ES2618567T3 - Antagonistas de receptor de tipo Toll 3 - Google Patents

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ES2618567T3
ES2618567T3 ES09824182.1T ES09824182T ES2618567T3 ES 2618567 T3 ES2618567 T3 ES 2618567T3 ES 09824182 T ES09824182 T ES 09824182T ES 2618567 T3 ES2618567 T3 ES 2618567T3
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Lani San Mateo
Robert T. Sarisky
Raymond Sweet
Robert Rauchenberger
Mark Rutz
Yiqing Feng
Katharine Heeringa
Jinquan Luo
Fang Teng
Alexey Teplyakov
Sheng-Jiun Wu
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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con receptor de tipo Toll 3 (TLR3), que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende: a. la cadena pesada CDR 1, 2 y secuencias de aminoácido 3 como se muestra en SEQ ID NO: 82 s, 86 y 84; y B. b. la cadena ligera CDR 1, 2 y secuencias de aminoácido 3 como se muestra en SEQ ID NO: s 79, 80 y 87.

Description

Antagonistas de receptor de tipo Toll 3
Descripción
Campo de la invención 5
[0001] La presente invención se refiere a antagonistas de anticuerpos del receptor de tipo Toll 3 (TLR3) o fragmentos de los mismos, y métodos de hacer y usar los anteriores.
Antecedentes de la invención 10
[0002] Los receptores tipo Toll (TLRs) regulan la activación de la respuesta inmune innata e influyen en el desarrollo de la inmunidad adaptativa mediante el inicio de cascadas de transducción de señales en respuesta a infecciones bacterianas, virales, parasitarias, y en algunos casos, los ligandos derivados del huésped (Lancaster et J. Physiol., 563: 945 - 955, 2005). Los TLR localizados en la membrana plasmática, TLR1, TLR2, TLR4 y TLR6 reconocen 15 ligandos que incluyen componentes proteicos o lipídicos de bacterias y hongos. Los TLR predominantemente intracelulares, TLR3, TLR7 y TLR9 responden a ARNds, ARNss y ADN CpG no metilado, respectivamente. Se cree que la desregulación de la señalización de TLR causa una multitud de problemas y se están desarrollando estrategias terapéuticas hacia este eje (Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov., 4: 879-880, 2005, Rezaei Int. Immunopharmacol 6 : 863 - 869, 2006, Wickelgren, Science 312: 184 - 187, 2006). Por ejemplo, los antagonistas de 20 TLR4 y TLRs 7 y 9 están en desarrollo clínico para sepsis severa y lupus, respectivamente (Kanzler et al., Nat. Med. 13: 552-559, 2007).
[0003] La señalización TLR3 es activada por ARN de doble cadena, ARNm o ARN liberado de las células necróticas durante la inflamación o infección del virus. La activación de TLR3 induce la secreción de interferones y citoquinas 25 pro-inflamatorias y activa la activación y el reclutamiento de células inmunitarias que son protectores durante ciertas infecciones microbianas. Por ejemplo, un alelo TLR3 dominante negativo ha sido asociado con un aumento de la susceptibilidad a la encefalitis por herpes simple en la infección primaria con HSV-1 en la infancia (Zheng et al., Science 317: 1522-1527 2007). En ratones, la deficiencia de TLR3 se asocia con una disminución de la supervivencia tras la exposición al virus coxsackie (Richer et al., PLoS One 4: e4127, 2009). Sin embargo, se ha 30 demostrado que la señalización de TLR3 no controlada o desregulada contribuye a la morbimortalidad en ciertos modelos de infección viral incluyendo el virus del Nilo Occidental, flebovirus, vaccinia e influenza A (Wang et al., Nat. Med. 10: 1366-1373, 2004; Gowen et al., J. Immunol., 177: 6301 - 6307, 2006, Hutchens et al., J. Immunol., 180: 483 - 491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2: E53, 2006).
35
[0004] TLR3 también se ha demostrado conducir los mecanismos patógenos en un espectro de enfermedades inflamatorias, mediadas inmunes y autoinmunes incluyendo, por ejemplo, choque séptico (Cavassani et al, J. Exp Med 205: 2609-2621, 2008), Lesión pulmonar aguda (Murray et al., Am. J. Respir. Crit. Med. 178: 1227 - 1237, 2008), artritis reumatoide (Kim et al., Immunol., Let. 124: 9 - 17, 2009, Brentano et al., Arth. Rheum. 52: 2656 - 2665, 2005), asma (Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40: 654 - 662, 2009; Morishima et al. Int. Arch. Allergy 40 Immunol., 145: 163-174, 2008, Stowell et al., Respir. Res. 10:43, 2009), enfermedad inflamatoria intestinal tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Zhou et al., J. Immunol, Zhou et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 104: 7512 - 7515, 2007), enfermedad hepática autoinmune (Lang et al., J. Clin. Invest., 116 : 2456 - 2463, 2006) y diabetes de tipo I (Dogusan et al., Diabetes 57: 1236 - 1245, 2008, Lien y Zipris, Curr. Mol. Med. 9: 52 - 68, 2009). Además, se ha demostrado que los aumentos de órganos específicos en la expresión de TLR3 se correlacionan con una serie de 45 condiciones patológicas impulsadas por respuestas inflamatorias locales desreguladas tales como la cirrosis biliar primaria de tejidos hepáticos (Takii et al., Lab Invest 85: 908-920, 2005), Las articulaciones de artritis reumatoide (Ospelt et al., Arthritis Rheum 58: 3684-3692, 2008) y la mucosa nasal de pacientes con rinitis alérgica (Fransson et al., Respir. Res. 6: 100, 2005).
50
[0005] En condiciones necróticas, la liberación del contenido intracelular incluyendo ARNm endógeno desencadena la secreción de citocinas, quimiocinas y otros factores que inducen la inflamación local, facilitan la limpieza de los restos de células muertas y reparan el daño. La necrosis frecuentemente perpetúa procesos inflamatorios que contribuyen a la inflamación crónica o exagerada (Bergsbaken et al., Nature Reviews 7: 99-109, 2009). La activación de TLR3 en el sitio de necrosis puede contribuir a estos procesos inflamatorios aberrantes y generar un nuevo bucle 55 de retroalimentación positiva pro-inflamatoria a través de los ligandos TLR3 liberados. Por lo tanto, el antagonismo de TLR3 puede ser beneficioso en una variedad de trastornos que implican inflamación crónica o exagerada y/o necrosis.
[0006] abajo de la modulación de la activación de TLR3 también puede representar una nueva estrategia de 60 tratamiento para indicaciones oncológicas incluyendo los carcinomas de células renales y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (Morikawa et al, Clin Cancer Res. 13: 5.703-5.709, 2007; Pries Et al., Int. J. Mol. Med. 21: 209 - 215, 2008). Además, el alelo TLR3L423F que codifica una proteína con actividad reducida se ha asociado con protección contra degeneración macular relacionada con la edad avanzada "Dray" (Yang et al, N. Engl J. Med 359: 1456-1463, 2008), Lo que indica que los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos en esta enfermedad. 65
[0007] Las patologías asociadas a condiciones inflamatorias y otras, tales como las asociadas con infecciones, tienen impactos de salud y económicos significativos. Sin embargo, a pesar de los avances en muchas áreas de la medicina, comparativamente pocas opciones de tratamiento y terapias están disponibles para muchas de estas condiciones.
5
[0008] Por lo tanto, existe la necesidad de suprimir la actividad de TLR3 para tratar condiciones TLR3-asociadas.
[0009] US 2006/115475 describe anticuerpos anti-TLR3. Se han descrito anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio extracelular de TLR3 humano (Duffy et al., Cellular Immunology 248 (2): 103-114, 2007). También se han descrito anticuerpos agonistas anti-TLR3 en el documento US 2007/098716. Un anticuerpo monoclonal anti-TLR3 10 contra TLR3 humano se ha demostrado que suprime producción IFN-β mediada por poli(I):poli(C) por expresión TLR3 de fibroblastos humanos (Matsumoto et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 293(5) : 1364 - 136 9, 2002 y US 2005/153910).
Breve descripción de los dibujos 15
[0010]
Fig. 1 muestra el efecto de TLR3 (huTLR3) mAbs anti-humanos en un ensayo de gen indicador de NF-κB.
Figs. 2A y 2B muestran el efecto (% de inhibición) o mAbs anti-huTLR3 en un ensayo BEAS-2B. 20
Figs. 3A y 3B muestran el efecto de mAbs anti-huTLR3 en un ensayo NHBE.
Fig. 4 muestra el efecto de los anti-huTLR3 mAbs en un ensayo PBMC.
Figs. 5A y 5B muestran el efecto de mAbs anti-huTLR3 en un ensayo HASM.
Figs. 6A, 6B y 6C muestran la unión de mAbs anti-huTLR3 a mutantes TLR3.
Fig. 7A muestra epítopos para mAb 15EVQ (negro) y mAb C1068 (gris) (imagen superior) y epítopo para mAb 25 12QVQ/QSV (imagen negra, inferior) superpuesta sobre la estructura de TLR3 ECD humano. Fig. 7B muestra un mapa de perturbación de intercambio H/D localizado de la proteína TLR3 ECD complejada con el mAb 15EVQ.
Figs. 8A y 8B muestran el efecto de anti-ratón TLR3 mAb mAb 5429 de rata/ratón (sustituto) en A) NF-κB y B) los ensayos de gen reportero ISRE.
Fig. 9 muestra el efecto de los mAbs sustitutivos (mAb 5429, mAb c1811) en el ensayo MEF CXCL10/IP-10. 30
Fig. 10 Muestra la especificidad de unión del mAb sustituto a TLR3. Panel superior: control de isotipo; Panel inferior: mAb C1811.
Fig. 11 Muestra el efecto de los mAbs sustitutos a nivel de penH en un modelo de AHR.
Fig. 12 Muestra el efecto de los mAbs sustitutivos sobre el número total de neutrófilos en el fluido BAL en un modelo de AHR. 35
Fig. 13 Muestra el efecto de los mAbs sustitutivos sobre los niveles de CXCL10/IP-10 en el fluido BAL en un modelo AHR.
Fig. 14 Muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones de histopatología en un modelo DSS.
Fig. 15 Muestra el efecto del mAb sustituto en A) puntajes de histopatología y B) afluencia de neutrófilos en un modelo de transferencia de células T. 40
Fig. 16 Muestra el efecto del mAb sustituto sobre las puntuaciones clínicas en un modelo de CIA.
Fig. 17 Muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones clínicas de AUC en un modelo de CIA.
Fig. 18 Muestra el efecto del mAb sustituto sobre la supervivencia de ratones C57BL/6 después de la administración intranasal de influenza A/PR/8/34.
Fig. 19 Muestra el efecto del mAb sustituto en las puntuaciones clínicas después de la administración de 45 influenza A/PR/8/34.
Fig. 20 Muestra el efecto del mAb sustituto sobre el peso corporal durante 14 días después de la administración de la gripe A/PR/8/34.
Fig. 21 Muestra el efecto de los mAbs sustitutivos sobre los niveles de glucosa en sangre en animales (A) WT DIO y (B) TLR3KO DIO después de la estimulación con glucosa. 50
Fig. 22 Muestra el efecto del mAb sustituto sobre los niveles de insulina en animales WT DIO.
Fig. 23 Muestra el efecto de mAb 15EVΩ en (A) NTHi y (B) rhinovirus inducidos CXCL10/IP-10 y los niveles de CCL5/RANTES en células NHBE.
Fig. 24 Muestra el efecto del mAb 15EVQ sobre los niveles de (A) sICAM-1 y (B) la viabilidad en células HUVEC.
55
Resumen de la invención
[0011] El primer aspecto de la invención es un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con receptor de tipo Toll 3 (TLR3), que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende: 60
a. Las secuencias de aminoácidos de CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: s 82, 86 y 84; y
b. Las secuencias de aminoácidos CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera como se muestra en SEQ ID NO: s 79, 80 y 87. 65
[0012] En una realización, el anticuerpo une al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado de un grupo constituido por los residuos K467, R488, o R489 de la SEQ ID NO: 2.
[0013] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une al menos un residuo TLR3 amino ácido seleccionado de un grupo que consiste en residuos D116 5 o K145 de SEQ ID NO: 2.
[0014] En una forma de realización, el anticuerpo tiene al menos una de las siguientes propiedades:
a. reduce la actividad biológica de TLR3 humano en un ensayo de gen reportero in vitro poli(I: C) NF-kB >50% a 10 <1 µg/mL;
b. inhibe> 60% de ILO-6 o CXCL10/IP-10 de producción a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I: C) a <10 µg/mL;
c. inhibe> 50% de ILO-6 o CXCL10/IP-10 de producción a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I: C) a <0,4 µg/mL; 15
d. inhibe >50% de ILO-6 producción a partir de células estimuladas con NHBE 62,5 poli mL/ng (I: C) a <5 µg/mL;
e. inhibe >50% de ILO-6 de producción a partir de células estimuladas con NHBE 62,5 poli mL/ng (I: C) a <1 µg/mL;
f. inhibe >20% de IFN-γ inducida por poli(I:C), ILO-6 o ILO-12 de producción por células PBMC a <1 µg/mL;
g. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomolgus en un ensayo de gen indicador in vitro NF-kB con IC50 <10 20 µg/mL; o
h. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomologus en un ensayo de gen indicador ISRE in vitro con IC50 <5 µg/mL.
[0015] También se describe aquí un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que compite por la unión TLR3 con un 25 anticuerpo monoclonal, donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones de cadena pesada determinantes de la complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 82, 86 y 84, y las secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera, como se muestra en las SEQ ID NO: 79, 80 y 87, o donde el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de (VH) de cadena pesada, tal como se muestra en SEQ ID NO: 216 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena 30 ligera (LV), como se muestra en SEQ ID NO: 41.
[0016] También se describe aquí un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende ciertas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1, 2 y 3 y las secuencias de aminoácidos de determinados CDR de 35 cadena ligera 1, 2 y 3.
[0017] También se describe aquí un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de cadena pesada (VH) y las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables de 40 cadena ligera (LV).
[0018] También se describe aquí un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cierta cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera determinada. 45
[0019] También se describe aquí una cadena pesada aislada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
50
[0020] También se describe aquí una cadena ligera de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 o 211.
[0021] También se describe aquí una cadena pesada de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de 55 aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
[0022] También se describe en este documento una cadena ligera de anticuerpo aislado que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 o 167.
60
[0023] También se describe en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216.
65
[0024] También se describe en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de
anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 o 211.
[0025] También se describe en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 5 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168.
[0026] También se describe en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 o 167. 10
[0027] Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describe en este documento un vector que comprende al menos un polinucleótido descrito en el presente documento.
15
[0028] También se describe aquí una célula huésped que comprende el vector de la invención.
[0029] También se describe en la presente memoria un método para preparar un anticuerpo reactivo con TLR3 según la reivindicación 1, que comprende el cultivo de la célula huésped descrita en la presente memoria y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. 20
[0030] Otro aspecto de la invención es el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención para uso en terapia.
[0031] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un 25 método de tratamiento o prevención de una condición inflamatoria que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente en necesidad durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria.
[0032] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un 30 método para tratar o prevenir una afección inflamatoria sistémica, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria sistémica.
[0033] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un 35 método de tratamiento de la diabetes de tipo II que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente en necesidad del mismo para un tiempo suficiente para tratar la diabetes de tipo II.
[0034] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un 40 método de tratamiento de la hiperglucemia que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente en necesidad del mismo durante un tiempo suficiente para tratar la hiperglucemia.
[0035] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un 45 método de tratamiento de la hiperinsulinemia, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente en necesidad del mismo por un tiempo suficiente para tratar la resistencia a la insulina.
[0036] En una realización, el anticuerpo aislado o composición farmacéutica de la invención es para uso en un método de tratamiento o prevención de infecciones virales que comprende la administración de una cantidad 50 terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir infecciones virales.
Descripcion detallada de la invencion
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[0037] El término "antagonista", como se usa en el presente documento significa una molécula que inhibe parcial o completamente, por cualquier mecanismo, un efecto de otra molécula tal como un receptor o mediador intracelular.
[0038] Como se usa en este documento, un "anticuerpo antagonista TRL3" o un anticuerpo "reactivo con TLR3" describe un anticuerpo que es capaz de, directa o indirectamente, contrarrestar sustancialmente, reducir o inhibir la 60 actividad biológica TLR3 o el receptor activo TLR3. Por ejemplo, un anticuerpo reactivo con TLR3 se puede unir directamente a TLR3 y neutralizar la actividad de TLR3, es decir, bloquear la señalización TLR3 para reducir citoquinas y liberación de quimiocinas o la activación de NF-κB.
[0039] El término "anticuerpos" tal como se utiliza aquí, se entiende en un sentido amplio e incluye inmunoglobulina 65 o moléculas de anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, incluyendo murino,
humano, anticuerpos monoclonales humanos adaptados, humanizados y quiméricos y fragmentos de anticuerpos.
[0040] En general, los anticuerpos son proteínas o cadenas de péptidos que exhiben una especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está unida a una cadena 5 pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro de intracadenas regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (LV) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineada con el primer 10 dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera del dominio variable está alineada con el dominio variable de la cadena pesada. Cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (κ) y lambda (λ), basado en secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
15
[0041] Las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de cadena pesada. IgA e IgG se sub-clasifican como isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[0042] El término "fragmentos de anticuerpos" significa una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la unión 20 del antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab’, F(ab')2 y fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos.
[0043] Una inmunoglobulina ligera o cadena pesada de la región variable se compone de una región "marco" 25 interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando diversos términos de la siguiente manera: (i) el término regiones de determinación de complementariedad (CDR) se basa en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat, J. Exp. Med. 132: 211 - 250, 1970). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis CDR; tres en el VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), y tres en la LV (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, 30 Bethesda, Md., 1991). (ii) El término "región hipervariable", "HVR" o "HV" se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en estructura como se define por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, Mol. Biol. 196: 901 -917, 1987). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis regiones hipervariables, tres en VH (H1, H2, H3) y tres en LV (L1, L2, L3). Chothia y Lesk se refieren a las HV estructuralmente conservadas como "estructuras canónicas". (iii) Las "CDR-IMGT", tal como se proponen por Lefranc (Lefranc et al., Dev. Comparative 35 Immunol., 27: 55-77, 2003) se basan en la comparación de dominios V de inmunoglobulinas y receptores de células T. La base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de estas regiones. La correspondencia entre CDRs, HVs y delimitaciones IMGT se describe en Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55 - 77, 2003. (iv) El sitio de unión al antígeno también se puede delinear basándose en la Especificidad Determinante del Uso de Residuos (SDRU), según Almagro (Almagro, 40 Mol. Recognit. 17: 132-143, 2004), donde Residuos Determinantes de Especificidad (SDR), se refiere a aminoácidos de una inmunoglobulina que están directamente implicados en el contacto con el antígeno. SDRU como se define por Almargo es una medida precisa de un número y distribución de SDR para diferentes tipos de antígenos como se define por los análisis de las estructuras cristalinas de complejos de antígeno-anticuerpo.
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[0044] El término "secuencias de material compuesto" como se utiliza aquí significa un sitio de unión al antígeno definido para incluir todos los residuos de aminoácidos delineados individualmente por Kabat, Chothia o IMGT, o cualquier otra delineación de región de unión al antígeno adecuado.
[0045] "Marco" o "secuencias estructurales" son las secuencias restantes de una región variable distintas de los 50 definidoa para ser el sitio de unión al antígeno. Debido a que el sitio de unión al antígeno puede definirse por diversos términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos exacta de un armazón depende de cómo se definió el sitio de unión al antígeno.
[0046] El término "antígeno", como se usa en este documento significa cualquier molécula que tiene la capacidad de 55 generar anticuerpos ya sea directa o indirectamente. Incluido dentro de la definición de "antígeno" está un ácido nucleico que codifica una proteína.
[0047] El término "homólogo" significa secuencias de proteínas que tienen entre 40% y 100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Los homólogos de TLR3 humano incluyen polipéptidos de otras 60 especies que tienen entre 40% y 100% de identidad de secuencia con una secuencia TLR3 humana conocida. El porcentaje de identidad entre dos cadenas peptídicas se puede determinar por alineación por pares usando los valores predeterminados del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Por TLR3 se entiende TLR3 humano (huTLR3) y sus homólogos. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la huTLR3 de longitud completa se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del 65 dominio extracelular huTLR3 (ECD) se muestran en SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente.
[0048] La expresión "sustancialmente idéntico" como se utiliza aquí significa que las dos secuencias de aminoácidos de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se comparan son idénticos o tienen "diferencias sustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias descritas aquí también son parte de esta solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de 5 aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. El porcentaje de identidad se puede determinar como se ha descrito anteriormente. Ejemplos de cadenas peptídicas que se comparan son regiones variables de cadena pesada o ligera.
[0049] El término "en combinación con" tal como se utiliza aquí significa que los agentes descritos se pueden 10 administrar a un animal juntos en una mezcla, al mismo tiempo como agentes únicos o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.
[0050] El término "enfermedad inflamatoria" como se usa en el presente documento significa una respuesta localizada a la lesión celular que está mediada en parte por la actividad de citocinas, quimiocinas, o células 15 inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos) que se caracteriza en la mayoría de los casos por dolor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de la función tisular. El término "estado pulmonar inflamatorio" tal como se usa en la presente memoria significa una afección inflamatoria que afecta o está asociada con los pulmones.
20
[0051] El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa en la presente memoria significa un anticuerpo (fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose típicamente contra un solo determinante antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo y no requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los mAbs murinos pueden prepararse por el método de 25 hibridoma de Kohler et al., Nature 256: 495-497, 1975. Los mAbs quiméricos que contienen una región variable de cadena ligera y cadena pesada derivada de un anticuerpo donante (típicamente murino) en asociación con regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor (típicamente otra especie de mamífero tal como humana) por el método descrito en la Patente de EE.UU. 4.816.567. Los mAbs adaptados para humanos que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina donante no humana (típicamente murina) y las partes derivadas de 30 inmunoglobulina restantes de la molécula que se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica tales como las que se describen en la Patente de EE.UU. 5.225.539. Las secuencias de marco humanas útiles para la adaptación humana pueden seleccionarse de las bases de datos pertinentes por los expertos en la técnica. Opcionalmente, los mAbs adaptados al ser humano pueden modificarse adicionalmente mediante la incorporación de residuos de soporte estructural 35 alterados para preservar la afinidad de unión mediante técnicas tales como las descritas en Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 86: 10029-10032, 1989 y Hodgson et al, Bio/Technology, 9: 421, 1991.
[0052] mAb completamente humanos que carecen de cualquier secuencia no humanos pueden prepararse a partir de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana mediante técnicas referenciadas en, por ejemplo, Lonberg et 40 al, Nature 368: 856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845 - 851, 1996;. y Mendez et al, Nature Genetics 15: 146-156, 1997. Los mAbs humanos también se pueden preparar y optimizar a partir de bibliotecas de expresión en fagos mediante técnicas descritas en, por ejemplo, Knappik et al, J. Mol. Biol. 296: 57 - 86, 2000; y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254: 67-84 2001.
45
[0053] El término "epítopo", como se usa en este documento significa una porción de un antígeno al que un anticuerpo se une específicamente. Los epıtopos consisten usualmente en grupos superficiales químicamente activos (tales como polares, no polares o hidrófobos) de restos tales como aminoácidos o cadenas laterales de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser un epítopo discontinuo, por ejemplo, un 50 epítopo conformacional, que está formado por una relación espacial entre los aminoácidos no contiguos de un antígeno en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un epítopo conformacional incluye epítopos resultantes del plegamiento de un antígeno, donde los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se encuentran muy próximos en el espacio tridimensional.
