JP2014526464A - 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト - Google Patents

代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト Download PDF

Info

Publication number
JP2014526464A
JP2014526464A JP2014529662A JP2014529662A JP2014526464A JP 2014526464 A JP2014526464 A JP 2014526464A JP 2014529662 A JP2014529662 A JP 2014529662A JP 2014529662 A JP2014529662 A JP 2014529662A JP 2014526464 A JP2014526464 A JP 2014526464A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tlr3
antibody
mab
seq
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2014529662A
Other languages
English (en)
Inventor
カニングハム，マーク
フォン，イーチン
ヒーリンガ，キャサリン
ルオ，ジンクアン
ロウシェンバーガー，ロバート
ルッツ，マーク
マテオ，ラニ サン
サリスキー，ロバート
ストヤノビッチ−ススリック，ヴェドラナ
スウィート，レイモンド
テン，ファン
テプラヤコフ，アレクシー
ウー，リンダ
ウー，シェン−ジウン
Original Assignee
ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド filed Critical ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Publication of JP2014526464A publication Critical patent/JP2014526464A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

ＴＯＬＬ様受容体３（ＴＬＲ３）抗体アンタゴニスト、ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト又はそのフラグメントをコードしたポリヌクレオチド、並びに上記を製造及び使用する方法を開示する。

