CN101415438B

CN101415438B - Toll样受体3拮抗剂、方法和用途

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Publication number: CN101415438B
Application number: CN200580047396.4A
Authority: CN
Inventors: J·卡顿; M·坎宁安; A·达斯; K·杜菲; D·M·奈特; R·兰布; M·L·姆鲍夫; G·拉亨纳坦; L·桑马特奥; R·T·萨里斯基; N·斯托威尔; R·斯维特; S·赵; S·陈; J·吉尔斯-科马; K·皮查; V·斯托亚诺维克-苏苏利克; T·J·戈尔茨
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: CN101415438A; ZA200705206B; SG158098A1; UA97229C2

Abstract

公开了TOLL样受体3(TLR3)拮抗剂，编码TLR3拮抗剂或其片段的多核苷酸，和制备和使用它们的方法。

Description

TOLL样受体3拮抗剂、方法和用途

发明领域

本发明涉及Toll样受体3(TLR3)拮抗剂，编码TLR3拮抗剂或其片段的多核苷酸，和制备和使用它们的方法。

发明背景

与炎性状况相关的病理学代表着卫生保健的重大挑战，且可能是痛苦的、使人虚弱的和致死的。例如，脓毒症和脓毒症-相关状况在美国每年影响超过750,000人，死亡率为28-50％，每年造成215,000人死亡(Natanson等，Crit.Care Med.26：1927-1931(1998)；Angus等，Crit.Care Med.29：1303-1310(2001))。其它炎性状况例如炎性肠疾病(IBD)、Crohn氏病和溃疡性结肠炎在美国每年影响超过1百万人(Hanauer等，Rev.Gastroenterol.Disord.3：81-92(2003))。

影响肺功能的炎性肺状况例如慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、哮喘和肺感染在美国也影响很大数目的人。例如，COPD影响估计一千万成年美国人，且患病率在增加(Mapel等，Manag.Care Interface17：61-66(2004))。与这些炎性状况有关的病理学和这些状况的恶化，具有重大的健康和经济影响。

肺病例如哮喘和COPD的恶化的特征在于，症状的恶化和肺功能的下降。病毒感染与许多肺病的恶化有关(Johnston，Am.J.Respir.Crit.Care Med.152：S46-52(1995)；Bandi等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.37：69-75(2003))，且被认为是恶化的主要原因。病毒感染后促炎细胞因子在肺中的分泌，代表着促进各种肺病中的炎症反应的关键步骤(Gern等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.28：731-737(2003)；Panina-Bordignon等，Curr.Opin.Pulm.Med.9：104-110(2003))。

胰岛素耐受性已经被公认为代谢综合征的完整特征，它包括葡萄糖耐受不良、胰岛素耐受性、肥胖、高甘油三酸酯血症、低HDL胆固醇、高血压和加速的动脉粥样硬化(Wisse，J.Am.Soc.Nephrol.15：2792-800(2004))。尽管肥胖、2型糖尿病和胰岛素耐受性之间的素因已经非常确定，但仍然不清楚控制肥胖-相关的胰岛素耐受性和2型糖尿病的分子和细胞机理。

肥胖个体表现出高水平的促炎细胞因子例如TNF-α、IL-1b和IL-6的事实，已经提示了下述假说，即肥胖-诱导的胰岛素耐受性是炎性状况(Karin等，Nat.Rev.Drug Discov.3：17-26(2004))。因而，炎症、肥胖、胰岛素耐受性和异常的脂质代谢可能构成代谢综合征的共同特征。实际上，可能干扰关键的炎性转录因子例如NF-kβ和IKKβ的非类固醇类药物例如环加氧酶抑制剂，增加2型糖尿病动物模型和人患者的胰岛素敏感性(Karin等，同上)。而且，最近的数据支持了胰岛素耐受性和炎症之间的关联，正如下述能力所证实的：在髓样细胞中条件地敲除IKKb的小鼠显示出总胰岛素敏感性且变得被保护免受胰岛素耐受性，以及在肝中超表达IKKb的小鼠发展全身性胰岛素耐受性(Arkan等，Nat.Med.11：191-198(2005)；Cai等，Nat.Med.11：183-90(2005))。总之，这些结果提供了将肥胖、胰岛素耐受性和2型糖尿病与炎性疾病相联系的有力基本理论。

宿主免疫系统对微生物抗原的识别，由先天性免疫受体介导，它的激活代表着启动炎症反应的重要步骤。Toll-样受体(TLR)代表着在介导对外来抗原的免疫反应中起关键作用的先天性免疫受体家族。例如，TLR3是哺乳动物模式识别受体，它识别双链(ds)RNA以及合成的ds RNA类似物聚-核糖肌苷酸-核糖胞苷酸(聚(I:C))，(Alexopoulou等，Nature 413：732-238(2001))。而且，已经表明TLR3识别内源配体，例如从坏死细胞释放的mRNA(Kariko等，J.Biol.Chem.26：12542-12550(2004))，从而表明炎症部位的坏死细胞死亡可能有助于TLR3的激活。

聚(I:C)或内源mRNA配体对TLR3的激活诱导促炎细胞因子和趋化因子的分泌，该发现表明，TLR3激动剂在感染-相关的炎症过程中调节疾病结果。因而，认为TLR3体内连接是发生在病毒感染(Tabeta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：3516-3521(2004))或与炎症相关的坏死(Kariko等，J.Biol.Chem.26：12542-12550(2004))的背景下。总之，这些数据证明，TLR3的连接启动磷酸化和转录激活事件的级联，这导致许多炎性细胞因子的生成，认为这些炎性细胞因子有助于先天免疫(综述见Takeda和Akira，J.Derm.Sci.34：73-82(2004))。而且，这些数据表明，持续的TLR3激活可以是调节感染-相关的炎性疾病的关键组分。公开的数据支持了该假设，正如将促炎细胞因子超表达与全身性炎症反应综合征、感染-相关的急性细胞因子暴发(综述见Van Amersfoort等，Clin.Microbiol.Rev.16：379-414(2003))和免疫-介导的慢性状况例如类风湿性关节炎(综述见Miossec等，Curr.Opin.Rheumatol.16：218-222(2004))和炎性肠疾病(综述见Ogata和Hibi，Curr.Pharm.Des.9：1107-1113(2003))相关联的发现所证实的。

尽管体外研究已经证实，用聚(I:C)刺激肺上皮细胞引起多种细胞因子、趋化因子的分泌，和转录因子的诱导，以及TLR的高表达(Ieki等，Clin.Exp.Allergy 34：745-52(2004)；Sha等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.31：358-64(2004))，但仍然不清楚这些事件的生理相关性。

与炎性状况和其它状况相关的这些病理学，例如与感染有关的状况，具有重大的健康和经济影响。然而，虽然在许多医学领域取得了进步，但相当少的治疗选择和疗法可以用于许多这样的状况。

例如，用高剂量的皮质类固醇和抗-IgE(例如XOLAIR

牌omalizumab)治疗肺病恶化。已经表明，吸入的皮质类固醇与β2激动剂的联合，可以有效地减少恶化的发病率。但是，由于这些治疗剂仅能减少发展恶化的危险，且与显著的副作用有关，所以需要预防和治疗肺病恶化的替代治疗方式。

因而，需要理解TLR3在炎性状况中的作用，并利用该作用来开发能有效地治疗这些状况的试剂，例如拮抗剂。

附图简述

图1显示了来自抗-人TLR3(hTLR3)单克隆抗体拮抗剂的重链可变区序列(CDR标有下划线)。

图2显示了来自抗-hTLR3单克隆抗体拮抗剂的轻链可变区序列(CDR标有下划线)。

图3显示了TLR3拮抗剂对聚(I:C)诱导的人肺上皮衍生细胞中IL-6细胞因子生产的抑制。

图4显示了TLR3拮抗剂对聚(I:C)诱导的人肺上皮衍生细胞中IL-8细胞因子生产的抑制。

图5显示了TLR3拮抗剂对聚(I:C)诱导的人肺衍生细胞中RANTES细胞因子生产的抑制。

图6显示了TLR3拮抗剂对聚(I:C)诱导的原代人支气管-上皮细胞中MIP1-α细胞因子生产的抑制。

图7显示了TLR3拮抗剂对聚(I:C)诱导的原代人支气管-上皮细胞中IL-6细胞因子生产的抑制。

图8显示了敲除TLR3活性对IBD-相关的体重减轻的作用。

图9显示了TLR3拮抗剂对IBD-相关的体重减轻的抑制。

图10显示了通过用TLR3拮抗剂治疗，鼠脓毒症模型的提高的存活。

图11显示了TLR3拮抗剂对鼠脓毒症模型中IL-6细胞因子生产的减少。

图12显示了TLR3拮抗剂对鼠脓毒症模型中TNF-α细胞因子生产的减少。

图13显示了聚(I:C)诱导的鼠肺组织中炎症细胞总数的增加。

图14显示了聚(I:C)诱导的鼠肺组织中嗜中性粒细胞的增加。

图15显示了聚(I:C)诱导的鼠肺组织中单核炎症细胞的增加。

图16表明，用单剂聚(I:C)激活TLR3进一步损害乙酰甲基胆碱攻击的小鼠的肺功能。

图17表明，用多剂聚(I:C)激活TLR3进一步损害乙酰甲基胆碱攻击的小鼠的肺功能。

图18表明，在乙酰甲基胆碱攻击过程中，保护TLR3敲除小鼠免受单剂聚(I:C)诱导的肺功能损害。

图19表明，在乙酰甲基胆碱攻击过程中，保护TLR3敲除小鼠免受多剂聚(I:C)诱导的肺功能损害。

图20显示了TLR3拮抗剂对人肺支气管上皮细胞中细胞因子和趋化因子生产的作用。

图21显示了通过用TLR3拮抗剂预防和治疗，致死性肺炎鼠模型的提高的存活。

图22显示了感染亚致死剂量的流感病毒A/PR/8和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)后，鼠模型中致死性肺炎的发展。

图23显示了流感病毒A/PR/8和肺炎链球菌感染的小鼠的肺中的细菌负荷。

图24A、B、C和D显示了在ELISA测定中人-适应的抗-TLR3mAb与hTLR3的结合。

图25显示了在基于细胞的细胞因子释放测定中，人-适应的抗-TLR3mAb的评价。

图26显示了用IP-10示值读数，在基于细胞的生物活性测定中评价变体mAb HBV1至HBV8(不包括HBV4)。

图27显示了用RANTES示值读数，在基于细胞的生物活性测定中评价变体mAb HBV1至HBV8(不包括HBV4)。

图28显示了用IL-8示值读数，在基于细胞的生物活性测定中评价变体mAb HBV1至HBV8(不包括HBV4)。

图29显示了用MCP-1示值读数，在基于细胞的生物活性测定中评价变体mAb HBV1至HBV8(不包括HBV4)。

图30显示了用IL-6示值读数，在基于细胞的生物活性测定中评价变体mAb HBV1至HBV8(不包括HBV4)。

图31A和B表明，喂饲高脂肪饮食的TLR3敲除小鼠被保护免于发展与高脂肪饲养有关的受损葡萄糖耐量。

图32表明，喂饲高脂肪饮食26周后，TLR3敲除小鼠具有正常的空腹血糖水平。

图33A、B和C显示了喂饲高脂肪饮食26周后，在葡萄糖攻击之前和之后，TLR3敲除小鼠中禁食胰岛素水平的增加。

图34A、B、C、D和E显示了与野生型喂饲高脂肪饮食的小鼠相比，喂饲高脂肪饮食30周的TLR3敲除小鼠的提高的脂质特性。

图35显示了在诱导慢性DSS结肠炎的过程中，用TLR3拮抗剂进行预防性(Pr)和治疗性(T)处理的实验方案。

图36显示了伴随每个DSS摄食周期发生的TLR3拮抗剂对体重减轻的保护。

图37显示了第二个DSS周期后TLR3拮抗剂的体重减轻和恢复。

图38显示了第三个DSS周期后TLR3拮抗剂的体重减轻和恢复。

图39显示了TLR3拮抗剂治疗对与慢性DSS结肠炎相关的净体重减轻的作用。

图40显示了TLR3拮抗剂治疗对与慢性DSS结肠炎相关的结肠缩短的作用。

图41A、B和C显示了TLR3拮抗剂治疗对慢性DSS结肠炎的严重性的作用。图41D、E和F显示了hTLR3拮抗剂治疗对慢性DSS结肠炎的组织病理学作用。

图42显示了慢性DSS结肠炎中的T-细胞激活。

图43显示了预防性TLR3拮抗剂治疗对脾中DSS-相关的CD11b+细胞增加的作用。

图44显示了TLR3拮抗剂治疗对慢性DSS结肠炎中IL-4和IL-10的全身水平的作用。

发明概述

本发明的一个方面是，抑制细胞生产RANTES的Toll样受体3(TLR3)拮抗剂。

本发明的另一个方面是，与TLR3反应的分离的抗体，其具有包含下述氨基酸序列的单克隆抗体的抗原结合能力：SEQ ID NO：9、11和13所示的重链互补性决定区(CDR)的氨基酸序列，和SEQ IDNO：19、21和23所示的轻链CDR的氨基酸序列。

本发明的另一个方面是，与TLR3反应的分离的抗体，其包含SEQ ID NO：9、11和13所示的重链互补性决定区(CDR)的氨基酸序列，和SEQ ID NO：19、21和23所示的轻链CDR的氨基酸序列。

本发明的另一个方面是分离的抗体，其具有式(I)所示的V_H CDR1氨基酸序列：

Thr Thr Tyr Trp Xaa₁ His

(I)

其中Xaa₁是Ile或Met(SEQ ID NO：61)；

式(II)所示的V_H CDR2氨基酸序列：

Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa₂ Xaa₃ Glu Lys Xaa₄ Lys Thr

(II)

其中Xaa₂是Tyr或Gly，Xaa₃是Asn或Ala，且Xaa₄是Phe或Gly(SEQID NO：62)；和

式(III)所示的V_H CDR3氨基酸序列：

Val Gly Val Xaa₅ Ile Thr Thr Phe Pro Tyr

(III)

其中Xaa₅是Met或Ile(SEQ ID NO：63)；

和具有SEQ ID NO：19、21和23所示的氨基酸序列的V_L CDR。

本发明的另一个方面是，分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：9、11和13所示的CDR氨基酸序列的抗体重链。

本发明的另一个方面是，分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：19、21和23所示的CDR氨基酸序列的抗体轻链。

本发明的另一个方面是，分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：6、25、27、29、31、45、47、49、51或53所示的氨基酸序列的抗体重链。

本发明的另一个方面是，分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：16、33、35、37或39所示的氨基酸序列的抗体轻链。

本发明的另一个方面是，治疗或预防炎性状况的方法，其包含，将治疗有效量的TLR3拮抗剂施用给需要的患者足以治疗或预防炎性状况的时间。

本发明的另一个方面是，提高细胞的增殖速率的方法，其包含，使TLR3拮抗剂接触表达TLR3受体的细胞足以提高细胞的增殖速率的时间。

发明详述

在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都如完整描述一样在本文中引作参考。

本文使用的术语“拮抗剂”指一种分子，其通过任意的机理，部分地或完全地抑制另一种分子例如受体的作用。如本文所使用的，“TLR3拮抗剂”或“与TLR3反应的”化合物指一种分子，其能直接或间接地基本上抵消、减少或抑制TLR3生物学活性或TLR3受体激活。这样的拮抗剂可以是，例如，小有机分子、肽、多肽、融合蛋白、抗体、抗体片段、mimetibody或多核苷酸。