55
[0054] El término "unión específica" tal como se utiliza aquí, se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado con una mayor afinidad que para otros antígenos o proteínas. Típicamente, el anticuerpo se une con una disociación constante (KD) de 10-7M o menos, y se une al antígeno predeterminado con una KD que es al menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína, o cualquier otro polipéptido especificado) distinto del antígeno predeterminado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un 60 antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente aquí con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno" o "un anticuerpo específico de antígeno", por ejemplo un anticuerpo específico de TLR3. La disociación constante se puede medir usando procedimientos estándar como se describe a continuación.
65
[0055] El término "actividad biológica TLR3" o "activación TLR3" como se usa en el presente documento se refiere a
cualquier actividad que se produce como resultado de la unión a ligando de TLR3. Ligandos TLR3 incluyen ARNds, poli(I: C), y el ARNm endógeno, por ejemplo, ARNm endógeno liberado de las células necróticas. Una activación ejemplar de activación de TLR3 resulta en la activación de NF-κB en respuesta al ligando de TLR3. La activación de NF-κB puede ensayarse usando un ensayo de gen informador después de la inducción del receptor con poli(I: C)(Alexopoulou y otros, Nature 413: 732-738, 2001; Hacker et al, EMBO J. 18 : 6973 - 6 982, 1999). Otra activación 5 ejemplar de TLR3 resulta en la activación de los factores de respuesta de interferón (IRF-3, IRF-7) en respuesta a ligando de TLR3. La activación de IRF mediada por TLR3 puede ensayarse usando un gen informador dirigido por un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE). Otros resultados ejemplares de activación TLR3 en la secreción de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias, por ejemplo TNFα, ILO-6, ILO-8, ILO-12, CXCL5/IP-10 y RANTES. La liberación de citoquinas y quimiocinas a partir de células, tejidos o en circulación se puede medir 10 usando inmunoensayos bien conocidos, tales como un inmunoensayo ELISA.
[0056] Códigos de aminoácido convencionales de una y tres letras se utilizan en el presente documento de la siguiente manera:
15
Aminoácido
Código de tres letras Código de una letra
Alanina
Ala A
Arginina
arg R
Asparagina
asn N
Aspartato
asp D
Cisteína
cys C
Glutamato
glu E
Glutamina
gli Q
Glicina
gl G
Histidina
ilo H
Isoleucina
gue I
Leucina
leu L
Lisina
lys K
Metionina
met M
Fenilalanina
phe F
Prolina
pro P
Serina
ser S
Treonina
thr T
Triptófano
trp W
Tirosina
tyr Y
Valina
val V
20
25
30
35
Composiciones de materia 40
[0057] La presente invención proporciona antigonistas de anticuerpos capaces de inhibir actividad biológica TLR3 y usos de tales anticuerpos como se definieron en las reivindicaciones. Tales antagonistas de TLR3 pueden tener las propiedades de unión de TLR3 e inhibición de la activación de TLR3. Mecanismos de ejemplo por los cuales la activación de TLR3 puede inhibirse por tales anticuerpos se incluyen in vitro, in vivo o en la inhibición in situ de la 45 unión a TLR3, la inhibición de la dimerización del receptor, la inhibición de localización TLR3 al compartimiento endosomal, la inhibición de la actividad de quinasa de las vías de señalización corriente abajo, o la inhibición de la transcripción de ARNm de TLR3. Otros antagonistas de anticuerpos capaces de inhibir la activación de TLR3 por otros mecanismos están también dentro del alcance de los diversos aspectos y realizaciones de la invención. Estos antagonistas son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos. 50
[0058] La diversidad de anticuerpos se crea mediante el uso de múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos génicos variables (V) y diversidad (D) y unión de segmentos génicos (J) para formar una región VH completa y la recombinación de segmentos de genes variables y de unión para formar una región LV completa. No 55 es probable que los anticuerpos y composiciones que tienen una secuencia de CDR idéntica o similar a las descritas en el presente documento, se hayan generado independientemente. La secuencia de genes de anticuerpos después del ensamblaje y mutación somática es muy variada y se estima que estos diversos genes codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995).
60
[0059] La invención proporciona nuevos sitios de unión a antígeno derivados de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. La estructura para llevar a un sitio de unión al antígeno es generalmente una cadena de anticuerpo pesado o ligero o porción del mismo, donde el sitio de unión al antígeno se encuentra a un sitio de unión al antígeno de origen natural como se determina como se describe anteriormente.
65
[0060] La invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con TLR3 como el expuesto
en la reivindicación 1 que comprende tanto una cadena pesada y una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), como se muestra en SEQ ID NOs: 82, 86 y 84 y regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera (CDR) de secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) SEQ ID NOs: 79, 80 y 87, como se muestra en la Tabla 1a. 5
[0061] También se describen otros anticuerpos o fragmentos de los mismos reactivos con TLR3 que comprenden una región variable tanto de cadena pesada como de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada de secuencias (CDR) de aminoácidos 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y regiones determinantes (CDR) de complementariedad de la cadena ligera de 10 secuencias de aminoácidos 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en la Tabla 1a.
Tabla 1a.
mAb
SEQ ID NO:
HCDR1
HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
16
52 88 54 49 50 51
17
58 64 60 55 56 57
18
70 77 72 67 68 69
19
82 83 84 79 80 89
1
46 47 48 43 44 45
2
52 53 54 49 50 51
3
58 59 60 55 56 57
4
61 62 60 55 56 57
5
61 64 60 55 56 63
6
61 64 60 55 56 65
7
61 64 60 55 56 66
8
70 71 72 67 68 69
9
70 73 72 67 68 69
10
70 75 72 67 68 74
11
70 77 72 67 68 76
12
70 77 72 67 68 78
13
82 83 84 79 80 81
14
82 86 84 79 80 85
15*
82 86 84 79 80 87
15**
111 112 84 109 110 113
15-1
111 114 84 109 110 113
15-2
115 112 84 109 110 113
15-3
116 112 84 109 110 113
15-4
111 117 84 109 110 113
15-5
116 118 84 109 110 113
15-6
116 112 119 109 110 113
15-7
111 112 84 120 110 113
15
20
25
30
35
40
45
50
mAb
SEQ ID NO:
HCDR1
HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
15-8
111 112 84 121 110 113
15-9
116 118 119 109 110 113
F17
61 192 60 55 56 191
F18
70 194 72 67 68 193
F19
82 196 84 79 80 195
55
60
[0062] Se describe en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una 65 secuencia de aminoácidos HCDR2 como se muestra en SEQ ID NO: 192, en el que el HCDR2 de SEQ ID NO: 192
se define como se muestra en la Fórmula (I):
5
Xaa6-I-Xaa7-Xaa8-RS-Xaa9-W-Y-N-D-Y-A-V-S-V-K-S, (I)
donde
Xaa6 puede ser Arg o Lys; 10
Xaa7 puede ser Tyr, His o Ser;
Xaa8 puede ser Met, Arg o Tyr;
y Xaa9 puede ser Lys o Arg.
[0063] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una 15 cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos HCDR2 como se muestra en SEQ ID NO: 194, en el que el HCDR2 de SEQ ID NO: 194 se define como se muestra en la Fórmula (III):
IIQ -Xaa15-RSKWYN-Xaa16-YA-Xaa17-SVKS, (III) 20
donde
Xaa15 puede ser Lys, Thr o Ile;
Xaa16 puede ser Asn o Asp; y 25
Xaa17 puede ser Val o Leu.
[0064] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos HCDR2 como se muestra en SEQ ID NO: 196, en el que el HCDR2 de SEQ ID NO: 196 se define como 30 se muestra en la Fórmula (V):
Xaa24-IDPSDSYTNY-Xaa25-P-S-F-Q-G, (V)
donde 35
Xaa24 puede ser Phe o Arg; y
Xaa25 puede ser Ala o Ser.
[0065] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una 40 cadena pesada y una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos LCDR3 como se muestra en SEQ ID NO: 191, en el que el LCDR3 de SEQ ID NO: 191 se define como se muestra en la Fórmula (II):
Xaa1-SYD-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-TV, (II) 45
donde
Xaa1 puede ser Ala, Gln, Gly o Ser;
Xaa2 puede ser Gly, Glu o Ser; 50
Xaa3 puede ser Asp o Asn;
Xaa4 puede ser Glu o Ser; y
Xaa5 puede ser Phe, Ala o Leu.
[0066] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una 55 cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos LCDR3 como se muestra en SEQ ID NO: 193, en el que el LCDR3 de SEQ ID NO: 193 se define como se muestra en la Fórmula (IV):
Xaa10-SYD-Xaa11-P-Xaa12-Xaa13-Xaa14-V, (IV) 60
donde
Xaa10 puede ser Gln o Ser;
Xaa11 puede ser Thr, Glu o Asp; 65
Xaa12 puede ser Val o Asn;
Xaa13 puede ser Tyr o Phe; y
Xaa14 puede ser Ser, Asn o Gln.
[0067] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de 5 aminoácidos LCDR3 como se muestra en SEQ ID NO: 195, en el que el LCDR3 de SEQ ID NO: 195 se define como se muestra en la Fórmula (VI):
QQ-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-T, (VI)
10
donde
Xaa18 puede ser Tyr, Gly o Ala;
Xaa19 puede ser Gly, Glu o Asn;
Xaa20 puede ser Ser o Thr; 15
Xaa21 puede ser Val, Ile o Leu;
Xaa22 puede ser Ser o Leu; y
Xaa23 puede ser Ile, Ser, Pro o Tyr.
[0068] También se describen en el presente documento otros anticuerpos aislados o fragmentos reactivos con TLR3 20 que tiene regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) de secuencias de aminoácidos 1,2 y 3 (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR) de secuencias de aminoácido 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) como se muestra en la Tabla 1a.
[0069] También se describen anticuerpos cuyas secuencias de aminoácido de sitio de unión al antígeno difieren 25 insustancialmente de los mostrados en la Tabla 1a (SEQ ID NOs: 49 a 121 y 191 a 196). Típicamente, esto implica una o más sustituciones de aminoácidos con un aminoácido que tienen características de carga similar, hidrofóbicas, o estereoquímicas. Sustituciones adicionales en las regiones de marco, en contraste con sitios de unión de antígeno también pueden hacerse siempre que no afecten negativamente a las propiedades del anticuerpo. Las sustituciones se pueden hacer para mejorar las propiedades de anticuerpos, por ejemplo la estabilidad o afinidad. Uno, dos, tres, 30 cuatro, cinco o seis sustituciones se pueden hacer con el sitio de unión al antígeno.
[0070] Las modificaciones conservativas producirán moléculas con características funcionales y químicas similares a las de la molécula de la que se realizan dichas modificaciones. Las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas pueden llevarse a cabo mediante la selección de 35 sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (1) de la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (2) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (3) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del 40 residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para la mutagénesis de barrido de alanina (MacLennan et al, Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67, 1998; Sasaki et al, adv Biophys 35: 1-24, 1998). Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por los expertos en la técnica en el momento en que se desean dichas sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden utilizar 45 para identificar residuos importantes de la secuencia de molécula, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en el presente documento. Sustituciones de aminoácidos de ejemplo se muestran en la Tabla 1b.
50
55
60
65
Tabla 1b.
Residuo original
Sustituciones ejemplares Sustituciones más conservadoras
Ala (A)
Val, Leu, Ile Val
Arg (R)
Lys, Gln, Asn Lys
Asn (N)
gln gln
Asp (D)
Glu Glu
Cys (C)
Ser, Ala Ser
Gln (Q)
Asn Asn
Gly (G)
Pro, Ala Ala
Su (H)
Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile (I)
Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina Leu
Leu (L)
Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys (K)
Arg, 1,4-diamino butírico, Gln, Asn Arg
Met (M)
Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu
Pro (P)
Ala Gly
Ser (S)
Thr, Ala, Cys Thr
Thr (T)
Ser Ser
Trp (W)
Tyr, Phe Tyr
Tyr (Y)
Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V)
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, norleucina Leu
5
10
15
20
25
[0071] En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de 30 aminoácidos no naturales que se incorporan típicamente mediante síntesis peptídica química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer por ejemplo por mutagénesis PCR (US Pat. No. 4,683,195). Bibliotecas de variantes se pueden generar utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo utilizando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW), y cribado de las bibliotecas para las variantes con propiedades deseadas, como se 35 muestra en el Ejemplo 1. La Tabla 1c muestra sustituciones hechas a tres antagonistas de anticuerpo parental TLR3 dentro de las regiones LCDR3 y HCDR2 para mejorar las propiedades de anticuerpos.
[0072] En función de delimitación de los sitios de unión al antígeno, los residuos del sitio de unión de antígenos de los anticuerpos de la invención y, posteriormente, los restos del marco pueden variar ligeramente dependiendo de la 40 cadena pesada y ligera. Las Tablas 2a y 2b muestran los residuos del sitio de unión a antígeno de anticuerpos ejemplares de la invención delineados de acuerdo con Kabat, Chothia y IMGT, y sus secuencias compuestas.
[0073] Otro anticuerpo ejemplar de la divulgación (mAb 14) se muestra de manera similar en las Tablas 2a y 2b.
45
50
55
60
65
Tabla 1c.
Familia 17
LCDR3 SEQ ID NO.
mAb
17
A S Y D G D E F T V
3
4
5
Q E S A
6
G S N S L
7
S S S L
consenso
A,Q,G,S S Y D G,E,S D,N E,S F,A,L T V 191
5
10
15
20
Familia 17
HCDR3 SEQ ID NO.
mAb
17
R I Y M R S K W Y N D Y A V S V K S
3
H R
4
K S Y R
5
6
7
consenso
R,K I Y,H,S M,R,Y R S K,R W Y N D Y A V S V K S 192
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
Familia 18A
LCDR3 SEQ ID NO.
mAb
18
Q S Y D S Q F S F G V
8
9
Familia 18B
mAb
10
Q S Y D T P V Y S V
11
S E N F N
12
S D N F Q
consenso
Q,S S Y D T,E,D P V,N Y,F S,N,Q V 193
*Consenso basado en mAbs 10, 11, 12
10
15
20
25
Familia 18A, 18B
HCDR3 SEQ ID NO.
mAb
18
I I Q K R S K W Y N N Y A V S V K S
8
T D
9
I D L
10
11
12
consenso
I I Q K,T,J R S K W Y N N,D Y A V,L S V K S 194
30
35
40
45
50
55
60
65
Familia 19
LCDR2 SEQ ID NO.:
mAb
19
Q Q Y G S V S I T
13
G E S I L S
14
A E T P
15
G N T L Y
15-1
G N T L Y
15-2
G N T L Y
15-3
I I G N T L K Y Y
15-4
G N T L Y
15-5
G N T L Y
15-6
G N T L Y
15-7
G N T L Y
15-8
G N T L Y
15-9
G N T L Y
Consenso
Q Q Y,G,A G,E,N S,T V,LL S,L I,S,P,Y T 195
5
10
15
20
25
30
Familia 19
HCDR2 SEQ ID NO:
mAb
19
F I D P S D S Y T N Y A P S F Q G
13
14
15
15-1
R
15-2
15-3
15-4
S
15-5
R S
15-6
15-7
15-8
15-9
R S
Consenso
F,R I D P S D S Y T N Y A,S P S F Q G 196
35
40
45
50
55
60
65
mAb
Definición CDR HCDR1 HCDR2 HCDR3
SEQ ID
Secuencia SEQ ID Secuencia SEQ ID Secuencia
14
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
14
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
14
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
14
Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
15
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15
Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-1
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-1
Kabat NYWVG RIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-1
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-1
Consenso 111 GYSFTNYWVG 114 RIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-2
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-2
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-2
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-2
Consenso 115 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-3
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-3
Kabat NYWVG 86 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ELYQGYMDTFDS
15-3
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-3
Consenso 116 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-4
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-4
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-4
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-4
Consenso 111 GYSFTNYWVG 117 FIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-5
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-5
Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-5
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-5
Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-6
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY ARQLYQGYMDTFDS
15-6
Kabat NYWIS FIDPSDSYTNYAPSFQ QLYQSGYMDTFDS
15-6
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-6
Consenso 116 GYSFTNYWIS 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 119 ARQLYQGYMDTFDS
15-7
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-7
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-7
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-7
Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-8
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 84 ARELYQGYMDTFDS
15-8
Kabat NYWVG FIDPSDSYTNYAPSFQ ELYQGYMDTFDS
15-8
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-8
Consenso 111 GYSFTNYWVG 112 FIDPSDSYTNYAPSFQ 84 ARELYQGYMDTFDS
15-9
IMGT 82 GYSFTNYW 86 IDPSDSYTNY 119 AROLYOGYMDTFDS
15-9
Kabat NYWIS RIDPSDSYTNYSPSFOG QLYQSGYMDTFDS
15-9
Chothia GYSFT PSDSYT LYQGYMDTFD
15-9
Consenso 116 GYSFTNYWIS 118 RIDPSDSYTNYSPSFQG 119 ARQLYQGYMDTFDS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0074] En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 según la reivindicación 1 que comprende tanto una cadena pesada como una región de variable de cadena ligera en la que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de la variable de cadena pesada (VH) y las regiones de variable de la cadena ligera (LV), como se muestra en la Tabla 3a. F17, F18 y F19 representan variantes de anticuerpos que comprenden secuencias de aminoácidos de consenso para las familias 17, 18 y 19, 5 respectivamente (véase el Ejemplo 1).
[0075] En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con TLR3 que comprende tanto una en la que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ de cadena pesada y una región variable de cadena ligera y ID NO: 216 y la 10 región variable de cadena ligera (LV) de la SEQ ID NO: 41, en la Tabla 3a.
[0076] También se describen en la Tabla 3a otros anticuerpos aislados o fragmentos reactivos con TLR3 que comprenden tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones de variable de cadena pesada (VH) y la variable de 15 cadena ligera (LV).
Tabla 2b.
mAb
Definición CDR LCDR1 LCDR2 LCDR3
SEQ ID NO:
Secuencia SEQ ID NO: Secuencia SEQ ID NO: Secuencia
14
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 85 QQAETVSPT
14
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQAETVSPT
14
Chothia SQSIGLY AAS AETVSP
14
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 85 QQAETVSPT
15
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-1
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-1
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-1
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-1
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-2
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-2
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-2
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-2
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-3
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-3
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-3
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-3
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-4
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-4
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-4
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-4
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-5
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-5
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-5
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-5
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(continuación)
mAb
Definición CDR LCDR1 LCDR2 LCDR3
SEQ ID NO:
Secuencia SEQ ID NO: Secuencia SEQ ID NO: Secuencia
15-6
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-6
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-6
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-6
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-7
IMGT QSISSY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-7
Kabat RASQSISSYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-7
Chothia SQSISSY AAS GNTLSY
15-7
Consenso 120 RASQSISSYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-8
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-8
Kabat RASQSIGLYLN AASSLQS QQGNTLSYT
15-8
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-8
Consenso 121 RASQSIGLYLN 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
15-9
IMGT 79 QSIGLY 80 AAS 87 QQGNTLSYT
15-9
Kabat RASQSIGLYLA AASSLQS QQGNTLSYT
15-9
Chothia SQSIGLY AAS GNTLSY
15-9
Consenso 109 RASQSIGLYLA 110 AASSLQS 113 QQGNTLSYT
5
10
15
20
25
Tabla 3a.
30
mAb
SEQ ID NO: mAb SEQ ID NO:
VH
VL VH VL
16
6 5 15-1 124 41
17
8 7 15-2 125 41
18
10 9 15-3 126 41
19
12 11 15-4 127 41
1
14 13 15-5 128 41
2
16 15 15-6 129 41
3
18 17 15-7 42 122
4
20 19 15-8 42 123
5
22 21 15-9 159 41
6
24 23 F17 198 197
7
26 25 F18 200 199
8
28 27 F19 202 201
9
30 29 c1811 164 163
10
32 31 9QVQ/QSV 212 209
11
34 33 10QVQ/QSV 213 210
12
36 35 12QVQ/QSV 214 211
13
38 37 14EVQ 215 39
14
40 39 15EVQ 216 41
15
42 41
35
40
45
50
55
60
[0077] Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de una cadena pesada y una de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que los casos alternativos pueden comprender regiones variables de cadena pesada o ligera individuales. La región variable única se puede utilizar para la detección de dominios variables capaces de formar un fragmento de unión al antígeno específico de dos dominios capaces de, por ejemplo, la unión a TLR3. El cribado se puede realizar mediante métodos de selección de 65 presentación de fagos usando por ejemplo enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en la PCT Publ. Nº
WO92/01047. En este enfoque, una colonia individual que contiene ya sea un clon de cadena H, ya sea de un clon de cadena L, se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de presentación en fagos como se describe.
5
[0078] En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento reactivo con TLR3 según la reivindicación 1 que comprende tanto regiones variables de cadena pesada como de una cadena ligera teniendo secuencias de aminoácidos al menos 95% idénticas a la secuencia de aminoácidos de la región variable como se muestra en la Tabla 3a.
10
[0079] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento que comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 220 y SEQ ID NO: 156.
[0080] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado según la reivindicación 1 que tiene ciertas secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera como se muestra en la Tabla 3b. 15
[0081] También se describen en el presente documento polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos de la invención o su complemento. Ciertos polinucleótidos de ejemplo se describen en el presente documento, sin embargo, se describen también otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los antagonistas de anticuerpos de la 20 invención.
[0082] Los antagonistas de anticuerpos ejemplares pueden ser anticuerpos de los isotipos IgG, IgD, IgG, IgA o IgM. Además, tales antagonistas de anticuerpos pueden modificarse después de la traducción por procesos tales como la glicosilación, isomerización, deglicosilación o modificación covalente de origen no natural, tales como la adición de 25 restos de polietilenglicol (PEG) (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden conjugar con polietilenglicol (pegilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica mientras que no interfiere con la función. Véase Deckert et al., Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15: 30 409-418, 2004; Leong et al, Cytokine 16: 106-119, 2001; y Yang et al., Protein Eng. 16: 761-770, 2003.
Tabla 3b.
mAb
Cadena pesada Cadena ligera
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
14
102 155
15
102 156
15-1
130 156
15-2
131 156
15-3
132 156
15-4
133 156
15-5
134 156
15-6
135 156
15-7
102 157
15-8
102 158
15-9
160 156
F17
204 203
F18
206 205
F19
208 207
14EVQ
220 155
15EVQ
220 156
5429
166 165
c1811
168 167
35
40
45
50
55
60
[0083] Propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de la invención también se podrían mejorar a través de modificaciones de Fc por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el isotipo de IgG4 de cadenas pesadas contienen un motivo Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) en la región de bisagra capaz de formar cualquiera de los enlaces de disulfuro de cadena pesada inter o intra, es decir, los dos restos de Cys en el motivo CPSC puede 65 enlazarse por disulfuro con los correspondientes restos de Cys en la otra cadena pesada (inter) o los dos restos de
Cys dentro de un motivo CPSC dado puede enlazarse por disulfuro entre sí (intra). Se cree que enzimas de isomerasa in vivo son capaces de convertir enlaces de cadenas pesada inter de las moléculas de IgG4 a enlaces de cadena pesada intra y viceversa (Aalberse y Schuurman, Immunology 105: 9-19, 2002). De acuerdo con ello, al no estar covalentemente asociados entre sí los pares de cadena pesada:ligera (H:L) en aquellas moléculas de IgG4 con enlaces de cadena intra-pesada en la región de bisagra, pueden disociarse en monómeros H:L, que después se 5 reasocian con monómeros H:L derivados de otras moléculas IgG4 que forman moléculas IgG4 biespecíficos, heterodiméricas. En un anticuerpo IgG biespecífico, los dos Fab de la molécula de anticuerpo difieren en los epítopos que se unen. Sustituyendo el resto de Ser en el motivo CPSC de región de bisagra de IgG4 con Pro resulta en "comportamiento similar a IgG1," es decir, Las moléculas forman enlaces de disulfuro estables entre las cadenas pesadas y por lo tanto, no son susceptibles al intercambio H:L con otras moléculas de IgG4. En una realización, los 10 anticuerpos de la invención comprenderán un dominio de IgG4 Fc con una mutación S a P en el motivo CPSC. La ubicación del motivo CPSC se encuentra típicamente en el residuo 228 de una cadena pesada madura, pero puede cambiar en función de las longitudes de CDR.
