、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６及びＹ１０７を同定した。

Ｆａｂ １５ＥＶＱ及びＦａｂ ｃ１０６８は、Ｃ末端近くのＬＲＲ １５〜２３（配
列番号２のアミノ酸４０６〜６３５）に懸る、非折りたたみ型エピトープを結合していた
。（図２８）。Ｆａｂ １５ＥＶＱは、抗原及び抗体上でそれぞれ１０８０Ų及び１０
６４Ųを埋め込み、Ｆａｂ ｃ１０６８は、抗原及び抗体上でそれぞれ９６３Ų及び９
１４Ųを埋め込んだ。Ｆａｂ １５ＥＶＱに対するエピトープは、配列番号２で示され
るＴＬＲ３の残基Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４
６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５
１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５及びＫ６１９を覆う。Ｆａｂ
１５ＥＶＱに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配列番号４１）：Ｑ
２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５、重鎖（配列番号２１６）：Ｗ３３、
Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４及びＤ
１０６を同定した。

Ｆａｂ ｃ１０６８に対しては、結晶構造は、ＴＬＲ３（配列番号２）上の次のエピト
ープ残基：Ｅ４４６、Ｔ４４８、Ｑ４５０、Ｒ４５３、Ｒ４７３、Ｎ４７４、Ａ４７７、
Ｌ４７８、Ｐ４８０、Ｓ４９８、Ｐ４９９、Ｑ５０３、Ｐ５０４、Ｒ５０７、Ｄ５２３、
Ｄ５２４、Ｅ５２７、Ｅ５３０、及びＫ５５９を同定した。Ｆａｂ ｃ１０６８に対して
は、結晶構造は、次のパラトープ残基、軽鎖：Ｈ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｎ５０、Ｅ６６
、Ｓ６７、Ｇ６８（ｇｌｙｃ）、重鎖：Ｔ３０、Ｔ３１、Ｙ３２、Ｗ３３、Ｈ３５、Ｅ５
０、Ｎ５２、Ｎ５４、Ｎ５５、Ｒ５７、Ｎ５９、Ｖ９９、Ｍ１０２、Ｉ１０３、及びＴ１
０４を同定した。

中和の機構及びＴＬＲ３機能との関連
ｍＡｂ １５ＥＶＱ：ｍＡｂ １５ＥＶＱエピトープは、ＴＬＲ３残基Ｎ５１７、Ｈ５
３９及びＮ５４１を含有し、これらはＣ末端二本鎖ＲＮＡ結合部位と重複する（Ｂｅｌｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：８７９２〜
７、２００６）。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、この
ように、ｍＡｂ １５ＥＶＱは、リガンドに対して結合するＴＬＲ３に対して競合し、シ
グナル伝達単位の形成に必要とされる、リガンドにより誘起される受容体二量体化を防止
すると考えられる。（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７９〜８１，
２００８）。図２９は、ｍＡｂ １５ＥＶＱに対するこの直接の競合機構を図示する。抗
体濃度に依存して、この機構は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の全阻害又は二本鎖ＲＮＡにより誘起さ
れるＴＬＲ３活性化を生じる。

ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８：図３０に示すように、これらの
２つの抗体は二本鎖ＲＮＡリガンドとの直接的な衝突を持たない。したがって、これらが
ＴＬＲ３機能をｍＡｂ １５ＥＶＱのそれに類似の機構で中和することはありえない。Ｆ
ａｂフラグメントもリガンドから離れて配向する（図３０）。構造的に、ｍＡｂ １２Ｑ
ＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８は、両方とも機能を損なわずにシグナル伝達単位（
ＳＵ）に結合することができる。立体的に、ｍＡｂ分子の２つのＦａｂフラグメントが、
２つのＴＬＲ３分子を１つのＳＵ中で同時に結合し、ひいては二本鎖ＲＮＡ介在型ＴＬＲ
３二量体化を防止し得るということはありえない。いかなる特定の理論からも束縛される
ことを望むものではないが、ＴＬＲ３へのｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ又はｍＡｂ ｃ１
０６８の結合が、抗体と隣接するシグナル伝達単位との間の立体的な衝突により、シグナ
ル伝達単位のクラスター形成を防止すると考えられる。二本鎖ＲＮＡへのＴＬＲ３の結合
は、二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３複合体により定義されるシグナル伝達単位に限定されない（
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７９〜８１，２００８）。多数のＳ
Ｕのクラスター形成がシグナル伝達の増強を生じ得、又は効率的なＴＬＲ３シグナル伝達
がこのクラスター形成を必要とし得る。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０
６８の位置決めにより、クラスター形成をブロックさせ、ＴＬＲ３活性の中和をもたらし
得る。それゆえ、抗体の最大中和効果は、抗体結合によるＳＵの分離の度合いに依存する
。図３０に図示するように、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは、ｍＡｂ ｃ１０６８よりも
大きい分離を引き起こし、このことがｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのより大きい効能に転
換する可能性がある。このことは、ｍＡｂ ｃ１０６８及びｍＡｂ １５ＥＶＱが、飽和
濃度においてそれぞれ約５０％及び１００％のＴＬＲ３中和を生じることができ、ｍＡｂ
１２ＱＶＱ／ＱＳＶが中間の活性を呈するという観察と一致する。このように、複合構
造及びＴＬＲ３中和に関する研究は、二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達ユニットがク
ラスター化して効率的なシグナル伝達を達成するＴＬＲ３シグナル伝達モデルを示唆する
。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８はまた、リガンド結合又は受容体
の二量化を妨げずにＴＬＲ３シグナル伝達をある程度調節することができる抗体の部類を
定義する。