本文使用的术语“抗体”具有广泛的含义，且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体，单克隆抗体，包括鼠、人、人-适应的、人源化的和嵌合的单克隆抗体和抗体片段。

通常，抗体是表现出对特定抗原的结合特异性的蛋白或肽链。完整的抗体是异源四聚体糖蛋白，由2个相同的轻链和2个相同的重链组成。一般地，每个轻链通过一个共价二硫键连接到重链上，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每个重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在一个末端具有可变结构域(V_H)，其后面是许多恒定结构域。每个轻链具有在一个末端的可变结构域(V_L)和在另一个末端的恒定结构域；轻链恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，且轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，可以将任意脊椎动物物种的抗体轻链归入2个明显不同的类型之一，即kappa(κ)和lambda(λ)。

根据重链恒定结构域氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分成5个主要类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。进一步将IgA和IgG细分成同种型IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

术语“抗体片段”指完整抗体的部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段、双抗体、单链抗体分子和由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体。

本文使用的术语“抗原”指具有直接或间接地产生抗体的能力的任何分子(或者，称作免疫原)。在“抗原”的定义中包括编码蛋白的核酸。

“CDR”定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，4th ed.，U.S.Department of Health andHuman Services，National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中，存在3个重链和3个轻链CDR或CDR区。因而，如果合适，本文使用的“CDR”指所有3个重链CDR，或所有3个轻链CDR，或所有重链和所有轻链CDR。

CDR提供抗体与抗原或表位结合的大多数接触残基。本发明中的目的CDR源自供体抗体可变重链和轻链序列，且包括天然存在的CDR的类似物，该类似物也共有或保留与它们所来源的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。

本文使用的术语“上皮细胞”指源自覆盖自由表面(例如，皮肤)的部分或衬在动物管或腔(例如，结肠)内的膜状细胞组织的细胞。这样的细胞可以是分离的，或包含部分更高度组织化的细胞群体，例如在组织、器官或它们的体外模型中发现的那些。

术语“同源物”指与参照序列具有40％至100％序列同一性的蛋白序列。hTLR3的同源物包括来自其它物种的多肽，其与已知的hTLR3序列具有40％至100％序列同一性。使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA)的AlignX模块的缺省设置，通过逐对比对，可以确定2个肽链之间的百分比同一性。“TLR3”指hTLR3和它的同源物。全长人TLR3氨基酸序列和编码多核苷酸序列分别见SEQ ID NO：1和2。

本文使用的术语“与……相联合”指，所述试剂可以在混合物中一起，作为单一试剂同时地，或作为单一试剂以任意的次序先后地，施用给动物。

本文使用的术语“炎性状况”指对细胞损伤的局部化反应，它部分地由细胞因子、趋化因子或炎症细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)的活性介导，其在大多数情况下的特征是疼痛、发红、肿胀和组织功能丧失。本文使用的术语“炎性肺状况”指影响肺或与肺有关的炎性状况。

本文使用的术语“mimetibody”指具有通式(I)的蛋白：

(V1-Pep-Lk-V2-Hg-C_H2-C_H3)(t)

(I)

其中V1是免疫球蛋白可变区N-末端的部分，Pep是结合细胞表面TLR3的多肽，Lk是多肽或化学键，V2是免疫球蛋白可变区C-末端的部分，Hg是免疫球蛋白铰链区的部分，C_H2是免疫球蛋白重链C_H2恒定区，C_H3是免疫球蛋白重链C_H3恒定区，且t独立地是1-10的整数。mimetibody可以模仿不同类型的免疫球蛋白分子例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE的性质和功能，这取决于存在于构建体中的重链恒定结构域氨基酸序列。在有些mimetibody实施方案中，V1可以不存在。本发明的mimetibody拮抗剂通过结合细胞表面TLR3，影响TLR3生物学活性。

本文使用的术语“单克隆抗体”(mAb)指从大量基本上均匀的抗体得到的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，一般地针对单一抗原决定簇。修饰语“单克隆”指抗体的基本上均匀的特性，且不需要通过任何特殊方法生产抗体。例如，鼠mAb可以通过Kohler等，Nature 256：495-497(1975)的杂交瘤方法来制备。通过美国专利号4,816,567公开的方法，可以制备含有源自供体抗体(通常是鼠)的轻链和重链可变区联合源自受体抗体(通常是另一种哺乳动物物种，例如人)的轻链和重链恒定区的嵌合mAb。通过本领域技术人员已知的技术，例如美国专利号5,225,539公开的技术，可以制备人-适应的mAb，其具有源自非-人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR，且该分子的剩余的免疫球蛋白-衍生部分源自一种或多种人免疫球蛋白。任选地，通过例如Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：10029-10032(1989)和Hodgson等，Bio/Technology，9：421(1991)公开的技术，通过掺入改变的构架支持残基来保持结合亲和力，可以进一步修饰人-适应的mAb。

可用于人适应的示例性人构架序列参见，例如，

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.ncbi.nih.gov/igblast；

www.atcc.org/phage/hdb.html；www.mrc-

cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php ；www.kabatdatabase.com/top.html；

ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat；www.sciquest.com；

www.abcam.com；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；

www.public.iastate.edu/～pedro/research_tools.html；

www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab；

www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html；

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html；www.immunologylink.com；

pathbox.wustl.edu/～hcenter/index.html；www.appliedbiosystems.com；

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody；www.m.ehime-

u.ac.jp/～yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com；

www.cancerresearchuk.org；www.biotech.ufl.edu；www.isac-net.org；

baserv.uci.kun.nl/～jraats/linksl.html；www.recab.uni-

hd.de/immuno.bme.nwu.edu；www.mrc-cpe.cam.ac.uk；

www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；http://www.bioinf.org.uk/abs；

antibody.bath.ac.uk；www.unizh.ch；www.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s；

www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html；

www.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/TAHHP.html；

www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；

www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.jerini.de；

imgt.cines.fr；和Kabat et al.，Sequences of Proteins of

Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1987)，其各自在本文中整体引作参考。

通过例如Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-851(1996)和Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)所述的技术，可以从人免疫球蛋白转基因小鼠制备缺少任何非人序列的全人mAb。通过例如Knappik等，J.Mol.Biol.296：57-86(2000)和Krebs等，J.Immunol.Meth.254：67-84(2001)所述的技术，也可以从噬菌体展示文库制备和最优化人mAb。

本文使用的术语“增殖速率”指每单位时间细胞数目的变化，或每单位时间表现出细胞周期向细胞分裂进展的标记的细胞的数目的变化。这样的标记可以是形态学的、DNA复制指示剂或表达的基因产物。

本文使用的术语“TLR3生物学活性”或“TLR3受体激活”指作为配体结合细胞表面TLR3的结果发生的任何活性。

本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸密码：

氨基酸三字母密码单字母密码

丙氨酸 ala A

精氨酸 arg R

天冬酰胺 asn N

天冬氨酸 asp D

半胱氨酸 cys C

谷氨酸 glu E

谷氨酰胺 gln Q

甘氨酸 gly G

组氨酸 his H

异亮氨酸 ile I

亮氨酸 leu L

赖氨酸 lys K

甲硫氨酸 met M

苯丙氨酸 phe F

脯氨酸 pro P

丝氨酸 ser S

苏氨酸 thr T

色氨酸 trp W

酪氨酸 tyr Y

缬氨酸 val V

物质组合物

本发明涉及能抑制TLR3受体-介导的信号传导的拮抗剂和这样的拮抗剂的用途。这样的TLR3拮抗剂可以具有结合TLR3受体和抑制TLR3受体-介导的信号传导的性质。这样的拮抗剂抑制TLR3信号传导的示例性机理包括，抑制激酶活性、转录物减少或受体拮抗。能通过其它机理抑制TLR3受体-介导的信号传导的其它拮抗剂，也在本发明的各个方面和实施方案的范围内。这些拮抗剂可以用作研究试剂、诊断试剂和治疗剂。

本发明的一个方面是，抑制细胞生产RANTES(受激活作用调节的正常T-细胞表达和分泌的)细胞因子的Toll样受体3(TLR3)拮抗剂。本发明的另一个方面是，抑制细胞生产RANTES和选自白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP1-α)的细胞因子的TLR3拮抗剂。

在另一个方面，本发明提供了与TLR3反应的分离的抗体，其具有单克隆抗体的抗原结合能力，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO：9(V_H CDR1)、11(V_H CDR2)和13(V_H CDR3)所示的重链互补性决定区(CDR)的氨基酸序列和SEQ ID NO：19(V_L CDR1)、21(V_L CDR2)和23(V_L CDR3)所示的轻链CDR的氨基酸序列。示例性抗体是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：9、11和13所示的重链CDR氨基酸序列，和SEQ ID NO：19、21和23所示的轻链CDR氨基酸序列。

本发明的另一个方面是，与TLR3反应的分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的V_H和具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的V_L。

本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其能编码任一种本发明的抗体或其它蛋白TLR3拮抗剂或它的补体。在本文中公开了某些示例性多核苷酸，但是，给定遗传密码的简并性或在给定表达系统中的密码子优选，编码本发明的抗体或其它蛋白TLR3拮抗剂的其它多核苷酸也在本发明的范围内。

本发明的另一个方面是，包含SEQ ID NO：9、11和13所示的CDR氨基酸序列的抗体重链。

本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：19、21和23所示的CDR氨基酸序列的抗体轻链。

本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列的抗体重链。示例性多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：5。

本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码包含SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列的抗体轻链。示例性多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：15。

本发明的另一个方面是人-适应的mAb，其包含SEQ ID NO：25、27、29或31所示的V_H氨基酸序列和SEQ ID NO：33、35、37或39所示的V_L氨基酸序列。编码SEQ ID NO：25、27、29和31所示的V_H氨基酸序列和SEQ ID NO：33、35、37和39所示的V_L氨基酸序列的分离的多核苷酸，也是本发明的一个方面。这些人-适应的mAb包含SEQ ID NO：9、11和13所示的V_H CDR氨基酸序列，和SEQID NO：19、21和23所示的V_L CDR氨基酸序列。编码SEQ ID NO：25、27、29和31的V_H氨基酸序列的示例性核酸序列分别显示为SEQID NO：26、28、30和32。编码SEQ ID NO：33、35、37和39的V_L氨基酸序列的示例性核酸序列分别显示为SEQ ID NO：34、36、38和40。本发明的人-适应的单克隆抗体的一个具体实施方案包含，SEQ ID NO：25所示的V_H氨基酸序列和SEQ ID NO：33所示的V_L氨基酸序列。

本发明的另一个实施方案是分离的抗体，其具有式(I)所示的V_HCDR1氨基酸序列：

Thr Thr Tyr Trp Xaa₁ His

(I)

其中Xaa₁是Ile或Met(SEQ ID NO：61)；

式(II)所示的V_H CDR2氨基酸序列：

Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa₂ Xaa₃ Glu Lys Xaa₄ Lys Thr

(II)

其中Xaa₂是Tyr或Gly，Xaa₃是Asn或Ala，且Xaa₄是Phe或Gly(SEQ ID NO：62)；和

式(III)所示的V_H CDR3氨基酸序列：

Val Gly Val Xaa5 Ile Thr Thr Phe Pro Tyr

(III)

其中Xaa₅是Met或Ile(SEQ ID NO：63)；

和具有SEQ ID NO：19、21和23所示的氨基酸序列的V_L CDR。

示例性种类包括下述抗体，其具有SEQ ID NO：33所示的V_L氨基酸序列，和包含式(I)(其中Xaa₁是Met)的V_L-CDR1、分别如SEQ ID NO：11和13所示的V_L-CDR2和V_L-CDR3氨基酸序列的V_H氨基酸序列(SEQ ID NO：45，示例性核酸显示为SEQ ID NO：46)。在该种类中，Xaa₁是Met；Xaa₂是Tyr；Xaa₃是Asn；Xaa₄是Phe；且Xaa₅是Met。

其它示例性种类包括下述抗体，其具有SEQ ID NO：33所示的V_L氨基酸序列，和包含分别如SEQ ID NO：9和13所示的V_H-CDR1和V_H-CDR3氨基酸序列、和式(II)的V_H-CDR2的V_H氨基酸序列：

其中

Xaa₂是Gly，Xaa₃是Asn，且Xaa₄是Pbe(SEQ ID NO：47，示例性核酸序列显示为SED ID NO：48)；

Xaa₂是Tyr，Xaa₃是Ala，且Xaa₄是Phe(SEQ ID NO：49，示例性核酸序列显示为SED ID NO：50)；和

Xaa₂是Tyr，Xaa₃是Asn，且Xaa₄是Gly(SEQ ID NO：51，示例性核酸序列显示为SED ID NO：52)。

其它示例性种类包括下述抗体，其具有SEQ ID NO：33所示的V_L氨基酸序列，和包含分别如SEQ ID NO：9和11所示的V_H-CDR1和V_H-CDR2氨基酸序列和式(III)(其中Xaa₅是Ile)V_H-CDR3的V_H氨基酸序列(SEQ ID NO：53，示例性核酸序列显示为SED ID NO：54)。

总之，示例性种类包括具有下述V_L和V_H氨基酸序列组合之一的抗体：

本发明还包括分离的抗体，其中V_H具有SEQ ID NO：45、47、49、51或53所示的氨基酸序列，且V_L具有SEQ ID NO：33、35、37或39所示的氨基酸序列。

示例性抗体拮抗剂可以是IgG、IgD、IgGA或IgM同种型的抗体。另外，这样的拮抗剂抗体可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(peg化))和脂质化(lipidation)的方法，被翻译后修饰。这样的修饰可以体内或体外地发生。例如，可以将本发明的抗体缀合到聚乙二醇上(PEG化)，以提高它们的药物代谢动力学特征。通过本领域技术人员已知的技术，可以进行缀合。已经表明，治疗性抗体与PEG的缀合增强药物动力学，而不妨碍功能。参见Deckert等，Int.J.Cancer 87：382-390，2000；Knight等，Platelets 15：409-418，2004；Leong等，Cytokine 16：106-119，2001；和Yang等，Protein Eng.16：761-770，2003.