[0084] Además, los sitios pueden eliminarse que afectan a la unión a receptores de Fc distintos de un receptor de 15 rescate de FcRn en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, las regiones de unión del receptor de Fc implicadas en la actividad ADCC se pueden eliminar en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, la mutación de Leu234/Leu235 de la región de bisagra de IgG1 a L234A/L235A o Phe235/Leu236 de la región de bisagra de IgG4 a P235A/L236A minimiza FcR vinculante y reduce la capacidad de la inmunoglobulina de mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento y ADCC. En una realización, los anticuerpos de la invención comprenderán un 20 dominio de IgG4 Fc con mutaciones P235A/L236A. La ubicación de estos residuos identificados anteriormente es típica en una cadena pesada madura, pero puede cambiar dependiendo de las longitudes de CDR. Ejemplos de anticuerpos que tienen mutaciones P235A/L236A son anticuerpos que tienen cadenas pesadas codificadas por la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 218, 219 o 220.
25
[0085] Moléculas de anticuerpo completamente humano, humano adaptado, humanizado y de afinidad madurada o fragmentos de anticuerpos están dentro del alcance de la invención como son proteínas de fusión y proteínas quiméricas. La afinidad del anticuerpo hacia un antígeno puede mejorarse mediante el diseño racional o maduración de la afinidad al azar usando métodos bien conocidos, tales como mutagénesis al azar o dirigida, o el empleo de bibliotecas de presentación de fagos. Por ejemplo, la variación de los residuos de zona Vernier que residen 30 principalmente en la región marco puede utilizarse para modular la afinidad de un anticuerpo como se describe en la patente de los Estados Unidos. Nº 6.639.055. Recientemente, Almagro et al. "Residuos Determinantes de Afinidad", ADR, que residen en los CDR, y cuya ingeniería puede aumentar la afinidad (Cobaugh et al., J. Mol Biol 378: 622-633, 2008).
35
[0086] Moléculas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos totalmente humanos, adaptados a los humanos, moléculas humanizadas, madurados por afinidad modificados para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, la afinidad, la inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable están dentro del alcance de la invención. La estabilidad de un anticuerpo está influenciada por un número de factores, incluyendo (1) embalaje de núcleo de dominios individuales que afecta a su estabilidad intrínseca, (2) las interacciones de interfaz de 40 proteína/proteína que tienen impacto sobre el emparejamiento HC y CL, (3) enterramiento de residuos polares y cargados, (4) la red de unión H para los residuos polares y cargados; (Worn et al., J. Mol Biol, 305: 989-1010, 2001) y (5) la carga superficial y la distribución de residuo polar entre otras fuerzas intra e intermoleculares. La estructura de la desestabilización de los residuos potenciales pueden identificarse en base a la estructura cristalina del anticuerpo o mediante modelado molecular en ciertos casos, y el efecto de los residuos sobre la estabilidad del 45 anticuerpo se puede probar mediante la generación y evaluación de variantes que albergan mutaciones en los residuos identificados. Una de las maneras de aumentar la estabilidad del anticuerpo es elevar el punto medio de transición térmica (Tm), medida por calorimetría diferencial de barrido (DSC). En general, la proteína de Tm se correlaciona con su estabilidad y se correlaciona inversamente con su susceptibilidad al despliegue y la desnaturalización en solución y los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a 50 desplegarse (Remmele et al, Biopharm., 13: 36-46, 2000). Un número de estudios ha encontrado una correlación entre la clasificación de la estabilidad física de las formulaciones medido como la estabilidad térmica por DSC y la estabilidad física medida por otros métodos (Gupta et al, AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al, J. Pharm Sci. 93: 3076 a 3089, de 2004; Maa et al, Int J. Pharm, 140: 155-168, 1996; Bedu-Addo et al, Pharm Res, 21: 1353-1361, 2004; Remmele et al, Pharm Res., 15: 200-208, 1997). Estudios de formulación sugieren que un Fab Tm tiene 55 implicaciones para la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente. Las diferencias en los aminoácidos, ya sea en el marco o dentro de las CDR podrían tener efectos significativos sobre la estabilidad térmica del dominio Fab (Yasui, et al., FEBS Lett 353: 143-146, 1994).
[0087] Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden unir TLR3 con una KD de menos de o igual a 60 aproximadamente 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 o 10-12 M. La afinidad de una molécula dada para TLR3, tal como un anticuerpo se puede determinar experimentalmente usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar instrumentación Biacore o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica.
65
[0088] Los antagonistas de anticuerpo unen un homólogo TLR3 dado con una afinidad deseada pueden
seleccionarse a partir de bibliotecas de variantes o fragmentos por técnicas que incluyen la maduración de afinidad de anticuerpos. Antagonistas de anticuerpos pueden ser identificados en base a su inhibición de la actividad biológica TLR3 usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar ensayos de genes reporteros o ensayos que miden la producción de citoquinas utilizando métodos bien conocidos y como se describe en la solicitud. 5
[0089] Otra realización de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores de expresión de baculovirus, vectores basados en transposón o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo dado o antecedentes genéticos por cualquier medio. 10
[0090] También se describe aquí una célula huésped que comprende polinucleótidos tales como un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 o 216 o una región variable de 15 cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209 o 210.
[0091] También se describe aquí una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una inmunoglobulina de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ 20 ID NO: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 o 168, o una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 o 167. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células del arquea. Los ejemplos de células eucariotas pueden ser de origen animal de mamíferos, insectos, aves u otros. Células eucariotas de mamíferos incluyen las líneas de células tales como hibridomas o líneas celulares de 25 mieloma inmortalizadas tales como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC Nº 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y AG653 (ATCC CRL-1580) las líneas celulares murinas. Una línea de células de mieloma humano ejemplar es U266 (ATCC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de ovario de hámster chino (CHO), las células tales como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL- 30 61) o DG44.
[0092] También se describe aquí un método de fabricación de un anticuerpo reactivo con TLR3 que comprende cultivar una célula huésped de la divulgación y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Métodos de fabricación de anticuerpos y su purificación es bien conocida en la técnica. 35
[0093] También se describe en el presente documento una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo de la invención.
[0094] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que es reactivo con TLR3, donde el 40 anticuerpo une al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado de un grupo que consiste en (a) residuos K467, R488, R489 o de la SEQ ID NO: 2; (b) residuo K467 de la SEQ ID NO: 2; (C) residuo R489 de la SEQ ID NO: 2; (d) residuos K467 y R489 de la SEQ ID NO: 2; y (e) residuos K467, R488, y R489 de la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo aislado puede unir además al menos un residuo de aminoácido TLR3 seleccionado entre los residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570 o K619 de SEQ ID NO: 2. 45
[0095] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en el que el anticuerpo une al menos en residuo de aminoácido TLR3 seleccionado de un grupo que consiste en residuos D116 o K145 de SEQ ID NO: 2.
[0096] Varias metodologías bien conocidas pueden emplearse para determinar el epítopo de unión de los 50 anticuerpos de la invención. Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de los dos componentes individuales, acoplamiento proteína-proteína in silico puede llevarse a cabo para identificar los sitios compatibles de interacción. El intercambio hidrógeno-deuterio (H/D) puede llevarse a cabo con el complejo de antígeno y anticuerpo para mapear regiones en el antígeno que pueden estar unidas por el anticuerpo. El segmento y el punto de mutagénesis del antígeno puede utilizarse para localizar aminoácidos importantes para la unión de anticuerpos. Para las 55 proteínas grandes, tales como TLR3, mapeo de mutagénesis de punto se simplifica cuando el sitio de unión se localiza primero a una región en la proteína, tal como por acoplamiento, mutagénesis de segmento o el intercambio H/D.
[0097] También se describe aquí un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con TLR3 que compite para 60 la unión TLR3 con un anticuerpo monoclonal, donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la cadena de complementariedad pesada (CDR) 1, 2 y 3, como se muestra en SEQ ID NO:s 82, 86 y 84 y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3, como se muestra en SEQ ID NO:s 79, 80 y 87; o la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) como se muestra en SEQ ID NO: 216 y la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena 65 ligera (LV) como se muestra en SEQ ID NO: 41. Los anticuerpos monoclonales ejemplares de la invención son un
anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 216 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 41, y un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 214 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 211. 5
[0098] La competencia entre la unión a TLR3 se puede ensayar in vitro utilizando métodos bien conocidos. Por ejemplo, la unión de anticuerpo marcado con MSD sulfo-TagTM NHS-éster para TLR3 en presencia de un anticuerpo no marcado puede evaluarse mediante ELISA. Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invención es mAb 15. Otros anticuerpos ejemplares de la divulgación son mAb 12 y mAb c1811 (véase la Tabla 3a). Anticuerpos anti-TLR3 10 descritos anteriormente c1068 y sus derivados (descritos en PCT Publ Nº WO06/060513A2.), TLR3,7 (eBiosciences, cat nº 14-9039) e Imgenex IMG-315A (Imgenex IMG-315A; generados contra aminoácidos de TLR3 humana aminoácidos 55-70, VLNLTHNQLRRLPAAN) no compiten con la unión a TLR3 con mAb 12, 15 o c1811 como se muestra en el ejemplo 5.
15
[0099] Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que comprende las secuencias enumeradas en las reivindicaciones, en las que el anticuerpo tiene al menos una de las siguientes propiedades:
a. reduce la actividad biológica TLR3 humana en un ensayo de gen reportero in vitro de poli(I: C) NF-kB >50% a <1 µg/mL; 20
b. inhibe >60% de producción de IL-6 o CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I: C) a <10 µg/mL;
c. inhibe >50% de producción de IL-6 o CXCL5/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I: C) a <0,4 µg/mL;
d. inhibe >50% de ILO-6 de producción a partir de células estimuladas con NHBE 62,5 poli mL/ng (I: C) a <5 25 µg/mL;
e. inhibe >50% de ILO-6 de producción a partir de células estimuladas con NHBE 62,5 poli mL/ng (I: C) a <1 µg/mL;
f. inhibe >20% de poli(I: C) inducida por IFN-γ, IL-6 o IL-12 por las células PBMC a <1 µg/mL.
g. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomologus en un ensayo de gen reportero in vitro NF-kB con IC50 <10 30 µg/mL; o
h. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomologus en un ensayo de gen reportero in vitro ISRE con IC50 <5 µg/mL.
Métodos de Tratamiento 35
[0100] Los antagonistas TLR3 de la invención, por ejemplo anticuerpos antagonistas TLR3, se pueden utilizar para modular el sistema inmune. Aunque no se desee estar vinculado por ninguna teoría en particular, los antagonistas de la invención pueden modular el sistema inmunológico mediante la prevención o la reducción de la unión del ligando a TLR3, la dimerización de TLR3, internalización TLR3 o el tráfico de TLR3. Un anticuerpo aislado o 40 fragmento del mismo de la invención se pueden usar para tratar un paciente animal que pertenece a cualquier clasificación. Ejemplos de tales animales incluyen mamíferos tales como seres humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para antagonizar la actividad de TLR3, en el tratamiento de la inflamación, enfermedades inflamatorias y metabólicas y también son útiles en la preparación de un medicamento para dicho tratamiento en el que el medicamento se prepara para la administración en dosis 45 definidas en el presente documento.
[0101] Generalmente, las condiciones inflamatorias, condiciones de infección asociada o trastornos inflamatorios inmunes que pueden prevenirse o tratarse mediante la administración de los antagonistas de anticuerpos TLR3 de la invención incluyen aquellas mediadas por citocinas o quimiocinas y las condiciones que resultan en su totalidad o 50 parcialmente de la activación de TLR3 o señalización a través de la vía de TLR3. Ejemplos de tales enfermedades inflamatorias incluyen condiciones asociadas a la sepsis, enfermedades inflamatorias del intestino, trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios y condiciones de infección asociada. También se cree que las condiciones de tipos de cáncer, cardiovasculares y metabólicas, neurológicas y condiciones fibróticas pueden prevenirse o tratarse mediante la administración de los antagonistas de anticuerpos TLR3 de la invención. La inflamación puede afectar a 55 un tejido o ser sistémica. Tejidos afectados ejemplares son el tracto respiratorio, el pulmón, el tracto gastrointestinal, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto, el sistema cardiovascular, el tejido cardíaco, vasos sanguíneos, articulaciones, huesos y el tejido sinovial, cartílago, epitelio, endotelio, hepático o tejido adiposo. Condiciones inflamatorias sistémicas ejemplares son tormenta de citocinas o hipercitoquinemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), enfermedad injerto contra huésped (EICH), síndrome de distrés respiratorio agudo 60 (SDRA), síndrome de distrés respiratorio agudo severo (SRAS), síndrome anti-fosfolípido catastrófico, infecciones virales graves, la gripe, la neumonía, choque o sepsis.
[0102] La inflamación es una respuesta protectora de un organismo para defenderse de un agente invasor. La inflamación es un evento en cascada que implica muchos mediadores celulares y humorales. Por un lado, la 65 supresión de las respuestas inflamatorias puede dejar un huésped inmunocomprometido; sin embargo, si no se
controla, la inflamación puede dar lugar a complicaciones graves, incluyendo enfermedades crónicas inflamatorias (por ejemplo, asma, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino y similares), choque séptico y fallo multiorgánico. Es importante destacar que estos diversos estados de enfermedad comparten mediadores inflamatorios comunes, tales como citocinas, quimiocinas, células inflamatorias y otros mediadores secretados por estas células. 5
[0103] La activación TLR3 por sus ligandos poli(I:C), ARNds o ARNm endógeno conduce a la activación de las vías de señalización resultantes en la síntesis y la secreción de citocinas pro-inflamatorias, la activación y el reclutamiento de células inflamatorias, tales como macrófagos, granulocitos, neutrófilos y eosinófilos, la muerte celular, y la destrucción del tejido. TLR3 induce la secreción de ILO-6, ILO-8, ILO-12, TNF-α, MIP-1, CXCL5/IP-10 y 10 RANTES y otras citocinas pro-inflamatorias y quimiocinas implicadas en el reclutamiento de células inmunes y la activación, lo que contribuye a la destrucción tisular en enfermedades autoinmunes y otras enfermedades inflamatorias. El ligando TLR3 endógeno ARNm se libera de las células necróticas durante la inflamación, y puede resultar en un bucle de retroalimentación positivo para activar TLR3 y perpetuar la inflamación y el daño tisular adicional. Antagonistas de TLR3, como los antagonistas de anticuerpos TLR3, pueden normalizar la secreción de 15 citoquinas, reducir el reclutamiento de células inflamatorias, y reducir el daño tisular y la muerte celular. Por lo tanto, los antagonistas de TLR3 tienen el potencial terapéutico para el tratamiento de la inflamación y un espectro de condiciones inflamatorias.
[0104] Un ejemplo de una condición inflamatoria es condición asociada a la sepsis, que puede incluir el síndrome de 20 respuesta de inflamación sistémica (SIRS), choque séptico o síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS). ARNds liberado por infección viral, bacteriana, fúngica, o parasitaria y por las células necróticas puede contribuir a la aparición de sepsis. Aunque no se desea estar vinculado por una teoría particular, se cree que el tratamiento con antagonistas de TLR3 puede proporcionar un beneficio terapéutico mediante la ampliación de los tiempos de supervivencia en pacientes que sufren de condiciones inflamatorias asociadas a la sepsis o prevenir un evento 25 inflamatorio local (por ejemplo, en el pulmón) se extienda a convertirse en una condición sistémica, potenciando la actividad antimicrobiana innata, mediante la demostración de una actividad sinérgica cuando se combina con agentes antimicrobianos, minimizando el estado inflamatorio local, que contribuyen a la patología, o cualquier combinación de los anteriores. Tal intervención puede ser suficiente para permitir un tratamiento adicional (por ejemplo, el tratamiento de la infección subyacente o la reducción de los niveles de citoquinas) necesario para 30 asegurar la supervivencia del paciente. La sepsis puede modelarse en animales, tales como ratones, por la administración de D-galactosamina y poli(I:C). En estos modelos, D-galactosamina es una hepatotoxina que funciona como un sensibilizador de sepsis y poli(I:C) es una molécula inductora de sepsis que imita ARNds y activa TLR3. El tratamiento con antagonistas de TLR3 puede aumentar las tasas de supervivencia de los animales en un modelo murino de sepsis, y por lo tanto los antagonistas de TLR3 pueden ser útiles en el tratamiento de la sepsis. 35
[0105] La inflamación gastrointestinal es la inflamación de una capa de la mucosa del tracto gastrointestinal, y abarca las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas. La inflamación aguda se caracteriza generalmente por un tiempo corto de aparición y la infiltración o afluencia de neutrófilos. La inflamación crónica se caracteriza generalmente por un período de inicio y la infiltración o afluencia de células mononucleares relativamente más 40 largas. La capa de la mucosa puede ser mucosa del intestino (incluyendo el intestino delgado y el intestino grueso), el recto, el estómago de revestimiento (gástrico), o en la cavidad oral. Condiciones inflamatorias gastrointestinales crónicas de ejemplo son la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis inducida por las agresiones ambientales (por ejemplo, la inflamación gastrointestinal (por ejemplo, colitis) causada por o asociada con (por ejemplo, como un efecto secundario) un régimen terapéutico, tales como la administración de la quimioterapia, la 45 radioterapia, y similares), las infecciones de colitis, colitis isquémica, colágeno o la colitis linfocítica, enterocolitis necrosante, colitis en condiciones tales como la enfermedad granulomatosa crónica o enfermedad celíaca, alergias a los alimentos, gastritis, gastritis o enterocolitis infecciosa (por ejemplo, gastritis activa crónica infectada por helicobacter pilori) y otras formas de inflamación gastrointestinal causada por un agente infeccioso.
50
[0106] La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) incluye un grupo de trastornos inflamatorios crónicos de etiología desconocida, en general, por ejemplo, colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Las evidencias clínicas y experimentales sugieren que la patogénesis de la EII es multifactorial implicando genes de susceptibilidad y factores ambientales. En la enfermedad inflamatoria intestinal, el daño resulta de tejido de una respuesta inmune inapropiada o exagerada a los antígenos de la microflora intestinal. Existen varios modelos animales de enfermedades 55 inflamatorias del intestino. Algunos de los modelos más utilizados son el modelo de colitis inducida por (TNBS) 2,4,6-ácido trinitrobenesulfónico/etanol o el modelo de oxazolona, que inducen la inflamación crónica y úlceras en el colon (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol 19: 51-62, 2000). Otro modelo utiliza sodio de sulfato de dextrano (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea sanguinolenta, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración mucosal con infiltración de neutrófilos. Colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por la 60 infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño cripta focal, y ulceración epitelial (Hendrickson et al, Clinical Microbiology Reviews 15:79-94, 2002). Otro modelo consiste en la transferencia adoptiva de células T naive CD4 CD45RBaltos a ratones RAG o SCID. En este modelo, las células T naive donantes atacan el intestino receptor causando inflamación intestinal crónica y síntomas similares a enfermedades inflamatorias intestinales humanas (Read y Powrie, Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 15 unidad 15.13,2001). La 65 administración de antagonistas de la presente invención en cualquiera de estos modelos se pueden utilizar para
evaluar la eficacia potencial de los antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de enfermedades asociadas con la inflamación en el intestino, tales como enfermedad intestinal inflamatoria. Varias opciones de tratamiento para EII están disponibles, por ejemplo terapias de anticuerpos anti-TNF-α se han utilizado durante una década para tratar la enfermedad de Crohn (Van Assche et al., Eur. J. Pharmacol. Epub Oct 2009). Sin embargo, un porcentaje significativo de pacientes son refractarios a los tratamientos actuales (Hanauer et al, Lancet 359: 1541-5 1549, 2002; Hanauer et al, Gastroenterology 130: 323-333, 2006), y por lo tanto se necesitan nuevas terapias dirigidas a poblaciones de pacientes refractarias.
[0107] Otro ejemplo de una condición inflamatoria es una condición inflamatoria pulmonar. Condiciones inflamatorias pulmonares ejemplares incluyen condiciones pulmonares inducidas por infección incluyendo aquellas asociadas con 10 infecciones virales, bacterianas, hongos, parásitos o priones; afecciones pulmonares inducidas por alérgenos; afecciones pulmonares inducidas por contaminantes tales como la asbestosis, silicosis, o beriliosis; condiciones gástricas inducidas por aspiración pulmonar, desregulación inmune, condiciones inflamatorias con predisposición genética, tales como la fibrosis quística, y condiciones pulmonares inducidas por trauma físico, como una lesión ventiladora. Estas condiciones inflamatorias también incluyen asma, enfisema, bronquitis, enfermedad pulmonar 15 obstructiva crónica (EPOC), la sarcoidosis, histiocitosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, la neumonía adquirida en la comunidad, neumonía nosocomial, neumonía asociada a ventilador, sepsis, neumonía viral, una infección por influenza, infección de parainfluenza, infección por rotavirus, infección por metapneumovirus humano, infección por el virus sincitial respiratorio y aspergillus u otras infecciones por hongos. Enfermedades inflamatorias de infección 20 asociada a modo de ejemplo pueden incluir neumonía viral o bacteriana, incluyendo neumonía grave, fibrosis quística, bronquitis, exacerbaciones de la vía aérea y el síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA). Tales condiciones de infección asociada pueden implicar múltiples infecciones, tales como una infección viral primaria y una infección bacteriana secundaria.
25
[0108] El asma es una enfermedad inflamatoria de los pulmones que se caracteriza por la hiperreactividad de las vías respiratorias ("AHR"), broncoconstricción, sibilancias, inflamación eosinofílica o neutrofílica, hipersecreción de moco, fibrosis subepitelial, y los niveles elevados de IgE. Los pacientes con asma experimentan "exacerbaciones", un empeoramiento de los síntomas, más comúnmente debidos a las infecciones microbianas de las vías respiratorias (por ejemplo, rinovirus, virus de influenza, influenza de haemophilus, etc.). Ataques de asma pueden 30 desencadenarse por factores ambientales (por ejemplo, ascáridos, insectos, animales (por ejemplo, gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsters, cobayas y pájaros), los hongos, los contaminantes del aire (por ejemplo, el humo del tabaco), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, productos químicos, el polen, el ejercicio o el aire frío. Aparte de asma, varias enfermedades inflamatorias crónicas que afectan a los pulmones se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, por ejemplo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), 35 neumonía bacterial y la fibrosis quística (Linden et al, Eur Respir J. 15: 973-977, 2000; Rahman et al, Clin. Immunol 115: 268-276, 2005), y las enfermedades como la EPOC, la rinitis alérgica y la fibrosis quística se caracterizan por hipersensibilidad de vía respiratoria (Fahy y O'Byrne, Am J. Respir Crit. Care Med. 163: 822-823, 2001). Modelos animales utilizados comúnmente para el asma y la inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de desafío de ovoalbúmina y la sensibilización de metacolina (Hessel et al., Eur. J. Pharmacol 293: 401-412, 1995). La 40 inhibición de la producción de citoquinas y quimioquinas a partir de células humanas cultivadas bronquiales epiteliales, fibroblastos bronquiales o células del músculo liso de las vías respiratorias también se pueden utilizar como modelos in vitro. La administración de antagonistas de la presente invención a cualquiera de estos modelos se puede utilizar para evaluar el uso de los antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso del asma, la inflamación de las vías respiratorias, la EPOC y similares. 45
[0109] Otras condiciones y neuropatías inflamatorias, que pueden ser prevenidas o tratadas por el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención son aquellas causadas por enfermedades autoinmunes. Estas condiciones y neuropatías incluyen la esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, y neurodegenerativas y trastornos del sistema nervioso central (SNC) incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, 50 enfermedad de Huntington, trastorno bipolar y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedades del hígado como la cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedad de hígado graso sin alcohol/esteatohepatitis, fibrosis, virus de hepatitis C (VHC) y el virus de hepatitis B (VHB), la diabetes y la resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares como la aterosclerosis, la hemorragia cerebral, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio, artritis, artritis reumatoide, la artritis psoriásica y la artritis reumatoide juvenil (ARJ), osteoporosis, osteoartritis, 55 pancreatitis, fibrosis, encefalitis, psoriasis, arteritis de células gigantes, espondilitis, anquilosante, hepatitis autoinmune, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), enfermedades inflamatorias de la piel, trasplante, cáncer, alergias, enfermedades endocrinas, reparación de heridas, otras enfermedades autoinmunes, la hiperreactividad de las vías respiratorias y las células, virus o infecciones o trastornos mediados por priones.