Description

本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）抗体アンタゴニスト、ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト又はそのフラグメントをコードしたポリヌクレオチド、並びに上記を製造及び使用する方法に関する。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌、ウイルス、寄生虫、及び場合によりホスト由来のリガンドに応答してシグナル伝達カスケードを開始させることにより、自然免疫反応の活性化を調節し、獲得免疫の発現に影響を及ぼす（Ｌａｎｃａｓｔｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６３：９４５〜９５５，２００５）。細胞膜に局在するＴＬＲであるＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ６は、細菌及び真菌のタンパク質又は脂質成分を含むリガンドを認識する。主として細胞内に存在するＴＬＲであるＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、それぞれ２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ及び非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡに対して応答する。ＴＬＲシグナル伝達の異常調節は数多くの問題を起こすと考えられており、治療方策がこの中枢に向けて開発されつつある（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．４：８７９〜８８０、２００５；Ｒｅｚａｅｉ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：８６３〜８６９、２００６；Ｗｉｃｋｅｌｇｒｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２：１８４〜１８７、２００６）。例えば、深刻な敗血症及び狼瘡用に、それぞれＴＬＲ４拮抗薬、並びにＴＬＲ７及び９の拮抗薬が臨床開発されている（Ｋａｎｚｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：５５２〜５５９、２００７）。
ＴＬＲ３シグナル伝達は、炎症又はウイルス感染時に壊死細胞から放出される２本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲ３の活性化によってインターフェロン及び炎症性サイトカインの分泌が誘導され、特定の微生物感染において保護作用のある免疫細胞の活性化及び動員が誘発される。例えば、ドミナントネガティブなＴＬＲ３対立遺伝子では、小児期におけるＨＳＶ−１による一次感染時に単純ヘルペス脳炎を発症しやすくなることが示されている（Ｚｈｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７：１５２２〜１５２７、２００７）。マウスではＴＬＲ３の欠損は、コクサッキーウイルスによるチャレンジ試験における生存率の低下との関連が示されている（Ｒｉｃｈｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ４１２７、２００９）。しかしながら、コントロール不良又は無調節のＴＬＲ３シグナル伝達は、西ナイル脳炎、フレボウイルス、ワクシニア、及びＡ型インフルエンザなどの特定のウイルス感染モデルにける罹患率及び死亡率に寄与することを示してきた（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３６６〜１３７３、２００４；Ｇｏｗｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６３０１〜６３０７、２００６；Ｈｕｔｃｈｅｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：４８３〜４９１、２００８；Ｌｅ Ｇｏｆｆｉｃら、ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２：Ｅ５３、２００６）。
ヒト及びマウスのＴＬＲ３細胞外ドメインの結晶構造が判定されている（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、１０２：１０９７６〜８０、２００５；Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１〜５８５、２００５；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７９〜３８１、２００８）。ＴＬＲ３は、グリカンにより修飾されたソレノイド馬蹄様の全体形状をとり、ロイシンに富んだ繰り返し（ＬＲＲ）モチーフのタンデム単位を２３個有する。二本鎖ＲＮＡ結合部位が、２つの別の領域にマッピングされている（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７９〜８１、２００８）。シグナル伝達集合体は、１つの二本鎖ＲＮＡ及び２つのＴＬＲ３細胞外ドメインからなることが提案されている（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５：２５８〜２６３、２００８）。
ＴＬＲ３は、炎症性疾患、免疫介在性疾患及び自己免疫疾患の範囲、例えば、敗血症性ショック（Ｃａｖａｓｓａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２６０９〜２６２１、２００８）、急性肺傷害（Ｍｕｒｒａｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７８：１２２７〜１２３７、２００８）、リウマチ性関節炎（Ｋｉｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２４：９〜１７、２００９；Ｂｒｅｎｔａｎｏら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．５２：２６５６〜２６６５、２００５）、喘息（Ｓｕｇｉｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：６５４〜６６２、２００９；Ｍｏｒｉｓｈｉｍａら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１６３〜１７４、２００８；Ｓｔｏｗｅｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．１０：４３、２００９）、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：４５４８〜４５５６、２００７；Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０４：７５１２〜７５１５、２００７）、自己免疫性肝疾患（Ｌａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２４５６〜２４６３、２００６）、並びに１型糖尿病（Ｄｏｇｕｓａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７：１２３６〜１２４５、２００８；Ｌｉｅｎ及びＺｉｐｒｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：５２〜６８、２００９）における病理学的機構を動かすことが示されている。更に、ＴＬＲ３発現における臓器特異的な増加は、原発性胆汁性肝硬変症の肝臓組織（Ｔａｋｉｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９０８〜９２０、２００５）、リウマチ性関節炎の関節（Ｏｓｐｅｌｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５８：３６８４〜３６９２、２００８）、及びアレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜（Ｆｒａｎｓｓｏｎら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．６：１００、２００５）など、無調節な局所的炎症反応により引き起こされる数多くの病的状態と相関することが示されている。
壊死状態では、内因性のｍＲＮＡを含む細胞内容物が放出されることによってサイトカイン、ケモカイン、及び局所炎症を誘導し、死細胞の残留物の除去を促進し、損傷を修復する他の因子の分泌が誘発される。壊死はしばしば炎症反応を持続させ、慢性又は過剰な炎症に寄与する（Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：９９〜１０９，２００９）。壊死部位におけるＴＬＲ３の活性化は、これらの異常な炎症反応に寄与し、放出されたＴＬＲ３リガンドを介して更なる炎症性のポジティブなフィードバックループを生じうる。したがって、ＴＬＲ３に対する拮抗性は慢性及び過剰な炎症及び／又は壊死を含む様々な疾患において有用でありうる。
ＴＬＲ３活性の下方制御も同様に、腎臓細胞癌、並びに頭部及び頸部扁平上皮細胞癌が含まれる腫瘍学的な兆候に対して、新規の治療法を示す（Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５７０３〜５７０９、２００７；Ｐｒｉｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２１：２０９〜２１５、２００８）。更に、タンパク質を低活性でコード化するＴＬＲ３L423F対立遺伝子は、進行性の年齢関連の「乾燥」黄斑変性症（Ｙａｎｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：１４５６〜１４６３、２００８）からの保護と関連づけられており、この疾病においてＴＬＲ３アンタゴニストが有益であり得ることを示した。
炎症状態にともなう病理及び感染症にともなう病理などの他の病理が健康及び経済に及ぼす影響は多大なものである。しかしながら、多くの医学領域における進歩にも関わらず、これらの状態の多くでは、治療上の選択肢及び治療法は比較的少ない。
したがって、ＴＬＲ３に関連する状態を治療するためにＴＬＲ３活性を抑制することが求められている。
本発明の一つの態様は単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合することを特徴とする。
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体がｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９に結合することを特徴とする。
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそのフラグメントを有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５により、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。
本発明の別の態様は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又はそれらのフラグメントを有し、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｎ３１ａ、Ｑ５２、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及びＹ１００、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｅ５０、Ｄ５１、Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３により、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３反応性を有し、以下のａ〜ｉの特性のうち少なくとも１つを有する、単離された抗体である；
ａ．Ｋｄ＜１０ｎＭでヒトＴＬＲ３に結合する；
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬで、ヒトＴＬＲ３の生物活性を５０％超低減させる；
ｃ．１０μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を６０％超阻害する；
ｄ．０．４μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を５０％超阻害する；
ｅ．５μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｆ．１μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｇ．１μｇ／ｍＬで、ＰＢＭＣ細胞による、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２の産生を２０％超阻害する；
ｈ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜１０μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する；又は
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０＜５μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する。
本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ １、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体である。
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有し、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３、並びに特定の軽鎖ＣＤＲ １、２及び３のアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、重鎖及び軽鎖可変領域を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体であって、前記抗体は特定の重鎖のアミノ酸配列、及び特定の軽鎖のアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、単離された抗体重鎖であって、前記抗体重鎖は配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、単離された抗体軽鎖であって、前記抗体軽鎖は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体重鎖は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、抗体重鎖をコードする単離されたポリペプチドであって、前記抗体重鎖は配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様は、単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖をコードする。
本発明の別の態様は、本発明の単離された抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の態様は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することと、を含む、ＴＬＲ３に対する反応性を有する抗体の製造方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、炎症性疾患の治療又は予防を必要とする患者に、炎症性疾患を治療又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、全身性の炎症状態を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、全身性炎症性疾患の処置又は予防方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ＩＩ型糖尿病を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ＩＩ型糖尿病の処置方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、高血糖を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高血糖の処置方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、インスリン抵抗性を処置するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、高インスリン血症の治療方法である。
本発明の別の態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、ウイルス感染を処置又は予防するうえで充分な時間にわたって投与することを含む、ウイルス感染の処置又は予防方法である。
ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおける抗ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）ｍＡｂの作用を示す。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す。 ＢＥＡＳ−２Ｂアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用（阻害率（％））を示す。 ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用を示す。 ＮＨＢＥアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用を示す。 ＰＢＭＣアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用を示す。 ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用を示す。 ＨＡＳＭアッセイにおける抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの作用を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの結合を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの結合を示す。 ＴＬＲ３突然変異体に対する抗ｈｕＴＬＲ ３ｍＡｂの結合を示す。 ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤ上の、ｍＡｂ １５ＥＶＱ（黒）及びＣ１０６８ｍＡｂ（灰色）のエピトープ（上の画像）、並びにｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ（黒、下の画像）のエピトープを示す。 ｍＡｂ １５ＥＶＱと複合体を形成させたＴＬＲ ３ＥＣＤタンパク質の局所的Ｈ／Ｄ交換撹乱マップを示す。 Ａ）ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウスの抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ ｍＡｂ ５４２９（代替抗体）の作用を示す。 Ａ）ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイ及びＢ）ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおけるラット／マウスの抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂｍ Ａｂ ５４２９（代替抗体）の作用を示す。 ＭＥＦ ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０アッセイにおける代理ｍＡｂ（ｍＡｂ ５４２９、ｍＡｂｃ １８１１）の作用を示す。 ＴＬＲ３に対する代理ｍＡｂの結合の特異性を示す。上側のパネル：アイソタイプコントロール；下側のパネル：ｍＡｂ ｃ１８１１。 ＡＨＲモデルにおけるｐｅｎＨレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中の全好中球数に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＡＨＲモデルにおけるＢＡＬ液中のＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＤＳＳモデルにおける組織病理学スコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 Ｔ細胞移植モデルにおける、Ａ）組織病理学スコア、及びＢ）好中球流入に対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＣＩＡモデルにおける臨床スコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す。 ＣＩＡモデルにおける臨床ＡＵＣスコアに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の経鼻投与の後のＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率に及ぼす代替ｍＡｂの効果を示す。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後の臨床スコアに対する代替ｍＡｂの効果を示す。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。 インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４の投与後に代替ｍＡｂを投与した後の１４日にわたる体重変化に及ぼす代替ｍＡｂの効果を示す。ｍＡｂの投与は１日目に始まった。 グルコースチャレンジ後の（Ａ）野生型ＤＩＯ及び（Ｂ）ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物における血中グルコース濃度に対する代替ｍＡｂの効果を示す。 野生型ＤＩＯ動物のインスリンレベルに対する代理ｍＡｂの効果を示す。 ＮＨＢＥ細胞における、（Ａ）ＮＴＨｉ、及び（Ｂ）ライノウイルス誘導ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳレベルに対するｍＡｂ １５ＥＶＱの効果を示す。 ＨＵＶＥＣ細胞における、（Ａ）ｓＩＣＡＭ−１レベル及び（Ｂ）生存率に対する、ｍＡｂ １５ＥＶＱの効果を示す。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の生存率を示す。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の臨床スコアを示す。 インフルエンザＡの感染３日後に代替ｍＡｂを投与した後の動物の体重変化を示す。 ＡではｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤとＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ１５ ＥＶＱ及びＦａｂ ｃ１０６８との四次構造の分子構造をリボン及び表面表示で示す。ＴＬＲ３ ＥＣＤの、Ｎで標識したＮ末端を薄い灰色で示し、すべてのＦａｂ分子を暗い灰色のリボン表示で示す。Ｂ．エピトープを薄い灰色で着色し、ＡにおけるＦａｂについてのようにＴＬＲ３ ＥＣＤ上で標識した。図２８、２９及び３０では、判り易くするために、Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ、Ｆａｂ ｃ１０６８及びＦａｂ １５ＥＶＱの標識を、それぞれ、Ｆａｂ１２、Ｆａｂ１０６８及びＦａｂ１５と明記する。 Ｆａｂ １５ＥＶＱによる中和機構を示す。Ａ．２つのＴＬＲ３ ＥＣＤ（薄い灰色及び暗い灰色で示す図、並び標識されたＴＬＲ３図）の一方において、Ｆａｂ １５ＥＶＱエピトープをハイライト（薄い灰色）した二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）を示す。二本鎖ＲＮＡリガンドは薄い灰色の二重らせんとして示される。Ｂ．二本鎖ＲＮＡの結合を立体的に阻害することで、ＳＵの形成を阻害する、Ｆａｂ １５ＥＶＱの結合が図示される。Ｆａｂ １５ＥＶＱの結合は高親和性であり、ＳＵの形成を阻害するか、又はすでに形成されているＳＵを分解する。 Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８及びＴＬＲ３シグナル伝達ユニット（ＳＵ）のクラスター形成の機構を示す。Ａ．Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８は、単一ＳＵを結合（又は共結合）することができる。Ｂ．約７６塩基対の二本鎖ＲＮＡ上の２つのＳＵの最近接クラスター形成のモデルである。判り易くするために３つのエピトープが異なる分子中でハイライトされている。Ｃ．Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８の結合は、抗体と、隣接するＳＵとの間の立体的な衝突によりＳＵのクラスター形成を防止する。２つの左を指す矢印は、抗体によるＳＵの分離の異なる度合いを定性的に表す（底部の矢印はＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対するものであり、及び 代表的な抗体に対する、配列番号と、Ｋａｂａｔによる番号付けと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けの対応を示す。ＣＤＲ及びＨＶを灰色でハイライトしてある。 ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＬと、ヒトＶκ１フレームワークとのアライメント結果を示す。Ｃｈｏｔｈｉａによるハイパー可変ループにアンダーラインし、パラトープ残基に二重アンダーラインし、及びフレームワークの差異を灰色でハイライトしてある。特記しない限り、Ｖκ１遺伝子は*０１対立遺伝子である。残基番号付けは連続的に行っている。 ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＨと、ヒトＶｈ５フレームワークとのアライメントを示す。配列の特徴は図３２のように示される。 ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬと、ヒトＶｋ３フレームワークとのアライメントを示す。配列の特徴は図３２のように示される。 ｍＡｂ １５ＥＶＱ又はｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＶＬ及びＶＨと、ヒトＪκ、Ｊλ又はＪｈフレームワークとのアライメントを示す。配列の特徴は図３２のように示される。
特許及び特許出願を含み、それらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
本明細書で用いる「アンタゴニスト」なる用語は、何らかの機構によって、受容体又は細胞内メディエーターなどの別の分子の作用を部分的又は完全に阻害する分子のことを意味する。
本明細書で用いるとき、「ＴＬＲ３抗体アンタゴニスト」又は「ＴＬＲ３反応性の」抗体とは、ＴＬＲ３の生物活性又はＴＬＲ３受容体の活性化を直接的又は間接的に実質上相殺、低減、又は阻害する能力を有する抗体のことを言う。例えば、ＴＬＲ３反応性を有する抗体は、ＴＬＲ３に直接結合してＴＬＲ３の活性を中和することによって、すなわちＴＬＲ３のシグナル伝達を遮断することによって、サイトカイン及びケモカインの放出、又はＮＦ−ｋＢの活性化を低減させることができる。
用語「抗体」は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。完全な抗体とは、２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一方の末端で可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）を有し、続いて多数の定常性のドメイン（定常領域）を有する。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる。
免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列をもとに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、イソ型のＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4へと更に細かく分類される。
「抗体フラグメント」なる用語は、完全な抗体の部分、通常は完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つの損なわれていない抗体から形成された多特異的抗体が挙げられる。
免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、３つの「抗原結合部位」を取り囲む「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を次のように使用して定義される：（ｉ）用語相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づく（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０、１９７０）。一般に、抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、即ちＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、及びＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を有する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」とは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋにより定義されるように、構造が超可変である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７、１９８７）。一般に抗原結合部位は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を有している。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼ぶ。（ｉｉｉ）Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７、２００３）により提案される「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体からのＶ領域の比較を基にしている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これらの領域の標準化された番号及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの記述間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７、２００３に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｕｓａｇｅ（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ、Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３、２００４）を基にして説明することもでき、特異性決定残基（ＳＤＲ）とは、抗原接触に直接関与する、免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。ＳＤＲＵは、抗原−抗体複合体についての結晶構造解析により定義される、異なるタイプの抗原に対するＳＤＲの数及び分布の精密な尺度である。（ｖ）抗原結合部位を、抗原抗体複合体の結晶構造から同定される抗体パラトープ残基とも定義することもできる。
用語「複合配列」は、本明細書で使用するとき、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴによって個別に表記されるすべてのアミノ酸残基又は他の任意の好適な抗原結合領域の表記を含むものとして定義される抗原結合部位を意味する。
本明細書で使用するとき、「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜４８、１９９７）に従って番号付けされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。連続的ポリペプチド番号付けに関して最も使用されている２つの番号付けシステム、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５th Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）及びＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７、１９８７）間の対応が、本発明の例示的抗体に関する図３１に示される。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、可変領域において、抗原結合部位として定義されている配列以外の配列である。フレームワークは、通常、それぞれの可変領域において、３つの抗原結合部位のための骨格を生成する、４つの領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ３に分割される。抗原結合部位は上記に述べたような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
「軽鎖可変領域カッパー１（Ｖκ１）フレームワーク」又は「Ｖκ１」は、本発明で使用するとき、ヒトＶκ１機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされている、アミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶκ１遺伝子は、ＩＧＫＶ１−５*０１、ＩＧＫＶ１−６*０１、ＩＧＫＶ１−８*０１、ＩＧＫＶ１−９*０１、ＩＧＫＶ１−１２*０１、ＩＧＫＶ１−１３*０２、ＩＧＫＶ１−１６*０１、ＩＧＫＶ１−１７*０１、ＩＧＫＶ１−２７*０１、ＩＧＫＶ１−３３*０１、ＩＧＫＶ１−３７*０１、ＩＧＫＶ１−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−８*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１７*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２*０１、又はＩＧＫＶ１Ｄ−４３*０１である。免疫グロブリン遺伝子の命名法は周知されたものである。
「軽鎖可変領域ラムダ３（Ｖλ３）フレームワーク」又は「Ｖλ３」は、本明細書で使用するとき、ヒトＶλ３機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶλ３遺伝子は、ＩＧＬＶ３−１*０１、ＩＧＬＶ３−９*０１、ＩＧＬＶ３−１０*０１、ＩＧＬＶ３−１２*０１、ＩＧＬＶ３−１６*０１、ＩＧＬＶ３−１９*０１、ＩＧＬＶ３−２１*０１、ＩＧＬＶ３−２２*０１、ＩＧＬＶ３−２５*０１、ＩＧＬＶ３−２７*０１、及びＩＧＬＶ３−３２*０１である。
「重鎖可変領域Ｖｈ５フレームワーク」又は「Ｖｈ５」は、本明細書で使用するとき、Ｖｈ５機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ５遺伝子は、ＩＧＨＶ５−５１*０１及びＩＧＨＶ５−１*０１である。
「重鎖可変領域Ｖｈ６フレームワーク」又は「Ｖｈ６」は、本明細書で使用するとき、Ｖｈ６機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶｈ６遺伝子はＩＧＨＶ６−１*０１である。
「軽鎖カッパーＪ領域（Ｊκ）フレームワーク」又は「Ｊκ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪκ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＶκ遺伝子は、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、及びＩＧＫＪ５である。
「軽鎖ラムダＪ領域（Ｊλ）フレームワーク」又は「Ｊλ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪλ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪλ遺伝子は、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６、及びＩＧＬＪ７である。
「重鎖Ｊ領域（Ｊｈ）フレームワーク」又は「Ｊｈ」は、本明細書で使用するとき、ヒトＪｈ機能性遺伝子又はその対立遺伝子のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。代表的な機能性ヒトＪｈ遺伝子は、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、及びＩＧＨＪ６である。
「生殖細胞系列遺伝子」又は「抗体生殖細胞系列遺伝子」は、本明細書で使用するとき、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再配列及び変異につながる成熟プロセスを経ていない非リンパ細胞によってコードされる免疫グロブリン配列である。
本明細書で用いられるとき、「スカフォールド」は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によってコードされる軽鎖又は重鎖の可変領域のアミノ酸配列を指す。したがって、スカフォールドは、フレームワークと抗原結合部位の両方を包含する。
本明細書で使用される用語「抗原」は、直接又は間接に抗体を生成する能力を有する任意の分子を意味する。「抗原」の定義内には、タンパク質エンコーディング核酸が含まれる。
用語「ホモログ」は、参照配列との配列同一性が４０％〜１００％であるタンパク質配列を意味する。ヒトＴＬＲ３のホモログには、既知のヒトＴＬＲ３配列との配列同一性が４０％〜１００％であるような他種由来のポリペプチドが含まれる。２つのペプチド鎖の配列の同一性（％）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用して、配列をペアでアライメントすることによって決定することができる。「ＴＬＲ３」とは、ヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）及びその同族体を意味する。完全長ｈｕＴＬＲ３のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示されている。ｈｕＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。
「実質的に同一の」は、本明細書で使用するとき、比較される２つの抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列が同一であるか、又は「実体のない差異」を有するということを意味する。抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列における１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸の置換が、実体のない差異として挙げられる。本明細書で開示する配列とほぼ同じアミノ酸配列も本願の一部である。特定の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い。同一性（％）は、上記に述べたようにして決定することができる。比較するペプチド鎖の例としては、重鎖又は軽鎖の可変領域がある。
用語「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用するとき、記述の対象である薬剤が、他の薬剤と共に、混合物として一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。
用語「炎症性状態」は、本明細書で使用するとき、ほとんどの場合、痛み、発赤、腫れ、及び組織機能の喪失を特徴とし、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば、好中球、単球、リンパ球、マクロファージ）の活性によりある程度介在される、細胞損傷に対する局所化された応答を意味する。用語「炎症性の肺状態」は、本明細書で使用するとき、肺を冒す又は肺と関連する炎症状態を意味する。
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対して作製される。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。例えば、マウスｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法によって製造することができる。ドナー抗体（通常はマウス）由来の軽鎖及び重鎖の可変領域を、アクセプター抗体（通常、例えばヒトなどの別の哺乳動物種）由来の軽鎖及び重鎖の定常領域とともに含むキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法によって作製することができる。ヒト以外のドナー由来の免疫グロブリン（通常はマウス）から誘導されたＣＤＲと、１以上のヒト免疫グロブリンから誘導された、抗体分子のその他の免疫グロブリン領域とを有するヒト化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知の方法によって調製することができる。ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選別することができる。場合により、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６：１００２９〜１００３２、１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１、１９９１に開示されるもののような方法によって、結合親和性を維持するために、変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによってヒト適合化ｍＡｂを更に改変することができる。
ヒト以外の配列を全く有さない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１，１９９６、及びＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリンのトランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、また、ファージディスプレイライブラリを元に、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６、２０００；及びＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１に参照される技法によって調製及び最適化することができる。抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びｄＡｂ断片を、抗体の切断又は遺伝子組み換え操作により生成してもよい。例えば、ペプシンなどの酵素により抗体を処理することで、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を生成することもできる。
用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは通常、アミノ酸及び多糖類側鎖のような化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性）部分の表面における集団からなり、特定の３次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは直線状のものであってもよく、あるいはアミノ酸の直線状の配列によってではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ（例えば、立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。
用語「パラトープ」は、本明細書で使用するとき、抗原が特異的に結合する抗体の一部を指す。パラトープは元来線状であるか、又は不連続であることができ、抗体のアミノ酸の線状構造よりも、隣接していないアミノ酸間の空間的な関係により形成される。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープアミノ酸残基」は、それぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖及び重鎖残基を指す。
用語「特異的結合」は、本明細書で使用するとき、抗体が特定の抗原と、他の抗原又はタンパク質に対するよりも高い親和性で結合することを指す。通常、抗体の結合における解離定数（ＫD）は１０-7Ｍ以下であり、抗体が特定の抗原と結合する際のＫDは、特定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド）と結合する際のＫDと比較して１／２以下である。本明細書では、「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句を、「抗原と特異的に結合する抗体」又は「抗原特異的抗体」、例えばＴＬＲ３特異的抗体という用語と互換可能に用いる。解離定数は後述するような標準的な方法を用いて測定することができる。
用語「ＴＬＲ３の生物活性」又は「ＴＬＲ３の活性化」は、本明細書で使用するとき、リガンドとＴＬＲ３との結合によって生ずる任意の活性を指す。ＴＬＲ３のリガンドには、２本鎖ＤＮＡ、ポリイノシンポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、及び例えば、壊死細胞から放出される内因性ｍＲＮＡなどの内因性ｍＲＮＡが含まれる。ＴＬＲ３の活性化の一例では、ＴＬＲ３のリガンドに応じてＮＦ−ｋＢが活性化される。レポーター遺伝子アッセイを用いることで、ポリ（Ｉ：Ｃ）による受容体の誘導に基づき、ＮＦ−ｋＢの活性化をアッセイすることができる（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２〜７３８，２００１；Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１８：６９７３〜６９８２、１９９９）。他の代表的なＴＬＲ３受容体の活性化は、ＴＬＲ３リガンドに対する応答として、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ−３、ＩＲＦ−７）の活性化をもたらす。ＴＬＲ３によって媒介されるＩＲＦの活性化は、インターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）によって制御されるレポーター遺伝子を用いてアッセイすることができる。別のＴＬＲ３の活性化の例では、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカイン及びケモカインが分泌される。細胞、組織からの、又は循環中へのサイトカイン及びケモカインの放出は、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイなどのよく知られた免疫アッセイによって測定することができる。
本明細書では、以下の通りの一般的なアミノ酸１文字表記及び３文字表記を用いる。
Figure 2014526464
物質の組成
本発明はＴＬＲ３の生物学的活性を阻害することが可能な抗体アンタゴニスト及びこうした抗体の使用法を提供する。こうしたＴＬＲ３アンタゴニストは、ＴＬＲ３に結合してＴＬＲ３の活性化を阻害する性質を有しうる。こうした抗体によってＴＬＲ３活性が阻害されうる機序の例としては、ＴＬＲ３へのリガンドの結合のインビトロ、インビボ、若しくはインサイチューでの阻害、受容体の２量化の阻害、エンドソーム区画へのＴＬＲ３の局在化の阻害、下流のシグナル伝達経路のキナーゼ活性の阻害、又はＴＬＲ３のｍＲＮＡの転写の阻害が挙げられる。他の機序によってＴＬＲ３の活性を阻害することが可能な他の抗体アンタゴニストもまた、本発明の異なる態様及び実施形態の範囲に含まれるものである。これらのアンタゴニストは、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。
抗体の多様性は、自然の系では、可変領域をコードする多数の生殖細胞系列遺伝子の使用及びさまざまな体細胞イベントにより作り出される。体細胞イベントとしては、完全なＶＨ領域を作るための多様性（Ｄ）及び接合（Ｊ）遺伝子セグメントを持つ可変遺伝子セグメントの組換え、並びに完全なＶＬ領域を作るための可変及び接合遺伝子セグメントの組換えがある。組み換えプロセスそれ自体は不正確であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部におけるアミノ酸の喪失又は追加を生じる可能性がある。多様性のこれらの機序は、抗原暴露に先立つＢ細胞の発生時に起こる。抗原刺激の後、Ｂ細胞中で発現された抗体遺伝子は、体細胞変異を受ける。生殖細胞系列遺伝子セグメント、これらのセグメントのランダムな組み換え、及びランダムなＶＨ−ＶＬの対形成の見積り数に基づいて，１．６×１０7までの異なる抗体が生成可能である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版（１９９３）Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。抗体多様性に寄与する他のプロセス（体細胞変異などの）を考慮に入れた場合、１０10以上の異なる抗体が生成可能であると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ、第２版（１９９５）Ｊｏｎｉｏら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。多数のプロセスが抗体多様性の生成において関与するために、同一の抗原特異性を有する独立に由来したモノクローナル抗体が同一のアミノ酸配列を有するということは極めてあり得ないことである。