通过本领域技术人员已知的技术，通过Fc修饰，也可以增强本发明的抗体的药物代谢动力学性质。例如，IgG4同种型重链在它们的铰链区含有Cys-Pro-Ser-Cys(CPSC)基序，其能形成重链间或重链内二硫键，即CPSC基序中的2个Cys残基可以与其它重链中的对应Cys残基形成二硫键(重链间)，或者给定CPSC基序中的2个Cys残基可以彼此形成二硫键(重链内)。认为体内异构酶能将IgG4分子的重链间键转化成重链内键，反之亦然(Aalberse和Schuurman，Immunology 105：9-19(2002))。因此，由于在铰链区具有重链内键的这些IgG4分子中的重链：轻链(HL)对不能彼此共价结合，所以它们可以解离成HL单体，后者然后与源自其它IgG4分子的HL单体重新结合，从而形成双特异性的、异源二聚体IgG4分子。在双特异性的IgG抗体中，抗体分子的2个Fab的不同之处是它们结合的表位。用Pro替代IgG4铰链区中的Ser228产生“IgG1-样行为，”即，该分子形成稳定的重链间二硫键，并因此，不易与其它IgG4分子进行HL交换。在一个实施方案中，本发明的抗体包含具有S228P突变的IgG4Fc结构域。

另外，可以去除本发明的抗体中的影响与Fc受体(除了FcRn补救受体以外)的结合的位点。例如，可以去除本发明抗体中的参与ADCC活性的Fc受体。例如，IgG1铰链区中的Leu234/Leu235至L234A/L235A的突变，或IgG4铰链区中的Phe234/Leu235至P234A/L235A的突变，使FcR结合最小化，并减少免疫球蛋白介导依赖于补体的细胞毒性和ADCC的能力。在一个实施方案中，本发明的抗体将包含具有P234A/L235A突变的IgG4Fc结构域。

在本发明的另一个实施方案中，抗体将包含具有S108P、P114A和L115A突变的IgG4Fc结构域，该Fc结构域具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。编码SEQ ID NO：41的示例性核酸序列显示为SEQ ID NO：42。在全长IgG4重链中，突变坐标是S228P、P234A和L235A。

全人的、人-适应的、人源化的和亲和力-成熟的抗体分子或抗体片段在本发明的范围内，mimetibody、融合蛋白和嵌合的蛋白也如此。

本发明的拮抗剂可以以小于或等于约10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11或10^-12M的K_d结合TLR3。使用任何合适的方法，可以实验地确定给定分子对TLR3受体例如hTLR3的亲和力。这样的方法可以使用本领域技术人员已知的Biacore或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。

通过包含抗体亲和力成熟的技术和其它本领域公知的适用于非-抗体分子的技术，可以从变体或片段文库中选择以所需的亲和力结合给定TLR3同源物的拮抗剂分子。

本发明的另一个实施方案是，包含至少一种本发明的多核苷酸的载体。这样的载体可以是质粒载体、病毒载体、基于转座子的载体或适合通过任何方式将本发明的多核苷酸导入给定生物或遗传背景中的任何其它载体。

本发明的另一个实施方案是宿主细胞，其包含本发明的任意多核苷酸，例如编码包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的多肽的多核苷酸，和编码包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的多肽的多核苷酸。其它示例性宿主细胞包含编码包含SEQ ID NO：25、27、29、31、45、47、49、51或53之一的多肽的多核苷酸，和编码包含SEQ ID NO：33、35、37或39的多肽的多核苷酸。这样的宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古细菌(archeal)细胞。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽或其它动物起源的。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，例如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)、Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它有用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些，例如CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。

本发明的另一个实施方案是，制备与TLR3反应的抗体的方法，其包含，培养本发明的宿主细胞，和回收由宿主细胞生产的抗体。这样的抗体可以是下面例证的TLR3拮抗剂抗体：分别包含SEQ IDNO：6和16所示的重链和轻链氨基酸序列的mAb 1068，或人-适应的mAb 1068或人-适应的mAb 1068的CDR变体，其包含SEQ IDNO：25、27、29、31、45、47、49、51或53所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：33、35、37或39所示的轻链氨基酸序列。

本发明的另一个实施方案是，生产本发明的抗体的杂交瘤细胞系。

治疗方法

本发明提供了预防和治疗其中需要减弱TLR3活性的状况的方法。可以用TLR3拮抗剂治疗或预防的状况包括由细胞因子介导的状况，和完全或部分地源自TLR3的激活或通过TLR3途径的信号传导的状况。本发明包括抑制细胞生产RANTES或RANTES以及IL-6、IL-8或MIP1-α的方法，其包含，使本文公开的TLR3拮抗剂例如分离的抗体与表达TLR3受体的细胞接触足以抑制这些细胞因子生产的时间。

本发明的方法可以用于治疗属于任意分类的动物患者。这样的动物的实例包括哺乳动物，例如人、啮齿类动物、狗、猫和农场动物，和其它动物类别，例如鸟、爬行动物和鱼。不希望受任何具体理论的约束，认为TLR3拮抗剂的治疗益处将是由于这样的拮抗剂抑制参与有些炎性状况的促炎趋化因子和细胞因子分泌的能力。还认为，TLR3拮抗剂的治疗益处将是由于这样的拮抗剂增加细胞增殖并从而促进组织修复的能力。

例如，本发明的方法可以用于治疗或预防患者的炎性状况和促进组织修复(例如创伤之后的伤口或烧伤愈合)。另外，本发明的方法也提供了体外细胞密度。

任意的TLR3拮抗剂可以用于本发明的预防和治疗方法中。作为实例，本文公开的任意分离的抗体可以用作治疗或预防炎性状况或促进组织修复的TLR3拮抗剂。具体地，有用的是与TLR3反应的分离的抗体，其具有包含下述氨基酸序列的单克隆抗体的抗原结合能力：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13所示的V_H CDR氨基酸序列，和SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23所示的V_L CDR氨基酸序列。其它有用的抗体包含具有SEQ IDNO：25、27、29、31、45、47、49、51或53所示的氨基酸序列的V_H，和具有SEQ ID NO：33、35、37或39所示的氨基酸序列的V_L。

可以容易地确定足以治疗或预防给定炎性状况的给定TLR3拮抗剂的量。在本发明的方法中，可以单独地或与至少一种其它分子组合地施用TLR3拮抗剂。这样的其它分子可以是其它TLR3拮抗剂分子或具有不通过TLR3受体信号传导介导的治疗益处的分子。抗生素、抗病毒剂、镇静剂和可以降低细胞因子水平或活性的其它化合物，是这样的其它分子的实例。

在治疗或预防炎性状况的方法的另一个实施方案中，通过抑制TLR3基因表达，降低TLR3活性。通过降低TLR3生物学活性的表达以抑制TLR3介导的信号传导的任何方式，可以抑制TLR3基因表达。这样的方式包括，例如，通过重组的基因灭活，以灭活基因组DNA(例如，基因敲除、启动子劫持(promoter hijacking)或其它基因诱变方法)和基因转录物灭活(例如，沉默RNA或反义RNA)。本领域技术人员会认识到用于降低有活性的TLR3表达的许多其它方式。

因而，本发明的一个方面是，治疗或预防炎性状况的方法，其包含，将治疗有效量的TLR3拮抗剂施用给需要的患者足以治疗或预防炎性状况的时间。

这样的炎性状况的一个实例是脓毒症-相关状况。脓毒症是对感染的全身性反应，在严重情况下，它会造成器官衰竭和死亡。脓毒症在医学上定义为，源自病毒、细菌、真菌或寄生物感染的全身性炎症反应综合征(SIRS)。由病毒、细菌、真菌或寄生物感染和由坏死细胞释放的dsRNA，可以促进脓毒症的发作。脓毒症-相关状况可以包括SIRS、脓毒性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。尽管不希望受具体理论的约束，但认为用TLR3拮抗剂治疗，可以通过延长脓毒症-相关炎性状况患者的存活时间提供治疗益处，或通过加强先天性抗微生物活性，通过证实与抗微生物剂组合时的协同活性，通过使促成病理学的局部炎症状态最小化，或通过前述方式的任意组合，预防局部炎症事件(例如，在肺中)扩散成全身性状况。这样的干涉可以足以允许确保患者存活所必需的其它治疗(例如，治疗潜在感染或降低细胞因子水平)。

这样的炎性状况另一个实例是炎性肠疾病。炎性肠疾病可以是Crohn氏病或溃疡性结肠炎。本领域技术人员会认识到已知或未知造成肠炎的病因学的其它炎性肠疾病。另外，TLR3拮抗剂可以用于治疗和预防与溃疡性结肠炎或Crohn氏病有关的肠外后遗症，例如关节痛和关节炎，包括强直性脊柱炎、骶髂关节炎和牛皮癣脊椎关节炎。其它肠外后遗症包括粘膜与皮肤损伤例如口腔溃疡、结节红斑(有疼痛的硬结的卵球形小结的发展)和特征在于深度严重皮肤溃疡的坏疽性脓皮病；眼科并发症，例如巩膜外层炎、虹膜炎和葡萄膜炎；肾病，例如肾石病；肝胆病，例如原发性硬化性胆管炎、特征在于与溃疡性结肠炎Crohn氏病有关的纤维炎症的慢性肝病；和骨病，包括骨量疏松症和骨量减少，其可以作为长期使用皮质类固醇的并发症而发生。也包括IBD-诱导的肺功能障碍和呼吸病症，包括间质性肺炎、气管狭窄、细支气管炎、细支气管炎闭塞性机化性肺炎(bronchiolitisobliterans organizing pneumonia)、肺血管炎、结节病、慢性支气管炎和表现出具有嗜曙红细胞增多的肺浸润的临床状况。

这样的炎性状况的另一个实例是感染-相关状况。感染-相关状况可以包括病毒或细菌性肺炎，包括严重肺炎、囊性纤维化、支气管炎、气管恶化和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这样的感染-相关状况可以包含多种感染，例如原发性病毒感染和继发性细菌感染。

这样的炎性状况的另一个实例是炎性肺状况。示例性炎性肺状况包括感染诱发的肺状况，包括与病毒、细菌、真菌、寄生物或朊病毒感染有关的那些；变应原诱发的肺状况；污染物诱发的肺状况，例如石棉沉着病、硅沉着病或铍中毒(berylliosis)；胃抽吸诱发的肺状况；免疫调节失常；遗传诱发的炎性肺状况，例如囊性纤维化；和身体创伤诱发的肺状况，例如呼吸器损伤(ventilator injury)。这些炎性状况也包括哮喘、肺气肿、支气管炎、COPD、结节病、组织细胞增多病、淋巴管肌瘤病(lympangiomyomatosis)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺病、支气管肺发育异常、社区获得性肺炎、医院性肺炎、呼吸器-相关的肺炎、脓毒症、病毒性肺炎、流感感染、副流感感染、人偏肺病毒(metapneumovirus)感染、呼吸道合孢病毒感染和曲霉或其它真菌感染。

这样的炎性状况的另一个实例是2型糖尿病、肥胖、异常脂血(dislipidemia)和代谢综合征。TLR3拮抗剂可以用于抑制与肥胖和胰岛素耐受性有关的炎症性过程。TLR3信号传导的抑制会提高患者的脂质特性，即总胆固醇水平的降低和HDlc/LDLc比的增加。TLR3信号传导的抑制，也会导致胰岛素分泌的增加，从而导致胰岛素耐受性的提高。现有的2型糖尿病治疗伴有许多有害的副作用，包括低血糖症和体重增加。预期使用TLR3拮抗剂来治疗2型糖尿病具有更少的副作用和持续的药物代谢动力学特性。另外，使用具有长循环半衰期的化合物(例如本发明的分离的抗体)的治疗，只需要低频率的给药。

另外，脂质特性的提高，可能会延迟或预防与肥胖和2型糖尿病有关的心血管疾病(例如动脉粥样硬化)的发展。另外，TLR3信号传导的抑制，会导致胰岛素循环水平的增加，这是通过对胰岛细胞的直接作用，或通过影响脂质特性和保护胰岛免受高脂质水平诱发的恶化。因此，单独的或与其它疗法相组合的TLR3抑制，可能延缓胰岛素治疗在2型糖尿病中的引入，和避免与胰岛素治疗有关的不希望的副作用。

另外，丙型肝炎和HIV感染患者易于发展胰岛素耐受性和2型糖尿病，这是由于脂质在肝中的积累或肝不能对胰岛素刺激作出反应，后者是由于治疗剂产生的肝硬化或纤维化。在该高度受损害的患者群体中，TLR3拮抗剂对TLR3信号传递的抑制，可以靶向感染和胰岛素耐受性。

本发明的方法可以预防或治疗的其它炎性状况和神经病包括，多发性硬化，硬化红斑狼疮，和神经变性病和中枢神经系统(CNS)病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、双相性精神障碍和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，肝病，包括纤维化、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)，关节炎，类风湿性关节炎，牛皮癣性关节炎和青少年类风湿性关节炎(JRA)，骨质疏松症，骨关节炎，胰腺炎，纤维化，脑炎，银屑病，巨细胞性动脉炎，强直性脊椎炎，自身免疫性肝炎，人免疫缺陷病毒(HIV)，炎性皮肤状况，移植，癌症，变态反应，内分泌疾病，其它自身免疫性疾病和气道高反应性。

本发明的另一个方面是，提高细胞的增殖速率的方法，其包含降低细胞中的TLR3活性，例如通过使细胞接触TLR3拮抗剂。在本发明该方面的一个实施方案中，细胞可以来自组织，例如上皮或结肠组织。上皮细胞可以源自任何上皮组织，例如胃肠道上皮、皮肤上皮、肺上皮或支气管肺上皮。炎性状况可以影响任何组织，例如心脏组织和胃肠道组织，从而导致结构和功能上偏离正常组织。在有些情况下，这样的炎性状况可以是遗传因子或感染的结果。在其它情况下，这样的炎性状况可以是创伤例如烧伤的结果。本领域技术人员会认识到许多由涉及的不同组织表现出的不同的炎性状况和相关病理学。

本发明的另一个方面是，治疗源自细胞死亡的状况的方法，其包含，将治疗有效量的TLR3拮抗剂施用给需要的患者足以治疗该状况的时间。

本发明的另一个方面是，预防源自细胞死亡的状况的方法，其包含，将治疗有效量的TLR3拮抗剂施用给需要的患者足以预防该状况的时间。

施用/药物组合物

本发明拮抗剂的治疗性应用的施用模式可以是任何适合递送试剂给宿主的途径。蛋白、抗体、抗体片段和mimetibody和这些试剂的药物组合物，特别适用于肠胃外施用，即，皮下地、肌内地、皮内地、静脉内地、鼻内地或通过吸入。

本发明的拮抗剂可以制备成药物组合物，其含有在可药用载体中的有效量的拮抗剂作为活性成分。含有拮抗剂的水性悬浮液或溶液，优选地在生理pH缓冲，以易于注射的形式，是优选的。用于肠胃外施用的组合物通常包含本发明拮抗剂的溶液或其溶于可药用载体(优选含水载体)中的混合物。可以使用许多种含水载体，例如，0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，且通常不含有颗粒物质。这些溶液可以通过常规的、众所周知的灭菌技术(例如，过滤)灭菌。根据近似生理条件的需要，组合物可以含有可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂等。本发明拮抗剂在这样的药物制剂中的浓度可以广泛变化，即从小于约0.5％、通常在或至少约1％至高达15或20％(按重量计)，且将根据选择的具体施用模式，主要基于流体体积、粘度等选择。

因而，本发明的肌内注射用药物组合物可以制备成含有1mL无菌缓冲水，和约1ng至约100mg例如约50ng至约30mg、或更优选约5mg至约25mg本发明的拮抗剂。类似地，本发明的静脉内输注用药物组合物可以配制成含有约250ml无菌林格溶液，和约1mg至约30mg、且优选5mg至约25mg本发明的拮抗剂。用于制备肠胃外施用组合物的实际方法是众所周知的，且更详细记载在，例如，“Remington′s Pharmaceutical Science”，15th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA。