60
[0110] La artritis, incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesión, y similares, son condiciones inflamatorias comunes que se beneficiarían del uso terapéutico de las proteínas antiinflamatorias, tales como los antagonistas de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica que afecta a todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Dado que los resultados de la artritis reumatoide en el daño tisular, los ligandos de TLR3 podrían estar presentes en el sitio de la 65 inflamación. La activación de la señalización TLR3 puede perpetuar la inflamación y daño tisular adicional en la
articulación inflamada. Varios modelos animales para la artritis reumatoide se conocen en la técnica. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se parece mucho a la artritis reumatoide humana. La administración de los antagonistas de TLR3 de la presente invención a los ratones modelo CIA se pueden utilizar para evaluar el uso de estos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de las enfermedades. 5
[0111] Diabetes mellitus, diabetes, se refiere a un proceso de enfermedad derivado de múltiples factores causantes y caracterizado por hiperglucemia (LeRoith et al., (Eds.), Diabetes mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. EE.UU. 1996), y todas las referencias citadas en el mismo. Hiperglucemia no controlada se asocia con mortalidad incrementada y prematura debida a un mayor riesgo de enfermedades microvasculares y 10 macrovasculares, incluyendo nefropatía, neuropatía, retinopatía, hipertensión, enfermedad cerebrovascular y enfermedad cardíaca coronaria. Por lo tanto, el control de la homeostasis de la glucosa es un enfoque críticamente importante para el tratamiento de la diabetes.
[0112] Los defectos subyacentes conducen a una clasificación de la diabetes en dos grupos principales: diabetes de 15 tipo I (diabetes mellitus dependiente de insulina, IDDM), que surge cuando los pacientes carecen de células beta productoras de insulina en sus glándulas pancreáticas, y diabetes de tipo 2 (diabetes mellitus dependiente no insulina, NIDDM), que se produce en pacientes con una alteración de la secreción de insulina de las células beta y/o resistencia a la acción de la insulina.
20
[0113] La diabetes de tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina acompañada de deficiencia relativa, no absoluta de insulina. En individuos resistentes a la insulina, el cuerpo secreta cantidades anormalmente altas de insulina para compensar este defecto. Cuando cantidades inadecuadas de insulina están presentes para compensar la resistencia a la insulina y controlar adecuadamente la glucosa, un estado de intolerancia a la glucosa se desarrolla. En un número significativo de individuos, la secreción de insulina disminuye aún más y el nivel de glucosa 25 en plasma se aumenta, dando como resultado el estado clínico de diabetes. Inflamación asociada a adipocidad ha sido fuertemente implicada en el desarrollo de resistencia a la insulina, diabetes de tipo 2, la dislipidemia y la enfermedad cardiovascular. La adiposa obesa recluta y retiene los macrófagos y pueden producir citoquinas pro-inflamatorias excesivas incluyendo TNF-α e IL-6, ácidos grasos libres y adipoquinas, que pueden interferir con la señalización de insulina e inducir resistencia a la insulina. La activación TLR3 en los macrófagos puede contribuir al 30 estado pro-inflamatorio del adiposo. Varios modos de animales de resistencia a la insulina se conocen. Por ejemplo, en un modelo de obesidad inducida por dieta (DIO) animales desarrollan hiperglucemia y resistencia a la insulina acompañada de aumento de peso. La administración de antagonistas de TLR3 de la presente invención al modelo DIO se puede utilizar para evaluar el uso de los antagonistas para mejorar las complicaciones asociadas con la diabetes de tipo 2 y alterar el curso de la enfermedad. 35
[0114] Cánceres ejemplares pueden incluir al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no limitado a la leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), de células B o de células T, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia crónica mieloide (LCM), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células peludas, síndrome mielodiplástico (MDS), linfoma, enfermedad de Hodgkin, 40 linfoma maligno, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, células de carcinoma renal, cáncer de mama, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, sarcomas, melanoma maligno, particularmente melanoma metastásico, hemangioma, enfermedad metastásica, la resorción ósea relacionada con el cáncer y el dolor en los huesos 45 relacionados con el cáncer.
[0115] Enfermedades cardiovasculares ejemplares pueden incluir la enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no limitado a, síndrome de aturdimiento cardíaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, 50 hemorragia, arteriosclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad aterosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, choque, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardíaca, cardiopatía pulmonar, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardíacas, latidos ectópicos auriculares, aleteo auricular, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), síndrome post perfusión, respuesta a la inflamación de bypass cardiopulmonar, taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia de QRS regular estrecha, arritmias 55 específicas, fibrilación ventricular, arritmias, bloqueo auriculoventricular, bloqueo de rama, trastornos isquémicos del miocardio, enfermedad de la arteria coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatía, cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía restrictiva, cardiopatías valvulares, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardíacos, aneurismas aórdico y periférico, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad aterosclerótica 60 periférica, tromboangitis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno y enfermedad de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa, limfederma, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, el síndrome post bomba y la lesión por isquemia-reperfusión.
65
[0116] Enfermedades neurológicas ejemplares pueden incluir la enfermedad neurológica en una célula, tejido,
órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no limitado a las enfermedades neurodegenerativas, la esclerosis múltiple, dolor de cabeza migraña, complejo de demencia del SIDA, enfermedades desmielinizantes, como la esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelosos; trastornos del movimiento hipercinéticos tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por fármacos, 5 como los inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC; trastornos del movimiento hipocinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; parálisis de supranucleo progresista; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno 10 multisistémico mitocondrial); trastornos desmielinizantes centrales, tales como la esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del cuerno anterior, tales como esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la mediana edad; enfermedad difusa de cuerpos de Lewy; tipo de cuerpo de demencia senil de Lewy; el síndrome de Wernicke-Korsakoff; el alcoholismo 15 crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz y demencia pugilística.
[0117] Condiciones fibróticas ejemplares pueden incluir la fibrosis hepática (incluyendo pero no limitado a cirrosis inducida por el alcohol, cirrosis inducida por virus, hepatitis autoinmune inducida); fibrosis pulmonar (incluyendo pero 20 no limitado a la esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática); fibrosis renal (incluyendo pero no limitado a la esclerodermia, nefritis diabética, nefritis glomerular, nefritis de lupus); fibrosis dérmica (incluyendo pero no limitado a la esclerodermia, hipertrófica y cicatrices queloides, quemaduras); mielofibrosis; neurofibromatosis; fibroma; la fibrosis intestinal; y las adherencias fibróticas que resultan de procedimientos quirúrgicos. En tal método, la fibrosis puede ser fibrosis específica de órgano o fibrosis sistémica. La fibrosis específica de órganos puede estar asociada 25 con al menos uno de fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis cardíaca, fibrosis vascular, fibrosis de la piel, fibrosis de los ojos, fibrosis de médula ósea u otra fibrosis. La fibrosis pulmonar se puede asociar con por lo menos una de fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, asma, sarcoidosis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La fibrosis hepática puede estar asociada con al menos uno de cirrosis, esquistosomiasis o colangitis. La cirrosis se puede seleccionar de la cirrosis alcohólica, cirrosis post-hepatitis C, 30 cirrosis biliar primaria. La colangitis esclerosante es colangitis. La fibrosis renal puede estar asociada con nefropatía diabética o glomerulosclerosis de lupus. La fibrosis cardíaca puede estar asociada con el infarto de miocardio. La fibrosis vascular puede estar asociada con la restenosis arterial de postangioplastia o aterosclerosis. La fibrosis de la piel puede estar asociada con la cicatrización de quemaduras, cicatrización hipertrófica, queloide, o dermatopatía fibrosante nefrogénica. La fibrosis de ojo puede estar asociada con fibrosis retro-orbital, la cirugía postcatarata o 35 vitreorretinopatía proliferativa. La fibrosis de médula ósea se puede asociar con mielofibrosis idiopática o inducida por fármacos de mielofibrosis. La otra fibrosis se puede seleccionar de la enfermedad de Peyronie, la contractura de Dupuytren o dermatomiositis. La fibrosis sistémica puede ser esclerosis sistémica o enfermedad de huésped contra injerto.
40
Administración/Composiciones farmacéuticas
[0118] La "cantidad terapéuticamente eficaz" del agente eficaz en el tratamiento o la prevención de condiciones en las que la supresión de la actividad de TLR3 es deseable puede determinarse por técnicas de investigación estándar. Por ejemplo, la dosis del agente que será efectiva en el tratamiento o prevención de la afección 45 inflamatoria, como el asma, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o la artritis reumatoide puede ser determinada por administración del agente a modelos animales relevantes, tales como los modelos descritos en el presente documento .
[0119] Además, ensayos in vitro pueden opcionalmente ser empleados para ayudar a identificar intervalos de 50 dosificación óptimos. La selección de una dosis eficaz particular puede determinarse (por ejemplo, a través de ensayos clínicos) por los expertos en la técnica basándose en la consideración de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la materia. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse de 55 acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas in vitro de prueba de modelo o de animales.
[0120] En los usos terapéuticos de la invención, el antagonista de TLR3 se puede administrar solo o en combinación con al menos otra molécula. Tales moléculas adicionales pueden ser otras moléculas antagonistas de TLR3 o 60 moléculas con un beneficio terapéutico no mediado por la señalización del receptor TLR3. Los antibióticos, antivirales, paliativos y otros compuestos que reducen los niveles de citoquinas o la actividad son ejemplos de tales moléculas adicionales.
[0121] El modo de administración para el uso terapéutico del agente de la invención puede ser cualquier vía 65 adecuada que suministre el agente al huésped. Las composiciones farmacéuticas de estos agentes son
particularmente útiles para la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o intranasal.
[0122] El agente de la invención se puede preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del agente como un ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo" se 5 refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, 0,4% de solución salina y 0,3% de glicina se pueden usar. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia particulada. Se pueden esterilizar mediante técnicas convencionales, bien conocidas de 10 esterilización (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes de tampón, estabilizantes, agentes espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración del agente de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,5%, normalmente a o al menos aproximadamente 1% hasta 15 o 20% en peso, y se seleccionará basándose 15 principalmente en dosis requerida, los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.
[0123] Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 mL de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, por 20 ejemplo, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo antagonista TLR3 de la invención. Del mismo modo, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse hasta contener aproximadamente 250 mL de solución estéril de Ringer, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y preferiblemente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un antagonista de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones 25 administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen en más detalle en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
[0124] Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales 30 y preparaciones de proteína y técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica se pueden emplear.
[0125] La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos, no limitativos.
Ejemplo 1 35
Identificación y derivación de mAb de Antagonista Anti-huTLR3
[0126] La MorphoSys Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®) Gold phage display library (Morphosys AG, Martinsried, Alemania) se utilizó como una fuente de fragmentos de anticuerpos humanos y se colocó contra un 40 antígeno purificado TLR3 generado a partir de la expresión de los aminoácidos 1-703 de TLR3 humana (huTLR3) (SEQ ID NO: 4) con una etiqueta de poli-histidina C-terminal y se purificó por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado. Los aminoácidos 1-703 corresponden al dominio extracelular predicho (ECD) de huTLR3. Los fragmentos Fab (Fabs) que se unían específicamente a huTRL3 ECD se seleccionaron mediante la presentación de la proteína de TLR3 en una variedad de maneras de modo que un conjunto diverso de fragmentos de anticuerpo se 45 pudo identificar, secuenciar y confirmar como únicos. A partir de diferentes estrategias de paneo, 62 candidatos (secuencias diferentes de la región V) fueron identificados como únicos agentes aglutinantes hTLR3 ECD.
[0127] Las 62 candidatos identificados como aglutinantes huTLR3 ECD fueron seleccionados para la actividad neutralizante en una gama de ensayos basados por células relevantes para la identificación de la actividad anti-50 inflamatoria. Utilizando los datos de actividad preliminares (véase el Ejemplo 2 a continuación), se seleccionaron cuatro candidatos (Fab 16-19) que definen las familias 16-19 se seleccionaron de los 62 como padres para maduración CDR de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) y CDR3 de cadena ligera (LCDR3). Uno de los candidatos de los padres (candidato 19) exhibió un sitio de glicosilación N-vinculado en HCDR2; una mutación Ser a Ala (S a A) se realizan en este candidato para eliminar el sitio. Después de maduración CDR de los cuatro candidatos de los 55 padres, se identificaron un total de 15 candidatos de la progenie (candidatos 1-15) para una caracterización adicional como se describe en el Ejemplo 2 a continuación. Un listado de las regiones variables de las cadenas pesadas presentes en cada uno de los 19 candidatos como se muestra en la Tabla 3 anterior. Los candidatos se denominan en este documento como mAb 1-19 o Fab 1-19, dependiendo si eran los Fab o se clonaron como cadenas de anticuerpo de longitud completa (Ejemplo 3). Debido al diseño del vector de expresión, los terminales de amino 60 maduros de las regiones variables para todos los candidatos eran EPC para la cadena pesada y DI para la cadena ligera. Las secuencias preferidas en estos terminales son aquellos en los respectivos genes germinales con alta identidad con las secuencias candidatas. Para las familias 17 y 18 las secuencias de línea germinal son QVQ para VH y LV para SY. Para la familia 19, las secuencias son EVQ para VH y LV para DI. La secuencia SY es única para el subgrupo lambda 3 y hay informes de heterogeneidad, ya sea con S o Y como el resto amino terminal. Por lo 65 tanto, el terminal de consenso QSV del subgrupo prominente lambda 1 se consideró un sustituto más adecuado para
DIE para LV de las familias 17 y 18. Estos cambios se introdujeron en los candidatos 9, 10 y 12 de la familia 18 y candidatos 14 y 15 de la familia 19. En este proceso, tanto regiones VH como LV de estos anticuerpos se optimizaron por cordon. Las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de variantes de la línea germinal N-terminales de los candidatos 9, 10 y 11 se muestran en la SEQ ID NO:s 209-211, y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de variantes de la línea germinal N-terminales para los 5 candidatos 9, 10, 12, 14, y 15 se muestran en la SEQ ID NO:s 212-216, respectivamente. Se referie a las variantes N-terminales de los candidatos en este documento como candidato/mAb/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ. Las variantes de la línea germinal N-terminal se expresaron como mAbs y no mostraron ningún efecto sobre la unión a TLR3 o en su capacidad para inhibir la actividad biológica TLR3 en comparación con sus homólogos de los padres (datos no mostrados). 10
Ejemplo 2
Determinación de actividad antagonista TLR3 in vitro
15
[0128] Los candidatos CDR-madurados 15 anteriormente descritos fueron seleccionados como potenciales agentes terapéuticos humanos y se determinó una serie de actividades de unión y de neutralización. Los ensayos de actividad y los resultados para las cuatro Fab parentales, Fabs 16-19 y Fab CDR-madurados 15, Fab 1-15 o sus variantes de región V de la línea germinal no se describen a continuación.
20
Inhibición de NF-κB y Cascada de Señalización ISRE
[0129] Las células 293T se cultivaron en DMEM y medios Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementadas con FBS inactivado por calor y se transfectaron con 30 ng pNF-κB o ISRE plásmidos reporteros de luciferasa de luciérnaga, vector de 13,5 ng pcDNA3.1, 5 ng phRL-TK, y FL TLR3 codificador de 1,5 ng pCDNA (SEQ ID NO: 2). El 25 plásmido phRL-TK contiene el gen de luciferasa de Renilla dirigido por el promotor de quinasa de timidina de HSV-1 (Promega, Madion, WI). Los anticuerpos TLR3 se incubaron 30 a 60 min. antes de la adición de poli(I:C)(GE Healthcare, Piscataway, NJ). Las placas se incubaron 6 horas o 24 horas a 37°C antes de la adición del reactivo de luciferasa Dual-Glo y las placas se leyeron en un lector de placas FLUOstar. Los valores normalizados (relación de luciferasa) se obtuvieron por división de la luciérnaga RLU por RLU de Renilla. Tras la estimulación con el agonista 30 de TLR3 poli(I:C)(1 µg/mL), el NF-κB o producción de luciferasa de luciérnaga estimulada por cascada de señalización ISRE se inhibió específicamente por incubación de las células con anticuerpos de anti-TLR3 (0,4, 2,0 y 10 µg/mL) antes de la estimulación. Los resultados de los ensayos NF-κB se muestran en la Fig. 1 y se expresan como % de inhibición de la relación de la luciérnaga/Renilla con 5465 como control positivo (la neutralización de TLR3 Mab anti-humano) y un mAb factor de tejido anti-humano (859) como el control de isotipo de IgG4 humano. 35 >50% inhibición se consiguió con concentraciones de mAb 0,4 a 10 µg/mL. c1068 y TLR3.7 inhibieron aproximadamente 38% y 8% de la actividad biológica TLR3 a 10 µg/mL. Resultados similares se obtuvieron con el ensayo de gen indicador ISRE (datos no mostrados).
Liberación de citoquinas en células BEAS-2B 40
[0130] Las células BEAS-2B (SV-40 transformó la línea celular epitelial bronquial humana normal) se sembraron en platos recubiertos de un colágeno de tipo I y se incubaron con o sin anticuerpos anti-humanos TLR3 antes de la adición de poli(I:C). Veinticuatro horas después de los tratamientos, se recogieron y se ensayaron para los niveles de citocinas y quimiocinas usando un ensayo de encargo multi-plex de talón para la detección de IL-6, IL-8, CCL-45 2/MCP-1, CCL5/RANTES, y CXCL10/IP-10. Los resultados se muestran en la Fig. 2 como % de inhibición de la citoquina/quimioquina individual después del tratamiento mAb en 0,4, 2,0 y 10 µg/mL. 5465 es un control positivo; 859 es un control de isotipo.
Liberación de citoquinas en las células NHBE 50
[0131] La liberación de citoquinas también se ensayó en las células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) (Lonza, Walkersville, MD). Las células NHBE se expandieron y se transfirieron a placas recubiertas con colágeno y se incubaron durante 48 horas después de lo cual se retiró el medio y se rellenó con 0,2 mL de medio fresco. Las células fueron incubadas con o sin TLR3 mAbs anti-humano 60 minutos antes de la adición de poli(I:C). Se 55 recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se almacenaron a -20°C o ensayaron inmediatamente para los niveles de IL-6. Los resultados se representan gráficamente en la Fig. 3 como % de inhibición de la secreción de IL-6 después del tratamiento mAb utilizando dosis entre 0,001 y 50 µg/mL. 5465 es un control positivo, 859 es un control de isotipo. La mayoría de los mAbs inhibieron al menos 50% de la producción de IL-6 a <1 µg/mL, y alcanzaron 75% de inhibición a <5 µg/mL. 60
Liberación de citocinas en las células PBMC
[0132] La liberación de citoquinas también se ensayó en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). La sangre completa se obtiene de donantes humanos en tubos de recogida de heparina a la que una 65 solución Ficoll-Paque Plus era lentamente en capas debajo. Los tubos se centrifugaron y el PBMCs, que se formó
una capa blanca por encima de la Ficoll, se recuperaron y se sembraron. Las PBMCs fueron incubadas con o sin anti-humano TLR3 mAbs antes de la adición de 25 µg/mL de poli(I:C). Después de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y los niveles de citoquinas se determinaron utilizando la tecnología Luminex. Los resultados se representan gráficamente en la Fig. 4 como porcentaje de inhibición acumulativa de IFN-γ, ILO-12 y ILO-6 usando una sola dosis de mAb (0,4 µg/mL) con 5465 es un control positivo; hIgG4 es un control de isotipo. 5
Liberación de citoquinas en células HASM
[0133] Brevemente, las células de las vías respiratorias humanas de músculo liso (HASM) se incubaron con o sin TLR3 mAbs anti-humanos antes de la adición de una combinación sinérgica de 500 poli ng/mL (I:C) y 10 ng/mL de 10 TNF-α. Después de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y los niveles de citoquinas se determinaron utilizando la tecnología Luminex. Los resultados se representan gráficamente en la Fig. 5 como los niveles de quimiocina CCL5/RANTES utilizando tres dosis de mAb (0,4, 2 y 10 µg/mL). 5465 es un control positivo; hIgG4 es un control de isotipo.
15
[0134] Los resultados de los ensayos in vitro en células humanas confirman la capacidad de los anticuerpos de la invención para reducir citoquinas y liberación de quimiocinas como resultado de la unión a huTLR3.
Ejemplo 3
20
Constructos de anticuerpos de larga duración
[0135] Los cuatro Fabs parentales (números de candidatos. 16-19) y 15 cadenas pesadas de Fab progenie (números de los candidatos. 1-15) se clonaron en un fondo de IgG4 humana con una mutación S229P FC. Los candidatos 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ se clonaron en un fondo de IgG4 humano con 25 mutaciones F235A/L236A y S229P FC.
[0136] Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa maduras se muestran en SEQ ID NOs: 90 a 102 y 218 a 220 de la siguiente manera:
30
Candidato
SEQ ID NO:
16
90
17
91
18
92
19
93
1
94
2
95
3
96
4
97
5, 6, 7
98
8
99
9
100
10, 11, 12
101
13, 14, 15
102
9EVQ
218
10EVQ, 12EVQ
219
14EVQ, 15EVQ
220
35
40
45
50
[0137] Para la expresión, estas secuencias de cadena pesada puede incluir una secuencia líder N-terminal tal como MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 103). Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican la cadena pesada de candidatos 14EVQ y 15EVQ con una secuencia líder y la forma madura (sin una secuencia líder) se muestran en SEQ ID NOs: 104 y 105, respectivamente. Del mismo modo, para la expresión, las secuencias de 55 cadena ligera de los anticuerpos de la invención pueden incluir una secuencia líder N-terminal tal como MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 106). Secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican la cadena ligera del candidato codón optimizado 15 con una secuencia líder y la forma madura (sin una secuencia líder) se muestran en SEQ ID NOs: 107 y 108, respectivamente.
60
Ejemplo 4
Caracterización de unión mAb anti-TLR3
[0138] Los valores de CE50 para la unión de los mAbs para dominio extracelular TLR3 humano (ECD) se 65 determinaron por ELISA. La proteína humana TLR3 ECD se diluyó a 2 µg/mL en PBS y 100 µl alícuotas se
dispensaron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Corning Inc., Acton, MA). Después de la incubación durante la noche a 4°C, la placa se lavó 3 veces en tampón de lavado que consiste en 0,05% de Tween-20 (Sigma-Aldrich) en PBS. Los pocillos se bloquearon con 200 µl de solución de bloqueo que consiste en 2% I-Block (Applied Biosystems, Foster City, CA) y 0,05% de Tween-20 en PBS. Después de bloquearse durante 2 horas a temperatura ambiente, la placa se lavó 3 veces seguido de la adición de diluciones en serie de los candidatos anti-TLR3 mAb 1 a 5 19 en tampón de bloqueo. Anti-TLR3 mAbs se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces. Esto se siguió por la adición de una oveja conjugada con peroxidasa anti-IgG humana (GE Healthcare, Piscataway, NJ) diluido 1: 4000 en tampón de bloqueo, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados en tampón de lavado. La unión se detectó mediante la incubación de 10-15 minutos en TMB-S (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA). La reacción se detuvo con 25 µl 2N H2SO4 y la absorbancia 10 se leyó a 450 nm con substracción a 650 nm usando un espectrofotómetro SPECTRA Max (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Los valores de CE50 se determinaron por regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
[0139] Se determinaron los valores de EC50 para la unión a huTLR3 (Tabla 4) mediante la incubación con 100 µl de 15 4 diluciones en serie de mAb de 2,5 µg/mL a 0,6 pg/mL. Un factor tisular humano anti-mAb 859 y hu IgG4κ se incluyeron como controles negativos.