（実施例２３）
ＴＬＲ３が欠如すると、脂質のプロファイル及び肝臓脂肪症が改善される。
モデル
ＴＬＲ３^-/-マウスは、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ（Ｙａｌｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手され、以前に記載された（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１７１〜６，２０００）。ＴＬＲ３^-/-及び野生型（ＷＴ）のコ
ントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両方に、普通の餌、又は６０．９％ ｋｃａｌの
脂肪及び２０．８％ ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｐｕｒｉｎａ
ＴｅｓｔＤｉｅｔ ＃５８１２６）のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂
取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルに維持した。各マウスの体重は毎週測定され
、データは、平均値±ＳＤで示された。ＲＮＡ単離及び組織学的分析のために、肝臓のサ
ンプルを採った。

臨床化学計器（Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ＮＪ）を使って、総コレステロール（Ｔ
Ｃ）、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びトリグリセリド（ＴＧ）の血漿レベルを測定した。ＮＥＦＡ
キット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を使って、遊離脂肪
酸（ＦＦＡ）レベルを測定した。製造者の推奨に従って、サンプルの調製及びアッセイを
行った。

ＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ、ＣＡ）を使って製造者のプロトコルに従い、総肝臓ＲＮＡをランダムへキサマーで
逆転写した。ＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入された。脂質及びグルコース代謝並びに炎症に関
与した合計３５の遺伝子が、遺伝子発現分析のために試験された。遺伝子発現の相対定量
は、２−ＤｅｌｔａＤｅｌｔａＣｔ計算を用いて行われた（Ａｒｏｃｈｏ ｅｔ ａｌ．
，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：５６〜６１、２００６）。

組織学のために、肝臓を単離し、湿重量を測定した。肝臓サンプルを１０％の中性緩衝
ホルマリン中に固定し、所定のパラフィン切片のために処理し、ＨＥ染色した。組織学的
評価により、肝臓脂肪症のレベルを測定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて、
統計的分析を行った。

結果
ＨＦＤを与えられた動物は、２６週間のＨＦＤ後、高インスリン血症及び高血糖性であ
った（１４週間のデータ地点に関して実施例１５を参照）。脂質プロファイルは３３週間
で検査された。通常食のＴＬＲ３^-/-マウスは、ＷＴコントロールと比較して、血漿ＴＧ
は著しく下がったが、ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、（表１５）及びＦＦＡのレベルは、類似し
ていた。３３週間のＨＦＤでは、ＷＴコントロール動物の血漿ＴＣ、ＨＤＬ、及びＬＤＬ
レベルは上がったが、ＴＬＲ３^-/-マウスはある程度保護された（表１５）。肝臓の重量
（対応する体重に正規化された）は、ＨＦＤを与えられたＷＴ動物のものと比較して、Ｈ
ＦＤを与えられたＴＬＲ３^-/-マウスでは約１６％、ｐ＜０．０５減少した。組織学的分
析は、ＷＴ動物と比較したときに、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３^-/-動物の脂質蓄積も肝
実質において著しく減少したことを示した。

脂質及びコレステロール代謝に関与する鍵となる遺伝子、ＬＸＲα及びＰＰＡＲδの肝
臓発現は、ＷＴ動物と比較すると、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３^-/-マウスでは上方調節
され（それぞれ３０％、ｐ＜０．０５及び１８６％、ｐ＜０．００１）、これは、ＴＬＲ
３が欠乏したマウスにおける低脂質レベルと一致していた。ＬＸＲα標的遺伝子であるＡ
ＢＣＡ１及びＳＲＥＢＰ１も、これらの動物において上方調節された（それぞれ７１％、
ｐ＜０．０１及び１３１％、ｐ＜０．００１）。ＴＬＲシグナル伝達とＬＸＲとの間のク
ロストークが報告されている（Ｃａｓｔｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
４：８０５〜１５、２００３）。コレステロール輸送体であるＡＢＣＡ１の上方調節は、
ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３^-/-マウスにおいてコレステロール輸送が改善されたことを
示唆する。