本発明は、新規の抗原結合部位及びヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する免疫グロブリン鎖を提供する。抗原結合部位を担持させるための構造は一般に抗体の重鎖又は軽鎖若しくはそれらの部分であり、抗原結合部位は上記に述べたようにして調べた天然の抗原結合部位に配置される。
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有している。
Figure 2014526464
 １５* ＩＭＧＴにより規定されるＣＤＲ
１５** コンセンサスとして規定されるＣＤＲ
特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９２に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９２のＨＣＤＲ２は式（Ｉ）に示されるように定義される。
Ｘａａ6−Ｉ−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｒ−Ｓ−Ｘａａ9−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ａ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ、
（Ｉ）
式中、
Ｘａａ6は、Ａｒｇ又はＬｙｓであってよく、
Ｘａａ7は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ8は、Ｍｅｔ、Ａｒｇ又はＴｙｒであってよく、
Ｘａａ9は、Ｌｙｓ又はＡｒｇであってよい。
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９４に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９４のＨＣＤＲ２は式（ＩＩＩ）に示されるように定義される。
Ｉ−Ｉ−Ｑ−Ｘａａ15−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｗ−Ｙ−Ｎ−Ｘａａ16−Ｙ−Ａ−Ｘａａ17−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｓ、
（ＩＩＩ）
式中、
Ｘａａ15は、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＩｌｅであってよく、
Ｘａａ16は、Ａｓｎ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ17は、Ｖａｌ又はＬｅｕであってよい。
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９６に示されるようなＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を有し、配列番号１９６のＨＣＤＲ２は式（Ｖ）に示されるように定義される。
Ｘａａ24−Ｉ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｓ−Ｙ−Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｘａａ25−Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ｑ−Ｇ、
（Ｖ）
式中、
Ｘａａ24は、Ｐｈｅ又はＡｒｇであってよく、
Ｘａａ25は、Ａｌａ又はＳｅｒであってよい。
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９１に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９１のＬＣＤＲ３は式（ＩＩ）に示されるように定義される。
Ｘａａ1−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｔ−Ｖ、
（ＩＩ）
式中、
Ｘａａ1は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ2は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ3は、Ａｓｐ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ4は、Ｇｌｕ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ5は、Ｐｈｅ、Ａｌａ又はＬｅｕであってよい。
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９３に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９３のＬＣＤＲ３は式（ＩＶ）に示されるように定義される。
Ｘａａ10−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｘａａ11−Ｐ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｘａａ14−Ｖ、
（ＩＶ）
式中、
Ｘａａ10は、Ｇｌｎ又はＳｅｒであってよく、
Ｘａａ11は、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであってよく、
Ｘａａ12は、Ｖａｌ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ13は、Ｔｙｒ又はＰｈｅであってよく、
Ｘａａ14は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎであってよい。
他の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は配列番号１９５に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を有し、配列番号１９５のＬＣＤＲ３は式（ＶＩ）に示されるように定義される。
Ｑ−Ｑ−Ｘａａ18−Ｘａａ19−Ｘａａ20−Ｘａａ21−Ｘａａ22−Ｘａａ23−Ｔ、
（ＶＩ）
式中、
Ｘａａ18は、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａであってよく、
Ｘａａ19は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｎであってよく、
Ｘａａ20は、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってよく、
Ｘａａ21は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ22は、Ｓｅｒ又はＬｅｕであってよく、
Ｘａａ23は、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであってよい。
本発明は、また、表１ａに示されるような重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントも提供するものである。
抗原結合部位のアミノ酸配列が表１ａのもの（配列番号４９〜１２１及び１９１〜１９６）と大きく異ならない抗体は本発明の範囲に含まれるものである。一般に、これには１以上のアミノ酸残基を、同様の電荷、疎水性又は立体化学的特性を有するアミノ酸によって置換することが含まれる。抗原結合部位ではなく、フレームワーク領域における更なる置換も、これらの置換が抗体の性質に悪影響を及ぼさない限りは行うことができる。置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるために行うことができる。１、２、３、４、５又は６個の置換を抗原結合部位に行うことができる。得られる抗体が所望の特性を保持するならば、フレームワーク残基の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は３０％を置換することができる。
保存的な改変では、こうした改変が行われた分子と同様の機能的及び化学的性質を有する分子が生ずる。分子の機能的及び／又は化学的特性における大幅な改変は、（１）置換領域における分子骨格の構造を例えばシート又はヘリックス立体構造として維持する、（２）標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持する、又は（３）分子のサイズを維持する効果において大きく異なるアミノ酸配列中の置換を選択することによって実現することができる。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換することができる。更に、アラニン・スキャニング変異導入法についてこれまでに述べられているように、ポリペプチド内の任意の内因性の残基をアラニンで置換することもできる（ＭａｃＬｅｎｎａｎら、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７、１９９８；Ｓａｓａｋｉら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４、１９９８）。当業者であれば、所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的であるかによらず）を、かかる置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書で述べる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。アミノ酸置換の例を表１ｂに示す。
特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換には、生物学的システムによって合成されるのではなく、一般的に化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然のアミノ酸残基も含まれる。アミノ酸置換は、例えば、ＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。変異型のライブラリーは、周知の方法を使用して、例えば、無作為（ＮＮＫ）又は非無作為コドン、例えば、１１のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコード化するＤＶＫコドンを使用し、実施例１に示されるように、所望の特性で変異型のライブラリーをスクリーニングして生成することができる。表１ｃは、抗体特性を改善するために、ＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ２領域内の３つの親ＴＬＲ３抗体アンタゴニストに対して行われた置換を示す。
抗原結合部位の表記に応じて、本発明の抗体の抗原結合部位、次いでフレームワーク残基は、各重鎖及び軽鎖ごとに若干異なりうる。
Figure 2014526464
表２ａ及び２ｂは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＩＭＧＴに基づいて表記された本発明の例示的抗体の抗原結合部位の残基及びそれらの複合配列を示したものである。
他の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を有する、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供するものであり、前記抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するとともに表３ａに示されるようなそれぞれの単離された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を提供する。Ｆ１７、Ｆ１８及びＦ１９は、それぞれ、ファミリー１７、１８及び１９のコンセンサスなアミノ酸配列を有する抗体の変異体を表す（実施例１を参照）。
Figure 2014526464
Figure 2014526464
Figure 2014526464
実施例で説明する実施形態は、１つは重鎖に由来し、１つは軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖の可変領域を単独で有してもよいということを認識するであろう。単一の可変領域を用いることで、例えば、ＴＬＲ３に結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合フラグメントを形成することが可能な第２の可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、例えば、国際特許公開第９２／０１０４７号に開示される階層的２重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選別する。
Figure 2014526464
他の実施形態では、本発明は、表３ａに示されるような可変領域のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の可変領域の両方を有し、ＴＬＲ３反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。
別の態様では、本発明は、表３ｂに示されるような特定の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有する単離された抗体を提供する。
本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドである。ある種のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されるが、遺伝コードの縮重又は所定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。
Figure 2014526464
Figure 2014526464
抗体アンタゴニストの例としては、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭアイソタイプの抗体が挙げられる。更にこうした抗体アンタゴニストは、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又は、ポリエチレングリコール部分の付加（ペギレーション）及び脂質化など非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されてもよい。このような修飾は、生体内あるいは生体外で行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと複合（ＰＥＧ化）することによって薬物動態特性を向上させることができる。複合は当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体をＰＥＧと複合させると、機能は低下せずに薬物動態が向上されることが示されている。（Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２〜３９０、２０００；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９〜４１８、２００４；Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１１９、２００１；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：７６１〜７７０、２００３）。
Figure 2014526464
本発明の抗体の薬物動態的性質は、当業者には周知の方法により、Ｆｃ修飾によって向上させることも可能である。例えば、ＩｇＧ４アイソタイプの重鎖は、ヒンジ領域に重鎖間又は重鎖内ジスルフィド結合を形成することが可能なＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（ＣＰＳＣ）というモチーフを含んでいる。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が他の重鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合する（重鎖間）か、あるいは特定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合しうる（重鎖内）。生体内のイソメラーゼ酵素は、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換し、またその逆反応を行うことが可能であると考えられている（Ａａｌｂｅｒｓｅ及びＳｃｈｕｕｒｍａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：９〜１９，２００２）。したがって、ヒンジ領域に重鎖内結合を有するこうしたＩｇＧ４分子内の重鎖：軽鎖（Ｈ：Ｌ）の各ペアは互いに共有結合していないことからＨ：Ｌモノマーに解離し、更に他のＩｇＧ４分子に由来するＨ：Ｌモノマーと再会合して、２重特異的なヘテロダイマーのＩｇＧ４分子を形成する。２重特異的なＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂはそれらが結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＣＰＳＣモチーフのＳｅｒ残基をＰｒｏで置換することによって「ＩｇＧ１様挙動」が生じる。すなわち、これらの分子は重鎖同士の間に安定したジスルフィド結合を形成するために他のＩｇＧ４分子とのＨ：Ｌ交換が起きない。一実施形態では、本発明の抗体はＣＰＳＣモチーフ内にＳ→Ｐの突然変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。ＣＰＳＣモチーフの位置は典型的に、成熟した重鎖の残基２２８に見出されるが、ＣＤＲの長さに応じて変化し得る。
更に、本発明の抗体のＦｃＲｎサルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響する部位を除去することもできる。例えば、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合領域を本発明の抗体において除去することができる。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異、又はＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３５／Ｌｅｕ２３６のＰ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａへの突然変異によって、ＦｃＲ結合が最小となり、補体依存性細胞毒性及びＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリンの能力が低減する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ変異を有するＩｇＧ４のＦｃドメインを有する。上記で特定したこれらの残基の位置は成熟した重鎖においては典型的なものであるが、ＣＤＲの長さに応じて変化しうる。Ｐ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ変異を有する抗体の例としては、配列番号２１８、２１９又は２２０に示される重鎖アミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。
完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、及び親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは、融合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。抗原に対する抗体親和性は、ランダム又は部位特異的な突然変異誘発などの周知の方法を用いた合理的設計又はランダムな親和性成熟によるか、あるいはファージディスプレイライブラリを用いることによって高めることができる。例えば、大部分がフレームワーク領域中に存在するバーニア残基又は「親和性決定残基」、ＡＤＲに対して置換を行うことで、抗体の親和性を調整することができる（米国特許第６，６３９，０５５号、国際特許公開第１０／０４５３４０号）。
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又はタンパク質の所望の生物学的若しくは生物物理学的性質を高めるように改変された完全なヒト、ヒト適合化、ヒト化、親和性成熟抗体分子又は抗体フラグメントは本発明の範囲に含まれる。抗体の安定性は、（１）内在的な安定性に影響する個々のドメインのコアパッキング、（２）重鎖と軽鎖とのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素結合ネットワーク、及び（５）分子内及び分子間力の中でも特に表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの要因によって影響される（Ｗｏｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０５：９８９〜１０１０、２００１）。残基を不安定化させる可能性のある構造は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって識別することが可能であり、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響を、識別された残基中で変異を有する変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される熱転移中点（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性との相関を示し、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並びにそのタンパク質のアンフォールドのしやすさに依存する分解プロセスと負の相関を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。数多くの研究により、ＤＳＣにより熱安定性として測定される製剤の物理的安定性の順位付けと他の方法により測定される物理的安定性との間に相互関係があることがわかった（Ｇｕｐｔａら、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８、２００３；Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６〜３０８９、２００４；Ｍａａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、１４０：１５５〜１６８、１９９６；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２１：１３５３〜１３６１、２００４；Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１５：２００〜２０８、１９９７）。これらの配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク中又は抗原結合部位内のアミノ酸の差は、Ｆａｂドメインの熱安定性に著しい影響を及ぼす可能性がある（Ｙａｓｕｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：１４３〜１４６、１９９４）。
本発明の抗体アンタゴニストは、約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12 Ｍ以下のＫdでＴＬＲ３と結合することができる。抗体などの特定の分子のＴＬＲ３に対する親和性は、任意の適当な方法によって実験的に求めることができる。このような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用し得る。
特定のＴＬＲ３ホモログと所望の親和性で結合する抗体アンタゴニストは、抗体親和性成熟などの方法によって変異体又はフラグメントのライブラリから選択することができる。抗体アンタゴニストは、任意の適当な方法を用いてＴＬＲ３の生物学的活性の阻害に基づいて同定することができる。かかる方法では、周知の方法を使用した、本出願に記載されるようなレポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用し得る。
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。
本発明の別の実施形態は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１５９、１９８、２００、２０２、１６４、２１２、２１３、２１４、２１５又は２１６に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、１２２、１２３、１９７、１９９、２０１、１６３、２０９、２１０、２１１又は２２５に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを有するホスト細胞である。
本発明の別の実施形態は、配列番号１０２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１６０、２０４、２０６、２０８、２２０、１６６又は１６８に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域、又は配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、２０３、２０５、２０７、１６５、１６７又は２２７に示されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するホスト細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、ＴＬＲ３と反応性を有する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
本発明の別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５、及びＫ６１９に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。
別の実施形態は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）の、配列番号２のアミノ酸残基；Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９に結合する、単離された抗体又はそのフラグメントである。
幾つかの周知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。ＴＬＲ３のような大きなタンパク質では、最初にドッキング、セグメント突然変異誘発、又はＨ／Ｄ交換などによって結合部位の位置をそのタンパク質の特定の領域に限定することで点突然変異誘発によるマッピングが単純化される。両方の個別の要素の構造が分かっている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って適合する相互作用の部位を同定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を同定することができる。
本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５４、Ｙ５６、Ｎ５８、Ｐ６１、Ｅ９５、Ｙ９７、Ｙ１００及びＤ１００ｂ、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５により、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープＣｈｏｔｈｉａ残基は、重鎖残基の配列番号２１６のＷ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４及びＤ１０６並びに軽鎖残基の配列番号４１のＱ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５に対応する。
本発明の別の実施形態は、単離された抗体又はそのフラグメントであって、重鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｎ３１ａ、Ｑ５２、Ｒ５２ｂ、Ｓ５３、Ｋ５４、Ｙ５６、Ｙ９７、Ｐ９８、Ｆ９９及びＹ１００、並びに軽鎖可変領域のＣｈｏｔｈｉａ残基；Ｇ２９、Ｓ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｅ５０、Ｄ５１、Ｙ９１、Ｄ９２及びＤ９３により、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＴＬＲ３に結合することを特徴とする。重鎖パラトープ及び軽鎖パラトープＣｈｏｔｈｉａ残基は、重鎖残基の配列番号２１４のＮ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｙ６０、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６及びＹ１０７並びに軽鎖残基の配列番号２１１のＧ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及びＤ９２に対応する。
例えば、パラトープ残基を好適な骨格にグラフトし、作製した骨格を完全な抗体に組立て、得られた抗体を発現させ、及びＴＬＲ３への結合又はＴＬＲ３の生物活性に及ぼす影響について抗体を試験することにより、ＴＬＲ３を結合する特定のパラトープ残基を有する単離された抗体を作製することができる。代表的な骨格は、ヒト生殖細胞系列遺伝子によりコードされたヒト抗体可変領域のアミノ酸配列である。例えば、全体配列同一性、パラトープ残基間の同一性（％）、又は骨格及びｍＡｂ １５ＥＶＱ又はｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶなどの代表的な抗体との間の正準構造クラス同一性に基づいて、骨格を選択することができる。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２７：７７６〜７９８，並びにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ＿：／／＿ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）に開示されている。例えば、米国特許第６，３００，０６４号で述べられているように、コンセンサスなヒトフレームワーク領域も使用することができる。好適な骨格の選択は、例えば、国際特許公開第１０／０４５３４０号に述べられている方法に従って行うことができる。
パラトープ残基をグラフトする骨格として使用可能な代表的なヒト生殖細胞系列遺伝子は、Ｖκ１、Ｖλ３、Ｖｈ５、Ｖｈ６、Ｊκ、Ｊλ、及びＪｈフレームワークによりコードされた遺伝子である。この生殖細胞系列Ｊ領域は、ＦＲ４配列を選択するために、その全体又は一部を使用される。例えば、ｍＡｂ １５ＥＶＱ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧκＪ１によりコードされたＪ領域配列に直接連結されている、ＩＧＫＶ１−３９*０１によりコードされたＶκ１フレームワークにグラフトすることができる。他のＶκ１遺伝子由来の配列を使用することもでき、ＩＧκＪ１の代わりに、他のＪκ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。ｍＡｂ １５ＥＶＱ重鎖パラトープ残基と、続いて、ＨＣＤＲ３及びＩＧＨＪ１によりコードされたＦＲ４配列を構成する約１１〜１３個の残基、例えば、１２個の残基を、ＩＧＨＶ５−５１*０１によりコードされたＶｈ５フレームワークにグラフトすることができる。１１〜１３個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端の間に懸り、ｍＡｂ １５ＥＶＱＶｈ由来の４個の規定されたパラトープ残基を含む。他のＶｈ５遺伝子由来の配列を使用することもでき、ＩＧＪＨ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。別の例では、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ軽鎖パラトープ残基を、ＩＧＪＬ２によりコードされたＪ領域配列に直接連結したＩＧＬＶ３−１*０１によりコードされたＶλ３フレームワークにグラフトすることができる。他のＶλ３及びＪλ遺伝子の配列を使用することもできる。ＬＣＤＲ３の長さは、約９〜１１個の残基、例えば、１０個の残基で維持される。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（大部分のＶラムダ骨格に対する「ＹＹＣ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＬ領域に対する「ＦＧＧ」）の初端との間に懸り、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ由来の３個の規定されたパラトープ残基を含む。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ重鎖パラトープ残基と、続いてＨＣＤＲ３及びＩＧＪＨ１によりコードされたＦＲ４配列を構成する約９〜１１個の残基、例えば、１０個の残基を、ＩＧＨＶ６−１*０１によりコードされたＶｈ６フレームワークにグラフトすることができる。これらの約９〜１１個の残基は、ＦＲ３領域（「ＣＡＲ」）の終端とＦＲ４領域（大部分のＪＨ領域に対するＷＧＱ）の初端との間に懸り、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶＶｈからの４個の規定されたパラトープ残基を含む。ＩＧＨＪ１の代わりに他のＪｈ遺伝子のＦＲ４配列を置換することもできる。ＴＬＲ３への結合及び得られた抗体の生物活性を、標準的な方法を用いて評価することができる。ｍＡｂ １５ＥＶＱ及びｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と、代表的なＶκ１、Ｖｈ５、Ｖλ３、Ｖｈ６、Ｊκ、Ｊλ又はＪｈ遺伝子とのアライメントを、図３２〜３５に示す。ラトープをグラフトした、作製された抗体を、バーニア残基又は親和性決定残基の置換により更に改変して、抗体の特性、例えば、上述のように親和性を改善することができる。パラトープをグラフトした抗体がＴＬＲ３への結合を保持する限り、パラトープをグラフトした抗体中のフレームワークアミノ酸配列は、ｍＡｂ １５ＥＶＱ又は１２ＱＶＱ／ＱＳＶフレームワーク配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であってもよい。
標準的な方法を用いて、パラトープ残基に追加して抗原結合部位由来の配列をグラフトすることもできる。例えば、完全なＨＣＤＲ３又はＬＣＤＲ３をグラフトしてもよい。
本発明の別の態様は、特定の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３のアミノ酸配列、特定の軽鎖ＣＤＲ１、２及び３のアミノ酸配列、特定の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列、又は特定の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体とＴＬＲ３との結合について競合する、ＴＬＲ３に対する反応性を有する単離された抗体又はそのフラグメントである。本発明のモノクローナル抗体の例としては、配列番号２１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する単離された抗体、並びに配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体がある。
ＴＬＲ３との結合についての競合は公知の方法によってインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体のＴＬＲ３への結合を、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。本発明の抗体の例としては、ｍＡｂ １２、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１がある（表３ａを参照）。先述の抗ＴＬＲ３抗体ｃ１０６８及びその誘導体（国際特許公開第０６／０６０５１３Ａ２号）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１４−９０３９）、並びにＩｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ；ヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して生成された）は、実施例５に示されるようにｍＡｂ １２、１５、又はｃ１８１１のいずれともＴＬＲ３に対する結合について競合しない。
本発明の別の態様は、ＴＬＲ３反応性を有し、以下のａ〜ｉの特性のうち少なくとも１つを有する、単離された抗体である；
ａ．Ｋｄ＜１０ｎＭでヒトＴＬＲ３に結合する；
ｂ．インビトロでのポリ（Ｉ：Ｃ）ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬで、ヒトＴＬＲ３の生物活性を５０％超低減させる；
ｃ．１０μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を６０％超阻害する；
ｄ．０．４μｇ／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬ未満のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞からのＩＬ−６又はＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０の産生を５０％超阻害する；
ｅ．５μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｆ．１μｇ／ｍＬで、６２．５ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたＮＨＢＥ細胞からのＩＬ−６の産生を５０％超阻害する；
ｇ．１μｇ／ｍＬで、ＰＢＭＣ細胞による、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−６又はＩＬ−１２の産生を２０％超阻害する；
ｈ．インビトロでのＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０ ＜１０μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する；
ｉ．インビトロでのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＩＣ５０ ＜５μｇ／ｍＬで、カニクイザルのＴＬＲ３の生物活性を阻害する。
治療方法
本発明のＴＬＲ３アンタゴニスト、例えば、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは、免疫系を調節する目的で使用することができる。何らのかの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、本発明のアンタゴニストは、ＴＬＲ３へのリガンドの結合、ＴＬＲ３の２量化、ＴＬＲ３の細胞内移行、又はＴＬＲ３の輸送を防止又は低減することによって免疫系を調節し得るものと考えられる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。かかる動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜等の哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、ＴＬＲ３活性の中和、炎症、炎症性及び代謝性疾患の治療に有用であるだけでなく、更にこうした治療のための薬剤の調製においても有用であり、その場合、薬剤は本明細書で定義する用量で投与されるように調製される。
一般的に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって予防又は治療することが可能な炎症状態、感染にともなう状態、又は免疫介在性炎症性疾患には、サイトカイン又はケモカインによって媒介されるもの、及びＴＬＲ３の活性化又はＴＬＲ３経路を介したシグナル伝達に全体的又は部分的に起因する状態が含まれる。こうした炎症性状態の例としては、敗血症にともなう状態、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、及び感染にともなう状態が挙げられる。更に、本発明のＴＬＲ３抗体アンタゴニストの投与によって癌、心血管及び代謝性の状態、神経病及び線維症の状態を予防又は治療することも可能であると考えられる。炎症は組織を冒し、全身性の症状となりうる。罹患する組織の例としては、気道、肺、消化管、小腸、大腸、結腸、直腸、心血管系、心組織、血管、関節、骨及び滑膜組織、軟骨、上皮、内皮、肝又は脂肪組織が挙げられる。全身性の炎症状態の例としては、サイトカインストームすなわち高サイトカイン血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、劇症型抗リン脂質症候群、重篤なウイルス感染、インフルエンザ、肺炎、ショック、又は敗血症がある。
炎症は、侵入する病原体を撃退するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性及び体液性のメディエーターが関与するカスケードイベントである。一方で炎症反応の抑制はホストを免疫的に無防備状態にし、炎症を放置した場合には慢性炎症性疾患（例えば、喘息、乾癬、関節炎、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、敗血性ショック、及び多臓器不全などの重篤な合併症を引き起こし得る。重要な点として、これらの多様な疾患状態は、サイトカイン、ケモカイン、炎症細胞、及びこれらの細胞によって分泌される他のメディエーターなどの共通の炎症性メディエーターを共有している。
リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）、２本鎖ＲＮＡ又は内因性のｍＲＮＡによってＴＬＲ３が活性化されるとシグナル伝達経路が活性化され、これにより炎症性サイトカインの合成及び分泌、マクロファージ、顆粒球、好中球及び好酸球などの炎症細胞の活性化及び動員、細胞死、並びに組織の破壊が引き起こされる。ＴＬＲ３は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＣＸＣＬ５／ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ、並びに免疫細胞の動員及び活性化に関わる他の炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導することにより、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患における組織の破壊に寄与する。ＴＬＲ３のリガンドである内因性のｍＲＮＡは炎症時に壊死細胞から放出され、ポジティブフィードバックループを引き起こすことによってＴＬＲ３を活性化し、炎症及び更なる組織破壊を持続させる。ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのようなＴＬＲ３アンタゴニストはサイトカインの分泌を正常化し、炎症細胞の動員を低減し、組織破壊及び細胞死を低減させると考えられる。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは炎症及び広範な炎症性状態を治療するうえで治療上の可能性を有するものである。
炎症性状態の１つの例は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血性ショック又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）が含まれうる、敗血症にともなう状態である。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染によって、及び壊死細胞によって放出される２本鎖ＲＮＡは敗血症の発症に寄与しうる。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は、敗血症にともなう炎症状態を有する患者における生存時間を延ばすか又は局所的な炎症性イベント（例えば、肺の）が広がって全身症状となることを防止することにより、あるいは内在的な抗微生物活性を強化することにより、あるいは抗微生物剤と組み合わされる場合に相乗的な活性を示すことにより、あるいは病状に寄与する局所的炎症状態を抑制することにより、あるいは上記の任意の組合わせにより、所定の治療効果を与えうるものと考えられる。こうした介入は、患者の生存を確実にするために必要な更なる治療（例えば、潜在する炎症の治療又はサイトカインレベルの低減）を可能とするうえで充分なものとなり得る。敗血症はＤ−ガラクトサミン及びポリ（Ｉ：Ｃ）を投与することによってマウスなどの動物でモデル化することができる。こうしたモデルにおいて、Ｄ−ガラクトサミンは、敗血症感作物質として機能する肝臓毒素であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）は２本鎖ＲＮＡを模倣してＴＬＲ３を活性化させる敗血症誘導分子である。ＴＬＲ３アンタゴニストによる治療は敗血症のマウスモデルにおける動物の生存率を高めうるものであり、したがってＴＬＲ３アンタゴニストは敗血症の治療に有用であると考えられる。
消化管の炎症は消化管の粘膜走の炎症であり、急性及び慢性の炎症状態が含まれる。急性炎症は、短時間の発症及び好中球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。慢性炎症は、比較的長期の発症及び単核球の浸潤又は流入によって一般的に特徴付けられる。粘膜層は、腸（小腸及び大腸を含む）、直腸、胃（胃部）壁、又は口腔の粘膜であってよい。慢性の消化管炎症状態の例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、外界からの刺激によって誘導される大腸炎（例えば、化学療法、放射線療法などの投与のような治療レジメンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう（例えば、副作用として）消化管炎症（例えば、大腸炎））、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、膠原性又はリンパ性大腸炎、壊死性腸炎、慢性肉芽腫症又はセリアック病などの状態における大腸炎、食品アレルギー、胃炎、感染性胃炎又は小腸結腸炎（例えば、ヘリコバクター・ピロリの感染による慢性活動性胃炎）、及び感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態がある。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、例えば、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）などの、一般に病因が不明の一群の慢性炎症性疾患が含まれる。臨床的及び実験的証拠は、ＩＢＤの病因が感受性遺伝子及び環境因子が関与する多因子的なものであることを示唆している。炎症性腸疾患では、組織の傷害は、腸内の微生物叢の抗原に対する不適切又は過剰な免疫反応によってもたらされる。炎症性腸疾患の幾つかの動物モデルが存在している。最も広く用いられているモデルは、結腸に慢性炎症及び潰瘍形成を誘発する２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル又はオキサゾロンモデルである（Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：５１〜６２、２０００）。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球の浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成として発現する急性大腸炎を誘発する硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。ＤＳＳ誘発大腸炎は、リンパ組織過形成、陰窩傷害、及び上皮潰瘍形成をともなう、基底膜内への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴付けられる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５：７９〜９４，２００２）。別のモデルは、ナイーブなＣＤ４５ＲＢhigh ＣＤ４ Ｔ細胞をＲＡＧ又はＳＣＩＤマウスに養子移入することを含む。このモデルでは、ドナーのナイーブＴ細胞がレシピエントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性腸疾患に似た慢性腸炎症及び症状を引き起こす（Ｒｅａｄ及びＰｏｗｒｉｅ、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ １５ユニット１５．１３、２００１）。これらのモデルのいずれかにおいて本発明のアンタゴニストの投与を用いることによって、これらのアンタゴニストが、炎症性腸疾患等の腸内の炎症に伴う症状を改善し、疾患の経過を変化させる潜在的な有効性を評価することができる。ＩＢＤに対しては幾つかの治療選択肢が存在し、例えば、抗ＴＮＦα抗体による治療法が、クローン病を治療する目的で１０年前から用いられている（Ｖａｎ Ａｓｓｃｈｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ２００９）。しかしながら、かなりの割合の患者が現在の治療法に応答しない（Ｈａｎａｕｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５９：１５４１〜１５４９，２００２；Ｈａｎａｕｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０：３２３〜３３３，２００６）ことから、難治性の患者集団を標的とした新たな治療法が求められている。