Tabla 4
20
Candidato no.
CE50 (ng/mL)
1
17,18
2
53,12
3
23,42
4
12,77
5
19,94
6
19
7
16,13
8
18,58
9
22,61
10
15,84
11
26 ,33
12
25,59
13
23,51
14
33,59
15
32,64
16
43,66
17
13,8
18
9,68
19
66,54
25
30
35
40
[0140] La afinidad de unión por huTLR3 ECD también se determinó mediante análisis Biacore. Los datos (que no se 45 muestran) indicaron que los mAb 1-19 tenían una Kd para huTLR3 ECD de menos de 10-8 M.
Ejemplo 5
Unión de epítopo competitivo 50
[0141] Se llevaron a cabo experimentos de unión a epítopo para determinar los grupos de competencia de anticuerpos anti-TLR3 o "contenedores de epítopo".
[0142] Para ELISA competitivo, 5 µl (20 µg/mL) de proteína humana purificada TLR3 ECD generada como se 55 describe en el Ejemplo 1 se revistió sobre placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. 150 µl de 5% tampón MSD Blocker A (Meso Scale Discovery) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón 0,1 M HEPES, pH 7,4, seguido de la adición de la mezcla de anticuerpo anti-TLR3 mAb con diferentes competidores. Los anticuerpos marcados (10 nM) se incubaron con concentraciones incrementadas (1 nM a 2 µM) 60 de anticuerpos anti-TLR3 no marcados, y después se añadieron a los pocillos designados en un volumen de 25 µl de mezcla. Después de la incubación de 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón de 0,1 M de HEPES (pH 7,4). MSD Read Buffer T se diluyó con agua destilada (4 veces) y se dispensó en un volumen de 150 µl/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000. Los anticuerpos se marcaron con MSD Sulfo-TagTM NHS-éster de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery). 65
[0143] Se evaluaron los siguientes anticuerpos anti-TLR3: mAbs 1-19 obtenidos de la biblioteca de anticuerpos de MorphoSys combinatoria humana (mostrada en la Tabla 3a); c1068 (descrito en WO06/060513A2), c1811 (TLR3 mAb de rata anti-ratón producido por un hibridoma generado a partir de ratas inmunizadas con la proteína de TLR3 ratón), TLR3.7 (eBiosciences, San Diego, CA, cat nº 14-9039) y IMG-315A (generado contra los aminoácidos TLR3 humanos los aminoácidos 55-70 (VLNLTHNQLRRLPAAN) de Imgenex, San Diego, CA). Para mAbs 9, 10, 12, 14 y 5 15, las variantes 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ o 15EVQ se utilizaron en este estudio.
[0144] Sobre la base de ensayos competitivos, los anticuerpos anti-TLR3 fueron asignados a cinco contenedores distintos. Contenedor A: mAbs 1, 2, 13, 14EVQ, 15EVQ, 16, 19; Contenedor B: mAbs 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 11, 12QVQ/QSV, 17, 18; Contenedor C: anticuerpo imgenex IMG-315A; Contenedor D: anticuerpos 10 TLR3.7, c1068; y Contenedor E: anticuerpo c1811.
Ejemplo 6
Mapeo de epítopos 15
[0145] Se seleccionaron los anticuerpos representativos de contenedores de epítopos distintos como se describe en el Ejemplo 5 para más mapeo de epítopos. El mapeo de epítopos se ha realizado mediante diversos enfoques, incluyendo experimentos de intercambio de segmento TLR3, mutagénesis, intercambio H/D y acoplamiento proteína-proteína in silico de (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6, Glen E. Morris ed., 20 1996).
[0146] Intercambio de segmento TLR3. Proteínas quiméricas de TLR3 ratón-humano se utilizan para localizar los dominios de unión de anticuerpos en bruto TLR3. El dominio extracelular de proteína TLR3 humana se dividió en tres segmentos (aa 1-209, aa 210-436, aa 437-708 de acuerdo con la numeración de aminoácidos basada en la 25 secuencia de aminoácidos de TLR3 humana, GenBank nº de acceso NP_003256). Proteína quimérica de MT5420 se generó mediante la sustitución de aminoácidos humanos TLR3 210-436 y 437-708 por los aminoácidos correspondientes de ratón (TLR3 de ratón, GenBank Nº de acceso NP_569054, aminoácidos 211-437 y 438-709). La quimera MT6251 se generó mediante la sustitución de aminoácidos humanos en las posiciones 437-708 de aminoácidos TLR3 de ratón (ratón TLR3, GenBank Nº de acceso NP_569054, aminoácidos 438-709). Todas las 30 construcciones se generaron en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carslbad, CA) utilizando procedimientos de clonación convencionales. Las proteínas se expresaron transitoriamente en células HEK293 como proteínas de fusión V5-His6 C-terminal, y se purificó como se describe en el Ejemplo 1.
mAb c1068. mAb c1068 unió TLR3 ECD humana con alta afinidad pero no se unió así a TLR3 murino. c1068 35 perdió su capacidad de unirse tanto a MT5420 como MT6251, lo que demuestra que el sitio de unión se encuentra dentro de los aminoácidos 437-708 de la proteína humana TLR3 WT.
mAb 12QVQ/QSV. mAb 12QVQ/QSV unió ambas quimeras, que indica que el sitio de unión para mAb 12QVQ/QSV se encuentra dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína de TLR3 humano que tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2. 40
[0147] Acoplamiento proteína-proteína in silico. La estructura cristalina de mAb 15EVQ (véase más abajo) y la estructura TLR3 humana publicada (Bell et al, J. Endotoxin Res. 12: 375-378, 2006) se minimizó la energía en CHARMm (Brooks et al, J. Computat. Chem. 4: 187-217, 1983) para su uso como los modelos de partida para el atraque. El acoplamiento de proteínas se llevó a cabo con ZDOCKpro 1.0 (Accelrys, San Diego, CA), que es 45 equivalente a ZDOCK 2,1 (Chen y Weng, Proteins 51: 397-408, 2003) con una rejilla angular de 6 grados. Residuos de sitio de glicosilación Asn N-ligado conocidos en TLR3 humana (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 y 636) (Sun et al, J. Biol Chem 281: 11144-11151, 2006) no participaron en la interfaz de complejo anticuerpo-antígeno por un término de energía en el algoritmo ZDOCK. 2000 poses iniciales eran de salida y se agruparon y las poses de conexión se refinaron y se volvieron a puntuar en RDOCK (Li et al., Proteins. 53: 693-707, 2003). Se 50 inspeccionaron visualmente los 200 poses con las puntuaciones más altas ZDOCK iniciales y 200 poses RDOCK superiores.
[0148] La cristalización del mAb 15EVQ se llevó a cabo por el método de difusión de vapor a 20°C (Benvenuti y Mangani, Nature Protocols 2: 1633-1651, 2007). La selección inicial se estableció utilizando un robot Hydra en 55 placas de 96 pocillos. Los experimentos se componen de gotitas de 0,5 µl de solución de proteína se mezcla con 0,5 µl de solución de reserva. Las gotitas se equilibraron contra 90 µl de solución de reserva. La solución de Fab en tampón Tris 20 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 50 mM se concentró a 14,3 mg/mL utilizando células Ultra-5 Amicon kDa. La detección se realizó con el Asistente I y II (Emerald BioSystems, Bainbridge Island, WA) y detección de cristalización en casa. 60
[0149] Se recogieron datos de difracción de rayos X y se procesaron utilizando el generador de rayos X de microfoco Rigaku MicroMaxTM-007HF equipado con una óptica confocal OsmicTM VariMaxTM, detector Saturno 944 CCD, y un sistema de crioenfriamiento X-StreamTM 2000 (Rigaku, Woodlands, TX). Se detectaron intensidades de difracción sobre una rotación de 270° de cristal con el tiempo de exposición de 120 s por imagen de medio grado. 65 Los datos de rayos X se procesaron con el programa D*TREK (Rigaku). La estructura se determinó por el método de
sustitución molecular usando el programa Phaser o CNX (Accelrys, San Diego, CA). Posiciones atómicas y factores de temperatura se perfeccionaron con REFMAC utilizando todos los datos en el rango de resolución de 15-2,2 Å para el mAb 15 y 50-1,9 Å para mAb 12. Moléculas de agua se añadieron en los picos de densidad de electrones (Fo-Fc) utilizando el nivel de corte de 3σ. Todos los cálculos cristalográficos se realizan con el conjunto de programas CCP4 (Collaborative Computational Project, Número 4. 1994. El conjunto CCP4: programas para la cristalografía de 5 proteínas Acta Crystallogr. D50: 760-763). Ajustes de modelo se llevaron a cabo utilizando el programa de COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr. D60: 2126-2132, 2004).
[0150] La estructura cristalina resuelta de mAb 15EVQ mostró que el sitio de combinación de anticuerpo se caracteriza por una serie de residuos de carga negativa de la cadena pesada (D52, D55, E99, D106 y D109). Por lo 10 tanto, el reconocimiento entre el mAb 15EVQ y TLR3 probablemente implicó residuos de carga positiva. Las simulaciones de acoplamiento proteína-proteína efectuadas sugirieron que dos grandes parches en TLR3 implicaron múltiples residuos de carga positiva mostraron una buena complementariedad con el anticuerpo. Los residuos en TLR3 en la interfaz de complejos simulados de anticuerpo TLR3 - anti-TLR3 eran R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 y K493. 15
[0151] Estudios de mutagénesis. Mutaciones puntuales individuales y combinadas se introdujeron en los residuos superficiales de TLR3 ECD en las regiones identificadas anteriormente para contener los epítopos de mAb 12 y mAb 15EVQ y las proteínas mutantes se ensayaron para determinar la unión del anticuerpo.
20
[0152] La secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos de TLR3 humanos 1-703 (ECD), (SEQ ID NO: 4; número de acceso GenBank NP_003256), se clonó utilizando protocolos estándar. Todos los mutantes se generaron por mutagénesis dirigida a sitio utilizando el kit Stratagene Quickchange II XL (Stratagene, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5a. Las mutaciones se verificaron mediante secuenciación de ADN. Las proteínas se expresaron bajo un promotor CMV como fusiones His-25 tag de C-terminal en células HEK293, y se purificaron como se describe en el Ejemplo 1.
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 5a. Oligonucleótidos usados para mutagenesis dirigida a sitio. Secuencias de los oligonucleótidos de sentido se muestran. Los oligonucleótidos de anti-sentido con secuencias complementarias se usaron en la reacción de mutagenesis.
Variante
Oligo SeqID NO:
R64E
5'CCTTACCCATAATCAACTCGAGAGATTACCAGCCGCCAAC 3' 136
K182E
5'CAAGAGCTTCTATTATCAAACAATGAGATTCAAGCGCTAAAAAGTGAAG 3' 137
K416E
5'CCTTACACATACTCAACCTAACCGAGAATAAAATCTCAAAAATAG 3' 138
K467E/Y468A
5'GAAATCTATCTTTCCTACAACGAGGCCCTGCAGCTGACTAGGAACTC 3' 139
R488/R489/K493E
5'GCCTTCAACGACTGATGCTCGAGGAGGTGGCCCTTGAGAATGTGGATAGCTCTCCTTC 3' 140
T472S/R473T/N474S
5'GTACCTGCAGCTGTCTACGAGCTCCTTTGCCTTGGTCCC 3' 141
N196A
5'GAAGAACTGGATATCTTTGCCGCTTCATCTTTAAAAAAATTAGAGTTG 3' 169
Q167A
5'GTCATCTACAAAATTAGGAACTGCGGTTCAGCTGGAAAATCTCC 3 ' 170
K163E
5'CTCATAATGGCTTGTCATCTACAGAATTAGGAACTCAGGTTCAGC 3' 171
K147E
5'GAAAATTAAAAATAATCCCTTTGTCAAGCAGGAGAATTTAATCACATTAGATCTGTC 3' 172
K145E
5'GAAAATTAAAAATAATCCCTTTGTCGAGCAGAAGAATTTAATCACATTAG 3' 173
V144A
5'CAGAAAATTAAAAATAATCCCTTTGCAAAGCAGAAGAATTTAATCACATTAG 3' 174
N140A
5'CCAACTCAATCCAGAAAATTAAAGCTAATCCCTTTGTCAAGCAGAAG 3' 175
D116R
5'CAATGAGCTATCTCAACTTTCTCGTAAAACCTTTGCCTTCTGCAC 3' 176
D536K
5'GTCTTGAGAAACTAGAAATTCTCAAGTTGCAGCATAACAACTTAGCAC 3' 177
D536A
5'CTTGAGAAACTAGAAATTCTCGCATTGCAGCATAACAACTTAGCAC 3' 178
K619E
5'CTAAAGTCATTGAACCTTCAGGAGAATCTCATAACATCCGTTG 3' 179
K619A
5'CTCTAAAGTCATTGAACCTTCAGGCGAATCTCATAACATCCGTTGAG 3' 180
E570R
5'CCACATCCTTAACTTGAGGTCCAACGGCTTTGACGAG 3' 181
N541A
5'GAAATTCTCGATTTGCAGCATAACGCCTTAGCACGGCTCTGGAAAC 3' 182
Q538A
5'GAGAAACTAGAAATTCTCGATTTGGCGCATAACAACTTAGCACGGC 3' 183
H539E
5'CTAGAAATTCTCGATTTGCAGGAAAACAACTTAGCACGGCTCTG 3' 184
H539A
5'CTAGAAATTCTCGATTTGCAGGCTAACAACTTAGCACGGCTCTG 3 ' 185
N517A
5'CATTCTGGATCTAAGCAACAACGCCATAGCCAACATAAATGATGAC 3 ' 186
Y465A
5'GAAAATATTTTCGAAATCTATCTTTCCGCCAACAAGTACCTGCAGCTGAC 3' 187
R488E
5'GCCTTCAACGACTGATGCTCGAAAGGGTGGCCCTTAAAAATG 3' 188
R489E
5'CTTCAACGACTGATGCTCCGAGAGGTGGCCCTTAAAAATGTGG 3' 189
K467E
5'CGAAATCTATCTTTCCTACAACGAGTACCTGCAGCTGACTAG 3' 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0153] Ensayos de unión. La actividad de unión de 12QVQ/QSV mAb y 15EVQ mAb para TLR3 humana y variantes generadas se evaluaron por ELISA. Para acelerar el proceso, los mutantes en el sitio de unión de 15EVQ mAb predicho se coexpresaron en células HEK por co-transfección de mutante TLR3 ECD que contiene una etiqueta C-terminal His con 12QVQ/QSV mAb, seguido de purificación por cromatografía de afinidad de metal. La muestra recuperada era un complejo del mutante TLR3 con mAb 12. Este enfoque fue posible debido a que los sitios de 5 unión de mAb 12QVQ/QSV y mAb 15EVQ están distantes los unos de los otros; y por lo tanto, las mutaciones puntuales en un sitio es probable que afecten el epítopo en el otro sitio. Estos complejos se utilizaron en los ensayos de unión ELISA. 5 µl por pocillo de 20 µg/mL de tipo salvaje TLR3 ECD o proteínas mutantes en PBS, se revistieron sobre una placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min y se bloquearon durante la noche en tampón MSD Blocker A (Meso Scale Discovery, 10 Gaithersburg, MD) a 4°C. El día siguiente se lavaron las placas y mAb 15EVQ marcado de MSDSulfo-etiqueta añadido a concentraciones de 500 pM a 1 pM durante 1,5 horas. Después de lavados se detectó el anticuerpo marcado con MSD Read Buffer T y se leyeron las placas utilizando un generador de imágenes SECTOR 6000. Para evaluar la actividad de unión de mAb 12QVQ/QSV para TLR3 humana y variantes, co-expresión se llevó a cabo con mAb 15EVQ y ELISA de unión se realizaron como se describe para el mAb 15EVQ, salvo que el anticuerpo de 15 detección se etiquetó mAb 12QVQ/QSV.
mAb 12QVQ/QSV: El sitio de unión de mAb 12QVQ/QSV se ubicó dentro de los aminoácidos 1-209 de la proteína de TLR3 humano, como se determinó en los estudios de intercambio de segmento. Se evaluaron los siguientes mutantes TLR3: D116R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E, y Q167A. Los mutantes de 20 tipo salvaje TLR3 y V144A mostraron una unión comparable a mAb 12QVQ/QSV (Figura 6A). El anticuerpo no se unió a mutante D116R TLR3 y había reducido significativamente la afinidad de unión para el mutante K145E. Por lo tanto, los residuos D116 y K145, que se colocan estrechamente en la superficie de TLR3 se identificaron como sitios de epítopos clave para mAb 12QVQ/QSV (Figura 7A).
25
[0154] Los dos residuos críticos del epítopo de unión a mAb 12QVQ/QSV se ubicaron cerca de la cara del sitio de unión ARNds en el segmento N-terminal del ectodominio TLR3 (Pirher, et al., Nature Struct. Y Mol. Biol., 15: 761-763, 2008). El epítopo completo contendrá otros residuos en las regiones vecinas, que no se revelaron por la realización de análisis mutacionales. Al no querer estar vinculado por ninguna teoría particular, se cree que la unión de mAb 12QVQ/QSV en su epítopo TLR3 puede interferir directa o indirectamente con ARNds vinculante sobre 30 TLR3 ectodominio, alterando de esta manera la dimerización del receptor y la activación de vías de señalización corriente abajo.
mAb 15EVQ: Se evaluaron los siguientes mutantes TLR3: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, Q538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, un doble mutante 35 K467E/Y468A, un triple mutante T472S/R473T/N474S, y un triple mutante R488E/R489E/K493E. El tipo salvaje TLR3, los mutantes R64E, K182E, K416E y el triple mutante T472S/R473T/N474S mostraron unión comparable a mAb 15EVQ (Figura 6B y Tabla 5b). El anticuerpo no se unió a mutantes TLR3 K467E, R489E, K467E/Y468A y R488E/R489E/K493E (Figura 6B y 6C). Las variantes restantes mostraron unión intermedia con el R488E teniendo el mayor efecto. Todos estos mutantes se unieron a mAb 12QVQ/QSV. Estos resultados mostraron que 40 los residuos K467 y R489 eran determinantes críticos del epítopo mAb 15EVQ. El residuo R488 también contribuyó al epítopo. Estos residuos están estrechamente yuxtapuestos en la misma superficie de TLR3 (Figura 7A). Los resultados también mostraron que los residuos Y465, Y468, N517, D536, Q538, H539, N541, E570, y K619, todos en la misma superficie que K467, R488 y R489, contribuyeron al epítopo. Esta conclusión se ve apoyada por los estudios de intercambio H/D con mAb 15EVQ. La Figura 7A muestra los sitios de epítopos de 45 unión para los mAb 12QVQ/QSV y 15EVQ (negro) y C1068 mAb (gris) superpuestos sobre la estructura de TLR3 humano. El epítopo para mAb 15EVQ cubre los residuos Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, Q538, H539, N541, E570, y K619.
[0155] Estudios de intercambio H/D. Para intercambio H/D, los procedimientos utilizados para analizar la 50 perturbación anticuerpo fueron similares a la descrita previamente (Hamuro et al., J. Biomol Techniques 14: 171-182, 2003; Horn y otros, Biochemistry 45: 8488-8498., 2006) con algunas modificaciones. ECD TLR3 recombinante (expresado a partir de células Sf9 con la etiqueta C-terminal His y purificada) se incubó en una solución de agua deuterada para momentos predeterminados que resultan en la incorporación de deuterio en los átomos de hidrógeno intercambiables. El deuterado TLR3 ECD se capturó en una columna que contiene mAb 15EVQ inmovilizado y 55 después se lavó con tampón acuoso. La proteína TLR3 ECD de intercambio se eluyó de la columna y se determinó la localización de deuterio que contiene fragmentos por digestión con la proteasa y el análisis de espectrometría de masas. Como control de referencia, muestra TLR3 ECD se procesó de manera similar excepto que se expuso a agua deuterada solamente después de la captura en la columna de anticuerpo y después se lavó y se eluyó en la misma manera que la muestra experimental. Regiones unidas al anticuerpo se infirieron a aquellos sitios 60 relativamente protegidos del cambio y por lo tanto contenían una fracción mayor de deuterio que la referencia de la muestra TLR3 ECD. Aproximadamente el 80% de la proteína podría asignarse a péptidos específicos. Mapas de perturbación de intercambio H/D de TLR3 ECD por mAb 15EVQ se muestran en la Figura 7B. Sólo el segmento de TLR3 alrededor de la parte afectada por mAb 15EVQ se muestra para mayor claridad. El resto de la proteína se extiende a los extremos de amino y carboxilo de TLR3 ECD no se vio afectado de forma apreciable. 65
[0156] Los estudios de intercambio H/D identificaron segmentos peptídicos 465YNKYLQL471, 514SNNNIANINDDML526 y 529LEKL532 de la SEQ ID NO: 2 como regiones donde el intercambio de TLR3 se alteró particularmente mediante la unión a mAb 15EVQ. Por su naturaleza, el intercambio H/D es un procedimiento de correlación lineal y por lo general no puede definir qué residuos dentro del segmento de péptido son los más afectados por la unión del anticuerpo. Sin embargo, la amplia superposición entre el intercambio H/D y los resultados mutacionales dan confianza adicional 5 que la superficie mostrada en la figura 7A es el sitio de unión para mAb 15. Este sitio de unión estaba en la misma región de la secuencia lineal de aminoácidos tal como se describe anteriormente para mAb c1068 (PCT Sol. nº WO06/060513A2), pero se encontró que se ubicaba sobre una superficie continua que no se solapaba (Figura 7A) de acuerdo con la falta de competencia cruzada entre estos anticuerpos.
10
[0157] El epítopo de unión a mAb 15EVQ era espacialmente proximal al sitio de unión ARNds en el segmento C-terminal en TLR3 (Bell et al., Proc Natl Acad Sci (EE.UU.) 103: 8792-8797, 2006; Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem, 282: 7668-7678, de 2007; Liu y otros, Science, 320: 379-381, 2008). Al no querer estar vinculado por ninguna teoría particular, se cree que la unión de mAb 15EVQ en su epítopo TLR3 causa choques estéricos con una molécula ARNds de ligando y/o la pareja de dímero, evitando la unión del ligando y la dimerización del receptor inducida por 15 ligando.
Tabla 5b.
Variante
mAb 15 Variante mAb 12
wt TLR3 ECD
+++ wt TLR3 ECD +++
R64E
+++ D116R -
K182E
+++ N140A ++
K416E
+++ V144A +++
Y465A
++ K145E +
K467E
- K147E ++
R488E
+ K163E ++
R489E
- Q167A ++
N517A
++ N196A ++
D536K
++
D536A
++
Q538A
++
H539E
++
H539A
++
N541A
++
E570R
++
K619E
++
K619A
++
K467E/Y468A
-
R488/R489/K493E
-
T472S/R473T/N474S
+++
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 7
Generación de variantes con estabilidad térmica mejorada
[0158] La ingeniería basada en la estructura se llevó a cabo para generar variantes de anticuerpos con una mayor 50 estabilidad térmica, con esfuerzos simultáneos para mantener la actividad biológica y minimizar la inmunogenicidad.