当在药物制剂中时，本发明的拮抗剂可以以单位剂量形式存在。本领域技术人员可以容易地确定适宜的治疗有效剂量。如果需要，可以在治疗时间段过程中医师认为适当的时间间隔重复确定的剂量。

可以冻干本发明的拮抗剂，以用于保藏和在使用前在适当载体中重构。已经表明，该技术对于常规的免疫球蛋白和蛋白制剂是有效的，且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。

通过将这样的分子提供给细胞的任何技术，可以施用拮抗剂。对于细胞，体外拮抗剂施用可以通过例如给培养基补加拮抗剂。对于细胞，体内拮抗剂施用可以通过例如将拮抗剂静脉内注射进动物或组织。本领域技术人员会认识到将拮抗剂体外或体内地施用给细胞的其它方式。这样的方式也包括，将试剂递送给上面讨论的宿主的那些模式。

现在，将参考下面的具体的非限制性实施例，描述本发明。

实施例1

抗-hTLR3拮抗剂mAb的鉴别

通过基于细胞的筛选测定，鉴别能阻断经过hTLR3受体的信号传导的抗-hTLR3拮抗剂mAb。使用标准技术(Kohler等，1976)，在BALB/C小鼠中生成生产抗-hTLR3mAb的杂交瘤库。通过皮内注射编码hTLR3的氨基酸1-703的质粒DNA(SEQ ID NO：3)，用hTLR3免疫小鼠。氨基酸1-703与预测的hTLR3胞外细构域相对应(SEQ IDNO：4)。最初，给小鼠注射10ug质粒DNA，2周后进行第二次10μgDNA注射。在第二次10μg质粒DNA注射后2周，给每只小鼠施用15μg DNA的加强注射。在B细胞融合前3天，给小鼠静脉内注射溶于磷酸缓冲盐水(PBS；10mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)中的15μg hTLR3蛋白。然后从免疫的小鼠收获脾，并使用标准方法(Kohler等，1976)进行B细胞融合。使用含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷的培养基，选择杂交瘤，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，初步筛选抗-TLR3抗体。通过有限稀释，克隆生成抗-hTLR3mAb的单个杂交瘤。

通过基于细胞的筛选测定，使用稳定地超表达hTLR3的人A549衍生的肺上皮细胞系，鉴别生成抗-TLR3拮抗剂mAb的杂交瘤。从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，得到用于生成这些测定的筛选和对照细胞系的A549细胞(ATCC CRL：CCL-185)。筛选细胞系是A549衍生的细胞系，称作A549-hTLR3。用编码hTLR3和新霉素抗性基因的哺乳动物质粒表达载体，稳定转染A549-hTLR3细胞。对照A549衍生的细胞系称作A549-neo。用只编码新霉素抗性基因的哺乳动物质粒表达载体，稳定转染A549-neo细胞。根据生产商的说明书和选择和克隆的标准方法，通过Lipofectamine

(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)转染，生成这些稳定转染的细胞系。在标准条件下，在含有10％FBS、1％MEM非必需氨基酸(Gibco Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)、1mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、20mM HEPES和0.5mg/ml G418的极限必需培养基(MEM)中，培养A549-hTRL3和A549-neo细胞。

使用A549-hTLR3细胞的基于细胞的筛选测定，鉴别出了一个hTLR3拮抗剂mAb，称作mAb 1068。这些筛选测定的基础原理是，存在于A549-hTLR3细胞中的hTLR3受体的聚(I:C)刺激导致增强的细胞因子生产。通过筛选测定鉴别出的候选物hTLR3拮抗剂mAb会抑制A549-hTLR3细胞中聚(I:C)介导的经过hTLR3受体的信号传导，并与未暴露于mAb的对照A549-hTLR3细胞相比，造成减少的细胞因子生产。

在加5μg/ml聚(I:C)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)之前，通过在37℃与试验mAb一起温育A549-hTLR3细胞30分钟进行筛选测定；24小时后，测量细胞培养物上清液中的细胞因子水平。同样处理对照A549-hTLR3细胞，尽管这些细胞未与试验mAb一起温育。根据生产商的指导，使用Luminex多通道分析(Luminex Corp.，Austin，TX)和IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)和RANTES(受激活作用调节的正常T细胞-表达并可能分泌的)特异性的mAb缀合的珠，在筛选测定中测量细胞的细胞因子生产水平。通过这样的测定，鉴别了hTLR3结合、拮抗剂mAb 1068。

使用标准方法，从表达mAb 1068的杂交瘤，克隆了编码mAb1068的重链和轻链的重链和轻链核酸序列。mAb 1068重链和轻链核酸和氨基酸序列分别显示在图1和2和SEQ ID NO：6和16。使用标准方法，生成包含编码重组mAb 1068(r1068)的重链和轻链核酸序列的细胞系。

实施例2

hTLR3拮抗剂对人肺衍生细胞中IL-6、IL-8和RANTES细胞因子生产的抑制

如图3、图4和图5所示，通过与1068 mAb或TLR3.7 mAb一起在37℃温育A549-hTLR3细胞30分钟，然后加入5μg/ml聚(I：C)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)，进行IL-6、IL-8和RANTES特异性的细胞因子测定。24小时后，使用Luminex

仪器(Luminex Corp.，Austin，TX)和适宜的IL-6、IL-8或RANTES特异性的mAb缀合的珠，测量细胞培养物上清液中的细胞因子水平。根据生产商的指导，进行每种细胞因子的Luminex

测定。

结果表明，hTLR3拮抗剂mAb 1068抑制人肺上皮衍生的A549-hTLR3细胞中hTLR3-介导的IL-6(图3)、IL-8(图4)和RANTES(图5)细胞因子生产。但是，hTLR3特异性的鼠mAb TLR3.7(eBioscience，San Diego，CA)没有与mAb 1068相同程度地抑制hTLR3介导的、聚(I:C)诱导的IL-6(图3)和IL-8(图4)生产。关于这些人肺-衍生细胞中的RANTES生产(图5)，mAb 1068抑制生产，而mAb TLR3.7增强RANTES生产。1068和TLR3.7 mAb之间的这些差异是重要的，因为以前的工作表明，TLR3.7 mAb可以拮抗hTLR3受体(Matsumoto M.等，Biochem.Biophys Res.Commun.24：1364-1369(2002))。该以前工作报道，TLR3.7 mAb似乎抑制人成纤维细胞衍生的MRC-5细胞中的聚(I:C)诱导的IFN-β生产(MatsumotoM.等，Biochem.Biophys Res.Commun.24：1364-1369(2002))。本文的结果清楚地表明，1068hTLR3拮抗剂mAb抑制比TLR3.7mAb更广谱的细胞因子的生产，且在该基础上，可以彼此区分这两种mAb。

实施例3

hTLR3拮抗剂对原发人支气管-上皮细胞中MIP1-α和IL-6细胞因子生产的抑制

hTLR3拮抗剂mAb 1068抑制原代人支气管-上皮细胞中hTLR3-介导的MIP1-α(图6)和IL-6(图7)细胞因子生产。如图6或图7所示，通过与1068 mAb或非特异性多克隆小鼠IgG制剂一起在37℃温育原代人支气管-上皮细胞30分钟，然后加入5μg/ml聚(I:C)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)，进行MIP1-α和IL-6特异性的细胞因子测定。24小时后，使用Luminex

仪器(LuminexCorp.，Austin，TX)和适宜的MIP1-α或IL-6特异性的mAb缀合的珠，测量细胞培养物上清液中的细胞因子水平。根据生产商的指导，进行每种细胞因子的Luminex

测定。从人组织样品分离了原代人支气管-上皮细胞，并使用标准方法进行培养。

实施例4

敲除TLR3活性减轻炎性肠疾病症状的严重性

通过敲除TLR3受体基因活性，减轻了IBD鼠模型中的炎性肠疾病(IBD)症状的严重性(图8)。在已经摄食右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)的动物中，可以建立Crohn氏病和溃疡性结肠炎模型(Hendrickson B.A.等，Clin Microbiol Rev.15：79-94，2002)。在这些动物模型中观察到的症状包括相当大的体重减轻(图8)和上皮细胞溃疡。这些症状模仿在IBD(例如溃疡性结肠炎或Crohn氏病)患者中观察到的那些症状。在该IBD鼠模型中，DSS处理的TLR3敲除小鼠没有丧失相当大的体重(图8)，并发展相对于DSS处理的野生型小鼠更轻的上皮细胞损伤，如通过组织病理学分析所评估的。这些结果表明，TLR3信号传导可以在炎症过程(例如参与IBD的过程)中起关键作用。

在这些实验中，如图8所示，给每只雌性野生型C57BL/6小鼠或TLR3敲除小鼠(Alexopoulou等，Nature，413：732-738(2001))随意施用溶于饮用水中的5％(w/v)右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)或无添加物的水，持续5天，以诱导急性溃疡性结肠炎。所有小鼠都是6-8周龄，且每个治疗组都具有至少5只小鼠。通过观察体重(图8)、结肠重量、粪便稠度、直肠出血和结肠组织病理学的变化，评价DSS处理后结肠炎的发展。根据Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)指南，进行所有这些评价。图8中的数据显示为处理1-5天的百分比重量变化。每个符号代表来自一只小鼠的数据。WT代表野生型小鼠；KO代表TLR3敲除小鼠。水平条代表平均值。显示的数据是3个独立实验的复合。没有接受DSS(图8)的对照野生型和TLR3敲除小鼠表现出类似的重量变化(P＝0.6，t-检验)。接受DSS(图8)的野生型和TLR3敲除小鼠表现出显著不同的重量变化(P＝0.003，t-检验)。

在实验的第5天，从动物收获用于组织病理学分析的结肠。使用标准方法，将结肠包埋入石蜡，切片，并用苏木精和伊红染色。来自接受DSS的野生型小鼠的代表性结肠切片表现出粘膜溃疡和密集的炎性浸润以及隐窝和杯形细胞损失。来自接受无添加物的水的TLR3敲除小鼠的代表性结肠切片，具有与在接受无添加物的水的野生型小鼠结肠中观察到的类似的形态学和组织学。来自接受DSS的TLR3敲除小鼠的代表性结肠包括一些密集的细胞浸润，但是另外表现出完整的粘膜上皮和最小的杯形细胞损失。该组织病理学数据表明，接受DSS的TLR3敲除小鼠发展比接受DSS的野生型小鼠更少的上皮溃疡，并揭示，TLR3活性可以在炎症过程(例如参与IBD的过程)中起关键作用。

实施例5

hTLR3拮抗剂治疗停止炎性肠疾病相关的体重减轻

hTLR3拮抗剂治疗减轻IBD鼠模型中炎性肠疾病(IBD)相关的体重减轻的严重性(图9)。数据揭示，用TLR3拮抗剂进行治疗，可以减轻与IBD例如溃疡性结肠炎和Crohn氏病有关的症状。另外，该结果还表明，TLR3信号传导可以在炎性状况例如IBD中起重要作用。

在这些实验中，如图9所示，给每只雌性野生型C57BL/6小鼠随意施用溶于饮用水中的5％(w/v)右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)，或无添加物的水，持续5天，以诱导急性溃疡性结肠炎。如图9所示，在DSS处理处理的前4天中的每一天，通过腹膜内注射给小鼠，施用溶于PBS载体中的0.2mg的mAb 1068、溶于PBS载体中的0.2mg非特异性小鼠IgG多克隆抗体制剂、或单独的PBS载体。每次注射包含溶于PBS中的0.9ml mAb或非特异性的IgG制剂或0.9ml单独的PBS载体。所有小鼠都是6-8周龄，且每个治疗组都具有至少5只小鼠。通过观察体重(图9)、结肠重量、粪便稠度、直肠出血和结肠组织病理学的变化，评价DSS处理后结肠炎的发展。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。

图9中的数据显示为处理1-4天的百分比重量变化。每个符号代表来自一只小鼠的数据。水平条代表中值。显示的数据是2个独立实验的复合。接受DSS和mAb 1068的小鼠和不接受DSS的小鼠之间没有重量变化的显著差异(P＞0.05，Dunn氏检验；图9)。接受DSS和mAb 1068的小鼠的重量变化明显不同于在接受溶于PBS中的DSS和非特异性IgG或单独的PBS的小鼠中观察到的重量变化(对于二者，P＜0.01；Dunn氏检验；图9)。

实施例6

TLR3敲除小鼠或hTLR3拮抗剂治疗小鼠中慢性结肠炎的严重性降低

在所有研究中，使用6-8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和C57BL/6背景下的TLR3敲除(KO)小鼠(Alexopoulou等，Nature413：732-738，(2001))。给小鼠施用溶于饮用水中的2％(重量/体积)右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)的共3个周期(Okayasu等，Gastroenterology98：694-702(1990))。随意提供DSS水5天，以诱导溃疡性结肠炎，然后提供单纯的饮用水9天。在第14天开始第二个2％DSS的5-天周期，随后是9-天休息。在第28天开始第三个2％DSS周期，这次是7天。在2个不同的时间点，处死小鼠：在研究的第25天，第二个休息时间段以后，或在研究的第37天，第三个DSS周期以后。每个治疗组由至少8小鼠组成。通过观察研究过程中体重的变化，以及另外评价DSS处理后处死后的其它参数，包括结肠长度、结肠重量、粪便稠度、直肠出血和结肠组织病理学，评价结肠炎的发展。

由不清楚研究设计的独立兽医病理学家评价组织病理学。对结肠纵切片的一组变化评分，包括上皮细胞坏死、上皮溃疡和腐肉形成、隐窝损失、隐窝细胞(cryptal cell)增殖、固有层中肉芽组织形成、粘膜下层中的肉芽组织、粘膜下层炎性细胞浸润和粘膜下层水肿。给出的评分反映了如下的病变程度：0，不存在；1，轻度，病灶的；2，轻度，多病灶的；3，中度，经常发现，但是在有限区域；4，严重，经常发现在呈送的组织的许多区域；5，非常严重，延伸到呈送的组织的大部分。使用斯氏t检验(JMP，SAS Institute；GraphPad Prism)，进行统计学分析。溃疡性结肠炎和Crohn氏病患者的症状包括体重减轻、粪便中存在血和结肠上皮层的溃疡。因而，右旋糖酐硫酸酯钠-处理的小鼠中诱发的症状部分地模拟在溃疡性结肠炎或Crohn氏病中看到的症状(Hendrickson等，Clin.Microbiol.Rev.15：79-94(2002))。

每个DSS摄食周期都诱发野生型和TLR3KO小鼠模型的体重减轻。但是，TLR3KO小鼠经历了比野生型小鼠明显更少的体重减轻。TLR3KO小鼠也表现出降低的疾病严重性，如通过大体测量结肠炎症和损伤所评估的：TLR3KO小鼠的结肠缩短明显小于在WT小鼠中观察到的，且TLR3KO小鼠表现出更低频率的直肠出血。结肠粘膜损伤的组织病理学评价与这些大体测量相一致。TLR3KO小鼠的单个细胞坏死、上皮溃疡、上皮腐肉形成、隐窝失控(cryptal dropout)和隐窝脓肿(abcesses)的中值评分低于WT小鼠。这些数据一起表明，TLR3信号传导的缺失赋予对慢性结肠炎小鼠模型疾病的部分保护，并表明，TLR3信号传导可能加重人IBD的疾病严重性。