炎症状態の別の一例は炎症性の肺状態である。炎症性の肺状態の例としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発される肺状態、アレルゲンにより誘発される肺状態、アスベスト症、珪肺症、又はベリリウム肺症などの汚染物質により誘発される肺状態、胃吸引により誘発される肺状態、嚢胞性線維症などの遺伝的素因にともなう免疫調節不全炎症状態、及び人工呼吸器傷害などの物理的外傷により誘発される肺状態が挙げられる。これらの炎症状態には更に、喘息、気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、院外感染性肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒトメタニューモウイルス感染、呼吸系発疹ウイルス感染、及びアスペルギルス又は他の真菌感染も含まれる。感染にともなう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、嚢胞性線維症、気管支炎、気道増悪、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次ウイルス感染のように複数の感染をともなう場合がある。
喘息は、気道過敏症（ＡＨＲ）、気管支収縮、喘鳴、好酸球又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥレベルによって特徴付けられる肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えば、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルスインフルエンザなど）により症状の悪化である「増悪」を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例えば煙草の煙））、刺激性ガス、フューム、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される。喘息とは別に、肺を侵すいくつかの慢性炎症性疾患は、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎及び嚢胞性線維症など、気道への好中球浸潤により特徴付けられ（Ｌｉｎｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．１５：９７３〜９７７、２０００；Ｒａｈｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：２６８〜２７６、２００５）ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、及び嚢胞性線維症などの疾患は、気道過敏性により特徴付けられる（Ｆａｈｙ及びＯ’Ｂｙｒｎｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６３：８２２〜８２３、２００１）。喘息及び気道炎症の一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミンチャレンジモデル及びメタコリン感作モデルが挙げられる（Ｈｅｓｓｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９３：４０１〜４１２、１９９５）。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明のアンタゴニストをこれらのモデルのいずれかに投与することによって、喘息、気道炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善し、経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
本発明の方法によって予防又は治療しうる他の炎症状態及び神経障害は、自己免疫疾患によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性疾患、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性及び中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、原発性胆汁性硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、線維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等の肝臓疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及び心筋梗塞等の心血管疾患、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性皮膚状態、移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに、細胞、ウイルス又はプリオンによって介在される感染症又は疾患が挙げられる。
変形性関節症、関節リウマチ、怪我による関節炎を有する関節などを含む関節炎は、本発明のアンタゴニストのような抗炎症性タンパク質の治療的使用によって利するところのある一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。関節リウマチは組織の傷害を引き起こすため、ＴＬＲ３リガンドが炎症部位に存在しうる。ＴＬＲ３シグナル伝達の活性化によって、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続しうる。関節リウマチの幾つかの動物モデルが当該技術分野において知られている。例えばコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。本発明のＴＬＲ３アンタゴニストをＣＩＡモデルマウスに投与することによって、疾患の症状を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
真性糖尿病すなわち糖尿病は、複数の原因因子によって誘導され、高血糖によって特徴付けられる疾患プロセスのことを指す（ＬｅＲｏｉｔｈら（編）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６）、及びそれにおいて引用されるすべての参考文献。制御されない高血糖は、腎障害、神経障害、網膜障害、高血圧、脳血管疾患及び冠状動脈性心疾患などの微小血管及び大血管性疾患のリスクが増大するために死亡率が増加し、若年死をともなう。したがって、グルコースホメオスタシスの制御は糖尿病の治療にとって極めて重要なアプローチである。
基礎となる欠陥により、糖尿病は、患者の膵線にインスリンを産生するβ細胞が存在しない場合に発症する１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）と、β細胞のインスリン分泌不全及び／又はインスリンの作用に対する抵抗性を有する患者において発症する２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）の２つの大きなグループに分類される。
２型糖尿病は、絶対的ではなく、相対的なインスリン欠乏をともなうインスリン抵抗性によって特徴付けられる。インスリン抵抗性の患者では、身体はこの欠陥を補償するために異常に高量のインスリンを分泌する。インスリン抵抗性を補償し、血糖値を適正に制御するために不適切な量のインスリンが存在すると、境界型糖尿病の状態が現れる。多くの患者でインスリン分泌は更に低下し、血漿グルコース濃度が上昇し、糖尿病の臨床状態がもたらされる。肥満症にともなう炎症は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、脂質代謝異常、及び心血管疾患の発症に深く関わっていることが示唆されている。肥満脂肪はマクロファージを動員及び維持し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、遊離脂肪酸及びアディポカインを過剰に産生する場合があり、インスリンシグナル伝達を妨害してインスリン抵抗性を誘発し得る。マクロファージのＴＬＲ３活性化は、こうした脂肪の炎症誘発状態に寄与しうる。インスリン抵抗性の幾つかの動物モデルが知られている。例えば、食餌誘発肥満モデル（ＤＩＯ）では、動物は体重増加をともなう高血糖症及びインスリン抵抗性を発症する。ＤＩＯモデルに本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを投与することによって、２型糖尿病にともなう合併症を改善して疾患の経過を変化させるためのこれらのアンタゴニストの使用を評価することができる。
脂肪性肝疾患は肝疾患の範囲を包含し、通常は、アルコール性又は非アルコール性のいずれかで分類される。どちらの場合も、脂肪性肝疾患は、単なる肝脂肪変性（脂質の蓄積及び堆積）からアルコール性及び非アルコール性の脂肪性肝炎（ＡＳＨ又はＮＡＳＨ）までの範囲に及ぶが、これは肝線維症、肝硬変、及び恐らくは肝細よ胞がんまで進行することが多い。アルコール性（ＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、組織学的に見て区別がつかないが、定義にると、ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんど又は全く摂取しない患者で発症する。その代わりに、ＮＡＦＬＤは、肥満症、メタボリック症候群、及び２型糖尿病の個人で頻繁に見られ、インスリン抵抗性と密接に関連している（Ｕｔｚｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９１：４７５３〜４７６１、２００６）。肥満症及びインスリン抵抗性の有病率における近年の劇的な増加とともに、ＮＡＦＬＤは、最もよく見られる慢性肝疾患として、ＡＦＬＤ及びウイルス性の肝炎誘発性肝疾患を上回っている。肥満症の人のおよそ７５％がＮＡＦＬＤを有し、２０％もの人がＮＡＳＨを有する可能性があると推定されている（Ｃｌａｒｋ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ４０（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ５〜Ｓ１０、２００６；Ｌａｚｏら、Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２８：３３９〜３５０、２００８）。
アテローム性冠状動脈硬化性心疾患（ＣＨＤ）は、西洋社会における死及び心血管罹患率の主な原因である。アテローム性冠状動脈硬化性心疾患の危険因子には、高血圧、真性糖尿病、家族歴、男性であること、喫煙、血清コレステロールの上昇、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロールレベルの上昇及び高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロールレベルの低下が挙げられる。一般に、約２２５〜２５０ｍｇ／ｄｌを超える総コレステロールレベルは、ＣＨＤの危険性の大幅な上昇に関係する。様々な臨床研究により、総コレステロールレベル及びＬＤＬコレステロールレベルの上昇がヒトのアテローム性動脈硬化を促進させることが立証されている。疫学的調査は、血管罹患率及び死亡率が総コレステロール及びＬＤＬコレステロールのレベルと直接関係して変化することを立証している。
癌の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞又はＴ細胞のＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡｍＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣｍＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛を含む（ただし、これらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも１つの悪性疾患が挙げられる。
心血管疾患の例としては、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動（持続性又は痙攣性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症反応、多源性（ｃｈａｏｔｉｃ又はｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）心房頻拍、規則的で狭いＱＲＳ頻拍、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心臓周囲疾患、心臓腫瘍、大動脈及び抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、抹消血管障害、閉塞性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、機能性抹消動脈障害、レイノー現象及び障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤血管、動静脈瘤、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ後症候群、及び虚血性再潅流傷害を含む（ただし、これらに限定されない）、細胞、組織、臓器、動物又は患者における心血管疾患が挙げられる。
代表的な神経性疾患の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、ＡＩＤＳ痴呆複合症、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性疾患；例えば、皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳疾患；基底核の疾患又は小脳疾患；脳幹神経節の障害；例えば、ハンチントン舞踏病及び老年舞踏病などの運動亢進性運動障害；例えばＣＮＳドーパミンレセプターを遮断する薬物によって誘導される運動障害などの薬物誘導性運動障害；例えばパーキンソン病などの運動低下性運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）などの脊髄小脳の変性；全身性疾患（Ｒｅｆｓｕｍ’ｓ疾患、無β−リポタンパク血症、麻痺、毛細管拡張症及びミトコンドリア性多系疾患）；例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの髄鞘脱落性コア疾患；及び神経性筋萎縮などの運動ユニットの障害（例えば筋委縮性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮及び若年性脊髄性筋委縮などの前角細胞変性）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年性認知症；ウェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデン・シュパッツ病；ボクサー痴呆を含む（ただし、これらに限定されない）細胞、組織、臓器、動物又は患者における神経疾患が挙げられる。
線維症状態の例としては、肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むが、これらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術による線維化付着などが挙げられる。このような１つの方法において、線維症は器官特異性線維症又は全身性線維症のいずれであってもよい。器官特異性線維症は、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、心臓線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、又はその他の線維症のうち少なくとも１つに関連し得る。肺線維症は、特発性肺線維症、薬剤誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患のうち少なくとも１つに関連し得る。肝臓線維症は、肝硬変、住血吸虫症、又は胆管炎のうち少なくとも１つに関連し得る。肝硬変は、アルコール性肝硬変、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎である。腎線維症は、糖尿病性腎障害又はループス糸球体腎炎にともないうる。心線維症は、心筋梗塞にともないうる。血管線維症は、血管形成術後動脈再狭窄、又はアテローム性動脈硬化にともないうる。皮膚線維症は、火傷瘢痕化、肥厚性瘢痕化、ケロイド、又は腎性線維性皮膚症にともないうる。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後又は増殖性硝子体網膜症にともないうる。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症にともないうる。他の線維症は、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮又は皮膚筋炎から選択され得る。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片体宿主病から選択されうる。
投与／医薬組成物
ＴＬＲ３活性の抑制が所望される病態の治療又は予防に効果的な剤の「治療上の有効量」は、標準的な研究技術により判定され得る。例えば、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチなどの炎症状態の治療又は予防において有効となる薬剤の用量は、本明細書に述べるモデルのような関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。
更に、場合によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。こうした因子には、治療又は防止しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の因子が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
本発明の方法では、ＴＬＲ３アンタゴニストは単独で、又は少なくとも１種類の他の分子と組み合わせて投与することができる。こうした更なる分子は、他のＴＬＲ３アンタゴニスト分子か、又はＴＬＲ３受容体のシグナル伝達によって媒介されない治療効果を有する分子であってよい。抗生剤、抗ウイルス剤、緩和剤、及びサイトカインのレベル又は活性を低減する他の化合物はこうした更なる分子の例である。
本発明の薬剤の治療上の使用のための投与方法は、薬剤をホストに送達する任意の好適な経路でよい。これらの薬剤の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。
本発明の薬剤は、有効量の薬剤を薬学的に許容される担体中の有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。用語「キャリア」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用賦形剤は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌液であり、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの製薬学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こうした製薬学的組成物に含まれる本発明の薬剤濃度は、重量にして約０．５％未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異なってよく、選択される投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＴＬＲ３アンタゴニストを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば、「レミントン製薬科学」第１５版マック出版（ペンシルベニア州イーストン）に、より詳細に記載されている。
本発明の抗体アンタゴニストは凍結乾燥して保存することができ、使用の前に適切な溶媒中で還元することができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタンパク製剤に有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び溶解法を用いることができる。
ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
（実施例１）
抗ｈｕＴＬＲ３アンタゴニストｍＡｂの同定及び誘導
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｇｏｌｄファージディスプレイライブラリ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をヒト抗体フラグメントの供給源として使用し、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを有するヒトＴＬＲ３（ｈｕＴＬＲ３）（配列番号４）のアミノ酸１〜７０３を発現させることによって生成した精製ＴＬＲ３抗原に対してパニングさせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。アミノ酸１〜７０３は、ｈｕＴＬＲ３の予想される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と一致している。ｈｕＴＬＲ ３ＥＣＤと特異的に結合するＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）を、多様な抗体フラグメント群を固有のものとして同定、配列決定及び確認できるように様々な方法でＴＬＲ３タンパク質を提示することによって選択した。異なるパンニングの手法により、６２種類の候補物質（Ｖ領域配列が異なる）がｈＴＬＲ３のＥＣＤに結合する固有の物質として同定された。
ｈｕＴＬＲ３のＥＣＤ結合物質として同定されたこれら６２種類の候補物質を、抗炎症活性の特定に関するさまざまな細胞アッセイにより中和活性についてスクリーニングした。予備活性データ（下記実施例２を参照）を用いて、ファミリー１６〜１９を形成する４種類の候補物質（Ｆａｂ １６〜１９）を、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）のＣＤＲ成熟の親として６２種類の候補物質から選択した。これらの親候補物質の１つ（候補物質１９）でＨＣＤＲ２にＮ結合型グリコシル化部位が認められたため、この候補物質にＳｅｒ→Ａｌａ（Ｓ→Ａ）の突然変異を導入してこの部位を除去した。４種類の親候補物質のＣＤＲ成熟の後、全部で１５種類の子孫候補物質（候補物質１〜１５）が同定され、これを下記実施例２で述べるように更なる特性評価に供した。１９種類の候補物質のそれぞれに存在する軽鎖及び重鎖の可変領域のリストを上記表３に示した。ここで各候補物質は、Ｆａｂであるか完全長の抗体鎖としてクローニングされた（実施例３）ものであるかに応じてｍＡｂ １〜１９又はＦａｂ １〜１９と呼ぶものとする。発現ベクターの設計のため、すべての候補物質について可変領域の成熟したアミノ末端は重鎖ではＱＶＥであり、軽鎖ではＤＩであった。これらの末端の好ましい配列は、候補配列と高い相同性を有するそれぞれの生殖細胞遺伝子内の配列である。ファミリー１７及び１８では、生殖細胞系の配列はＶＨでＱＶＱ、ＶＬでＳＹである。ファミリー１９ではこの配列はＶＨでＥＶＱ、ＶＬでＤＩである。ＳＹ配列はλサブグループ３に固有であり、アミノ末端残基としてのＳ又はＹは種間で異なることが報告されている。したがって、有名なλサブグループ１からのＱＳＶコンセンサス末端は、ファミリー１７及び１８のＶＬのＤＩＥのより好適な置換になるものと考えられる。これらの改変を、ファミリー１８から候補物質９、１０及び１２に、ファミリー１９から候補物質１４及び１５に導入した。このプロセスでは、これらの抗体のＶＨ及びＶＬ領域のコドンを最適化した。候補物質９、１０及び１１の軽鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２０９〜２１１に示し、候補物質９、１０、１２、１４及び１５の重鎖可変領域のＮ末端生殖細胞変異体のアミノ酸配列を配列番号２１２〜２１６にそれぞれ示す。これらの候補物質のＮ末端変異体をここでは、候補物質／ｍＡｂ／Ｆａｂ ９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱと呼ぶ。これらのＮ末端生殖細胞変異体をｍＡｂとして発現させたところ、それぞれの親候補物質と比較した場合にＴＬＲ３への結合についても、ＴＬＲ３の生物学的活性を阻害する能力においても何らの影響を示さなかった（データは示されていない）。
（実施例２）
インビトロでのＴＬＲ３アンタゴニスト活性の判定
上記に述べた１５種類のＣＤＲ成熟させた候補物質を潜在的なヒトの治療物質として選択し、広範な結合及び中和活性を調べた。４種類の親ＦａｂであるＦａｂ １６〜１９及び１５種類のＣＤＲ成熟であるＦａｂ １〜１５又はこれらの非生殖細胞Ｖ領域変異体について、活性のアッセイ及び結果を下記に述べる。
ＮＦ−ｋＢ及びＩＳＲＥシグナル伝達カスケードの阻害
熱で不活化したＦＢＳを添加したＤＭＥＭ及びＧｌｕｔａＭａｘ培地（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）中で２９３Ｔ細胞を増殖させ、３０ｎｇのｐＮＦ−ｋＢ又はＩＳＲＥホタルルシフェラーゼレポータープラスミド、１３．５ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ベクター、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫ、及び１．５ｎｇのＦＬ ＴＬＲ３をコードしたｐＣＤＮＡ（配列番号２）をトランスフェクトした。ｐｈＲＬ−ＴＫプラスミドは、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモーターによって制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有している（プロメガ社（Promega）ウィスコンシン州マディソン）。ＴＬＲ３抗体を３０〜６０分インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を加えた。各プレートを３７度で６時間又は２４時間インキュベートした後、ＤｕａｌＧｌｏルシフェラーゼ試薬を加えて各プレートをＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。ホタルの相対発光量（ＲＬＵ）をウミシイタケのＲＬＵで割ることによって正規化された値（ルシフェラーゼ比）を求めた。ホタルルシフェラーゼの産生を刺激するＮＦ−ｋＢ又はＩＳＲＥシグナル伝達カスケードは、ＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍＬ）による刺激前に、細胞を抗ＴＬＲ３抗体（０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬ）とインキュベートすることによって特異的に阻害された。ＮＦ−ｋＢアッセイの結果を図１に示し、５４６５をポジティブコントロール（抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂを中和する）として、また抗ヒト組織因子ｍＡｂ（８５９）をヒトＩｇＧ４アイソタイプコントロールとして、ホタル／ウミシイタケ比の阻害率（％）として表した。０．４〜１０μｇのｍＡｂ濃度で５０％よりも高い阻害率が得られた。ｃ１０６８及びＴＬＲ３．７は、１０μｇ／ｍｌでＴＬＲ３の生物学的活性の約３８％及び８％を阻害した。同様の結果がＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイで得られた（データは示されていない）。
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるサイトカイン放出
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＳＶ−４０で形質転換した正常なヒト気管支上皮細胞）を、Ｉ型コラーゲンをコーティングした培養皿に播種し、抗ヒトＴＬＲ３抗体の存在下又は非存在下でインキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。処理の２４時間後に上清を回収し、カスタム多重ビーズアッセイを用いてサイトカイン及びケモカインレベルについてアッセイして、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ−２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を検出した。結果を、０．４、２．０及び１０μｇ／ｍＬのｍＡｂで処理した後の、サイトカイン／ケモカインの個別の阻害率（％）として図２に示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。
ＮＨＢＥ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）においてもアッセイした。ＮＨＢＥ細胞を増殖させ、コラーゲンコーティングした培養皿に移して４８時間インキュベートした後、培地を除去して０．２ｍｌの新鮮な培地を補充した。次いで細胞を抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂの存在下又は非存在下で６０分間インキュベートした後、ポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液を回収し、−２０℃で保存するか、又は直ちにＩＬ−６のレベルについてアッセイした。結果を、投与量０．００１〜５０μｇ／ｍＬでのｍＡｂ処理後の、ＩＬ−６分泌の阻害率（％）として図３にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、８５９はアイソタイプコントロールである。大部分のｍＡｂは１μｇ／ｍＬでＩＬ−６の産生の少なくとも５０％を阻害し、５μｇ／ｍＬで阻害率７５％を達成した。
ＰＢＭＣ細胞におけるサイトカイン放出
サイトカインの放出を、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）においてもアッセイした。ヒトドナーから全血をヘパリン回収試験管に回収し、これにＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ溶液を下側に層を形成するようにゆっくりと加えた。試験管を遠心してＦｉｃｏｌｌの直ぐ上に白色の層を形成しているＰＢＭＣを回収して播種した。この後、ＰＢＭＣを抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂの存在下又は非存在下でインキュベートした後、２５μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後に上澄み液を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いて、サイトカインレベルを求めた。５４６５をポジティブコントロールとし、ｈＩｇＧ４をアイソタイプコントロールとして用い、ｍＡｂの単回用量（０．４μｇ／ｍＬ）によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の累積阻害率（％）として、結果を図４にグラフ化して示す。
ＨＡＳＭ細胞におけるサイトカイン放出
簡潔に言うと、５００ｎｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの相乗的組み合わせを加える前に、ヒト気道平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞を、抗ヒトＴＬＲ３ ｍＡｂで、又はそれを用いずにインキュベートした。２４時間後、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いてサイトカインのレベルを測定した。結果を、ｍＡｂの３つの用量（０．４、２及び１０μｇ／ｍｌ）を用いてＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのレベルとして図５にグラフで示す。５４６５はポジティブコントロールであり、ｈＩｇＧ４はアイソタイプコントロールである。
ヒト細胞におけるインビトロアッセイからの結果によって、ｈｕＴＬＲ３に結合することによりサイトカイン及びケモカインの放出を低減させる本発明の抗体の能力が確認された。
（実施例３）
完全長の抗体コンストラクト
４種類の親Ｆａｂ（候補物質番号１６〜１９）及び１５種類の子孫Ｆａｂ（候補物質番号１〜１５）の重鎖をＳ２２９Ｐ Ｆｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。候補物質９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ又は１５ＥＶＱを、Ｆ２３５Ａ／Ｌ２３６及びＳ２２９Ｐ Ｆｃ突然変異を有するヒトＩｇＧ４バックグラウンド上にクローニングした。
成熟した完全長の重鎖アミノ酸配列を以下のように配列番号９０〜１０２及び２１８〜２２０に示す。
Figure 2014526464
発現のため、これらの重鎖はＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号１０３）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有する候補物質１４ＥＶＱ及び１５ＥＶＱの重鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０４及び１０５にそれぞれ示す。同様に、発現のために、本発明の抗体の軽鎖の配列は、ＭＧＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１０６）のようなＮ末端のリーダー配列を有してもよい。リーダー配列を有するコドン最適化された候補物質１５の軽鎖、及び成熟型（リーダー配列を有さない）をコードするヌクレオチド配列の例を、配列番号１０７及び１０８にそれぞれ示す。
（実施例４）
抗ＴＬＲ３ ｍＡｂの結合の特性評価
ヒトＴＬＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するｍＡｂの結合のＥＣ５０値をＥＬＩＳＡによって求めた。ヒトＴＬＲ３のＥＣＤタンパク質をＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの一定分量を９６穴プレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州アクトン）の各ウェルに分配した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を加えた洗浄緩衝液中で３回プレートを洗った。ウェルは、２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０からなる、２００μｌのＰＢＳ中のブロッキング溶液でブロックされた。室温で２時間ブロッキングした後、プレートを３回洗浄し、次いで、抗ＴＬＲ３ ｍＡｂ候補物質１〜９をブロッキング緩衝剤中で段階的に希釈した。
Figure 2014526464
この抗ＴＬＲ３ ｍＡｂを室温で２時間インキュベートして３回洗った。この後、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）ニュージャージー州ピスカタウェイ）を加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液中で３回洗った。結合は、ＴＭＢ−Ｓ（フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル社（Fitzgerald Industries Internationl, Inc.）マサチューセッツ州コンコード）中で１０〜１５分間インキュベートすることによって検出した。
反応を２５μＬの２ＮＨ2ＳＯ4で停止させ、ＳＰＥＣＴＲＡ Ｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、吸光度を４５０ｎｍで読み取り６５０ｎｍでの値を差し引いた。ＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプリズムソフトウェア（グラフパッド・ソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して非線形回帰によって求めた。
ｍＡｂを２．５μｇ／ｍＬ〜０．６ｐｇ／ｍＬまで４倍ずつ希釈した１００μＬの連続希釈液とインキュベートすることにより、ｈｕＴＬＲ３に対する結合についてＥＣ５０値を求めた（表４）。抗ヒト組織因子ｍＡｂ ８５９及びｈｕ ＩｇＧ４κをネガティブコントロールとして含めた。
ｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対する結合親和性もＢｉａｃｏｒｅ分析によって求めた。データ（示されていない）は、ｍＡｂ １〜１９ではｈｕＴＬＲ３ ＥＣＤに対するＫｄが１０-8Ｍ未満であることを示した。
（実施例５）
競合的エピトープ結合
抗ＴＬＲ３抗体競合グループ又は「エピトープビン」を決定するためにエピトープ結合実験を行った。
競合的ＥＬＩＳＡを行うため、実施例１に述べるようにして作製した５μＬ（２０μｇ／ｍＬ）の精製ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質を、ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の各ウェルに室温で２時間コーティングした。１５０μｌの５％ ＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（メソ・スケール・ディスカバリー社（Ｍｅｓｃｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ））を各ウェルに加えて室温で２時間インキュベートした。プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗った後、標識した抗ＴＬＲ３ ｍＡｂと異なる競合物質との混合液を加えた。標識した抗体（１０ｎＭ）を、濃度を増加させた（１ｎＭ〜２μＭ）非標識抗ＴＬＲ３抗体とインキュベートし、次いで２５μＬの量の混合液を、指定されたウェルに加えた。室温で穏やかに振盪しながら２時間インキュベートした後、プレートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗った。ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを蒸留水で希釈し（４倍）、１５０μｌ／ウェルの量で分配してＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００によって分析した。抗体を製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の使用説明書に従ってＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−エステルで標識した。
以下の抗ＴＬＲ３抗体を評価した。すなわち、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓヒト組み換え抗体ライブラリより入手したｍＡｂ １〜１９（表３に示すもの）；ｃ１０６８（国際特許公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号に述べられるもの）、ｃ１８１１（マウスＴＬＲ３タンパク質で免疫性を与えられたラットから作製されるハイブリドーマにより産生されるラット抗マウスＴＬＲ３ ｍＡｂ）、ＴＬＲ３．７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１４〜９０３９）、及びＩＭＧ−３１５Ａ（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手したヒトＴＬＲ３アミノ酸５５〜７０（ＶＬＮＬＴＨＮＱＬＲＲＬＰＡＡＮ）に対して生成したもの）。ｍＡｂ ９、１０、１２、１４及び１５については、変異体９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１４ＥＶＱ、又は１５ＥＶＱをこの実験で使用した。
競合アッセイに基づき、抗ＴＬＲ３抗体を５つの異なるビンに割り当てた。ビンＡ：ｍＡｂ １、２、１３、１４ＥＶＱ、１５ＥＶＱ、１６、１９；ビンＢ：ｍＡｂ ３、４、５、６、７、８、９ＱＶＱ／ＱＳＶ、１０ＱＶＱ／ＱＳＶ、１１、１２ＱＶＱ／ＱＳＶ、１７、１８；ビンＣ：抗体Ｉｍｇｅｎｅｘ ＩＭＧ−３１５Ａ；ビンＤ：抗体ＴＬＲ３．７、ｃ１０６８；及びビンＥ：抗体ｃ１８１１。
（実施例６）
エピトープマッピング
実施例５で述べた異なるエピトープビンからの代表的な抗体を更なるエピトープマッピングのために選択した。エピトープマッピングは、ＴＬＲ３分節スワッピング実験、突然変異誘発、Ｈ／Ｄ交換、及びインシリコタンパク質−タンパク質ドッキングを含む各種のアプローチを用いて行った（Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ６、Ｇｌｅｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）。
ＴＬＲ３セグメントスワッピング。ＴＬＲ３ヒト−マウスキメラタンパク質を用いてＴＬＲ３上の全体の抗体結合ドメインの位置を特定した。ヒトＴＬＲ３タンパク質の細胞外ドメインを３つのセグメントに分割した（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿００３２５６のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列に基づくアミノ酸番号によるａａ １〜２０９ａａ ２１０、〜４３６、ａａ ４３７〜７０８）。ヒトＴＬＲ３のアミノ酸２１０〜４３６及び４３７〜７０８を対応するマウスのアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸２１１〜４３７及び４３８〜７０９）と置き換えることによって、ＭＴ５４２０キメラタンパク質を生成した。ヒトアミノ酸の位置４３７〜７０８をマウスＴＬＲ３のアミノ酸（マウスＴＬＲ３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４、アミノ酸４３８〜７０９）で置き換えることによって、ＭＴ６２５１キメラを生成した。すべてのコンストラクトを、標準的なクローニング手法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）で生成させた。各タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内でＶ５−Ｈｉｓ６ Ｃ末端融合タンパク質として一過性に発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。
ｍＡｂ ｃ１０６８。ｍＡｂ ｃ１０６８は、高親和性のヒトＴＬＲ３ ＥＣＤに結合したが、マウスＴＬＲ３にはよく結合しなかった。ｃ１０６８は、ＭＴ５４２０及びＭＴ６２５１の両方に結合する能力をなくし、これは、結合部位が、ＷＴヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸４３７〜７０８内に位置することを示していた。
ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは両方のキメラに結合したが、このことはｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位が配列番号２に示される配列を有するヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置していることを示している。
インシリコタンパク質−タンパク質ドッキング。ｍＡｂ １５ＥＶＱ（以下参照）の結晶構造及び公開されたヒトＴＬＲ３構造（Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１２：３７５〜３７８、２００６）は、ドッキングのための出発モデルとして使用するために、ＣＨＡＲＭｍ中でエネルギー最小化された（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７〜２１７、１９８３）。タンパク質ドッキングは、ＺＤＯＣＫ ２．１（Ｃｈｅｎ及びＷｅｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５１：３９７〜４０８，２００３）と同様のＺＤＯＣＫ ｐｒｏ１．０（アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）により６°の角度グリッドで行った。ヒトＴＬＲ３（Ａｓｎ ５２、７０、１９６、２５２、２６５、２７５、２９１、３９８、４１３、５０７及び６３６）における既知のＮ結合型グリコシル化部位Ａｓｎ残基（Ｓｕｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１１４４〜１１１５１、２００６）は、ＺＤＯＣＫアルゴリズムのエネルギー項により抗体−抗原複合インターフェースに加わることを阻止された。２０００個の最初のポーズを出力してクラスター化し、ドッキングポーズをリファインしてＲＤＯＣＫで再スコアリングを行った（Ｌｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５３：６９３〜７０７，２００３）。最初のＺＤＯＣＫスコアが最も高かった２００個のポーズ及びＲＤＯＣＫの上位２００個のポーズを視覚的に調べた。
Ｆａｂ １５ＥＶＱの結晶化を２０℃で蒸気拡散法によって行った（Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉ及びＭａｎｇａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：１６３３〜５１、２００７）。最初のスクリーニングは、９６穴プレートでＨｙｄｒａロボットを使用してセットアップした。実験は、０．５μｌのタンパク質溶液を０．５μｌのリザーバ溶液と混合した液滴で構成した。液滴は９０μｌのリザーバ溶液に対して平衡化した。５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．４）中のＦａｂ溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−５ｋＤａセルを使用して１４．３ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。スクリーニングは、Ｗｉｚａｒｄ Ｉ ＆ ＩＩ（エメラルド・バイオシステムズ社（Emerald Biosystems）、ワシントン州ベインブリッジアイランド）及びインハウス結晶化スクリーンによって行った。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶを類似の方法で結晶化させた。
Ｘ線回折データを収集し、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ、ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦｓ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して処理した。回折強度を、１／２°の像当たり１２０秒の露光時間で２７０°（結晶回転）にわたって検出した。Ｘ線データをＤ*ＴＲＥＫプログラム（リガク社（Rigaku））により処理した。構造は、Ｐｈａｓｅｒ又はＣＮＸプログラム（アクセルリス社（Accelrys）、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分子置換法によって決定した。すべてのデータを用いて、原子位置及び温度因子をＲＥＦＭＡＣによりＦａｂ １５ＥＶＱに対して１５〜２．２Å及びＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して５０〜１．９Åの分解能範囲で精密化した。水分子は、３σのカットオフレベルを使用して、（Ｆo−Ｆc）の電子密度ピークにて加えられた。全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４プログラムスイート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ ４．１９９４．ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０〜７６３）で行われた。ＣＯＯＴプログラム（Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２、２００４）を使用して、モデル調整を行った。
解像されたｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造は、抗体結合部位が重鎖の多数の負に帯電した残基（Ｄ５２、Ｄ５５、Ｅ９９、Ｄ１０６及びＤ１０９）によって特徴付けられることを示すものであった。したがってｍＡｂ １５ＥＱＶとＴＬＲ３との間の認識には、正に帯電した残基が関与している可能性が高いと考えられた。行ったタンパク質−タンパク質ドッキングシミュレーションは、複数の正に帯電した残基を含むＴＬＲ３上の２個の大きなパッチが、抗体に対して優れた相補性を示すことを示唆するものであった。シミュレートしたＴＬＲ３−抗ＴＬＲ３抗体複合体の界面内のＴＬＲ３上の残基は、Ｒ６４、Ｋ１８２、Ｋ４１６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９及びＫ４９３であった。
突然変異誘発実験単一及び組合わせの突然変異をＴＬＲ３ ＥＣＤの、上記でｍＡｂ１２及びｍＡｂ １５ＥＶＱのエピトープを含んでいることが特定された領域内の表面残基に導入し、突然変異タンパク質を抗体結合について試験した。
ヒトＴＬＲ３のアミノ酸１〜７０３（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＮＰ＿００３２５６）を標準的なプロトコールを用いてクローニングした。表５ａに示されるオリゴヌクレオチドを用い、製造者のプロトコールに従ってＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、すべての変異体を、部位特異的な変異の誘導によって作製した。突然変異はＤＮＡの配列決定によって確認した。タンパク質はＣＭＶプロモーターの制御下で、ＨＥＫ２９３細胞内でＣ末端ＨＩｓ−タグ融合タンパク質として発現させ、実施例１で述べたようにして精製した。