この実施例で報告された研究により、野生型動物と比較すると、肥満症のＴＬＲ３が欠
乏した動物の脂質及びコレステロールレベルが改善されたことが立証され、抗ＴＬＲ３シ
グナル伝達が心臓血管疾患及び代謝性疾患の処置のための有効な治療手段であることが示
される。

（実施例２４）
ＴＬＲ３抗体の結合親和性
表面プラズモン共鳴分析
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００光学バイオセンサ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して２５℃で行われた。全ての試料をフィルタ滅
菌し、脱気されたＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液（ＢＲＢ）中で調製した（０．００５
％のポリソルベート２０を有するダルベッコＰＢＳ（ｐＨ ７．４））。ｍＡｂ １５Ｅ
ＱＶの３つの異なる調整物をこの実験に使用した。

ＣＭ５センサチップを５０ｍＭのＮａＯＨ、１００ｍＭのＨＣｌ、及び０．１％のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で前処理し、前処理と前処理との間に脱イオン水を注入し
た。まず、マウス抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号ＭＡＢ０５０，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）
のおよそ６０００応答単位（ＲＵ）を、メーカの説明書を使用して、アミン結合を介して
、センサチップ上に、そのカルボキシルメチル化デキストラン表面へ共有結合的に固定し
た。その後、ＨｉｓタグヒトＴＬＲ３ ＥＣＤを捕捉（約１２６ ＲＵ）し、Ｗｉｌｌａ
ｒｄ及び共同研究者によって使用されたものと同様の手順［Ｗｉｉｌａｒｄ ａｎｄ Ｓ
ｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｊｈｅｍ，１４７〜１４９，２００６］に従っ
て、同様にｐＨ ７．５でアミン結合した。

結合実験は、ＢＲＢの３倍希釈液において、０．４ｎＭ〜３３ｎＭ（０．４、１．２２
、３．６７、１１、３３ｎＭ）の範囲の濃度で、ｍＡｂ １５ＥＶＱの注入により行われ
た。会合相を３分間監視し、解離相を１５分間監視した。表面は、５０ｍＭのリン酸の２
つの３秒パルス（１００μＬ／ｍｉｎで５μＬ）によって、各サイクルの終了時に再生さ
れた。ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤの無いフローセルを参照として使用した。

Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウエア、バージョン１．１ｇ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ）を使用してデータを処理した。データの二重参照減算（double reference subtr
action）を実施して、シグナル及び機器ノイズに対する緩衝剤の寄与を補正した（Ｍｙｓ
ｚｋａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：２７９〜２８４，１９９９）。データの
動力学的分析は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０．１ソフトウエア（ＧＥ Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、データにグローバルにフィッテ
イングする単純なラングミュア１：１結合モデルを使用して実施した。まず、会合速度と
独立して解離速度（ｋ_off）をフィッテイングさせた。その後、オフ速度を定数として使
用し、会合相をフィッテイングさせ会合速度（ｋ_on）を導出した。

表１６は、ｍＡｂ １５ＥＶＱの３つの個別の調製物の動力学的パラメータ及び親和性
を示す。親和性は、タンパク質調製物間の９ｐＭ（９×１０^-12Ｍ）〜１４ｐＭ（１．４
×１０^-11Ｍ）の範囲にわたり、統計的有意差は無かった。親和性は、実験誤差（標準偏
差）内の５ｐＭ（５×１０^-12Ｍ）〜１７ｐＭ（１．７×１０^-11Ｍ）の範囲にわたった。

Claims (3)

1. ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントであって、該抗体が、２
   ５℃における表面プラズモン共鳴によって判定される場合、ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン
   （ＥＣＤ）に対する約５×１０^-12Ｍ〜１．７×１０^-11の解離定数（Ｋ_D）を有する、単
   離された抗体又はそのフラグメント。
2. 前記抗体が、以下の特性、
   ａ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒ
   トＴＬＲ３の生物活性を、約１μｇ／ｍＬで５０％超低減させる、
   ｂ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
   −６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を、約１０μｇ／ｍＬで６０％超阻害する、
   ｃ．１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ
   −６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を、約０．４μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
   ｄ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
   生を、約５μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
   ｅ．６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産
   生を、約１μｇ／ｍＬで５０％超阻害する、
   ｆ．ＰＢＭＣによるポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、又はＩＬ
   −１２の産生を、約１μｇ／ｍＬで２０％超阻害する、
   ｇ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬ
   Ｒ３の生物活性をＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで阻害するか、又は、
   ｈ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいてカニクイザルのＴＬＲ
   ３の生物活性をＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで阻害する、の少なくとも１つを有する、請求項
   １に記載の単離された抗体。
3. 前記抗体が、それぞれ配列番号８２、８６、及び８４の重鎖可変領域相補性決定領域（
   ＣＤＲ）１、２、及び３と、それぞれ配列番号７９、８０、及び８７の軽鎖ＣＤＲ１、２
   、及び３と、を含む、請求項２に記載の単離された抗体。