为了进一步证实TLR3在疾病调节中的作用，用拮抗剂抗-TLR3mAb 1068治疗WT C57BL/6小鼠。DSS-暴露的小鼠组接受0.2mg抗-TLR3mAb 1068，它是预防性的(从第一个DSS周期开始，“Pr”)或“治疗性的”(从第二个DSS周期开始，“Th”；图35)。DSS-暴露的小鼠对照组接受PBS(载体对照)或0.2mg非特异性的阴性对照mAb。另一个对照组不给予DSS。图35中的星号代表着抗-TLR3拮抗剂mAb给药的时间点。

在所有DSS-暴露的小鼠组中，每个DSS摄食周期都跟随着体重减轻(图36)。图36中的每个符号代表至少8只小鼠的平均值，误差条代表标准差。在第0-4、14-18和28-35天，给予DSS。但是，与PBS或对照mAb治疗的组相比，在第二个DSS周期后，用抗-TLR3mAb治疗的组表现出减少的体重减轻和更快的体重恢复速度(图37)。在抗-TLR3 mAb-治疗组中，在第三个DSS周期后的体重减轻也显著减少(图38)。在接受PBS或对照mAb的DSS-暴露的小鼠中，从研究开始(第0天)至研究结束(第37天)的平均净体重减轻是约20％。用抗-TLR3 mAb治疗显著减少体重减轻至约10％(图39)。在图39中，显示的数据是从研究开始(第0天)至研究结束(第37天)的体重％变化，所以正数显示净增加，且负数显示净减轻。抗-TLR3 mAb治疗组的％体重减轻明显小于载体对照(PBS)或非特异性IgG治疗组(预防性抗-TLR3治疗(抗-TLR3P)vs.PBS，P＝0.006；抗-TLR3 P vs.非特异性IgG，P＝0.006)；治疗性抗-TLR3(抗-TLR3Th)vs.PBS，P＝0.001；抗-TLR3Th vs.非特异性IgG，P＝0.009)。每个符号代表一只小鼠；水平条代表平均值。

抗-TLR3mAb治疗也减少结肠缩短的程度。用抗-TLR3mAb预防性或治疗性治疗的小鼠组中的结肠长度，明显大于给予载体或对照mAb的组中的那些(图40)(抗-TLR3P vs.PBS，P＝0.009；抗-TLR3Pvs.非特异性IgG，P＝0.01；抗-TLR3Th vs.PBS，P＝0.03；抗-TLR3Th vs.非特异性IgG，P＝0.04)。

而且，与给予PBS或非特异性对照mAb的对照组相比，用抗-TLR3mAb治疗性治疗的组中的结肠粘膜损伤的严重性明显更低，如通过轻度组织病理学变化(包括上皮细胞坏死、隐窝失控、上皮溃疡和腐肉形成、隐窝损失和隐窝细胞增殖)和慢性修复组织病理学变化(包括固有层中肉芽组织形成、粘膜下层中的肉芽组织、粘膜下层炎性细胞浸润和粘膜下层水肿；图41a)所评估的。在图中显示的数据代表着接受DSS和不同治疗的每组小鼠的所有组织病理学评分的总和，轻度变化的总和，或慢性变化的总和(组：1，PBS载体-治疗的；3，预防性抗-TLR3mAb；4，治疗性抗-TLR3mAb；5，非特异性对照mAb)。每个图中的右边小图上的圆圈，包围着每个治疗组的评分的平均值和标准差。具有最小重叠的圆圈，代表着组间的统计学上显著的差异。

具体地，与PBS或非特异性mAb相比，抗-TLR3mAb治疗减轻上皮溃疡，并预防肉芽组织在粘膜下层和固有层中的形成(图41b)。在图中显示的数据代表着接受DSS和不同治疗的每组小鼠的组织病理学评分(组：1，PBS载体-治疗的；3，预防性抗-TLR3mAb；4，治疗性抗-TLR3mAb；5，非特异性对照mAb)。每个图中的右边小图上的圆圈，包围着每个治疗组的评分的平均值和标准差。具有最小重叠的圆圈，代表着组间的统计学上显著的差异。

为了确定抗-TLR3-赋予的保护的潜在免疫关联，检查了免疫细胞群体和全身性细胞因子水平。发现DSS暴露与脾和肠系膜淋巴结中激活的T细胞数的增加有关(图42)，这与证实T细胞参与该慢性结肠炎模型的公开报道一致。使用流式细胞术来测量脾和肠系膜淋巴结中CD62L^low T细胞的频率，它们分别代表全身和局部T细胞激活。慢性结肠炎与脾和肠系膜淋巴结中激活的CD4+(辅助)T细胞的提高的频率有关，这暗示着辅助T细胞激活的全面增加。脾中激活的CD8+效应T细胞的提高的频率，伴有肠系膜淋巴结中激活的CD8+T细胞的提高的频率，这暗示着效应T细胞向肠场所的运输。显示了第二个DSS周期后从第25天的数据。每个符号代表来自一只小鼠的数据；水平条代表平均值。

另外，在DSS-暴露的小鼠脾中发现了更高频率的CD11b+细胞，这可能反映了结肠炎-相关的炎症巨噬细胞的增加。惊人地，预防性抗-TLR3mAb治疗与显著降低的脾CD11b+细胞频率相关，低至在未暴露于DSS的对照小鼠中看到的水平(图43)。DSS-暴露的抗-TLR3mAb-治疗小鼠脾中CD11b+细胞的百分比，类似于未接受DSS的小鼠，且显著低于接受PBS(P＝0.001)或非特异性IgG(P＝0.02)的DSS-暴露的小鼠。显示了第二个DSS周期后从第25天的数据。每个符号代表来自一只小鼠的数据；水平条代表平均值。

DSS-暴露的小鼠的血清细胞因子特性也表现出与抗-TLR3mAb治疗有关的变化：在预防性地接受抗-TLR3mAb的小鼠中，测得提高的IL-4和IL-10水平(图44)。在诱导慢性DSS结肠炎的过程中，抗-TLR3mAb治疗增强全身性IL-4和IL-10水平。显示了从第25和37天的数据，它们分别代表第二个和第三个DSS周期后的时间点。每个符号代表来自一只小鼠的数据；水平条代表平均值。已经证实，IL-4和IL-10都在炎症的调节中起关键作用。发现IL-10敲除小鼠自发地发展结肠炎，这暗示着IL-10在控制IBD的免疫发病机制中的具体作用。这些结果表明，抗-TLR3mAb治疗改变由DSS摄食诱导的炎症和T细胞反应。

总之，这些数据证实，抗-TLR3mAb对TLR3信号传导的阻断，可以改善慢性结肠炎模型的疾病严重性，并提供抗-TLR3mAb治疗人IBD的潜在功效的证据。

实施例7

hTLR3拮抗剂治疗提高脓毒症存活

通过施用D-半乳糖胺和聚(I:C)，可以在动物例如小鼠中建立脓毒症模型。在这样的模型中，D-半乳糖胺是起脓毒症“致敏物”作用的肝毒素，而聚(I:C)是脓毒症-诱导分子，它模仿dsRNA并激活TLR3。结果表明，TLR3拮抗剂治疗可以使脓毒症鼠模型的动物存活率几乎加倍。

如图10所示，在这些实验中，给雌性野生型C57BL/6小鼠腹膜内注射溶于PBS载体中的1mg hTLR3拮抗剂1068mAb、溶于PBS载体中的1mg非特异性鼠多克隆IgG制剂，或单独的PBS载体。每次注射包含溶于PBS中的1ml mAb或非特异性IgG制剂或1ml单独的PBS载体。次日，通过腹膜内注射，小鼠接收溶于100μl无菌PBS中的10μg聚(I:C)和20mg D-半乳糖胺(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)，如图10所示。每天监控小鼠的存活2次，持续3天。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。结果表明，hTLR3拮抗剂治疗提高脓毒症鼠模型的动物存活率(图10)。

实施例8

hTLR3拮抗剂治疗降低脓毒症鼠模型的IL-6和TNF-α细胞因子生产

hTLR3拮抗剂治疗降低脓毒症鼠模型中炎症相关的IL-6(图11)和TNF-α(图12)细胞因子的血清水平。该结果表明，抑制TLR3活性，可以通过降低TLR3介导的促进脓毒症的细胞因子的生产，促进脓毒症存活。

施用聚(I:C)后2小时，通过CO₂/O₂麻醉的小鼠的眶后窦出血，制备如上面实施例6所述处理的小鼠的血清。通过在室温温育血液，然后在2500rpm离心15分钟，制备血清。在细胞因子测定之前，将血清保藏在-80℃。使用Luminex

仪器(Luminex Corp.，Austin，TX)和适宜的IL-6(图11)或TNF-α(图12)特异性的mAb缀合的珠，测量血清样品中的细胞因子水平。根据生产商的指导，进行每种细胞因子的Luminex

测定。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。

图11和图12中的每个符号都代表来自一只小鼠的数据。水平条代表平均值。显示的数据是2个独立实验的复合。用mAb 1068治疗显著降低施用聚(I:C)后2小时的血清IL-6水平(P＝0.04，t-检验；图11)。用mAb 1068治疗显著降低施用聚(I:C)后2小时的血清TNF-α水平(P＝0.03，t-检验；图12)。

实施例9

聚I:C施用诱导肺中促炎细胞因子的分泌和TLR基因表达的上调

异氟烷麻醉的雄性或雌性野生型C57BL/6小鼠接受3次鼻内施用的溶于PBS中的聚(I:C)或单独的PBS，间隔24小时，持续3天。所有小鼠都是12周龄。每剂聚(I:C)含有表1所示的50μg或100μg聚(I:C)。每剂的体积是50μL。每个治疗组都含有6-8只小鼠。通过CO₂处理，处死小鼠，并在最后给药后24小时，给肺插管。然后通过将1mL PBS注射进肺中，并回收流出物，进行支气管肺泡灌洗(BAL)。然后，将BAL制剂离心，以沉淀细胞，并收集无细胞的上清液，且在用于多通道细胞因子测定之前，保藏在-80℃。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。

使用Luminex

多通道分析(Luminex Corp.，Austin，TX)和适宜的IFNγα、IL-1α、IL-6、CXCL10、JE、KC、MGCSF、MIP1α、RANTES、TNFα或GMCSF特异性的mAb缀合的珠(LINCO Research，St.Charles，MO)，测量BAL上清液中的细胞因子水平。根据生产商的指导，进行每种细胞因子的Luminex

测定。将数据表达为6-8只小鼠的平均值pg/ml±平均值的标准误(SEM)。

结果表明，多次施用50或100μg聚I:C诱导细胞因子、趋化因子和生长因子，包括干扰素-γ(IFNγ)、白细胞介素-6(IL-6)、组织坏死因子-α(TNFα)、趋化因子(CXC基序)配体10(CXCL10)、趋化因子(CC基序)配体2(JE)、趋化因子KC(KC)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、受激活作用调节的正常T细胞表达和分泌的/CCL5(RANTES)、鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的提高的蛋白水平(表1)。该结果表明，TLR3激活可能在细胞因子、趋化因子和生长因子介导的肺病理学例如COPD中起重要作用。

另外，肺组织的Taqman实时PCR分析证实，多次施用引起细胞因子基因以及多种TLR和它们的相关细胞内信号传导分子的mRNA的上调(表2)。这些数据证实，体内施用的聚I:C(一种合成的双链RNA类似物)引起级联事件，从而导致多种促炎细胞因子、趋化因子的分泌和TLR基因表达例如TLR2、TLR3、TLR7和TLR9的上调。

表1：向C57BL/6小鼠的肺多次施用聚(I:C)诱导细胞因子、趋化因子和生长因子向气道中的分泌。将数据表达为6-8只小鼠的平均值pg/ml±平均值的标准误(SEM)。

实施例10

TLR3激活增加肺组织中细胞因子、趋化因子、生长因子和Toll 基因转录物水平

通过实时-PCR(RT-PCR)，测量从如上面实施例8所述处理的雄性或雌性C57BL/6小鼠的肺中提取的总RNA的转录物水平。使用TrizoI^TM(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，从小鼠肺组织样品提取总RNA，并使用RNEasy Mini试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)进行分离。然后，合并来自6-8只相同处理的小鼠的RNA。

根据生产商的说明书，使用Omniscript^TM试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，从每个RNA库制备cDNA。根据生产商的指导，使用TaqMan^TM低密度免疫特性分析阵列卡(Applied Biosystems，FosterCity，CA)或定制的低密度阵列(LDA)卡，扩增100ng cDNA。使用Primer Express^TM软件(Applied Biosystems)来设计探针和引物组合。然后，根据生产商的指导，使用ABI PRISM^TM 7000HT仪器(AppliedBiosystems)，以384孔格式进行TaqMan^TM RT-PCR(AppliedBiosystems)。

使用ABI PRISM^TM 7000HT仪器和相关软件，进行PCR早期指数期的数据收集和转录物定量。针对18S核糖体RNA的转录物水平，标准化单个转录物水平。表2中的数据表达为接受多次聚(I:C)施用的小鼠相对于用PBS载体处理的小鼠的mRNA转录物水平的平均倍数增加。数据代表着来自6-8小鼠的合并的RNA。

数据表明，TLR3激活增加鼠肺组织中的细胞因子、趋化因子、生长因子和Toll基因转录(例如TLR3和其它Toll-样受体)(表2)。该结果进一步表明，TLR3激活和其它Toll样受体(TLR)的激活，可能在细胞因子、趋化因子和生长因子介导的肺病理学中起重要作用。

表2：通过向C57BL/6小鼠肺多次施用聚(I:C)来激活TLR3，增加了细胞因子、趋化因子、生长因子和Toll基因转录物水平。数据表达为接受多次聚(I:C)施用的小鼠相对于用PBS载体处理的小鼠的mRNA转录物水平的平均倍数增加。数据代表着来自6-8小鼠的合并的RNA。

IL-1α	3.37	3.52
			IL-1β	11.96	10.86
IL-2rα	12.17	3.97
			IL-7	4.47	1.43
MUC1	3.05	1.47
			PDGFβ	2.96	2.20
SFTPa	2.32	1.19
			SFTPb	2.50	-
SFTPc	1.89	-
			SFTPd	3.12	1.93
TGFβ	3.05	2.40
			TNFα	105.91	78.45
Vamp8	2.59	1.78
			CXCL10	90.03	357.38
IFNαR1	2.50	2.32
			IFNαR2	3.64	3.01
IFNγR	2.20	1.54
			IRAK1	2.57	1.73
IRAK2	2.56	2.26

IRAK4	2.35	1.72
			IRF3	1.97	1.62
IRF7	17.03	22.92
			ISGF3G	5.63	4.45
OAS2	5.29	10.76
			PRKR	5.49	9.32
RNASE1	2.25	1.91
			SOCS3	3.93	4.63
TLR2	3.72	6.96
			TLR3	3.77	5.41
TLR4	2.43	1.89
			TLR7	6.26	10.86
TLR9	21.21	55.78
			TOLLIP	2.48	1.72