結合アッセイヒトＴＬＲ３に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５ＥＶＱの結合活性及び生成された変異体をＥＬＩＳＡによって評価した。プロセスを促進するため、ｍＡｂ １５ＥＶＱの結合が予想される部位についての変異体を、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶと共にＣ末端Ｈｉｓタグを含むＴＬＲ ３ＥＣＤ変異体と、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクトすることで同時発現させた後、金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。回収された試料は、ＴＬＲ３突然変異体とｍＡｂとの複合体であった。このアプローチは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ １５ＥＶＱの結合部位が互いに離れており、したがって一方の部位における点変異が他方の部位のエピトープに影響する可能性が低いことから実行可能であった。これらの複合体をＥＬＩＳＡ結合アッセイで使用した。ＰＢＳに加えた２０μｇ／ｍｌ野生型ＴＬＲ３ ＥＣＤ又は突然変異タンパク質を各ウェル当たり５μｌずつ、ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（メソ・スケール・ディスカバリー社（Meso Scale Discovery）、メリーランド州ゲイザースバーグ）にコーティングした。プレートを室温で６０分間インキュベートし、ブロッキングした。
Figure 2014526464
ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ緩衝剤（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で４℃にて一晩。翌日、プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−タグ標識したｍＡｂ １５ＥＶＱを５００ｐＭ〜１ｐＭの濃度で１．５時間添加した。洗浄後、ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを使用して標識抗体を検出し、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。ヒトＴＬＲ３及び変異体に対するｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合活性を評価するため、ｍＡｂ １５ＥＶＱと同時発現させ、検出抗体を標識ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶとした以外はｍＡｂ １５ＥＶＱについて述べたのと同様にして結合ＥＬＩＳＡを行った。
ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ：ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合部位は、セグメント交換実験において決定されたようにヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸１〜２０９内に位置が特定された。以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った。すなわち、Ｄ１１６Ｒ、Ｎ１９６Ａ、Ｎ１４０Ａ、Ｖ１４４Ａ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１６３Ｅ、及びＱ１６７Ａ。野生型ＴＬＲ３及びＶ１４４Ａ変異体は、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対して同等の結合性を示した（図６Ａ）。抗体はＴＬＲ３Ｄ１１６Ｒ突然変異体には結合せず、Ｋ１４５Ｅ突然変異体に対しては大幅に低い結合親和性を示した。したがって、ＴＬＲ３上で近接して配置されている残基Ｄ１１６及びＫ１４５は、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対する中心的なエピトープ部位と特定された（図７Ａ）。
ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ結合エピトープの２つの重要な残基は、ＴＬＲ３のエクトドメインのＮ末端セグメントの本差ＲＮＡ結合部位の面の近くに位置が特定されている（Ｐｉｒｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５：７６１〜７６３、２００８）。完全なエピトープは隣接領域に、実施した突然変異分析によっては明らかにされなかった他の残基を含むと考えられる。いずれの理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶがそのＴＬＲ３エピトープに結合すると、ＴＬＲ外部ドメインへの２本鎖ＲＮＡの結合に直接的又は間接的に干渉することにより、受容体の２量化及び下流のシグナル伝達経路の活性化が妨害されるものと考えられる。
ｍＡｂ １５ＥＶＱ：以下のＴＬＲ３突然変異体について評価を行った：Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ、Ｙ４６５Ａ、Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８８Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｎ５１７Ａ、Ｄ５３６Ａ、Ｄ５３６Ｋ、Ｑ５３８Ａ、Ｈ５３９Ａ、Ｈ５３９Ｅ、Ｎ５４１Ａ、Ｅ５７０Ｒ、Ｋ６１９Ａ、Ｋ６１９Ｅ、２重突然変異体Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ、３重突然変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓ、及び３重突然変異体Ｒ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅ。野生型ＴＬＲ３、Ｒ６４Ｅ、Ｋ１８２Ｅ、Ｋ４１６Ｅ突然変異体及び３重突然変異体Ｔ４７２Ｓ／Ｒ４７３Ｔ／Ｎ４７４Ｓは、ｍＡｂ １５ＥＶＱに対して同等の結合性を示した（図６Ｂ及び表５ｂ）。抗体は、ＴＬＲ３突然変異体Ｋ４６７Ｅ、Ｒ４８９Ｅ、Ｋ４６７Ｅ／Ｙ４６８Ａ及びＲ４８８Ｅ／Ｒ４８９Ｅ／Ｋ４９３Ｅには結合しなかった（図６Ｂ及び６Ｃ）。残りの変異体は中間的な結合性を示し、Ｒ４８８Ｅが最も高い作用を示した。これらの変異体のすべてがｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに結合した。これらの結果は、残基Ｋ４６７及びＲ４８９がｍＡｂ １５ＥＶＱエピトープの重要な決定因子であることを示すものである。残基Ｒ４８８もエピトープに寄与した。これらの残基は、ＴＬＲ３の同じ表面上に近接して配置されていた（図７Ａ）。この結果はまた、いずれもＫ４６７、Ｒ４８８及びＲ４８９と同じ表面上に位置する残基Ｙ４６５、Ｙ４６８、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９がエピトープに寄与することを示している。この結果は、ｍＡｂ １５ＥＶＱを用いたＨ／Ｄ交換実験によって更に支持された。図７Ａは、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及び１５ＥＶＱ（黒）に対する結合エピトープ部位と、Ｃ１０６８ ｍＡｂ（灰色）に対する結合エピトープ部位とがヒトＴＬＲ３の構造上で重なっていることを示している。ｍＡｂ １５ＥＶＱに対するエピトープは、残基Ｙ４６５、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ｎ５１７、Ｄ５３６、Ｑ５３８、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｅ５７０、及びＫ６１９の範囲にわたっている。
Ｈ／Ｄ交換実験Ｈ／Ｄ交換に関して、抗体摂動を解析するのに使用される手順は、いくつかの変更を加えて先述のもの（Ｈａｍｕｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：１７１〜１８２、２００３；Ｈｏｒｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：８４８８〜８４９８、２００６）と類似していた。組換えＴＬＲ３ ＥＣＤ（Ｃ末端Ｈｉｓタグを付加してＳｆ９細胞で発現させて精製したもの）を重水素化水溶液中で所定の時間インキュベートして、交換可能な水素原子に重水素を取り込ませた。重水素化ＴＬＲ３ ＥＣＤを、固定されたｍＡｂ １５ＥＶＱを含むカラムで捕捉した後、水性緩衝液で洗った。逆交換したＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質をカラムから溶出し、重水素含有フラグメントの局在性をプロテアーゼ消化及び質量分析により調べた。基準コントロールとして、ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料を、抗体カラムで捕捉した後に重水素化水と接触させてから実験試料と同様にして洗浄及び溶出した点を除いて同様に処理した。抗体と結合する領域は比較的交換から保護される部位であり、そのため、基準ＴＬＲ３ ＥＣＤ試料と比較して高い割合の重水素を含むものと推測された。タンパク質の約８０％を特定のペプチドにマッピングすることができた。ｍＡｂ １５ＥＶＱによるＴＬＲ３ ＥＣＤのＨ／Ｄ交換の攪乱のマップを図７Ｂに示す。分かりやすさのために、ＴＬＲ３の、ｍＡｂ １５ＥＶＱに影響される部分の周囲のセグメントのみを示した。ＴＬＲ３ ＥＣＤのアミノ末端及びカルボキシル末端に延びるタンパク質の残りの部分は大きく影響されなかった。
Ｈ／Ｄ交換実験により、配列番号２のペプチドセグメント465ＹＮＫＹＬＱＬ471、514ＳＮＮＮＩＡＮＩＮＤＤｍＬ526及び529ＬＥＫＬ532が、ｍＡｂ １５ＥＶＱとの結合によってＴＬＲ３上の交換が特に変化する領域として特定された。その性質上、Ｈ／Ｄ交換は線形マッピング法であり、ペプチド内のどの残基が抗体結合によって最も影響されるかを定義することは通常できない。しかしながら、Ｈ／Ｄ交換と変異の結果が大きく重なっていることは、図７Ａに示される表面がｍＡｂ １５の結合部位であることの更なる確証を与えるものである。この結合部位は、ｍＡｂ ｃ１０６８について過去に述べられているもの（国際公開特許第０６／０６０５１３（Ａ２）号）と同じ直線状アミノ酸配列領域内にあったが、まったく重ならない表面（図７Ａ）上に位置することが判明し、これらの抗体間で交差競合が見られないことと一致する。
ｍＡｂ １５ＥＶＱ結合エピトープは、ＴＬＲ３上のＣ末端セグメントにてｄｓＲＮＡ結合部位に空間的に近位であった（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０３：８７９２〜８７９７、２００６；Ｒａｎｊｉｔｈ−Ｋｕｍａｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８２：７６６８〜７６７８、２００７；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０：３７９〜３８１、２００８）。いずれの特定の理論に束縛されることも望むものではないが、ｍＡｂ １５ＥＶＱがそのＴＬＲ３エピトープと結合すると、リガンドである２本鎖ＲＮＡ分子及び／又は２量体のもう一方との立体障害を生じ、リガンドの結合及びリガンドによって誘導される受容体の２量化が妨げられるものと考えられる。
Figure 2014526464
（実施例７）
熱安定性が向上した変異体の作製
結晶構造に基づいた機能改変を行って高い熱安定性を有する抗体の変異体を作製すると同時に、生物学的活性を維持して免疫原性を最小に抑えることを試みた。
ｍＡｂ １５ＥＶＱを機能改変用に選択した。免疫原性を最小に抑えるため、構造的考慮に基づいて有益であることが予想される生殖細胞の突然変異のみを行った。ｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＬ及びＶＨの配列（それぞれ配列番号４１及び配列番号２１６）を、ＢＬＡＳＴサーチを使用してヒト生殖細胞の遺伝子と並べた。識別された一番近い生殖細胞系配列は、ＶＨ及びＶＬに関して、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＣ０９０９３及びＸ５９３１８であった。生殖細胞のＶＨ及びＶＬとｍＡｂ １５ＥＶＱのＶＨ及びＶＬ配列との間で以下の違いが特定された。すなわち、（ＶＨ）Ｖ３４Ｉ、Ｇ３５Ｓ、Ｆ５０Ｒ、Ａ６１Ｓ、及びＱ６７Ｈ；（ＶＬ）Ｇ３０Ｓ、Ｌ３１Ｓ、及びＡ３４Ｎ。特定された配列の違いをｍＡｂ １５ＥＶＱの結晶構造上にマッピングし、パッキング及び界面相互作用を変化させることが予測される残基を機能改変用に選択した。抗体の結晶構造（実施例６を参照）に基づいて、構造を不安定化させる可能性のある残基を特定した。（１）ＶＨのコア内のＶ３４の近くに小さな包囲空洞が特定された。この空洞は、Ｉｌｅ等のわずかに大きい側鎖に対応するのに十分大きかった。（２）ＶＨ ＣＤＲ３のＥ９９は、Ｈ結合ネットワークなしに、ＶＨ／ＶＬ界面にて埋め込まれていた。Ｅ９９の負に帯電したカルボキシレート基は概ね疎水性環境にあり、周囲の残基と主としてファンデルワールス（ｖｄｓ）接触状態にあった。荷電基を埋め込むことは、通常はエネルギー的に好ましくなく、したがって不安定化作用をもたらす。（３）ＶＨのＦ５０は、ＶＨ／ＶＬの界面残基である。その芳香族側鎖は嵩張るため、ペアリングに悪影響を及ぼしうる。Ｆｖの水素結合及びｖｄｗパッキングネットワークを計算し、Ｐｙｍｏｌにより視覚的に調べた（ｗｗｗ：／／＿ｐｙｍｏｌ＿ｏｒｇ）。ＶＨ及びＶＬドメイン内の埋め込まれた空洞はＣａｖｅｒ（Ｐｅｔｒｅｋら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：３１６，２００６）によって計算した。分子のグラフィック図はすべてＰｙｍｏｌで作製した。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ多重突然変異部位特異的突然変異誘発キット（ユー・エス・ビー社（USB Corporation）、オハイオ州クリーブランド）、又はＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用し、標準的なクローニング法によって実施例３で述べたようにして作製したＦａｂフラグメント又はＩｇＧ４完全ヒト抗体をコードした発現ベクターに突然変異を導入した。反応を、それぞれの製造者の推奨に従って行った。得られたクローンの配列を、確認のために配列決定し、得られた機能改変された変異体を、改変された重鎖又は軽鎖に従ってｍＡｂｓ １５−１−１５−１０と命名した。各変異鎖（Ｈ又はＬ）は、野生型ｍＡｂ １５ＥＶＱ Ｌ又はＨ鎖で発現して抗体を生成したが、ｍＡｂ １５−１０の重鎖は、ｍＡｂ １５−６からであった。ＣＤＲの配列番号、軽鎖及び重鎖の可変領域、並びにｍＡｂ １５ＥＶＱの完全重鎖及び軽鎖並びにその人工変異体のリストを、表６に示す。表７は、各変異体の作製用のプライマーを示す。
Figure 2014526464
ＴＬＲ３に対するｍＡｂ １５−１〜１５−９の結合性をＥＬＩＳＡ免疫アッセイによって評価した。ヒトＴＬＲ３ ＥＣＤ（１００μＬの２μｇ／ｍＬ ＴＬＲ３ＥＣＤ）を黒色のＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に４℃で一晩結合させた。プレートを洗ってブロッキングし、希釈した抗体をウェル上に各ウェル当たり５０μｌで２重に一定分量に分配した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。発光ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１ ５８２ ９５０ ００１）及びヤギの抗ヒトＦｃ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−０３５−０９８）を使用して結合が検知され、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレート読取器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）でプレートを読み取った。
ＤＳＣ実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌの自動ＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）で行って、基準細胞と試料細胞との間の温度差を継続的に測定して出力単位に較正した。試料は１０℃〜９５℃まで６０℃／時の加熱速度で加熱した。前走査時間は１５分とし、フィルタリング時間は１０秒間とした。ＤＳＣ実験で使用した濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌである。得られたサーモグラムの分析はＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェア（マイクロカル社（MicroCal, LLC））を用いて行った。
Figure 2014526464
作製した変異体の熱安定性（Ｔｍ）をＤＳＣによって測定した（表８）。ＴＬＲ３に対する抗体の変異体の結合性は親抗体の結合性と同等であった。
Figure 2014526464
 （実施例８）
代理抗ＴＬＲ３抗体の作製
実施例１で作製したヒト化抗体がマウスＴＬＲ３に対して充分な特異性もアンタゴニスト活性も有さなかったことから、ここではｍＡｂ ５４２９と命名するキメラアンタゴニストであるラット／マウス抗マウスＴＬＲ３抗体を作製して様々なインビボモデルにおいてＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する作用について評価を行った。この代理キメラｍＡｂ ５４２９及びその親ラット抗マウスＴＬＲ３抗体ｃ１８１１はインビトロ及びインビボでマウスのＴＬＲ３シグナル伝達を阻害し、いくつかのマウスの疾患モデルにおいて発症機構を改善した。
以下に考察するデータは、有害な炎症の誘発及び持続化におけるＴＬＲ３の役割を示唆するものであり、例えば、高サイトカイン血症、喘息及び気道炎症、炎症性腸疾患及び関節リウマチ、ウイルス感染、及びＩＩ型糖尿病などの急性及び慢性の炎症状態におけるＴＬＲ３アンタゴニスト及びＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療的使用の根拠を与えるものである。
代理ｍＡｂ ５４２９の作製
通常の方法を用いて生成させた、遺伝子組み換え型マウスＴＬＲ３の外部ドメイン（配列番号１６２のアミノ酸１〜７０３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿５６９０５４）により、ＣＤラットに免疫性を与えた。マウスＴＬＲ３に特異的な抗体力価を示す２匹のラットのリンパ球を、ＦＯ骨髄腫細胞に融合させた。マウスＴＬＲ３に反応性のモノクローナル抗体のパネルを識別し、マウスルシフェラーゼレポーター及びマウス胎仔線維芽細胞アッセイにおいてインビトロアンタゴニスト活性に関して試験した。ハイブリドーマ株Ｃ１８１１Ａを更なる研究のために選択した。機能する可変領域遺伝子をハイブリドーマによって分泌されるｍＡｂ ｃ１８１１から配列決定した。次いで、クローニングされた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をプラスミド発現ベクターにそれぞれ挿入し、ｍＡｂ ５４２９と表示されるキメララット／Ｂａｌｂ Ｃ ｍｕＩｇＧ１／κ ｍＡｂを常法によって作製するためのコード配列を得た。抗体を実施例３で述べたようにして発現させた。ｍＡｂ ５４２９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１６４及び配列番号１６３にそれぞれ示し、重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６６及び配列番号１６５にそれぞれ示す。ｍＡｂ ｃ１８１１の重鎖及び軽鎖の完全長の配列を配列番号１６８及び配列番号１６７にそれぞれ示す。
ｍＡｂ ５４２９の特性評価
ｍＡｂ ５４２９を、ＴＬＲ３シグナル伝達に対する中和能力について一連のインビトロアッセイにおいて特性評価した。活性のアッセイ及び結果を以下に述べる。
マウスルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
マウスＴＬＲ３のｃＤＮＡ（配列番号１６１、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ：ＮＭ＿１２６１６６）をマウス脾臓ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からＰＣＲによって増幅し、標準的な方法を用いてｐＣＥＰ４ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。２００μＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全ＤＭＥＭ中、４×１０4細胞／ウェルの濃度で９６穴白色透明底プレートに播種し、３０ｎｇのｐＮＦ−ｋＢホタルルシフェラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）又は３０ｎｇのｐＩＳＲＥホタルルシフェラーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、５ｎｇのｐｈＲＬ−ＴＫコントロールウミシイタケルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）レポータープラスミド、１．５ｎｇの完全長マウスＴＬＲ３をコードするｐＣＥＰ４、及び１３．５ｎｇの空のｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を使用して、翌日Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＤＮＡ量を５０ｎｇ／ウェルとし、トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を３７℃で３０分〜１時間、抗マウスＴＬＲ３抗体と新鮮な無血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした後、０．１又は１μｇ／μｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を加えた。２４時間後にＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）を使用してプレートを収穫した。相対的な光量単位を、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ多重検出リーダーを使用し、ＯＰＴＩＭＡＬソフトウェア（ベー・エム・ゲー・ラブテック社（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）、ドイツ）により測定した。標準化された値（ルシフェラーゼ比）はホタルの相対光量単位（ＲＬＵ）をウミシイタケのＲＬＵで割ることによって得た。ｍＡｂ ５４２９、並びにその親ｍＡｂ ｃ１８１１及びｍＡｂ １５（表３ａ）は、用量依存的にポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＮＦ−ｋＢ及びＩＳＲＥ活性化を低下させ（図８Ａ及び８Ｂ）、ＴＬＲ３の活性を中和するこれらの抗体の能力が実証された。ＩＳＲＥアッセイにおいて測定されたＩＣ５０は、ｍＡｂ ５２４９、ｍＡｂ １５及びｍＡｂ ｃ１８１１についてそれぞれ０．５、２２、及び０．７μｇ／ｍｌであった。
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＥＦ細胞をアーティス・オプティマス社（Artis Optimus）より入手した（Ｏｐｔｉ−ＭＥＦ（商標）Ｃ５７ＢＬ／６−０００１）。細胞を、２００μｌのＭＥＦ培地（ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％熱失活ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ）中、９６穴平底プレート（ビー・ディー・ファルコン社（BD Falcon））に２００００細胞／ウェルで播種した。インキュベーションはすべて、３７℃／５％ＣＯ2で行った。播種の２４時間後に、ｍＡｂ ５４２９又はｍＡｂ ｃ１８１１を各ウェルに加えた。プレートをｍＡｂと１時間インキュベートした後、各ウェルにポリ（Ｉ：Ｃ）を１μｇ／ｍｌで加えた。２４時間のインキュベーションの後、上清を回収した。ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用い、サイトカインレベルを定量して、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０を製造者のプロトコールに従って検出した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。いずれの抗体もポリ（Ｉ：Ｃ）誘発ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０レベルを用量依存的に低下させ、これらの抗体が内因性のＴＬＲ３を中和してＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する能力が実証された（図９）。
フローサイトメトリー−表面染色
各群１０匹ずつのＣ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ノックアウトマウス（ＴＬＲ３ＫＯ）（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；雌、８〜１２週齢、エース・アニマルズ社（Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌ，Ｉｎｃ．））に１ｍｌの３％チオグリコレート培地（シグマ社（Sigma））を腹腔内投与し、９６時間後にマウスを安楽死させ、各マウスからの腹膜を１０ｍｌの滅菌ＰＢＳで洗浄した。チオグリコレートにより腹膜に誘導されたマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁し、細胞の生存率をＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ染色によって評価した。細胞を遠心してペレットとし、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｃａ2+−Ｍｇ2+、１％熱失活ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、濡れた氷上に保持した。ＣＤ１６／３２試薬（イー・バイオサイエンス社（eBioscience））を１０μｇ／１０6細胞で１０分間使用してマクロファージ上のＦｃ受容体をブロッキングした。細胞を１００μｌ／ウェル中、１０6細胞で分配して表面染色を行った。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６４７（モレキュラー・プローブズ社（Molecular Probes））−接合ｍＡｂ ｃ１８１１及びｍＡｂ １６７９（ＴＬＲ３特異性を有さないことからアイソタイプコントロールとして用いられるラット抗マウスＴＬＲ３抗体）を０．２５μｇ／１０6細胞で加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。生存率染色として７−ＡＡＤ（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社（BD Bioscience）、マサチューセッツ州ベッドフォード）を５μｌ／ウェルで３０分を超えないように加えた後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで試料を取得して死細胞集団を検出した。試料はＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによって採取した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して収集したデータをヒストグラムを作成することによって分析した。
Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ３ＫＯマウスからのマウスチオグリコレート誘発腹腔マクロファージへのｍＡｂ ｃ１８１１の結合がフローサイトメトリーにより評価されて、結合特異性が判定された。このキメラ抗体のマウスＦｃ領域は非特異性結合に寄与することが予想されたため、ｍＡｂ ５４２９は、このアッセイには使用されなかった。ｍＡｂ ｃ１８１１は、ＴＬＲ３ＫＯマクロファージへの結合を示さず、Ｃ５７ＢＬ／６腹腔マクロファージの組織表面への結合が増大したが、これは、ＴＬＲ３に対するｍＡｂの特異性を示唆する（表１０）。ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合領域を有するｍＡｂ ５４２９は、ｍＡｂ ｃ１８１１と同じ結合特異性を有することが推測される。
（実施例９）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはＴＬＲ３媒介性全身性炎症から防御する。
モデル
ポリ（Ｉ：Ｃ）誘発全身性サイトカイン／ケモカインモデルをＴＬＲ３媒介性全身性炎症のモデルとして用いた。このモデルでは、腹腔内投与したポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）により、ＴＬＲ３によって一部媒介される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８〜１０週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animals, Inc.））に、ｍＡｂ ５４２９を０．５ｍｌのＰＢＳ中、１０、２０又は５０ｍｇ／ｋｇで、ｍＡｂ ｃ１８１１を、０．５ｍｌのＰＢＳ中、２、１０又は２０ｍｇ／ｋｇで、又は０．５ｍｌのＰＢＳを単独（溶媒コントロール）で皮下に投与した。抗体投与の２４時間後、マウスに、０．１ｍｌのＰＢＳに加えた５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（アマシャム社（Amersham）カタログ番号２６−４７３２、ロット番号ＩＨ０１５６）を腹腔内投与した。ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジの１及び４時間後に後眼窩より血液を採取した。全血より血清を調製してＬｕｍｉｎｅｘによりサイトカイン及びケモカインの濃度について分析した。
結果
腹腔内投与されたポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３ノックアウト動物においてケモカイン及びサイトカイン群の産生が大幅に低減されたことによって示されるように、ＴＬＲ３によって一部介在される全身性のサイトカイン及びケモカイン応答を誘導した（表９Ａ）。ＴＬＲ３依存性のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導型メディエーターは、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポストチャレンジ１時間では、ＩＬ−６、ＫＣ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１及びＴＮＦ−αであり、ポリ（Ｉ：Ｃ）ポストチャレンジ４時間では、ＩＬ−１α、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＴＮＦ−αであった。ｍＡｂ ｃ１８１及びｍＡｂ ５４２９は両方とも、これらのＴＬＲ３依存性メディエーターのレベルを大幅に下げたが、これは、抗体がインビボでＴＬＲ３シグナル伝達を下げる能力を立証するものである（表９Ｂ）。表９の値は、６つの動物／群の平均サイトカイン又はケモカイン濃度（±標準誤差）をｐｇ／ｍｌで示している。これらのデータは、ＴＬＲ３の拮抗作用が、サイトカインストーム又は致死的ショックなどの状態における過剰なＴＬＲ３介在サイトカイン及びケモカインレベルを低減させるうえで有用となり得ることを示唆するものである。
Figure 2014526464
Figure 2014526464
 （実施例１０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは気道過敏症を軽減する。
モデル
気道過敏症をポリ（Ｉ：Ｃ）によって誘発させた。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．）をイソフルランで麻酔し、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）を数回投与量（１０〜１００μｇ）で鼻腔内投与した。各投与の間に２４時間の休止時間を置いてポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）を３回マウスに投与した。最後のポリ（Ｉ：Ｃ）（又はＰＢＳ）の投与の２４時間後に、全身プレチスモグラフィー（ブクスコ・システム社（BUXCO system））を用いて肺機能及びメタコリンに対する気道過敏症を測定した。マウスを全身プレチスモグラフチャンバに入れ、少なくとも５分間順応させた。ベースラインの読み取りの後、増加する量の霧状化したメタコリン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）にマウスを暴露した。霧状化メタコリンを２分間投与した後、５分間のデータ収集時間、その後、１０分間の休止時間を置いた後、メタコリンの用量を増大させた後続のチャレンジを行った。空気流の抵抗の増加をエンハンストポーズ（Enhanced Pause）（Ｐｅｎｈ）として測定し、５分間の記録時間にわたった平均のＰｅｎｈ値として表した（ブクスコ・システム社）。肺機能の測定の後、マウスを安楽死させ、肺にカニューレを挿管した。肺に１ｍｌのＰＢＳを注入し、流出液を回収することによって気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。肺組織を切除して凍結した。ＢＡＬ液を遠心（１２００ｒｐｍ、１０分）し、細胞を含まない上澄み液を回収して、解析を行うまでの間−８０℃で保存した。細胞ペレットを２００μｌのＰＢＳに再懸濁して全細胞計数及び分画別の細胞計数を行った。製造者のプロトコール及びＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ）に従って多重アッセイを行った。
結果
過去の観察により、ポリ（Ｉ：Ｃ）の鼻腔内投与はマウスの肺機能にＴＬＲ３によって介在される障害を誘発し、全身プレチスモグラフィー（ＢＵＸＣＯ）におけるベースラインのエンハンストポーズ（ＰｅｎＨ）測定値が高くなり、霧状化されたメタコリンに対する応答性が高くなることが示されている（国際特許公開第０６／０６０５１３（Ａ２）号）。肺機能のこうした障害は、肺への好中球の動員、及び肺における炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルの上昇をともなった。この実験では、肺機能におけるポリ（Ｉ：Ｃ）誘発障害におけるｍＡｂ １８１１及びｍＡｂ ５４２９の作用を、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立ってそれぞれの抗体を５０ｍｇ／ｋｇで皮下投与することによって評価した。
ＴＬＲ３によって媒介される肺機能の障害は、ポリ（Ｉ：Ｃ）チャレンジに先立って動物をＴＬＲ３抗体アンタゴニストで処置することによって大幅に軽減された。抗ＴＬＲ３抗体で処置された動物ではＴＬＲ３によって介在される、ベースラインＰｅｎＨ及びメタコリンに対する気道の感受性の増大を防止した（図１１）。更に、抗ＴＬＲ３抗体で処置した動物ではＴＬＲ３によって介在される、マウスの肺への好中球の動員及び気道におけるケモカインの生成を低減した。好中球の数（図１２）及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０のレベル（図１３）は、回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から測定した。この実験を少なくとも３回繰り返して同様の結果を得た。図１１、１２、及び１３に示されるデータは、１つの代表的な実験からのものである。各記号は１匹のマウスからのデータポイントを表し、横棒線は群の平均を示す。この実験によって、使用したモデルにおいて全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストが肺に達し、ＴＬＲ３によって媒介される肺機能の障害、気道内への好中球の浸潤、ケモカインの生成及び気道の炎症を軽減したことが示された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び嚢胞性線維症などの、気道過敏症によって特徴付けられる呼吸器疾患の治療又は予防に有用でありうる。
（実施例１１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは炎症性腸疾患から防御する。
モデル
ＤＳＳ大腸炎モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢未満）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；８週齢未満で体重１６．５ｇ〜１８ｇ、Ａｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ）にγ線照射した餌を１日目から与えた。ＤＳＳ（硫酸デキストラン）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ，カタログ番号１６０１１０；３５〜５０ｋＤａ；１８〜２０％イオウ，ロット番号８２４７Ｊ）を、オートクレーブにかけた酸性化した飲料水中で５％の最終濃度まで希釈した。ＤＳＳ水を５日間投与し、その後ＤＳＳ水をただの水に置き換えた。マウスには実験全体を通じて自由に水を飲ませた。すべての水ボトルの重量を毎日測定して水の消費量を記録した。０、２、及び４日目にマウスに５ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ ＰＢＳに０．１ｍｇを加えた）のｍＡｂ ５４２９、マウス抗ＴＮＦ−α抗体、又はコントロールとしてのＰＢＳを腹腔内投与した。マウスを実験の全体を通じて毎日監視し、０〜４日目及び７日目に体重を測定した。マウスを実験の２日目及び７日目に安楽死させた。腹腔を開き、上行結腸を盲腸と接合する位置で切断した。結腸を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。結腸をパラフィンに埋め込み、薄片にスライスし、Ｈ＆Ｅ染色（カルテック・モレキュラー・ラブズ社（Qualtek Molecular Labs）、カリフォルニア州サンタバーバラ）した。下記に述べるように獣医病理学者によって盲検により結腸の組織病理学的評価を行った（パソメトリクス社（PanthoMetrix）カリフォルニア州サンホセ）。
組織病理学的評価
大腸、結腸、及び直腸の２つの切片を評価し、以下の変化についてスコア化した。すなわち、（ｉ）単一の細胞の壊死、（ｉｉ）上皮の潰瘍形成、（ｉｉｉ）上皮の脱落、（ｉｖ）陰窩腫瘍、（ｖ）細胞増殖、（ｖｉ）陰窩細胞増殖、（ｖｉｉ）粘膜固有層における肉芽組織形成、（ｖｉｉｉ）粘膜下組織における肉芽組織、（ｉｘ）粘膜下炎症細胞の浸潤物、好中球優勢、及び（ｘ）粘膜下浮腫。
重篤度の単一の全体的スコアを以下の基準に基づいて与えた。すなわち、
０−所見を認めず。
１−軽度、限局性、又は時折認められる。
２−軽度、多病巣である。
３−中度、頻繁だが限定された領域に認められる。
４−重度、提供された組織の多くの領域又は広範囲に頻繁に認められる。
５−極めて重度、提供された組織の大部分に拡がっている。
結果
過去の観察によれば、ＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳの摂取によって誘発された炎症性腸疾患のモデルにおいて野生型マウスと比較して大幅に軽減された組織病理学的所見を示すことが実証されており（国際特許公開第０６／６０５１３Ａ２号）、このことはＴＬＲ３シグナル伝達がこのモデルにおける病因に一定の役割を果たすことを示唆するものである。壊死細胞から放出される片利共生的細菌性ＲＮＡ又は哺乳類ＲＮＡが内因性リガンドとして作用して、ＴＬＲ３シグナル伝達を刺激し得ることが報告されており（Ｋａｒｉｋｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３１６５〜２３１１７５ ２００５；Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２５４２〜１２５５０ ２００４）、したがって、胃腸内の内因性リガンドによるＴＬＲ３刺激は、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける炎症を増進持続させ得る。
化合物組織病理学スコア（図１４）によって評価されるように、ＤＳＳに曝露した動物における疾患重篤度は、抗ＴＬＲ３抗体による処置によって改善された。図１４は、疾患重篤度スコアについて平均、標準偏差及び９５％信頼区間を横棒線として示している。抗ＴＬＲ３抗体で処置した野生型のＤＳＳ曝露動物では、非処置の野生型動物と比較してスコアの有意な低下が認められた（ｐ＜０．０５）。ＤＳＳに曝露したＴＬＲ３ノックアウト動物は、ＤＳＳによって誘発される変化から防御された。抗マウスＴＮＦ−α ｍＡｂを投与したＤＳＳ曝露動物では、ＤＳＳモデルにおいて組織病理学的所見の改善は認められなかった。したがって、ＤＳＳモデルは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しないヒト患者集団を対象とする治療法の評価において有用であり得、抗ＴＬＲ３抗体を中和することは、抗ＴＮＦ−αによる治療に応答しない炎症性腸疾患の患者にとって利益となる可能性を有すると考えられる。
モデル
Ｔ細胞移植モデルを炎症性腸疾患のモデルとして用いた。このモデルでは、免疫応答能のあるマウスから得た制御性Ｔ細胞を含まないナイーブＴ細胞（腸粘膜の抗原提示細胞を攻撃する）の集団を移植することによって、ＳＣＩＤマウスに腸の炎症を誘発した。
ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢhigh Ｔ細胞）をＳＣＩＤレシピエントに腹腔内注射することによって慢性大腸炎を誘発した。マウスに、ＰＢＳ（５００μＬ／マウス、腹腔内投与；溶媒コントロール）、ｍＡｂ ５４２９（０．１ｍｇ／マウス、腹腔内投与）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（０．０５ｍｇ／マウス、腹腔内投与；ポジティブコントロール）のいずれかを、Ｔ細胞の移植４８時間後から開始して毎週２回、８週間の実験期間全体を通じて投与した。Ｔ細胞の移植から８週間後（又はマウスが初期の体重の１５％以上を失った時点）に、動物を安楽死させて結腸を取り出した。結腸を固定し、パラフィンに埋め込んでＨ＆Ｅ染色した。組織病理学的所見（細胞浸潤、陰窩腫瘍、上皮びらん、杯細胞喪失、及び腸壁の肥厚）を盲検的に定量的に評価した。
結果
コントロール動物と比較した場合の組織病理学的スコアの合計の有意な低下（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ）によって評価されるように、疾患重篤度は、Ｔ細胞移植を受けた動物において抗ＴＬＲ３抗体による処置に応じて改善された。スコアの合計には、陰窩腫瘍、潰瘍形成、好中球流入、杯細胞喪失、異常陰窩、粘膜固有層の炎症、及び経壁併発を評価した。陰窩腫瘍、潰瘍形成、及び好中球流入では有意な低下が認められた（いずれもｐ＜０．０５）（図１５Ｂ）。抗ＴＮＦα抗体を、最適な効果を与えることが知られている用量でポジティブコントロールとして用いた。
ＤＳＳ及びＴ細胞移植モデルという２つの広く知られた炎症性腸疾患のモデルを用いた実験により、全身投与されたＴＬＲ３抗体アンタゴニストは腸粘膜に達し、２つの異なる病因機構によって誘発された消化管の炎症を軽減させることが実証された。したがって、ＴＬＲ３アンタゴニストは、抗ＴＮＦα不応性の症例及び消化管の他の免疫介在性の病態を含む炎症性腸疾患の治療に有益であると考えられる。
（実施例１２）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストはコラーゲン誘発関節炎から防御する。
モデル
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルを関節リウマチのモデルとして用いた。
雄Ｂ１０ＲＩＩＩマウス（６〜８週齢、ジャクソン・ラボラトリーズ社（Jackson Labs））を１群当たり１５匹（関節炎群）及び１群当たり４匹（コントロール群）の群に分けた。関節炎群をイソフルランで麻酔し、ＩＩ型コラーゲン、及び結核菌（Ｄｉｆｃｏ）を添加したフロイントの完全アジュバントを０及び１５日目に投与した。１２日目にＩＩ型コラーゲン誘導関節炎を発症したマウスを体重により治療群にランダム化し、ｍＡｂ ５４２９（２５ｍｇ／ｋｇ）、ネガティブコントロール抗体としてＣＶＡＭ（マウスに既知の特異性を示さない組換えｍＡｂ）（５ｍｇ／ｋｇ）、又は抗ＴＮＦ−α抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ポジティブコントロール）を、１２、１７、及び２２日目（ｄ１２、ｄ１７、ｄ２２）に皮下投与（ＳＣ）した。更に、マウスのコントロール群に溶媒（ＰＢＳ）又はデキサメタゾン（０．５ｍｇ／ｋｇ、Ｄｅｘ、基準化合物）を１２〜２５日目まで毎日（ＱＤ）皮下投与（ＳＣ）した。動物を１２〜２６日まで毎日観察した。前足及び後足を臨床スコアシステム（下記に示す）によって評価した。実験２６日目に動物を安楽死させ、組織病理学的所見を盲検的に評価した（下記にスコアシステムを述べる）。有効性評価は、動物の体重及び臨床的関節炎スコアに基づいて行った。すべての動物が実験終了時まで生存した。
前足及び後足の臨床的スコア基準
０−正常
１−後足又は前足関節が冒されるか、わずかなびまん性紅斑及び腫脹。
２−後足又は前足関節が冒されるか、軽度のびまん性紅斑及び腫脹。
３−後足又は前足関節が冒されるか、中度のびまん性紅斑及び腫脹。
４−顕著なびまん性紅斑及び腫脹又は４本の指の関節が冒される。
５−足全体に重篤なびまん性紅斑及び重篤な腫脹、指を曲げられない。
ＩＩ型コラーゲン関節炎を有するマウス関節の組織病理学的スコアリング方法
ＩＩ型コラーゲン関節炎の病変を有するマウスの足又は足関節をスコア化する場合、変化の重篤度及び冒された個々の関節の数を考慮する。中手骨／中足骨／指又は足根骨／脛足根骨の多数の関節の可能性のうち、１〜３個のみの足又は足関節の関節が冒されている場合には、変化の重篤度に応じて下記のパラメータの１、２又は３の最大スコアが任意に与えられる。２個よりも多い関節が関与している場合には、最も重く冒された／大多数の関節に下記の基準を適用する。
足スコアの臨床データは、１〜１５日目についてＡＵＣによて分析し、コントロールからの阻害率（％）を計算した。
炎症
０−正常
１−冒された関節の滑膜及び関節周囲組織への炎症細胞の最小の浸潤。
２−足の場合には冒された関節に限定された軽度の浸潤。
３−足の場合には冒された関節に限定された中度の浸潤。
４−大部分の領域を侵す、顕著な浮腫をともなう顕著な浸潤。
５−重篤な浮腫をともなう重篤なびまん性浸潤。
パンヌス
０−正常
１−軟骨及び肋軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤。
２−冒された関節の硬組織の周辺帯の破壊をともなう浸潤。
３−冒された関節の中度の高組織破壊をともなう中度の浸潤。
４−大部分の関節で顕著な関節構造の破壊をともなう顕著な浸潤。
５−全体的又はほぼ全体的な関節構造の破壊をともなう重篤な浸潤がすべての関節を冒す。
軟骨の傷害
０−正常
１−冒された関節に明らかな軟骨細胞の損失もコラーゲン破壊も認めない、トルイジンブルー染色の最小〜軽度の損失。
２−トルイジンブルー染色が軽度に損傷を受けている。冒された関節に限局性の軽度（表在性）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊が認められる。
３−冒された関節に多病巣性の中度（深部又は中間層）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の中度の損失。
４−大部分の関節に多病巣性の顕著な（深部〜深層）軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の顕著な喪失。
５−すべての関節に多病巣性の重度（深部〜タイドマーク）の軟骨細胞の損失及び／又はコラーゲン破壊を認める、トルイジンブルー染色の重度の喪失。
骨吸収
０−正常
１−小さい範囲の吸収が認められ、最小の程度に生じている。低倍率では容易に確認できず、冒された関節に破骨細胞をほとんど認めない。
２−より多くの範囲の吸収を認める軽度。低倍率では容易に確認できず、冒された関節により多くの破骨細胞を認める。
３−皮質の厚さ全体の欠損をともなわない髄様骨梁（medullary trabecular）及び皮質骨の明らかな吸収が、中度に生じている。一部の髄様骨梁が損傷し、病変が低倍率で明瞭に確認できる。冒された関節により多くの破骨細胞が認められる。
４−残存する皮質表面の断面の歪みをしばしばともなう、皮質骨の厚さ全体の欠損が、顕著な程度に生じている。髄様骨の顕著な損失、多数の破骨細胞が認められる。大部分の関節が冒されている。
５−皮質骨の厚さ全体の欠損及びすべての関節の関節構造の破壊が認められる。重度。
結果
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び抗マウスＴＮＦ−α抗体をポジティブコントロールとして用い、ＰＢＳを溶媒コントロールとして用い、ＣＶＡＭをネガティブコントロール抗体として用いた。すべての処置は、実験の１２日目の関節疾患が進行する間に開始した。溶媒で処置した疾患コントロール動物では疾患発症率は実験２２日目までに１００％となった。溶媒又はＣＶＡＭ抗体で処置したネガティブコントロール群では臨床スコアは最も高かった。Ｄｅｘ（ｄ１８〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（ｄ１８〜２６についてｐ＜０．０５）、又は２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（ｄ１８〜ｄ２３及びｄ２５〜ｄ２６についてｐ＜０．０５）で処置した各群では有意に低い臨床スコアが認められた（図１６）。曲線下面積（ＡＵＣ）として表した臨床的関節炎スコアは、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（低下率４３％）、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体（５２％）、又はＤｅｘ（６９％）による処置により、溶媒コントロールと比較して有意に低下した。図１７は、各群についてＡＵＣの平均及び標準偏差を示す。