[0159] mAb 15EVQ fue seleccionado para la ingeniería. Para minimizar la inmunogenicidad, sólo se persiguieron las mutaciones germinales que se prevén que sean beneficiosas en base a consideraciones estructurales. Las secuencias de LV y VH de mAb 15EVQ (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 216, respectivamente) fueron alineadas con 55 los genes de la línea germinal humanos utilizando búsquedas BLAST. Las secuencias de la línea germinal más cercanas identificadas fueron GenBank Nº de acceso AAC09093 y X59318 para VH y LV, respectivamente. Se identificaron las siguientes diferencias entre la línea germinal VH, LV y los de las secuencias mAb 15EVQ VH y LV: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S, y Q67H; (LV) G30S, L31S, y A34N. Las diferencias en las secuencias identificadas fueron asignadas en la estructura cristalina de mAb 15EVQ, y residuos predichos para alterar interacciones de 60 interfaz fueron seleccionados para la ingeniería. En base a la estructura cristalina de anticuerpo (véase el Ejemplo 6), se identificaron residuos desestabilizantes de estructura potencial. (1) Una pequeña cavidad encerrada se identificó en el núcleo de VH cerca de V34. Esta cavidad era lo suficientemente grande para dar cabida a una cadena lateral ligeramente más grande, tal como Ile. (2) E99 de CDR3 de VH fue enterrado en la interfasa VH/LV sin una red de enlace de hidrógeno. El grupo carboxilato de carga negativa de E99 estaba en un ambiente 65 generalmente hidrófobo con contactos en su mayoría de van der Waals (VDW) a los residuos vecinos. El entierro de
un grupo de carga suele ser energéticamente desfavorable y por lo tanto tiene un efecto desestabilizador. (3) F50 de VH es una interfaz de residuos VH/LV. Su cadena lateral aromática es voluminosa y por lo tanto puede tener un impacto negativo sobre el emparejamiento. El enlace de H y redes de embalaje VDW para el Fv se calcularon y se inspeccionaron visualmente en PyMoI
(www://_pymol_org). Cavidades enterradas en los dominios VH y LV se calcularon por Caver (Petrek et al., BMC 5 bioinformatics, 7:316, 2006). Todas las cifras de gráficos moleculares se prepararon en PyMoI. Se hicieron mutaciones a los vectores de expresión que codifican los fragmentos Fab o anticuerpos humanos completos IgG4 generados como se describe en el Ejemplo 3 usando técnicas de clonación estándar utilizando Quick Change II XL Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA), Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit (USB Corporation, Cleveland, OH) o Quick Change II Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA). 10 Las reacciones se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de cada fabricante. Los clones obtenidos se secuenciaron para la verificación, y las variantes de ingeniería resultantes se denominaron mAbs 15-1-15-9. Un listado de la SEC ID Nº: para los CDR, las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas y de larga duración en las cadenas pesada y ligera para mAb 15EVQ y sus variantes modificadas se muestra en la Tabla 6. La Tabla 7 muestra los cebadores para la generación de cada variante. 15
Tabla 6.
SEQ ID NO:
Nº de Candidato:
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 LV HV IgG4 pesado Cadena ligera
15
111 112 84 109 110 113 41 216 220 156
15-1
111 114 84 109 110 113 41 124 130 156
15-2
115 112 84 109 110 113 41 125 131 156
15-3
116 112 84 109 110 113 41 126 132 156
15-4
111 117 84 109 110 113 41 127 133 156
15-5
116 118 84 109 110 113 41 128 134 156
15-6
116 112 119 109 110 113 41 129 135 156
15-7
111 112 84 120 110 113 122 42 102 157
15-8
111 112 84 121 110 113 123 42 102 158
15-9
116 118 119 109 110 113 41 159 160 156
20
25
30
35
[0160] La unión de mAb 15-1-15-9 a TLR3 se evaluó mediante inmunoensayo ELISA. TLR3 ECD humana (100 µl de 2 µg/mL TLR3-ECD) se une a una placa negra Maxisorb (eBioscience) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron y se bloquearon, y los anticuerpos diluidos se dividieron en alícuotas en 50 µl por pocillo en duplicado sobre los pocillos. La placa se incubó a TA durante 2 horas agitando suavemente. La unión se detectó usando sustrato de luminiscencia POD (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, Cat nº 11 582 950 001) y Fc anti-humano de 40 cabra: HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat nº 109-035- 098) y la placa se leyó en un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
45
50
55
60
65
Nº de candidato
Mutantes Cebadores Seq ID NO: Nº de pálsmido resultante Nº de oalsmido de plantilla de mutagenesis
15-1
HC: F50R GCCTGGAGTGGATGGGCCGGATCGACCCCAGCG 142 5042 p4595
CGCTGGGGTCGATCCGGCCCATCCACTCCAGGC
143
15-2
HC: V341 AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 144 5046 p4584
GCATCTGGCGCACCCAGCCGATCCAGTAGTTGGTGAAG
145
15-3
HC: V341/G35S AGAGAATAACGCCCGTTGCGG 146 5045 p4584
GCATCTGGCGCACCCAGCCGATCCAGTAGTTGGTGAAG
147
15-4
HC: A61S/Q67H AGAGAATAACGCCCGTTGCGG 144 5048 p4584
CGCTGATGGTCACGTGGCCCTGGAAGCTAGGGCTGTAGTTGGTTGTAG
148
15-5
HC: F50R/V34I/G35S/A61S/Q67H CTTCACCAACTACTGGATCAGCTGGGTGCGCCAGATGC 149 5069 p5042
CGCTGATGGTCACGRGGCCCTGGAAGCTAGGGCTGTAGTTGGTGTAG
148
15-6
HC: V34I/G35S/E99Q CGCCATGTACTACTGCGCCCGCCAGCTGTACCAGGGCTAC 150 5070 p5045
GTAGCCCTGGTACAGCTGGCGGGCGCAGTAGTACATGGCG
151
15-7
LC: G30S/L31S GCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGC 152 5043 p5045
GCTGGTACCAGGCCAGGTAGCTGCTGATGCTCTGGCTGGC
153
15-8
LC: A34N AGAGGTAACTCCCGTTGCGG 144 5043 p4595
CGGGCTTCTGCTGGTACCAGTTCAGGTAGCTGCTGCTGATG
154
15-9
HC: F50R/V34I/G35S/A61S/!67H/E99Q CGCCATGTACTACTGCGCCCGCCAGCTGTACCAGGGCTAC 150 5047 p4588
GTAGCCCTGGTACAGCTGGCGGGCGCAGTAGTACATGGCG
151
*p5069 como un único gen para cadena pesada. Región variable de p5069 intercambiado a columna p5070
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0161] Los experimentos DSC se realizaron en un sistema DSC VP-capilar MicroCal auto (MicroCal, LLC, Northampton, MA) a cuya temperatura diferencias entre la referencia y células de muestra se midieron 5 continuamente y se calibra para unidades de potencia. Las muestras se calentaron desde 10°C a 95°C a una velocidad de calentamiento de 60°C/hora. El tiempo de pre-scan era de 15 minutos y el periodo de filtrado era de 10 segundos. La concentración utilizada en los experimentos de DSC era de aproximadamente 0,5 mg/mL. El análisis de los termogramas resultantes se realizó utilizando el software MicroCal Origen 7 (MicroCal, LLC).
10
[0162] La estabilidad térmica (Tm) de las variantes generadas se midió por DSC (Tabla 8). La unión de las variantes de anticuerpos a TLR3 era comparable a la del anticuerpo parental.
Tabla 8. Resumen de las temperaturas de fusión (TM) de las variantes y razón para hacerlas.
Nº de candidato:
Mutaciones Justificación TM (°C) TM (°C)
15EVQ
WT 64,7 0
15-1
HV F50R Interfaz VH/LV 69,3 4,6
15-2
HV V34I Embalaje de núcleo VH 66,9 2,2
15-3
HV V34I/G35S Enlace de H, embalaje de núcleo VH 71,2 6,5
15-4
HV A61S/Q67H Embalaje de VH/LV, distribución de carga superficial VH 65,4 0,7
15-5
HV F50R/V34I/G35S/ A61S/Q67H Interfaz VH/LV, enlace de H, embalaje de núcleo VH, embalaje VH/LV, distribución de carga superficial VH 76,2 11,5
15-6
HV V34I/G34S/E99Q H-enlace, embalaje de núcleo VH, eliminación de carga enterrada 75 10,3
15-7
LV G30S/L31S Residuos polares de superficie L-CDR1 63,1 -1,6
15-8
LV A34N Interfaz LV/VH 64 -0,7
15-9
HV F50R/V34I/G35S/ A61S/Q67H/E99Q Interfaz VH/LV, enlace de H, embalaje de núcleo VH, embalaje VH/LV, distribución de carga superficial VH, eliminación de carga enterrada 76 11,3
15
20
25
30
35
Ejemplo 8
Generación de un anticuerpo anti-TLR3 sustituto
40
[0163] Un anticuerpo TLR3 anti-ratón rata/ratón antagonista quimérico, denominado en el presente documento mAb 5429 se generó para evaluar los efectos de la inhibición de la señalización TLR3 en varios modelos in vivo, al no tener los anticuerpos humanizados generados en el Ejemplo 1 especificidad suficiente o actividad antagonista para el ratón TLR3. El mAb 5429 quimérico sustituto, así como su señalización TLR3 de ratón inhibido c1811 de anticuerpo TLR3 anti-ratón de rata padre in vitro, y en vivo, y mecanismos patogénicos mejorados en varios modelos 45 de enfermedad en el ratón.
[0164] Los datos discutidos a continuación sugieren un papel para TLR3 en la inducción y perpetuación de la inflamación perjudicial, y contribuyen a la justificación para el uso terapéutico de los antagonistas de TLR3 y antagonistas de anticuerpos TLR3, por ejemplo afecciones inflamatorias agudas y crónicas incluyendo 50 hipercitoquinemia, el asma e inflamación de vías respiratorias, enfermedades inflamatorias del intestino y la artritis reumatoide, infecciones virales, y la diabetes de tipo II.
Generación del mAb 5429 sustituto
55
[0165] Ratas EC fueron inmunizadas con murina recombinante TLR3 ectodominio (aminoácidos 1-703 de la seq ID NO: 162, GenBank Nº de acceso NP_569054) generados usando métodos de rutina. Los linfocitos de dos ratas que demuestran títulos de anticuerpos específicos a murino TLR3 se fusionaron con células de mieloma FO. Se identificó un panel de anticuerpos monoclonales reactivos a murino TLR3 y se examinaron para actividad antagonista in vitro en el indicador de luciferasa murina y ensayos de fibroblastos embrionarios murinos. La línea de hibridoma C1811A 60 se seleccionó para el trabajo posterior. Genes de región variable funcionales fueron secuenciados de mAb c1811 secretada por el hibridoma. La cadena pesada clonada y la cadena ligera variable de genes de la región, respectivamente, se insertaron entonces en vectores de expresión de plásmidos que proporcionaron secuencias de codificación para la generación de una rata/Balb C muIgG1/κ mAb quimérico designado como mAb 5429 utilizando métodos de rutina. Los anticuerpos se expresaron como se ha descrito en el Ejemplo 3. Las secuencias de 65 aminoácidos de regiones variables mAb 5429 de cadena pesada y ligera se muestran en SEQ ID NO: 164 y SEQ ID
NO: 163, respectivamente, y secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa se muestran en SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 165, respectivamente. Las secuencias de longitud de cadena pesada y ligera completas de mAb c1811 se muestran en la SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 167, respectivamente.
Caracterización de mAb 5429 5
[0166] mAb 5429 se caracterizó en un panel de ensayos in vitro por su capacidad de neutralización de la señalización TLR3. Los ensayos de actividad y los resultados se describen a continuación.
Ensayo de gen reportero murino de luciferasa 10
[0167] El ADNc TLR3 murino (SEQ ID NO: 161, GenBank Nº de acceso: NM_126166) se amplificó por PCR a partir de ADNc murino de bazo (BD Biosciences, Bedford, MA), y se clonó en el vector pCEP4 (Life Technologies, Carslbad, CA) utilizando métodos estándar. 200 µl células HEK293T se sembraron en placas de fondo claro blancos de 96 pocillos a una concentración de 4 x 104 células/pocillo en DMEM completo, y se utilizaron al día siguiente para 15 transfecciones utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) usando 30 ng pNF-κB luciferasa de luciérnaga (Stratagene, San Diego, CA) o luciferasa de luciérnaga de 30 ng pISRE (BD Biosciences, Bedford, MA), plásmidos de reportero de luciferasa de renilla de 5 ng de control phRL-TK (Promega Corp., Madison, WI), 1,5 ng pCEP4 que codifica TLR3 murino de longitud completa, y vector pcDNA3.1 vacío 13,5 ng (Life Technologies, Carslbad, CA) para llevar la cantidad de ADN total a 50 ng/pocillo. 24 horas después de la transfección, las células 20 se incubaron durante 30 minutos a 1 hora a 37°C con los anticuerpos TLR3 anti-murinos en DMEM libre de suero fresco antes de la adición de 0,1 o 1 µg/µl de poli(I:C). Las placas se recogieron después de 24 horas usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega, Madison, WI). Las unidades ligeras relativas se midieron utilizando un lector de multi-detección FLUOstar OPTIMA con software OPTIMA (BMG Labtech GmbH, Alemania). Los valores normalizados (relación de luciferasa) se obtuvieron dividiendo las unidades ligeras relativas (luciérnaga) 25 (RLU) por las RLU de renilla. mAb 5429, así como su c1811 mAb matriz y mAb 15 (Tabla 3a) redujo poli(I:C) - NF-kB inducida y la activación ISRE de una manera dependiente de la dosis (Figura 8A y 8B), demostrando su capacidad para antagonizar la actividad de TLR3. CI50 medidos en el ensayo de ISRE eran 0,5, 22, y 0,7 µg/ml para mAb 5249, mAb 15 y mAb c1811, respectivamente.
30
Ensayo de fibroblastos murino embrionario (MEF)
[0168] Las células C57BL/6 MEF se obtuvieron de Artis Optimus (Opti-MEFTM C57BL/6 - 0001). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano (BD Falcon) a 20.000 células/pocillo en medios 200 µl MEF (DMEM con glutamax, 10% inactivado por calor-FBS, 1x NEAA, y 10 µg/mL de gentamicina). Todas las incubaciones 35 se realizaron a 37°C/5% de CO2. 24 horas después de la siembra, el mAb 5429 o c1811 mAb se añadieron a los pozos. Las placas se incubaron con mAb durante 1 hora, después de lo cual se añadió Poli(I:C) a 1 µg/mL en cada pocillo. Los sobrenadantes se recogieron después de una incubación de 24 horas. Los niveles de citocinas se determinaron utilizando un kit de talón (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) para detectar CXCL10/IP-10 siguiendo el protocolo del fabricante. Los resultados se representan gráficamente usando GraphPad Prism Software. Ambos 40 anticuerpos redujeron niveles CXCL10/IP-10 poli(I:C)-inducidos en una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra la capacidad de estos anticuerpos para antagonizar endógeno TLR3 e inhiben señalización de TLR3 (Figura 9).
Tinción de superficie de flujo de citometría 45
[0169] C57BL/6 y knockout TLR3 (TLR3KO)(fondo C57BL/6; femenino, 8-12 semanas de edad, Ace Animals, Inc.), 10 por grupo, se dosificaron por vía intraperitoneal con 1 mL de 3% medio de tioglicolato (Sigma) y 96 horas más tarde, los ratones fueron sacrificados y el peritoneo de cada ratón se lavaron con 10 ml de PBS estéril. Macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato se resuspendieron en PBS y la viabilidad celular se evaluó mediante tinción 50 con azul de tripano. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 250 µl de tampón FACS (PBS -Ca2+ Mg2+, 1% de FBS inactivado por calor, 0,09% de azida de sodio) y se mantuvieron en hielo húmedo. El reactivo CD16/32 (eBioscience) se utilizó a 10 µg/106 células durante 10 minutos para bloquear los receptores de la Fc de los macrófagos. Las células se distribuyeron en 106 células en 100 µl/pocillo para la tinción de la superficie. Alexa-Fluor 647 (Molecular Probes)-conjugado con mAb c1811 y mAb 1679 (anticuerpo TLR3 anti-ratón de rata que 55 no tenía especificidad TLR3, y por lo tanto utilizado como un control de isotipo) se añadieron a 0,25 µg/106 células y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron en 250 µl de tampón FACS. La tinción de viabilidad, 7-AAD (BD Biosciences, Bedford, MA), se añadió a 5 µl/pocillo no más de 30 minutos antes de la adquisición de muestras en FACS Calibur para detectar una población de células muertas. Las muestras fueron recolectadas por el FACS Calibur utilizando la célula de Quest Pro Software. FCS Express se utilizó 60 para analizar los datos recogidos por la formación de histogramas.
[0170] La unión de mAb c1811 a macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato murinos de ratones C57BL/6 y TLR3KO se evaluaron por citometría de flujo para determinar la especificidad de unión. mAb 5429 no se utilizó en este ensayo ya que se esperaba que la región Fc de ratón de este anticuerpo quimérico contribuía a la unión no 65 específica. mAb c1811 no mostró unión a macrófagos TLR3KO, y unión incrementada a las superficies celulares de
macrófagos peritoneales C57BL/6, lo que sugiere una especificidad del mAb para TLR3 (Figura 10). mAb 5429, teniendo las mismas regiones de unión como mAb c1811, se supone que tiene la misma especificidad de unión como mAb c1811.
Ejemplo 9 5
Antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen frente a la inflamación sistémica mediada por TLR3
Modelo
10
[0171] El modelo de citoquinas/quimioquinas sistémico inducido por poli(I:C) se utilizó como modelo de inflamación sistémica mediada por TLR3. En este modelo, poli(I:C) (PIC) administrado por vía intraperitoneal indujo una respuesta de citoquinas y quimioquinas sistémica que fue parcialmente mediada TLR3.
[0172] Ratones hembras C57BL/6 (8-10 semanas de edad) o ratones hembra TLR3KO (C57BL/6 de fondo; 8-10 15 semanas de edad, Ace Animals, Inc.) se dieron mAb 5429 a 10, 20 o 50 mg/kg en 0,5 ml de PBS, mAb c1811 a 2, 10 o 20 mg/kg en 0,5 ml de PBS o 0,5 ml de PBS solo (control de vehículo) por vía subcutánea. 24 horas después de la dosificación del anticuerpo, se administraron a los ratones 50 µg de poli(I:C)(Amersham Cat nº 26-4732 Lote nº IH0156) en 0,1 mL de PBS por vía intraperitoneal. Se recogió sangre retro-orbital de 1 y 4 horas después del desafío poli(I:C). Se preparó el suero de la sangre total y se analizó para concentraciones de citoquinas y quimioquinas por 20 Luminex.
Resultados
[0173] Poli(I:C) administrado por vía intraperitoneal indujo una respuesta de citoquinas y quimioquinas sistémica que 25 fue parcialmente mediada por TLR3, como se demostró por la producción significativamente reducida de un panel de quimioquinas y citoquinas en los animales TLR3KO (Tabla 9A). Los mediadores inducidos por poli(I:C) dependientes de TLR3 eran IL-6, KC, CCL2/MCP-1 y TNF-α en 1 hora desafío post-poli(I:C), e IL-1α, CCL5/RANTES y TNF-α a las 4 horas después del desafío poli:(I:C). Ambos mAb c1811 y mAb 5429 redujeron significativamente los niveles de estos mediadores dependientes de TLR3, demostrando la capacidad de los anticuerpos para reducir la señalización 30 de TLR3 in vivo (Tabla 9B). Los valores en la Tabla 9 se muestran como concentraciones medias de citoquinas o quimioquinas en pg/ml de seis animales/grupo +SEM. Estos datos sugieren que antagonismo TLR3 puede ser beneficioso en la reducción del exceso de los niveles de citoquinas y quimioquinas mediados por TLR3 en condiciones tales como la tormenta de citoquinas o de descarga eléctrica mortal.
35
Tabla 9A.
C57BL/6 TLR3KO
PIC
- + - +
mAb 5429 (mg/kg)
- - - -
mAb c1811 (mg/kg)
- - - -
Desafío 1 h PIC
TNF
6,005 + 0,32 319,4 + 34,1 * 9,13 + 4,41 43,80 + 10,13**
KC
129,3 + 9,83 2357 + 491,5* 152,0 + 21,34 432,3 + 90,66**
IL-6
40,91 + 5,66 5317 + 856,7* 120,1 + 99,99 1214 + 294,9**
MCP-1
84,67 + 18,45 694,6 + 127,8* 67,85 + 34,16 249,9 + 55,60**
Desafío 4 h PIC
IL-1
28,21 + 17,78 796,7 + 45,0* 13,94 + 13,84 408,5 + 29,91**
RANTES
20,87 + 1,738 4511 + 783,4* 36,01 + 4,484 706,3 + 84,36**
TNF
0,10 + 0 561,7 + 81,84* 3,215 + 3,115 305,8 + 53,63**
*p<0.001: ANOVA unidireccional a C57BL/6 PBS **p<0.001 ANOVA unidireccional a C57BL/6 PIC
40
45
50
55
60
65
Tabla 9B.
C57BL/6
PIC
+ + + + + +
mAb 5429 (mg/kg)
50 20 10 - - -
mAb c1811 (mg/kg)
- - - 20 10 2
Desafío 1 h PIC
TNF-
29,33 6 3,78*** 31,05 61,59*** 59,55 6 12,71 "’ 32,54 6 3,89*** 42,22 6 7,04*** 42,61 6 10,58***
KC
466,3 6 92,35*** 440,3 6 10,01*** 744,6 6 103,1** 637,3 6 151,0*** 944,2 6 130,9** 919,36 231,2**
IL-6
480,2 6 62,88*** 375,9 6 46,14*** 705,2 6 149,8*** 739,2 6 113,3*** 1047 6 222*** 1229 6 378,4***
MCP-1
168,5 6 15,04** 321,6 6 206,7 219,2 6 70,58* 184,0 6 14,92** 278,3 6 53,57 414,9 6 97,17
Desafío 4 h PIC
IL-1
343,0 6 33,01*** 452,6 6 94,86** 481,1 6 121,0* 354,8 6 45,43*** 351,7 6 68,85*** 352,4 6 39,60***
RANTES
1381 6 169,7*** 2439 6 308,7** 1601 6 398,9*** 1303 168,0*** 1365 6 474,1*** 2209 6 402,5**
TNF-
100,1 6 8,5*** 205,1 6 41,85*** 226,1 6 64,72*** 138,9 6 26,0*** 121,6 6 38,85*** 223,8 6 47,74***
***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05: Estadísticas ANOVA unidireccionales se compararon a C57BL/6 + grupo PIC
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 10
Los antagonistas de anticuerpos TLR3 reducen la hiperreactividad de vías respiratorias
Modelo 35
[0174] Hiperreactividad de las vías respiratorias se indujo por Poli(I:C).
[0175] Ratones hembra C57BL/6 (12 semanas de edad) o ratones hembra TLR3KO (C57BL/6 de fondo; 12 semanas de edad, Ace Animals, Inc.) fueron anestesiados con isoflurano y varias dosis (10-100 µg) de poli(I:C) en 40 50 µl de PBS estéril se administraron por vía intranasal. Los ratones recibieron tres administraciones de poli(I:C)(PBS) o con un período de descanso de 24 horas entre cada administración. 24 horas después de la última administración de poli(I:C) (o PBS), la función pulmonar y hiperreactividad de las vías respiratorias a la metacolina se midieron usando pletismografía de cuerpo entero (sistema BUXCO). Los ratones fueron colocados en la cámara de pletismógrafo y se dejaron aclimatar durante al menos 5 minutos. Después de las lecturas de línea de base, los 45 ratones fueron expuestos a dosis crecientes de metacolina nebulizada (Sigma, St. Louis, MO). La metacolina nebulizada se administró durante 2 minutos, seguido de un período de recogida de datos de 5 minutos, seguido de un período de descanso de 10 minutos antes de desafíos de metacolina de dosis crecientes posteriores. El aumento de la resistencia del flujo de aire se midió como Pausa Mejorada (Penh) y se representó como el valor medio Penh durante el periodo de grabación de 5 minutos (sistema BUXCO). Después de las mediciones de la función pulmonar, 50 los ratones fueron sacrificados y se introdujeron cánulas en los pulmones. Lavados broncoalveolares (BAL) se llevaron a cabo mediante la inyección de 1 ml de PBS en los pulmones y recuperación del efluente. Los tejidos pulmonares se eliminaron y se congelaron. Fluidos BAL se centrifugaron (1200 rpm, 10 min.) y se recogieron y se almacenaron a -80°C hasta el análisis de los sobrenadantes libres de células. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 200 µl de PBS para el recuento total y diferencial de células. El ensayo múltiple se realizó siguiendo 55 el protocolo del fabricante y el Kit de Inmunoensayo Multiplex (Millipore, Billercia, MA).