实施例11

TLR3激活增加肺组织中的炎症细胞水平

TLR3激活增加鼠肺组织中的炎症细胞水平(图13、14和15)。该结果表明，TLR3激活可能在与由炎症细胞(图13)例如嗜中性粒细胞(图14)和单核细胞(图15)(例如单核细胞或淋巴细胞)提高的肺浸润相关的肺病理学中起重要作用。

通过血细胞计数器计数(图13)或差异染色(图14和图15)，评价炎症细胞向接受聚(I:C)的C57BL/6小鼠肺中的浸润。小鼠接受如上面实施例9所述的多剂聚(I:C)或单剂聚(I:C)。单剂聚(I:C)鼻内地施用给异氟烷麻醉的雄性或雌性C57BL/6小鼠。所有小鼠都是8-12周龄。单剂包含溶于50μL PBS中的50μg或100μg聚(I:C)。在向接受单剂聚(I:C)的动物施用聚(I:C)后24小时，或在向接受多剂的动物最后施用聚(I:C)后24小时，进行BAL，以回收肺浸润细胞。如上面实施例8所述，进行BAL。

将在处理的小鼠肺上进行BAL后回收的细胞沉淀重新悬浮于200μL Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(DPBS)，其中含有0.1％BSA。然后，将悬浮细胞的50μL等分试样加入50μL Turk氏血稀释流体(RedBird Service，Osgood，IN)，彻底混合，并通过血细胞计数器计数，计算总细胞数(图13)。然后，将含有小于1x 10⁵细胞/μL的悬浮液的100μL等分试样加载到Cytospin^TM载玻片装置上，并在400rpm旋转4分钟。从Cytospin^TM装置取出载玻片，并使其干燥至少1小时。然后，将载玻片浸入Wright-Giemsa染料90秒，并在ddH₂O中脱色5分钟。允许载玻片干燥过夜。在油浸下，使用100x物镜，差异计数载玻片，并计数嗜中性粒细胞(图14)和单核细胞(图15)的总数。然后，将从每个治疗组的6-8只小鼠收集的肺浸润细胞数据的平均值和SEM绘图(图13、14和15)。

实施例12

保护TLR3敲除动物免于聚(I:C)诱导的肺组织中炎症细胞水平增加

通过血细胞计数器计数和差异染色，评价炎症细胞向接受单次或多次聚(I:C)施用的C57BL/6或TLR3敲除小鼠肺中的浸润，以鉴别嗜中性粒细胞和单核细胞。小鼠接受如实施例8所述的多剂聚(I:C)或如实施例10所述的单剂聚(I:C)。在向接受单剂聚(I:C)的动物施用聚(I:C)后24小时，或在向接受多剂的动物最后施用聚(I:C)后24小时，进行BAL，以回收肺浸润细胞。如上面实施例8所述，进行BAL。通过如实施例10所述的血细胞计数器计数或差异染色，评价炎症细胞向野生型C57BL/6或TLR3敲除小鼠肺中的浸润。数据表达为聚(I:C)处理的动物相对于只接受PBS的动物中平均肺浸润细胞计数的平均倍数增加。数据代表着从6只小鼠得到的值。

表3所示的结果表明，相对于野生型小鼠，TLR3敲除小鼠被保护免于聚(I:C)诱导的肺组织中炎症细胞水平增加，且聚(I:C)施用的作用主要是由于TLR3激活。另外，这些结果表明，TLR3激活可能在与炎症细胞例如嗜中性粒细胞和单核细胞(例如，单核细胞或淋巴细胞)提高的肺浸润相关的肺病理学中起重要作用。

表3：相对于野生型(WT)小鼠，TLR3敲除(KO)小鼠被保护免于聚(I:C)诱导的肺组织中炎症细胞水平增加。数据表达为聚(I:C)处理的动物相对于只接受PBS的动物中平均肺浸润细胞计数的平均倍数增加。数据代表着从6只小鼠得到的值。

实施例13

用聚(I:C)激活TLR3进一步损伤乙酰甲基胆碱攻击的动物的肺功能

雄性或雌性野生型C57BL/6小鼠接受单剂溶于PBS中的聚(I:C)或单独的PBS(图16)，或3剂鼻内施用的溶于PBS中的聚(I:C)或单独的PBS，间隔24小时，持续3天(图17)。聚(I:C)激活TLR3。所有小鼠都是12周龄。每剂聚(I:C)含有50μg或100μg聚(I:C)，且包含50μL的体积。每个治疗组含有6-8只小鼠。

使用PenH值作为最后一剂聚(I:C)后24小时气道阻塞和呼吸努力的标记，评价肺功能。通过整个身体体积描记器(WBP)，从如图16或图17指示的递增乙酰甲基胆碱暴露攻击的小鼠收集PenH值。乙酰甲基胆碱增强呼吸努力和损害肺功能。将乙酰甲基胆碱溶于PBS中，并作为雾化的气溶胶施用。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。图16和17中的数据代表着来自每个治疗组6-8只小鼠的平均值和SEM。

这些结果表明，TLR3的激活进一步损伤乙酰甲基胆碱攻击的野生型小鼠的肺功能(图16和图17)。该结果表明，TLR3激活可能进一步损害由于感染、慢性阻塞性肺病(COPD)或其它病症已经遭受肺损伤的个体的肺功能。结果，拮抗TLR3活性的治疗性干预，可以预防已经遭受受损的肺功能的个体的其它肺功能损伤。

实施例14

保护TLR3敲除动物免于乙酰甲基胆碱攻击过程中聚(I:C)诱导的肺功能损伤

如实施例12所述，对雄性或雌性野生型C57BL/6小鼠或TLR3敲除小鼠进行单剂(图18)和多剂(图19)聚(I:C)施用。使用通过如实施例12所述的WBP收集的PenH值，评价肺功能。乙酰甲基胆碱施用也如实施例12所述。根据确立的动物照料和使用指南，进行所有这些评价。图18和19中的数据代表着来自每个治疗组6-8只小鼠的平均值和SEM。

TLR3敲除动物被保护免于乙酰甲基胆碱攻击过程中聚(I:C)诱导的肺功能损伤(图18和图19)。该结果表明，拮抗TLR3活性的治疗性干预，可以预防由于感染、慢性阻塞性肺病(COPD)或其它病症例如哮喘已经遭受受损的肺功能的个体的其它肺功能损伤。另外，该结果进一步表明，聚(I:C)施用的作用主要是由于TLR3激活。

实施例15

hTLR3拮抗剂对人肺支气管上皮细胞中细胞因子和趋化因子生产的作用

从美国典型培养物保藏中心(CRL-9609)得到人肺支气管上皮细胞系BEAS-2B。BEAS-2B生长在胶原I包被的瓶(BD Biosciences)内的LHC-9无血清培养基中，并在0.25％胰蛋白酶/EDTA中简单洗涤后收获。然后在LHC-9无血清培养基(Biosource)中洗涤细胞，并以1x10⁶/ml重新悬浮于LHC-9培养基中。以200μl/孔，将细胞铺平板在胶原I包被的96-孔平底平板上；对于每种条件，进行一式三份培养孔。

温育6小时以使细胞附着后，去除培养基，并替换为200μl新鲜培养基。在37℃，将从100μg/ml开始的10倍mAb 1068系列稀释液温育40分钟，然后加入125ng/孔的TLR3激动剂聚(I:C)。在聚(I:C)刺激后24小时，收集培养物上清液，并在样品上进行Luminex

多通道分析(Luminex Corp.，Austin，TX)，以测定IL-6、IL-8、RANTES、MCP-1、IP-10、IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-12、TNF-α、MCP-1和IL-10表达水平。

结果表明，抗-TLR3拮抗剂mAb 1068(在图20中鉴别为mAbCNTO260)降低聚(I:C)刺激的BEAS-2B细胞中的IL-6、IL-8、RANTES、MCP-1和IP-10生产。如图20所示，IL-6、IL-8、RANTES、MCP-1和IP-10的表达以mAb 1068剂量依赖性的方式降低。在样品中未检测到IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-12、TNF-α、MCP-1和IL-10表达。

实施例16

hTLR3拮抗剂治疗提高致死性肺炎的存活

在这些实验中，用溶于50μL PBS中的5蚀斑形成单位(PFU)的流感病毒A/PR/8鼻内地感染8-10周龄雌性野生型C57BL/6小鼠，再在7天后，用溶于50μL PBS中的50菌落形成单位(CFU)的肺炎链球菌鼻内地感染。单独施用的病毒和细菌剂量是亚致死的，但是它们的剂量总和对于大多数小鼠是致死的(图22)。假感染的小鼠对照组接受替代流感病毒A/PR/8或肺炎链球菌的PBS。在第7天，在肺炎链球菌接种之前2小时，hTLR3拮抗剂治疗的小鼠接受在通过腹膜内注射施用的溶于0.2ml PBS中的0.6mg或0.06mg(预防性施用)，并在第8天再次相同给药(治疗性施用)。假治疗的小鼠对照组接受0.6mg或0.06mg溶于PBS中的腹膜内施用的非特异性IgG。每个治疗或对照组含有7只小鼠。根据IACUC指南，进行所有这些评价。

在鸡蛋中培养流感A/PR/8病毒，使用标准测定，用MDCK细胞确定PFU效价，并维持为用于接种的冷冻病毒原种。在含有5％羊血的胰胨豆胨琼脂平板(TSA/血)上，培养肺炎链球菌(ATCC

号：6301^TM)接种物过夜，然后将细菌从平板上取出，并悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中。使用600nm光密度和标准方法，计算PBS悬浮液中的细菌CFU效价。然后在PBS中制备细菌接种物。通过标准的菌落形成测定，证实细菌接种物的CFU，以确定实际存在于施用给小鼠的接种物中的细菌数。

制备接种物以后，使用如上所述的流感A/PR/8病毒或肺炎链球菌鼻内地感染小鼠。假感染的对照小鼠接受鼻内施用的如上所述的PBS。hTLR3拮抗剂治疗的小鼠如上所述预防性和治疗性地接受腹膜内施用的mAb 1068。假治疗的对照小鼠接受如上所述腹膜内施用的溶于PBS中的非特异性IgG。单独的流感A/PR/8病毒和肺炎链球菌剂量是亚致死的，因为100％的用单独的病毒或细菌感染的小鼠存活(图22)。但是，这些否则是亚致死剂量的病毒或细菌感染一起在大多数小鼠中产生致死性肺炎(图22)。

在细菌感染后48小时，对小鼠实施安死术，无菌地收获肺，在无菌PBS中匀浆，制备溶于PBS中的匀浆稀释液，并将稀释液置于TSA/血平板上，以确定肺中的细菌负荷。然后温育平板，直到可以看到菌落，并计数CFU。如图23所示，先用亚致死剂量的流感病毒感染增加肺炎链球菌感染后2天小鼠肺中的细菌负荷。

与接受0.6mg或0.06mg非特异性IgG对照mAb的对照小鼠相比，在第8和9天给每只小鼠施用0.6mg或0.06mg抗-TLR3mAb1068，增加了用流感病毒A/PR/8和肺炎链球菌感染的小鼠的小鼠存活率(图21)。

重要的是，雌性C57BL/6小鼠的平均体重是18g至20g；结果，接受0.6mg mAb 1068的小鼠施用的TLR3拮抗剂的剂量范围是约3.0mg/kg至3.3mg/kg体重，或接受0.06mg mAb 1068的小鼠是约30mg/kg至33mg/kg体重。标记图21，以指示该范围的低端。

实施例17

TLR3活性对结肠上皮细胞增殖速率的作用

通过敲除TLR3受体基因活性，可以增加鼠模型中结肠上皮细胞的增殖速率(数据显示在表4)。在这些实验中，给上述雌性野生型C57BL/6小鼠或TLR3敲除小鼠各自腹膜内地给予溶于1ml PBS中的1mg溴脱氧尿苷(BrdU)，且在2小时后处死。所有小鼠都是6-8周龄，且每个治疗组含有至少3只小鼠。

然后收获用于组织病理学分析的结肠。固定结肠组织，切成段，包埋入石蜡中，并制备5μm切片。按照生产商的说明书，依次与小鼠抗-BrdU IgG mAb(Becton-Dickinson Biosciences，Inc.，San Jose，CA)山羊抗-小鼠IgG mAb辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Becton-Dickinson Biosciences，Inc.，San Jose，CA)和二氨基联苯胺(DAB)底物(Becton-Dickinson Biosciences，Inc.，San Jose，CA)温育切片。通过标准方法，用苏木精复染色温育的切片。

然后视觉观察温育的切片，并计数BrdU向DNA中的掺入染色阳性的结肠隐窝中的细胞数。在来自相同结肠段的切片中的24个连续的定向较好的隐窝中，计数细胞。BrdU掺入用作替代标记，以鉴别通过细胞周期的细胞发展；即增殖细胞。在表4中，增殖速率数据表达为每2小时每个动物每个结肠隐窝中BrdU染色的细胞的平均数。这些数据表达为平均增殖速率±标准差(P＜0.0001，T-检验)。数据表明，TLR3的灭活增加结肠上皮细胞增殖。

表4：TLR3敲除(KO)小鼠中增加的结肠上皮细胞增殖速率

	野生型小鼠	TLR3基因敲除的小鼠
			结肠上皮细胞增殖速率	2.4±0.6	5.6±1.6

实施例18

在炎性肠疾病恢复过程中，TLR3活性对结肠上皮细胞增殖速率的作用

通过敲除TLR3受体基因活性，增加了在炎性肠疾病(IBD)鼠模型恢复过程中结肠上皮细胞的增殖速率(表5)。在这些实验中，给上述的雌性野生型C57BL/6小鼠或TLR3 KO小鼠各自提供溶于饮用水中的5％(w/v)右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)，持续3天，以诱导急性溃疡性结肠炎。然后给小鼠供给单纯的水，直到30小时后实验结束。在它们开始接受单纯的水后6小时，如上所述给小鼠注射BrdU。然后使小鼠从DSS诱导的溃疡性结肠炎恢复24小时，并处死。所有小鼠都是6-8周龄，且每个治疗组含有至少3只小鼠。

如上面实施例15所述，制备和分析用于结肠隐窝细胞增殖的组织病理学分析的结肠样品。增殖速率数据表达为每24小时每个动物每个结肠隐窝中BrdU染色的细胞的平均数。这些数据表达为平均增殖速率±标准差(P＜0.004，T-检验)。表5中的数据表明，TLR3的灭活增加炎性肠疾病恢复过程中结肠上皮细胞的增殖速率。

表5：在TLR3KO小鼠DSS诱导的炎性肠疾病模型恢复过程中，增加的结肠上皮细胞增殖速率

	野生型DSS处理的小鼠	TLR3基因敲除的DSS处理的小鼠
			结肠上皮细胞增殖速率	0.4±0.2	2.8±0.6

实施例19

TLR3敲除小鼠的胰岛素敏感性

给TLR3敲除(KO)(在C57BL/6背景下)和野生型(WT)对照小鼠(C57Bl/6)喂饲由60.9％千卡脂肪和20.8％千卡碳水化合物组成的高脂肪饮食(Purina TestDiet#58126)。给对照TLR3KO和WT小鼠喂饲普通食物。将动物禁食过夜，并通过腹膜内注射1.0mg/g葡萄糖，进行葡萄糖耐量实验(GTT)，且在第0、15、30、60、90和120分钟，获取血糖读数。