各処置の組織病理学的作用についても評価を行った。足の骨吸収は、２５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９（低下率４７％）による処置によって溶媒コントロールと比較して有意に低下した。５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−α抗体で処置したポジティブコントロールマウスでは、足の炎症（３３％）、軟骨傷害（３８％）、及び合計した足スコア（３７％）は有意に低下した。Ｄｅｘによる処置によって、足の組織病理学的パラメータのすべてが有意に低下した（合計スコアにおいて７３％の低下率）。
これらのデータは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが、ＣＩＡモデルにおいて臨床的及び組織病理学的疾患症状を改善することを示すものであり、関節リウマチの治療におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用を示唆するものである。
（実施例１４）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは急性致死性ウイルス感染から防御する。
モデル
インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを急性致死性ウイルス感染のモデルとして使用した。
１、４、８及び１２日目に雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢）又は雌ＴＬＲ３ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；１２週齢、ＡＣＥ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．、１群当たり１５匹のマウス）に２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９、又はＰＢＳ単独を皮下投与した。０日目にイソフルランでマウスを麻酔し、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＤ、ロット番号２１８１７１）を２５μＬのＰＢＳに加えたもの（１０5.55 ＣＥＩＤ５０に相当）を鼻腔内投与した。動物を体重変化及び生存率について１日２回、１４日間の期間にわたって観察した。臨床的スコアリングシステムを用いて疾患の進行のレベル及びインフルエンザＡウイルス治療に対するわずかな改善を評価した。
臨床スコア
０−正常、機敏で反応性があり、目に見える病気の兆候が認められない。
１−毛皮が逆立っている、歩行のわずかな低下が認められるか、又は認められない。
２−歩行時に背中が曲がっている、歩行をいやがる、呼吸困難である。
３−毛皮が逆立っている、呼吸困難である、運動失調、震えが生じている。
４−毛皮が逆立っている、そっと突いても歩行不可能、意識不明、触れると冷たく感じる。
５−死亡。
結果
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ ５４２９（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与したインフルエンザＡ感染野生型マウス及びｍＡｂ ５４２９を投与しないインフルエンザＡ感染ＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して生存率が統計的に有意に増大した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）が、このことは、ＴＬＲ３の阻害又は欠損がインフルエンザによって誘発される死を予防しうることを示すものである（図１８）。臨床スコアは、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９を投与した群、及びＴＬＲ３ノックアウト群において有意に低下した（図１９）。マウスの体重をインフルエンザウイルス投与後１４日間にわたって観察した。インフルエンザＡウイルスを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスでは体重は安定的に減少した。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ ５４２９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ノックアウトマウスのいずれも、インフルエンザウイルスを接種した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して有意に大きな体重を示した（図２０）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。
（実施例１５）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは高血糖を改善し、血症インスリンを低下させる。
モデル
食餌誘発肥満（ＤＩＯ）モデルを高血糖及びインスリン抵抗性、並びに肥満のモデルとして用いた。
Ｃ５７ＢＬ／６野生型動物（約３週齢、ジャクソン・ラボラトリーズ社（Jackson Labs））及びＴＬＲ３ノックアウト動物（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；約３週齢、エース・アニマルズ社（Ace Animal, Inc.））を高脂肪の食餌に１２〜１６週間維持した。ＴＬＲ３ノックアウト及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両方に、通常の固形飼料又は６０．９％ ｋｃａｌの脂肪及び２０．８％ ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食餌（Ｐｕｒｉｎａ ＴｅｓｔＤｉｅｔカタログ番号５８１２６）のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルに維持した。各群の各マウスの体重を毎週測定した。ｍＡｂ ５４２９を第１週に週２回、その後は週１回全体で７週間腹腔内投与した。空腹時に後眼窩から採取した血清試料を、示した時点でのインスリンの測定に用いた。７週目に一晩絶食させた後、１．０ｍｇ／ｇ（体重）のグルコースを腹腔内投与することによって耐糖試験を行った。更に、空腹時のインスリン及びグルコースレベルを測定した。
以下の式を用いて、空腹時グルコースレベル及びインスリンレベルに基づきＨＯＭＡ−ＩＲを式から求めた。すなわち、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（（空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）×空腹時インスリン（ｍＵ／ｌ））／２２．５（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２７：１４８７〜１４９５，２００４）。空腹時血中グルコース（血糖値）（ＢＧ）をグルコースオキシダーゼアッセイによって求めた。空腹時インスリンレベルをインスリンラット／マウスＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ、ｃａｔ．Ｎｏ．９００６０）を使用して求めた。
結果
１２〜１６週間の高脂肪の食餌の後、野生型ＤＩＯ動物は高血糖及び高インスリンとなった。ｍＡｂ ５４２９による処置により、野生型ＤＩＯ動物では耐糖能が改善したがＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善が見られなかった。グルコースチャレンジの６０、９０、１２０及び１８０分後に、ｍＡｂ ５４２９で処置した動物においてコントロール（ＰＢＳのみ）と比較して有意に低い血中グルコースレベルが観察された（図２１Ａ）。ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では、ｍＡｂを投与しない野生型ＤＩＯマウスと比較してＡＵＣの約２１％の低下が観察された。ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物では空腹時インスリンレベルも低下した（図２２）。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では、ｍＡｂ ５４２９による処置により空腹時インスリンに改善は認められなかった。インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ）分析は、ｍＡｂ ５４２９で処置した野生型ＤＩＯ動物においてインスリン感受性の改善を示したが、ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では改善を示さなかった。ＨＯＭＡ−ＩＲ価は、ＷＴ ＤＩＯ、５ｍｇ／ｋｇのＷＴ ＤＩＯ ｍＡｂ ５４２９、及び２０ｍｇ／ｋｇのＷＴ ＤＩＯ ｍＡｂ ５４２９動物に関して、それぞれ１４．０±９．８、８．７±４．９、９．０±３．０であった。ＴＬＲ３ノックアウトＤＩＯ動物では何らの効果も認められなかった。
この実験により、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストがＤＩＯモデルにおいて体重の損失をともなわずにインスリン抵抗性を改善し、空腹時グルコースを低下させることが示されたが、このことは、ＴＬＲ３アンタゴニストが高血糖症、インスリン抵抗性、及びＩＩ型糖尿病の治療に有用でありうることを示唆するものである。
（実施例１６）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは細菌及びウイルス誘発炎症反応から防御する。
試薬
細菌性増悪のＣＯＰＤ患者から単離された分類不能型ヘモフィラスインフルエンザ（ＨＮＴＨｉ）株３５をＤｒ．Ｔ．Ｆ．Ｍｕｒｐｈｙ（Ｂｕｆｆａｌｏ ＶＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）より入手した。ヒトライノウイルス１６をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）よりＴＣＩＤ（５０）＝２．８×１０7／ｍｌのものを入手した。
ＮＴＨｉ刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６穴組織培養プレート（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）に１×１０5／ウェルで播いた。寒天プレート上で１６〜２０時間増殖させたＮＴＨｉを増殖培地に約２×１０8ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで３０分間処理してから約２×１０7／ウェルでＮＨＢＥを含む９６穴プレートに加えた。３時間後に上澄み液を除去し、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍＬの最終濃度）を添加又は非添加の新鮮な増殖培地に交換した。更に２４時間インキュベートした後、細胞上澄み液中のサイトカイン及びケモカインの存在を、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００ＩＳ多重蛍光分析器及びリーダーシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）でサイトカイン２５重ＡＢビーズキット、ヒト（ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１を含む）によって３重にアッセイした。
ライノウイルス刺激アッセイ
ＮＨＢＥ細胞をＭｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６穴組織培養プレート（ビー・ディー・バイオサイエンシーズ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）に１×１０5細胞／ウェルで播いた。翌日、抗体（０．０８〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度）をＮＨＢＥ又はＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に加えて１時間インキュベートした後、１０μｌ／ウェルのライノウイルスを加えた。更に２４時間アッセイした後、細胞上清中のサイトカイン及びケモカインの存在について上記に述べたようにｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってアッセイを行った。
結果
ｍＡｂ １５ＥＶＱが、ＮＴＨｉにより誘導されたＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及びＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の産生を用量依存的に阻害したのに対して、コントロール抗体であるヒトＩｇＧ４（シグマ社ミズーリ州、セントルイス）はＮＴＨｉによる刺激に対して阻害作用を示さなかった（図２３Ａ）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ライノウイルスにより誘導されたＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生も阻害した（図２３Ｂ）。
（実施例１７）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは星状細胞における炎症反応を抑制する。
方法
２人のドナーから得た正常なヒト星状細胞（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）を２４穴プレートに７５，０００細胞／ウェルで播き、一晩付着させた。翌日、星状細胞を２００ｎｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又は１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ １８で２４時間処理した。サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。
結果
表１０に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生はｍＡｂ １８によって阻害された。
Figure 2014526464
（実施例１８）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストは上皮細胞における炎症反応を抑制する。
方法
ＨＵＶＥＣ細胞（ロンザ社、メリーランド州ウォーカーズビル）をロンザ社の推奨する血清含有増殖培地中で培養した。細胞を無血清培地（ロンザ社、メリーランド州ウォーカーズビル）に再懸濁し、９６穴プレートに３×１０5細胞／ｍｌで播き、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を増大する濃度（１．５〜１００μｇ／ｍｌ）で加え、３７℃で更に２４時間培養した。サイトカイン阻害アッセイに関しては、ｍＡｂ １５ＥＶＱを様々な濃度（０〜５０μｍｌ）で細胞に加え、３０分間培養し、その後、２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を２４時間加えた。細胞上澄み液を回収し、ヒトサイトカイン３０重キット及びＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＰ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ）を用いてサイトカインレベルを測定した。ｓＩＣＡＭ−１の発現を測定するため、ＨＵＶＥＣ細胞を２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び異なる濃度のｍＡｂ １５ＥＶＱ（０．８〜５０μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞上清をＥＬＩＳＡ（アール・アンド・ディー・システムズ社（R&D Systems）によりｓＩＣＡＭ−１の発現について分析した。＆細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）により測定した。
結果
ＨＵＶＥＣ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して次のサイトカインを産生した：ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１２ （ｐ４０／ｐ７０）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ、及びＨＧＦ（表１１）。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導される全サイトカインのレベルを用量依存的に低下させた（表１２）。ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されるＴＮＦ−α、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の産生を低下させるｍＡｂ １５ＥＶＱの能力は、ＴＬＲ３により媒介される活性の阻害が、アテローム性動脈硬化症につながりうる白血球及びＴ細胞の浸潤に対する防御を与えうることを示唆するものである。更に、ｍＡｂ １５ＥＶＱによるＶＥＧＦの阻害は、各種の癌及び加齢性黄斑変性などの眼疾患における脈管形成を含む、ＶＥＧＦによって媒介される病態におけるＴＬＲ３の遮断の潜在的な効果を示唆するものである。
ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γは白血球の動員において機能するとともに、活性化された内皮上の接着分子の発現を増大させる（Ｄｏｕｋａｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：１３７〜４７、１９９４；Ｐｏｂｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４２６〜３３、１９８８）。ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、単球及びＴ細胞の動員に関与していることが示されており、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与する（Ｌｕｎｄｇｅｒｇら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９）。内皮細胞によるＶＥＧＦの生成は、各種の癌において脈管形成時の異常な組織増殖又は腫瘍との関連が示されている（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２、２００７）。
Figure 2014526464
可溶性細胞内接着分子１（ｓＩＣＡＭ−１）はタンパク質切断によって生成し、内皮細胞活性化のマーカーである。ＩＣＡＭ−１は白血球の遊走及び活性化において重要な役割を有し、炎症時に内皮細胞及び上皮細胞において発現が上昇して、インテグリン分子ＬＦＡ−１及びＭａｃ−１を介した白血球への接着を媒介する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、
内皮細胞を活性化してｓＩＣＡＭ−１の発現を上昇させたが、この発現上昇はｍＡｂ １５ＥＶＱによる処理によって低減した（図２４Ａ）。
Figure 2014526464
このことは、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが白血球のトラフィッキング、したがって炎症細胞の流入によって引き起こされる組織障害を阻害しうることを示すものである。
生存率アッセイを行うため、上記で述べたようにＨＵＶＥＣを培養、播種し、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。ｍＡｂ １５ＥＶＱはポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の生存率の低下を用量依存的に回復させた（図２４Ｂ）。
内皮細胞の活性化の下方調節は、過剰な免疫細胞の浸潤を抑制し、炎症状態において増加するサイトカインによって引き起こされる組織障害を低減させうる。炎症及び内皮細胞におけるサイトカイン及び接着分子の過剰発現は、アテローム性動脈硬化症及び高血圧の発症の主要な寄与因子である。これらのデータは、脈管炎及び内皮機能不全をともなう血管疾患などの血管の疾患におけるＴＬＲ３アンタゴニストの使用の潜在的な有用性を探求することの根拠を与えるものである。炎症及び過剰発現したサイトカインによって引き起こされる別の疾患として、免疫抑制患者及びＨＩＶ感染患者において一般的に見られ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によって引き起こされるカポジ肉腫（ＫＳ）がある。ＶＥＧＦ及びサイトカインの産生は、ＫＳ細胞の生存に寄与する（Ｌｉｖｅｎｇｏｏｄら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４９：５５〜６２、２００７）。ＴＬＲ３アンタゴニストは、ＫＳ及び他の腫瘍にともなう血管新生のリスクを低減するうえで有用であるばかりでなく、細胞生存率の低下を防止し、内皮バリアの完全性を保護することによって、臓器不全及び敗血症などの重篤な炎症状態にともなう潜在的に重大な状態である血管漏出を防止するうえでも有用であり得る。ＴＬＲ３拮抗作用はまた、フラビウイルス科（例えば、デング、黄熱病）、フィロウイルス科（エボラ、マールブルグ）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス）、及びアレナウイルス科（例えば、ルジョ出血熱、ラッサ出血熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、ベネズエラ出血熱（Ｓｉｈｉｂａｍｉｙａら、Ｂｌｏｏｄ １１３：７１４〜７２２、２００９））の要素が原因となるウイルス性出血熱などの内皮細胞の病変に関与するウイルス性感染症においても有益であり得る。
（実施例２０）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストのカニクイザル及びマウスＴＬＲ３との交叉反応性
実施例２で述べたようにＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイを用いて、カニクイザル又はマウスＴＬＲ３に対する活性を評価した。カニクイザルのＴＬＲ３ ｃＤＮＡ（配列番号２１７）及びマウスのＴＬＲ３ ｃＤＮＡ（配列番号１６１）は、全血から増幅され、ｐＣＥＰ４ベクトル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化され、上述のように発現される。ｍＡｂ １５ＥＶＱは、ヒトＴＬＲ３ ＮＦ−ｋＢアッセイ及びＩＳＲＥアッセイにおけるそれぞれ０．４４μｇ／ｍｌ及び０．６５μｇ／ｍｌのＩＣ５０と比較して、ｃｙｎｏ ＮＦ−ｋＢアッセイ及びＩＳＲＥアッセイにおいてそれぞれ４．１８μｇ／ｍｌ及び１．７４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有していた。アイソタイプコントロール抗体はこれらのアッセイでは何らの作用も示さなかった。
（実施例２１）
ＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与は、急性の致命的なウイルス感染症を防御する。
実施例１４は、インフルエンザＡ感染症に対するＴＬＲ３抗体アンタゴニストによる予防的な治療（１、４、８、及び１２日目に投与）について述べている。この実施例は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストの治療用投与（インフルエンザＡ感染後臨床症状の発症３日後）が生存率の向上において効果的であるということを実証している。
モデル
動物へのｍＡｂ ５２４９の投与をインフルエンザＡの感染後３日後に行ったこと、及び投与した動物が８週齢であったことを除いて、インフルエンザＡウイルスチャレンジモデルを、実施例１４に述べたように急性の致命的なウイルス感染症のモデルとして使用した。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂはＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのものであった。インフルエンザＡの感染後３、７及び１１日に動物に投与した。
この実験では、生存率、毎日の臨床スコア、及び体重変化を評価した。ｍＡｂ ５２４９を投与したＣ５７Ｂｌ／６マウス及びＴＬＲ３ＫＯマウスは、抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ及びインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスと比べて、両方とも生存率の統計的に有意な増加（ｐ＜０．０２８及びｐ＜０．００１）を示した（図２５）。抗マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ及びインフルエンザＡを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較した場合、ｍＡｂ ５２４９を投与したＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ３ＫＯ動物において臨床的なスコアは低下し（図２６）、体重は増加した（図２７）。これらの結果は、ＴＬＲ３抗体アンタゴニストが急性致死性インフルエンザウイルス感染モデルにおける臨床症状及び死亡率を低下させることを示すものであり、ＴＬＲ３アンタゴニストが急性の感染状態にあるヒトに防御を与えることを示唆するものである。
（実施例２２）
Ｘ線結晶法によるＴＬＲ３抗体アンタゴニストのエピトープ及びパラトープ。
ヒトＴＬＲ３細胞外ドメインを、ｍＡｂ １５ＥＶＱ、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８のＦａｂｓと複合体の状態で結晶化させた。
方法
タンパク質の発現及び精製。
ＴＬＲ３ ＥＣＤ（配列番号２のアミノ酸１−７０３）の３つのＦａｂの発現及び精製は上述の通りであった。
ＴＬＲ３ ＥＣＤの３つのＦａｂの四次複合体の作製
１ＴＬＲ３ ＥＣＤ：１．１Ｆａｂのモル比に対応させて、４ｍｇのヒトＴＬＲ３ ＥＣＤを２．４ｍｇのそれぞれのＦａｂと混合し、４℃で３．５時間インキュベートした。複合体をアニオン交換クロマトグラフ法により２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．５）、１０％のグリセロール（緩衝液Ａ）で平衡化したＭｏｎｏＱ ５／５０ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製し、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．５）、１０％のグリセロール、１ＭのＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）により溶離した。１．７４ｍＬ中のほぼ２．４８ｍｇの複合体を緩衝液Ａにより１０ｍＬまで希釈し、カラム上に１ｍＬ／ｍｉｎで充填し、Ｂ濃度の０〜４０％の直線的な勾配により４０カラム容積にわたって溶離した。５回の連続的な精製操作を行った。ピーク１由来の区分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ−１５ｍＬのＵｌｔｒａ−３００００ＭＷＣＯ及びＭｉｃｒｏｃｏｎ ３００００ＭＷＣＯにより２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．５）／２７ｍＭのＮａＣｌ／１０％グリセロール中に、１４．４９ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（吸光係数：Ａ280（１ｍｇ／ｍＬ）＝１．３１）。
結晶化
Ｃｏｒｎｉｎｇプレート３５５０（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を用いて等容量のタンパク質及びリザーバ溶液を、シッティングドロップ法で分注するＯｒｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、自動化結晶化スクリーニングを行った。初期のスクリーニングは、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（ＨＲ２−１３０，Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）により実施した。いくつかの条件から、小さい結晶を使用してシードを生成し、次いでこれをＭｉｃｒｏｓｅｅｄ−Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＭＭＳ）で使用した。小さい結晶を与える初期のスクリーニング条件に基づき、何回かの精密化を行った。ＭＭＳに使用するリザーバ条件は、精密化後に小さい結晶を与えた条件に基づくものであった：１８〜２８％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、ｐＨ ４．５及び２．０〜２．９Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、５％のＰＥＧ４００、ｐＨ ４．５、及び探索したｐＨ及び異なる添加物。成分を１タンパク質溶液：０．２５シード原料：０．７５リザーバ溶液の容量比で分注することにより、Ｏｒｙｘ４自動タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＭＭＳ結晶化スクリーニングを行った。〜１０Åの分解能で回折する結晶は、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２．９Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、５％メチル−ペンタン−ジオール（ＭＰＤ）及び０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２６％のＰＥＧ３３５０、１ＭのＬｉＣｌから成長させたものであった。
結晶の分解能を改善するための試みとして、上記の条件を有するＭＭＳを、Ｈａｍｐｔｏｎ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＲ２−４２８（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）から選択された成分を容積比：１タンパク質溶液：０．１２５シード原料：０．２添加物溶液：０．６７５リザーバ溶液で用いる、添加物スクリーニングと組み合わせた。ＭＭＳと、０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２８％のＰＥＧ ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、及び３０ｍＭのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含有する溶液からの添加物スクリーニングとの組み合わせを適用した後、Ｆａｂと複合体形成し、約５Åの分解能で回折する、ＴＬＲ３ ＥＣＤのＸ線品質の結晶を得た。
ＴＬＲ３ ＥＣＤ四次複合体のＸ線データ収集
Ｘ線データを収集するために、結晶（サイズ約１．０×０．５×０．１ｍｍ3）を、合成母液（０．１Ｍの酢酸Ｎａ（ｐＨ ４．５）、２８％ ＰＥＧ ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、１６％グリセロール）中に数秒浸漬し、窒素流中１００Ｋで瞬間凍結した。Ｘ線回折データを収集し、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦光学系、Ｓａｔｕｒｎ９４４ ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００低温冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して処理した。回折強度を、１／２度の像当たり１ｍｉｎの露出時間、５Åの最大分解能で２５０°（結晶回転）にわたって検出した。Ｘ線データを、プログラムＤ*ＴＲＥＫ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，５５：１７１８〜１７２５，１９９９）により処理した。この結晶は、単位セルパラメータ：ａ＝２１４．９０Å、ｂ＝１４２．０８Å、ｃ＝１２５．０４Å、及びβ＝１０３．１７の単斜晶系空間群Ｃ２に属する。この非対称ユニットには１分子の複合体を含む。Ｘ線データ統計値を表１３に示す。
Figure 2014526464
構造決定
ＴＬＲ３ ＥＣＤ−Ｆａｂ １５ＥＶＱ−Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ−Ｆａｂ ｃ１０６８の結晶構造を、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：１３７３〜１３８２、２００１）を用いて分子置換により決定した。探索モデルはＴＬＲ３ ＥＣＤ（すべてのグルカンを取り除いた、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造番号１ｚｉｗ，Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１〜５８５，２００５）であり、３つのＦａｂの高分解能結晶構造を決定した（これらのＦａｂ構造に対する結晶データ及び精密化統計値の要約としては表１３を参照のこと）。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのエルボー角度は、遊離形態におけるものから著しくはずれていることが判明した。エルボー角度を約５°間隔で調整することにより、一連のＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶモデルを生成し、その１つが電子密度とよく一致することが判明した。構造精密化は、ＰＨＥＮＩＸで行われた（Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔ．１１：５３〜５５、２００４）。ＴＬＲ３ ＥＣＤに対して構造を、Ｆａｂ及び１３個の剛体セグメント（精密化で使用される定義：３０〜６０、６１〜１０８、１０９〜１５６、１５７〜２０６、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６４〜４１５、４１６〜４６４、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１９〜６８７）に対する剛体ドメイン（各Ｖ又はＣドメイン）として、それぞれのＦａｂ剛体に対する１つのＢ因子及びＴＬＲ３ ＥＣＤ全体に対する単一のＢ因子によって精密化した。
Ｆａｂ剛体のそれぞれに対して並進／回転／回転を伴った並進（ＴＬＳ）精密化を導入し、配列番号２の残基３３０において、ＴＬＲ３ ＥＣＤを２つのＴＬＳセグメントに分割した。グリカン密度は１５個のＮ−グリコシル化部位の１０個に対して目視可能であった。次いで、ヒトＴＬＲ３細胞外ドメイン（Ｃｈｏｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：５８１−５８５，２００５，ＰＤＢ構造番号１ｚｉｗ）の結晶構造からの炭水化物モデルを付加した。ＴＬＲ３ ＥＣＤ中の短い見えないセグメント（配列番号２の残基３３７〜３４２）に対する密度が剛体の精密化後に目視可能となり、それは、ＴＬＲ３細胞外構造２ａ０ｚからの対応するセグメントで充填された（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０２：１０９７６〜１０９８０、２００５、ＰＤＢ構造ＩＤ：２ａ０ｚ）。ＴＬＲ３ ＥＣＤのＣ末端は、２ａ０ｚの密度に一致する更なる密度を含んでいた。次いで、このセグメント（配列番号２の６４７〜７０３）を２ａ０ｗの（残基６４７〜６８７）により置き換えた。このように、ＴＬＲ３ ＥＣＤモデルは、ＴＬＲ３構造体１ｚｉｗと２ａ０ｚとの間のハイブリッドであり、１３個の剛体セグメント（アミノ酸範囲：３０〜６０、６１〜１０８、１０９〜１５６、１５７〜２０６、２０７〜２５７、２５８〜３０７、３０８〜３６３、３６４〜４１５、４１６〜４６４、４６５〜５１４、５１５〜５７０、５７１〜６１８、６１９〜６８７）として精密化されたものであった。
Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＬＣＤＲ３は、遊離形態と異なる立体配置を見掛け上とっていた。マルチスタートシミュレーションアニーリングをＰＨＥＮＩＸの標準的なパラメータにより行った。このＬＣＤＲ３のモデルを電子密度マップで目視的に検査し、「最もよく合う」立体配置を元のモデル上に接合した。精密化のプロセスを、計算開始の前に脇に置いておいた反射の５％に対してＲfreeによりモニターした。最終回では、それぞれの残基に対して１つのＢ因子を含めた。モデル検査、並びにＦａｂ及びタンパク質−タンパク質界面における側鎖のエルボー領域の手動による再組立てを、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：２１２６〜３２、２００４）を用いて行った。最終のＲcryst及びＲfreeは、５．０Å対する全１５，７９２個の独立の反射のそれぞれについて２６．８％及び３０．０％であった。精密化統計値を表１３及び１４に示す。
結果
ＴＬＲ３ ＥＣＤ−３つのＦａｂ四次複合体の分子構造
複合体の全体的な分子構造を図２８に示す。非対称単位中に１つのＴＬＲ３ ＥＣＤ及びそれぞれのＦａｂの１分子が存在する。ＴＬＲ３ ＥＣＤに対する構造モデルは、ｈｕＴＬＲ３（配列番号２）の３０〜６８７個のすべての残基を含む。３つのＦａｂに対しては、それぞれの非結合形からのすべての残基を、溶媒イオン及び水分子を除いて含めた。ＴＬＲ３ ＥＣＤ分子は、全体のトポロジー（１ｚｉｗに対して０．７９Åのｒｍｓ、６１３Ｃα’、及び２ａ０ｚに対して１．３７Å、５９５ Ｃα’）において以前に報告された構造と極めて類似している。このＦａｂ構造は、方法に記載のＦａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのＬＣＤＲ３、並びにＴＬＲ３ ＥＣＤ／Ｆａｂ界面におけるエルボー領域及び一部の側鎖を除いて、それぞれの非結合形とすべて同一である。
Figure 2014526464
エピトープ及びパラトープ
ＴＬＲ３ ＥＣＤと３つのＦａｂとの間の結合に関与する残基を、図２８Ｂに示す。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶはＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ末端近くで結合した。立体配置エピトープは、ＴＬＲ３ ＬＲＲ３〜７からの残基（配列番号２のアミノ酸１００〜２２１）から構成されるものであった。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶの結合は、抗原及び抗体上でそれぞれほぼ９２８Å2及び８９６Å2を埋め込んだ。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対しては、結晶構造は、次のＴＬＲ３（配列番号２）エピトープ残基：Ｓ１１５、Ｄ１１６、Ｋ１１７、Ａ１２０、Ｋ１３９、Ｎ１４０、Ｎ１４１、Ｖ１４４、Ｋ１４５、Ｔ１６６、Ｑ１６７、Ｖ１６８、Ｓ１８８、Ｅ１８９、Ｄ１９２、Ａ１９５、及びＡ２１９を同定した。Ｆａｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配列番号２１１）：Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｙ３１、Ｅ４９、Ｄ５０、Ｙ９０、Ｄ９１及びＤ９２、重鎖（配列番号２１４）：Ｎ３２、Ｑ５４、Ｒ５６、Ｓ５７、Ｋ５８、Ｙ６０、Ｙ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０６及びＹ１０７を同定した。
Ｆａｂ １５ＥＶＱ及びＦａｂ ｃ１０６８は、Ｃ末端近くのＬＲＲ １５〜２３（配列番号２のアミノ酸４０６〜６３５）に懸る、非折りたたみ型エピトープを結合していた（図２８）。Ｆａｂ １５ＥＶＱは、抗原及び抗体上でそれぞれ１０８０Å2及び１０６４Å2を埋め込み、Ｆａｂ ｃ１０６８は抗原及び抗体上でそれぞれ９６３Å2及び９１４Å2を埋め込んでいた。Ｆａｂ １５ＥＶＱに対するエピトープは、配列番号２で示されるＴＬＲ３の残基Ｋ４１６、Ｋ４１８、Ｌ４４０、Ｎ４４１、Ｅ４４２、Ｙ４６５、Ｎ４６６、Ｋ４６７、Ｙ４６８、Ｒ４８８、Ｒ４８９、Ａ４９１、Ｋ４９３、Ｎ５１５、Ｎ５１６、Ｎ５１７、Ｈ５３９、Ｎ５４１、Ｓ５７１、Ｌ５９５及びＫ６１９を覆う。Ｆａｂ １５ＥＶＱに対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基：軽鎖（配列番号４１）：Ｑ２７、Ｙ３２、Ｎ９２、Ｔ９３、Ｌ９４及びＳ９５、重鎖（配列番号２１６）：Ｗ３３、Ｆ５０、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｙ５７、Ｎ５９、Ｐ６２、Ｅ９９、Ｙ１０１、Ｙ１０４及びＤ１０６を同定した。
Ｆａｂ ｃ１０６８に対しては、結晶構造は、ＴＬＲ３（配列番号２）上の次のエピトープ残基：Ｅ４４６、Ｔ４４８、Ｑ４５０、Ｒ４５３、Ｒ４７３、Ｎ４７４、Ａ４７７、Ｌ４７８、Ｐ４８０、Ｓ４９８、Ｐ４９９、Ｑ５０３、Ｐ５０４、Ｒ５０７、Ｄ５２３、Ｄ５２４、Ｅ５２７、Ｅ５３０、及びＫ５５９を同定した。Ｆａｂ ｃ１０６８に対しては、結晶構造は、次のパラトープ残基、軽鎖：Ｈ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｎ５０、Ｅ６６、Ｓ６７、Ｇ６８（ｇｌｙｃ）、重鎖：Ｔ３０、Ｔ３１、Ｙ３２、Ｗ３３、Ｈ３５、Ｅ５０、Ｎ５２、Ｎ５４、Ｎ５５、Ｒ５７、Ｎ５９、Ｖ９９、Ｍ１０２、Ｉ１０３、及びＴ１０４を同定した。
中和の機構及びＴＬＲ３機能との関連
ｍＡｂ １５ＥＶＱ：ｍＡｂ １５ＥＶＱエピトープは、ＴＬＲ３残基Ｎ５１７、Ｈ５３９及びＮ５４１を含み、これらはＣ末端二本鎖ＲＮＡ結合部位と重複する（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：８７９２〜７、２００６）。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、このように、ｍＡｂ １５ＥＶＱは、リガンドに対して結合するＴＬＲ３に対して競合し、及びシグナル伝達単位の形成に必要とされる、リガンドにより誘起される受容体二量体化を防止すると考えられる。（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７９〜８１，２００８）。図２９は、ｍＡｂ １５ＥＶＱに対するこの直接の競合機構を図示する。抗体濃度に依存して、この機構は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の全阻害又は二本鎖ＲＮＡにより誘起されるＴＬＲ３活性化を生じる。
ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８：図３０に示すように、これらの２つの抗体は二本鎖ＲＮＡリガンドとの直接的な衝突を持たない。したがって、これらがＴＬＲ３機能をｍＡｂ １５ＥＶＱのそれに類似の機構で中和することはありえない。Ｆａｂフラグメントもリガンドから離れて配向する（図３０）。構造的に、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びＦａｂ ｃ１０６８は、両方とも機能を損なわずにシグナル伝達単位（ＳＵ）に結合することができる。立体的に、ｍＡｂ分子の２つのＦａｂフラグメントが、２つのＴＬＲ３分子を１つのＳＵ中で同時に結合し、ひいては二本鎖ＲＮＡ介在型ＴＬＲ３二量体化を防止し得るということはありえない。いかなる特定の理論からも束縛されることを望むものではないが、ＴＬＲ３へのｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ又はｍＡｂ ｃ１０６８の結合が、抗体と隣接するシグナル伝達単位との間の立体的な衝突により、シグナル伝達単位のクラスター形成を防止すると考えられる。二本鎖ＲＮＡへのＴＬＲ３の結合は、二本鎖ＲＮＡ：ＴＬＲ３複合体により定義されるシグナル伝達単位に限定されない（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７９〜８１，２００８）。多数のＳＵのクラスター形成がシグナル伝達の増強を生じる得、又は効率的なＴＬＲ３シグナル伝達がこのクラスター形成を必要とし得る。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８の配置が、クラスター形成をブロックし、ＴＬＲ３活性の中和を生じることができる。それゆえ、抗体の最大中和効果は、抗体結合によるＳＵの分離の度合いに依存する。図３０に図示するように、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶは、ｍＡｂ ｃ１０６８よりも大きい分離を引き起こし、このことがｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶのより大きい効能に転換する可能性がある。このことは、ｍＡｂ ｃ１０６８及びｍＡｂ １５ＥＶＱが、飽和濃度においてそれぞれ約５０％及び１００％のＴＬＲ３中和を生じることができ、ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶが中間の活性を呈するという観察と一致する。このように、複合構造及びＴＬＲ３中和に関する研究は、ｄｓＲＮＡ：ＴＬＲ３シグナル伝達ユニットがクラスター化して効率的なシグナル伝達を達成するＴＬＲ３シグナル伝達モデルを示唆する。ｍＡｂ １２ＱＶＱ／ＱＳＶ及びｍＡｂ ｃ１０６８はまた、リガンド結合又は受容体の２量化を妨げずにある程度ＴＬＲ３シグナル伝達を調節することができる抗体の部類を特徴付ける。
（実施例２３）
ＴＬＲ３が欠如すると、脂質のプロファイル及び肝臓脂肪症が改善される。
モデル
ＴＬＲ３-/-マウスは、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手し、前述してある（Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１７１〜６、２０００）。ＴＬＲ３-/-及び野生型（ＷＴ）の対照マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両方に、普通の餌、又は６０．９％ ｋｃａｌの脂肪及び２０．８％ ｋｃａｌの炭水化物からなる高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｐｕｒｉｎａ ＴｅｓｔＤｉｅｔ ＃５８１２６）のいずれかを与えた。マウスは、水及び食餌を自由摂取させ、１２時間／１２時間の明暗サイクルに維持した。各マウスの重量は毎週測定され、データは、平均値±ＳＤで示された。ＲＮＡ単離及び組織学的分析のために、肝臓のサンプルを採った。
臨床化学計器（Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｃａｌｄｗｅｌｌ、ＮＪ）を使って、総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びトリグリセリド（ＴＧ）の血漿レベルを測定した。ＮＥＦＡキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を使って、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルを測定した。製造者の推奨に従って、サンプルの調製及びアッセイを行った。
ＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って製造者のプロトコルに従い、総肝臓ＲＮＡをランダムへキサマーで逆転写した。ＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入された。脂質及びグルコース代謝並びに炎症に関与した合計３５の遺伝子が、遺伝子発現分析のために試験された。遺伝子発現の相対定量は、２−ＤｅｌｔａＤｅｌｔａＣｔ計算を用いて行われた（Ａｒｏｃｈｏら、Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１５：５６〜６１、２００６）。
組織学のために、肝臓を単離し、湿重量を測定した。肝臓サンプルを１０％の中性緩衝ホルマリン中に固定し、所定のパラフィン切片のために処理し、ＨＥ染色した。組織学的評価により、肝臓脂肪症のレベルを測定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて、統計的分析を行った。
結果
ＨＦＤを与えられた動物は、２６週間のＨＦＤ後、高インスリン血症及び高血糖性であった（１４週間のデータ地点に関して実施例１５を参照）。脂質プロファイルは３３週間で検査された。通常食のＴＬＲ３-/-マウスは、ＷＴ対照と比較して、血漿ＴＧは著しく下がったが、ＴＣ、ＨＤＬ、ＬＤＬ、（表１５）及びＦＦＡのレベルは、類似していた。３３週間の高脂肪食では、ＷＴ対照動物の血漿ＴＣ、ＨＤＬ、及びＬＤＬレベルは上がったが、ＴＬＲ３-/-マウスはある程度保護された（表１５）。肝臓の重量（対応する体重に正規化された）は、ＨＦＤを与えられたＷＴ動物のものと比較して、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３-/-マウスではおよそ１６％、ｐ＜０．０５減少した。組織学的分析は、ＷＴ動物と比較したときに、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３-/-動物の脂質蓄積も肝実質において著しく減少したことを示した。
脂質及びコレステロール代謝に関与する主要遺伝子、ＬＸＲα及びＰＰＡＲδの肝臓発現は、ＷＴ動物と比較すると、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３-/-マウスでは上方調節され（それぞれ３０％、ｐ＜０．０５及び１８６％、ｐ＜０．００１）、これは、ＴＬＲ３が欠乏しているマウスにおける低脂質レベルと一致していた。ＬＸＲα標的遺伝子であるＡＢＣＡ１及びＳＲＥＢＰ１も、これらの動物において上方調節された（それぞれ７１％、ｐ＜０．０１及び１３１％、ｐ＜０．００１）。ＴＬＲシグナル伝達とＬＸＲとの間のクロストークが報告されている（Ｃａｓｔｒｉｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：８０５〜１５、２００３）。コレステロール輸送体であるＡＢＣＡ１の上方調節は、ＨＦＤを与えられたＴＬＲ３-/-マウスにおいてコレステロール輸送が改善されたことを示唆する。
Figure 2014526464
この実施形態で報告された研究により、野生型動物と比較すると、肥満症のＴＬＲ３が欠乏した動物の脂質及びコレステロールレベルが改善されたことが立証され、抗ＴＬＲ３シグナル伝達が心臓血管疾患及び代謝性疾患のための有効な治療手段であることを示す。