Resultados
[0176] Observaciones anteriores demostraron que la administración intranasal de poli(I:C) indujo un deterioro 60 mediado por TLR3 de la función pulmonar en ratones con aumento de la pausa mejorada (PenH) de medición en toda la pletismografía (Buxco) al inicio del estudio y una mayor capacidad de respuesta a metacolina en aerosol (un indicador de la hiperreactividad de vía aérea) (PCT Sol. Nº WO06/060513A2). Este deterioro en la función pulmonar se asoció con el reclutamiento de neutrófilos en el pulmón, y los niveles de citocinas pro-inflamatorias/quimiocinas se aumentaron en el pulmón. En este estudio, el efecto de mAb 1811 y el mAb 5429 se evaluó en poli(I:C) inducido por 65 el deterioro de la función pulmonar mediante la administración de cada anticuerpo a 50 mg/kg por vía subcutánea
antes de desafío poli(I:C).
[0177] Deterioro mediado por TLR3 de la función pulmonar se redujo significativamente por el tratamiento de los animales con antagonistas de anticuerpos TLR3 anteriores al desafío poli(I:C). Aumentos mediados por TLR3 en la línea de base PenH y sensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina se impidieron en los animales tratados 5 con anticuerpo anti-TLR3 (Figura 11). Además, el reclutamiento TLR3 mediado por neutrófilos en el pulmón de ratón y la generación de quimiocinas en las vías aéreas se redujeron en animales tratados por anticuerpo de anti-TLR3. Los números de neutrófilos (Figura 12) y los niveles de CXCL10/IP-10 (Figura 13) se midieron a partir del fluido de lavado broncoalveolar recogido (BALF). Los estudios se repitieron al menos tres veces con resultados similares. Los datos mostrados en las Figuras 11, 12 y 13 son de un estudio representativo. Cada símbolo representa un punto de 10 datos de un ratón, y las barras horizontales representan medias de los grupos. El estudio demostró que los antagonistas de anticuerpos TLR3 administrados sistémicamente alcanzaron el pulmón, deterioro mediado por TLR3 reducido de la función pulmonar, la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, la generación de quimioquinas y la inflamación de las vías respiratorias en el modelo utilizado. Por lo tanto, los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos en el tratamiento o prevención de las enfermedades respiratorias caracterizadas por la hiperreactividad 15 de vías aéreas, tales como asma, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística.
Ejemplo 11
20
Antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen frente a la enfermedad intestinal inflamatoria
Modelo
[0178] El modelo de colitis DSS se utilizó como un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. 25
[0179] Ratones hembra C57BL/6 (<8 semanas de edad) o ratones hembra TLR3KO (C57BL/6 de fondo; <8 semanas de edad con un peso entre 16,5 g y 18 g, Ace Animals, Inc.) se alimentaron con alimentos irradiados gamma en el día -1. DSS (sulfato de dextrano) (MP Biomedicals, Aurora, OH, nº de catálogo: 160110; 35-50kDa; 18-20% de azufre, Lote nº 8247J.) Se diluyó en agua potable acidificada en autoclave a una concentración final de 5%. 30 El agua DSS se administró durante 5 días, después de lo cual se sustituyó con agua corriente. A los ratones se les permitió beber agua ad libitum durante todo el estudio. Todas las botellas de agua se pesaron todos los días para registrar el consumo de agua. En los días 0, 2 y 4 ratones se dosificaron por vía intraperitoneal con 5 mg/kg (0,1 mg en 0,1 mL PBS) mAb 5429, anticuerpo TNF-α anti-ratón, o PBS como control. Los ratones fueron controlados diariamente durante todo el estudio y se pesaron en los días 0 a 4 y día 7. Los ratones se sacrificaron en los días 2 y 35 7 del estudio. Las cavidades abdominales se abrieron y los colones ascendentes se cortaron donde se unen al intestino ciego. Los colones se recogieron y se fijaron en 10% de formalina tamponada neutral. Los colones fueron embebidos en parafina, seccionados y teñidos con H&E (Qualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA). Evaluaciones histopatológicas del colon se realizaron de forma ciega por un patólogo veterinario como se describe a continuación (PathoMetrix, San Jose, CA). 40
Evaluación histopatológica
[0180] Se evaluaron dos segmentos de intestino grueso, colon y recto y se obtuvieron los siguientes cambios: (i) necrosis de células individuales; (ii) ulceración epitelial; (iii) descamación epitelial; (iv) absceso cryptal; (v) 45 proliferación celular; (vi) proliferación de células criptales; (vii) formación de tejido de granulación en la lámina propia; (viii) tejido de granulación en la submucosa; (ix) infiltrado de células inflamatorias de la submucosa, neutrófilos predominantes; y (x) edema submucoso.
[0181] Una puntuación individual, global de la severidad se administró en base a las siguientes normas: 50
0 - inexistente
1 - leve, focal o encontrado ocasionalmente
2 - leve, multifocal
3 - moderado, encontrado frecuentemente, pero en áreas limitadas 55
4 - severo, frecuente en muchas áreas o extensiones
del tejido presentado
5 - muy severo, se extiende a grandes porciones del tejido 60
presentado
Resultados
65
[0182] Observaciones anteriores demostraron que los animales TLR3KO mostraron una histopatología
significativamente reducida en comparación con ratones de tipo salvaje en un modelo de enfermedad intestinal inflamatoria inducida por la ingestión DSS (PCT Sol. Nº WO06/60513A2), lo que sugiere que la señalización de TLR3 juega un papel en la patogénesis en este modelo. Se ha informado de que el ARN bacteriano comensal o ARN de mamífero liberado de las células necróticas pueden actuar como ligandos endógenos para estimular la señalización de TLR3 (Kariko et al., Immunity 23.165-231.175 2005; Kariko et al., J. Biol Chem 279: 12.542-12.550 5 2.004), y por lo tanto la estimulación TLR3 por ligandos endógenos en el intestino pueden aumentar y perpetuar la inflamación en el modelo de colitis DSS.
[0183] La gravedad de la enfermedad se ha mejorado en los animales expuestos al DSS tras el tratamiento con anticuerpos anti-TLR3, como se evaluó por las puntuaciones de histopatología de compuesto (Figura 14). La figura 10 14 muestra las medias, desviaciones estándar y los intervalos de confianza del 95% para las puntuaciones de gravedad de enfermedad como barras horizontales. Se observó una reducción significativa en las puntuaciones en los animales expuestos al DSS de tipo salvaje tratados con anticuerpos anti-TLR3 (p <0,05) en comparación con los animales de tipo salvaje no tratados. Animales TLR3KO DSS expuestos fueron protegidos de cambios inducidos por DSS. Animales expuestos a DSS que reciben TNF-α mAb anti-ratón no mostraron ninguna mejora en la 15 histopatología en el modelo de DSS. Por lo tanto, el modelo de DSS puede ser útil en la evaluación de agentes terapéuticos que pueden dirigirse a la población de pacientes humanos que no respone a terapias anti-TNF-α, y neutralizando anticuerpos anti-TLR3 pueden tener el potencial para proporcionar un beneficio a los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal que no responden a las terapias anti-TNF-α.
20
Modelo
[0184] El modelo de transferencia de células T se utilizó como un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. En este modelo, la inflamación del intestino se indujo en ratones SCID por la transferencia de una población de células T naive desprovistas por células T reguladoras de ratones inmunocompetentes, los cuales atacan células que 25 presentan antígeno en la mucosa intestinal.
[0185] Las células T naive (CD4+CD45RBalto células T) se inyectaron por vía intraperitoneal a los destinatarios SCID para inducir la colitis crónica. Los ratones recibieron o bien PBS (500 µl/ratón por vía intraperitoneal; control de vehículo), mAb 5429 (0,1 mg/ratón por vía intraperitoneal), o anticuerpo anti-TNF-α (0,05 mg/ratón por vía 30 intraperitoneal; control positivo) a partir de 48 horas tras transferencia de las células T y después dos veces por semana durante el estudio de 8 semanas. A las 8 semanas después de la transferencia de células T (o cuando los ratones perdieron >15% de su peso corporal original) animales se sometieron y colones se removieron. Los colones se fijaron, embebidos en parafina y teñidos con H&E. Histopatología (infiltración celular, abscesos de las criptas, erosión epitelial, pérdida de células caliciformes, y engrosamiento de la pared intestinal) se evaluó cuantitativamente 35 de manera ciega.
Resultados
[0186] La gravedad de la enfermedad se ha mejorado en animales que recibieron la transferencia de células T tras 40 el tratamiento con anticuerpos anti-TLR3, según la evaluación de la reducción significativa en la suma de las puntuaciones de la histopatología en comparación con los animales de control (p <0,05) (Figura 15A). A la suma de las puntuaciones, abscesos en las criptas, ulceración, afluencia de neutrófilos, pérdida de células caliciformes, criptas anormales, inflamación de la lámina propia y la afectación transmural se evaluó. La reducción significativa se observó con abscesos de las criptas, ulceración y la afluencia de neutrófilos (para todos p <0,05) (Figura 15B). 45 Anticuerpo Anti-TNF-α se utilizó como control positivo a dosis conocidas para proporcionar un beneficio óptimo.
[0187] Los estudios que utilizan dos modelos bien conocidos de enfermedades inflamatorias del intestino, el DSS y el modelo de transferencia de células T, demostraron que antagonistas de anticuerpo TLR3 sistémicamente emitidos llegaron a la mucosa intestinal e inflamación del tracto gastrointestinal reducido inducida a través de dos 50 mecanismos patogénicos diferentes. Por lo tanto, los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo casos refractorios anti-TNF-α, y otras patologías inmunes en el tracto gastrointestinal.
Ejemplo 12 55
Antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen frente a la artritis inducida por colágeno
Modelo
60
[0188] El modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) se utilizó como un modelo de la artritis reumatoide.
[0189] Ratones macho B10RIII (6-8 semanas de edad, Jackson Labs) se dividieron en grupos de 15 por grupo (grupos artritis) o 4 por grupo (ratones de control). Grupos de la artritis fueron anestesiados con isoflurano y se les administró inyecciones de colágeno de tipo II (productos de elastina) y el adyuvante completo de Freund 65 suplementado con M. tuberculosis (Difco) en los días 0 y 15. El día 12, los ratones con el desarrollo de artritis de tipo
II de colágeno fueron asignados aleatoriamente por el peso corporal en grupos de tratamiento y se dosificaron por vía subcutánea (SC) en los días 12, 17 y 22 (d12, d17, 2d2) con mAb 5429 (25 mg/kg), anticuerpo de control negativo CVAM (un recombinante mAb de ninguna especificidad conocida en el ratón) (5 mg/kg) o anticuerpo anti-TNF-α (5 mg/kg, control positivo). Además, los grupos de control de ratones se trataron con vehículo (PBS) o dexametasona (0,5 mg/kg, Dex, compuesto de referencia) por vía subcutánea (SC) al día (QD) en los días 12-25. 5 Los animales fueron observados diariamente de 12 días a través de 26. Patas delanteras y traseras se evaluaron por un sistema de puntuación clínica (que se muestra a continuación). Los animales fueron sacrificados en el día de estudio 26 y la histopatología se evaluó de una manera ciega (sistema de puntuación descrito a continuación). Evaluación de la eficacia se basó en el peso corporal de los animales, y las puntuaciones de artritis clínica. Todos los animales sobrevivieron hasta la terminación del estudio. 10
Criterios de puntuación clínica para las patas delanteras y traseras
[0190]
15
0 - normal
1 - articulación de las patas delanteras y traseras afectada o eritema difuso mínimo e hinchazón
2 - articulación de las patas delanteras y traseras afectada o eritema difuso leve e hinchazón
3 - articulación de las patas delanteras y traseras afectada o eritema difuso moderado e hinchazón
4 - eritema difuso marcado e hinchazón, o = 4 articulaciones de dígitos afectadas) 20
5 - eritema difuso severo e hinchazón severo de toda la pata, no pudiendo flexionar los dígitos)
Métodos de puntuación histopatológicos de las articulaciones de ratones con artritis de colágeno de tipo II
[0191] Cuando se consideraron las patas o los tobillos de los ratones con lesiones de artritis de colágeno de tipo II, 25 la gravedad de los cambios, así como un número de articulaciones individuales afectadas. Cuando sólo se afectaron 1-3 articulaciones de las patas o tobillos fuera de la posibilidad de numerosas articulaciones de metacarpianas/metatarsianas/de dígito o tarsianas/tibiotarsales, una asignación arbitraria de una puntuación máxima de 1, 2 o 3 para los parámetros a continuación se determinó en función de gravedad de los cambios. Si se implicaron más de 2 articulaciones, los siguientes criterios se aplicaron a las articulaciones más afectadas/la mayoría 30 de las articulaciones.
[0192] Los datos clínicos para las puntuaciones de pata se analizaron mediante el AUC para los días 1-15, y se calculó el % de inhibición de los controles.
35
Inflamación
[0193]
0 - normal 40
1 - infiltración mínima de células inflamatorias en la membrana sinovial y tejido periarticular de las articulaciones afectadas
2 - infiltración leve, si patas, restringidas a las articulaciones afectadas
3 - infiltración moderada con edema moderado, si patas, restringidas a las articulaciones afectadas
4 - infiltración marcada que afecta la mayoría de las áreas con edema marcado 45
5 - infiltración difusa grave con edema severo
Pannus
[0194] 50
0 - normal
1 - infiltración mínima de pannus en el cartílago y el hueso subcondral
2 - infiltración leve con la destrucción de la zona marginal del tejido duro en las articulaciones afectadas
3 - infiltración moderada con la destrucción de los tejidos duros moderados en las articulaciones afectadas 55
4 - infiltración marcada con la destrucción marcada de la arquitectura conjunta, la mayoría de las articulaciones
5 - infiltración severa asociada con la destrucción total o casi total de la arquitectura conjunta, afecta a todas las juntas
Daño del cartílago 60
[0195]
0 - normal
1 - mínimo a la pérdida leve de tinción azul de toluidina sin pérdida obvia de condrocitos o interrupción de 65 colágeno en las articulaciones afectadas
2 - pérdida leve de tinción azul de toluidina con pérdida focal leve (superficial) de los condrocitos y/o interrupción de colágeno en las articulaciones afectadas
3 - pérdida moderada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocitos multifocales moderados (profundidad a la zona media) y/o interrupción de colágeno en las articulaciones afectadas
4 - pérdida marcada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocitos multifocales marcados (profundidad a 5 la zona profunda) y/o interrupción de colágeno en la mayoría de las articulaciones
5 - pérdida difusa severa de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocitos multifocales severos (profundidad a la marca de marea) y/o interrupción de colágeno en todas las articulaciones
Resorción ósea 10
[0196]
0 - Normal
1 - mínimo con pequeñas áreas de resorción, puede no resultar evidente a baja magnificación, osteoclastos raros 15 en las articulaciones afectadas
2 - suaves con más ámbitos numerosos, puede no resultar evidente a baja magnificación, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas
3 - moderados con reabsorción evidente de trabecular medular y hueso cortical sin defectos de espesor total en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión aparente en la ampliación baja, osteoclastos más 20 numerosos en las articulaciones afectadas
4 - marcado con defectos de espesor total en el hueso cortical, a menudo con una distorsión del perfil de superficie cortical restante, pérdida de hueso medular, numerosos osteoclastos marcados, afecta a la mayoría de las articulaciones
5 - graves con defectos de espesor total en el hueso cortical y destrucción de la arquitectura conjunta de todas 25 las articulaciones
Resultados
[0197] Dexametasona (Dex) y anticuerpo TNF-α anti-ratón se utilizó como control positivo, PBS se utilizó como 30 control del vehículo, y CVAM se utilizó como un anticuerpo de control negativo. Todos los tratamientos se iniciaron el día 12 del estudio, durante el desarrollo de enfermedad de las articulaciones. La incidencia de la enfermedad para animales de control de enfermedades tratados con vehículo era del 100% el día 22. Grupos de control negativo de estudio tratados con el anticuerpo vehículo o CVAM tenía las puntuaciones clínicas más altas. No se observaron puntuaciones clínicas significativamente reducidas para los grupos tratados con Dex (p <0,05 para d18-d26), 5 35 mg/kg de anticuerpos anti-TNF-α (p <0,05 para d18-26), o 25 mg/kg de anticuerpo monoclonal 5429 (p <0,05 para D18-D23 y D25-D26) (Figura 16). Puntuaciones de artritis clínica expresadas como el área bajo la curva (AUC) se redujeron significativamente por el tratamiento con 25 mg/kg mAb 5429 (reducción de 43%), 5 mg/kg anticuerpo anti-TNF-α (52%), o Dex (69 %) en comparación con los controles del vehículo. La figura 17 muestra las medias y las desviaciones estándar para AUC para cada grupo. 40
[0198] También se evaluaron los efectos histopatológicos de los tratamientos. La resorción ósea de la pata se disminuyó significativamente por el tratamiento con 25 mg/kg mAb 5429 (disminución de 47%) en comparación con los controles del vehículo. Los ratones de control positivo tratados con 5 mg/kg anticuerpo anti-TNF-α había disminuido significativamente la inflamación de la pata (33%), el daño del cartílago (38%), y las puntuaciones de 45 pata sumada (37%). El tratamiento con Dex redujo significativamente todos los parámetros de la pata de histopatología (reducción del 73% de las puntuaciones sumadas).
[0199] Estos datos demuestran que los antagonistas de anticuerpos TLR3 mejoran síntomas de enfermedad clínicos e histopatológicos en el modelo de CIA, y sugieren el uso de antagonistas de TLR3 para el tratamiento de la artritis 50 reumatoide.
Ejemplo 14
Antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen frente a las infecciones agudas virales letales 55
Modelo
[0200] Un modelo de exposición de virus de influenza A se utilizó como un modelo de infección viral aguda letal.
60
[0201] En el día -1, 4, 8, y 12, ratones hembra C57BL/6 (12 semanas de edad) o ratones hembra TLR3KO (fondo C57BL/6; 12 semanas de edad, ACE Animals, inc., 15 ratones por grupo) se administraron por vía subcutánea 20 mg/kg mAb 5429, o PBS solo. En el día 0, los ratones fueron anestesiados por isoflurano y se administraron por vía intranasal de virus de gripe A/PR/8/34 (ATCC, Rockland, MD, Lote nº 218171), en 25 µl PBS (equivalente a 105,55 CEID50). Los animales fueron observados dos veces al día para los cambios en el peso corporal y la supervivencia 65 durante el período de 14 días. Un sistema de puntuación clínica se utilizó para evaluar el grado de progresión de la
enfermedad y las mejoras sutiles en respuesta al virus de influenza A del tratamiento.
Puntuaciones clínicas
[0202] 5
0 - normal, alerto y reactivo, no hay signos visibles de enfermedad
1 - capa rizada, con o sin deambulación ligeramente reducida
2 - capa rizada, postura encorvada al caminar, deambulación reacia, dificultad para respirar
3 - capa de rizada, dificultad respiratoria, ataxia, temblor 10
4 - capa de rizada, incapacidad para caminar con un empujón suave, pérdida del conocimiento, frío al tacto
5 - encontrado muerto
Resultados
15
[0203] La supervivencia, las puntuaciones clínicas diarias, y cambios en el peso corporal fueron evaluados en el estudio. Tanto la influenza A infectada con ratones WT administrados mAb 5429 (20 mg/kg) e influenza A infectada por TLR3KO no recibiendo mAb 5429 demostró un aumento estadísticamente significativo en la supervivencia (p <0,001 y p <0,01, respectivamente) en comparación con ratones C57BL/6 inoculados con el virus de la influenza, lo que indica que el antagonismo o deficiencia de TLR3 puede prevenir la influenza - mortalidad inducida (Figura 18). 20 Las puntuaciones clínicas se redujeron significativamente en el grupo que recibió 20 mg/kg mAb/5429, así como en el grupo TLR3KO (Figura 19). Se observó que el peso corporal de los ratones durante un período de 14 días después de la administración del virus de la influenza. El peso corporal se disminuyó de manera constante en ratones C57BL/6 dosificados con el virus de la influenza A. Sin embargo, tanto los ratones C57BL/6 dosificados con 20 mg/kg mAb 5429 como los ratones TLR3KO demostraron significativamente mayor peso corporal en relación con 25 ratones WT C57BL/6 inoculados con virus de la gripe (Figura 20). Estos resultados demostraron que los antagonistas de anticuerpos TLR3 reducen los síntomas clínicos y la mortalidad en un modelo de infección viral de la influenza letal aguda, y sugirió que los antagonistas de TLR3 pueden proporcionar protección a los seres humanos en estados infecciosos agudos.
30
Ejemplo 15
Antagonistas de anticuerpos TLR3 mejoran la hiperglucemia y reducen la insulina en plasma
Modelo 35
[0204] El modelo de obesidad inducida por dieta (DIO) se utilizó como un modelo de la hiperglucemia y resistencia a la insulina y la obesidad.
[0205] Animales WT C57BL/6 (de aproximadamente 3 semanas de edad, Jackson Labs) y animales TLR3KO (fondo C57BL/6; de aproximadamente 3 semanas de edad, Ace Animals, Inc.) se mantuvieron en una dieta alta en grasas 40 durante 12 a 16 semanas. Tanto ratones WT TLR3KO como C57BL/6 fueron alimentados con pienso normal o dieta alta en grasas (Purina TestDiet cat. nº 58126) que consiste en el 60,9% de grasa kcal y 20,8% de carbohidratos kcal. Los ratones se mantuvieron en un 12: ciclo de luz-oscuridad de 12 h, con agua y comida ad libitum. El peso de cada ratón de cada grupo se midió semanalmente. mAb 5429 se administró por vía intraperitoneal dos veces a la semana para la primera semana, seguido de dosificación una vez a la semana para un total de 7 semanas. Muestras de 45 suero de sangre retro-orbital en ayunas se utilizaron para la determinación de la insulina en los puntos de tiempo indicados. Pruebas de tolerancia de glucosa se realizaron mediante la administración ip de glucosa a 1,0 mg/g de peso corporal después de ayuno durante la noche en la semana 7. Además, se midieron los niveles de insulina en ayunas y glucosa.