图31表明，与喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠相比，喂饲高脂肪饮食14和26周的TLR3KO小鼠表现出葡萄糖耐量实验的提高。如预期的，用普通食物喂饲的小鼠没有表现出任何变化。这些结果表明，TLR3信号传导可能影响胰岛素敏感性，并提供了使用TLR3拮抗剂来治疗2型糖尿病的基础。

图32显示了喂饲高脂肪和常规食物饮食小鼠的空腹血糖水平。当与喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠相比时，TLR3KO动物使它们的空腹血糖水平标准化。这些数据表明，TLR3信号传导可以干扰肝葡萄糖代谢，这会促成葡萄糖耐量损伤和胰岛素耐受性的发展。

接着，评价了用普通食物或高脂肪饮食喂饲的TLR3KO和野生型小鼠的胰岛素水平。测量在葡萄糖攻击之前和之后禁食过夜的小鼠的血液胰岛素水平。使用Crystal Chem(Downers Grove，IL)超敏ELISA测定试剂盒(目录号90060)，定量胰岛素。在基线(没有葡萄糖攻击)和葡萄糖攻击后20和60分钟，高脂肪饮食喂饲的TLR3KO小鼠表现出提高的胰岛素水平(图33)。总之，在葡萄糖耐量实验中得到的数据表明，TLR3信号传导的缺失影响胰岛素水平和胰岛素敏感性。

在喂饲高脂肪饮食的30周时，处死TLR3KO小鼠，并测定它们血清样品中的脂质特性。测定总胆固醇、HDl、LDL、甘油三酯和FFA的水平。简而言之，使用GEMCAL参照血清(Alfa WassermannDiagnostic Technologies，LCC，West Caldwell，NJ)，通过将未知样品吸光度的变化参照标准中吸光度的变化，校准所有脂质试验。每天进行2个对照水平，然后报告结果。加样，获取脂质数据，并以常规单位mg/dL表达。使用NEFA试剂盒(Wako)，测定FFA水平。与喂饲相同饮食的野生型小鼠相比，TLR3KO动物表现出更低水平的循环胆固醇、LDL和HDL以及FFA。这些结果表明，TLR3信号传导的缺失，在降低胆固醇水平中具有有益作用，从而表明TLR3拮抗剂MAb在治疗心血管疾病和预防与2型糖尿病有关的心血管并发症的发展中的用途。

总之，所述结果表明，与野生型小鼠相比，高脂肪饮食喂饲的TLR3KO小鼠被保护免于发展葡萄糖耐量降低(它是胰岛素耐受性的一个特征)，从而证实了TLR3信号传导的缺失保护小鼠免于2型糖尿病。而且，数据表明，与喂饲高脂肪饮食的野生型小鼠相比，喂饲高脂肪饮食的TLR3KO小鼠表现出更低水平的总胆固醇、LDH和HDL胆固醇以及HDLc/LDLc比，从而表明TLR3拮抗剂在下调与心血管疾病有关的危险因子中的有益作用。这些发现暗示着TLR3抑制剂作为治疗2型糖尿病、异常脂血和代谢综合征的方法的用途。

实施例20

人-适应的抗-TLR3mAb的生成和表征

使用鼠抗-TLR3mAb C1068的氨基酸序列来查询从公共抗体序列数据库编译的人抗体数据库。C1068重链可变区(SEQ ID NO：6)表现出与4个重链种系序列的高度同源性，即人VH1重链家族的VB_1-03/JH172、VB_1-02/JH171、VB_1-08/JH171和VB_1-69/JH270。合成4个核酸构建体，其中将C1068重链的CDR区转入选择的人种系重链序列，以生成4个人-适应的抗-TLR3mAb重链，称作HV1、HV4、HV5和HV7，它们分别具有SEQ ID NO：25、27、29和31所示的可变区氨基酸序列。

C1068轻链可变区(SEQ ID NO：16)表现出与4个轻链种系序列的高度同源性，即人VK I家族的VB_O12/JK278、VB_A30/JK277、VB_A20/JK476和VB_L1/JK276。合成4个核酸构建体，其中将C1068轻链的CDR区转入选择的人种系轻链序列，以生成4个人-适应的抗-TLR3mAb轻链，称作LV1、LV3、LV5和LV7，它们分别具有SEQ ID NO：33、35、37和39所示的可变区氨基酸序列。

表达了16个代表4个重链和4个轻链可变区构建体的所有可能组合的mAb。使用人IgG4重链恒定区，其具有在残基108处的Ser至Pro替代，和Phe114和Leu115至Ala替代(SEQ ID NO：41)；在全长重链中的S228P、F234A和L235A，表达所有重链可变区构架。使用人K恒定区，表达所有轻链可变区构架(SEQ ID NO：4)。

通过共转染适宜的含有重链和轻链的质粒，在哺乳动物细胞中瞬时表达抗体。使用标准的A蛋白纯化，纯化抗体，并向PBS中透析，以进行表征。

使用ELISA格式，与亲本鼠mAb C1068相对比，评价所有16个mAb与人TLR3胞外结构域(SEQ ID NO：4)的结合。简而言之，将可溶人TLR3胞外结构域涂覆在96孔平板的孔中，并以各种浓度(10^-3至10³ng/ml)温育候选mAb，用兔抗-小鼠IgG-HRP检测结合的抗体的鼠IgG1同种型(Zymed，South San Francisco，CA)，或用HRP-标记的抗-人IgG(Jackson 109-036-088)检测人IgG4同种型。测定EC₅₀值，且结果显示在图24和下面的表7中。

表7：组合mAb的计算EC₅₀值

EC₅₀ng/ml	HV1	HV4	HV5	HV7
					LV1	29.2	29.1	15.5	1474.0
LV3	117.7	60.2	28.9	＞5000
					LV5	27.7	18.7	13.7	1820.0
LV7	288.8	182.9	78.6	4258.0

C1068的计算EC₅₀是8ng/ml；结果表明，与鼠亲本mAb 1068相比，12个人-适应的mAb的计算EC₅₀具有小于40-倍的降低。通过Biacore和在基于细胞的细胞因子释放测定中的结合活性，通过测定结合亲和力，进一步表征具有粗体文字的EC₅₀值的mAb。

通过mAb捕获和TLR3捕获技术，使用Biacore测量结合亲和力。使用装配有CM5芯片的Biacore 2000生物传感器，所述生物传感器具有使用A蛋白(6,000RU)通过标准胺偶联在25℃修饰的表面，在25℃进行MAb捕获分析。将抗体稀释至30nM，并在不同的A蛋白表面上捕获1分钟。注射0、0.1、0.3、1.0、3.0和9.0nM的TLR3，并监控结合和解离5分钟。使用2个6秒脉冲100mM磷酸，再生A蛋白修饰的表面。将得到的结合数据集拟合1∶1相互作用模型(CLAMP^TM)。计算速率常数和它们的比(K_D＝k_d/k_a)和进行的对表观平衡常数的估计的拟合的误差。

使用装配有CM5芯片的Biacore 3000生物传感器，所述生物传感器具有使用抗-His抗体(R&D Systems)(10,000RU)通过标准胺偶联在30℃修饰的表面，在25℃进行TLR3捕获分析。将80、120和300RU密度的人六-组氨酸-TLR3捕获到3个表面上，而第四个表面用作参照。一式两份地注射0、0.41.1、3.3、10和30nM的抗体。监控结合阶段3分钟，并监控解离7分钟。使用2个3秒脉冲50mM磷酸，再生抗-His抗体表面。将得到的结合数据集拟合1∶1相互作用模型(BIAeval^TM)，该模型对每个mAb-浓度曲线的不同漂移进行了校正。计算速率常数和它们的比(K_D＝k_d/k_a)和进行的对表观平衡常数的估计的拟合的误差。

在下面的表8中显示了计算的K_D结果。2次测量代表：1)捕获到芯片表面上的抗-TLR3mAb与应用于溶液中的人TLR3的结合亲和力；和2)捕获到芯片表面上的TLR3和应用于溶液相中的抗-TLR3mAb。这些结果表明，当通过固定化的mAb捕获基于溶液的TLR3时，所有候选物都保留nM亲和力，这证实了组合的mAb已经保留了1068的结合特性。当TLR3固定化在芯片上时，大多数候选物会保留紧密的结合特性，该结果与ELISA结合曲线相一致。

表8：组合mAb的计算K_D值

mAb	mAb捕获的K_D	TLR3捕获的K_D
			1068(mIgG1)	1.2±0.7nM	0.316±0.06nM

			HV5/LV5	1.1nM	0.7±0.001nM
HV5/LV1	2.0nM	0.65±0.07nM
			HV1/LV1	3.9nM	1.7±1.2nM
HV4/LV3	0.5nM	3.4±2.8nM
			HV1/LV7	7.2nM	90±18nM

还在基于细胞的细胞因子释放测定中，测定通过Biacore测定的人-适应的抗-TLR3mAb的结合活性。将人肺上皮细胞系BEAS-2B铺平板在96-孔平板上，并向细胞加入溶于无血清基质中的聚(I:C)或与抗体候选物一起预温育的聚(I:C)。4天后，去除条件培养基，并通过Luminex

技术测量可溶细胞因子水平。结果如图25所示，并证实，在人-适应的mAb中，保留了亲本mAb C1068的生物学活性，即TLR3活性的中和，如通过用TLR3配体聚(I:C)攻击的细胞中促炎细胞因子生产的减少测量的。

实施例21

人-适应的C1068重链和轻链变体的生成和表征

鼠抗-TLR3mAb 1068CDR的计算机(in silico)免疫原性分析，揭示了一系列在CDR边界内的aggretope，可以操纵它们来减少序列的免疫原性评分。一旦鉴别出可以操作的区域，就应用序列和结构标准来决定应当使用哪个氨基酸替代。使用这些标准，在重链可变区(V_H)鉴别出4个单点-氨基酸替代，在轻链可变区(Vκ)鉴别出3个突变(单独的、二重的的和三重的)。在HV1/LV1背景下独立地进行所有8个突变，并列在表9中。还应用一种其它类型的替代，以确定将M102残基变为异亮氨酸的作用，实现这一点以减少CDR中的甲硫氨酸的总数，因为这些残基可以被翻译后氧化，即潜在地对蛋白的溶解度有害的一种修饰。如上所述，生成这些抗体，并评价TLR3结合(参见表10和11)和生物活性(参见图26-30)。

表9：CDR点突变的位置和特性

位置	变体编号	SEQ ID NO：
			Vh CDR1 134M	HBV1	45

			Vh CDR2 Y60GVh CDR2 N61AVh CDR2 F64G	HBV2HBV3HBV4	474951

			Vh CDR3 M1021	HBV5	53

			VκCDR1 H30SVκH30S/N31SVκCDR1H30S/N31S/N28G	HBV6HBV7HBV8	555759

表10：TLR3结合测定中Vh CDR变体的计算EC₅₀

变体	HBV1	HBV2	HBV3	HBV4	HBV5
						EC₅₀(ng/ml)	17	14.6	48	40.9	74.7

表11：TLR3结合测定中VκCDR变体的计算EC₅₀

变体	HBV6	HBV7	HBV8
				EC₅₀(ng/ml)	1223	＞5000	＞5000

如对人TLR3的结合EC50所指示的，较好地耐受在移植进HV1/LV1背景中的1068CDR的Vh中产生的所有5个单点突变。测得HV1/LV1背景的EC₅₀是29.2ng/ml；I34M和Y60G的值都低于该值，分别是17和14.6ng/ml。这表明，这些变化不但降低HV1/LV1的计算机免疫原性，而且提高与TLR3的结合。其它3个突变的结合比HV1/LV1略小。

不能耐受Vl的CDR1中的突变(EC₅₀＞1000ng/ml)，从而表明该区域对于1068如何识别人TLR3是关键的。

现在，已经充分描述了本发明，对本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，对其作出许多变化和改进。

序列表

<110>CENTOCOR，INC.

<120>TOLL样受体3拮抗剂、方法和用途

<130>CEN5083 PCT

<140>TO BE ASSIGNED

<141>2005-11-30

<150>60/631,815

<151>2004-11-30

<150>60/636,399

<151>2004-12-15

<150>60/641,877

<151>2005-01-06

<150>60/713,195

<151>2005-08-31

<150>60/727,610

<151>2005-10-18

<160>63

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>2712

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60

tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120

aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180

aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240

gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300

ttaaaagttt tgaacctcca gcacaatgag ctatctcaac tttctgataa aacctttgcc 360

ttctgcacga atttgactga actccatctc atgtccaact caatccagaa aattaaaaat 420

aatccctttg tcaagcagaa gaatttaatc acattagatc tgtctcataa tggcttgtca 480

tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540

aataaaattc aagcgctaaa aagtgaagaa ctggatatct ttgccaattc atctttaaaa 600

aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660

ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720

ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780

tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840

ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900

gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960

cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020

gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080

aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140

ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200

tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260

aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320

aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 1380

atctatcttt cctacaacaa gtacctgcag ctgactagga actcctttgc cttggtccca 1440

agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggatag ctctccttca 1500

ccattccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560

ataaatgatg acatgttgga gggtcttgag aaactagaaa ttctcgattt gcagcataac 1620

aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680

ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tccaacggct ttgacgagat cccagttgag 1740

gtcttcaagg atttatttga actaaagatc atcgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800

cttccagcat ctgtctttaa taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860

ctcataacat ccgttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gactgagtta 1920

gatatgcgct ttaatccctt tgattgcacg tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980

attaacgaga cccataccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040

cctcactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcttgcaa agacagtgcc 2100

ccctttgaac tctttttcat gatcaatacc agtatcctgt tgatttttat ctttattgta 2160

cttctcatcc actttgaggg ctggaggata tctttttatt ggaatgtttc agtacatcga 2220

gttcttggtt tcaaagaaat agacagacag acagaacagt ttgaatatgc agcatatata 2280

attcatgcct ataaagataa ggattgggtc tgggaacatt tctcttcaat ggaaaaggaa 2340

gaccaatctc tcaaattttg tctggaagaa agggactttg aggcgggtgt ttttgaacta 2400

gaagcaattg ttaacagcat caaaagaagc agaaaaatta tttttgttat aacacaccat 2460

ctattaaaag acccattatg caaaagattc aaggtacatc atgcagttca acaagctatt 2520

gaacaaaatc tggattccat tatattggtt ttccttgagg agattccaga ttataaactg 2580

aaccatgcac tctgtttgcg aagaggaatg tttaaatctc actgcatctt gaactggcca 2640

gttcagaaag aacggatagg tgcctttcgt cataaattgc aagtagcact tggatccaaa 2700

aactctgtac at 2712

<210>2

<211>904

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro

1 5 10 15

Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His

20 25 30

Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp

35 40 45

Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg

50 55 60

Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu

65 70 75 80

Asp Val Gly Phe Asn Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln

85 90 95

Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser

100 105 110

Gln Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu

115 120 125

His Leu Met Ser Asn Ser Ile Gln Lys Ile Lys Asn Asn Pro Phe Val

130 135 140

Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser

145 150 155 160

Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu

165 170 175

Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp

180 185 190

Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln

195 200 205

Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe His Ala Ile Gly Arg Leu Phe