Claims (7)

  1. 治療上有効量のＴＬＲ３と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、ＩＩ型糖尿病、高血糖症又は高インスリン症を治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、ＩＩ型糖尿病、高血糖症又は高インスリン症の治療方法。
  2. 治療上有効量のＴＬＲ３と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、心臓血管疾患を治療するのに十分な時間にわたって投与することを含む、心臓血管疾患の治療方法。
  3. 治療上有効量のＴＬＲ３と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、患者の総コレステロールを下げるのに十分な時間にわたって投与することを含む、患者の総コレステロールを下げる方法。
  4. 治療上有効量のＴＬＲ３と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、患者の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を下げるのに十分な時間にわたって投与することを含む、患者の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を下げる方法。
  5. 治療上有効量のＴＬＲ３と反応する単離抗体を、それを必要とする患者に、肝臓の脂肪蓄積を低減させるのに十分な時間にわたって投与することを含む、肝臓の脂肪蓄積を低減させる方法。
  6. ＴＬＲ３抗体と反応する前記単離抗体が、配列番号７０、７７及び７２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、並びに配列番号６７、６８及び７８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む、請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。
  7. ＴＬＲ３抗体と反応する前記単離抗体が、配列番号８２、８６及び８４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、並びに配列番号７９、８０及び８７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む、請求項１、２、３、４又は５に記載の方法。
JP2014529662A 2011-09-12 2011-09-12 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト Pending JP2014526464A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2011/051202 WO2013039471A1 (en) 2011-09-12 2011-09-12 Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014526464A true JP2014526464A (ja) 2014-10-06