50
[0206] HOMA-IR se determinó a partir de la ecuación en base a los niveles de glucosa en ayunas y niveles de insulina (12) utilizando la siguiente ecuación: HOMA-IR = ((glucosa en ayunas (mmol/l) x insulina en ayunas (mU/l))/22,5 (Wallace et al., Diabetes Care 27: 1487-1495, 2004). glucosa en sangre en ayunas (BG) se determinó usando un ensayo de oxidasa de glucosa. Niveles de insulina en ayunas se determinaron usando el kit de ELISA de insulina rata/ratón (Crystal Chem,. cat. nº 90060). 55
Resultados
[0207] Después de 12-16 semanas en la dieta alta en grasas, los animales WT DIO presentaban hiperglucemia e hiperinsulinemia. La tolerancia a la glucosa se mejoró en los animales WT DIO pero no en los animales DIO 60 TLR3KO tras el tratamiento con mAb 5429. Niveles significativamente reducidos de glucosa en sangre fueron observados en animales mAb 5429 tratados después de la exposición de glucosa a 60, 90, 120, y 180 min en comparación con control (PBS solamente) (Figura 21A). Se observó una reducción de aproximadamente 21% en el AUC en el animales WT mAb 5429 tratados DIO en comparación con los ratones WT DIO que no reciben el mAb. Niveles de insulina en ayunas también se redujeron en los animales WT DIO tratados con mAb 5429 (Figura 22). 65 Animales TLR3KO DIO no mostraron ninguna mejora en la insulina en ayunas al tratamiento con mAb 5429. El
análisis de evaluación del modelo homeostático (HOMA) indica sensibilidad a la insulina mejorada en los animales WT DIO tratados con mAb 5429, pero no en los animales TLR3KO DIO. Los valores de HOMA-IR fueron 14,0 + 9,8, 8,7 + 4,9, 9,0 + 3,0 para WT DIO, 5 mg/kg de WT DIO mAb 5429, y 20 mg/kg de animales mAb 5429 WT DIO, respectivamente. Ningún efecto se observó en los animales TLR3KO DIO.
[0208] El estudio demostró que los antagonistas de anticuerpos TLR3 mejoraron resistencia a la insulina y la 5 reducción de la glucosa en ayunas en el modelo DIO sin pérdida de peso, lo que sugiere que los antagonistas de TLR3 pueden ser beneficiosos para el tratamiento de la hiperglucemia, resistencia a la insulina, y diabetes de tipo II.
Ejemplo 16
10
Antagonistas de anticuerpos TLR3 protegen frente a las bacterias y las respuestas inflamatorias inducidas por el virus
Reactivos
15
[0209] Cepas Haemophilus influenza no tipificables (NTHi) 35, aisladas de un paciente EPOC con exacerbaciones bacterianas, se obtuvo del Dr. T. F. Murphy (Buffalo VA Medical Center, Buffalo, Nueva York). Rinovirus humano 16 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) con TCID(50)=2,8 x 107/mL.
Ensayos de estimulación de NTHi 20
[0210] Las células NHBE (Lonza, Wakersville, MD) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA) a 1 x 105/pocillo. NTHi cultivado en placas de agar de 16-20 horas se resuspendieron en medio de crecimiento a ~2 x 108 ufc/ml, se trató con 100 µg/mL de gentamicina durante 30 min. y se añadió a ~2 x 107/pocillo a placas de 96 pocillos que contenían NHBEs. Después de 3 horas, los sobrenadantes se retiraron y se 25 reemplazaron con medio de cultivo fresco con o sin anticuerpos (0,08-50 µg/ml de concentración final). Después de incubación adicional de 24 horas, la presencia de citocinas y quimiocinas en los sobrenadantes de células se ensayó por triplicado con un kit de grano de citoquinas 25-plex AB, humano (incluyendo IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM- CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, eotaxina, RANTES y MCP-1)(Life Technologies, Carslbad, CA) en la fluorescencia multiplex Luminex 100IS sistema 30 de análisis y el lector (Luminex Corporation, Austin, TX).
Ensayos de estimulación de rinovirus
[0211] Las células NHBE se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos Microtest (BD Biosciences, 35 Bedford, MA) a 1 x 105 células/pocillo. El día siguiente, los anticuerpos (0,08 a 50 µg/mL de concentración final) se añadieron a NHBE o células BEAS-2B y se incubaron durante 1 h, seguido de adición de 10 µl/pocillo de rinovirus. Después de la incubación adicional de 24 horas, la presencia de citocinas y quimiocinas en los sobrenadantes de células se ensayó por ensayos de Luminex como se describe anteriormente.
40
Resultados
[0212] mAb 15EVQ inhibió producción IP-10/CXCL10 y RANTES/CCL5 inducida por NTHi de una manera dependiente de la dosis, mientras que el anticuerpo de control, IgG4 humana (Sigma, St. Louis, MO), no mostró ningún efecto inhibidor sobre la estimulación NTHi (Figura 23A). mAb 15EVQ también inhibió producción 45 CXCL10/IP-10 y CCL5/RANTES inducida por rinovirus (Figura 23B).
Ejemplo 17
Antagonistas de anticuerpos TLR3 suprimen las respuestas inflamatorias en astrocitos 50
Métodos
[0213] Astrocitos humanos normales a partir de 2 donantes (Lonza, Walkersville, MD) se sembraron en una placa de 24 pocillos a 75.000 células/pocillo y se dejó que se unieran durante la noche. El día siguiente, los astrocitos se 55 trataron con 200 ng/ml de poli(I:C) y/o 10 µg/mL de mAb 18 por 24 horas. Las citoquinas se midieron mediante Luminex.
Resultados
60
[0214] El poli(I:C) - producción inducida de IL-6, IL-8, IL-12, IFN-α, IFN-γ, CXCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CCL4, CCL5/RANTES y CXCL10/IP-10 fueron inhibidas por mAb 18, como se muestra en la Tabla 10.
65
Tabla 10.
Donante 1
IL-6 IL-8 IL-12 IFN-α IFN-γ
no tratado
876,0 + 36,8 539 + 32,6 16,6 + 0,5 28,8 + 1,5 12,3 + 0,3
mAb 18
1011,9 + 57,4 1401,9 + 49,7 17,1 + 0,5 31,6 + 0,7 10,4 + 0,2
Poli(tC)
ol* ol 30,3 + 1,5 47,1 + 3,1 35,9 + 1,0
Poli(tC) + mAb 18
2225,0 + 108,1 6104,4 + 259,9 16,8 + 0,9 30,5 + 1,6 11,7 + 0,6
Donante 2
no tratado
729,1 + 7,1 248,2 + 4,7 14 + 0,5 19,5 + 1,8 10,5 + 0,5
mAb 18
779,0 + 9,8 1132,6 + 30,6 14,3 + 0,6 20,8 + 1,9 10,5 + 0,1
Poli(tC)
ol ol 25,5 + 0,4 36,3 + 1,9 30,8 + 0,9
Poli(tC) + mAb 18
3393,3 + 107,5 8660,4 + 354,3 16,2 + 0,3 24,7 + 1,2 12,6 + 0,3
5
10
15
Donante 1
CXCL9/MG CCL3/MP-1a CCL4 CCL5/RANTES CXCL10/P-10
no tratado
12,6 + 0,7 21 + 0,9 14,8 + 0,7 bl** bl
mAb 18
14,8 + 1,7 19,5 + 1,5 14,8 + 1,1 bl bl
Poli(tC)
78,3 + 4,8 1569,3 + 36,9 159,7 + 12,7 788,2 + 94,9 461,4 + 10,3
Poli(tC) + mAb 18
18,5 + 1,6 31,2 + 1,9 13,2 + 0,9 bl 6,9 + 0,5
Donante 2
no tratado
9,9 + 1,6 12,3 + 1,7 11,3 + 0,3 bl bl
mAb 18
8,9 + 0,7 13,2 + 1,5 11,1 + 0,7 bl bl
Poli(tC)
62 + 3,8 1552,9 + 41,1 140,7 + 4,8 546,8 + 21,7 533,2 + 15
Poli(tC) + mAb 18
18,3 + 2,7 66,6 + 3,8 12,1 + 0,8 bl 29,1 + 6,2
*ol: sobre el nivel de detección
**bl: debajo del nivel de detección
20
25
30
35
Ejemplo 18
Antagonistas de anticuerpo TLR3 suprimen las respuestas inflamatorias en las células endoteliales
Métodos 40
[0215] Las células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) se cultivaron en medio de crecimiento que contiene suero recomendado por Lonza. Las células se resuspendieron en medio libre de suero (Lonza, Walkersville, MD), en placas de 96 pocillos a 3x105 células/mL, y se incubaron a 37°C, 5% CO2 durante 24 horas. Poli(I:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) se añadió a concentraciones crecientes (1,5 a 100 µg/mL) y se incubaron durante otras 45 24 horas a 37°C. Para los ensayos de inhibición de citoquinas, mAb 15EVQ se añadió a las células a diversas concentraciones (0 - 50 µg/ml) y se incubó durante 30 min, después de lo cual 20 µg/mL de poli(I:C) se añadió durante 24 horas. Los sobrenadantes celulares se recogieron y los niveles de citoquinas se midieron utilizando la citoquina humana 30-plex kit y la tecnología MAP Luminex (Invitrogen Corp., Carslbad, CA). Para medir la expresión sICAM-1, las células HUVEC fueron tratadas con 20 µg/mL de poli(I:C) y diversas concentraciones de mAb 15EVQ 50 (0,8 - 50 µg/mL). Los sobrenadantes celulares se analizaron para la expresión sICAM-1 mediante ELISA (R&D systems). La viabilidad celular se midió usando el kit CellTiterGlo (Promega, Madison, WI).
Resultados
55
[0216] Las células HUVEC produjeron las siguientes citoquinas en respuesta a poli(I:C): IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CXCL8/IL-8, IL-12 (p40/p70), IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CXCL10/IP-10, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, VEGF, G-CSF, FGF-básico, y HGF (Tabla 11). mAb 15EVQ niveles reducidos dependientes de dosis de todas las citocinas inducidas por poli(I:C) (Tabla 12). La capacidad de los mAb 15EVQ para reducir producción poli(I:C)-inducida de TNF-α, CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, y CXCL10/IP-10 sugiere 60 que la inhibición de las actividades mediadas por TLR3 puede proteger frente a leucocitos y la infiltración de células T que pueden conducir a la aterosclerosis. También, la inhibición de VEGF por mAb 15EVQ sugirió un beneficio potencial de bloqueo de TLR3 en patologías mediadas por VEGF incluyendo la angiogénesis en una variedad de cánceres y enfermedades oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad.
65
[0217] TNF-α e IFN-γ funcionan en reclutamiento de leucocitos y aumentan la expresión de moléculas de adhesión
en el endotelio activado (Doukas et al., Am J. Pathol 145: 137-47, 1994; Pober et al., Am J. Pathol 133: 426-33, 1988). CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, y CXCL10/IP-10 han sido implicados en monocitos y el reclutamiento de células T y contribuyen al desarrollo de la aterosclerosis (Lundgerg et al., Clin. Immunol. 2009). La generación de VEGF por las células endoteliales se ha relacionado con el crecimiento o tumores de tejido anormal en una variedad de tipos de cáncer durante la angiogénesis (Livengood et al., Cell Immunol 249: 55-62, 2007). 5
[0218] La molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1) se genera por escisión proteolítica y es un marcador de activación de células endoteliales. ICAM-1 desempeña un papel fundamental en la migración de leucocitos y la activación y se regula al alza en las células endoteliales y las células epiteliales durante la inflamación en la que media la adhesión de los leucocitos a través de moléculas de integrina LFA-1 y Mac-1. El poli(I:C) 10
activó las células endoteliales para regular al alza la expresión sICAM-1 y la regulación se redujo mediante el tratamiento con mAb 15EVQ (Figura 24A).
Tabla 11.
15
Poli(I:C) µg/mL
ILO-6 CXCLB/ILO-8 CCL2/MCP-1
10
848,8 + 50,9 12,876,0 2,314,0 + 11,813,4 1,420,9 +
5
751,3 + 2,1 11,363,7 + 108,2 11,365,7 + 113,1
2,5
607,1 + 91,6 10,961,5 2,200,7 + 11,607,3 2,155,7 +
1,25
419,2 + 178,4 9631,5 + 3675,8 11,690,9 3,189,9 +
0,63
263,8 + 81,4 6231,9 + 1568,0 9075,6 + 1152,2
0,31
183,5 + 168,3 5257,9 + 1855,0 8106,8 + 1193,1
0,16
111,9 + 72,5 4057,6 + 1127,4 6619,8 + 1728,2
no poli(I:C)
0,00 1286,6 + 300,8 1360,1 + 245,4
Poli(I:C) µg/mL
IL-2R IL-15 IL-17
100
784,4 + 45,4 61,3 + 12,5 43,8 + 5,3
50
718,6 + 56,8 61,3 + 12,5 47,6 + 0
25
735,7 + 23,4 56,7 + 18,9 58,3 + 4,9
12,5
650,5 + 29,8 38,8 + 6,5 39,8 + 10,9
6,25
643,4 + 39,9 34,2 + 0 32,1 + 0
3,13
681,8 + 24,3 38,8 + 6,5 43,8 + 5,3
1,56
578,6 + 10,5 29,4 + 6,7 36,1 + 5,6
no poli(I:C)
0,0 0,0 0,0
Poli(I:C) µg/mL
IFNα CXCL10/IP-10 CCl4/MP-1β
100
50,7 + 0 3803,1 + 185,5 234,5 + 19,7
50
44,9 + 1,7 2235,9 + 184,6 291,6 + 41,8
25
46,1 + 0 2403,0 + 271,9 278,7 + 4,7
12,5
41,2 + 3,5 2,185,4 + 64,9 243,8 + 63,4
6,25
36,1 + 0 2100,0 288,1 + 201,9 + 46,2
3,13
40,0 + 1,8 3553,2 + 197,1 191,5 + 20,8
1,56
42,5 + 1,7 2064,3 + 242,1 165,3 + 16,3
no poli(I:C)
0,0 0,0 0,0
El poli(I:C) µg/mL
RANTES TNF-α VEGF
100
6266,9 + 1708,7 12,8 + 3,2 581,1 + 181,4
50
2919,7 + 119,4 11,5 + 3,2 637,9 + 47,7
25
2805,1 + 176,7 9,8 + 2,8 700,3 + 62,5
12,5
2,598,6 + 68,6 7,3 + 0,9 513,2 + 73,5
6,25
2449,2 + 830,6 6,9 + 1,4 440,4 + 29,5
3,13
3117,1 + 795,7 7,3 + 0,9 393,9 + 40,2
1,56
2481,0 + 719,3 6,0 + 1,8 358,4 + 74,8
no poli(I:C)
4,9 + 4,5 1,9 + 0,4 32,1 + 8,8
concentraciones mostradas como pg/mL
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 12.
mAb 15 (mg/ml)
50,00 10,00 2,00 0,40 0,08 0,016 0,003 0
PIC
+ + + + + + +
IL-6
177,8 + 5,6 * 214,6 + 3,6 * 359,2 + 57,6 * 727,2 + 50,5 * 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0 10000 + 0
CXCL8/IL-8
1040,7 + 185,9 1765,9 + 97,1 6460,3 + 3684,4 57349,5 + 6293,4 72422,8 + 88279,2 47047,5 + 52393,1 76066,5 + 11354,1 196478,0 + 122298,4
CCL2/MCP-1
1187,7 + 165,4 * 1955,4 + 72,7 * 9054,4 + 4110,9* 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0 20000 + 0,0
IL-2R
25,0 + 35,3 * 0,0 + 0,0 * 312,3 + 137,6 * 521,5 + 5,5 664,7 + 9,8 661,2 + 14,8 698,4 + 57,6 654,2 + 14,8
IL-15
0,0 + 0,0 * 0,0 + 0,0 * 0,0 + 0,0* 4,1 + 0,0 * 38,8 + 6,5 43,4 + 0,0 38,8 + 6,5 43,4 + 0,0
IL-17
1,3 + 1,8 * 11,8 + 16,8 11,8 + 16,8 27,9 + 6,0 47,4 + 10,4 54,3 + 20,2 40,0 + 0,0 51,2 + 5,1
IFN
0,9 + 1,3 * 0,9 + 1,3 * 19,0 + 7,7 * 36,1 + 0,0 44,9 + 1,7 41,2 + 3,5 47,3 + 1,7 40,0 + 1,8
CXCL10/IP-10
0,0 + 0,0 * 58,1 + 2,6 * 633,0 + 471,6 * 1441,4 + 97,1 3023,8 + 166,1 2107,5 + 372,6 2346,4 + 226,1 2157,4 + 282,7
CCL4/MIP-1
0,0 + 0,0 * 0,0 + 0,0 * 2,9 + 4,1 * 62,1+7,2* 176,6 + 21,3 * 227,5 + 19,9 248,3 + 19,4 281,7 + 37,5
RANTES
3,0 + 0,0 * 15,4 + 4,5 * 201,1 + 169,1 * 952,4 + 41,1 * 2454,4 + 98,5 * 2698,1 + 88,6 * 2624,4 + 129,8 * 3459,7 + 181,8
TNF
1,9 + 0,4 * 1,6 + 0,0 * 2,2 + 0,0 * 3,4 + 0,0 6,3 + 0,5 8,5 + 0,0 7,6 + 1,4 6,9 + 2,3
VEGF
87,2 + 8,7 * 28,6 + 8,7 * 88,3 + 52,1 * 156,1 + 6,4 * 479,6 + 14,1 544,6 + 8,3 533,5 + 70,2 607,3 + 29,9
* Indica p-valores significativos (menos que 0,05) comparando concentración mAb15 vs. poli(I:C) solo Valores son media (pg/ml) + SEM
5
10
15
20
25
30
35
40
[0219] Esto sugirió que los antagonistas de anticuerpos TLR3 pueden inhibir el tráfico de leucocitos y por lo tanto daño tisular causado por la afluencia de células inflamatorias.
[0220] Para los ensayos de viabilidad, HUVECs se cultivaron, se sembraron y se estimularon con poli(I:C) como se 45 describe anteriormente. mAb 15EVQ dependiente de dosis restauraron reducción inducida por poli(I:C) en viabilidad celular HUVEC (Figura 24B).
[0221] Modulación hacia abajo de la activación de células endoteliales puede suprimir la infiltración excesiva de células inmunes y reducir el daño tisular causado por citoquinas que se incrementan durante las condiciones 50 inflamatorias. La inflamación y la sobreexpresión de citoquinas y moléculas de adhesión en las células endoteliales son factores clave para el desarrollo de la aterosclerosis y la hipertensión. Estos datos proporcionan una base lógica para explorar el beneficio potencial de los antagonistas de TLR3 para su uso en enfermedades de los vasos sanguíneos, incluyendo vasculitis, y aquellos con disfunción endotelial. Otra enfermedad que se ve afectada por la inflamación y citoquinas sobreexpresadas es el sarcoma de Kaposi (KS) que es común en los individuos infectados 55 por el VIH e inmunodeprimidos y se causa por el virus del sarcoma de Kaposi herpes (VHSK). VEGF y la producción de citoquinas contribuyen a la supervivencia de las células KS (Livengood et al., Cell Immunol 249: 55-62, 2007). Antagonistas TLR3 podrían ser beneficiosos en la reducción de los riesgos asociados con KS angiogénicos y otros tumores y en la prevención de la pérdida de la viabilidad celular y la protección de la integridad de la barrera endotelial vascular para evitar fugas, una condición potencialmente seria asociada con insuficiencia orgánica y 60 enfermedades inflamatorias que amenazan la vida, tales como la sepsis. Antagonismo TLR3 también puede ser beneficioso en las infecciones virales que comprometen la patología de las células endoteliales, tales como las fiebres hemorrágicas virales causadas por miembros de familias de flaviviridae (por ejemplo, dengue, fiebre amarilla), filoviridiae (Ebola, Marburg), Bunyaviridae (por ejemplo, hantavirus, nairovirus, flebovirus) y arenaviridae (por ejemplo, fiebres hemorrágicas de lujo, lassa, argentina, boliviana, venezolana (Sihibamiya et al., Blood. 113: 65 714-722, 2009).

Claims (17)

  1. Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo reactivo con receptor de tipo Toll 3 (TLR3), que comprende tanto una cadena pesada como una región variable de cadena ligera y en el que el anticuerpo comprende:
    5
    a. la cadena pesada CDR 1, 2 y secuencias de aminoácido 3 como se muestra en SEQ ID NO: 82 s, 86 y 84; y B.
    b. la cadena ligera CDR 1, 2 y secuencias de aminoácido 3 como se muestra en SEQ ID NO: s 79, 80 y 87.
  2. 2. El anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicación 1, que comprende la región de cadena pesada variable de 10 la SEQ ID NO: 216 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 41.
  3. 3. El anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 220 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 156.
    15
  4. 4. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo tiene al menos una de las siguientes propiedades:
    1. reduce la actividad biológica de TLR3 humano en un ensayo de gen indicador poli(I:C) NF-κB in vitro de > 50% a <1 µg/mL; 20
  5. 2. inhibe >60% de IL-6 o CXCL10/IP-10 de producción a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I:C) a <10 µg/mL;
  6. 3. inhibe >50% de IL-6 o producción CXCL10/IP-10 a partir de células BEAS-2B estimuladas con <100 poli ng/mL (I:C) a <0,4 µg/mL;
  7. 4. inhibe >50% de IL-6 de producción a partir de células NHBE estimuladas con 62,5 ng/ml poli(I:C) a <5 25 µg/mL;
  8. 5. inhibe> 50% de producción IL-6 a partir de células NHBE estimuladas con 62,5 ng/ml poli(I:C) a <1 µg/mL;
  9. 6. inhibe >20% de poli(I:C) inducida por IFN-γ, IL-6 o IL-12 por PBMC a <1 µg/mL;
  10. 7. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomologus en un ensayo de gen reportero NF-kB in vitro con IC50 30 <10 µg/mL; o
  11. 8. inhibe la actividad biológica TLR3 cynomologus en un ensayo de gen indicador ISRE in vitro con IC50 <5 µg/mL.
  12. 5. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las anteriores 35
    a. el anticuerpo es totalmente humano;
    b. el anticuerpo o fragmento es adaptado a los humanos;
    c. el anticuerpo se conjuga con polietilenglicol; o
    d. el dominio Fc comprende mutaciones S229P, P235A o L236A. 40
  13. 6. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene un isotipo IgG4.
  14. 7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las 45 reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 8. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso en terapia.
    50
  16. 9. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso en un método de tratamiento de:
    a. una enfermedad inflamatoria, opcionalmente en la que la condición inflamatoria:
    55
    ii) afecta a un tejido seleccionado de un grupo que consiste en el tracto respiratorio, el pulmón, el tracto gastrointestinal, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto, el sistema cardiovascular, el tejido cardíaco, vasos sanguíneos, articulaciones, huesos y el tejido sinovial, cartílago, epitelio, endotelio, hepático o tejido adiposo;
    iii) se asocia con un aumento de la infiltración de neutrófilos mediados por TLR3 en el tejido; 60
    iv) es una enfermedad pulmonar inflamatoria, opcionalmente:
    I) el asma o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC);
    II) inducida por influenza de Haemophilus no tipificable; o
    III) hiperreactividad de las vías respiratorias, opcionalmente asociada con el asma, la rinitis 65 alérgica, EPOC, o fibrosis quística;
    iv) es una enfermedad inflamatoria del intestino;
    v) está asociado con ulceración gastronintestinal, colitis opcionalmente infecciosa, colitis isquémica, colágeno o colitis linfocítica o enterocolitis necrotizante; o
    vi) es una enfermedad autoinmune, opcionalmente reumatoide 5
    b. diabetes de tipo II;
    c. la hiperglucemia; o
    d. la hiperinsulinemia;
    10
    donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o fragmento o la composición farmacéutica a un paciente en necesidad del mismo durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria, la diabetes de tipo II, la hiperglucemia o resistencia a la insulina.
  17. 10. El anticuerpo aislado o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición farmacéutica 15 de la reivindicación 7 para su uso en un método de tratamiento o prevención de:
    a) una afección inflamatoria sistémica, opcionalmente tormenta de citocinas o hipercitoquinemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), enfermedad de injerto contra huésped (EICH), síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA), síndrome de distrés respiratorio agudo 20 severo (SRAS), síndrome de antifosfolipídico catastrófico, infecciones virales graves, gripe, neumonía, choque o sepsis; o
    b) infecciones virales, infección por el virus opcionalmente influenza A;
    donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o 25 fragmento o la composición farmacéutica a un paciente en necesidad del mismo durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección inflamatoria sistémica o una infección viral.
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
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