210 215 220

Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys

225 230 235 240

Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser

245 250 255

Asn Ser Gln Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys

260 265 270

Trp Thr Asn Leu Thr Met Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val

275 280 285

Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu Pro Gln Leu Glu Tyr Phe Phe

290 295 300

Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe Ser His Ser Leu His Gly

305 310 315 320

Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gln

325 330 335

Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gln

340 345 350

Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro

355 360 365

Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu

370 375 380

Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr

385 390 395 400

Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His Ile Leu Asn Leu Thr Lys

405 410 415

Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Phe Ser Trp Leu Gly His

420 425 430

Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ile Gly Gln Glu Leu Thr

435 440 445

Gly Gln Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser

450 455 460

Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Thr Arg Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro

465 470 475 480

Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp

485 490 495

Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gln Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp

500 505 510

Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly

515 520 525

Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gln His Asn Asn Leu Ala Arg

530 535 540

Leu Trp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly

545 550 555 560

Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu

565 570 575

Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp

580 585 590

Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn

595 600 605

Gln Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ser

610 615 620

Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu

625 630 635 640

Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp

645 650 655

Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser

660 665 670

Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val

675 680 685

Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu Leu

690 695 700

Phe Phe Met Ile Asn Thr Ser Ile Leu Leu Ile Phe Ile Phe Ile Val

705 710 715 720

Leu Leu Ile His Phe Glu Gly Trp Arg Ile Ser Phe Tyr Trp Asn Val

725 730 735

Ser Val His Arg Val Leu Gly Phe Lys Glu Ile Asp Arg Gln Thr Glu

740 745 750

Gln Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp

755 760 765

Trp Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gln Ser Leu

770 775 780

Lys Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu

785 790 795 800

Glu Ala Ile Val Asn Ser Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val

805 810 815

Ile Thr His His Leu Leu Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val

820 825 830

His His Ala Val Gln Gln Ala Ile Glu Gln Asn Leu Asp Ser Ile Ile

835 840 845

Leu Val Phe Leu Glu Glu Ile Pro Asp Tyr Lys Leu Asn His Ala Leu

850 855 860

Cys Leu Arg Arg Gly Met Phe Lys Ser His Cys Ile Leu Asn Trp Pro

865 870 875 880

Val Gln Lys Glu Arg Ile Gly Ala Phe Arg His Lys Leu Gln Val Ala

885 890 895

Leu Gly Ser Lys Asn Ser Val His

900

<210>3

<211>2109

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

atgagacaga ctttgccttg tatctacttt tgggggggcc ttttgccctt tgggatgctg 60

tgtgcatcct ccaccaccaa gtgcactgtt agccatgaag ttgctgactg cagccacctg 120

aagttgactc aggtacccga tgatctaccc acaaacataa cagtgttgaa ccttacccat 180

aatcaactca gaagattacc agccgccaac ttcacaaggt atagccagct aactagcttg 240

gatgtaggat ttaacaccat ctcaaaactg gagccagaat tgtgccagaa acttcccatg 300

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tctacaaaat taggaactca ggttcagctg gaaaatctcc aagagcttct attatcaaac 540

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aaattagagt tgtcatcgaa tcaaattaaa gagttttctc cagggtgttt tcacgcaatt 660

ggaagattat ttggcctctt tctgaacaat gtccagctgg gtcccagcct tacagagaag 720

ctatgtttgg aattagcaaa cacaagcatt cggaatctgt ctctgagtaa cagccagctg 780

tccaccacca gcaatacaac tttcttggga ctaaagtgga caaatctcac tatgctcgat 840

ctttcctaca acaacttaaa tgtggttggt aacgattcct ttgcttggct tccacaacta 900

gaatatttct tcctagagta taataatata cagcatttgt tttctcactc tttgcacggg 960

cttttcaatg tgaggtacct gaatttgaaa cggtctttta ctaaacaaag tatttccctt 1020

gcctcactcc ccaagattga tgatttttct tttcagtggc taaaatgttt ggagcacctt 1080

aacatggaag ataatgatat tccaggcata aaaagcaata tgttcacagg attgataaac 1140

ctgaaatact taagtctatc caactccttt acaagtttgc gaactttgac aaatgaaaca 1200

tttgtatcac ttgctcattc tcccttacac atactcaacc taaccaagaa taaaatctca 1260

aaaatagaga gtgatgcttt ctcttggttg ggccacctag aagtacttga cctgggcctt 1320

aatgaaattg ggcaagaact cacaggccag gaatggagag gtctagaaaa tattttcgaa 1380

atctatcttt cctacaacaa gtacctgcag ctgactagga actcctttgc cttggtccca 1440

agccttcaac gactgatgct ccgaagggtg gcccttaaaa atgtggatag ctctccttca 1500

ccattccagc ctcttcgtaa cttgaccatt ctggatctaa gcaacaacaa catagccaac 1560

ataaatgatg acatgttgga gggtcttgag aaactagaaa ttctcgattt gcagcataac 1620

aacttagcac ggctctggaa acacgcaaac cctggtggtc ccatttattt cctaaagggt 1680

ctgtctcacc tccacatcct taacttggag tccaacggct ttgacgagat cccagttgag 1740

gtcttcaagg atttatttga actaaagatc atcgatttag gattgaataa tttaaacaca 1800

cttccagcat ctgtctttaa taatcaggtg tctctaaagt cattgaacct tcagaagaat 1860

ctcataacat ccgttgagaa gaaggttttc gggccagctt tcaggaacct gactgagtta 1920

gatatgcgct ttaatccctt tgattgcacg tgtgaaagta ttgcctggtt tgttaattgg 1980

attaacgaga cccataccaa catccctgag ctgtcaagcc actacctttg caacactcca 2040

cctcactatc atgggttccc agtgagactt tttgatacat catcttgcaa agacagtgcc 2100

ccctttgaa 2109

<210>4

<211>703

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Met Arg Gln Thr Leu Pro Cys Ile Tyr Phe Trp Gly Gly Leu Leu Pro

1 5 10 15

Phe Gly Met Leu Cys Ala Ser Ser Thr Thr Lys Cys Thr Val Ser His

20 25 30

Glu Val Ala Asp Cys Ser His Leu Lys Leu Thr Gln Val Pro Asp Asp

35 40 45

Leu Pro Thr Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Thr His Asn Gln Leu Arg

50 55 60

Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Thr Ser Leu

65 70 75 80

Asp Val Gly Phe Asn Thr Ile Ser Lys Leu Glu Pro Glu Leu Cys Gln

85 90 95

Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gln His Asn Glu Leu Ser

100 105 110

Gln Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu

115 120 125

His Leu Met Ser Asn Ser Ile Gln Lys Ile Lys Asn Asn Pro Phe Val

130 135 140

Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser

145 150 155 160

Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gln Val Gln Leu Glu Asn Leu Gln Glu Leu

165 170 175

Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gln Ala Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp

180 185 190

Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gln

195 200 205

Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe His Ala Ile Gly Arg Leu Phe

210 215 220

Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gln Leu Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys

225 230 235 240

Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser

245 250 255

Asn Ser Gln Leu Ser Thr Thr Ser Asn Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys

260 265 270

Trp Thr Asn Leu Thr Met Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val

275 280 285

Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu Pro Gln Leu Glu Tyr Phe Phe

290 295 300

Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe Ser His Ser Leu His Gly

305 310 315 320

Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gln

325 330 335

Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gln

340 345 350

Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro

355 360 365

Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu

370 375 380

Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr

385 390 395 400

Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu His Ile Leu Asn Leu Thr Lys

405 410 415

Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Phe Ser Trp Leu Gly His

420 425 430

Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn Glu Ile Gly Gln Glu Leu Thr

435 440 445

Gly Gln Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser

450 455 460

Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Thr Arg Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro

465 470 475 480

Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp

485 490 495

Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gln Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp

500 505 510

Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly

515 520 525

Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gln His Asn Asn Leu Ala Arg

530 535 540

Leu Trp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly

545 550 555 560

Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu

565 570 575

Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp

580 585 590

Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn

595 600 605

Gln Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gln Lys Asn Leu Ile Thr Ser

610 615 620

Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu

625 630 635 640

Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp

645 650 655

Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser

660 665 670

Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val

675 680 685

Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu

690 695 700

<210>5

<211>381

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120

atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240

agattcagtg gcagtgaatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 300

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccatttac gttcggctcg 360

gggacaaagt tggaactaaa a 381

<210>6

<211>138

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210>7

<211>19

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>7

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Val His Ser

<210>8

<211>29

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

20 25

<210>9

<211>6

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

Thr Thr Tyr Trp Ile His

1 5

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210>11

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>11

Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210>12

<211>32

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>12

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>13

Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr

1 5 10

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>14

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210>15

<211>381

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>15

atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120

atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240

agattcagtg gcagtgaatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 300

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccatttac gttcggctcg 360

gggacaaagt tggaactaaa a 381

<210>16

<211>127

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>16

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn

35 40 45

Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>17

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys

20

<210>18

<211>23

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys

20

<210>19

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>19

Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>20

<211>15

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>20

Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr

1 5 10 15

<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>21

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp

1 5

<210>22

<211>32

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>22

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Gln Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210>23

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>23

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro

1 5

<210>24

<211>12

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>24

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210>25

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV1

<400>25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>26

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV1

<400>26

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>27

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV4

<400>27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Set Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>28

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV4

<400>28

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatg acccgcgata ccagcattag caccgcgtat 240

atggaactga gccgcctgcg cagcgatgat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>29

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV5

<400>29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Set Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>30

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV5

<400>30

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

accggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatg acccgcaaca ccagcattag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>31

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV7

<400>31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>32

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链HV7

<400>32

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcgg cacctttagc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cgcggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>33

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV1

<400>33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>34

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV1

<400>34

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>35

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV3

<400>35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>36

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV3

<400>36

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaacgcct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgaa tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>37

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV5

<400>37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>38

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV5

<400>38

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagtgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagatgtgg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggcggc 300

ggcaccaaag tggaaattaa a 321

<210>39

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV7

<400>39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>40

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链LV7

<400>40

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattcat aactatctgg cgtggtttca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaaagcct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>41

<211>327

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人IgG4重链恒定区变体

<400>41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210>42

<211>981

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人IgG4重链恒定区变体

<400>42

gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccgt gcagccgcag caccagcgaa 60

agcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 180

ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg caccaaaacc 240

tatacctgca acgtggatca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggaaagc 300

aaatatggcc cgccgtgccc gccgtgcccg gcgccggaag cggcgggcgg cccgagcgtg 360

tttctgtttc cgccgaaacc gaaagatacc ctgatgatta gccgcacccc ggaagtgacc 420

tgcgtggtgg tggatgtgag ccaggaagat ccggaagtgc agtttaactg gtatgtggat 480

ggcgtggaag tgcataacgc gaaaaccaaa ccgcgcgaag aacagtttaa cagcacctat 540

cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat caggattggc tgaacggcaa agaatataaa 600

tgcaaagtga gcaacaaagg cctgccgagc agcattgaaa aaaccattag caaagcgaaa 660

ggccagccgc gcgaaccgca ggtgtatacc ctgccgccga gccaggaaga aatgaccaaa 720

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa 780

tgggaaagca acggccagcc ggaaaacaac tataaaacca ccccgccggt gctggatagc 840

gatggcagct tttttctgta tagccgcctg accgtggata aaagccgctg gcaggaaggc 900

aacgtgttta gctgcagcgt gatgcatgaa gcgctgcata accattatac ccagaaaagc 960

ctgagcctga gcctgggcaa a 981

<210>43

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人k恒定区

<400>43

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>44

<211>324

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人k恒定区

<400>44

gcgcgcaccg tggcggcgcc gagcgtgttt atttttccgc cgagcgatga acagctgaaa 60

agcggcaccg cgagcgtggt gtgcctgctg aacaactttt atccgcgcga agcgaaagtg 120

cagtggaaag tggataacgc gctgcagagc ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgaacag 180

gatagcaaag atagcaccta tagcctgagc agcaccctga ccctgagcaa agcggattat 240

gaaaaacata aagtgtatgc gtgcgaagtg acccatcagg gcctgagcag cccggtgacc 300

aaaagcttta accgcggcga atgc 324

<210>45

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV1

<400>45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>46

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV1

<400>46

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga tgcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>47

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV2

<400>47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Gly Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>48

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV2

<400>48

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaacggc 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>49

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV3

<400>49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>50

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV3

<400>50

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

gcggaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>51

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV4

<400>51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Gly

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Met Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>52

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV4

<400>52

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaag gcaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgatgatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>53

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV5

<400>53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Val Ile Ile Thr Thr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>54

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的重链变体HBV5

<400>54

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc acctattgga ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagc gcctggaatg gatgggcgaa attaacccga acaacggccg cattaactat 180

aacgaaaaat ttaaaacccg cgtgaccatt acccgcgata ccagcgcgag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgtgggc 300

gtgattatta ccacctttcc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210>55

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV6

<400>55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>56

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV6

<400>56

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattagc aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>57

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV7

<400>57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>58

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV7

<400>58

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg caacattagc agctatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>59

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV8

<400>59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>60

<211>321

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人适应的轻链变体HBV8

<400>60

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcgg cggcattagc agctatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttataac gcgaaaaccc tggcggatgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcat ttttggagca ccccgtttac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa a 321

<210>61

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>不确定

<222>(5)

<223>重链CDR1，其中第5位Xaa可以是异亮氨酸或<223>甲硫氨酸

<400>61

Thr Thr Tyr Trp Xaa His

1 5

<210>62

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>不确定

<222>(11)

<223>重链CDR2，其中第11位Xaa可以是酪氨酸或<223>甘氨酸

<220>

<221>不确定

<222>(12)

<223>重链CDR2，其中第12位Xaa可以是天冬酰胺或<223>丙氨酸

<220>

<221>不确定

<222>(15)

<223>重链CDR2，其中第15位Xaa可以是苯丙氨酸或<223>甘氨酸

<400>62

Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Arg Ile Asn Xaa Xaa Glu Lys Xaa Lys

1 5 10 15

Thr

<210>63

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>不确定

<222>(4)

<223>重链CDR3，其中第4位Xaa可以是甲硫氨酸或<223>异亮氨酸

<400>63

Val Gly Val Xaa Ile Thr Thr Phe Pro Tyr

1 5 10

Claims

1.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：6、25、27或29所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：16、33、35、37或39所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况选自以下的一种或多种：感染-相关状况、2型糖尿病、异常脂血或代谢综合征。

2.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：6、25、27或29所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：16、33、35、37或39所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况为脓毒症-相关状况。

3.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：45、47、49、51或53所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况选自以下的一种或多种：感染-相关状况、2型糖尿病、异常脂血或代谢综合征。

4.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：45、47、49、51或53所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况为脓毒症-相关状况。

5.权利要求1或3的用途，其中所述炎性状况选自以下的一种或两种：炎性肠疾病或炎性肺状况。

6.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：6、25、27或29所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：16、33、35、37或39所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况由自身免疫病造成。

7.TLR3拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性状况的药物中的应用，其中所述TLR3拮抗剂为分离的抗体，其包含SEQ IDNO：45、47、49、51或53所示的氨基酸序列的V_H和SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的V_L，并且其中所述炎性状况由自身免疫病造成。