Family

ID=47883555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014529662A Pending JP2014526464A (ja) 2011-09-12 2011-09-12 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP2755685A4 (ja)
JP (1) JP2014526464A (ja)
KR (1) KR20140075708A (ja)
CN (1) CN104159610A (ja)
BR (1) BR112014005786A2 (ja)
CA (1) CA2855955A1 (ja)
EA (1) EA201490623A1 (ja)
IL (1) IL231413A0 (ja)
MX (1) MX362457B (ja)
NZ (1) NZ622260A (ja)
WO (1) WO2013039471A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6366195B2 (ja) * 2013-04-22 2018-08-01 国立大学法人 東京大学 炎症性疾患の予防又は治療剤
WO2015016282A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 国立大学法人東京大学 放射線誘導性消化管症候群の予防又は治療用医薬組成物
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
MA43023A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps de récepteur de la transferrine humaine/anti-humaine cd20 bispécifique et leurs procédés d'utilisation
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008521440A (ja) * 2004-11-30 2008-06-26 セントカー・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト、方法および使用
WO2010040054A2 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for suppressing toll-like receptor activity
WO2010051470A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Toll-like receptor 3 antagonists
WO2010127113A2 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Centocor Ortho Biotech Inc. Toll-like receptor 3 antagonists

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
DK0859841T3 (da) 1995-08-18 2002-09-09 Morphosys Ag Protein/(poly)peptidbiblioteker
SG158098A1 (en) * 2004-11-30 2010-01-29 Centocor Inc 22 30 74 Date Of Toll like receptor 3 antagonists, methods and uses
US20080299138A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Duffy Karen E Toll-Like Receptor 3 Modulators and Uses Thereof
JP2012505654A (ja) 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008521440A (ja) * 2004-11-30 2008-06-26 セントカー・インコーポレーテツド Ｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト、方法および使用
WO2010040054A2 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for suppressing toll-like receptor activity
WO2010051470A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Toll-like receptor 3 antagonists
WO2010127113A2 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Centocor Ortho Biotech Inc. Toll-like receptor 3 antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
MX362457B (es) 2019-01-18
MX2014002982A (es) 2015-07-06
CN104159610A (zh) 2014-11-19
KR20140075708A (ko) 2014-06-19
EP2755685A4 (en) 2015-07-01
CA2855955A1 (en) 2013-03-21
IL231413A0 (en) 2014-04-30
WO2013039471A1 (en) 2013-03-21
EP2755685A1 (en) 2014-07-23
EA201490623A1 (ru) 2016-01-29
BR112014005786A2 (pt) 2017-03-28
NZ622260A (en) 2016-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9932404B2 (en) Methods of reducing clinical symptoms of viral infection by administering a toll-like receptor 3 antagonist
JP5727463B2 (ja) Ｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト
JP2018118970A (ja) 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト
US8460659B2 (en) Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
JP2014526464A (ja) 代謝性疾患及び心臓血管疾患を治療するためのｔｏｌｌ様受容体３アンタゴニスト

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20140819

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150630

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150930

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160105